CN111849962A - 一种生物制剂中宿主残留rDNA的去除方法 - Google Patents
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Abstract
一种酶制剂等生物制品中宿主残留DNA的去除方法，属于基因工程及酶制剂研究领域，本发明应用超滤、絮凝、鱼精蛋白处理、核酸酶降解及喷雾干燥等技术针对发酵液中rDNA对其进行处理。利用该技术最优条件下可将生物制剂中rDNA含量降至10ng/g以下。
Description
技术领域
一种生物制剂中宿主残留rDNA的去除技术。所述的宿主为基因工程菌，属于生物工程领域。
背景技术
伴随着生物技术的发展，酶制剂、氨基酸、维生素等生物制品在食品、医药、农牧行业的应用日益增加。目前除木瓜蛋白酶等少数酶制剂是由动植物组织中直接提取之外，常见的酶制剂均由微生物培养获得，如饲用酶制剂的主要生产菌株即为利用基因重组技术构建的工程菌，而在氨基酸、维生素等大宗生物制品的生产中，多数也利用发酵法进行制备。尽管利用转基因技术能大幅度提高生产水平，但宿主细胞残留DNA却因为具有特别的潜在安全风险，一直是国内外监管机构关注的重点。如欧盟遵循“预防原则”，认为转基因技术存在着潜在风险，因此欧洲食品安全局(EFSA)规定出口至欧盟的生物制剂中重组DNA(rDNA)含量不得高于10ng/g。随着行业发展，人们对于转基因技术生产的产品中rDNA关注度日益增强，未来国家关于转基因技术的管控会愈加严格，因此本技术在生物产业的良性发展及降低转基因产品安全风险等方面均具有良好的应用前景。
目前国外生物制剂中rDNA去除技术主要依托不同孔径的滤膜过滤、絮凝、结晶等分离技术来降低产品中的rDNA含量，但由于酵母等高密度发酵的酶液含菌量高，且杂质较多，因此对滤膜等分离设备要求较高，且依靠单一的超滤技术不仅提高了生产成本，还会降低产品收率。国内目前关于酶制剂中rDNA含量暂无规范，在医药领域中rDNA主要依靠层析等技术去除，后处理成本高昂，不适用于工业化制备。未来低rDNA生物制品制备技术的发展将集中于不同分离技术与核酸酶降解技术的集成。
发明内容
本发明的目的是提供一种降低酶制剂等生物制品中rDNA含量的方法；本发明提供生物产品或发酵液中rDNA的提取及检测方法以及酶制剂中rDNA的去除方法。
本发明要解决的第一个技术问题，是提供一种生物制品中微量DNA的提取及检测方法。所述提取方法为碘化钠提取法，即利用高浓度的促溶剂碘化钠使蛋白质溶解，然后加入异丙醇，并利用糖原和核酸共沉淀，从而特异性的使DNA沉淀抽提出来，提取率可达80％以上。
rDNA的检测使用荧光法，即利用标准DNA浓度与相应的荧光值建立标准曲线，并取一定量提取的待测DNA与荧光染料结合，根据荧光值计算得出样品的DNA含量，每组设2个平行。
本发明要解决的第二个技术问题，是提供一种生物制品中rDNA的去除方法。主要包括以下步骤：
1)测定表达菌株在不同培养时间上清液中的DNA含量，在一个优选的实施例中，酵母培养物前150h，其上清液DNA含量低于100ng/mL，而在150h之后，大量产酶细胞自溶凋亡，上清液中DNA含量迅速上升，184h时胞外DNA含量为544ng/mL。
2)先后利用板框及微滤膜对发酵液进行过滤除菌，对于含菌量较高的发酵液可进行多次过滤。
3)在发酵液上清中添加0.01％-2％的絮凝剂，絮凝剂可以是碱式氯化铝或聚合硫酸铁，并根据目的酶的耐热稳定性将温度控制在50-70℃之间，在一个优选的实施例中，将温度控制在70℃处理6h，不仅可将rDNA含量由424ng/mL降低至139ng/mL，还可以去除大量的杂蛋白并降低上清液粘度。
4)利用微滤膜对上述处理液进行二次过滤后，根据目的酶分子量选择孔径低于蛋白分子量的超滤膜对上清液进行超滤浓缩，在一个优选的实施例中选择30kDa滤膜对植酸酶发酵液进行浓缩，酶活收率可达85％，浓缩倍数6.5倍。
5)在浓缩液中添加适宜比例的鱼精蛋白，鱼精蛋白的添加量根据样品的DNA含量及发酵液的体积进行计算，在一个优选的实施例中，根据体积比添加0.05％的鱼精蛋白后，利用100kDa滤膜进行过滤后，可使rDNA含量由296ng/mL降至22.4ng/mL。
6)在上述透过液中添加适宜比例的核酸酶，核酸酶的添加量依据样品中rDNA含量及体积进行计算，一般认为rDNA含量越高，所需的核酸酶添加量越大。为了节约成本，也可以通过延长酶解时间达到预期效果。在一个优选的实施例中，添加1％的核酸酶水解2h，可使rDNA含量由712ng/mL降至42.4ng/mL。
7)利用喷雾干燥塔对上述步骤获得的酶液进行干燥，根据目的酶的热稳定性选择干燥温度，干燥温度越高rDNA的去除效果越佳，但酶活损失也越大。在一个优选的实施例中，干燥温度为180℃时，rDNA含量降低了13倍，酶活收率为79.4％。
附图说明
图1培养时间对发酵液上清中DNA含量的影响
图2鱼精蛋白浓度对rDNA含量的影响
图3核酸酶添加量对发酵液中rDNA含量的影响
图4不同干燥温度获得的酶粉中rDNA的含量变化
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1重组菌株胞外上清液中的rDNA含量
利用15t发酵罐对产植酸酶重组菌株进行中试试验，诱导48h后间隔24h无菌取样，4000rpm离心10min后取上清100μL提取DNA，并利用荧光法进行检测，并镜检观察细胞活力。结果表明，在诱导前120h，细胞形态良好，胞外DNA含量增长缓慢，之后细胞逐渐膨大变形，部分细胞凋亡白溶，在不同生产批次的发酵罐中发现正常放罐的胞外rDNA达320-746ng/mL。
实施例2不同孔径滤膜对rDNA的去除效果
发酵液中的rDNA主要为重组细胞染色体DNA以及发酵后期细胞自溶后释放至上清中的长链DNA，因此分离细胞菌体以及过滤掉高分子量的DNA(如微滤除菌)是降低rDNA的重要方法。但在实际应用中该方法的效果受滤膜的种类、过滤作用力、浓差极化等多种因素影响。本申请中用不同孔径的滤膜结合絮凝及鱼精蛋白特异性结合DNA的方法对发酵液进行前处理，rDNA含量较低，且目的酶回收率较高。
实施例3鱼精蛋白与超滤膜集成去除rDNA
鱼精蛋白是一种碱性蛋白质，在鱼类(如鲑鱼、鳟鱼、鲱鱼等)成熟精子细胞核中作为和DNA结合的核精蛋白存在，因此在医药领域(如狂犬病疫苗)中被用于降低rDNA含量。在微滤除菌后的酶液(rDNA含量为182.2ng/mL)中分别添加不同浓度(0.01％-0.1％)的鱼精蛋白，室温静置后进一步过膜处理去除DNA与鱼精蛋白的复合物。结果表明鱼精蛋白的添加量为0.05％时，经100kDa滤膜过滤可有效去除长链DNA与鱼精蛋白特异性结合的大分子物质，透过液中rDNA含量明显降低，仅为25.2ng/mL。
实施例4核酸酶对发酵液中rDNA的降解作用
为了利于核酸酶在生产中的应用，探究了核酸酶的不同添加量对高rDNA酶液(712ng/mL)的降解效果。结果表明对于高浓度的rDNA样品，添加0.1％核酸酶的实验组水解3h后DNA含量仍在300ng/mL以上，且rDNA含量与核酸酶添加量呈负相关。进一步过夜水浴处理后，添加1％核酸酶的样品rDNA含量降至17.8ng/mL。说明该核酸酶具有良好的稳定性，且高浓度的rDNA经核酸酶充分水解后DNA含量也可降至20ng/mL。
实施例5喷雾干燥温度对酶粉中rDNA含量的影响
干燥过程中的高温会对rDNA有一定的降解效果，设计实验探究喷干温度对rDNA的影响。实验设计4组，分别取1L酶活为13212U/mL、rDNA含量为712ng/mL的发酵液分4个温度梯度(150℃、165℃、180℃、190℃)进行喷雾干燥，计算酶活得率及rDNA残留率。结果表明随着温度升高，rDNA残留率明显降低，与150℃干燥的酶粉相比相比，喷干温度为190℃时rDNA的残留率由40.5％降至8.9％，酶活收率则由93.4％降至72.1％。结合较佳的酶活收率，因此选择170-180℃进行喷雾干燥，既能保证酶活得率在83％(实际生产中更高)以上，同时rDNA的残留率也在12％以下。
结果表明：利用过滤与絮凝、鱼精蛋白特异结合以及核酸酶降解等技术结合可有效降低发酵液中的rDNA含量，可使rDNA由500ng/mL降至10ng/mL以下，且利用该技术处理可使目的酶收率保留60％以上。因此利用该技术可有效提高生物制剂的品质，为国产生物制品的出口及降低转基因技术安全风险建立了良好的基础。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (8)
1.一种基因工程菌生产的生物制品中rDNA去除方法，其特征在于，步骤为：
(1)将产目的物的发酵菌株培养至一定阶段，提取并检测发酵液中rDNA含量；
(2)利用板框过滤、微滤膜除菌进行固液分离；
(3)在发酵液上清中添加絮凝剂，并根据发酵产物的耐热稳定性将温度控制在50-70℃之间；
(4)利用微滤膜对步骤(3)获得的发酵液进行二次过滤，之后利用超滤膜进行浓缩；
(5)在步骤(4)获得的浓缩液中添加鱼精蛋白，低速搅拌后利用超滤膜除杂；
(6)在超滤膜透过液中添加核酸酶，过夜水解。
(7)利用喷雾干燥塔对步骤(6)获得的水解液进行干燥。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述絮凝剂添加比例为0.01％-2％，絮凝剂可以是碱式氯化铝或聚合硫酸铁，所述超滤膜为30kDa超滤膜。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述浓缩体积需在5～10倍。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述浓缩体积为10倍。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)鱼精蛋白添加比例为0.05-1％，低速搅拌3-10h后利用50-100kDa的超滤膜除杂，所述步骤(6)核酸酶添加比例为0.01-1％过夜水解温度为30-60℃。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，鱼精蛋白的添加量为0.5％。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述干燥温度设定在140-190℃。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵工程菌包括酿酒酵母、毕赤酵母、黑曲霉在内的真核菌属，也包括芽孢杆菌属、肠球菌属、梭菌属在内的原核菌属，所述酶制剂包括植酸酶、葡聚糖酶、甘露聚糖酶、酸性蛋白酶、淀粉酶在内的工业酶制剂，也包括利用发酵法生产的氨基酸、维生素等其它生物制品。
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Citations (3)
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| GB715572A (en) * | 1951-08-03 | 1954-09-15 | American Cyanamid Co | Improvements relating to and the purification of enzymes of enzyme mixtures |
| US4055469A (en) * | 1976-12-10 | 1977-10-25 | Eastman Kodak Company | Purification of microbial enzyme extracts using synthetic polyelectrolytes |
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2019
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Patent Citations (3)
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