JP2020516605A - キメラ抗原受容体(car)t細胞療法の副作用を治療する方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、キメラ抗原受容体(CAR)T細胞療法の副作用を治療する方法であって、CAR T細胞療法を施されたことがあるか又は施されている被験体に間葉系幹細胞(MSC)を投与することを含む方法に関する。【選択図】図11
Description
本発明は、キメラ抗原受容体(CAR)T細胞療法の副作用の治療に関する。
免疫療法は、疾患と戦うために被験体が生まれつき備える免疫系を改善するように設計された生物学的療法である。一般的に、免疫療法は、がん免疫療法を指す。
がん免疫療法の発展している分野は養子細胞移入(ACT)であり、この方法では、T細胞を単離し、がん細胞を認識及び攻撃するように操作し、次いで、増幅させ、がんを有する被験体に再導入する。これは、自家ACT用に被験体自身のT細胞を単離及び操作することを含み得るが、同種(時に同属とも呼ばれる)ACT用にドナーのT細胞を使用することについても研究が行われている。
ACTでは、がん細胞で発現する抗原を認識する受容体を発現するようにT細胞又はNK細胞を操作する。該受容体は、T細胞受容体(TCR)又はキメラ抗原受容体(CAR)であり得る。CARを発現するT細胞をCAR T細胞と称する。
今日まで、ACT及びCAR T細胞療法は主に血液がんに使用されており、小規模の臨床試験に限定されているが、固形がんについては非常に限られた治験しか行われていない。それにもかかわらず、CAR T細胞療法は、進行がんの被験体において目覚ましい応答を示している。
B細胞に存在する細胞表面抗原であるCD19に対するCARを通常使用するCAR T細胞療法に供されているがんとしては、急性リンパ芽球性白血病(ALL);慢性リンパ性白血病(CLL);びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)及び濾胞性リンパ腫を含む数種の非ホジキンリンパ腫(NHL);並びに多発性骨髄腫が挙げられる。
有望であるにもかかわらず、CAR T細胞療法は、副作用及び大きなリスクがない訳ではない。観察される副作用としては、マクロファージ活性化症候群(MAS)に関連するサイトカイン放出症候群(CRS);移植片対宿主病(GVHD)及びB細胞無形成と同様の転帰を引き起こすオンターゲットオフがん作用(on−target,off−cancer effects);腫瘍崩壊症候群(TLS);脳浮腫等の神経毒性;並びに非ヒト抗原を含むCARに対する被験体のIgG応答によって引き起こされるアナフィラキシーが挙げられる。
CRSは、ステロイドを含む標準的な支持療法で治療されている。しかし、ステロイドは、被験体におけるCAR T細胞の活性又は増殖に影響を及ぼす場合がある。CRSのための別の療法は、CRSにおいて増加する炎症促進性サイトカインの阻害剤を投与することである。抗IL−6受容体抗体であるトシリズマブ及びTNF阻害剤であるエタネルセプトが、CRSを治療するために使用されている。
抗体産生を減少させるB細胞無形成は、感染を予防するために静脈内免疫グロブリンで治療されている。
TLSは、水分補給、利尿、アロプリノール及び組み換え尿酸オキシダーゼの投与、並びに必要に応じて血液透析を含む、標準的な支持療法によって管理されている。
これら副作用は様々な程度管理に成功しているが、定期的に生じる有害事象、そして更には多数の臨床試験で生じる被験体の死があり、完全に成功しているとはいえない。
明らかに、ACT、特にCAR T細胞療法の副作用のための改善された予防及び/又は治療法が必要とされている。
本明細書において何らかの先行技術の刊行物を参照する場合、このような参照は、その刊行物がオーストラリア又は任意の他の国における当技術分野の技術常識の一部を形成することを認めるものではないことを理解されたい。
第1の態様は、CAR T細胞療法の副作用を治療する方法であって、CAR T細胞療法を施されたことがあるか又は施されている被験体に間葉系幹細胞(MSC)を投与することを含む方法を提供する。
第1の態様の代替の又は追加の実施形態は、CAR T細胞療法を施されたことがあるか又は施されている被験体におけるCAR T細胞療法の副作用を治療するための医薬の製造における間葉系幹細胞(MSC)の使用を提供する。
第1の態様の更なる代替の又は追加の実施形態は、CAR T細胞療法を施されたことがあるか又は施されている被験体におけるCAR T細胞療法の副作用の治療において使用するための間葉系幹細胞(MSC)を提供する。
一実施形態では、MSCは、CD73+CD105+CD90+CD146+CD44+CD10+CD31−CD45−表現型を有する。
一実施形態では、MSCは、miR−145−5p、miR−181b−5p、及びmiR−214−3pを発現するが、miR−127−3p及びmiR−299−5pは発現しない。
一実施形態では、治療は、約1×106〜約1×107個のMSCを被験体に投与することを含む。
一実施形態では、治療は、被験体がCAR T細胞療法を受ける前、受けている間、又は受けた後にMSC(複数可)を投与することを含む。一実施形態では、治療は、被験体がCAR T細胞療法を受けた後にMSC(複数可)を投与することを含む。一実施形態では、治療は、被験体がCAR T細胞療法を受けた後24時間〜72時間以内にMSC(複数可)を投与することを含む。
一実施形態では、副作用又は症状は、サイトカイン放出症候群(CRS)、任意選択でインターフェロン−6(IL−6)、インターフェロン−γ(IFN−γ)、腫瘍壊死因子(TNF)、IL−2、IL−2受容体α、IL−8、IL−10、若しくは顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GMCSF)の放出;マクロファージ活性化症候群(MAS);オンターゲットオフがん作用、任意選択でB細胞無形成;腫瘍崩壊症候群(TLS);神経毒性、任意選択で脳浮腫;又はアナフィラキシーである。
一実施形態では、CAR T細胞療法は、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL);非ホジキンリンパ腫(NHL);縦隔原発B細胞リンパ腫(PMBCL);慢性リンパ性白血病(CLL);形質転換濾胞性リンパ腫(TFL);多発性骨髄腫(MM);マントル細胞リンパ腫(MCL);急性骨髄性白血病(AML);又は急性リンパ芽球性白血病(ALL)を治療するためのものである。
一実施形態では、CARは、抗CD19 CARである。
一実施形態では、被験体は、哺乳類、任意選択でヒトである。
第2の態様は、哺乳類被験体におけるCAR T細胞療法の副作用を治療、改善、又は低減するための治療用組成物であって、間葉系幹細胞(MSC)を含み、該MSCが、
(a)間葉系コロニーを形成するのに十分な時間、正常酸素圧条件下において、LiCl及びFGF2を含むが、PDGFは含まない間葉系コロニー形成培地(M−CFM)中で原始中胚葉細胞を培養することと;
(b)(a)の間葉系コロニーを接着培養して、MSCを生成させることと
を含む方法によって作製され、
(b)のMSCが、miR−145−5p、miR−181b−5p、及びmiR−214−3pは発現するが、miR−127−3p及びmiR−299−5pは発現しない、並びに/又は表現型CD73+CD105+CD90+CD146+CD44+CD10+CD31−CD45−を有する治療用組成物を提供する。
(a)間葉系コロニーを形成するのに十分な時間、正常酸素圧条件下において、LiCl及びFGF2を含むが、PDGFは含まない間葉系コロニー形成培地(M−CFM)中で原始中胚葉細胞を培養することと;
(b)(a)の間葉系コロニーを接着培養して、MSCを生成させることと
を含む方法によって作製され、
(b)のMSCが、miR−145−5p、miR−181b−5p、及びmiR−214−3pは発現するが、miR−127−3p及びmiR−299−5pは発現しない、並びに/又は表現型CD73+CD105+CD90+CD146+CD44+CD10+CD31−CD45−を有する治療用組成物を提供する。
第3の態様は、第2の態様の治療用組成物を含む容器を提供する。
本明細書で特に定義しない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって及び公開されている文書を参照することによって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
用語「a」又は「an」は、1以上を指し、例えば、「a MSC」は、1以上のMSCを表すと理解されることに留意すべきである。このように、用語「a」又は「an」、「1以上」、及び「少なくとも1」は、本明細書において互換的に用いることができる。
続く特許請求の範囲及び発明の説明では、言語表現又は必然的な関連性から文脈上他の意味に解すべき場合を除いて、用語「含む(comprise)」、又は「comprises」若しくは「comprising」等の変形は、包括的な意味で、すなわち、記載されている特徴の存在を特定するために使用され、本発明の様々な実施形態における更なる特徴の存在又は追加を排除するために使用されるものではない。
用語「約」は、本明細書で使用するとき、所与の数について、その数±25%の大きさの数値範囲を意図する。他の実施形態では、用語「約」は、所与の数について、その数±20%、±15%、±10%、又は±5%の大きさの数値範囲を意図する。例えば、一実施形態では、「約3グラム」は、2.7グラム〜3.3グラム(すなわち、3グラム±10%)の値を示す。
同様に、事象のタイミング又は持続時間も少なくとも25%変動し得る。例えば、特定の事象が一実施形態において1日間持続すると開示されている場合があるが、その事象は1日間よりも長い時間又は短い時間持続してもよい。例えば、「1日間」は、約18時間〜約30時間の時間を含み得る。他の実施形態では、期間は、その期間の±20%、±15%、±10%、又は±5%変動し得る。
本明細書で使用するとき、「養子細胞移入」又は「ACT」とは、T細胞又はNK細胞を単離し、特定の抗原を認識するように操作し、次いで、増幅させ、被験体に再導入するプロセスを指す。ACTに使用されるT細胞又はNK細胞は、治療される被験体に由来する「自家」であってもよく、ACTを受ける被験体によって拒絶されないのに十分な程度類似している免疫原性プロファイルを有するドナー被験体に由来する「同種」(時に「同属」とも呼ばれる)であってもよい。
本明細書で使用するとき、ACTにおいて移入される細胞は、「キメラ抗原受容体T細胞」、「キメラ抗原受容体NK細胞」、又は「CAR T細胞」である。本明細書で使用するとき、「CAR T細胞」は、T細胞又はNK細胞を含む。本明細書で使用するとき、「CAR T細胞」は、CAR又はT細胞受容体(TCR)を発現するように操作された細胞を含む。CAR T細胞は、任意選択で規定の比率で存在する、TヘルパーCD4+及び/又はTエフェクターCD8+の細胞であってよい。CAR T細胞は、全CD3+細胞を含んでいてよい。
CAR−T細胞の生成
CAR T細胞は、レトロウイルス、レンチウイルス、若しくはトランスポゾンを含むウイルスベクター等のゲノムに組み込まれるベクター、又はプラスミド若しくはmRNA等のゲノムに組み込まれない(エピソーマル)DNA/RNAベクターを使用することによって生成され得る。ゲノムに組み込まれるベクターは、安定であるが、レシピエントのT細胞又はNK細胞における内因性遺伝子発現に負の影響を与える場合がある。エピソーマルベクターは、レシピエントのT細胞又はNK細胞における内因性遺伝子発現に負の影響を与える可能性は低いが、CARの発現が不安定であり、多くの場合約1週間以内に失われる。別のエピソーマルアプローチは、スカフォールド/マトリクス付着領域(S/MAR)エレメントを含む、組み込まれないレンチウイルス(NILV)ベクターに依存する。このアプローチは、ゲノムに組み込まれることなく、CAR T細胞において安定に維持される/長期間発現するという利点を有する。
CAR T細胞は、レトロウイルス、レンチウイルス、若しくはトランスポゾンを含むウイルスベクター等のゲノムに組み込まれるベクター、又はプラスミド若しくはmRNA等のゲノムに組み込まれない(エピソーマル)DNA/RNAベクターを使用することによって生成され得る。ゲノムに組み込まれるベクターは、安定であるが、レシピエントのT細胞又はNK細胞における内因性遺伝子発現に負の影響を与える場合がある。エピソーマルベクターは、レシピエントのT細胞又はNK細胞における内因性遺伝子発現に負の影響を与える可能性は低いが、CARの発現が不安定であり、多くの場合約1週間以内に失われる。別のエピソーマルアプローチは、スカフォールド/マトリクス付着領域(S/MAR)エレメントを含む、組み込まれないレンチウイルス(NILV)ベクターに依存する。このアプローチは、ゲノムに組み込まれることなく、CAR T細胞において安定に維持される/長期間発現するという利点を有する。
CAR及びCAR T細胞の生成は、当技術分野において公知であり、(i)米国特許第7,446,190号、同第7,741,465号、及び同第9,181,527号を含む多くの特許公報;並びに(ii)Kalos et al.Sci Transl Med.2011,3(95):95ra73、Milone et al.Mol Ther.2009,17(8):1453−64、及びMaude et al.N Engl J Med.2014,371(16):1507−17を含む雑誌刊行物;並びに(iii)本開示の実施例1〜4に記載されている。(i)及び(ii)の例はそれぞれ、この相互参照によって全体が組み込まれる。
理論に束縛されるものではないが、CARは、4つのドメインを含み得る:
(1)特定の細胞表面抗原(複数可)を標的とする、単鎖抗体可変断片(scFV)の細胞外結合ドメイン
(2)ヒンジドメイン
(3)膜貫通ドメイン
(4)T細胞の増殖、生存、及びサイトカイン生成を誘発する、細胞質シグナル伝達ドメイン。
(1)特定の細胞表面抗原(複数可)を標的とする、単鎖抗体可変断片(scFV)の細胞外結合ドメイン
(2)ヒンジドメイン
(3)膜貫通ドメイン
(4)T細胞の増殖、生存、及びサイトカイン生成を誘発する、細胞質シグナル伝達ドメイン。
同様に、理論に束縛されるものではないが、CARは多数のカテゴリーのうちの1つに分類することができる:第1世代(最古)、第2世代、第3世代、又は第4世代(最新)。
第1世代のCARは、CD3ゼータ鎖(CD3ζ)由来の単一のシグナル伝達ドメインを有する。第2世代のCARは、例えば、それぞれCD3ζ及びCD28又は4−1BB(CD137)に由来する、シグナル伝達ドメイン及び共刺激ドメインを有する。第3世代のCARは、例えばCD3ζに由来するシグナル伝達ドメインと、例えばCD28及び4−1BB(CD137)に由来する複数の共刺激ドメインとを有する。第4世代のCARは、第2世代のCARを更なる配列、例えば、IL−12等のサイトカイン又は共刺激リガンドをコードしているカセットの発現を誘導し、それによって、CAR T細胞の細胞殺傷能を増強するための活性化T細胞の核因子(NFAT)と組み合わせたものである。
CARが標的とする関連抗原は、例えば、アルファVベータ6インテグリン、CAIX、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD138、CD171、CEA、EGFR、ErbB(HER)、ErbB2(HER2)、FAP、葉酸受容体−アルファ、GD2、グリピカン3、IL−13、カッパ軽鎖、Lewis Y、メソテリン、MUC16、NKG2D、PSMA、RORI(RORアルファ)、又はVEGFRであってよい。
適応症
CAR T細胞を使用して、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL);非ホジキンリンパ腫(NHL);縦隔原発B細胞リンパ腫(PMBCL);慢性リンパ性白血病(CLL);形質転換濾胞性リンパ腫(TFL);多発性骨髄腫(MM);マントル細胞リンパ腫(MCL);急性骨髄性白血病(AML);急性リンパ芽球性白血病(ALL)を治療することができる。このリストは、網羅的であることを意図するものではない。
CAR T細胞を使用して、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL);非ホジキンリンパ腫(NHL);縦隔原発B細胞リンパ腫(PMBCL);慢性リンパ性白血病(CLL);形質転換濾胞性リンパ腫(TFL);多発性骨髄腫(MM);マントル細胞リンパ腫(MCL);急性骨髄性白血病(AML);急性リンパ芽球性白血病(ALL)を治療することができる。このリストは、網羅的であることを意図するものではない。
更に、CAR T細胞は、B細胞悪性腫瘍;B細胞悪性腫瘍を有する小児若しくは若年成人;B細胞白血病;CD19+リンパ腫;CD19+B細胞リンパ腫;CD19陽性悪性B細胞由来の白血病若しくはリンパ腫;再発性若しくは難治性のCD19+リンパ腫;難治性/再発性のB細胞血液悪性腫瘍;同種幹細胞移植後の反復性若しくは持続性のB細胞悪性腫瘍;化学療法抵抗性若しくは難治性のALL;再発性B細胞ALLを有する小児若しくは若年成人患者;神経膠芽腫;多形神経膠芽腫;反復性多形神経膠芽腫;CD7陽性の白血病若しくはリンパ腫;CD30陽性リンパ腫;EGFR VIII+神経膠芽腫;進行肝臓悪性腫瘍;肝細胞がん腫;神経芽腫;難治性及び/若しくは反復性の神経芽腫;小児における再発性若しくは難治性の神経芽腫;GD2+固形腫瘍;小児固形腫瘍;MUC1陽性の再発性若しくは難治性の固形腫瘍;乳がん;進行肉腫;がん胎児抗原(CEA)陽性がん;CD70発現がん;再発性及び難治性の侵襲性B細胞NHL;再発性/難治性のCD30+ホジキンリンパ腫若しくはCD30+NHL;再発性若しくは難治性のCD19+CLL若しくは小リンパ球性リンパ腫(SLL);悪性神経膠腫;再発性/難治性のCD33+AML;鼻咽腔がん腫;メソテリン陽性進行悪性腫瘍;反復性若しくは転移性の悪性腫瘍;切除不可能な膵臓がん;転移性膵臓がん;進行膵臓がん腫;進行ROR1+悪性腫瘍;反復性若しくは難治性のDLBCL;CD19陽性全身性エリテマトーデス(SLE);難治性若しくは転移性のGD2陽性肉腫;骨髄腫;骨髄異形成症候群;胃がん;反復性若しくは難治性の急性非Tリンパ球白血病;CD5抗原を発現しているT細胞悪性腫瘍;反復性若しくは難治性の肺扁平細胞がん腫;進行肝細胞がん腫;GPC3陽性進行肝細胞がん腫(HCC);進行性MG7陽性肝転移;持続性/反復性の芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍;頭頸部がん;HER2陽性悪性腫瘍;化学療法難治性ヒト上皮増殖因子受容体−2(HER−2)陽性進行固形腫瘍;化学療法抵抗性若しくは難治性のCD20+リンパ腫;(FAP)陽性悪性胸膜中皮腫;慢性骨髄性白血病(CML);化学療法難治性EGFR(上皮増殖因子受容体)陽性進行固形腫瘍;腺がん腫;又は1型糖尿病を治療するために使用することもできる。
一実施形態では、CAR T細胞の用量は、1×105細胞/kgであってよい。別の実施形態では、CAR T細胞の用量は、1×1010細胞/kgであってよい。他の実施形態では、CAR T細胞の用量は、5×105細胞/kg、1×106細胞/kg、5×106細胞/kg、1×107細胞/kg、5×107細胞/kg、1×108細胞/kg、5×108細胞/kg、1×109細胞/kg、又は5×109細胞/kgであってよい。
一実施形態では、CAR T細胞の用量は、1×105細胞/m2であってよい。別の実施形態では、CAR T細胞の用量は、1×1010細胞/m2であってよい。他の実施形態では、CAR T細胞の用量は、5×105細胞/m2、1×106細胞/m2、5×106細胞/m2、1×107細胞/m2、5×107細胞/m2、1×108細胞/m2、5×108細胞/m2、1×109細胞/m2、又は5×109細胞/m2であってよい。
一実施形態では、CAR T細胞の用量は、1×105細胞であってよい。別の実施形態では、CAR T細胞の用量は、1×1010細胞であってよい。他の実施形態では、CAR T細胞の用量は、5×105細胞、1×106細胞、5×106細胞、1×107細胞、5×107細胞、1×108細胞、5×108細胞、1×109細胞、又は5×109細胞であってよい。
CAR T細胞は、単一用量、分割用量、又は多回用量で投与してよい。
CAR T細胞の用量は、標的抗原及び当該標的抗原を発現している標的細胞に関連し、従って、治療される適応症によって変動し得る。
CAR T細胞の用量は、CAR T細胞療法についての原則に従って、投与する臨床家によって決定される。
副作用及び症状
サイトカイン放出症候群(CRS)は、CAR T細胞療法の重篤な副作用である。CRSは、インターロイキン−6(IL−6)、インターフェロン−γ(IFN−γ)、腫瘍壊死因子(TNF)、IL−2、IL−2受容体α、IL−8、IL−10、及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GMCSF)を含むサイトカインを大量に放出する、増殖しているT細胞に起因すると考えられる。
サイトカイン放出症候群(CRS)は、CAR T細胞療法の重篤な副作用である。CRSは、インターロイキン−6(IL−6)、インターフェロン−γ(IFN−γ)、腫瘍壊死因子(TNF)、IL−2、IL−2受容体α、IL−8、IL−10、及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GMCSF)を含むサイトカインを大量に放出する、増殖しているT細胞に起因すると考えられる。
CRSの症状としては、高熱、倦怠感、疲労、筋肉痛、吐き気、食欲不振、頻拍/低血圧、毛細血管漏出、心機能不全、腎機能障害、肝不全、及び播種性血管内凝固が挙げられる。
従って、CRSの被験体は、発熱;頻拍、低血圧、不整脈、心臓駆出分画の減少を含む心血管症状;浮腫、低酸素症、呼吸困難、及び肺炎を含む肺症状;通常、腎血流量の低下によって引き起こされる急性腎損傷;血清トランスアミナーゼ及びビリルビンの増加、下痢、大腸炎、吐き気、及び腹痛を含む肝臓及び胃腸の症状;グレード3〜4の貧血、血小板減少、白血球減少、好中球減少、及びリンパ球減少等の血球減少を含む血液症状;プロトロンビン時間及び活性化部分トロンボプラスチン時間(PTT)の延長、Dダイマーの増加、低フィブリノゲン、播種性血管内凝固、マクロファージ活性化症候群(MAS)、出血、B細胞無形成、並びに低ガンマグロブリン血症を含む凝固障害;菌血症、サルモネラ、尿路感染症、ウイルス感染症、例えば、インフルエンザ、呼吸器合胞体ウイルス、及び帯状疱疹ウイルス等を含む感染性疾患;クレアチンキナーゼの増加、筋肉痛、及び脱力を含む筋骨格症状;せん妄、錯乱、及び発作を含む神経症状を経験し得る。例えば、エタネルセプト、及び抗TNF分子、並びに抗IL−6受容体抗体であるトシリズマブといったステロイド及び抗サイトカイン療法が、CRSを治療するために使用されている。
MASは、肝脾腫、リンパ節腫脹、汎血球減少、肝機能障害、播種性血管内凝固、低フィブリノゲン血症、高フェリチン血症、及び高トリグリセリド血症を経験する可能性のある被験体では、CRSと臨床的に重複している。CRSと同様に、MASを有する被験体は、IFN−γ及びGMCSFを含むサイトカインの濃度上昇を呈する。
オンターゲットオフがん作用は、移植片対宿主病(GVHD)、及び標的がん抗原が他の健常/正常細胞型において内因的に発現するときに引き起こされるB細胞無形成と同様の転帰を引き起こす場合がある。
例えば、抗CD19 CARはCD19を発現する正常B細胞も標的とするので、B細胞無形成が生じる。B細胞無形成の結果、低免疫グロブリン血症に起因する、感染症と戦う能力が低下する。感染症を予防するためにIV注入免疫グロブリン補充療法が使用される。
CAR T細胞療法の別の副作用は、腫瘍崩壊症候群(TLS)であり、これは、細胞死を引き起こす療法の結果として細胞の内容物が放出されるときに生じ、ほとんどの場合リンパ腫及び白血病を伴う。TLSは、血液イオン及び代謝物の不均衡を特徴とし、症状としては、吐き気、嘔吐、急性尿酸腎症、急性腎不全、発作、心不整脈、及び死亡が挙げられる。
CAR T細胞療法から神経毒性が生じる場合もあり、症状としては、脳浮腫、せん妄、幻覚、失語症、無動無言症、頭痛、錯乱、覚醒状態の変化、運動失調、失行症、顔面神経麻痺、振戦、測定障害、及び発作を挙げることができる。
CARの一部を形成するマウス由来のタンパク質等の非宿主タンパク質から、アナフィラキシーが発生することもある。
副作用の管理
一般に、CAR T細胞療法の副作用は、任意の提示された症状に対する標準的な支持療法で管理される。しかし、CAR T細胞療法の結果として無数の副作用及び症状が生じ得ることを考えると、複数の支持療法が同時に必要となる場合がある。
一般に、CAR T細胞療法の副作用は、任意の提示された症状に対する標準的な支持療法で管理される。しかし、CAR T細胞療法の結果として無数の副作用及び症状が生じ得ることを考えると、複数の支持療法が同時に必要となる場合がある。
間葉系幹細胞
従って、本発明は、CAR T細胞及び間葉系幹細胞(MSC)を投与することによって、CAR T療法によって引き起こされる副作用の数、重篤度、及び持続時間を低減するための改善された療法を提供する。MSCは、その免疫調節特性を通して効果を発揮するので、多くの副作用及び症状に対して、MSCは、当該副作用又は症状の免疫原性の原因に直接作用することができる。
従って、本発明は、CAR T細胞及び間葉系幹細胞(MSC)を投与することによって、CAR T療法によって引き起こされる副作用の数、重篤度、及び持続時間を低減するための改善された療法を提供する。MSCは、その免疫調節特性を通して効果を発揮するので、多くの副作用及び症状に対して、MSCは、当該副作用又は症状の免疫原性の原因に直接作用することができる。
MSCは、サイトカイン、ケモカイン、及び成長因子等の生物活性分子を分泌し、そして、免疫系を調節する能力を有する。MSCは、生着に依存することなく、再生及び免疫系に対する効果を促進することが示されている。言い換えれば、MSC自体が必ずしも宿主に組み込まれる訳ではなく、むしろ、MSCは、短期間でその効果を発揮し、次いで、排出される。しかし、MSCが生着してもよい。
本明細書で使用するとき、「間葉系幹細胞」又は「MSC」とは、骨髄、脂肪組織(脂肪)、胎盤、及び臍帯血を含む広範な組織から単離することができる特定の種類の幹細胞を指す。あるいは、MSCは、多能性幹細胞(PSC)から生成することもできる。MSCは、「間葉系間質細胞」としても知られている。
誤解を避けるために、本明細書で使用するとき、「副作用」は「症状」を含み、両用語は、定性的に(すなわち、どんな形であれ望ましくない)又は定量的に(特定の閾値を上回ると又は下回ると望ましくない)判定される、CAR T細胞療法の望まれていない、又は有害な作用を指す。このような症状は、効果をCAR T細胞療法の必要な又は所望の効果と区別するために「有害症状」と称されることもある。CAR T細胞療法の副作用又は症状は、「有害事象」、「免疫介在有害事象」、又は「免疫関連有害事象」と称されることもある。
PSCからのMSCの生成は、この相互参照によって全体が組み込まれる、2017年3月14日出願の国際特許出願第PCT/AU2017/050228号に記載されており、そして、実施例5及び6に記載されている。
MSCは、T細胞、B細胞、樹状細胞、マクロファージ、及びナチュラルキラー細胞に対する免疫調節活性を発揮することが示されている。理論に束縛されるものではないが、根底にある機序は、免疫調節メディエーター、例えば、一酸化窒素、インドールアミン2、3、ジオキシゲナーゼ、プロスタグランジンE2、腫瘍壊死因子誘導性遺伝子6タンパク質、CCL−2、及びプログラム死リガンド1を含み得る。これらメディエーターは、例えば、IFNγ、TNFα、及びIL−17等の炎症性サイトカインによって刺激されるまで、低レベルで発現する。
MSCは、例えば、静脈内(IV)、動脈内、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、頭蓋内、皮下(SC)、関節内、滑液包内、くも膜下腔内、冠動脈内、経心内膜、外科的移植、局所及び吸入(例えば、肺内)を含む経路によって、全身又は末梢に投与され得る。MSCは、生体適合性材料のスカフォールドと組み合わせて投与されてもよい。
一実施形態では、MSCは、投与前に前処理される。例えば、成長因子を用いて又は遺伝子編集によって前処理を行ってよく、この場合、成長因子はMSCを予備刺激することができ、遺伝子編集はMSCに新規治療特性を付与することができる。
本明細書で使用するとき、「多能性幹細胞」又は「PSC」とは、それ自体無限に再生し、任意の他の細胞型に分化する能力を有する細胞を指す。主に2種のPSCが存在する:胚幹細胞(ESC)及び人工多能性幹細胞(iPSC)。
本明細書で使用するとき、「胚幹細胞」又は「ESC」とは、体外受精療法を終了し、余剰胚を有する被験体によって同意を得て供与された5〜7日齢胚から単離された細胞を指す。ESCの使用は、ヒト胚由来の細胞の採取についての倫理上の問題がある程度妨げとなっている。
好適なヒトPSCは、H1及びH9のヒト胚幹細胞を含む。
本明細書で使用するとき、「人工多能性幹細胞」又は「iPSC」とは、成人細胞に由来するESC様細胞を指す。iPSCは、ESCと非常によく似た特徴を有するが、iPSCは胚に由来していないので、ESCに関連する倫理上の問題が回避される。その代わり、iPSCは、典型的には、「初期化」されて多能性状態に戻された、完全に分化した成人細胞に由来している。
好適なヒトiPSCとしては、線維芽細胞に由来するiPSC 19−9−7T、MIRJT6i−mND1−4、及びMIRJT7i−mND2−0、並びに骨髄単核細胞に由来するiPSC BM119−9が挙げられるが、これらに限定されない。他の好適なiPSCは、Cellular Dynamics International(CDI)(Madison,WI,USA)から入手することができる。
一実施形態では、本発明に従って使用されるMSCは、原始中胚葉細胞から形成される。原始中胚葉細胞は、間葉血管芽細胞(MCA)能を有し得る。原始中胚葉細胞は、EMHlin-KDR+APLNR+PDGFRalpha+表現型を有し得る。一実施形態では、本発明に従って使用されるMSCは、MCA能を有するEMHlin-KDR+APLNR+PDGFRalpha+原始中胚葉細胞から形成される。
本明細書で使用するとき、「MCA能を有するEMHlin-KDR+APLNR+PDGFRalpha+原始中胚葉細胞」とは、典型的な原始線条及び側板/胚外中胚葉の遺伝子を発現する細胞を指す。これら細胞は、線維芽細胞増殖因子2(FGF2)に応答して無血清培地でMCA及び血管芽細胞のコロニーを形成する能力を有する。実施例6に従って培養されるとき、これら細胞はMSCになる。
EMHlin-という用語は、CD31、VE−カドヘリン内皮細胞マーカー、CD73及びCD105間葉/内皮細胞マーカー、並びにCD43及びCD45造血細胞マーカーを発現しないことを意味する。
一実施形態では、本発明に従って使用されるMSCは、CD73+CD105+CD90+CD146+CD44+CD10+CD31−CD45−表現型を示す。
一実施形態では、本発明に従って使用されるMSCは、microRNAのmiR−145−5p、miR−181b−5p、及びmiR−214−3pのそれぞれを発現するが、miR−127−3p及びmiR−299−5pは発現しない。
MSCは、「免疫調節活性」を有し、これは、Tヘルパー(CD4+)リンパ球の増殖を抑制するMSCの能力としてインビトロで評価することができる。免疫調節活性は、例えば、免疫力アッセイを使用して判定したとき、参照物質に対してインビトロで定量することができる。
好適な免疫力アッセイは、放射線照射された試験MSC(例えば、本明細書に開示される方法に従って生成されたiPSC−MSC)及び放射線照射された参照サンプルMSCを使用し、これらを、健常ドナーの末梢血から精製された、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステルで標識された白血球と共に様々な濃度で別々にプレーティングする。参照サンプルのサブセットとなるTヘルパー(CD4+)リンパ球を、CD3及びCD28の抗体を添加することによって刺激する。CD4で標識されたT細胞をフローサイトメトリーを使用して計数して、T細胞の増殖を評価する。参照サンプルの関数としてIC50値を記録する。より大きなC50値は、Tヘルパー(CD4+)リンパ球の増殖を抑制する程度がより大きいことを示し、従って、優れたT細胞免疫調節特性の指標となる。その増殖能の交絡因子を排除するために、このアッセイで使用する前にMSCサンプルに放射線を照射する。
被験体におけるCAR T細胞療法の副作用又は症状を治療するために治療有効量のMSCを被験体に投与する正確な方法は、医師の裁量によるものであることを当業者であれば理解するであろう。用量、他の剤との併用、投与のタイミング及び頻度等を含む投与方式は、被験体の状態及び病歴によって影響を受けることがある。
MSCは、治療用組成物として投与され得る。本明細書で使用するとき、用語「治療用組成物」とは、被験体に投与するために製剤化されている、本明細書に記載されるMSC又はMSCの集団を含む組成物を指す。好ましくは、治療用組成物は滅菌されている。一実施形態では、治療用組成物はパイロジェンフリーである。
一実施形態では、治療用組成物は、容器、好ましくは滅菌容器、好ましくはパイロジェンフリー容器内で提供される。一実施形態では、容器は、例えば、ボーラス投与に好適なシリンジである。別の実施形態では、容器は、輸注に好適な輸液バッグである。
MSCは、良質の医療実施基準(good medical practice)に合致するように製剤化、調薬、及び投与される。この状況において考慮すべき要因としては、治療される障害及び予測される副作用又は症状の具体的な種類、治療される具体的な被験体、被験体の臨床状態、投与部位、投与方法、投与スケジュール、並びに医師に公知の他の要因が挙げられる。投与されるMSCの治療有効量は、このような考慮事項によって決定される。
MSCの用量は、約103細胞/m2〜約1010細胞/m2、例えば、約106細胞/m2〜約2×108細胞/m2の範囲、又は約103細胞/m2、約5×103細胞/m2、約104細胞/m2、約5×104細胞/m2、約105細胞/m2、約5×105細胞/m2、約106細胞/m2、約5×106細胞/m2、約107細胞/m2、約5×107細胞/m2、約108細胞/m2、約5×108細胞/m2、約109細胞/m2、約5×109細胞/m2、約1010細胞/m2、若しくは約5×1010細胞/m2であってよい。
MSCの用量は、約103細胞/kg〜約1010細胞/kg、例えば、約106細胞/kg〜約2×108細胞/kgの範囲、又は約103細胞/kg、約5×103細胞/kg、約104細胞/kg、約5×104細胞/kg、約105細胞/kg、約5×105細胞/kg、約106細胞/kg、約5×106細胞/kg、約107細胞/kg、約5×107細胞/kg、約108細胞/kg、約5×108細胞/kg、約109細胞/kg、約5×109細胞/kg、約1010細胞/kg、若しくは約5×1010細胞/kgであってよい。
MSCの用量は、約103細胞〜約1010細胞、例えば、約106細胞〜約2×108細胞の範囲、又は約103細胞、約5×103細胞、約104細胞、約5×104細胞、約105細胞、約5×105細胞、約106細胞、約5×106細胞、約107細胞、約5×107細胞、約108細胞、約5×108細胞、約109細胞、約5×109細胞、約1010細胞、若しくは約5×1010細胞であってよい。
MSCは、単一用量、分割用量、又は多回用量で投与してよい。
MSCは、静脈内(IV)、動脈内、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、頭蓋内、皮下(SC)、関節内、滑液包内、くも膜下腔内、冠動脈内、経心内膜、外科的移植、局所及び吸入(例えば、肺内)の経路を含む任意の好適な方法によって被験体に投与され得る。最も好ましくは、MSCはIV投与される。
MSCは、被験体がCAR T細胞療法を受ける前、受けている間、又は受けた後に投与され得る。一実施形態では、MSCは、炎症中に投与される。従って、一実施形態では、MSCは、CAR T細胞の投与後、任意選択で、炎症が始まった後、及び/又は炎症促進性サイトカインの放出が始まったか若しくは対照に比べて、例えば、CAR T細胞の投与前に比べて増加した後に投与される。理論に束縛されるものではないが、ほとんどの効果は、CAR T細胞療法を施した後にMSCを投与することによって得られると考えられる。これは、CAR T細胞療法は本質的に免疫/炎症応答であるが、一方、MSCは免疫調節及び抗炎症の効果を発揮するためである。従って、CAR T細胞療法を施す前、最中、又は後の早すぎる時点でMSCを投与すると、CAR T細胞療法の効果が弱まる場合がある。この理論にもかかわらず、本発明はそれに限定されるものではない。
しかし、この明らかな逆説は、当業者に理解され、受け入れられる。例えば、CAR T細胞療法によって引き起こされるCRSの一次治療法は免疫抑制性が高いステロイドの投与である。MSCの利点としては、例えば、ステロイドによる全身免疫抑制に比べて局所的に免疫調節する、体内に残留しない、ステロイドにも他の免疫抑制療法にも反応しない被験体に更なる防御線を提供する、ステロイドに比べて毒性が低くかつ特異性が高い、及びステロイドに比べてMSCは自己制御されることを挙げることができる。毒性の低下、特異性の上昇、及び自己制御は関連しており、自己制御とは、MSCはCAR T細胞療法の副作用又は症状の免疫応答が消失したときにその免疫調節活性を低下させる能力を有すると考えられることを意味するが、一方、ステロイドは、例えば、次の半減期でもステロイド濃度が治療濃度を下回らない場合、医師が中止しなければならない。
従って、一実施形態では、CAR T細胞の投与の約1週間後に、CAR T細胞療法を受けた被験体にMSCを投与してよい。別の実施形態では、CAR T細胞の投与の約5分間後に、CAR T細胞療法を受けた被験体にMSCを投与してよい。別の実施形態では、CAR T細胞の投与の約6日間、約5日間、約4日間、約72時間、約48時間、約36時間、約24時間、約16時間、約12時間、約8時間、約4時間、約2時間、約60分間、約45分間、約30分間、約15分間、又は約5分間後に、CAR T細胞療法を受けた被験体にMSCを投与してよい。一実施形態では、CAR T細胞療法の投与後約24時間〜約72時間以内に、CAR T細胞療法を受けた被験体にMSCを投与してよい。
一実施形態では、CAR T細胞の投与の約1週間前に、CAR T細胞療法を受ける被験体にMSCを投与してよい。別の実施形態では、CAR T細胞の投与の約5分間前に、CAR T細胞療法を受ける被験体にMSCを投与してよい。別の実施形態では、CAR T細胞の投与の約6日間、約5日間、約4日間、約72時間、約48時間、約36時間、約24時間、約16時間、約12時間、約8時間、約4時間、約2時間、約60分間、約45分間、約30分間、又は約15分間前に、CAR T細胞療法を受ける被験体にMSCを投与してよい。
別の実施形態では、CAR T細胞療法の投与とほぼ同時に又は投与中に、CAR T細胞療法を受けている被験体にMSCを投与してよい。
用語「治療有効量」とは、被験体におけるCAR T細胞療法の副作用又は症状を治療するのに有効なMSCの量を指す。
用語「治療する」、「治療している」、又は「治療」とは、治療的処理と予防的(prophylactic)又は防止的(preventative)手段とをいずれも指し、その目的は、被験体におけるCAR T細胞療法の副作用若しくは症状を予防、低減、若しくは改善するか、又は被験体におけるCAR T細胞療法の副作用若しくは症状の進行を減速(緩和)することである。治療を必要とする被験体としては、CAR T細胞療法の副作用又は症状を既に有しているものに加えて、CAR T細胞療法の副作用又は症状を予防又は改善すべきものが挙げられる。
用語「予防している」、「予防」、「防止的」、又は「予防的」とは、CAR T細胞療法の副作用又は症状が発生するのを抑えるか又は妨げる、該発生から守るか又は保護することを指す。予防を必要とする被験体は、CAR T細胞療法の副作用又は症状を発現しやすい可能性がある。
用語「改善する」又は「改善」とは、CAR T細胞療法の副作用又は症状の減少、低減、又は排除を指す。
CAR T細胞療法の副作用又は症状は、二元事象として、すなわち、有りか無しか、0か1かで定量化することができる。あるいは、CAR T細胞療法の副作用又は症状は、半定量的尺度、例えば、0〜5(0は無しを表し、1〜4は重篤度の同定可能な増大を表し、5は最高の重篤度を表す)定量化することができる。臨床試験では、多くの場合、1〜5の尺度(1は、軽度の有害事象(副作用)を表し、2は、中等度の有害事象(副作用)を表し、3は、重篤な有害事象(副作用)を表し、4は、生命を脅かすか又は日常生活に支障を来す有害事象(副作用)を表し、5は、有害事象(副作用)に関連する死を表す)が使用される。他の半定量的な尺度は、当業者に容易に明らかになるであろう。別の実施形態では、CAR T細胞療法の副作用又は症状は、定量的尺度、例えば、組織液の体積当たりのサイトカインの質量等の体積当たりの質量、温度、持続時間、速度、酵素活性、酸素飽和度等で定量化することができる。
当業者であれば、CAR T細胞療法の任意の副作用又は症状を評価及び定量する方法を容易に理解し、困難も過度の負担もなくそれを行うことができるであろう。例えば、当業者は、血漿又は血清中のサイトカイン濃度、温度(発熱)、心拍数(頻拍)、血圧(低血圧)、心機能不全、腎機能障害、血清又は血漿の酵素濃度(肝機能)等を測定することができる。
CAR T細胞療法の副作用又は症状の任意の定量結果を、対照、例えば、CAR T細胞療法を受けておらずMSCも投与されていない健常対照被験体、CAR T細胞療法で治療されたが、MSC又は集団では治療されていない罹患対照被験体と比較してよい。
MSCを投与することによるCAR T細胞療法の副作用又は症状の治療は、CAR T細胞療法の副作用又は症状を約1%減少、約2%減少、約3%減少、約4%減少、約5%減少、約6%減少、約7%減少、約8%減少、約9%減少、約10%減少、約20%減少、約30%減少、約40%減少、約50%減少、約60%減少、約70%減少、約80%減少、約90%減少、約100%、又はそれ以上減少させることであってよい。あるいは、CAR T細胞療法の副作用又は症状の治療は、CAR T細胞療法の副作用又は症状を約2倍、約3倍、約4倍、約5倍、約6倍、約7倍、約8倍、約9倍、約10倍、又はそれ以上減少させることであってもよい。
本明細書で使用するとき、用語「被験体」は、哺乳類を指し得る。哺乳類は、霊長類、特にヒトであってもよく、又は家畜、動物園の動物、若しくはコンパニオンアニマルであってもよい。本明細書に開示される方法はヒトの医学的治療に好適であることが特に意図されるが、ウマ、ウシ、及びヒツジ等の家畜、イヌ及びネコ等のコンパニオンアニマル、又はネコ科、イヌ科、ウシ科、及び有蹄動物等の動物園の動物の治療を含む獣医学的治療にも適用可能である。
以下の実施例は、本発明の説明を支援するが、本発明をこのような実施例に限定するものではない。
実施例1.CAR及びレトロウイルスベクター
これら実施例における全てのCARは、前立腺特異的膜抗原(PSMA)に特異的な、記載されている通りの(Gong,M.C.et al.Neoplasia 1,123−127(1999))J591ハイブリドーマに由来するscFvを含有している。形質導入細胞の検出を容易にするために、全てのコンストラクトは、SFGベクターに挿入された脳心筋炎ウイルス内部リボソーム侵入部位(EMCV−IRES)及びeGFP遺伝子を含有していた。Pz1では、ヒトCD8αのヒンジ及び膜貫通の配列を介してJ591のscFv(P)がヒトTCRζ(z)の細胞内ドメインに結合している(Gong et al.)。P28は、記載されている通り(Krause,A.et al.J.Exp.Med.188,619−626(1998)及びKrause,A.et al.Mol.Ther.1,S260,713(2000))、J591のscFv(P)のヒトCD28(28)への融合物を含んでいる。P28zを構築するために、プライマー5’−GGCGGCCGCAATTGAAGTTATGTATC−3’(配列番号1)及び5’−TGCGCTCCTGCTGAACTTCACTCTGGAGCGATAGGCTGCTAAGTCGCG−3 配列番号2)を使用して、CD28のヌクレオチド336〜660を増幅した。プライマー5’−AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCA−3’(配列番号3)及び5’−CTCGAGTGGCTGTTAGCCAGA−3’(配列番号4)を使用して、TCRζの細胞内ドメインを増幅した。生成物を、配列番号1及び4のプライマーによって駆動される別個のPCR反応において融合させ、TaqポリメラーゼでAテールを付加し、NotI/XhoIリガメントとしてSFG−Pz1にサブクローニングした。Pz28を作製するために、5’−GCACTTCACATGCAGGCTCTGCCACCTCGCAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCAC−3’(配列番号5)及び5’−CGCTCGAGTCAGGAGCGATAGGCTGCGAAGTCGCGT−3’(配列番号6)(シトシンリピートに割り込むように導入された2つのサイレント突然変異に下線を引く)を使用してCD28の細胞内ドメインを増幅した。得られたPCR生成物は、TCRζの末端の9つのコドン(終止コドンを除く)をCD28の細胞内ドメインに融合させたものを表し、便利な5’NspI部位を含有している。この断片をサブクローニングし、NspI/XhoIで切断し、SFG−Pz1にライゲーションした。SFG−c−fmsは、ヒトマクロファージコロニー刺激因子受容体をコードしている。これによって、TCRζ及び/又はCD28に由来するシグナル伝達エレメントにカップリングしているPSMA特異的scFv断片を含む一連の受容体が得られた。Pz1及びP28は、それぞれPSMA依存的にシグナルを伝達するように設計されている。P28zでは、TCRζの細胞内部分がP28のC末端に連結されているが、Pz28では、Pz1のC末端にCD28シグナル伝達ドメインが付加された。全てのキメラ相補的DNA(cDNA)を、高感度緑色蛍光タンパク質の上流のバイシストロニックなオンコ−レトロウイルスベクターにクローニングした。
これら実施例における全てのCARは、前立腺特異的膜抗原(PSMA)に特異的な、記載されている通りの(Gong,M.C.et al.Neoplasia 1,123−127(1999))J591ハイブリドーマに由来するscFvを含有している。形質導入細胞の検出を容易にするために、全てのコンストラクトは、SFGベクターに挿入された脳心筋炎ウイルス内部リボソーム侵入部位(EMCV−IRES)及びeGFP遺伝子を含有していた。Pz1では、ヒトCD8αのヒンジ及び膜貫通の配列を介してJ591のscFv(P)がヒトTCRζ(z)の細胞内ドメインに結合している(Gong et al.)。P28は、記載されている通り(Krause,A.et al.J.Exp.Med.188,619−626(1998)及びKrause,A.et al.Mol.Ther.1,S260,713(2000))、J591のscFv(P)のヒトCD28(28)への融合物を含んでいる。P28zを構築するために、プライマー5’−GGCGGCCGCAATTGAAGTTATGTATC−3’(配列番号1)及び5’−TGCGCTCCTGCTGAACTTCACTCTGGAGCGATAGGCTGCTAAGTCGCG−3 配列番号2)を使用して、CD28のヌクレオチド336〜660を増幅した。プライマー5’−AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCA−3’(配列番号3)及び5’−CTCGAGTGGCTGTTAGCCAGA−3’(配列番号4)を使用して、TCRζの細胞内ドメインを増幅した。生成物を、配列番号1及び4のプライマーによって駆動される別個のPCR反応において融合させ、TaqポリメラーゼでAテールを付加し、NotI/XhoIリガメントとしてSFG−Pz1にサブクローニングした。Pz28を作製するために、5’−GCACTTCACATGCAGGCTCTGCCACCTCGCAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCAC−3’(配列番号5)及び5’−CGCTCGAGTCAGGAGCGATAGGCTGCGAAGTCGCGT−3’(配列番号6)(シトシンリピートに割り込むように導入された2つのサイレント突然変異に下線を引く)を使用してCD28の細胞内ドメインを増幅した。得られたPCR生成物は、TCRζの末端の9つのコドン(終止コドンを除く)をCD28の細胞内ドメインに融合させたものを表し、便利な5’NspI部位を含有している。この断片をサブクローニングし、NspI/XhoIで切断し、SFG−Pz1にライゲーションした。SFG−c−fmsは、ヒトマクロファージコロニー刺激因子受容体をコードしている。これによって、TCRζ及び/又はCD28に由来するシグナル伝達エレメントにカップリングしているPSMA特異的scFv断片を含む一連の受容体が得られた。Pz1及びP28は、それぞれPSMA依存的にシグナルを伝達するように設計されている。P28zでは、TCRζの細胞内部分がP28のC末端に連結されているが、Pz28では、Pz1のC末端にCD28シグナル伝達ドメインが付加された。全てのキメラ相補的DNA(cDNA)を、高感度緑色蛍光タンパク質の上流のバイシストロニックなオンコ−レトロウイルスベクターにクローニングした。
実施例2.初代ヒトT細胞の培養及びレトロウイルス形質導入
RPMI+10%(vol/vol)ヒト血清中で健常ドナー由来の末梢血単核細胞を樹立し、植物性血球凝集素(2μg/mL)で2日間活性化し、レトロネクチン(15μg/mL;Takara Biomedicals,Shiga,Japan)でプレコーティングされた非組織培養プレート(FALCON,Becton Dickinson,Franklin Lakes,N.J.)に移した。記載されている通り(Gallardo,H.F.et al.Blood 90,952−957(1997)及びRiviere,I.et al.Mol.Biotechnol.15,133−142(2000))、CARコンストラクトを含むテナガザル白血病ウイルスエンベロープ偽型レトロウイルス粒子を作製した。
RPMI+10%(vol/vol)ヒト血清中で健常ドナー由来の末梢血単核細胞を樹立し、植物性血球凝集素(2μg/mL)で2日間活性化し、レトロネクチン(15μg/mL;Takara Biomedicals,Shiga,Japan)でプレコーティングされた非組織培養プレート(FALCON,Becton Dickinson,Franklin Lakes,N.J.)に移した。記載されている通り(Gallardo,H.F.et al.Blood 90,952−957(1997)及びRiviere,I.et al.Mol.Biotechnol.15,133−142(2000))、CARコンストラクトを含むテナガザル白血病ウイルスエンベロープ偽型レトロウイルス粒子を作製した。
マイトジェン活性化PBLの形質導入の3日間後、遺伝子導入効率は20%〜70%の範囲であった。CD4+及びCD8+のT細胞サブセットも同様の効率で形質導入された。また、融合受容体を含有するζ鎖の発現をウエスタンブロッティングによって分析したところ、ホモダイマーの形成と、存在したとしてもわずかではあるが内因性のCD8又はCD28とのヘテロダイマー形成が確認された。P28z及びPz28の受容体はいずれも、ヒトPSMAを発現している線維芽細胞の特異的溶解を媒介したが、P28は媒介しなかった。PSMA、Pz1、P28z、及びPz28を発現しているNIH3T3細胞においてT細胞を刺激したとき、PSMA及びB7.1の存在下でIL−2の分泌が誘発された。共刺激リガンドが存在しない場合、P28zが形質導入されたT細胞の培養物においてのみIL−2の生成が観察された。PSMAのみを発現しているNIH3T3細胞によって刺激された場合、Pz1を発現しているT細胞の増幅が制限された。Pz28が形質導入された細胞もあまり増殖しなかった。対照的に、P28zが形質導入されたT細胞は一貫して増殖し、PSMA+線維芽細胞単層上で7日間共培養した後、P28zを発現しているT細胞はPSMA+標的を特異的に溶解する能力を保持していた。
実施例3.CD19特異的scFv
CD19特異的scFvを構築するために、記載されている(Orlandi et.al.Proc Natl Acad Sci USA 86,3833−3837(1989))縮重プライマーを使用して、ハイブリドーマ細胞株SJ25C1から重鎖(VH)及び軽鎖(VL)の可変領域をクローニングした。これらのコード領域を、(Gly3Ser)4スペーサ領域をコードしているDNA断片と融合させた。膜貫通及び細胞外の部分(配列番号7)を得られたscFvの3’末端に、そして、ヒト−ζの細胞質ドメイン(配列番号8)をCD28部分の3’末端にライゲーションすることを含む、ヒトCD28由来の共刺激シグナル伝達エレメントのライゲーションを行って、融合遺伝子19−28zを形成した。
CD19特異的scFvを構築するために、記載されている(Orlandi et.al.Proc Natl Acad Sci USA 86,3833−3837(1989))縮重プライマーを使用して、ハイブリドーマ細胞株SJ25C1から重鎖(VH)及び軽鎖(VL)の可変領域をクローニングした。これらのコード領域を、(Gly3Ser)4スペーサ領域をコードしているDNA断片と融合させた。膜貫通及び細胞外の部分(配列番号7)を得られたscFvの3’末端に、そして、ヒト−ζの細胞質ドメイン(配列番号8)をCD28部分の3’末端にライゲーションすることを含む、ヒトCD28由来の共刺激シグナル伝達エレメントのライゲーションを行って、融合遺伝子19−28zを形成した。
NALM6 T細胞を注射したマウスにおける腫瘍成長を低減し、生存を強化する能力について、19−28z融合物を試験した。NALM6細胞は、CD19、MHC I、及びMHC IIを発現するが、B7.1もB7.2も発現しない。大部分の(〜80%)の未処理SCID−Beigeマウスは、腫瘍細胞を注射した4〜5週間後に後肢麻痺を発症し、残りのマウスは、体重減少及び/又は他のCNS症状(すなわち、前庭症状)を発症する。19−28z融合物が存在する場合、T細胞刺激はほぼ10倍に増強され、当該マウスのうちの何匹かは、Pz1(PSMA特異的コンストラクト)又は共刺激シグナル伝達エレメントを有しないCD19特異的コンストラクトである19z1で処理されたマウスと比べて生存期間が大きく延長された。
実施例4.CD19特異的CAR
実施例1の方法を使用して、CD19結合エレメント、共刺激領域としての4−1BB(CD137)、及びCD3ζ鎖の細胞内ドメインをこの順序で含むCARを調製する。CD19のscFv及びゼータ鎖の部分へのライゲーションを促進するために、以下のプライマー:GCGGCCGCA−CCATCTCCAGCCGAC 配列番号9)及びCTTCACTCT−CAGTTCACATCCTTC 配列番号10)を使用して4−1BBを増幅して、制限酵素切断部位を有するCD19のscFv及びゼータテールを含む4−1BBアンプリコンを作製する。配列におけるハイフンは、4−1BB配列から該テールへの移行を示す。同じ配列で終わるPSMA等の他の結合エレメントについても同じプライマーを使用することができる。
実施例1の方法を使用して、CD19結合エレメント、共刺激領域としての4−1BB(CD137)、及びCD3ζ鎖の細胞内ドメインをこの順序で含むCARを調製する。CD19のscFv及びゼータ鎖の部分へのライゲーションを促進するために、以下のプライマー:GCGGCCGCA−CCATCTCCAGCCGAC 配列番号9)及びCTTCACTCT−CAGTTCACATCCTTC 配列番号10)を使用して4−1BBを増幅して、制限酵素切断部位を有するCD19のscFv及びゼータテールを含む4−1BBアンプリコンを作製する。配列におけるハイフンは、4−1BB配列から該テールへの移行を示す。同じ配列で終わるPSMA等の他の結合エレメントについても同じプライマーを使用することができる。
実施例1の方法を使用して、CD19結合エレメント、共刺激領域としてのICOS、及びCD3ζ鎖の細胞内ドメインをこの順序で含むCARを調製する。CD19のscFv及びゼータ鎖の部分へのライゲーションを促進するために、以下のプライマー:GCGGCCGCA−CTATCAATTTTTGATCCT 配列番号11)及びCTTCACTCT−TAGGGTCACATCTGTGAG 配列番号12)を使用してICOSを増幅して、制限酵素切断部位を有するCD19のscFv及びゼータテールを含むICOSアンプリコンを作製する。配列におけるハイフンは、ICOS配列から該テールへの移行を示す。同じ配列で終わるPSMA等の他の結合エレメントについても同じプライマーを使用することができる。
実施例1の方法を使用して、CD19結合エレメント、共刺激領域としてのDAP−10、及びCD3ζ鎖の細胞内ドメインをこの順序で含むCARを調製する。CD19のscFv及びゼータ鎖の部分へのライゲーションを促進するために、以下のプライマー:GCGGCCGCA−CAGACGACCCCAGGA(配列番号13)及びCTTCACTCT−GCCCCTGCCTGGCATG(配列番号14)を使用してDAP−10を増幅して、制限酵素切断部位を有するCD19のscFv及びゼータテールを含むDAP−10アンプリコンを作製する。配列におけるハイフンは、DAP−10配列から該テールへの移行を示す。同じ配列で終わるPSMA等の他の結合エレメントについても同じプライマーを使用することができる。
実施例5.MSCを生成するための試薬
表1に列挙した試薬は、当業者に公知であり、例えば、IMDM及びハムF12等の認められている組成を有する。GLUTAMAXは、通常0.85%NaCl中200mMで供給されるL−アラニル−L−グルタミンジペプチドを含む。GLUTAMAXは、培養されている細胞によってジペプチド結合が切断されたときにL−グルタミンを放出する。既知組成脂質濃縮物は、2mg/L アラキドン酸、220mg/L コレステロール、70mg/L DL−アルファ−トコフェロール酢酸エステル、10mg/L リノール酸、10mg/L リノレン酸、10mg/L ミリスチン酸、10mg/L オレイン酸、10mg/L パルミチン酸、10mg/L パルミトレイン酸、90g/L pluronic F−68、10mg/L ステアリン酸、2.2g/L TWEEN 80(登録商標)、及びエチルアルコールを含む。H−1152及びY27632は、非常に強力で、細胞透過性である選択的ROCK(Rho結合コイルドコイル形成タンパク質セリン/トレオニンキナーゼ)阻害剤である。
実施例6.ヒトPSCをMSCに分化させるためのプロトコール
1. ビトロネクチンでコーティングされた(0.5μg/ckg)プラスチックの器において、E8完全培地(DMEM/F12基本培地+E8サプリメント)+1μM H1152中でiPSCを解凍した。37℃、5%CO2、20%O2(正常酸素圧)で、プレーティングしたiPSCをインキュベートした。
2. ビトロネクチンでコーティングされた(0.5μg/ckg)プラスチックの器において、E8完全培地(ROCK阻害剤を含まない)中で3回継代してiPSCを増幅し、37℃、5%CO2、20%O2(正常酸素圧)でインキュベートした後、分化プロセスを開始させた。
3. iPSCを回収し、IV型コラーゲンでコーティングされた(0.5μg/ckg)プラスチックの器において、E8完全培地+10μM Y27632中に5×103細胞/ckgで単細胞/小コロニーとして播種し、37℃、5%CO2、20%O2(正常酸素圧)で24時間インキュベートした。
4. E8完全培地+10μM Y27632を分化培地に交換し、37℃、5%CO2、5%O2(低酸素)で48時間インキュベートして、原始中胚葉細胞を生成した。
5. 単細胞懸濁液として分化培地接着培養物からコロニー形成原始中胚葉細胞を回収し、M−CFM懸濁培養液に移し、間葉系コロニーが形成されるまで、37℃、5%CO2、20%O2(正常酸素圧)で12日間インキュベートした。
6. 間葉系コロニーを回収し、フィブロネクチン/I型コラーゲンでコーティングされた(0.67μg/ckg フィブロネクチン、1.2μg/ckg I型コラーゲン)プラスチックの器において、M−SFEM中に播種し、37℃、5%CO2、20%O2(正常酸素圧)で3日間インキュベートして、MSC(継代数0)を生成した。
7. コロニーを回収し、フィブロネクチン/1型コラーゲンでコーティングされたプラスチックの器において、M−SFEM中に1.3×104細胞/ckgで単細胞として播種し(継代数1)、37℃、5%CO2、20%O2(正常酸素圧)で3日間インキュベートした。
8. 回収し、フィブロネクチン/1型コラーゲンでコーティングされたプラスチックの器において、M−SFEM中に1.3×104細胞/ckgで単細胞として播種し(継代数2)、37℃、5%CO2、20%O2(正常酸素圧)で3日間インキュベートした。
9. 回収し、フィブロネクチン/1型コラーゲンでコーティングされたプラスチックの器において、M−SFEM中に1.3×104細胞/ckgで単細胞として播種し(継代数3)、37℃、5%CO2、20%O2(正常酸素圧)で3日間インキュベートした。
10. 回収し、フィブロネクチン/1型コラーゲンでコーティングされたプラスチックの器において、M−SFEM中に1.3×104細胞/ckgで単細胞として播種し(継代数4)、37℃、5%CO2、20%O2(正常酸素圧)で3日間インキュベートした。
11. 回収し、フィブロネクチン/1型コラーゲンでコーティングされたプラスチックの器において、M−SFEM中に1.3×104細胞/ckgで単細胞として播種し(継代数5)、37℃、5%CO2、20%O2(正常酸素圧)で3日間インキュベートした。
12. 単細胞として回収し、最終生成物を冷凍した。
1. ビトロネクチンでコーティングされた(0.5μg/ckg)プラスチックの器において、E8完全培地(DMEM/F12基本培地+E8サプリメント)+1μM H1152中でiPSCを解凍した。37℃、5%CO2、20%O2(正常酸素圧)で、プレーティングしたiPSCをインキュベートした。
2. ビトロネクチンでコーティングされた(0.5μg/ckg)プラスチックの器において、E8完全培地(ROCK阻害剤を含まない)中で3回継代してiPSCを増幅し、37℃、5%CO2、20%O2(正常酸素圧)でインキュベートした後、分化プロセスを開始させた。
3. iPSCを回収し、IV型コラーゲンでコーティングされた(0.5μg/ckg)プラスチックの器において、E8完全培地+10μM Y27632中に5×103細胞/ckgで単細胞/小コロニーとして播種し、37℃、5%CO2、20%O2(正常酸素圧)で24時間インキュベートした。
4. E8完全培地+10μM Y27632を分化培地に交換し、37℃、5%CO2、5%O2(低酸素)で48時間インキュベートして、原始中胚葉細胞を生成した。
5. 単細胞懸濁液として分化培地接着培養物からコロニー形成原始中胚葉細胞を回収し、M−CFM懸濁培養液に移し、間葉系コロニーが形成されるまで、37℃、5%CO2、20%O2(正常酸素圧)で12日間インキュベートした。
6. 間葉系コロニーを回収し、フィブロネクチン/I型コラーゲンでコーティングされた(0.67μg/ckg フィブロネクチン、1.2μg/ckg I型コラーゲン)プラスチックの器において、M−SFEM中に播種し、37℃、5%CO2、20%O2(正常酸素圧)で3日間インキュベートして、MSC(継代数0)を生成した。
7. コロニーを回収し、フィブロネクチン/1型コラーゲンでコーティングされたプラスチックの器において、M−SFEM中に1.3×104細胞/ckgで単細胞として播種し(継代数1)、37℃、5%CO2、20%O2(正常酸素圧)で3日間インキュベートした。
8. 回収し、フィブロネクチン/1型コラーゲンでコーティングされたプラスチックの器において、M−SFEM中に1.3×104細胞/ckgで単細胞として播種し(継代数2)、37℃、5%CO2、20%O2(正常酸素圧)で3日間インキュベートした。
9. 回収し、フィブロネクチン/1型コラーゲンでコーティングされたプラスチックの器において、M−SFEM中に1.3×104細胞/ckgで単細胞として播種し(継代数3)、37℃、5%CO2、20%O2(正常酸素圧)で3日間インキュベートした。
10. 回収し、フィブロネクチン/1型コラーゲンでコーティングされたプラスチックの器において、M−SFEM中に1.3×104細胞/ckgで単細胞として播種し(継代数4)、37℃、5%CO2、20%O2(正常酸素圧)で3日間インキュベートした。
11. 回収し、フィブロネクチン/1型コラーゲンでコーティングされたプラスチックの器において、M−SFEM中に1.3×104細胞/ckgで単細胞として播種し(継代数5)、37℃、5%CO2、20%O2(正常酸素圧)で3日間インキュベートした。
12. 単細胞として回収し、最終生成物を冷凍した。
M−CFMにPDGF−BB(10ng/mL)及び/又はLiCl(1mM)を補給することのiPSC−MSCのT細胞抑制に対する影響について調べるために、2つの実験(TC−A−96及びDAD−V−90)を実施した。Waisman Biomanufacturingの免疫力アッセイ(ImmunoPotency Assay)(IPA)を使用して生じたT細胞抑制を評価した。
表7に概説する通り、以下の血小板由来の成長因子(PDGF)及びLiClの組み合わせを評価した:PDGF+/LiCl+、PDGF−/LiCl−、PDGF+/LiCl−、及びPDGF−/LiCl+。2つの異なるDneg1播種密度(5×103細胞/ckg及び1×104細胞/ckg)及び分化培地中における2つの異なるアクチビンA(AA)濃度(1×AA=15ng/mL及び0.1×AA=1.5ng/mL)をTC−A−96実験で比較したことに留意すべきである。DAD−V−90実験では1つのDneg1播種密度(5×10e3細胞/ckg)及びアクチビンA濃度(1.5ng/mL)を使用した。また、第1のIPA(IPA1)では1つのロイコパック(LPK7)を使用し、第2のIPA(IPA2)では2つのロイコパック(LPK7及びLPK8)を使用した。
このアッセイは、各MSC株がTヘルパー(CD4+)リンパ球の増殖を抑制することができる程度を評価するように設計される。健常個体の末梢血から精製された凍結保存白血球(ロイコパック(LPK)に由来する末梢血単核細胞(PBMC))を使用して、凍結保存MSCを試験した。従って、ドナー間でLPK細胞集団がばらつくことが予測される。研究グレードの材料について1つのPMBCサンプルに試験を限定することを選択肢にしつつ、臨床グレードの材料について2人の異なる個体に由来するPMBCに対して各MSC試験サンプルを試験した。アッセイの整合性/再現性を確保し、試験サンプルを正規化するために、参照標準MSC株と併せて各MSC試験サンプルについてのアッセイを実施した。このアッセイは、Bloom et al.Cytotherapy,2015,17(2):140−51に記載されている。
簡潔に述べると、試験MSCを21Gyのガンマ線照射に曝露した。48ウェル組織培養プレートにおいて、4×10e5、2×10e5、4×10e4、及び2×10e4個の放射線照射されたMSCを個々のウェルにプレーティングした。PMBCをカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステルで別々に標識した。標識されたPMBC細胞を、上記MSCを含むウェル当たり4×105細胞でプレーティングする。これによって、PBMC:MSC比は1:1、1:0.5、1:0.1、及び1:0.05に用量設定される。更なるウェルには刺激されたPBMCのみをプレーティングし、別のウェルにはMSCのみをプレーティングし、更に別のウェルには刺激せずに1:0.05比でプレーティングし、これらは全て対照として役割を果たす。続いて、T細胞刺激性モノクローナル抗体である抗ヒトCD3−イプシロン(epilson)及び抗ヒトCD28(R&D Systems,Inc.,Minneapolis,MN)を各ウェルに添加した。
培養4日目、個々のウェルから細胞を回収した。各ウェルからの細胞を、アロフィコシアニンで標識された抗ヒトCD4と共にインキュベートした。次いで、フローサイトメーターを使用してカルボキシフルオレセイン強度を介して、CD4+細胞を増殖について分析した。MSCのみの対照は、共培養ウェルからMSCをゲートして除くことに役立った。PBMCのみの対照は、最大のT細胞増殖についてのポジティブコントロールとしての役割を果たし、それに対するMSCが媒介した抑制の程度を測定する。刺激されていない1:0.05比のウェルは、ネガティブコントロールのゲートを作製するために使用され、それに対する増殖を測定した。
試験サンプル比から、最良適合曲線を使用してIC50値を得た。IC50値を参照標準に対して正規化した(IC50参照標準/IC50試験サンプル)。この正規化されたIC50は、より作用の強い(より抑制性の高い)サンプルについてはより大きな値が得られ、より作用の弱いサンプルについてはより小さな値が得られる。
結果
表7に提示するIC50のデータは、免疫調節性であるiPSC−MSCを生成するために、分化しているiPSCにとって、LiClを補給したが、PDGFは含まない(すなわち、PDGF−/LiCl+)M−CFMが最適であったことを示す。更に、より低濃度のアクチビンAもiPSC−MSCの免疫抑制を改善した。
表7に提示するIC50のデータは、免疫調節性であるiPSC−MSCを生成するために、分化しているiPSCにとって、LiClを補給したが、PDGFは含まない(すなわち、PDGF−/LiCl+)M−CFMが最適であったことを示す。更に、より低濃度のアクチビンAもiPSC−MSCの免疫抑制を改善した。
この実施例に従って生成されたMSCは、CD73+CD105+CD90+CD146+CD44+CD10+CD31−CD45−表現型を示す。
実施例7.MSCマイクロRNA分析
実施例6に従って生成されたMSCを、1194個のmiRNA、及びmiR−127−3p、miR−145−5p、miR−181b−5p、miR−214−3p、miR−299−5pからなる独自のmiRNAパネルを含むマイクロRNA(miRNA)アイクロアレイに対する分析に供し、71個のMSCサンプル及び94個の非MSCサンプルに対して検証した。
実施例6に従って生成されたMSCを、1194個のmiRNA、及びmiR−127−3p、miR−145−5p、miR−181b−5p、miR−214−3p、miR−299−5pからなる独自のmiRNAパネルを含むマイクロRNA(miRNA)アイクロアレイに対する分析に供し、71個のMSCサンプル及び94個の非MSCサンプルに対して検証した。
実施例6に従って生成されたMSCは、miR−145−5p、miR−181b−5p、及びmiR−214−3pのそれぞれを発現したが、miR−127−3p及びmiR−299−5pは発現しなかった。
実施例8.別の免疫力アッセイ1
MSCの免疫力を以下の通り評価する:様々なドナー由来のヒトPBMCをリン酸緩衝生理食塩水にプールし(個体間の免疫応答のばらつきを最小化するため)、2×107PBMC/mLの細胞密度で、暗条件下において37℃で15分間、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル(CFSE、2μM)で染色した。10%ヒト血液型AB血清を補給したRPMI−1640培地を等量添加することによって、反応を停止させる。次いで、10%のプールされたヒト血小板溶解物、2IU/mL 防腐剤不含ヘパリン(Biochrom)、2mM L−グルタミン、10mM(4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジンエタンスルホン酸)(HEPES;Gibco)、100IU/mL ペニシリン(Sigma)、及び100μg/mL ストレプトマイシン(Sigma)を補給したRPMI−1640培地に再懸濁させた、CFSEで標識されたPBMC3×105個を、96ウェル平底プレート(Corning)の1ウェルごとにトリプリケートでプレーティングする。Gallios10色フローサイトメーター及びKaluza G1.0ソフトウェア(いずれもCoulter)を使用して、T細胞の増殖を判定する。生存している、7−アミノアクチノマイシン−D(7−AAD−;BD Pharmingen)を排除しているCD3−APC+(eBioscience)T細胞を4〜7日間後に分析する。Modfit 4.1ソフトウェア(Verity)を使用して、増殖動態及び集団分布を分析する。
MSCの免疫力を以下の通り評価する:様々なドナー由来のヒトPBMCをリン酸緩衝生理食塩水にプールし(個体間の免疫応答のばらつきを最小化するため)、2×107PBMC/mLの細胞密度で、暗条件下において37℃で15分間、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル(CFSE、2μM)で染色した。10%ヒト血液型AB血清を補給したRPMI−1640培地を等量添加することによって、反応を停止させる。次いで、10%のプールされたヒト血小板溶解物、2IU/mL 防腐剤不含ヘパリン(Biochrom)、2mM L−グルタミン、10mM(4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジンエタンスルホン酸)(HEPES;Gibco)、100IU/mL ペニシリン(Sigma)、及び100μg/mL ストレプトマイシン(Sigma)を補給したRPMI−1640培地に再懸濁させた、CFSEで標識されたPBMC3×105個を、96ウェル平底プレート(Corning)の1ウェルごとにトリプリケートでプレーティングする。Gallios10色フローサイトメーター及びKaluza G1.0ソフトウェア(いずれもCoulter)を使用して、T細胞の増殖を判定する。生存している、7−アミノアクチノマイシン−D(7−AAD−;BD Pharmingen)を排除しているCD3−APC+(eBioscience)T細胞を4〜7日間後に分析する。Modfit 4.1ソフトウェア(Verity)を使用して、増殖動態及び集団分布を分析する。
実施例9.別の免疫力アッセイ2
MSCの免疫力を以下の通り評価する:製造業者の指示書に従ってTヘルパー(CD4+)リンパ球をCellTrace violet(CTV;Invitrogen)で染色し、次いで、96ウェルU底プレートにおいて、5:1のT細胞/ビーズ比で、抗CD3/CD28でコーティングされたビーズ(Dynabeads,Invitrogen)によって刺激する。次いで、レスポンダーCD4 T細胞を、参照標準としての放射線照射(100Gy)されたKarpas299細胞(K299細胞;Sigma)又はMSCと共にインキュベートする。共培養された細胞を、37℃、5%CO2で72時間、RPMI−1640培地中においてインキュベートする。次いで、該細胞をアネキシンV結合バッファ(BD Biosciences)で洗浄し、暗条件下、室温で15分間、アネキシンV−フルオレセインイソチオシアネート又はAPC(BD Biosciences)で染色する。このインキュベート後、該細胞をヨウ化プロピジウム(PI)(Molecular Probes)で染色し、次いで、LSRII Fortessa(BD Biosciences)において直ちにデータを取得する。収集されたデータをFlowJoソフトウェア(バージョン8.8.6;Tree Star)を使用して分析する。アネキシンV陰性かつPI陰性のT細胞集団によって生存率を測定する。この生存細胞の集団をCTVdim(増殖%)について分析する。以下の等式を用いてT細胞集団の抑制を計算する:抑制%=100−(a/b×100)(式中、aはサプレッサー細胞の存在下における増殖率であり、bはサプレッサー細胞の非存在下における増殖率である)。
MSCの免疫力を以下の通り評価する:製造業者の指示書に従ってTヘルパー(CD4+)リンパ球をCellTrace violet(CTV;Invitrogen)で染色し、次いで、96ウェルU底プレートにおいて、5:1のT細胞/ビーズ比で、抗CD3/CD28でコーティングされたビーズ(Dynabeads,Invitrogen)によって刺激する。次いで、レスポンダーCD4 T細胞を、参照標準としての放射線照射(100Gy)されたKarpas299細胞(K299細胞;Sigma)又はMSCと共にインキュベートする。共培養された細胞を、37℃、5%CO2で72時間、RPMI−1640培地中においてインキュベートする。次いで、該細胞をアネキシンV結合バッファ(BD Biosciences)で洗浄し、暗条件下、室温で15分間、アネキシンV−フルオレセインイソチオシアネート又はAPC(BD Biosciences)で染色する。このインキュベート後、該細胞をヨウ化プロピジウム(PI)(Molecular Probes)で染色し、次いで、LSRII Fortessa(BD Biosciences)において直ちにデータを取得する。収集されたデータをFlowJoソフトウェア(バージョン8.8.6;Tree Star)を使用して分析する。アネキシンV陰性かつPI陰性のT細胞集団によって生存率を測定する。この生存細胞の集団をCTVdim(増殖%)について分析する。以下の等式を用いてT細胞集団の抑制を計算する:抑制%=100−(a/b×100)(式中、aはサプレッサー細胞の存在下における増殖率であり、bはサプレッサー細胞の非存在下における増殖率である)。
実施例10.ALLについてのCAR T細胞療法の副作用の発生率の低下
難治性ALL被験体を2群に分け、CD19に特異的な自家CAR T細胞を各群にIV注入する。CD19 CARをコードしているレンチウイルスベクターで該CAR T細胞に形質導入する。体重1キログラム当たり0.76×106〜20.6×106個のCD19 CAR T細胞の用量を被験体に注入する。応答、毒性、及び副作用、並びに循環CD19 CAR T細胞の増幅及び持続性について患者をモニタリングする。
難治性ALL被験体を2群に分け、CD19に特異的な自家CAR T細胞を各群にIV注入する。CD19 CARをコードしているレンチウイルスベクターで該CAR T細胞に形質導入する。体重1キログラム当たり0.76×106〜20.6×106個のCD19 CAR T細胞の用量を被験体に注入する。応答、毒性、及び副作用、並びに循環CD19 CAR T細胞の増幅及び持続性について患者をモニタリングする。
CD19 CAR T細胞を注入した後3時間以内に、1群の被験体に1×106〜1×107個のMSCをIV注入する。
被験体の約90%でALLの完全寛解が予測される。CD19 CAR T細胞は、増殖し、応答被験体の血液、骨髄、及び脳脊髄液において検出可能になると予測される。ALLの持続的寛解が予測され、推定6ヶ月無再発生存率は約67%、推定全生存率は約80%である。
MSCを注入しない全ての被験体は、CRSを発症すると予測される。この群の被験体の約25%は、重篤なCRSを発症すると予測され、これはトシリズマブで治療される。
MSCを注入する全ての被験体は、MSCで治療されない被験体と比べて症状の重篤度の低下として示される、CRSの低減を示すと予測される。この群の被験体は、より少なくかつより重篤度が低い、CRS以外の副作用も示すと予測される。
実施例11.ALLについてのCAR T細胞療法の副作用の治療
難治性ALL被験体を2群に分け、CD19に特異的な自家CAR T細胞を各群にIV注入する。CD19 CARをコードしているレンチウイルスベクターで該CAR T細胞に形質導入する。体重1キログラム当たり0.76×106〜20.6×106個のCD19 CAR T細胞の用量を被験体に注入する。応答、毒性、及び副作用、並びに循環CD19 CAR T細胞の増幅及び持続性について患者をモニタリングする。
難治性ALL被験体を2群に分け、CD19に特異的な自家CAR T細胞を各群にIV注入する。CD19 CARをコードしているレンチウイルスベクターで該CAR T細胞に形質導入する。体重1キログラム当たり0.76×106〜20.6×106個のCD19 CAR T細胞の用量を被験体に注入する。応答、毒性、及び副作用、並びに循環CD19 CAR T細胞の増幅及び持続性について患者をモニタリングする。
CD19 CAR T細胞を注入した24〜72時間後に、1×106〜1×107個のMSCを1群の被験体にIV注入する。
被験体の約90%でALLの完全寛解が予測される。CD19 CAR T細胞は、増殖し、応答被験体の血液、骨髄、及び脳脊髄液において検出可能になると予測される。ALLの持続的寛解が予測され、推定6ヶ月無再発生存率は約67%、推定全生存率は約80%である。
MSCを注入しない全ての被験体は、CRSを発症すると予測される。この群の被験体の約25%は、重篤なCRSを発症すると予測され、これはトシリズマブで治療される。
MSCを注入する全ての被験体は、MSCで治療されない被験体と比べて症状の重篤度の低下として示される、CRSの低減を示すと予測される。この群の被験体は、より少なくかつより重篤度が低い、CRS以外の副作用も示すと予測される。
実施例12.CLLについてのCAR T細胞療法の副作用の発生率の低下
難治性CLLの被験体を実施例10に従って治療する。MSCなしで治療されたALL被験体に対するMSCで治療されたALL被験体における改善と比べて、同一ではないが同様な、MSCなしで治療されたCLL被験体に対するMSCで治療されたCLL被験体における改善が期待される。
難治性CLLの被験体を実施例10に従って治療する。MSCなしで治療されたALL被験体に対するMSCで治療されたALL被験体における改善と比べて、同一ではないが同様な、MSCなしで治療されたCLL被験体に対するMSCで治療されたCLL被験体における改善が期待される。
実施例13.CLLについてのCAR T細胞療法の副作用の治療
難治性CLLの被験体を実施例11に従って治療する。MSCなしで治療されたALL被験体に対するMSCで治療されたALL被験体における改善と比べて、同一ではないが同様な、MSCなしで治療されたCLL被験体に対するMSCで治療されたCLL被験体における改善が期待される。
難治性CLLの被験体を実施例11に従って治療する。MSCなしで治療されたALL被験体に対するMSCで治療されたALL被験体における改善と比べて、同一ではないが同様な、MSCなしで治療されたCLL被験体に対するMSCで治療されたCLL被験体における改善が期待される。
実施例14.NHLについてのCAR T細胞療法の副作用の発生率の低下
NHLの被験体を実施例10に従って治療する。MSCなしで治療されたALL被験体に対するMSCで治療されたALL被験体における改善と比べて、同一ではないが同様な、MSCなしで治療されたNHL被験体に対するMSCで治療されたNHL被験体における改善が期待される。
NHLの被験体を実施例10に従って治療する。MSCなしで治療されたALL被験体に対するMSCで治療されたALL被験体における改善と比べて、同一ではないが同様な、MSCなしで治療されたNHL被験体に対するMSCで治療されたNHL被験体における改善が期待される。
実施例15.NHLについてのCAR T細胞療法の副作用の治療
NHLの被験体を実施例11に従って治療する。MSCなしで治療されたALL被験体に対するMSCで治療されたALL被験体における改善と比べて、同一ではないが同様な、MSCなしで治療されたNHL被験体に対するMSCで治療されたNHL被験体における改善が期待される。
NHLの被験体を実施例11に従って治療する。MSCなしで治療されたALL被験体に対するMSCで治療されたALL被験体における改善と比べて、同一ではないが同様な、MSCなしで治療されたNHL被験体に対するMSCで治療されたNHL被験体における改善が期待される。
実施例16.肉腫又はGD2陽性固形腫瘍についてのCAR T細胞療法の副作用の発生率の低下
反復性/難治性GD2陽性肉腫の被験体を2群に分ける。T細胞の回収後、リンパ球枯渇レジメンとして1800mg/m2/日 シクロホスファミドを被験体に投与する。GD2 CARをコードしているレンチウイルスベクターCAR T細胞に形質導入する。次いで、各群の被験体に1×105〜1×107 CAR T細胞/kgをIV注入する。応答及び副作用、並びに循環GD2 CAR T細胞の増幅及び持続性について被験体をモニタリングする。
反復性/難治性GD2陽性肉腫の被験体を2群に分ける。T細胞の回収後、リンパ球枯渇レジメンとして1800mg/m2/日 シクロホスファミドを被験体に投与する。GD2 CARをコードしているレンチウイルスベクターCAR T細胞に形質導入する。次いで、各群の被験体に1×105〜1×107 CAR T細胞/kgをIV注入する。応答及び副作用、並びに循環GD2 CAR T細胞の増幅及び持続性について被験体をモニタリングする。
CAR T細胞を注入する3日間前に、被験体に、1日2回、2時間にわたって1800mg/m2/日 シクロホスファミドをIV投与し、1日2回、連続IV注入によって1800mg/m2/日 Mesnaを投与する。CAR T細胞の注入日、30〜60分間前に、被験体に、1mg/kg/日 ジフェンヒドラミン(最大50mg)をIV又はp.o.投与し、15mg/kg/用量 アセトアミノフェン(最大650mg)をp.o.投与する。GD2−CAR T細胞を15〜30分間にわたって注入する。
GD2 CAR T細胞を注入した後3時間以内に、1群の被験体に1×106〜1×107個のMSCをIV注入する。
MSCを注入しない全ての被験体は、CRSの少なくとも1つの症状又はCRS以外の副作用を発症すると予測される。MSCを注入する全ての被験体は、CRSの少なくとも1つの症状又はCRS以外の副作用の重篤度及び/又は持続期間の減少を示すと予測される。
実施例17.肉腫又はGD2陽性固形腫瘍についてのCAR T細胞療法の副作用の治療
反復性/難治性GD2陽性肉腫の被験体を2群に分ける。T細胞の回収後、リンパ球枯渇レジメンとして1800mg/m2/日 シクロホスファミドを被験体に投与する。GD2 CARをコードしているレンチウイルスベクターでCAR T細胞に形質導入する。次いで、各群の被験体に1×105〜1×107 CAR T細胞/kgをIV注入する。応答及び副作用、並びに循環GD2 CAR T細胞の増幅及び持続性について被験体をモニタリングする。
反復性/難治性GD2陽性肉腫の被験体を2群に分ける。T細胞の回収後、リンパ球枯渇レジメンとして1800mg/m2/日 シクロホスファミドを被験体に投与する。GD2 CARをコードしているレンチウイルスベクターでCAR T細胞に形質導入する。次いで、各群の被験体に1×105〜1×107 CAR T細胞/kgをIV注入する。応答及び副作用、並びに循環GD2 CAR T細胞の増幅及び持続性について被験体をモニタリングする。
CAR T細胞を注入する3日間前に、被験体に、1日2回、2時間にわたって1800mg/m2/日 シクロホスファミドをIV投与し、1日2回、連続IV注入によって1800mg/m2/日 Mesnaを投与する。CAR T細胞の注入日、30〜60分間前に、被験体に、1mg/kg/日 ジフェンヒドラミン(最大50mg)をIV又はp.o.投与し、15mg/kg/用量 アセトアミノフェン(最大650mg)をp.o.投与する。GD2−CAR T細胞を15〜30分間にわたって注入する。
GD2 CAR T細胞を注入した24〜72時間後に、1群の被験体に1×106〜1×107個のMSCをIV注入する。
MSCを注入しない全ての被験体は、CRSの少なくとも1つの症状又はCRS以外の副作用を発症すると予測される。MSCを注入する全ての被験体は、CRSの少なくとも1つの症状又はCRS以外の副作用の重篤度及び/又は持続期間の減少を示すと予測される。
実施例18.サイトカイン放出症候群の予防又は治療
この実施例では、重篤な免疫不全であるNOD.Cg−PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ(NSG)マウスを使用するので、末梢血単核細胞(PBMC)の生着及び分化によってこれらマウスをヒト化することができ、その結果、マウスの末梢血及び脾臓において高い割合のヒトCD4+及びCD8+T細胞が生じる。OKT3抗体はヒトT細胞に結合し、ヒトサイトカインを強く誘導し、それによって、ヒトにおけるCRSをモデル化する。
この実施例では、重篤な免疫不全であるNOD.Cg−PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ(NSG)マウスを使用するので、末梢血単核細胞(PBMC)の生着及び分化によってこれらマウスをヒト化することができ、その結果、マウスの末梢血及び脾臓において高い割合のヒトCD4+及びCD8+T細胞が生じる。OKT3抗体はヒトT細胞に結合し、ヒトサイトカインを強く誘導し、それによって、ヒトにおけるCRSをモデル化する。
ゼロ日目に、20×106個のヒトPBMC(huPBMC)を8〜12週齢の雌NOD.Cg−PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ(NSG)マウスに尾静脈を通して静脈内注射した。実験設計の概略図を図3に提供する。
冷凍ヒトPBMCはStemCell Technologiesから購入し、NSGマウスはThe Jackson Laboratoryから購入した。
製造業者の指示書に従って、冷凍huPBMCサンプルを保存及び解凍した。簡潔に述べると、冷凍細胞のバイアルを37℃の水浴で解凍し、バイアルの外側を70%エタノールで清浄にし、37℃に予め加熱しておいたRPMI10%FBSを10mL含有する15mLのコニカルチューブに該細胞を移し、1500rpmで10分間遠心分離し、PBS10mLで1回洗浄し、トリパンブルー色素排除によって細胞をカウントするためにPBS1mLに懸濁させた。PBS150μL中20×106個のhuPBMCのアリコートを調製し、注射のためにマウスを準備している間氷上で維持した。
マウスをケージに入れ、ランプで2〜3分間温めて、尾静脈の拡張を誘導した。次に、マウスをマウス拘束衣に入れ、尾を70%エタノールで清浄にし、1mLのシリンジ、27Gの針を用いて投与される20×106個のhuPBMCを、尾静脈を通してマウスに注射した。注射後、出血を防ぐために注射部位に軽く圧力を印加した。安楽死の日まで、疾患の兆候についてマウスを毎日モニタリングした。
huPBMC生着の10〜12日間後、マウスを対照コホート(n=2)又は試験コホート(n=5)に割り付けた。対照コホートには、腹腔内注射を介して10μgの用量でムロモナブ−CD3(OKT3)抗体を投与した。OKT3抗体は、臓器移植後の急性拒絶反応を治療するために免疫抑制剤として使用される抗CD3抗体である。OKT3抗体は、abcam(カタログ番号ab86883)若しくはThermoFisher Scientific(カタログ番号14−0037−82)等の商業的供給元、又はWalter and Eliza Hall Institute’s Antibody Facility等の他の供給元から購入することができる。huPBMC投与の12時間後に、腹腔内注射を介して対照及び試験のコホートにOKT3抗体を投与した。試験コホートには、OKT3投与の5時間前(すなわち、huPBMC投与の7時間後)に、尾静脈注射によって2×106個のMSCを投与した。他の例では、OKT3投与と同時に、又はOKT3投与の1時間、3時間、5時間、若しくは24時間後にMSCを投与する(図3)。
OKT3抗体投与の0、1、3、5、及び24時間後にマウスの体温を取得した。直腸温度と表面/皮膚温度との間の差を補正するために、標準的な直腸体温計に対して較正された非接触式赤外線放射温度計を使用して温度を測定した。
OKT3抗体投与の5時間後、滅菌した4mm Goldenrod Animal Lancetを使用する頬静脈穿刺を介して、又は尾静脈から採血することによって、末梢血サンプルを得た。
臨床スコア及び体温に依存して、OKT3投与の5又は24時間後にマウスを殺処分した。心臓穿刺を介して安楽死させた直後に末梢血サンプルを得、次いで、脾臓を採取した。標準的なフローサイトメトリー染色及び分析によって、循環中及び脾臓でみられたヒトCD45、CD4、及びCD8 T細胞の百分率を求めた。表面染色及びフローサイトメトリー分析によって、循環及び脾臓のCD4及びCD8 T細胞におけるCD69発現を評価した。
OKT3投与の5及び24時間後に回収した血漿サンプルを、IL−1β、IL−2、IL−6、IFNγ、TNF、IL−10、並びに任意選択でIL−4及びIL−5の発現について評価する。
このCRSモデルでは、試験マウスは、対照マウスと比べて高い直腸温度を示した(図4)。また、試験マウスは、このCRSモデルにおいて試験マウスと比べて低い臨床スコアを示した(図5)。
末梢血(図6)又は脾臓(図9)におけるCD45+細胞の百分率では、対照マウスと試験マウスとの間に差はみられなかった。
しかし、CD69発現は、末梢血(図7)及び脾臓(図10)の両方におけるヒトCD4+細胞において、また、末梢血(図8)及び脾臓(図11)の両方におけるヒトCD8+細胞において、対照マウスと比べて試験マウスで減少した。
対照マウスと比べて試験マウスのヒトCD4+細胞及びヒトCD8+細胞におけるCD69発現が減少したことに鑑みて、IL−1β、IL−2、IL−6、IFNγ、TNF、IL−10、IL−4、及びIL−5のうちの1つ以上の発現が、対照マウスと比べて試験マウスで減少すると予測される。
Claims (14)
- CAR T細胞療法の副作用を治療する方法であって、CAR T細胞療法を施されたことがあるか又は施されている被験体に間葉系幹細胞(MSC)を投与することを含む方法。
- CAR T細胞療法を施されたことがあるか又は施されている被験体におけるCAR T細胞療法の副作用を治療するための医薬の製造における間葉系幹細胞(MSC)の使用。
- 前記MSCが、CD73+CD105+CD90+CD146+CD44+CD10+CD31−CD45−表現型を有する、請求項1に記載の方法又は請求項2に記載の使用。
- 前記MSCが、miR−145−5p、miR−181b−5p、及びmiR−214−3pを発現するが、miR−127−3p及びmiR−299−5pは発現しない、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法又は使用。
- 治療が、前記被験体に約1×106〜約1×107個のMSCを投与することを含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法又は使用。
- 治療が、前記被験体が前記CAR T細胞療法を受ける前、受けている間、又は受けた後に前記MSC(複数可)を投与することを含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法又は使用。
- 治療が、前記被験体が前記CAR T細胞療法を受けた後に前記MSC(複数可)を投与することを含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法又は使用。
- 治療が、前記被験体が前記CAR T細胞療法を受けた後24時間〜72時間以内に前記MSC(複数可)を投与することを含む、請求項7に記載の方法又は使用。
- 前記副作用又は症状が、サイトカイン放出症候群(CRS)、任意選択でインターロイキン−6(IL−6)、インターフェロン−γ(IFN−γ)、腫瘍壊死因子(TNF)、IL−2、IL−2受容体α、IL−8、IL−10、若しくは顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GMCSF)の放出;マクロファージ活性化症候群(MAS);オンターゲットオフがん作用、任意選択でB細胞無形成;腫瘍崩壊症候群(TLS);神経毒性、任意選択で脳浮腫;又はアナフィラキシーである、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法又は使用。
- 前記CAR T細胞療法が、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL);非ホジキンリンパ腫(NHL);縦隔原発B細胞リンパ腫(PMBCL);慢性リンパ性白血病(CLL);形質転換濾胞性リンパ腫(TFL);多発性骨髄腫(MM);マントル細胞リンパ腫(MCL);急性骨髄性白血病(AML);又は急性リンパ芽球性白血病(ALL)を治療するためのものである、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法又は使用。
- 前記CARが、抗CD19 CARである、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法又は使用。
- 前記被験体が、哺乳類、任意選択でヒトである、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法又は使用。
- 哺乳類被験体におけるCAR T細胞療法の副作用を治療、改善、又は低減するための治療用組成物であって、間葉系幹細胞(MSC)を含み、前記MSCが、
(a)間葉系コロニーを形成するのに十分な時間、正常酸素圧条件下において、LiCl及びFGF2を含むが、PDGFは含まない間葉系コロニー形成培地(M−CFM)中で原始中胚葉細胞を培養することと;
(b)(a)の前記間葉系コロニーを接着培養して、前記MSCを生成させることと
を含む方法によって作製され、
(b)の前記MSCが、miR−145−5p、miR−181b−5p、及びmiR−214−3pは発現するが、miR−127−3p及びmiR−299−5pは発現しない、並びに/又は表現型CD73+CD105+CD90+CD146+CD44+CD10+CD31−CD45−を有する治療用組成物。 - 請求項13に記載の治療用組成物を含む容器。
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