KR20190133254A - 키메라 항원 수용체 (car) t 세포 요법의 부작용을 치료하는 방법 - Google Patents

키메라 항원 수용체 (car) t 세포 요법의 부작용을 치료하는 방법 Download PDF

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KR20190133254A
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킬리안 켈리
이고르 슬럭빈
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시나타 세라퓨틱스 엘티디
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Abstract

본 발명은 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포 요법의 부작용을 치료하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 CAR T 세포 요법이 투여되었거나 또는 투여되고 있는 피험체에게 중간엽 줄기세포 (MSC)를 투여하는 단계를 포함한다.

Description

키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포 요법의 부작용을 치료하는 방법
본 발명은 키메라 항원 수용체 (chimeric antigen receptor: CAR) T 세포 요법의 부작용을 치료하는 방법에 관한 것이다.
면역요법 (Immunotherapy)은 질병에 대항하는 피험체의 본래 면역계를 향상시키도록 설계된 생물학적 요법이다. 통상, 면역요법은 암 면역요법을 지칭한다.
암 면역요법의 개발 영역은 입양 세포 전달 (adoptive cell transfer: ACT)이고, 여기서 T 세포가 단리되고, 암 세포를 인식 및 공격하도록 조작되고, 그 다음에 증식시키고 암을 가진 피험체에게 재도입된다. 동종이형 (때로는, 동종이라 함) ACT에 대한 공여자 T 세포의 사용이 또한 연구되고 있기는 하지만, 이는 자가 ACT에 대해 피험체 자신의 T 세포를 단리 및 조작하는 것을 포함할 수 있다.
ACT에 있어서, T 세포 또는 NK 세포는 암 세포에서 발현된 항원을 인식하는 수용체를 발현하도록 조작되었다. 상기 수용체는 T 세포 수용체 (TCR) 또는 키메라 항원 수용체 (CAR)일 수 있다. CAR를 발현하는 T 세포를 CAR T 세포라고 한다.
현재까지, ACT 및 CAR T 세포 요법은 주로 혈액암에서 사용되어 왔고, 소규모 임상 시험으로 제한되었으며, 고형암에 대한 시험은 매우 제한적이었다. 그럼에도 불구하고, CAR T 세포 요법은 진행성 암을 갖는 피험체에서 인상적인 반응을 보여주었다.
통상적으로 B 세포 상에 존재하는 세포 표면 항원인 CD19에 대한 CAR로 CAR T 세포 요법의 치료 대상이 되는 암으로는 급성 림프모구 백혈병 (acute lymphoblastic leukaemia: ALL), 만성 림프구 백혈병 (chronic lymphocytic leukaemia: CLL), 광범위 큰 B 세포 림프종 (diffuse large B cell lymphoma: DLBCL) 및 소포 림프종 (follicular lymphoma)을 포함하는 일부 타입의 비-호지킨 림프종 (non-Hodgkin lymphoma: NHL) 및 다발 골수종 (multiple myeloma)을 포함한다.
이러한 유망함에도 불구하고, CAR T 세포 요법은 부작용 및 상당한 위험이 없는 것은 아니다. 관찰된 부작용으로는 마크로파지 활성화 증후군 (macrophage activation syndrome: MAS)과 관련된 시토킨 방출 증후군 (cytokine release syndrome: CRS), 이식편대 숙주 질환 (graft-versus-host disease: GVHD) 및 B 세포 무형성 (aplasia)과 유사한 결과를 유도하는 on-표적 off-암 효과 (on-target, off-cancer effect), 종양 용해 증후군 (tumour lysis syndrome: TLS), 대뇌 부종 (cerebral oedema)과 같은 신경독성 (neurotoxicity), 및 비-인간 항원을 포함하는 CAR에 대한 피험체의 IgG 반응에 의해 유발되는 아나필락시스 (anaphylaxis)를 포함한다.
CRS는 스테로이드를 포함하는 표준 지지 요법으로 치료되었다. 그러나, 스테로이드는 피험체에서 CAR T 세포의 활성 또는 증식에 영향을 줄 수 있다. CRS에 대한 다른 요법으로는 CRS에서 증가되는 염증촉진성 (pro-inflammatory) 시토킨의 저해제를 투여하는 것이다. 항-IL-6 수용체 항체인 토실리주맙 (Tocilizumab) 및 TNF 저해제인 에타네르셉트 (etanercept)가 CRS를 치료하기 위해 사용되었다.
감소된 항체 생성을 유도하는 B 세포 무형성은 감염을 방지하기 위해 정맥내 면역글로불린으로 치료되었다.
TLS는 수분공급 (hydration), 이뇨 (diuresis), 알로푸리놀 (allopurinol) 및 재조합 유레이트 옥시다제 (recombinant urate oxidase)의 투여, 및 필요에 따라 혈액투석을 포함하는 표준 지지 요법에 의해 관리되었다.
이러한 부작용은 다양한 수준의 성공으로 관리되었지만, 이는 규칙적으로 발생하는 유해 사례, 심지어 다수의 임상 시험에서 발생한 피험체의 사망으로 완전히 성공적이지는 않았다.
분명하게 ACT, 구체적으로 CAR T 세포 요법의 부작용에 대한 예방 및/또는 요법의 개선이 요구된다.
임의의 선행 기술 간행물이 본원에 언급되는 경우, 이러한 참고 문헌은 해당 문헌이 오스트레일리아나 임의의 다른 국가에서 당해 기술분야에서 통상의 일반적 지식의 일부를 형성한다고 인정하는 것은 아니라고 이해해야 한다.
제1 양상은 CAR T 세포 요법의 부작용을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 CAR T 세포 요법이 투여되었거나 또는 투여되고 있는 피험체에게 중간엽 줄기세포 (mesenchymal stem cell: MSC)를 투여하는 단계를 포함한다.
제1 양상의 대안 또는 부가의 구현예는 CAR T 세포 요법이 투여되었거나 또는 투여되고 있는 피험체에서 CAR T 세포 요법의 부작용 치료용 약제의 제조에 있어서 중간엽 줄기세포 (MSC)의 용도를 제공한다.
제1 양상의 추가의 대안 또는 부가의 구현예는 CAR T 세포 요법이 투여되었거나 또는 투여되고 있는 피험체에서 CAR T 세포 요법의 부작용을 치료하는데 사용하기 위해 중간엽 줄기세포 (MSC)를 제공한다.
일 구현예에서, 상기 MSC는 CD73+CD105+CD90+CD146+CD44+CD10+CD31-CD45- 표현형을 갖는다.
일 구현예에서, 상기 MSC는 miR-145-5p, miR-181b-5p 및 miR-214-3p를 발현하지만, miR-127-3p 및 miR-299-5p는 발현하지 않는다.
일 구현예에서, 치료는 약 1x106 내지 약 1x107 MSC를 피험체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일 구현예에서, 치료는 피험체가 CAR T 세포 요법의 수용 (receipt) 전에, 중에 또는 후에 MSC(들)를 투여하는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 치료는 피험체가 CAR T 세포 요법의 수용 후에 MSC(들)를 투여하는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 치료는 피험체가 CAR T 세포 요법의 수용 후 24시간 내지 72시간 내에 MSC(들)을 투여하는 단계를 포함한다.
일 구현예에서, 상기 부작용 또는 증상은 하기와 같다: 시토킨 방출 증후군 (CRS), 선택적으로 인터류킨-6 (IL-6), 인터페론-γ (IFN-γ), 종양 괴사 인자 (TNF), IL-2, IL-2-수용체 α, IL-8, IL-10 또는 과립구 마크로파지 콜로니-자극 인자 (GMCSF)의 방출; 마크로파지 활성화 증후군 (MAS); on-표적 off-암 효과, 선택적으로 B 세포 무형성; 종양 용해 증후군 (TLS); 신경독성, 선택적으로 대뇌 부종; 또는 아나필락시스.
일 구현예에서, 상기 CAR T 세포 요법은 하기를 치료하기 위한 것이다: 광범위 큰 B 세포 림프종 (DLBCL); 비-호지킨 림프종 (NHL); 원발성 종격동 B 세포 림프종 (primary mediastinal B cell lymphoma: PMBCL); 만성 림프구 백혈병 (CLL); 형질전환된 소포 림프종 (TFL); 다발 골수종 (MM); 외투 세포 림프종 (MCL); 급성 골수성 백혈병 (AML); 또는 급성 림프모구 백혈병 (ALL).
일 구현예에서, 상기 CAR는 항-CD19 CAR이다.
일 구현예에서, 상기 피험체는 포유동물, 선택적으로 인간이다.
제2 양상은 포유동물 피험체에서 CAR T 세포 요법의 부작용을 치료, 개선 또는 감소시키기 위한 치료적 조성물을 제공하며, 상기 치료적 조성물은 중간엽 줄기세포 (MSC)를 포함하고, 상기 MSC는 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되며:
(a) LiCl 및 FGF2를 포함하지만, PDGF는 배제된 중간엽-콜로니 형성 배지 (M-CFM)에서 원시 중배엽 세포를, 중간엽 콜로니가 형성되기에 충분한 시간 동안 정상산소군 (normoxic) 조건하에 배양하는 단계; 및
(b) (a)의 중간엽 콜로니를 부착 배양하여 MSC를 생성하는 단계,
상기 (b)의 MSC는 miR-145-5p, miR-181b-5p 및 miR-214-3p를 발현하지만, miR-127-3p 및 miR-299-5p는 발현하지 않으며, 및/또는 표현형 CD73+CD105+CD90+CD146+CD44+CD10+CD31-CD45-을 갖는다.
제3 양상은 제2 양상의 치료적 조성물을 포함하는 용기 (container)를 제공한다.
도 1은 막횡단 및 세포외 부분을 포함하는 인간 CD28로부터 공동-자극 (co-stimulatory) 신호전달 요소를 코딩하는 서열번호:　7로 확인된 핵산 서열이다.
도 2는 인간 CD3 ζ 사슬의 세포질 도메인을 코딩하는 서열번호:　8로 확인된 핵산 서열이다.
도 3은 실시예 18의 실험 설계의 개략도이다.
도 4는 실시예 18의 대조군 및 시험 마우스의 직장 온도를 보여주는 그래프이다.
도 5는 실시예 18의 대조군 및 시험 마우스의 임상 점수 (clinical score)를 보여주는 그래프이다. 0 = 정상 활동; 1 = 정상 활동, 털세움 (piloerection), 첨족 보행 (tiptoe gait); 2 = 웅크림 (Hunched), 활동이 감소되었지만 여전히 움직임; 3 = 운동저하 (Hypomotile), 그러나 촉발시키면 움직임; 4 = 빈사 상태 (Moribund), 안락사됨 (euthanized).
도 6은 실시예 18의 마우스 말초혈 중에 퍼센트 마우스 CD45+ 세포, 퍼센트 인간 CD45+ 세포, 인간 CD45+ 세포의 퍼센트로서 CD4+ 세포, 및 인간 CD45+ 세포의 퍼센트로서 CD8+ 세포를 나타내는 그래프 세트이다.
도 7은 실시예 18의 마우스 말초혈 중에 인간 CD4+ T 세포에서 CD69 발현을 보여주는 그래프 세트이다.
도 8은 실시예 18의 마우스 말초혈 중에 인간 CD8+ T 세포에서 CD69 발현을 보여주는 그래프 세트이다.
도 9는 실시예 18의 마우스 비장 중에 퍼센트 마우스 CD45+ 세포, 퍼센트 인간 CD45+ 세포, 인간 CD45+ 세포의 퍼센트로서 CD4+ 세포, 및 인간 CD45+ 세포의 퍼센트로서 CD8+ 세포를 나타내는 그래프 세트이다.
도 10은 실시예 18의 마우스 비장 중에 인간 CD4+ T 세포에서 CD69 발현을 나타내는 그래프 세트이다.
도 11은 실시예 18의 마우스 비장 중에 인간 CD8+ T 세포에서 CD69 발현을 나타내는 그래프 세트이다.
본 명세서에서 다르게 정의하지 않는 한, 본원에서 사용되는 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 당해 기술 분야의 통상의 기술자 또는 공개된 문헌을 참고하여 통상적으로 이해되는 의미와 동일한 의미를 갖는다.
"a" 또는 "an"이라는 용어는 하나 이상을 의미하는 것으로, 예를 들어, "a MSC"는 하나 이상의 MSC들을 나타내는 것으로 이해해야 한다. 이와 같이, 용어 "a" 또는 "an", "하나 이상" 및 "적어도 하나"는 본원에서 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
하기 청구범위 및 본 발명의 설명에서, 명시적인 언어 또는 필수적인 함축으로 인해 문맥이 달리 요구하는 경우를 제외하고, 용어 "포함하다" 또는 이들의 파생어 "포함한다" 또는 "포함하는"은 포괄적인 의미로 사용되며, 즉 기재된 특징의 존재를 명시하지만, 발명의 다양한 구현예에서 추가적인 특징의 존재 또는 부가를배제하지는 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "약"은 주어진 수에 대해 그 수의 크기의 ± 25 % 값의 범위를 고려한다. 다른 구현예에서, 용어 "약"은 주어진 수에 대해 그 수의 크기의 ±20%, ±15%, ±10% 또는 ±5% 값의 범위를 고려한다. 예를 들어, 일 구현예에서, "약 3 그람"은 2.7 그람 내지 3.3 그람 (즉, 3 그람 ± 10 %) 등의 값을 나타낸다.
유사하게, 사건의 시기 또는 지속시간은 적어도 25% 만큼 가변할 수 있다. 예를 들어, 일 구현예에서 특정 사건이 1일 지속하는 것으로 개시될 수 있고, 상기 사건은 1일 보다 많거나 또는 적게 지속될 수 있다. 예를 들어, "1일"은 약 18시간 내지 약 30시간의 기간을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 시간의 기간은 상기 시간의 기간의 ±20%, ±15%, ±10% 또는 ±5% 만큼 가변할 수 있다.
본원에서 사용되는, "입양 세포 전달" 또는 "ACT"는 T 세포 또는 NK 세포가 단리되고, 특정 항원을 인식하도록 조작되고, 그 다음에 증식시키고 피험체에게 재도입하는 과정을 나타낸다. ACT에 사용되는 T　세포 또는 NK 세포는 치료되는 피험체로부터 유래되는 "자가" 또는 ACT를 수용한 피험체에 의해 거부되지 않도록 충분히 유사한 면역원성 프로파일을 갖는 공여 피험체로부터 유래되는 "동종이형" (때로는 "동종"이라 함)일 수 있다.
본원에서 사용되는, ACT로 전달되는 세포는 "키메라 항원 수용체 T 세포", "키메라 항원 수용체 NK 세포" 또는 "CAR T 세포"이다. 본원에서 사용되는, "CAR T 세포"는 T 세포 또는 NK 세포를 포함한다. 본원에서 사용되는, "CAR T 세포"는 CAR 또는 T 세포 수용체 (TCR)를 발현하도록 조작된 세포를 포함한다. CAR T 세포는 선택적으로 정의된 비율로 T 헬퍼 CD4+ 및/또는 T 이펙터 CD8+ 세포일 수 있다. CAR T 세포는 전체 CD3+ 세포를 포함할 수 있다.
CAR-T 세포 생성
CAR T 세포는 레트로바이러스 (retrovirus), 렌티바이러스 (lentivirus) 또는 트란스포존 (transposon)을 포함하는 바이러스 벡터와 같은 게놈-통합 벡터 (genome-integrating vectors), 또는 플라스미드 또는 mRNA와 같은 비-게놈-통합 (에피솜) DNA/RNA 벡터를 사용하여 생성될 수 있다. 게놈-통합 벡터는 안정하지만, 수용자 T 또는 NK 세포에서 내인성 유전자 발현에 부정적인 영향을 줄 수 있다. 에피솜 벡터는 수용자 T 또는 NK 세포에서 내인성 유전자 발현에 부정적인 영향을 미치지 않을 것이지만, 약 1주일 내에 CAR 발현이 종종 상실되어 불안정하다. 다른 에피솜 접근법은 스캐폴드/매트릭스 부착 영역 (scaffold/matrix attachment region: S/MAR) 요소를 포함하는 비-통합 렌티바이러스 (NILV) 벡터에 의존한다. 이러한 접근법은 게놈 통합 없이, CAR T 세포에서 안정한 유지/장기간 발현의 이점을 갖는다.
CAR 및 CAR T 세포의 생성은 당 분야에 알려져 있고, 하기에 기재되어 있다: (i) US　7,446,190, US 7,741,465 및 US　9,181,527을 포함하는 다수의 특허 공보; 및 (ii) Kalos et al. Sci Transl Med . 2011, 3(95):95ra73, Milone et al. Mol Ther. 2009, 17(8):1453-64, 및 Maude et al. N Engl J Med. 2014, 371(16):1507-17를 포함하는 학술지 출판물; 및 (iii) 본 개시내용의 실시예 1 내지 4. 상기 각 (i) 및 (ii)의 예는 전문이 상호-참조로 포함된다.
이론에 국한되지 않으면서, CAR는 하기 4개의 도메인을 포함할 수 있다:
(1) 특정 세포 표면 항원(들)을 표적으로 하는 단일 사슬 항체 가변 단편 (scFv) 세포외 결합 도메인
(2) 힌지 도메인
(3) 막횡단 도메인
(4) T 세포 증식, 생존 및 시토킨 생성을 유발하는 세포질 신호전달 도메인
다시, 이론에 국한되지 않으면서, CAR는 다수의 카테고리 중 하나에 속할 수 있다: 제1 세대 (초기), 제2 세대, 제3 세대 또는 제4 세대 (최신).
제1 세대 CAR는 CD3 제타 사슬 (CD3ζ)로부터 유래되는 단일 신호전달 도메인을 보유한다. 제2 세대 CAR는 예를 들어 CD3ζ 및 CD28 또는 4-1BB (CD137)로부터 각각 유래되는 신호전달 도메인 및 공동-자극 도메인을 보유한다. 제3 세대 CAR는 예를 들어 CD3ζ로부터 유래되는 신호전달 도메인 및 예를 들어 CD28 및 4-1BB (CD137)로부터 유래되는 다수의 공동-자극 도메인을 보유한다. 제4 세대 CAR는 활성화된 T 세포의 핵 인자 (NFAT)와 같은 추가의 서열과 제2 세대 CAR를 조합하여, 공동-자극 리간드, 또는 IL-12와 같은 시토킨을 코딩하는 카세트의 발현을 유도하고, 이로 인해 CAR T 세포의 세포 사멸 능력을 증진시킨다.
CAR에 대한 관련 항원은 예를 들어 알파 V 베타 6 인테그린, CAIX, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD138, CD171, CEA, EGFR, ErbB (HER), ErbB2 (HER2), FAP, 폴레이트 수용체-알파, GD2, 글리피칸 (Glypican) 3, IL-13, 카파 경쇄, Lewis Y, 메소텔린 (mesothelin), MUC16, NKG2D, PSMA, RORI (ROR 알파) 또는 VEGFR일 수 있다.
적응증
CAR T 세포는 하기를 치료하는데 사용될 수 있다: 광범위 큰 B 세포 림프종 (DLBCL); 비-호지킨 림프종 (NHL); 원발성 종격동 B　세포 림프종 (PMBCL); 만성 림프구 백혈병 (CLL); 형질전환된 소포 림프종 (TFL); 다발 골수종 (MM); 외투 세포 림프종 (MCL); 급성 골수성 백혈병 (AML); 급성 림프모구 백혈병 (ALL). 상기 목록은 완전한 것은 아니다.
또한, CAR T 세포는 하기를 치료하는데 사용될 수 있다: B 세포 악성종양; B 세포 악성종양을 갖는 소아 또는 청소년; B　세포 백혈병; CD19+ 림프종; CD19+ B 세포 림프종; CD19 포지티브 악성 B 세포 유래 백혈병 또는 림프종; 재발 또는 난치성 CD19+ 림프종; 난치성/ 재발 B 세포 혈액암; 동종이형 줄기세포 이식후 재발 또는 지속 B 세포 악성종양; 화학요법 저항 또는 난치성 ALL; 재발 B 세포 ALL을 갖는 소아 또는 청소년 환자; 아교모세포종 (glioblastoma); 다형성 아교모세포종 (glioblastoma multiforme); 재발 다형성 아교모세포종; CD7 포지티브 백혈병 또는 림프종; CD30 포지티브 림프종; EGFR VIII+ 아교모세포종; 진행성 간 악성종양; 간세포 암종; 신경모세포종; 난치성 및/또는 재발 신경모세포종; 유아에서 재발 또는 난치성 신경모세포종; GD2+ 고형 종양; 소아 고형 종양; MUC1 포지티브 재발 또는 난치성 고형 종양; 유방암; 진행성 육종; 암배아 항원 (carcinoembryonic antigen: CEA) 포지티브 암; CD70 발현 암; 재발 및 난치성 침습 B 세포 NHL; 재발/난치성 CD30+ 호지킨 림프종 또는 CD30+ NHL; 재발 또는 난치성 CD19+ CLL 또는 소 림프구 림프종 (small lymphocytic lymphoma: SLL); 악성 신경아교종; 재발/난치성 CD33+ AML; 비인두 암종; 메소텔린 포지티브 진행성 악성종양; 재발 또는 전이 악성 종양; 비-절제가능한 췌장암; 전이 췌장암; 진행성 췌장 암종; 진행성 ROR1+ 악성종양; 재발 또는 난치성 DLBCL; CD19 포지티브 전신 홍반 루푸스 (systemic lupus erythematosus: SLE); 난치성 또는 전이 GD2-포지티브 육종; 골수종; 골수형성이상 증후군; 위암; 재발 또는 난치성 급성 비-T 림프구 백혈병; CD5 항원 발현 T 세포 악성종양; 재발 또는 난치성 폐 편평 세포 암종; 진행성 간세포 암종; GPC3-포지티브 진행성 간세포 암종 (HCC); 진행성 MG7 포지티브 간 전이; 지속/재발 모세포성 형질세포성 수지상 세포 신생물 (blastic plasmacytoid dendritic cell neoplasm); 두경부암; HER2 포지티브 악성종양; 화학요법 난치성 인간 표피 성장 인자 수용체-2 (HER-2) 포지티브 진행성 고형 종양; 화학요법 저항 또는 난치성 CD20+ 림프종; (FAP)-포지티브 악성 흉막 중피종 (pleural mesothelioma); 만성 골수성 백혈병 (chronic myelogenous leukaemia: CML); 화학요법 난치성 EGFR (epidermal growth factor receptor) 포지티브 진행성 고형 종양; 선암종; 또는 제1형 당뇨병.
일 구현예에서, CAR T 세포의 용량 (dose)은 1x105　세포/kg 일 수 있다. 다른 구현예에서, CAR T 세포의 용량은 1x1010 세포/kg 일 수 있다. 다른 구현예에서, CAR T 세포의 용량은 5x105 세포/kg, 1x106 세포/kg, 5x106 세포/kg, 1x107 세포/kg, 5x107　세포/kg, 1x108　세포/kg, 5x108 세포/kg, 1x109 세포/kg 또는 5x109　세포/kg일 수 있다.
일 구현예에서, CAR T 세포의 용량은 1x105　세포/m2 일 수 있다. 다른 구현예에서, CAR T 세포의 용량은 1x1010 세포/m2 일 수 있다. 다른 구현예에서, CAR T 세포의 용량은 5x105 세포/m2, 1x106 세포/m2, 5x106 세포/m2, 1x107 세포/m2, 5x107　세포/m2, 1x108　세포/m2, 5x108 세포/m2, 1x109 세포/m2 또는 5x109　세포/m2 일 수 있다.
일 구현예에서, CAR T 세포의 용량은 1x105　세포일 수 있다. 다른 구현예에서, CAR T 세포의 용량은 1x1010 세포일 수 있다. 다른 구현예에서, CAR T 세포의 용량은 5x105 세포, 1x106　세포, 5x106 세포, 1x107 세포, 5x107　세포, 1x108　세포, 5x108　세포, 1x109 세포 또는 5x109　세포일 수 있다.
CAR T 세포는 단회 용량, 분할 용량 또는 다회 용량으로 투여될 수 있다.
CAR T 세포의 용량은 표적 항원 및 표적 항원 발현 표적 세포와 관련될 것이며, 그러므로 치료되는 적응증에 따라 가변될 수 있다.
CAR T 세포의 용량은 CAR T 세포 요법에 대한 원리에 따라 투여하는 임상의가 결정할 것이다.
부작용 및 증상
시토킨-방출 증후군 (Cytokine-release syndrome: CRS)은 CAR T 세포 요법의 중증 부작용이다. CRS는 인터류킨-6 (IL-6), 인터페론-γ (IFN-γ), 종양 괴사 인자 (TNF), IL-2, IL-2-수용체 α, IL-8, IL-10 및 과립구 마크로파지 콜로니-자극 인자 (GMCSF)를 포함하는 시토킨을 다량 방출하는 증식하는 T 세포로부터 기인하는 것으로 사료된다.
CRS의 증상은 하기를 포함한다: 고열, 권태감, 피로, 근육통, 구역, 식욕부진, 빈맥/ 저혈압, 모세관 누출 (capillary leak), 심장 기능장애, 신장 손상, 간 부전 및 파종성 혈관내 응고 (disseminated intravascular coagulation).
따라서, CRS 피험체는 열, 빈맥, 저혈압, 부정맥, 감소된 심장 박출 계수 (cardiac ejection fraction) 포함 심혈관 증상, 부종, 저산소증, 호흡곤란 및 폐렴 포함 폐 증상, 감소된 신장 관류 (renal perfusion)의 통상적 유발로 인한 급성 신장 손상, 증가된 혈청 트란스아미나제 (serum transaminases) 및 빌리루빈 (bilirubin), 설사, 결장염, 구역 및 복부 통증 포함 간 및 위장관 증상, 3-4 등급 (grade) 빈혈, 저혈소판증, 백혈구감소증, 중성구감소증 및 림프구감소증과 같은 혈구감소증 (cytopenias) 포함 혈액 증상, 프로트롬빈 시간 (prothrombin time) 및 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간 (partial thromboplastin time: PTT)의 연장, D-이량체 증강, 낮은 피브리노겐, 파종성 혈관내 응고, 마크로파지 활성화 증후군 (MAS), 출혈, B-세포 무형성 및 저감마글로불린혈증 (hypogammaglobulinemia) 포함 응고 이상 (derangements), 박테리아혈증 (bacteremia), 살모넬라 (Salmonella), 요도 감염, 바이러스 감염 예컨대 인플루엔자, 호흡기 세포융합 바이러스 (respiratory syncytial virus) 및 대상포진 바이러스 (herpes zoster virus) 포함 감염 질환, 증가된 크레아틴 키나제, 근육통 및 쇠약 (weakness) 포함 근골격계 증상, 섬망, 착란 (confusion) 및 발작 (seizure) 포함 신경계 증상을 경험할 수 있다. 에타네르셉트, 및 항-TNF 분자, 및 토실리주맙, 항-IL-6 수용체 항체와 같은 스테로이드 및 항-시토킨 요법이 CRS를 치료하기 위해 사용되었다.
MAS는 간지라비대 (hepatosplenomegaly), 림프절병증 (lymphadenopathy), 범혈구감소증 (pancytopenia), 간 기능장애, 파종성 혈관내 응고, 저피브리노겐혈증 (hypofibrinogenemia), 고페리틴혈증 (hyperferritinemia) 및 고트리글리세리드혈증 (hypertriglyceridemia)을 잠재적으로 경험하는 피험체에서 CRS와 임상적으로 중복된다. CRS와 마찬가지로, MAS 피험체는 IFN-γ 및 GMCSF를 포함하는 시토킨 수준의 증가를 나타내었다.
On-표적 off-암 효과는 이식편대 숙주 질환 (GVHD) 및 B 세포 무형성과 유사한 결과를 초래할 수 있고, 이는 표적 암 항원이 다른 건강한/ 정상 세포 타입에서 내인성으로 발현될 때 유발된다.
예를 들어, 항-CD19 CAR는 또한 CD19를 발현하는 정상 B 세포를 표적으로 하기 때문에 B 세포 무형성이 발생한다. B 세포 무형성의 결과로 저면역글로불린혈증 때문에 감염에 대항하는 능력이 감소된다. 정맥내 면역글로불린 대체 요법은 감염을 예방하기 위해 사용된다.
CAR T 세포 요법의 다른 부작용은 종양 용해 증후군 (TLS)이며, 이는 세포 사멸을 유발하는 요법의 결과로 세포 내용물이 방출될 때 발생하며, 대부분 림프종 및 백혈병에서 발생한다. TLS는 혈중 철 및 대사산물 불균형을 특징으로 하며, 증상으로는 구역, 구토, 급성 요산 신장병증, 급성 신장 부전, 발작, 심장 부정맥 및 사망을 포함한다.
신경독성은 CAR T 세포 요법으로부터 기인할 수 있고, 증상으로는 대뇌 부종, 섬망, 환각, 언어장애, 무운동함구증 (akinetic mutism), 두통, 착란, 각성 변경 (alterations in wakefulness), 운동실조 (ataxia), 운동불능 (apraxia), 안면 신경 마비 (facial nerve palsy), 떨림 (tremor), 운동거리조절이상 (dysmetria) 및 발작을 포함할 수 있다.
아나필락시스는 비-숙주 단백질, 예컨대 CAR의 일부를 형성하는 뮤린-유래 (murine-derived) 단백질로부터 발생할 수 있다.
부작용 관리
일반적으로, CAR T 세포 요법의 부작용은 임의의 제시 증상에 대해 표준 지지 요법에 의해 관리된다. 그러나, CAR T 세포 요법의 결과로서 발생할 수 있는 수 많은 부작용 및 증상을 고려하여, 다수의 지지 요법이 동시에 요구될 수 있다.
중간엽 줄기세포
따라서, 본 발명은 CAR T 요법에 의해 유발된 부작용의 수, 중증도 및 기간을 CAR T 세포 및 중간엽 줄기세포 (MSC)의 투여에 의해 감소시키기 위한 개선된 요법을 제공한다. MSC는 그의 면역조절 특성을 통해 다수의 부작용 및 증상에 대해 효과를 발휘하므로, MSC는 상기 부작용 또는 증상의 면역원성 원인에 직접 작용할 수 있다.
MSC는 시토킨, 케모킨 및 성장 인자와 같은 생체활성 분자를 분비하며, 면역계를 조절하는 능력을 갖는다. MSC는 생착 (engraftment)에 의존하지 않고 면역계에서 재생 및 효과를 촉진하는 것으로 나타났다. 다시 말해서, MSC 자체는 반드시 숙주로 통합될 필요는 없으며, 오히려 이들은 효과를 발휘하고 그 다음에 짧은 시간내에 제거된다. 그러나 MSC는 생착될 수 있다.
본원에서 사용되는, "중간엽 줄기세포" 또는 "MSC"는 골수, 지방 조직 (지방), 태반 및 제대혈을 포함하는 광범위한 조직으로부터 분리될 수 있는 특정 타입의 줄기세포를 나타낸다. 대안으로서, MSC는 만능성 줄기세포 (PSC)로부터 생성될 수 있다. MSC는 또한 "중간엽 기질 세포 (mesenchymal stromal cells)"로서도 알려져 있다.
의심의 여지를 피하기 위해, 본원에서 사용되는 "부작용"은 "증상"을 포함하고, 두 용어는 정성적으로, 즉 원하지 않는 임의의 형태, 또는 정량적으로, 즉 특정 역치의 원하지 않는 초과 또는 미만으로 결정되는, CAR T 세포 요법의 원하지 않거나 또는 유해 효과를 나타낸다. 이러한 증상은 또한 CAR T 세포 요법의 필수 또는 원하는 효과와 구별되는 효과인 "유해 증상"으로서 지칭될 수 있다. CAR T 세포 요법의 부작용 또는 증상은 또한 "유해 사례", "면역-매개 유해 사례" 또는 "면역-관련 유해 사례"로서도 지칭될 수 있다.
PSC 유래의 MSC 생성은 2017년 3월 14일자로 출원된 국제특허출원 제PCT/AU2017/050228호에 기재되어 있고, 이는 상호-참조에 의해 전체적으로 포함되며, 실시예 5 및 6에 기재되어 있다.
MSC는 T 세포, B 세포, 수지상 세포, 마크로파지 및 자연 살해 세포에 대해 면역조절 활성을 발휘하는 것으로 나타났다. 이론에 국한되지 않고, 기초 기전은 산화질소 (nitric oxide), 인돌아민 2,3, 디옥시게나제, 프로스타글란딘 E2, 종양 괴사 인자-유도 유전자 6 단백질, CCL-2 및 프로그램된 사멸 리간드 1 (programmed death ligand 1)과 같은 면역조절 매개인자를 포함할 수 있다. 이러한 매개인자는 예를 들어 염증성 시토킨, 예컨대 IFNγ, TNFα 및 IL-17에 의해 자극될 때까지 낮은 수준으로 발현된다.
MSC는 정맥내 (IV), 동맥내, 근육내, 복강내, 뇌척수내 (intracerobrospinal), 두개내, 피하 (SC), 관절내 (intra-articular), 활액내 (intrasynovial), 수막강내 (intrathecal), 관상동맥내 (intracoronary), 경심막내 (transendocardial), 외과적 이식 (surgical implantation), 국소 및 흡입 (예: 폐내 (intrapulmonary))을 포함하는 경로에 의해 전신 또는 말초로 투여될 수 있다. MSC는 생체적합성 물질의 스캐폴드와 조합하여 투여될 수 있다.
일 구현예에서, MSC는 투여 전에 사전-처리된다. 예를 들어 성장 인자가 MSC를 프라이밍할 수 있고 유전자 편집 (gene editing)이 MSC에 새로운 치료적 특성을 부여할 수 있는 경우, 성장 인자 또는 유전자 편집에 의해 사전-처리될 수 있다.
본원에서 사용되는, "만능성 줄기세포" 또는 "PSC"는 무한정으로 자기 복제하고, 다른 세포 타입으로 분화할 수 있는 능력을 갖는 세포를 의미한다. PSC에는 배아 줄기세포 (ESC)와 유도 만능성 줄기세포 (iPSC)의 두가지 주요 타입이 있다.
본원에서 사용되는, "배아 줄기세포" 또는 "ESC"는 인 비트로 수정 요법을 완료하고 잉여 배아를 갖는 피험체의 동의를 얻은 후에 기증된 5 내지 7일 된 배아로부터 분리된 세포를 말한다. ESC의 사용은 인간 배아에서 세포를 추출하는 것에 대한 윤리적인 우려로 어느 정도 장애가 되었다.
적합한 인간 PSC는 H1 및 H9 인간 배아 줄기세포를 포함한다.
본원에서 사용되는 "유도 만능성 줄기세포" 또는 "iPSC"는 성체 세포 (adult cell) 유래의 ESC-유사 세포를 의미한다. iPSC는 ESC와 매우 유사한 특성을 가지고 있지만, iPSC는 배아에서 유래되지 않기 때문에 ESC와 관련된 윤리적인 우려를 피할 수 있다. 대신에, iPSC는 전형적으로 만능성 상태로 돌아가도록 "재프로그래밍된" 완전 분화된 성체 세포로부터 유래된다.
적합한 인간 iPSC는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 섬유모세포 (fibroblast) 유래 iPSC 19-9-7T, MIRJT6i-mND1-4 및 MIRJT7i-mND2-0 및 골수 단핵세포 유래 iPSC BM119-9를 포함한다. 다른 적합한 iPSC는 미국 위스콘신주 Madison의 Cellular Dynamics International (CDI)로부터 입수할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명에 따라 사용된 MSC는 원시 중배엽 세포로부터 형성된다. 상기 원시 중배엽 세포는 중간엽혈관모세포 (MCA) 잠재력을 가질 수 있다. 상기 원시 중배엽 세포는 EMH lin-KDR+APLNR+PDGFRalpha+ 표현형을 가질 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명에 따라 사용된 MSC는 MCA 잠재력을 갖는 EMH lin-KDR+APLNR+PDGFRalpha+ 원시 중배엽 세포로부터 형성된다.
본원에서 사용되는, "MCA 잠재력을 갖는 EMH lin-KDR+APLNR+PDGFRalpha+ 원시 중배엽 세포"는 전형적인 원시 줄무늬 및 측판/여분-배아 중배엽 유전자를 발현하는 세포를 나타낸다. 상기 세포는 FGF2 (fibroblast growth factor 2)에 반응하여 무-혈청 배지에서 MCA 및 혈관모세포 콜로니를 형성할 잠재력을 갖는다. 실시예 6에 따라 배양될 때, 이들 세포는 MSC가 된다.
용어 EMH lin-는 CD31, VE-카드헤린 내피 마커 (endothelial markers), CD73 및 Cd105 중간엽/내피 마커 (mesenchymal/endothelial markers), 및 CD43 및 CD45 조혈 마커 (hematopoietic markers)의 발현이 결여됨을 나타낸다.
일 구현예에서, 본 발명에 따라 사용된 MSC는 CD73+CD105+CD90+CD146+CD44+CD10+CD31-CD45- 표현형을 나타낸다.
일 구현예에서, 본 발명에 따라 사용된 MSC는 각 microRNAs miR-145-5p, miR-181b-5p 및 miR-214-3p를 발현하지만, miR-127-3p 및 miR-299-5p는 발현하지 않는다.
MSC는 "면역조절 활성"을 보유하며, 이는 T 헬퍼 (CD4+) 림프구의 증식을 억제하는 MSC의 능력으로 인 비트로에서 평가될 수 있다. 면역조절 활성은 예를 들어 면역역가 분석 (ImmunoPotency Assay)을 사용하여 결정되는 바와 같이, 참조값에 대해 인 비트로에서 정량화될 수 있다.
적합한 면역역가 분석은 조사된 시험 MSC (예: 본원에 개시된 방법에 따라 생성된 iPSC-MSC) 및 조사된 참조 시료 MSC를 사용하며, 이는 건강한 공여자의 말초혈로부터 정제된 카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르-표지된 백혈구와 다양한 농도로 별도로 플레이트된다. 상기 참조 시료의 서브세트를 나타내는 T 헬퍼 (CD4+) 림프구는 CD3 및 CD28 항체를 첨가하여 자극된다. CD4 표지된 T 세포는 T 세포 증식을 평가하기 위해 유세포 측정법 (flow cytometry)을 사용하여 계수된다. IC50 값은 참조 시료의 기능으로서 보고된다. IC50 값이 더 높아지면 T 헬퍼 (CD4+) 림프구의 증식 억제 크기가 더 커지므로, 우수한 T-세포 면역조절 특성을 나타낸다. MSC 시료는 이러한 분석에 사용되기 전에 조사되어 이들 증식 잠재력의 혼란 요인을 제거하였다.
당업자라면 피험체에서 CAR T 세포 요법의 부작용 또는 증상 치료를 위해 MSC의 치료적으로 유효한 양을 상기 피험체에게 투여하는 정확한 방식은 의사 재량에 달려 있다는 것을 이해할 것이다. 용량, 다른 작용제와의 조합, 투여 시기 및 빈도 등을 포함하는 투여 방식은 피험체의 상태 및 병력에 의해 영향을 받을 수 있다.
상기 MSC는 치료적 조성물로서 투여될 수 있다. 본원에서 사용되는, 용어 "치료적 조성물"은 피험체에게의 투여를 위해 제제화되어진 본원에 기재된 바와 같은 MSC 또는 MSC 개체군을 포함하는 조성물을 나타낸다. 바람직하게, 상기 치료적 조성물은 멸균되어 있다. 일 구현예에서, 상기 치료적 조성물은 무발열원 (pyrogen-free)이다.
일 구현예에서, 상기 치료적 조성물은 용기, 바람직하게는 멸균 용기, 바람직하게는 발연원-제거 용기에 제공된다. 일 구현예에서, 상기 용기는 주사기, 예를 들어 볼루스 투여에 적합한 주사기이다. 다른 구현예에서, 상기 용기는 주입 (infusion)에 적합한 주입 백 (infusion bag)이다.
상기 MSC는 양호한 의학적 실시와 일치하는 형태로 제제화, 용량화 및 투여될 것이다. 이러한 맥락에서 고려 요인으로는 치료되는 장애의 특정 형태 및 기대되는 부작용 또는 증상, 치료되는 특정 피험체, 피험체의 임상적 상태, 투여 부위, 투여 방법, 투여 일정 및 의사에게 알려져 있는 다른 요인을 포함한다. 투여될 MSC의 치료적으로 유효한 양은 이러한 고려사항에 의해 지배될 것이다.
MSC의 용량은 약 103 세포/m2 내지 약 1010　세포/m2, 예를 들어 약 106 세포/m2 내지 약 2x108 세포/m2 또는 약 103 세포/m2, 약 5x103 세포/m2, 약 104 세포/m2, 약 5x104 세포/m2, 약 105 세포/m2, 약 5x105 세포/m2, 약 106 세포/m2, 약 5x106 세포/m2, 약 107 세포/m2, 약 5x107 세포/m2, 약 108 세포/m2, 약 5x108 세포/m2, 약 109　세포/m2, 약 5x109 세포/m2, 약 1010 세포/m2 또는 약 5x1010 세포/m2 범위일 수 있다.
MSC의 용량은 약 103 세포/kg 내지 약 1010　세포/kg, 예를 들어 약 106 세포/kg 내지 약 2x108 세포/kg 또는 약 103 세포/kg, 약 5x103 세포/kg, 약 104　세포/kg, 약 5x104 세포/kg, 약 105 세포/kg, 약 5x105　세포/kg, 약 106 세포/kg, 약 5x106 세포/kg, 약 107　세포/kg, 약 5x107 세포/kg, 약 108 세포/kg, 약 5x108　세포/kg, 약 109　세포/kg, 약 5x109 세포/kg, 약 1010　세포/kg 또는 약 5x1010 세포/kg 범위일 수 있다.
MSC의 용량은 약 103 세포 내지 약 1010　세포, 예를 들어 약 106 세포 내지 약 2x108 세포 또는 약 103 세포, 약 5x103 세포, 약 104 세포, 약 5x104　세포, 약 105 세포, 약 5x105 세포, 약 106 세포, 약 5x106 세포, 약 107 세포, 약 5x107 세포, 약 108　세포, 약 5x108 세포, 약 109　세포, 약 5x109 세포, 약 1010 세포 또는 약 5x1010 세포 범위일 수 있다.
상기 MSC는 단회 용량, 분할 용량 또는 다회 용량으로 투여될 수 있다.
상기 MSC는 정맥내 (IV), 동맥내, 근육내, 복강내, 뇌척수내, 두개내, 피하 (SC), 관절내, 활액내, 수막강내, 관상동맥내, 경심막내, 외과적 이식, 국소 및 흡입 (예: 폐내) 경로를 포함하는 임의의 적합한 방법으로 피험체에게 투여될 수 있다. 가장 바람직하게, 상기 MSC는 IV로 투여된다.
상기 MSC는 피험체가 CAR T 세포 요법의 수용 전에, 중에 또는 후에 상기 피험체에게 투여될 수 있다. 일 구현예에서, MSC는 염증 중에 투여된다. 따라서, 일 구현예에서, CAR T 세포 투여 후에, 선택적으로 염증이 시작되고 및/또는 염증촉진성 시토킨 방출이 시작되거나 대조군과 비교하여, 예를 들어 CAR T 세포의 투여전과 비교하여 증가되어진 후에, MSC가 투여된다. 이론에 국한되지 않고, CAR T 세포 요법 투여 후에 MSC 투여에 의해 최대의 이점을 얻을 것으로 생각된다. 이는 CAR T 세포 요법이 본질적으로 면역/염증 반응인 반면에, MSC는 면역조절 및 항-염증 효과를 발휘하기 때문이다. 그러므로, CAR T 세포 요법의 투여 전에, 중에 또는 직후에 MSC 투여는 CAR T 세포 요법 효과를 약화시킬 수 있다. 이러한 이론에도 불구하고, 본 발명은 이에 제한되지 않는다.
그러나, 당업자는 이러한 명백한 역설을 이해하거나 또는 수용하였다. 예를 들어, CAR T 세포 요법에 의해 유발된 CRS에 대한 1차 치료는 스테로이드 투여이며, 이는 상당하게 면역억제한다. MSC의 이점은 예를 들어 스테로이드에 의한 전신 면역억제에 대한 국소 면역조절, 체내 지속 부족, 스테로이드 또는 다른 면역억제 요법에 반응하지 않는 피험체에서 추가적인 방어선 제공, 스테로이드에 대한 감소된 독성 및 증가된 특이성, 및 스테로이드에 대한 MSC에 의한 자기-조절을 포함할 수 있다. 감소된 독성, 증가된 특이성 및 자기-조절은 관련이 있고, 자기-조절이라 함은 CAR T 세포 요법의 부작용 또는 증상의 면역 반응이 소멸될 때 MSC는 그의 면역조절 활성을 감소시키는 능력을 갖는 것을 의미하며, 반면에 예를 들어 스테로이드는 상기 스테로이드 농도가 치료적 농도 이하로 떨어지기 전에 반감기를 유지하면서 내과의에 의해 중단되어야 한다.
따라서, 일 구현예에서, 상기 MSC는 CAR T 세포를 투여하고 약 1주일 후에 CAR T 세포 요법을 받는 피험체에게 투여될 수 있다. 다른 구현예에서, 상기 MSC는 CAR T 세포를 투여하고 약 5분 후에 CAR T 세포 요법을 받는 피험체에게 투여될 수 있다. 다른 구현예에서, 상기 MSC는 CAR T 세포를 투여하고 약 6일, 약 5일, 약 4일, 약 72시간, 약 48시간, 약 36시간, 약 24시간, 약 16시간, 약 12시간, 약 8시간, 약 4시간, 약 2시간, 약 60분, 약 45분, 약 30분, 약 15분 또는 약 5분 후에 CAR T 세포 요법을 받는 피험체에게 투여될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 MSC는 CAR T 세포를 투여하고 약 24시간 내지 약 72시간 내에 CAR T 세포 요법을 받는 피험체에게 투여될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 MSC는 CAR T 세포를 투여하기 약 1주일 전에 CAR T 세포 요법을 받는 피험체에게 투여될 수 있다. 다른 구현예에서, 상기 MSC는 CAR T 세포를 투여하기 약 5분 전에 CAR T 세포 요법을 받는 피험체에게 투여될 수 있다. 다른 구현예에서, 상기 MSC는 CAR T 세포를 투여하기 약 6일, 약 5일, 약 4일, 약 72시간, 약 48시간, 약 36시간, 약 24시간, 약 16시간, 약 12시간, 약 8시간, 약 4시간, 약 2시간, 약 60분, 약 45분, 약 30분 또는 약 15분 전에 CAR T 세포 요법을 받는 피험체에게 투여될 수 있다.
다른 구현예에서, 상기 MSC는 CAR T 세포 투여와 거의 동시에 또는 투여 중에 CAR T 세포 요법을 받는 피험체에게 투여될 수 있다.
용어 "치료적으로 유효한 양"은 피험체에서 CAR T 세포 요법의 부작용 또는 증상을 치료하는데 유효한 MSC의 양을 나타낸다.
용어 "치료하다", "치료하는" 또는 "치료"는 치료적 처치 및 예방적 또는 방지 조치 모두를 나타내고, 상기 목적은 피험체에서 CAR T 세포 요법의 부작용 또는 증상을 방지, 감소 또는 개선하거나, 또는 피험체에서 CAR T 세포 요법의 부작용 또는 증상의 진행을 지연(감속)시키는데 있다. 치료를 필요로 하는 피험체는 CAR T 세포 요법의 부작용 또는 증상을 이미 갖고 있는 피험체뿐만 아니라 CAR T 세포 요법의 부작용 또는 증상이 예방 또는 개선되어야 하는 피험체도 포함한다.
용어 "예방하는", "예방", "예방적" 또는 "예방적인"은 CAR T 세포 요법의 부작용 또는 증상이 발생하는 것을 막거나, 또는 이의 발생을 방해하거나, 방어하거나, 보호하는 것을 나타낸다. 예방을 필요로 하는 피험체는 CAR T 세포 요법의 부작용 또는 증상이 발생하기 쉬울 수 있다.
용어 "개선하다" 또는 "개선"은 CAR T 세포 요법의 부작용 또는 증상의 감소, 줄어듦 또는 제거를 나타낸다.
CAR T 세포 요법의 부작용 또는 증상은 이진법 사례 (binary event), 즉 존재 또는 부재, 0 또는 1로 정량화될 수 있다. 대안으로서, CAR T 세포 요법의 부작용 또는 증상은 반-정량적 척도 (semi-quantitative scale), 예를 들어 0 내지 5로 정량화될 수 있고, 여기서 0은 부재를 나타내고, 1 내지 4는 중증도의 식별가능한 증가를 나타내며, 5는 최대 중증도를 나타낸다. 임상 시험은 종종 1 내지 5의 척도를 사용하며, 여기서: 1은 경증 유해 사례 (부작용)를 나타내고; 2는 중등도 유해 사례 (부작용)를 나타내며; 3은 중증 유해 사례 (부작용)를 나타내고; 4는 생명-위협 또는 불능화 유해 사례 (부작용)를 나타내며; 5는 사망과 관련된 유해 사례 (부작용)를 나타낸다. 다른 반-정량적 척도도 당업자에게 명백할 것이다. 다른 구현예에서, CAR T 세포 요법의 부작용 또는 증상은 정량적 척도로, 예를 들면: 부피당 질량 (mass per volume) 예컨대 조직 유체 부피 당 시토킨 질량; 온도; 지속시간; 속도; 효소 활성; 산소 포화도 등으로 정량화될 수 있다.
당업자는 CAR T 세포 요법의 임의의 부작용 또는 증상을 평가 및 정량화하는 방법을 용이하게 이해하고, 어려움이나 과도한 부담 없이 수행할 수 있을 것이다. 예를 들어, 당업자는 하기를 측정할 수 있을 것이다: 혈장 또는 혈청 중 시토킨 농도; 온도 (열); 심박수 (빈맥); 혈압 (저혈압); 심장 기능장애; 신장 손상; 혈청 또는 혈장 효소 농도 (간 기능) 등.
CAR T 세포 요법의 부작용 또는 증상의 임의의 정량화는 대조군, 예를 들어 CAR T 세포 요법도 MSC도 받지 않은 건강한 대조군 피험체, CAR T 세포 요법으로 치료되었지만, MSC로는 치료되지 않은 영향받은 대조군 피험체, 또는 개체군과 비교될 수 있다.
MSC 투여에 의해 CAR T 세포 요법의 부작용 또는 증상을 치료하면, CAR T 세포 요법의 부작용 또는 증상이 약 1% 감소, 약 2% 감소, 약 3% 감소, 약 4% 감소, 약 5% 감소, 약 6% 감소, 약 7% 감소, 약 8% 감소, 약 9% 감소, 약 10% 감소, 약 20% 감소, 약 30% 감소, 약 40% 감소, 약 50% 감소, 약 60% 감소, 약 70% 감소, 약 80% 감소, 약 90% 감소, 약 100% 또는 초과로 감소될 수 있다. 대안으로서, CAR T 세포 요법의 부작용 또는 증상을 치료하면 CAR T 세포 요법의 부작용 또는 증상이 약 2-배, 약 3-배, 약 4-배, 약 5-배, 약 6-배, 약 7-배, 약 8-배, 약 9-배, 약 10-배 또는 초과로 감소될 수 있다.
본원에서 사용되는, 용어 "피험체"는 포유동물을 나타낼 수 있다. 상기 포유동물은 영장류, 구체적으로 인간일 수 있거나, 또는 가축, 동물원 또는 반려 동물일 수 있다. 본원에 개시된 방법이 인간의 의학적 치료에 적합하다는 것이 특히 고려됨에도 불구하고, 이는 또한 말, 소 및 양과 같은 가축, 개와 고양이 같은 반려 동물, 또는 고양이과 동물, 개과 동물 (canids), 소과 동물 (bovids) 및 발굽동물 (ungulates)과 같은 동물원 동물의 치료를 포함하는 수의학적 치료에도 적용 가능하다.
하기 실시예는 본 발명을 설명하는데 도움이 되며, 이러한 실시예에 제한되지 않는다.
실시예
실시예 1. CAR 및 레트로바이러스 벡터
본 실시예에서 모든 CAR는 전립선 특이적 막 항원 (PSMA)에 특이적인 (Gong, M. C. et al. Neoplasia 1, 123-127 (1999))에 기재된 바와 같은 J591 하이브리도마 (hybridoma) 유래의 scFv를 함유한다. 형질도입된 세포의 검출을 용이하게 하기 위해, 모든 구조체는 뇌심근염 바이러스 내부 리보좀 진입 부위 (encephalomyocarditis virus internal ribosome entry site: EMCV-IRES) 및 SFG 벡터에 삽입된 eGFP 유전자를 함유하였다. Pz1에서, 상기 J591 scFv (P)는 인간 CD8α 힌지 및 막횡단 서열을 통해 인간 TCRζ (z)의 세포내 도메인에 결합된다 (Gong et al.). P28은 (Krause, A. et al. J. Exp . Med . 188, 619-626 (1998) 및 Krause, A. et al. Mol . Ther . 1, S260, 713 (2000))에 기재된 바와 같이 인간 CD28 (28)에 대한 J591 scFv (P)의 융합을 포함한다. P28z를 제작하기 위해, CD28의 뉴클레오티드 336-660은 프라이머 5'-GGCGGCCGCAATTGAAGTTATGTATC-3' (서열번호: 1) 및 5'-TGCGCTCCTGCTGAACTTCACTCTGGAGCGATAGGCTGCTAAGTCGCG-3' (서열번호: 2)를 사용하여 증폭되었다. TCRζ의 세포내 도메인은 프라이머 5'-AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCA-3' (서열번호: 3) 및 5'-CTCGAGTGGCTGTTAGCCAGA-3' (서열번호: 4)를 사용하여 증폭되었다. 산물은 서열번호: 1 및 4의 프라이머에 의해 구동되고, Taq 폴리머라제로 A-테일을 생성하며, NotI/XhoI 결찰로서 SFG-Pz1에 서브클로닝되는 개별 PCR 반응에서 융합되었다. Pz28을 생성하기 위해, CD28의 세포내 도메인은 5'-GCACTTCACATGCAGGCTCTGCCACCTCGCAGGAGTAAGAGGAGCAGG CTCCTGCAC-3' (서열번호: 5) 및 5'-CGCTCGAGTCAGGAGCGATAGGCTGCGAAGTCGCGT-3' (서열번호: 6)을 사용하여 증폭되었다 (시토신 반복을 방해하기 위해 도입된 2개의 사일런트 돌연변이는 밑줄 그어져 있음). 결과의 PCR 산물은 CD28의 세포내 도메인에 TCRζ의 마지막 9개의 코돈 (마이너스 정지 코돈)의 융합을 나타내고, 편리한 5' NspI 부위를 함유한다. 이러한 단편은 서브클로닝되고, NspI/XhoI로 소화되고, SFG-Pz1로 결찰되었다. SFG-c-fms은 인간 마크로파지 콜로니-자극 인자 수용체를 코딩한다. 이는 TCRζ 및/또는 CD28 유래의 신호전달 요소에 결합된 PSMA-특이적 scFv 단편을 포함하는 일련의 수용체를 초래하였다. Pz1 및 P28은 PSMA-의존적 방식으로 신호를 개별적으로 전달하도록 설계되었다. P28z에서, TCRζ의 세포내 부분은 P28의 C 말단에 결합되는 반면에, Pz28에서, 상기 CD28 신호전달 도메인은 Pz1의 C 말단에서 첨가되었다. 모든 키메라 상보적 DNAs (cDNAs)는 증가된 녹색 형광 단백질의 상류에 비시스트로닉 온코-레트로바이러스 벡터 (bicistronic onco-retroviral vectors)에서 클로닝되었다.
실시예 2. 1차 인간 T 세포의 배양 및 레트로바이러스 형질도입
건강한 공여자로부터의 말초혈 단핵 세포는 RPMI+10% (vol/vol) 인간 혈청에서 수립되고, 피토헤마글루티닌 (phytohemagglutinin) (2 μg/ml)로 2일 동안 활성화되고, 레트로넥틴 (retronectin) (15 μg/ml; Takara Biomedicals, Shiga, Japan)으로 사전코팅된 비-조직 배양 플레이트 (non-tissue culture plates) (FALCON, Becton Dickinson, Franklin Lakes, N.J.)로 옮겼다. CAR 구조체를 포함하는 긴팔원숭이 (Gibbon ape) 백혈병 바이러스 외피-의사 레트로바이러스 입자 (leukemia virus envelope-pseudotyped retroviral particles)는 (Gallardo, H. F. et al. Blood 90, 952-957 (1997) 및 Riviere, I. et al. Mol . Biotechnol . 15, 133-142 (2000))에 기재된 바와 같이 생성되었다.
미토겐 (mitogen)-활성화 PBL의 형질도입 3일 후에, 유전자 전달 효율은 20% 내지 70% 범위였다. CD4+ 및 CD8+ T-세포 서브세트가 유사한 효율로 형질도입되었다. ζ-사슬 함유 융합 수용체의 발현은 또한 웨스턴 블로팅 (Western blotting)에 의해 분석하고, 동종이량체 형성을 확인하고, 내인성 CD8 또는 CD28에 의한 이종이량체화가 거의 없음을 확인하였다. P28이 아닌, P28z 및 Pz28 수용체 모두는 인간 PSMA를 발현하는 섬유모세포의 특이적 용해를 매개한다. T-세포가 PSMA를 발현하는 NIH3T3 세포에서 자극될 때, Pz1, P28z 및 Pz28은 PSMA 및 B7.1의 존재하에 IL-2 분비를 유도하였다. 공동-자극 리간드의 부재하에, IL-2 생성은 P28z-형질도입된 T-세포의 배양물에서만 관찰되었다. PSMA 단독을 발현하는 NIH3T3 세포에 의해 자극이 제공될 때, Pz1을 발현하는 T-세포는 제한적인 증식을 겪었다. Pz28-형질도입된 세포는 또한 불량하게 성장하였다. 대조적으로, P28z-형질도입된 T-세포는 지속적으로 증식하고, PSMA+ 섬유모세포 단일층 상에 공동-배양 7일 후에, P28z를 발현하는 T-세포는 PSMA+ 표적을 특이적으로 용해하는 능력을 보유하였다.
실시예 3. CD19-특이적 scFv
CD19-특이적 scFv를 제작하기 위해, 중쇄 (VH) 및 경쇄 (VL) 가변 영역은 (Orlandi et. al. Proc Natl Acad Sci USA 86, 3833-3837 (1989))에 기재된 바와 같이 변성 프라이머를 사용하여 하이브리도마 세포주 SJ25C1로부터 클로닝되었다. 이러한 코딩 영역은 (Gly3Ser)4 스페이서 영역을 코딩하는 DNA 단편과 융합되었다. 막횡단 및 세포외 부분 (서열번호: 7)을 포함하는 인간 CD28 유래의 공동자극 신호전달 요소는 결과의 scFv의 3' 말단에 결찰되고, 인간-ζ의 세포질 도메인 (서열번호: 8)은 CD28 부분의 3' 말단에 결찰되어, 융합 유전자 19-28z를 형성하였다.
상기 19-28z 융합은 NALM6 T 세포가 주입된 마우스에서 종양 성장을 감소시키고 생존을 증가시키는 그의 능력에 대해 테스트하였다. NALM6 세포는 CD19, MHC I 및 MHC II를 발현하지만, B7.1 또는 B7.2는 발현하지 않았다. 대부분의 (~ 80%) 처리되지 않은 SCID-Beige 마우스는 종양 세포 주입하고 4-5주 후에 사지-마비가 발생하고, 나머지 마우스는 체중 감소 및/또는 다른 CNS 증상 (즉, 전정 (vestibular) 증상)이 발생하였다. 상기 19-28z 융합이 존재할 때, T 세포 자극은 거의 10배 증가하고, 일부 마우스의 생존은 공동자극 신호전달 요소가 결여된 CD19-특이적 구조체인 Pz1 (PSMA 특이적 구조체) 또는 19z1로 처리된 마우스와 비교하여 크게 연장되었다.
실시예 4. CD19 특이적 CAR
공동자극 영역으로서 CD19 결합 요소인 4-1BB (CD137) 및 CD3ζ 사슬의 세포내 도메인을 순서대로 포함하는 CAR는 실시예 1의 방법을 사용하여 제조될 것이다. 상기 4-1BB는 하기 프라이머 GCGGCCGCA-CCATCTCCAGCCGAC (서열번호: 9) 및 CTTCACTCT-CAGTTCACATCCTTC (서열번호: 10)를 사용하여 증폭시켜서 CD19 scFv 및 제타 사슬 부분에의 결찰을 촉진하는 제한 절단 부위를 갖는 제타 테일 및 CD19 scFv를 갖는 4-1BB 앰플리콘 (amplicon)을 생성하였다. 서열에서 하이픈은 4-1BB 서열로부터 테일로의 전이를 나타내었다. 동일한 서열로 끝나는 PSMA와 같은 다른 결합 요소에 대해 동일한 프라이머가 사용될 수 있다.
공동자극 영역으로서 CD19 결합 요소인 ICOS 및 CD3 ζ 사슬의 세포내 도메인을 순서대로 포함하는 CAR는 실시예 1의 방법을 사용하여 제조될 것이다. 상기 ICOS는 하기 프라이머 GCGGCCGCA-CTATCAATTTTTGATCCT (서열번호: 11) 및 CTTCACTCT-TAGGGTCACATCTGTGAG (서열번호: 12)를 사용하여 증폭시켜서 CD19 scFv 및 제타 사슬 부분으로의 결찰을 촉진하는 제한 절단 부위를 갖는 제타 테일 및 CD19 scFv를 갖는 ICOS 앰플리콘을 생성하였다. 상기 서열에서 하이픈은 ICOS 서열에서 테일로의 전이를 나타내었다. 동일한 서열로 끝나는 PSMA와 같은 다른 결합 요소에 대해 동일한 프라이머가 사용될 수 있다.
공동자극 영역으로서 CD19 결합 요소인 DAP-10 및 CD3 ζ 사슬의 세포내 도메인을 순서대로 포함하는 CAR는 실시예 1의 방법을 사용하여 제조될 것이다. 상기 DAP-10은 하기 프라이머 GCGGCCGCA-CAGACGACCCCAGGA (서열번호: 13) 및 CTTCACTCT-GCCCCTGCCTGGCATG (서열번호: 14)를 사용하여 증폭시켜서 CD19 scFv 및 제타 사슬 부분으로의 결찰을 촉진하는 제한 절단 부위를 갖는 제타 테일 및 CD19 scFv를 갖는 DAP-10 앰플리콘을 생성하였다. 상기 서열에서 하이픈은 DAP-10 서열에서 테일로의 전이를 나타내었다. 동일한 서열로 끝나는 PSMA와 같은 다른 결합 요소에 대해 동일한 프라이머가 사용될 수 있다.
실시예 5. MSC 생성을 위한 시약
시약
설명 판매사 / 카탈로그 # 또는 참조 #
DMEM/F12 기본 배지 Invitrogen / A1516901
E8 보충제 Invitrogen / A1517101
비트로넥틴 Life Technologies / A14700
콜라겐 IV Sigma / C5533
H-1152 ROCK 저해제 EMD Millipore / 555550
Y27632 디히드로클로리드 ROCK 저해제 Tocris / 1254
FGF2 Waisman Biomanufacturing / WC-FGF2-FP
인간 내피-SFM Life Technologies / 11111-044
stemline II 조혈 줄기세포 증식 배지 Sigma / S0192
GLUTAMAX Invitrogen / 35050-061
인슐린 Sigma / I9278
리튬 클로리드 (LiCl) Sigma / L4408
콜라겐 I 용액 Sigma / C2249
피브로넥틴 Life Technologies / 33016-015
DMEM/F12 Invitrogen / 11330032
재조합 인간 BMP4 Peprotech / 120-05ET
악티빈 A Peprotech / 120-14E
Iscove 변형 Dulbecco 배지 (IMDM) Invitrogen / 12200036
Ham F12 영양 믹스 Invitrogen / 21700075
소듐 비카르보네이트 Sigma / S5761
L-아스코르브산 2-포스페이트 Mg2 + Sigma / A8960
1-티오글리세롤 Sigma / M6145
소듐 셀레나이트 Sigma / S5261
비필수 아미노산 HyClone / SH30853.01
화학적으로 규정된 지질 농축물 Invitrogen / 11905031
배아 전달 등급 물 (embryo transfer grade water) Sigma / W1503
폴리비닐 알콜 (PVA) MP Bio / 151-941-83
홀로-트란스페린 Sigma / T0665
ES-CULT M3120 Stem Cell Technologies / 03120
STEMSPAN 무혈청 증식 배지 (SFEM) Stem Cell Technologies / 09650
L-아스코르브산 Sigma / A4544
혈소판-유래 성장 인자 서브유닛 B 동종이량체 (PDGF-BB) Peprotech / 110-14B
표 1에 열거된 시약은 당해 기술분야의 기술자에게 알려져 있으며, 허용되는 조성물, 예를 들어 IMDM 및 Ham F12와 같은 조성물을 갖는다. GLUTAMAX는 L-알라닐-L-글루타민 디펩티드를 포함하며, 일반적으로 0.85% NaCl 중 200 mM로 공급된다. GLUTAMAX는 배양되는 세포가 디펩티드 결합을 절단할 때 L-글루타민을 방출한다. 화학적으로 규정된 지질 농축물은 아라키돈산 2 mg/L, 콜레스테롤 220 mg/L, DL-α-토코페롤 아세테이트 70 mg/L, 리놀레산 10 mg/L, 리놀렌산 10 mg/L, 미리스트산 10 mg/L, 올레산 10 mg/L, 팔미트산 10 mg/L, 팔미톨산 10 mg/L, 플루로닉 F-68 90 g/L, 스테아르산 10 mg/L, TWEEN 80® 2.2 g/L 및 에틸 알콜을 포함한다. H-1152 및 Y27632는 매우 강력한 세포-투과성의, 선택적 ROCK (Rho-결합된 코일형 코일 형성 단백질 세린/트레오닌 키나제) 저해제이다.
IF6S 배지 (10X 농축)
10X IF6S 정량 최종 농도
IMDM 1 패키지,
1 L에 대한 분말		 5X
Ham F12 영양 믹스 1 패키지,
1 L에 대한 분말		 5X
소듐 비카르보네이트 4.2 g 21 mg/mL
L-아스코르브산 2-포스페이트 Mg2 + 128 mg 640 μg/mL
1-티오글리세롤 80 μL 4.6　mM
소듐 셀레나이트 (0.7 mg/mL 용액) 24 μL 84 ng/mL
GLUTAMAX 20 mL 10X
비필수 아미노산 20 mL 10X
화학적으로 규정된 지질 농축물 4 mL 10X
배아 전달 등급 물 ~ 200 mL NA
IF9S 배지 (1X 농축; IF6S 기반)
IF9S 정량 최종 농도
IF6S 5 mL 1X
폴리비닐 알콜 (PVA; 20 mg/mL 용액) 25 mL 10 mg/mL
홀로-트란스페린 (10.6 mg/mL 용액) 50 μL 10.6 μg/mL
인슐린 100　μL 20 μg/mL
배아 전달 등급 물 ~ 50 mL NA
분화 배지 (1X 농축; IF9S 기반)
분화 배지 정량 최종 농도
IF9S 36 mL 1X
FGF2 1.8 μg 50 ng/mL
LiCl (2M 용액) 36 μL 2mM
BMP4 (100 μg/mL 용액) 18 μL 50 ng/mL
악티빈 A (10 mg/mL 용엑) 5.4 μL 1.5 ng/mL
중간엽 콜로니 형성 배지 (1X 농축)
중간엽 콜로니 형성 배지 (M- CFM ) 정량 최종 농도
ES-CULT M3120 40 mL 40%
STEMSPAN SFEM 30 mL 30%
인간 내피-SFM 30 mL 30%
GLUTAMAX 1 mL 1X
L-아스코르브산 (250 mM 용액) 100 μL 250　μM
LiCl (2M 용액) 50 μL 1　mM
1-티오글리세롤 (100 mM 용액) 100 μL 100 μM
FGF2 600 ng 20 ng/mL
중간엽 무혈청 증식 배지 (1X 농축)
중간엽 무혈청 증식 배지 (M- SFEM ) 정량 최종 농도
인간 내피-SFM 5 L 50%
STEMLINE II HSFM 5 L 50%
GLUTAMAX 100 mL 1X
1-티오글리세롤 87 μL 100 μM
FGF2 100 μg 10 ng/mL
실시예 6. 인간 PSC를 MSC로 분화시키기 위한 프로토콜
1. 비트로넥틴 코팅된 (0.5 μg/ckg) 플라스틱 웨어 (plastic ware) 상에, E8 완전 배지 (DMEM / F12 기본 배지 + E8 보충제) + 1 μM H1152에서 iPSC를 해동시켰다. 도말된 iPSC를 37 ℃, 5% CO2, 20% O2 (정상 산소)에서 인큐베이션하였다.
2. 비트로넥틴 코팅된 (0.5 μg/ckg) 플라스틱 웨어 상에, E8 완전 배지 (ROCK 저해제 없음)에서 iPSC를 3회 계대로 증식하고, 37 ℃, 5% CO2, 20% O2 (정상 산소)에서 인큐베이션하고, 그 다음에 분화 과정을 개시하였다.
3. 수확한 다음, E8 완전 배지 + 10 μM Y27632 중에 콜라겐 IV 코팅된 (0.5 μg/ckg) 플라스틱 웨어 상에 5x103 세포/ckg의 단일 세포/작은 콜로니로서 iPSC를 시딩하고, 37 ℃, 5% CO2, 20% O2 (정상 산소)에서 24시간 동안 인큐베이션하였다.
4. E8 완전 배지 + 10 μM Y27632를 분화 배지로 대체하고, 37 ℃, 5% CO2, 5% O2 (저산소)에서 48시간 동안 인큐베이션하여 원시 중배엽 세포를 생성하였다.
5. 분화 배지 부착 배양물로부터 단일 세포 현탁액으로서 콜로니 형성 원시 중배엽 세포를 수확하고, M-CFM 현탁 배양물로 전달한 후, 37℃, 5% CO2, 20% O2 (정상 산소)에서 12일 동안, 중배엽 콜로니가 형성될 때까지 인큐베이션하였다.
6. 수확한 다음, M-SFEM 중에 피브로넥틴/콜라겐 I 코팅된 (0.67 μg/ckg 피브로넥틴, 1.2 μg/ckg 콜라겐 I) 플라스틱 웨어 상에 중간엽 콜로니 (계대 0)를 시딩하고, 37 ℃, 5% CO2, 20% O2 (정상 산소)에서 3일 동안 인큐베이션하여 MSC를 생성하였다.
7. 콜로니를 수확한 후, M-SFEM 중에 피브로넥틴/콜라겐 1 코팅된 플라스틱 웨어 상에 1.3x104 세포/ckg의 단일 세포 (계대 1)로서 시딩하고, 37 ℃, 5% CO2, 20% O2 (정상 산소)에서 3일 동안 인큐베이션하였다.
8. 수확한 다음, M-SFEM 중에 피브로넥틴/콜라겐 1 코팅된 플라스틱 웨어 상에 1.3x104 세포/ckg의 단일 세포 (계대 2)로서 시딩하고, 37 ℃, 5% CO2, 20% O2 (정상 산소)에서 3일 동안 인큐베이션하였다.
9. 수확한 다음, M-SFEM 중에 피브로넥틴/콜라겐 1 코팅된 플라스틱 웨어 상에 1.3x104 세포/ckg의 단일 세포 (계대 3)로서 시딩하고, 37 ℃, 5% CO2, 20% O2 (정상 산소)에서 3일 동안 인큐베이션하였다.
10. 수확한 다음, M-SFEM 중에 피브로넥틴/콜라겐 1 코팅된 플라스틱 웨어 상에 1.3x104 세포/ckg의 단일 세포 (계대 4)로서 시딩하고, 37 ℃, 5% CO2, 20% O2 (정상 산소)에서 3일 동안 인큐베이션하였다.
11. 수확한 다음, M-SFEM 중에 피브로넥틴/콜라겐 1 코팅된 플라스틱 웨어 상에 1.3x104 세포/ckg의 단일 세포 (계대 5)로서 시딩하고, 37 ℃, 5% CO2, 20% O2 (정상 산소)에서 3일 동안 인큐베이션하였다.
12. 단일 세포로 수확하고 최종 산물을 동결시켰다.
iPSC-MSC의 T 세포 억제에 있어서 PDGF-BB (10　ng/mL) 및/또는 LiCl (1　mM)을 M-CFM에 보충하는 영향을 조사하기 위해 2개의 실험 (TC-A-96 및 DAD-V-90)을 수행하였다. T 세포 억제는 Waisman Biomanufacturing의 면역역가 분석 (IPA)을 사용하여 평가하였다.
하기 표 7에 요약된 바와 같이, 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF) 및 LiCl의 하기 조합을 평가하였다: PDGF+/LiCl+, PDGF-/LiCl-, PDGF+/LiCl- 및 PDGF-/LiCl+. 2개의 상이한 Dneg1 시드 밀도 (5x103　세포/ckg 및 1x104　세포/ckg) 및 분화 배지 중 2개의 상이한 악티빈 A (activin A: AA)의 농도 (1X AA = 15ng/mL 및 0.1X AA = 1.5ng/mL)가 TC-A-96 실험에서 비교되었다. 단일 Dneg1 시드 밀도 (5x10e3　세포/ckg) 및 악티빈 A 농도 (1.5 ng/mL)가 DAD-V-90 실험에서 사용되었다. 또한, 단일 leukopak (LPK7)은 제1 IPA (IPA 1)에서 사용되고, 2개의 leukopak (LPK7 및 LPK8)은 제2 IPA (IPA 2)에서 사용되었다.
상기 분석은 각 MSC 계통이 T　헬퍼 (CD4+) 림프구의 증식을 억제할 수 있는 정도를 평가하기 위해 설계되었다. 냉동보존된 MSC는 건강한 개체의 말초혈 (Leucopaks (LPK) 유래의 말초혈 단핵구 세포 (PBMC))로부터 정제된 냉동보존된 백혈구를 사용하여 시험되었다. 따라서, 공여자에서 공여자로 LPK 세포 집단 변이가 예상된다. 각 MSC 시험 시료는 임상 등급 물질에 대해 2명의 상이한 개인으로부터의 PMBC에 대해, 연구 등급 물질에 대한 단일 PMBC 시료로 시험을 제한하는 옵션을 사용하여 시험되었다. 각 MSC 시험 시료에 대한 분석은 참조 기준 MSC 계통과 함께 수행하여 분석 무결성/재현성을 보장하고 시험 시료를 정규화하였다. 상기 분석은 Bloom et al. Cytotherapy, 2015, 17(2):140-51에 기재되어 있다.
요약하면, 시험 MSC를 21 Gy의 감마선 조사에 노출시켰다. 48-웰 조직 배양 플레이트에서, 4x10e5, 2x10e5, 4x10e4 및 2x10e4 조사된 MSC를 개별 웰로 플레이트하였다. PMBC는 카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르로 개별적으로 표지하였다. 표지된 PMBC 세포를 상기 MSC 함유 웰에 대해 4x105 세포로 플레이트하였다. 이는 1:1, 1:0.5, 1:0.1 및 1:0.05의 적정된 PBMC:MSC 비율을 초래하였다. 추가의 웰에 자극된 PBMC 단독, 다른 것에 MSC 단독, 및 또 다른 것에는 자극 없이 1:0.05 비율로 플레이트하고, 이들 모두는 대조군으로 제공되었다. 후속하여, T 세포-자극 모노클로날 항체, 항-인간 CD3-엡실론 및 항-인간 CD28 (R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN)을 각 웰에 첨가하였다.
배양 4일 차에, 세포를 개별의 웰로부터 수확하였다. 각 웰로부터의 세포를 알로피코시아닌 (allophycocyanin)-표지된 항-인간 CD4와 인큐베이션하였다. 그 다음에 CD4+ 세포를 유세포 측정기를 사용하여 카르복시플루오레세인 세기를 통해 증식을 분석하였다. MSC 단독 대조군은 공동-배양 웰로부터 MSC를 차단하는 역할로 제공되었다. PBMC 단독 대조군은 MSC 매개된 억제 정도가 측정되는 최대 T 세포 증식에 대한 포지티브 대조군으로 제공되었다. 비자극된 1:0.05 비율의 웰은 증식이 측정되는 네가티브 대조군 게이트를 생성하는데 사용되었다.
시험 시료 비율로부터 IC50 값을 생성하기 위한 가장 적합한 곡선이 사용되었다. 상기 IC50 값을 참조 기준 (IC50 Ref Std/IC50 시험 시료)에 대해 정규화하였다. 상기 정규화된 IC50은 보다 강력한 (보다 억제되는) 시료에 대해서는 값이 더 크고, 덜 강력한 시료에 대해서는 값이 더 작았다.
결과
하기 표 7에 제시된 IC50 데이터는 LiCl이 보충되었지만 PDGF는 배제된 (즉 PDGF-/LiCl+) M-CFM이 iPSC를 분화시켜서 면역조절하는 iPSC-MSC를 생성하는데 최적임을 보여주었다. 또한, 악티빈 A의 보다 적은 농도로 또한 iPSC-MSC의 면역억제를 향상시켰다.
면역역가 분석
IC50 ( LPK7 ) IC50 ( LPK8 ) 시료 PDGF LiCl 악티빈 A 시드 밀도 (D2)
해당 없음 억제되지 않음 TC-A-96-B3 + + 0.1X (1.5ng/mL) 5x103 세포/cm2
해당 없음 0.17 TC-A-96-B1 + + 1X (15ng/mL) 5x103 세포/cm2
해당 없음 0.17 DAD-V-90-4 + + 0.1X (1.5ng/mL) 5x103 세포/cm2
해당 없음 0.19 TC-A-96-D3 + + 0.1X (1.5ng/mL) 1x104 세포/cm2
해당 없음 0.36 DAD-V-90-2 + - 0.1X (1.5ng/mL) 5x103 세포/cm2
해당 없음 0.57 DAD-V-90-1 - - 0.1X (1.5ng/mL) 5x103 세포/cm2
0.39 0.54 TC-A-96-B2 - + 1X (15ng/mL) 5x103 세포/cm2
0.37 0.58 TC-A-96-D2 - + 1X (15ng/mL) 1x104 세포/cm2
0.69 0.93 DAD-V-90-3 - + 0.1X (1.5ng/mL) 5x103 세포/cm2
본 실시예에 따라 생성된 MSC는 CD73+CD105+CD90+CD146+CD44+CD10+CD31-CD45- 표현형을 나타내었다.
실시예 7. MSC 마이크로RNA 분석
실시예 6에 따라 생성된 MSC는 miR-127-3p, miR-145-5p, miR-181b-5p, miR-214-3p, miR-299-5p로 구성된 전매 miRNA 패널 및 1194 miRNAs를 포함하는 마이크로RNA (miRNA) 마이크로어레이에 대한 분석을 수행하여, 71개의　MSC 시료 및 94개의 비-MSC 시료에 대해 검증하였다.
실시예 6에 따라 생성된 MSC는 각 miR-145-5p, miR-181b-5p 및 miR-214-3p를 발현하였지만, miR-127-3p 및 miR-299-5p는 발현하지 않았다.
실시예 8. 대체 면역역가 분석 1
MSC의 면역역가는 하기와 같이 평가될 것이다: 다양한 공여자 유래의 인간 PBMC를 포스페이트-완충 식염수 중에 모으고 (면역 반응의 개체간 변동성을 최소화하기 위해), 세포 밀도 2 x 107 PBMCs/mL로 37 ℃ 암실에서 15분 동안 카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르 (CFSE, 2 μM)로 염색하였다. 10 % 인간 혈액 그룹 AB 혈청이 보충된 RPMI-1640 배지를 동량으로 첨가하여 반응을 정지시킬 것이다. 그 다음에 10 % 풀링된 (pooled) 인간 혈소판 용해물, 2 IU/mL 무-보존제 헤파린 (Biochrom), 2 mM L-글루타민, 10 mM (4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산) (HEPES; Gibco), 100 IU/mL 페니실린 (Sigma) 및 100　μg/mL　스트렙토마이신 (Sigma)이 보충된 RPMI-1640 배지 중에 재현탁된 3 x 105 CFSE 표지된 PBMC를 96-웰 평면-바닥 플레이트 (Corning) 중에 3중으로 각 웰에 대해 플레이트할 것이다. T-세포 증식은 Gallios 10-색상 유세포 측정기 및 Kaluza G1.0 소프트웨어 (모두 Coulter)를 사용하여 결정될 것이다. 생존가능한 7-아미노악티노마이신-D-배제 (7-AAD-; BD Pharmingen) CD3-APC+ (eBioscience) T 세포는 4 내지 7일 후에 분석될 것이다. 증식 키네틱스 및 개체군 분포는 Modfit 4.1 소프트웨어 (Verity)를 사용하여 분석될 것이다.
실시예 9. 대체 면역역가 분석 2
MSC의 면역역가는 하기와 같이 평가될 것이다: T　헬퍼 (CD4+) 림프구는 제조자 지침에 따라 CellTrace violet (CTV; Invitrogen)으로 염색되고, 그 다음에 96-웰 U-바닥 플레이트에서 T-세포/비드 비율 5:1로 항-CD3/CD28-코팅된 비드 (Dynabeads, Invitrogen)로 자극되었다. 그 다음에 반응인자 CD4 T 세포를 참조 표준으로 조사된 (100 Gy) Karpas 299 세포 (K299 세포; Sigma), 또는 MSC와 인큐베이션하였다. 공동-배양된 세포를 RPMI-1640 배지에서 72시간 동안 5% CO2 중 37℃에서 인큐베이션할 것이다. 그 다음에 상기 세포를 아넥신(Annexin)V 결합 버퍼 (BD Biosciences)로 세척하고, 실온의 암실에서 15분 동안 아넥신 V-플루오레세인 이소티오시아네이트 또는 APC (BD Biosciences)로 염색하였다. 상기 인큐베이션 후에, 상기 세포를 프로피디움 요오디드 (propidium iodide: PI) (Molecular Probes)로 염색하고, 그 다음에 LSRII Fortessa (BD Biosciences)에서 즉시 데이터를 획득하였다. 수집된 데이터는 FlowJo 소프트웨어 (버젼 8.8.6; Tree Star)를 사용하여 분석될 것이다. 생존력 (viability)은 아넥신 V-네가티브 및 PI-네가티브 T 세포의 개체군에 의해 측정되었다. 생존가능한 세포의 비율은 CTV dim (% 증식)에 대해 분석될 것이다. T-세포 증식의 억제는 하기 식으로 계산될 것이다: %　억제 = 100 - (a/b * 100), 여기서 a는 억제인자 세포의 존재하에 증식 퍼센트이고, b는 억제인자 세포의 부재하에 증식 퍼센트이다.
실시예 10. ALL에 대한 CAR T 세포 요법의 부작용 발생 감소
난치성 ALL 피험체를 2개의 그룹으로 나누고, 각 그룹에게 CD19에 특이적인 자가 CAR T 세포를 IV로 주입하였다. 상기 CAR T 세포는 CD19 CAR를 코딩하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입되었다. 피험체에게 체중 1 kg 당 0.76Х106 내지 20.6Х106 CD19 CAR T 세포의 용량으로 주입하였다. 반응, 독성 및 부작용, 및 순환하는 CD19 CAR T 세포의 증식 및 지속에 대해 환자를 모니터할 것이다.
CD19 CAR T 세포를 주입한 후 3시간 내에, 하나의 피험체 그룹에게 1x106 내지 1x107 MSC를 IV로 주입할 것이다.
피험체의 약 90%에서 ALL의 완전한 완화가 기대된다. CD19 CAR T 세포는 증식되고 반응하는 피험체의 혈액, 골수 및 뇌척수액에서 검출되는 것으로 기대된다. 기대되는 6-개월 무사고 생존율은 약 67% 및 기대되는 전체 생존율은 약 80%로 ALL의 지속적인 완화가 기대된다.
MSC가 주입되지 않은 모든 피험체는 CRS가 발생되는 것으로 기대된다. 상기 그룹의 피험체의 약 25%는 중증의 CRS가 발생되는 것으로 기대되며, 이는 토실리주맙으로 치료될 것이다.
MSC가 주입된 모든 피험체는 감소된 CRS를 나타내는 것으로 기대되며, MSC로 치료되지 않은 피험체와 비교하여 증상의 중증도가 감소하는 것으로 나타났다. 본 그룹의 피험체는 또한 CRS 이외의 중증 부작용을 더 적게 나타내는 것으로 기대된다.
실시예 11. ALL에 대한 CAR T 세포 요법의 부작용 치료
난치성 ALL 피험체를 2개의 그룹으로 나누고, 각 그룹에게 CD19에 특이적인 자가 CAR T 세포를 IV로 주입하였다. 상기 CAR T 세포는 CD19 CAR를 코딩하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입될 것이다. 피험체에게 체중 1 kg 당 0.76Х106 내지 20.6Х106 CD19 CAR T 세포의 용량으로 주입할 것이다. 반응, 독성 및 부작용, 및 순환하는 CD19 CAR T 세포의 증식 및 지속에 대해 환자를 모니터할 것이다.
CD19 CAR T 세포를 주입하고 24 내지 72시간 후에, 하나의 피험체 그룹에게 1x106 내지 1x107 MSC를 IV로 주입할 것이다.
피험체의 약 90%에서 ALL의 완전한 완화가 기대된다. CD19 CAR T 세포는 증식되고 반응하는 피험체의 혈액, 골수 및 뇌척수액에서 검출되는 것으로 기대된다. 기대되는 6-개월 무사고 생존율은 약 67% 및 기대되는 전체 생존율은 약 80%로 ALL의 지속적인 완화가 기대된다.
MSC가 주입되지 않은 모든 피험체는 CRS가 발생되는 것으로 기대된다. 본 그룹의 피험체의 약 25%는 중증의 CRS가 발생되는 것으로 기대되며, 이는 토실리주맙으로 치료할 것이다.
MSC가 주입된 모든 피험체는 감소된 CRS를 나타내는 것으로 기대되며, MSC로 치료되지 않은 피험체와 비교하여 증상의 중증도가 감소하는 것으로 나타났다. 본 그룹의 피험체는 또한 CRS 이외의 중증 부작용을 더 적게 나타내는 것으로 기대된다.
실시예 12. CLL에 대한 CAR T 세포 요법의 부작용 발생 감소
난치성 CLL 피험체는 실시예 10에 따라 치료될 것이다. 유사하게, 동일하지는 않지만, MSC 없이 치료된 피험체보다 MSC로 치료된 ALL 피험체에서의 향상과 비교하여, MSC 없이 치료된 피험체보다 MSC로 치료된 CLL 피험체에서의 향상이 기대된다.
실시예 13. CLL에 대한 CAR T 세포 요법의 부작용 치료
난치성 CLL 피험체는 실시예 11에 따라 치료될 것이다. 유사하게, 동일하지는 않지만, MSC 없이 치료된 피험체보다 MSC로 치료된 ALL 피험체에서의 향상과 비교하여, MSC 없이 치료된 피험체보다 MSC로 치료된 CLL 피험체에서의 향상이 기대된다.
실시예 14. NHL에 대한 CAR T 세포 요법의 부작용 발생 감소
NHL 피험체는 실시예 10에 따라 치료될 것이다. 유사하게, 동일하지는 않지만, MSC 없이 치료된 피험체보다 MSC로 치료된 ALL 피험체에서의 향상과 비교하여, MSC 없이 치료된 피험체보다 MSC로 치료된 NHL 피험체에서의 향상이 기대된다.
실시예 15. NHL에 대한 CAR T 세포 요법의 부작용 치료
NHL 피험체는 실시예 11에 따라 치료될 것이다. 유사하게, 동일하지는 않지만, MSC 없이 치료된 피험체보다 MSC로 치료된 ALL 피험체에서의 향상과 비교하여, MSC 없이 치료된 피험체보다 MSC로 치료된 NHL 피험체에서의 향상이 기대된다.
실시예 16. 육종 또는 GD2-포지티브 고형 종양에 대한 CAR T 세포 요법의 부작용 발생 감소
재발/ 난치성 GD2-포지티브 육종 피험체를 2개의 그룹으로 나눴다. T 세포의 수집 후에, 피험체에게 림프구제거 요법 (lymphodepleting regimen)으로서 시클로포스파미드 1800mg/m2/d를 투여하였다. 상기 CAR T 세포는 GD2 CAR를 코딩하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입될 것이다. 그 다음에 각 피험체 그룹에게 1x105 내지 1x107 CAR T 세포/kg를 IV로 주입할 것이다. 반응 및 부작용, 및 순환하는 GD2 CAR T 세포의 증식 및 지속에 대해 피험체를 모니터할 것이다.
CAR T 세포를 주입하기 3일 전에, 피험체에게 매일 x2 2시간에 걸쳐 IV로 일 당 시클로포스파미드, 1800 mg/m2, 및 매일 x2 연속 IV 주입에 의해 일 당 메스나 (Mesna), 1800 mg/m2를 투여할 것이다. CAR T 세포 주입 당일에, 30-60분 전에, 피험체에게 디펜히드라민 1 mg/kg/d (최대 50 mg)를 IV 또는 p.o.로, 아세타미노펜 15 mg/kg/용량 (최대 650 mg)을 p.o.로 투여할 것이고, GD2-CAR T 세포는 15-30분에 걸쳐 주입할 것이다.
GD2 CAR T 세포를 주입하고 3시간 내에, 하나의 피험체 그룹에게 1x106 내지 1x107 MSC를 IV로 주입할 것이다.
MSC가 주입되지 않은 모든 피험체는 CRS의 적어도 하나의 증상 또는 CRS 이외의 부작용이 발생되는 것으로 기대된다. MSC가 주입된 모든 피험체는 CRS의 적어도 하나의 증상 또는 CRS 이외의 부작용의 중증도 및/또는 지속시간이 감소하는 것으로 기대된다.
실시예 17. 육종 또는 GD2-포지티브 고형 종양에 대한 CAR T 세포 요법의 부작용 치료
재발/ 난치성 GD2-포지티브 육종 피험체를 2개의 그룹으로 나눴다. T 세포의 수집 후에, 피험체에게 림프구제거 요법으로 시클로포스파미드 1800mg/m2/d를 투여할 것이다. 상기 CAR T 세포는 GD2 CAR를 코딩하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입될 것이다. 그 다음에 각 피험체 그룹에게 1x105 내지 1x107 CAR T 세포/kg를 IV로 주입할 것이다. 반응 및 부작용, 및 순환하는 GD2 CAR T 세포의 증식 및 지속에 대해 피험체를 모니터할 것이다.
CAR T 세포를 주입하기 3일 전에, 피험체에게 매일 x2 2시간에 걸쳐서 IV로 일 당 시클로포스파미드, 1800 mg/m2, 및 매일 x2 연속 IV 주입에 의해 일 당 메스나, 1800 mg/m2를 투여할 것이다. CAR T 세포 주입 당일에, 30-60분 전에, 피험체에게 디펜히드라민 1 mg/kg/d (최대 50 mg)를 IV 또는 p.o.로, 아세타미노펜 15 mg/kg/용량 (최대 650 mg)을 p.o.로 투여할 것이고, GD2-CAR T 세포는 15-30분에 걸쳐서 주입할 것이다.
GD2 CAR T 세포를 주입하고 24 내지 72시간 후에, 하나의 피험체 그룹에게 1x106 내지 1x107 MSC를 IV로 주입할 것이다.
MSC가 주입되지 않은 모든 피험체는 CRS의 적어도 하나의 증상 또는 CRS 이외의 부작용이 발생되는 것으로 기대된다. MSC가 주입된 모든 피험체는 CRS의 적어도 하나의 증상 또는 CRS 이외의 부작용의 중증도 및/또는 지속시간이 감소하는 것으로 나타났다.
실시예 18. 시토킨 방출 증후군의 예방 또는 치료
본 실시예는 심각한 면역결핍인 NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wjl /SzJ (NSG) 마우스를 사용하고, 상기 마우스는 말초혈 단핵 세포 (PBMC)의 생착 및 분화에 의해 인간화되도록 하여 상기 마우스의 말초혈 및 비장에서 인간 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 높은 퍼센트를 유도하였다. OKT3 항체는 인간 T 세포에 결합하고 인간 시토킨의 강한 유도를 유발하여, 이로 인해 인간에서 CRS를 모델링하였다.
0일 차에, 8- 내지 12-주령 암컷 NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wjl /SzJ (NSG) 마우스에게 20x106 인간 PBMC(huPBMC)를 꼬리 정맥을 통해 정맥내로 주사하였다. 실험 설계의 개략도는 도 3에 제공되었다.
동결된 인간 PBMC를 StemCell Technologies로부터 구입하고, NSG 마우스는 The Jackson Laboratory로부터 구입하였다.
동결된 huPBMC 시료를 저장하고, 제조자 지침에 따라 해동하였다. 간략하게, 동결된 세포의 바이알을 37℃ 수조에서 해동하고, 상기 바이알의 외부를 70% 에탄올로 세척하고, 상기 세포를 37℃로 예열된 RPMI 10% FBS 10 mL 함유 15mL 원추형 튜브로 옮기고, 1500 rpm으로 10분 동안 원심분리하고, 10 mL의 PBS로 한번 세척하고, Trypan Blue dye exclusion에 의한 세포 계수를 위해 1 mL의 PBS에 현탁하였다. 150　μl의 PBS 중 20x106 huPBMC 알리코트 (aliquots)를 제조하고, 얼음에서 유지하면서 주사를 위해 마우스를 준비하였다.
마우스를 케이지에 넣고, 꼬리 정맥의 확장을 유도하기 위해 램프로 2 내지 3분 동안 가온시켰다. 다음, 마우스를 마우스 억제기 (restrainer)에 넣고, 꼬리를 70% 에탄올로 세척하고, 마우스에게 1 ml 주사기, 27G 바늘로 20x106 huPBMC를 꼬리 정맥을 통해 주사로 투여하였다. 주사 후에, 출혈을 막기 위해 주사 부위를 가볍게 눌러 주었다. 마우스는 안락사될 때까지 질병 증후를 매일 모니터하였다.
huPBMC 생착 10-12일 후에, 마우스를 대조군 (n=2) 또는 시험 (n=5) 코호트로 배분하였다. 대조군 코호트에게 무로모나브 (muromonab)-CD3 (OKT3) 항체를 10 μg의 용량으로, 복강내 주사를 통해 투여하였다. OKT3 항체는 장기 이식 후 급성 거부를 치료하기 위해 면역억제제로서 사용되는 항-CD3 항체이다. OKT3 항체는 abcam (catalog no. ab86883) 또는 ThermoFisher Scientific (catalog no. 14-0037-82)과 같은 상업적 공급처 또는 Walter and Eliza Hall Institute's Antibody Facility와 같은 다른 공급처로부터 구입될 수 있다. 대조군 및 시험 코호트에게 OKT3 항체를 복강내 주사를 통해 huPBMC 투여하고 12시간 후에 투여하였다. 시험 코호트에게 OKT3 투여 5시간 전에 (즉 huPBMC 투여 7시간 후에) 꼬리 정맥 주사로 2x106 MSC를 투여하였다. 다른 예에서, MSC를 OKT3 투여와 동시에, 또는 OKT3 투여하고 1 h, 3 h, 5　h 또는 24 h 후에 투여할 것이다 (도 3).
OKT3 항체를 투여하고 0, 1, 3, 5 및 24시간 후에 마우스 체온을 수득하였다. 직장과 표면/피부 온도 사이에서의 차이를 조정하기 위해 표준 직장 온도계에 대해 보정되어진 비-접촉, 적외선 온도계를 사용하여 체온을 측정하였다.
OKT3 항체를 투여하고 5시간 후에, 무균 4　mm Goldenrod Animal 란셋을 사용한 볼 정맥 천자 (cheek vein puncture)를 통해서 또는 꼬리 정맥으로부터 혈액을 채취하여 말초혈 시료를 수득하였다.
마우스를 임상 점수 및 체온을 고려하여, OKT3 투여하고 5 또는 24시간 후에 희생시켰다. 말초혈 시료는 심장 천자를 통해 안락사 직후에 입수하고, 그 다음에 비장을 수집하였다. 순환계 및 비장에서 발견되는 인간 CD45, CD4 및 CD8 T 세포 퍼센트는 표준 유세포 측정 염색 및 분석에 의해 결정되었다. 순환계 및 비장 CD4 및 CD8 T 세포에서 CD69 발현은 표면 염색 및 유세포 측정 분석에 의해 평가되었다.
OKT3 투여하고 5 및 24시간에 수집된 혈장 시료는 IL-1β, IL-2, IL-6, IFNγ, TNF, IL-10, 및 선택적으로 IL-4 및 IL-5의 발현에 대해 평가될 것이다.
본 CRS 모델에서, 시험 마우스는 대조군 마우스와 비교하여 더 높은 직장 온도를 나타내었다 (도 4). 또한, 시험 마우스는 본 CRS 모델에서 시험 마우스와 비교하여 감소된 임상 점수를 나타내었다 (도 5).
말초혈 (도 6) 또는 비장 (도 9)에서 CD45+ 세포 퍼센트에 있어서 대조군과 시험 마우스 사이에 차이는 관찰되지 않았다.
그러나, CD69 발현은, 말초혈 (도 7) 및 비장 (도 10) 중에 인간 CD4+ 세포에 있어서 및 말초혈 (도 8) 및 비장 (도 11) 중에 인간 CD8+ 세포에 있어서 대조군 마우스와 비교하여 시험 마우스에서 감소되었다.
대조군 마우스에 비해 시험 마우스의 인간 CD4+ 세포 및 인간 CD8+ 세포에서 감소된 CD69 발현의 관점에서, IL-1β, IL-2, IL-6, IFNγ, TNF, IL-10, IL-4 및 IL-5 중 하나 이상의 발현은 대조군 마우스에 비해 시험 마우스에서 감소되는 것으로 기대된다.

Claims (14)

  1. CAR T 세포 요법의 부작용을 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 CAR T 세포 요법이 투여되었거나 또는 투여되고 있는 피험체에게 중간엽 줄기세포 (mesenchymal stem cell: MSC)를 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  2. CAR T 세포 요법이 투여되었거나 또는 투여되고 있는 피험체에서 CAR T 세포 요법의 부작용 치료용 약제의 제조에 있어서 중간엽 줄기세포 (MSC)의 용도.
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 MSC는 CD73+CD105+CD90+CD146+CD44+CD10+CD31-CD45- 표현형을 갖는 것인 방법 또는 용도.
  4. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MSC는 miR-145-5p, miR-181b-5p 및 miR-214-3p를 발현하지만, miR-127-3p 및 miR-299-5p는 발현하지 않는 것인 방법 또는 용도.
  5. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료는 약 1x106 내지 약 1x107 MSC를 상기 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는 것인 방법 또는 용도.
  6. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료는 상기 피험체가 CAR T 세포 요법의 수용 (receipt) 전에, 중에 또는 후에 MSC(들)를 투여하는 단계를 포함하는 것인 방법 또는 용도.
  7. 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료는 상기 피험체가 CAR T 세포 요법의 수용 후에 MSC(들)를 투여하는 단계를 포함하는 것인 방법 또는 용도.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 치료는 상기 피험체가 CAR T 세포 요법의 수용 후 24시간 내지 72시간 내에 MSC(들)를 투여하는 단계를 포함하는 것인 방법 또는 용도.
  9. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, 상기 부작용 또는 증상은 하기인 것인 방법 또는 용도: 시토킨 방출 증후군 (cytokine release syndrome: CRS), 선택적으로 인터류킨-6 (IL-6), 인터페론-γ (IFN-γ), 종양 괴사 인자 (TNF), IL-2, IL-2-수용체 α, IL-8, IL-10 또는 과립구 마크로파지 콜로니-자극 인자 (granulocyte macrophage colony-stimulating factor: GMCSF)의 방출; 마크로파지 활성화 증후군 (macrophage activation syndrome: MAS); on-표적 off-암 효과 (on-target, off-cancer effect), 선택적으로 B 세포 무형성 (B cell aplasia); 종양 용해 증후군 (tumour lysis syndrome: TLS); 신경독성, 선택적으로 대뇌 부종; 또는 아나필락시스 (anaphylaxis).
  10. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CAR T 세포 요법은 하기를 치료하기 위한 것인 방법 또는 용도: 광범위 큰 B 세포 림프종 (diffuse large B cell lymphoma: DLBCL); 비-호지킨 림프종 (non-Hodgkin lymphoma: NHL); 원발성 종격동 B　세포 림프종 (primary mediastinal B　cell lymphoma: PMBCL); 만성 림프구 백혈병 (chronic lymphocytic leukaemia: CLL); 형질전환된 소포 림프종 (transformed follicular lymphoma: TFL); 다발 골수종 (multiple myeloma: MM); 외투 세포 림프종 (mantle cell lymphoma: MCL); 급성 골수성 백혈병 (acute myeloid leukaemia: AML); 또는 급성 림프모구 백혈병 (acute lymphoblastic leukaemia: ALL).
  11. 청구항 1 내지 10 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CAR는 항-CD19 CAR인 것인 방법 또는 용도.
  12. 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피험체는 포유동물, 선택적으로 인간인 것인 방법 또는 용도.
  13. 포유동물 피험체에서 CAR T 세포 요법의 부작용을 치료, 개선 또는 감소시키기 위한 치료적 조성물로서, 상기 치료적 조성물은 중간엽 줄기세포 (MSC)를 포함하고, 상기 MSC는 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되며:
    (a) LiCl 및 FGF2를 포함하지만, PDGF는 배제된 중간엽-콜로니 형성 배지 (M-CFM)에서 원시 중배엽 세포를, 중간엽 콜로니가 형성되기에 충분한 시간 동안 정상산소군 (normoxic) 조건하에 배양하는 단계; 및
    (b) (a)의 중간엽 콜로니를 부착 배양하여 MSC를 생성하는 단계,
    상기 (b)의 MSC는 miR-145-5p, miR-181b-5p 및 miR-214-3p를 발현하지만, miR-127-3p 및 miR-299-5p는 발현하지 않고, 및/또는 표현형 CD73+CD105+CD90+CD146+CD44+CD10+CD31-CD45-을 갖는 것인 치료적 조성물.
  14. 청구항 13의 치료적 조성물을 포함하는 용기 (container).
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