JP2020515578A - Ｈｄａｃ阻害剤系抗体薬物コンジュゲート（ａｄｃ）及び治療における使用 - Google Patents

Ｈｄａｃ阻害剤系抗体薬物コンジュゲート（ａｄｃ）及び治療における使用 Download PDF

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Abstract

本発明は、特にＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２及びＥｒｂＢ３受容に指向する抗体を有する新規なヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（ＨＤＡＣｉ）系抗体薬物コンジュゲート、前記抗体を含む医薬組成物、並びに１若しくは複数のヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームの調節が治療介入に有効な癌又は腫瘍及び他の疾患の治療におけるそれらの使用に関する。【選択図】なし

Description

（技術分野）
本発明は、増殖性疾患の治療に有用な、新規なヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（ＨＤＡＣｉ）系抗体薬物コンジュゲート（Histone Deacetylase Inhibitors (HDACi)-based antibody drug conjugates）に関する。本発明は、特に、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３受容体又は関連する分子標的に指向される抗体を含む抗体薬物コンジュゲートに関する。本発明は、さらに、この抗体薬物コンジュゲートに含まれる、新たなＨＤＡＣ阻害剤薬物を提供する。また、本発明は、ＡＤＣ医薬組成物、並びに１若しくは複数のヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームの調節（modulation）が治療介入に有効な癌又は腫瘍及び他の疾患の治療におけるそれらの使用に関する。
（発明の背景）
医学研究は、癌、神経障害、炎症性疾患及びウイルス感染の治療のための個別化医療（personalized medicine）に重点を置いている。今日、遺伝的変異とヒト疾患との関連についての知識によって、それらの病因のより深い理解が可能になる。
エピジェネティック異常（epigenetic aberrations）は、エピジェネティック調節タンパク質（epigenetic regulatory proteins）の機能の獲得又は喪失を介して上記のヒト疾患の発症及び進行に寄与し得る［Berdasco, 2013 Hum Genet 132: 359-83（非特許文献１）］。なぜなら、ヒト細胞中の１，７５０を超えるタンパク質が、アセチル化及び脱アセチル化を介してリシン残基で翻訳後修飾を受け得るからである［Choudhary 2009 Science 325: 834-40（非特許文献２）］。脱アセチル化酵素は、癌に関連する異常な脱アセチル化だけでなく、神経障害、炎症、ウイルス感染及び心血管障害のような様々な他の疾患を治療するための貴重な標的と見なされている［Minucci 2006 Nature Rev Cancer 6: 38-51（非特許文献３）；Glozak 2007 Oncogene 26: 5420-32（非特許文献４）；Zhang 2015 Med Res Rev 35: 63-84（非特許文献５）；Dinarello 2010 Mol Med 17: 333-52（非特許文献６）］。
今日までに、ＦＤＡによって承認されているＨＤＡＣｉはわずかしかない。すなわち、難治性皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）の治療用のボリノスタット（vorinostat）［Ｚｏｌｉｎｚａ（ゾリンザ）（登録商標）；メルク（Merck）］［Duvic 2007 Blood 109: 31-39（非特許文献７）］；ＣＴＣＬ及び末梢性Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）の治療用のロミデプシン（romidepsin）［Ｉｓｔｏｄａｘ（イストダックス）（登録商標）；セルジーン（Celgene）］［VanderMolen 2011 J Antibiot (Tokyo) 64: 525-531（非特許文献８）］並びにＰＴＣＬの治療用のベリノスタット（belinostat）［Ｂｅｌｅｏｄａｑ（ベレオダク）（登録商標）；スペクトラム・ファーマシューティカルズ（Spectrum Pharmaceuticals）］［West 2014 J Clin Invest 124: 30-39（非特許文献９）］。２０１５年初めに、再発性多発性骨髄腫の患者におけるボルテゾミブ（bortezomib）とデキサメタゾン（dexamethasone）との併用療法として、経口用パノビノスタット（panobinostat）［Ｆａｒｙｄａｋ（ファリーダック）（登録商標）、ノバルティス（Novartis）］がＦＤＡによって承認された［Garnock-Jones KP (2015) Drugs. 75: 695-704（非特許文献１０）］。また、２０１５年１月には、経口的に利用可能な小分子ベンズアミドＨＤＡＣ１、２、３及び１０阻害剤であるチダミド（chidamide）［Ｅｐｉｄａｚａ（エピダザ）（登録商標）、シェンツェン・チップスクリーン・バイオサイエンシーズ（Shenzhen Chipscreen Biosciences）（創製者）がフヤ・バイオサイエンス（HUYA Bioscience）にライセンス供与］が、直腸結腸及び肺癌の治療並びに再発性又は難治性ＰＴＣＬの治療について、中国ＦＤＡによって承認された［Ruolan Gu, (2015) Journal of Chromatography B, 1000: 181-186（非特許文献１１）］。
ＨＤＡＣ阻害剤（ＨＤＡＣｉ）は、主に抗癌剤として研究されているが、ＨＤＡＣ酵素が神経障害、炎症過程及びウイルス感染のなどの他の疾患において重要な役割を果たすと主張する文献が増えている［Dinarello 2010 Cell 140: 935-950（非特許文献１２）；Gray 2011 Epigenomics 3: 431-450（非特許文献１３）；Giannini 2012 Future Med Chem 4: 1439-60（非特許文献１４）］。
ＷＯ２０１５／１５７５９５（特許文献１）には、システイン操作抗体（cysteine engineered antibodies）と異種部分とのコンジュゲートが記載されている。異種部分の中には薬物が挙げられ、薬物の中にはヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（ＨＤＡＣ）が挙げられる。
Choi Sらは、J Control. Release 152, suppl.1, 2011, e9-e10a（非特許文献１５）において、ＰＬＧＡナノ粒子を介した、ＣＤ７抗体とのジェネリック（generic）ＨＤＡＣｉコンジュゲートを記載している。このコンジュゲートは、卵巣ＣＤ７受容体を介して、ＨＤＡＣ阻害剤をヒトＴ細胞に送達することができた。この文献には、いかなる特定のコンジュゲートも報告されていない。
Battistuzzi Gらは、Current Bioactice Compounds 12, 2016, 282-288（非特許文献１６）において、チオール誘導体であるＨＤＡＣ阻害剤の合成の四つの工程を記載している。この文献には、この化合物を他の医薬化合物を得るために使用することについて、いかなる情報も報告されていない。
Ai T.らは、Current Med Chem 2012, 19, 475（非特許文献１７）において、ＨＤＡＣｉと抗癌剤との使用及びそれらの相乗効果を報告している。この文献には、葉酸、レチノイン酸、白金系薬剤、プロテインキナーゼ阻害剤及びイノシン一リン酸デヒドロゲナーゼ阻害剤を用いるＨＤＡＣ阻害剤誘導体が報告されている。
West A.C.らは、Oncoimmunology 1, 2012, 376（非特許文献１８）において、抗腫瘍薬物としてＨＤＡＣ阻害剤と免疫刺激抗体との組み合わせの使用が報告されている。
特に、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２及びＨＤＡＣ３、主に核は、腫瘍細胞における後期の攻撃的な悪性腫瘍において特に見出されており、これらは低い生存率と相関しており［Gryder 2012 Future Med Chem 4: 505-24（非特許文献１９）］；細胞質におけるＨＤＡＣ６の主要な細胞局在（primary cellular localization）は、アセチル化状態を調節し、それによってチューブリン、ＨＳＰ９０及び他の核外タンパク質の機能性を調節し、従って細胞内のミスフォールドタンパク質の除去、細胞運動性及び転移能における関与を示唆する［Clawson 2016 Ann Transl Med 4: 287（非特許文献２０）］。
ＨＤＡＣアイソフォーム（２、３、６、９、１０）はまた、慢性腸炎に関与するので、ＨＤＡＣ阻害剤は、腫瘍細胞のアポトーシス誘導に加えて、炎症性腸疾患のために使用できる［Felice 2015 Aliment Pharmacol Ther 41:26-38（非特許文献２１）］。
近年、チオール系の効力ある汎ＨＤＡＣｉの新たなクラス［Giannini 2014 J Med Chem 57: 8358-77（非特許文献２２）］が報告されており、この文献では、効力あるＨＤＡＣ阻害剤であるＳＴ７６１２ＡＡ１が、ヒトの固形及び血液の悪性腫瘍に対する広範囲の活性を特徴とする薬物候補として選択された。
ＳＴ７６１２ＡＡ１は、患者の生存の低下に関連したＲａｓ変異型結腸癌、強い増殖性の脱分化結腸癌のサブセット；野生型ＥＧＦＲ（及び変異型ＫＲＡＳ）及びＴ７９０ ＥＧＦＲ変異を有する非小細胞肺腫瘍；ＰＴＥＮのレベルが低くＥｒｂＢ１及びＥｒｂＢ２が過剰発現している卵巣、又はＰＴＥＮのない卵巣癌；エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体及びＥｒｂＢ２の非存在によって定義されるトリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）；急性骨髄性白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫などのいくつかの腫瘍の成長を抑制するという特性を示す。また、ＳＴ７６１２ＡＡ１は、免疫応答並びにＮＦ−κＢ経路及び上皮間葉転換（ＥＭＴ）のような重要な病因経路に関与するいくつかの転写産物を調節することを示し、その結果、癌のみならず炎症性疾患にも関連する意味（relevant implication）を示唆した［Vesci 2015 OncoTarget 20: 5735-48（非特許文献２３）］。
ＳＴ７６１２ＡＡ１の作用は、腫瘍細胞の核及び細胞質ＨＤＡＣアイソフォームの両方に対して働き、Ｅ−カドヘリン、ケラチン及び他の典型的な上皮マーカーの転写の増大、並びにそれに付随して、間葉表現型に関連するビメンチン及び他の遺伝子のダウンレギュレーションをもたらす。これらのデータは、ＳＴ７６１２ＡＡ１を用いる治療が、「カドヘリンスイッチ」及び細胞分化を促進する上皮間葉転換（ＥＭＴ）プロセスの復帰（reversion）を引き起こし得ることを示唆する。細胞が分化転換及び脱分化する能力は、ＥＭＴプロセスによる浸潤及び転移において重要な役割を果たし、分化は、治療的有用性（effectiveness）のさらなる予後及び予測指標として使用され得る。ＨＤＡＣ６の阻害を介して、ＳＴ７６１２ＡＡ１はまた、例えば、ＤＮＡ損傷シグナル伝達、転写因子結合、分子ホメオスタシス及びＤＮＡ修復プロセスに関与するＴＰ５３、アルファ−チューブリン又は熱ショックタンパク質９０（ＨＳＰ９０）のような非ヒストンＨＤＡＣ基質を標的にすることができた。
ＳＴ７６１２ＡＡ１は、ウイルスリザーバーの根絶を目的とした新たな治療のために潜在的に有用であるＨＩＶ再活性化を誘導できることを証明した［Badia 2015 Antiviral Res 123: 62-9（非特許文献２４）］。
腫瘍特異性を改善し、毒性を低減するために、近年、抗体薬物コンジュゲートは、臨床的に確証された癌治療法となっている。血液腫瘍の治療においては多くの研究がなされているが、治療がより困難な固形癌には課題が残っている。
抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、ｍＡｂの標的特性と効力ある細胞傷害性薬物の抗腫瘍効果とを組み合わせる、急速に成長しているクラスの癌薬物である［Leal M 2014 Ann NY Acad Sci 1321: 41-54（非特許文献２５）］。
現在、微小管阻害剤は、臨床的に確証されたＡＤＣペイロード（ADC payloads）である。カドサイラ（Kadcyla）［トラスツズマブ エムタンシン（Trastuzumab emtansine）；ジェネンテック（Genentech）］、アドセトリス（Adcetris）［ブレンツキシマブ ベドチン（brentuximab vedotin）；シアトル・ジェネティクス（Seattle Genetics）］、ベスポンサ（Besponsa）［イノツズマブ オゾガマイシン（Inotuzumab ozogamicin）；ファイザー（Pfizer）］及びマイロターグ（Mylotarg）［ゲムツズマブ オゾガマイシン（Gemtuzumab Ozogamicin）；ファイザー］は、ＦＤＡに承認されたＡＤＣ治療薬であり、４０を超える他のＡＤＣが臨床に進んでいる［Okeley 2014 Hematol Oncol Clin North Am 28: 13-25（非特許文献２６）；Baron 2015 J Oncol Pharm Pract 21: 132-42（非特許文献２７）］。
ＡＤＣにおいて現在利用されているペイロードは、非常に効力のある細胞傷害性薬物であり、生存に要する重要な細胞過程にそれらの効果を発揮する。マイタンシン誘導体（ＤＭ１／ＤＭ４）又はアウリスタチン（ＭＭＡＥ／ＭＭＡＦ）などの非常に効力のある微小管阻害剤は、現在のＡＤＣ業界を支配している。これらの阻害剤は、典型的には、Ｇ２／Ｍで細胞周期停止を引き起こすことによって有糸分裂を受けている細胞においてアポトーシスを誘導する。より最近の研究では、微小管阻害剤が、間期に非分裂細胞をも破壊し得ることが示されている。これらの知見は、微小管阻害剤がゆっくりと複製しているか又は分裂していない腫瘍細胞に対しても細胞傷害性であり、従って有意な毒性を示すということの説明を与える。ＡＤＣにおいて使用される他のクラスの細胞傷害性薬物としては、エンジイン類（enediynes）（カリケアミシン（calicheamicin））、デュオカルマイシン（duocarmycin）誘導体、ピロロベンゾジアゼピン類（pyrrolobenzodiazepines、ＰＢＤ）、インドリノベンゾジアゼピン類（indolinobenzodiazepines）、及びキノリンアルカロイド類（ＳＮ−３８）が挙げられ、エンジイン類、デュオカルマイシン誘導体、ピロロベンゾジアゼピン類及びインドリノベンゾジアゼピン類はすべてＤＮＡの副溝を標的とし、キノリンアルカロイド類はトポイソメラーゼＩを阻害する。従って、現在ＡＤＣにおいて利用されているペイロードの大半は非常に強力であり、ピコモル範囲においてしばしば細胞傷害性である。このことは、ごく少量（＜１％）のＡＤＣ注射用量が腫瘍に局在化するので、ＡＤＣストラテジーの要件であると考えられる［Bornstein 2015 AAPS Journal 17: 525-34（非特許文献２８）；Casi及びNeri 2015 J Med Chem 58: 8751-61（非特許文献２９）］。
ＡＤＣ毒性の大半は、リンカーの不安定性に起因するペイロード放出（payload release）に由来すると考えられる。消化管を覆う細胞、毛嚢内の細胞及び骨髄性細胞などの急速に分裂する正常細胞は、放出された微小管阻害剤による毒性のおそれがあり、胃腸症状、脱毛及び骨髄抑制をもたらす。いくつかの重要な毒性は、異なるペイロードで見られる。特に、ＭＭＡＥは、末梢神経障害及び好中球減少を誘発し；ＭＭＡＦは、血小板減少及び眼毒性に関連し；ＤＭ１は、リンカー及び結果として生じる代謝産物に依存して、胃腸への影響並びに血小板減少及び好中球減少を引き起こす。眼毒性は、ＤＭ４コンジュゲート（又はＤＭ４結合）ＡＤＣの最も一般的な有害事象であり；カリケアミシンは、血小板減少及び肝機能不全を引き起こし；ＳＮ−３８コンジュゲート（又はＳＮ−３８結合）薬物からの初期兆候は、頻繁な毒性として好中球減少を示唆する。
次世代のＡＤＣの毒性を最小化するための考えられ得るストラテジーは、低毒性ペイロードを選択することである。
本発明は、驚くべきことに、ＨＤＡＣｉなどの低毒性の薬物にコンジュゲート（複合、結合、接合又は抱合）した抗腫瘍抗体から作製された抗体薬物コンジュゲート（複合体、結合体、接合体又は抱合体）が、in vivoで優れた有効性（efficacy）を発揮できることを実証する。また、ＡＤＣ構築のためのエピジェネティックモジュレーター（すなわち、ＨＤＡＣｉ）の使用は、この分野におけるクラスの最初の例を示す。ＨＤＡＣ阻害剤のように、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤［アザシチジン（azacitidine）及びデシタビン（decitabine）］などのＤＮＡ塩基配列を変更することなく遺伝子発現を調節する他のエピジェネティックモジュレーターを使用することができる［Pachaiyappan 2014 Bioorg and Med Chem Lett 24: 21-32（非特許文献３０）］。
前記抗体薬物コンジュゲートは、さらに、従来技術の抗体薬物コンジュゲートと比較して低い毒性を有しつつ、血液及び体液中で良好な安定性を有し、かつ優れた抗癌活性を有している。
従って、本発明の目的は、抗体に結合した安全な抗癌薬物を含む抗体薬物コンジュゲートを提供することにある。本発明の他の目的は、前記抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を調製するための方法を提供することにある。
本発明のさらなる目的は、前記抗体薬物コンジュゲートを含む医薬組成物を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、１若しくは複数のヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームの調節が治療介入に有効な癌又は腫瘍及び他の疾患の治療に使用するために前記抗体薬物コンジュゲートを提供することにある。
特に、代謝障害、自閉症又は炎症性関連疾患（肺損傷、自己免疫疾患、喘息及び２型糖尿病など）のような他の疾患であって、発症の間異常な遺伝子発現及びエピジェネティック調節を示す疾患が関与し得る［Samanta 2017 Biochim Biophys Acta 1863: 518-28（非特許文献３１）；Akhtar 2013 Plos One 8:e67813（非特許文献３２）；Mei 2014 Neuron 83: 27-49（非特許文献３３）］。ＤＮＡメチル化及びヒストン脱アセチル化酵素を標的とするエピジェネティック修飾因子は、これらの疾患の病因を治療するための源となり得る。
ＷＯ２０１５／１５７５９５
Berdasco, 2013 Hum Genet 132: 359-83 Choudhary 2009 Science 325: 834-40 Minucci 2006 Nature Rev Cancer 6: 38-51 Glozak 2007 Oncogene 26: 5420-32 Zhang 2015 Med Res Rev 35: 63-84 Dinarello 2010 Mol Med 17: 333-52 Duvic 2007 Blood 109: 31-39 VanderMolen 2011 J Antibiot (Tokyo) 64: 525-531 West 2014 J Clin Invest 124: 30-39 Garnock-Jones KP (2015) Drugs. 75: 695-704 Ruolan Gu, (2015) Journal of Chromatography B, 1000: 181-186 Dinarello 2010 Cell 140: 935-950 Gray 2011 Epigenomics 3: 431-450 Giannini 2012 Future Med Chem 4: 1439-60 Choi Sら、J Control. Release 152, suppl.1, 2011, e9-e10a Battistuzzi Gら、Current Bioactice Compounds 12, 2016, 282-288 Ai T.ら、Current Med Chem 2012, 19, 475 West A.C.ら、Oncoimmunology 1, 2012, 376 Gryder 2012 Future Med Chem 4: 505-24 Clawson 2016 Ann Transl Med 4: 287 Felice 2015 Aliment Pharmacol Ther 41: 26-38 Giannini 2014 J Med Chem 57: 8358-77 Vesci 2015 OncoTarget 20: 5735-48 Badia 2015 Antiviral Res 123: 62-9 Leal M 2014 Ann NY Acad Sci 1321: 41-54 Okeley 2014 Hematol Oncol Clin North Am 28: 13-25 Baron 2015 J Oncol Pharm Pract 21: 132-42 Bornstein 2015 AAPS Journal 17: 525-34 Casi及びNeri 2015 J Med Chem 58: 8751-61 Pachaiyappan 2014 Bioorg and Med Chem Lett 24: 21-32 Samanta 2017 Biochim Biophys Acta 1863: 518-28 Akhtar 2013 Plos One 8:e67813 Mei 2014 Neuron 83: 27-49
（発明の概要）
本発明は、式（Ｉ）
Ｄ−（ＣＵ）ｍ−（Ｓ１）ｎ−Ｌ−（Ｓ２）ｏ−（ＣＧ）ｐ−Ａｂ
（式Ｉ）
の抗体薬物複合体（抗体薬物コンジュゲート）又はその薬学的に許容可能な塩に関し、式中、
Ｄは、細胞傷害性薬物（弾頭（warhead）とも称される）であって、亜鉛結合基（ＺＢＧ）としてのベンズアミド、ヒドロキサマート（ヒドロキサメート）又はチオール基を含むヒストン脱アセチル化酵素阻害剤薬物であり、
ＣＵは、連結ユニットであって、存在しなくてもよいか、又は
から選択され、
Ｓ１は、スペーサーであって、存在しなくてもよいか、又は
であり、
Ｌは、リンカーであって、（ＣＨ２）ｑ−ＣＯ、ＮＨ−（ＣＨ２）ｒ−（ＰＥＧ）ｓ−（ＣＨ２）ｗ−ＣＯ、ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｒ−（ＰＥＧ）ｓ−Ｘ−（ＣＨ２）ｗ−ＣＯから選択され、式中、Ｘは、存在しなくてもよいか、ＮＨ又はＯであってもよく、ｑは、２〜８の整数であり、ｒは、存在しなくてもよいか、又は１〜４の整数であり、ｓは、存在しなくてもよいか、又は１〜６の整数であり、ｗは、存在しなくてもよいか、又は１〜２の整数であってもよく、
Ｓ２は、スペーサーであって、存在しなくてもよいか、又は
であり、
ＣＧは、抗体のシステインチオール基又はリシンアミノ基への結合（接合又は抱合）（conjugation）後に形成された連結基であって、存在しなくてもよいか、又は以下の部分：
の一つであってもよく、式中、ｙは、０〜８の整数であり、
Ａｂは、抗体又はその抗原結合性フラグメントであり、
ｍ、ｎ、ｏ及びｐは、０又は１の整数を示す。
リンカー（Ｌ）は、好ましくは、
から選択され、式中、ｎは、２〜５の整数である。
特に、ペイロード（payload）は、適切なリンカー／スペーサーに結合した毒素（ＨＤＡＣ阻害剤）であって、抗体への結合（接合又は抱合）に適した基（すなわち、マレイミド、ＮＨＳエステル）を末端に有し、式Ｉの以下の部分：
Ｄ−（ＣＵ）ｍ−（Ｓ１）ｎ−Ｌ−（Ｓ２）ｏ−（ＣＧ）’ｐ
（式ＩＩ）
を含む。
本発明において、式ＩＩのペイロードにおける（ＣＧ）’は、下記式：
のＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）又は活性化アシル誘導体（ペンタフルオロフェニル（pentaflurophenyl）エステル、ｐ−ニトロ及び２，４−ジニトロフェノールエステル、チオフェノールエステル、アシルイミダゾール、イソブチルカルボナート（カーボネート）、トリクロロ安息香酸無水物を含む）、又はマレイミド−若しくは３−メチレンスクシンイミド、３，４−ジブロモマレイミド又は｛アミノ−カルボニル｝−３−ブテン酸であってもよい。
特に、本発明は、弾頭（warhead）としてＨＤＡＣ阻害剤を有するＡＤＣに関し、下記式：
を有するＳＴ７４６４ＡＡ１及びＳＴ７６６０ＡＡ１（ボリノスタット（vorinostat）のチオールアナログ）などのチオール系（チオールベース）ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、
又は下記式：
を有するボリノスタット（ＳＡＨＡ）、パノビノスタット（panobinostat）（ＬＢＨ５８９）若しくはダシノスタット（dacinostat）（ＬＡＱ８２４）などのヒドロキサム酸系（ヒドロキサム酸ベース）ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（ＨＤＡＣ）、
又は下記式：
を有するエンチノスタット（entinostat）（ＭＳ２７５）などのベンズアミド系（ベンズアミドベース）ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（ＨＤＡＣ）
から選択される。
ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤及びＤ−（ＣＵ）ｍ−（Ｓ１）ｎ−Ｌ−（Ｓ２）−（ＣＧ）’ｐ−（式ＩＩ）を含むペイロードは、以下：
から選択される化合物であってもよい。
さらなる実施形態において、本発明は、抗体薬物コンジュゲートに関し、このコンジュゲートにおいて、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤薬物及び構造Ｄ−（ＣＵ）ｍ−（Ｓ１）ｎ−Ｌ−（Ｓ２）−（ＣＧ）’ｐを含むペイロードが、以下：
から選択される。
さらなる実施形態において、本発明は、ペイロード薬物コンジュゲート（ペイロード薬物複合体）に関し、ペイロード薬物コンジュゲートは、以下：
から選択される。
発明のさらなる実施形態において、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、前記１〜２３の化合物に由来する。
さらなる実施形態において、ＡＤＣは、式２４〜３７：
によって表される化合物から選択される。
特に好ましいのは、式２４〜２９のＡＤＣである。
本発明のさらなる実施形態は、他のＡＤＣであり、このＡＤＣにおいて、ｍＡｂは本発明に示されるものから選択される一つであってもよい。
本発明は、さらに、治療的に有効な量の式Ｉの誘導体と、薬学的に許容可能な賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。
医薬組成物は、経腸又は非経口投与用であってもよく、経腸投与は、経口、エアロゾル、直腸又は経頬経路を含み、非経口投与は、皮下、筋肉内又は静脈内、及び皮内経路を含む。
本発明はまた、治療的に有効な量の式Ｉの誘導体と、放射線療法又は化学療法レジメン（regiment）などの他の公知の抗癌治療との組み合わせ、細胞増殖抑制性又は細胞傷害性薬剤、抗生物質型薬剤、アルキル化剤、代謝拮抗剤、ホルモン剤、インターフェロン型薬剤、シクロオキシゲナーゼ阻害剤（例えば、ＣＯＸ−２阻害剤）、メタロプロテイナーゼ阻害剤、テロメラーゼ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、抗増殖因子受容体薬剤、抗ＨＥＲ２薬剤、抗ＥＧＦＲ薬剤、抗血管新生剤（例えば、血管新生阻害剤）、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、ｒａｓ−ｒａｆシグナル伝達経路阻害剤、細胞周期阻害剤、他のｃｄｋｓ阻害剤、チューブリン結合剤、トポイソメラーゼＩ阻害剤、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤などとの組み合わせを含む医薬組成物を提供する。
さらに、本発明は、抗癌療法において同時に、別個に又は連続（逐次）的に使用するための配合剤（合剤）（combined preparation）として、上記に定義した式（Ｉ）の誘導体又はその薬学的に許容可能な塩と、１又は複数の化学療法剤とを含む製品を提供する。
本発明のさらに他の態様において、薬剤としての使用のための、上記に定義した式（Ｉ）の誘導体又はその薬学的に許容可能な塩を提供する。
本発明はまた、癌又は腫瘍の治療における使用のための、前記抗体薬物コンジュゲート（複合体、結合体、接合体又は抱合体）又は本発明の薬物抗体コンジュゲートを含む医薬組成物に関する。本発明は、特に、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２及び／又はＥｒｂＢ３受容体を発現する癌又は腫瘍の治療に関する。本発明に従って治療されるべき癌の具体例は、膀胱癌、乳癌（胸部癌）、結腸癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌（小細胞肺癌を含む）、食道癌、胆嚢癌、卵巣癌、膵臓癌、胃癌、子宮頸癌、甲状腺癌、前立腺癌及び皮膚癌（扁平上皮癌を含む）を含む癌腫；白血病、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、有毛細胞リンパ腫及びバーキットリンパ腫を含むリンパ系の造血器腫瘍；急性及び慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群並びに前骨髄球性白血病を含む骨髄細胞系の造血器腫瘍；線維肉腫及び横紋筋肉腫を含む間葉系に由来する腫瘍；星細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫及び神経鞘腫を含む中枢及び末梢神経系の腫瘍；並びに黒色腫（メラノーマ）、精上皮腫（セミノーマ）、奇形癌腫（テラトカルシノーマ）、骨肉腫、色素性乾皮症、ケラトキサントーマ（keratoxanthoma）、甲状腺濾胞癌、カポジ肉腫及び中皮腫を含む他の腫瘍である。さらに、ＨＤＡＣｉ系ＡＤＣによって誘発されるＨＩＶ再活性化は、ウイルスリザーバーの根絶を目的とする新たな療法にとって潜在的に有用である（Badia 2015 Antiviral Res 123: 62-9）。この関連で、上記の抗体薬物コンジュゲートは、ＨＩＶの治療におけるアジュバント治療薬（補助薬）として使用されてもよい。
また、本発明は、前記抗体薬物コンジュゲートを含む医薬組成物、並びにＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２又はＥｒｂＢ３から選択される受容体を発現する癌又は腫瘍の治療に使用するための前記抗体薬物コンジュゲート又は前記医薬組成物に関する。
（効果）
本発明の抗体薬物コンジュゲート又は複合体は、同じ濃度、経路及びスケジュールで投与された単一抗体及び細胞傷害性薬剤よりも高い効力を有していた。また、驚くべきことに、抗体に結合したＨＤＡＣ阻害剤などの細胞傷害性薬剤は、最適以下の投薬量において、リンカー又は結合型（type conjugation）（リシン又はシステイン）に依存することなく非常に有効であった。さらに、これらのＨＤＡＣ阻害剤系（ＨＤＡＣ阻害剤ベースの）（HDAC inhibitors-based）ＡＤＣは、対応する抗体よりも低い投薬量で抗腫瘍有効性が得られることを可能にするので、毒性がより低くなる。
（図面の簡単な説明）
図１は、セツキシマブ（Cetuximab）のＭＡＬＤＩマススペクトル（上段）、及びセツキシマブとペイロード−ＮＨＳ ＳＴ８１２８ＡＡ１（１）とのコンジュゲート形態（結合型）（conjugated form）ＳＴ８１５４ＡＡ１（２４）のＭＡＬＤＩマススペクトル（下段）を示す。質量差から計算されたＤＡＲは、８．９であった。 図２は、トラスツズマブ（Trastuzumab）のＭＡＬＤＩマススペクトル（上段）、及びトラスツズマブとペイロード−ＮＨＳ ＳＴ８１２８ＡＡ１（１）とのコンジュゲート形態（結合型）ＳＴ８１７８ＡＡ１（２７）のＭＡＬＤＩマススペクトル（下段）を示す。質量差から計算されたＤＡＲは、６．９であった。 図３は、異なる腫瘍細胞株に対する天然セツキシマブ及びセツキシマブ由来ＡＤＣの結合（ＦＡＣＳ解析）を示し、セツキシマブ由来ＡＤＣは、ＳＴ８１５４ＡＡ１（２４）及びＳＴ８１７７ＡＡ１（２６）（Ａ）、又はＳＴ８２１９ＡＡ１（３７）（Ｂ）である。抗体結合は、ＦＩＴＣ結合マウス抗ヒトＩｇ（ＢＤ）によって検出した。灰色のピークは、一次抗体のない細胞を示す。 図４は、異なる腫瘍細胞株に対する天然トラスツズマブ及びトラスツズマブ由来ＡＤＣの結合（ＦＡＣＳ解析）を示し、トラスツズマブ由来ＡＤＣは、ＳＴ８１７８ＡＡ１（２７）及びＳＴ８１７６ＡＡ１（２８）（Ａ）、又はＳＴ８２０５ＡＡ１（３０）及びＳＴ８２１８ＡＡ１（３６）（Ｂ）である。抗体結合は、ＦＩＴＣ結合マウス抗ヒトＩｇ（ＢＤ）によって検出した。灰色のピークは、一次抗体のない細胞を示す。 図５は、抗原特異的ＥＬＩＳＡによって試験されたＡＤＣの免疫反応性を示す。活性は、（Ａ）組換えヒトＥＧＦ−Ｒ／Ｅｒｂ１ Ｆｃキメラ、又は（Ｂ）組換えヒトＥｒｂＢ２／ＨＥＲ２タンパク質に対して測定した。抗ヒトΚ軽鎖西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗体及びＴＭＢ基質添加による検出。４５０ｎｍにおける光学密度は、ＥＬＩＳＡ分光光度計によって測定した。結果は、二つの独立した反復実験（replicates）の平均（±ＳＤ）である。 図６は、６日間の治療におけるＮＣＩ−Ｈ１９７５非小細胞肺癌細胞に対するＳＴ８１５４ＡＡ１（２４）の抗増殖活性を示す。ＡＤＣのＩＣ５０値±ＳＤは、効果的でなかった（ＩＣ５０＞５００ｎＭ）セツキシマブと比較して、２５０±１０ｎＭであった。 図７は、６日間の治療におけるＣａｌｕ−３非小細胞肺癌細胞に対するＳＴ８１５４ＡＡ１（２４）の抗増殖活性を示す。ＡＤＣのＩＣ５０値±ＳＤは、効果的でなかった（ＩＣ５０＞５００ｎＭ）セツキシマブと比較して、４５０±１０ｎＭであった。 図８は、異なる腫瘍細胞株におけるアセチル化α−チューブリンのレベルに対するセツキシマブ由来ＡＤＣの効果を示し、セツキシマブ由来ＡＤＣは、ＳＴ８１５４ＡＡ１（２４）及びＳＴ８１７７ＡＡ１（２６）（Ａ）、又はＳＴ８２１９ＡＡ１（３７）（Ｂ）である。細胞を、抗体（５μｇ／ｍＬ）とともに３７℃で３時間培養した。２回洗浄した後、細胞を固定し、マウス抗アセチル化α−チューブリンＩｇＧ、次いでＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウスＩｇＧで染色した。核及び細胞質のＤｒａｑ５染色。挿入図は、アセチル化α−チューブリンに特異的に関連する蛍光シグナルを示す。ハイコンテントスクリーニング（ＨＣＳ）Ｏｐｅｒｅｔｔａ（オペレッタ）による蛍光イメージング。各画像は、二重ウェル（duplicate wells）の少なくとも五つの視野（at least 5 fields of duplicate wells）を代表している。倍率６０倍。データは、二つのうちの一つの代表的な実験からのものである。 図９ａは、異なる腫瘍細胞株におけるアセチル化α−チューブリンのレベルに対するトラスツズマブ由来ＡＤＣの効果を示し、トラスツズマブ由来ＡＤＣは、ＳＴ８１７８ＡＡ１（２７）及びＳＴ８１７６ＡＡ１（２８）（Ａ）、又はＳＴ８２０２ＡＡ１（３１）、ＳＴ８２０５ＡＡ１（３０）及びＳＴ８２１８ＡＡ１（３６）（Ｂ）である。細胞を、抗体（５μｇ／ｍＬ）とともに３７℃で３時間培養した。２回洗浄した後、細胞を固定し、マウス抗アセチル化α−チューブリンＩｇＧ、次いでＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウスＩｇＧで染色した。核及び細胞質のＤｒａｑ５染色。挿入図は、アセチル化α−チューブリンに特異的に関連する蛍光シグナルを示す。ハイコンテントスクリーニング（ＨＣＳ）Ｏｐｅｒｅｔｔａによる蛍光イメージング。各画像は、二重ウェルの少なくとも五つの視野を代表している。倍率６０倍。データは、二つのうちの一つの代表的な実験からのものである。 図９ｂは、異なる腫瘍細胞株におけるアセチル化α−チューブリンのレベルに対するトラスツズマブ由来ＡＤＣの効果を示し、トラスツズマブ由来ＡＤＣは、ＳＴ８１７８ＡＡ１（２７）及びＳＴ８１７６ＡＡ１（２８）（Ａ）、又はＳＴ８２０２ＡＡ１（３１）、ＳＴ８２０５ＡＡ１（３０）及びＳＴ８２１８ＡＡ１（３６）（Ｂ）である。細胞を、抗体（５μｇ／ｍＬ）とともに３７℃で３時間培養した。２回洗浄した後、細胞を固定し、マウス抗アセチル化α−チューブリンＩｇＧ、次いでＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウスＩｇＧで染色した。核及び細胞質のＤｒａｑ５染色。挿入図は、アセチル化α−チューブリンに特異的に関連する蛍光シグナルを示す。ハイコンテントスクリーニング（ＨＣＳ）Ｏｐｅｒｅｔｔａによる蛍光イメージング。各画像は、二重ウェルの少なくとも五つの視野を代表している。倍率６０倍。データは、二つのうちの一つの代表的な実験からのものである。 図１０は、異なる腫瘍細胞株におけるアセチル化ヒストンＨ３のレベルに対するセツキシマブ由来ＡＤＣの効果を示し、セツキシマブ由来ＡＤＣは、ＳＴ８１５４ＡＡ１（２４）及びＳＴ８１７７ＡＡ１（２６）（Ａ）、又はＳＴ８２１９ＡＡ１（３７）（Ｂ）である。細胞を、抗体（５μｇ／ｍＬ）とともに３７℃で３時間培養した。２回洗浄した後、細胞を固定し、ウサギ抗アセチル化ヒストンＨ３ ＩｇＧ、次いでＦＩＴＣ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧで染色した。核及び細胞質のＤｒａｑ５染色。挿入図は、アセチル化ヒストンＨ３に特異的に関連する蛍光シグナルを示す。ハイコンテントスクリーニング（ＨＣＳ）Ｏｐｅｒｅｔｔａによる蛍光イメージング。各画像は、二重ウェルの少なくとも五つの視野を代表している。倍率６０倍。データは、二つのうちの一つの代表的な実験からのものである。 図１１は、異なる腫瘍細胞株におけるアセチル化ヒストンＨ３のレベルに対するトラスツズマブ由来ＡＤＣの効果を示し、トラスツズマブ由来ＡＤＣは、ＳＴ８１７８ＡＡ１（２７）及びＳＴ８１７６ＡＡ１（２８）（Ａ）、又はＳＴ８２０２ＡＡ１（３１）、ＳＴ８２０５ＡＡ１（３０）及びＳＴ８２１８ＡＡ１（３６）（Ｂ）である。細胞を、抗体（５μｇ／ｍＬ）とともに３７℃で３時間培養した。２回洗浄した後、細胞を固定し、ウサギ抗アセチル化ヒストンＨ３ ＩｇＧ、次いでＦＩＴＣ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧで染色した。核及び細胞質のＤｒａｑ５染色。挿入図は、アセチル化α−ヒストンＨ３に特異的に関連する蛍光シグナルを示す。ハイコンテントスクリーニング（ＨＣＳ）Ｏｐｅｒｅｔｔａによる蛍光イメージング。各画像は、二重ウェルの少なくとも五つの視野を代表している。倍率６０倍。データは、二つのうちの一つの代表的な実験からのものである。 図１２は、Ａ５４９（Ａ）及びＳＫＢＲ３（Ｂ）細胞株におけるα−チューブリン及びヒストンＨ４のアセチル化に対するＡＤＣの効果を示す。細胞を、抗体（２０μｇ／ｍＬ）とともに３７℃で３時間培養し、次いでウェスタンブロット（Western Blot）解析を全タンパク質溶解物に対して行った。代表的なブロットを示す。 図１３は、皮下（sc）ＮＣＩ−Ｈ１９７５担腫瘍マウスにおいて、ｑ４ｄｘ４スケジュールに従って腹腔内投与されたＳＴ８１５５ＡＡ１（２５）、ＳＴ８１５４ＡＡ１（２４）及びＳＴ７６１２ＡＡ１の抗腫瘍活性を、セツキシマブと比較して示す。腫瘍細胞（５×１０６個の細胞）を、マウスの右脇腹に皮下（sc）注射した。ＡＤＣ及びセツキシマブは、５０ｍｇ／ｋｇの用量で投与されたが、ＳＴ７６１２ＡＡ１は１２０ｍｇ／ｋｇで投与された。腫瘍病変（tumor lesions）を、デジタルノギス（digital caliper）によって評価した（ｎ＝８ マウス／群；平均及びＳＥＭ（標準誤差）、°°°Ｐ＜０．００１及び°°Ｐ＜０．０１対セツキシマブ単独、マン・ホイットニーの検定（Mann-Whitney’s test））。 図１４は、５×１０６個のＡ５４９細胞の皮下（s.c.）注射後のＮｕ／Ｎｕマウスに発生した腫瘍において、ＡＤＣ ＳＴ８１５４ＡＡ１（２４）の抗腫瘍効果を、セツキシマブと比較して示す。抗体治療（処置）に対する病変発生（lesion development）及び応答を、デジタルノギスを用いてモニターした。マウスに、（２４）及びセツキシマブ（４日に１回、５０ｍｇ／ｋｇの４回用量）、又はＰＢＳのいずれかを腹腔内（i.）注射した（ｎ＝１０ マウス／群；平均及びＳＥＭ、°Ｐ＜０．０５対セツキシマブ；＊＊Ｐ＜０．０１及び＊Ｐ＜０．０５対ビヒクル（vehicle）、マン・ホイットニーの検定）。 図１５は、免疫不全ＳＣＩＤ／ベージュマウスの尾静脈への５×１０６個のＡ５４９−ｌｕｃ−Ｃ８（Ａ５４９ｌｕｃ）細胞の注射から生じる人工転移性肺癌に対して、ＳＴ８１５４ＡＡ１（２４）の抗転移活性を、セツキシマブ（Ｃｔｘ）と比較して示す。ルシフェリンの腹腔内（i.）注射（１５０μｇ／マウス）後、腫瘍の生物発光イメージング（ＢＬＩ）を、Ｘｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ ２００によって、異なる時点（細胞注射から＋３５、＋４９及び＋５６日）で記録した。マウスを、ＰＢＳ又はＳＴ８１５４ＡＡ１又はＣｔｘ（１００μｇ／ｍＬ溶液を３．５ｍＬ）でｑ７ｄｘ４、エアロゾルによって処置した（ｎ＝１２ マウス／群；平均及びＳＥＭ、°°Ｐ＜０．０１対Ｃｔｘ；＊Ｐ＜０．０５及び＊＊Ｐ＜０．０１対ビヒクル）。 図１６は、同所腫瘍膵臓に対して、ＳＴ８１５４ＡＡ１（２４）の抗腫瘍効果を、セツキシマブ（Ｃｔｘ）及びＳＴ７６１２ＡＡ１と比較して示す。腫瘍細胞１×１０６個を、膵臓に直接注射した。腫瘍の重量を、腫瘍注射の９０日後に評価した。マウスに、（２４）又はＣｔｘ（４日に１回、４０ｍｇ／ｋｇの４回用量）、ＰＢＳ及びＳＴ７６１２ＡＡ１（２００ｍｇ／ｋｇ、ｑ４ｄｘ４）を腹腔内処置した（ｎ＝１０ マウス／群）；平均及びＳＥＭ、°Ｐ＜０．０５対Ｃｔｘ、＊Ｐ＜０．０５及び＊＊Ｐ＜０．０１対ビヒクル。 図１７は、ヌードマウスに皮下（sc）移植された患者由来腫瘍異種移植片（ＰＤＸ）膵臓癌に対して、腹腔内送達された（ｑ４ｄｘ５）ＳＴ８１５４ＡＡ１（２４）の抗腫瘍活性を、セツキシマブと比較して示す。ＮＯＤ ＳＣＩＤマウスに、患者ＰＡ５３６３からの腫瘍細胞（５１０００個の細胞）を皮下（sc）投与した。担腫瘍マウスの処置は、腹腔内（ip）に４０ｍｇ／ｋｇの用量でＡＤＣを用いて行われた。腫瘍成長を、デジタルノギスによって評価した（ｎ＝１０ マウス／群）。平均及びＳＥＭ、°Ｐ＜０．０５対セツキシマブ、＊＊＊Ｐ＜０．００１対ビヒクル。 図１８は、ＳＫＯＶ−３卵巣癌に対して、ｑ４ｄｘ４スケジュールに従って腹腔内送達されたＳＴ８１７８ＡＡ１（２７）の抗腫瘍活性を、トラスツズマブと比較して示す。５×１０６個のＳＫＯＶ−３卵巣細胞の皮下（s.c.）注射後、腫瘍をＮｕ／Ｎｕマウスに発生させた。処置は、腹腔内（ip）に１５ｍｇ／ｋｇでＡＤＣ及びトラスツズマブを用いて行われた（ｎ＝１１ マウス／群；平均及びＳＥＭ、＊Ｐ＜０．０５対ビヒクル、°Ｐ＜０．０５対トラスツズマブ、マン・ホイットニーの検定）。 図１９は、ＳＫＯＶ−３卵巣癌に対して、ｑ４ｄｘ４スケジュールに従って腹腔内送達されたＳＴ８１７６ＡＡ１（２８）の抗腫瘍活性を、トラスツズマブと比較して示す。５×１０６個のＳＫＯＶ−３卵巣細胞の皮下（s.c.）注射後、腫瘍をＮｕ／Ｎｕマウスに発生させた。処置は、腹腔内（ip）に３０及び１５ｍｇ／ｋｇでＡＤＣ及びトラスツズマブを用いて行われた（ｎ＝１２ マウス／群；平均及びＳＥＭ、＊Ｐ＜０．０５対ビヒクル、°Ｐ＜０．０５対トラスツズマブ、マン・ホイットニーの検定）。 図２０は、ＳＫＯＶ−３卵巣癌に対して、ｑ４ｄｘ４スケジュールに従って腹腔内送達されたＳＴ８１７６ＡＡ１（２８）の抗腫瘍活性を、トラスツズマブと比較して示す。１０×１０６個のＳＫＯＶ−３卵巣細胞の腹腔内（i.）注射後、腫瘍をＮｕ／Ｎｕマウスに発生させた。処置は、腹腔内（ip）に１５ｍｇ／ｋｇでＡＤＣ及びトラスツズマブを用いて行われた（ｎ＝９ マウス／群）。生存率曲線を、カプラン−マイヤー（Kaplan-Meier）解析によってプロットした。＊Ｐ＜０．０５及び＊＊Ｐ＜０．０１対ビヒクル、°Ｐ＜０．０５対トラスツズマブ。 図２１は、ＬＳ１７４−Ｔ結腸癌に対して、ｑ４ｄｘ４スケジュールに従って腹腔内送達されたＳＴ８１７６ＡＡ１（２８）の抗腫瘍活性を、トラスツズマブと比較して示す。１０×１０６個のＬＳ１７４Ｔ結腸癌細胞の腹腔内（i.）注射後、腫瘍をＮｕ／Ｎｕマウスに発生させた。処置は、腹腔内（ip）に１５ｍｇ／ｋｇでＡＤＣ及びトラスツズマブを用いて行われた（ｎ＝１０ マウス／群）。生存率曲線を、カプラン−マイヤー解析によってプロットした。Ｐ値を、両側ログランク検定（two-sides log rank-test）、＊Ｐ＜０．０５対ビヒクル及び°Ｐ＜０．０５対トラスツズマブを用いて計算した。 図２２は、ＬＳ−１７４Ｔ結腸癌に対して、ｑ４ｄｘ４スケジュールに従って腹腔内送達されたＳＴ８１７６ＡＡ１（２８）の抗腫瘍活性を、トラスツズマブと比較して示す。５×１０６個のＬＳ１７４−Ｔ結腸癌細胞の皮下（s.c.）注射後、腫瘍をＮｕ／Ｎｕマウスに発生させた。処置は、腹腔内（ip）に１５ｍｇ／ｋｇでＡＤＣ及びトラスツズマブを用いて行われた（ｎ＝１０ マウス／群；平均及びＳＥＭ、＊ｐ＜０．０５対ビヒクル、°Ｐ＜０．０５対トラスツズマブ、マン・ホイットニーの検定）。 図２３は、ＰＤＸ（患者由来異種移植片）膵臓癌に対して、ｑ４ｄｘ４スケジュールに従って腹腔内送達されたＳＴ８１７６ＡＡ１（２８）の抗腫瘍活性を、トラスツズマブと比較して示す。患者ＰＡ５３６３からのヒト膵臓腫瘍細胞（７７×１０３個の細胞）を、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに皮下（sc）注射した。処置は、１５ｍｇ／ｋｇでＳＴ８１７６ＡＡ１又はトラスツズマブを用いて行われた（ｎ＝１０ マウス／群；平均及びＳＥＭ、＊Ｐ＜０．０５対ビヒクル及び°Ｐ＜０．０５対トラスツズマブ、マン・ホイットニーの検定）。
（発明の詳細な説明）
本発明は、ＨＤＡＣｉ系（ＨＤＡＣｉベースの）ペイロードに結合した抗癌抗体から作製された新規なＡＤＣに関する。このようなＡＤＣは、腫瘍受容体を特異的に結合し、内在化（インターナリゼーション）され、そしてリソソームに送達されることが示されている。これらの特性は、驚くべきことに、ＨＤＡＣペイロードの低い効力にもかかわらず、in vitro細胞傷害性及びin vivo抗腫瘍活性と相関する。本発明の抗体薬物コンジュゲートは、１若しくは複数のヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームの調節（modulation）及びＥｒｂＢ受容体の発現が治療介入に有効な腫瘍又は任意の他の疾患の治療において特に有用である。
本発明は、抗体（特に、癌治療のために使用される免疫グロブリン）にリンカーで結合した安全なＨＤＡＣｉを含む、安全かつ有効な（efficacy）ＡＤＣを記載する。エピジェネティックモジュレーターであるＨＤＡＣ阻害剤は、負の作用及び毒性作用を低減しつつ、ＡＤＣの構築を可能にする。
本発明の好ましい実施形態は、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２又はＥｒｂＢ３などの受容体を発現する癌の治療のためにＨＤＡＣｉ系ＡＤＣを使用することであり、癌の例としては、肺癌、乳癌、結腸癌、脳癌、頭頸部癌、子宮内膜癌、腎臓癌、膵臓癌、胃癌、食道癌、卵巣癌及び前立腺癌並びに白血病が挙げられる。
本発明は、式（Ｉ）
Ｄ−（ＣＵ）ｍ−（Ｓ１）ｎ−Ｌ−（Ｓ２）ｏ−（ＣＧ）ｐ−Ａｂ
（式Ｉ）
の抗体薬物コンジュゲート又はその薬学的に許容可能な塩に関し、式中、
Ｄは、細胞傷害性薬物（弾頭（warhead）とも称される）であって、亜鉛結合基（ＺＢＧ）としてのベンズアミド、ヒドロキサマート又はチオール基を含むヒストン脱アセチル化酵素阻害剤薬物であり、
ＣＵは、連結ユニットであって、存在しなくてもよいか、又は
から選択され、
Ｓ１は、スペーサーであって、存在しなくてもよいか、又は
であり、
Ｌは、リンカーであって、（ＣＨ２）ｑ−ＣＯ、ＮＨ−（ＣＨ２）ｒ−（ＰＥＧ）ｓ−（ＣＨ２）ｗ−ＣＯ、ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｒ−（ＰＥＧ）ｓ−Ｘ−（ＣＨ２）ｗ−ＣＯから選択され、式中、Ｘは、存在しなくてもよいか、ＮＨ又はＯであってもよく、ｑは、２〜８の整数であり、ｒは、存在しなくてもよいか、又は１〜４の整数であり、ｓは、存在しなくてもよいか、又は１〜６の整数であり、ｗは、存在しなくてもよいか、又は１〜２の整数であり、
Ｓ２は、スペーサーであって、存在しなくてもよいか、又は
であり、
ＣＧは、抗体のシステインチオール基又はリシンアミノ基への結合後に形成された連結基であって、存在しなくてもよいか、又は以下の部分の一つであってもよい：
式中、ｙは、０〜８の整数であり、
Ａｂは、抗体又はその抗原結合性フラグメントであり、
ｍ、ｎ、ｏ及びｐは、０又は１の整数を示す。
リンカー（Ｌ）は、好ましくは、
から選択され、式中、ｎは、２〜５の整数である。
特に、ペイロードは、適切なリンカー／スペーサーに結合した毒素（ＨＤＡＣ阻害剤）であって、抗体への結合に適した基（すなわち、マレイミド、ＮＨＳエステル）を末端に有し、式Ｉの以下の部分：
Ｄ−（ＣＵ）ｍ−（Ｓ１）ｎ−Ｌ−（Ｓ２）ｏ−（ＣＧ）’ｐ
式ＩＩ
を含む。
本発明において、式ＩＩのペイロードにおける（ＣＧ）は、下記式：
のＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）又は活性化アシル誘導体（ペンタフルオロフェニル（pentaflurophenyl）エステル、ｐ−ニトロ及び２，４−ジニトロフェノールエステル、チオフェノールエステル、アシルイミダゾール、イソブチルカルボナート、トリクロロ安息香酸無水物を含む）、又はマレイミド−若しくは３−メチレンスクシンイミド、３，４−ジブロモマレイミド又は｛アミノ−カルボニル｝−３−ブテン酸であってもよい。
ペイロードＤ−（ＣＵ）ｍ−（Ｓ１）ｎ−Ｌ−（Ｓ２）ｏ−（ＣＧ）ｐ−において使用されるヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（ＨＤＡＣ）は、当該分野において公知のヒストン脱アセチル化酵素阻害剤であってもよく、以下のカテゴリーのものであってもよい：
・下記式を有するＳＴ７４６４ＡＡ１及びＳＴ７６６０ＡＡ１（ボリノスタット（vorinostat）のチオールアナログ）などのチオール系ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤：
・下記式を有するボリノスタット（ＳＡＨＡ）、パノビノスタット（panobinostat）（ＬＢＨ５８９）若しくはダシノスタット（dacinostat）（ＬＡＱ８２４）などのヒドロキサム酸系ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（ＨＤＡＣ）：
・下記式を有するエンチノスタット（entinostat）（ＭＳ２７５）及びチダミド（chidamide）（ＣＳ０５５）などのベンズアミド系ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（ＨＤＡＣ）：
特定の実施形態において、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤は、ＳＴ７４６４ＡＡ１、対応するプロドラッグＳＴ７６１２ＡＡ１の薬物、経口チオール系ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤である。
ペイロードは、「脱離基」を含む。脱離基とは、置換反応において別の基によって置換できる基をいう。このような脱離基は、当該分野において周知であり、例としては、ハロゲン化物（フッ化物、塩化物、臭化物及びヨウ化物）、アジド（アジ化物）、スルホナート（スルホネート）［例えば、エタンスルホナート及びトリフルオトメタンスルホナート（trifluoromeethanesulfonate）などの任意に置換されたＣ１−Ｃ６アルカンスルホナート、又はトルエンスルホナートなどの任意に置換されたＣ７−Ｃ１２アルキルベンゼンスルホナート］、スクシンイミド−Ｎ−オキシド、ｐ−ニトロフェノキシド、ペンタフルオロフェノキシド、テトラフルオロフェノキシド、カルボキシラート（arboxylates）、アミノカルボキシラート（カルバマート）及びアルコキシカルボキシラート（カルボナート）が挙げられるが、これらに限定されない。飽和炭素における置換については、ハロゲン化物及びスルホナートが好ましい脱離基である。カルボニル炭素における置換については、例えば、ハロゲン化物、スクシンイミド−Ｎ−オキシド、ｐ−ニトロフェノキシド、ペンタフルオロフェノキシド、テトラフルオロフェノキシド、カルボキシラート又はアルコキシカルボキシラート（カルボナート）が、脱離基として使用されてもよい。用語「脱離基」はまた、脱離反応（例えば、電子カスケード反応又はスピロ環化（pirocyclization）反応）の結果として脱離される基もいう。この場合、例えば、ハロゲン化物、スルホナート、アジド、アミノカルボキシラート（カルバマート）又はアルコキシカルボキシラート（カルボナート）が、脱離基として使用されてもよい。
化学官能基を別のものへ変換するには、望ましくない副反応を回避するためこのような官能基を含む化合物中の１又は複数の反応中心を保護しなければならないことが必要であることは、当業者にとって公知である。このような反応中心の保護、及びそれに続く合成変換の終わりでの脱保護は、文献に記載されている標準的な手順に従って達成できる（例えば、Green, Theodora W.及びWuts, Peter G.M. - Protective Groups in Organic Synthesis, Third Edition, John Wiley & Sons Inc., New York (NY), 1999を参照のこと）。
特に好ましい実施形態において、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（histone deacetlyase inhibitor）は、上記に示されるように、化合物ＳＴ７４６４ＡＡ１のプロドラッグである化合物ＳＴ７６１２ＡＡ１である。
本発明において有用なペイロードのさらなる例は、上記表１の化合物である。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）部分又は部位（moiety）を含む特定のリンカーを有するペイロード（すなわち、ＳＴ８１２８ＡＡ１、ＳＴ８１３２ＡＡ１）は、アミド結合を介して、ｍＡｂのＬｙｓ残基の側鎖に共有結合することができ、ｍＡｂは、抗体リシンと反応し得るアミノ特異的ＮＨＳエステルを含む。マレイミド部分を含む特定のリンカーを有するペイロード（すなわち、ＳＴ８１５２ＡＡ１、ＳＴ８１８９ＡＡ１）は、マレイミド−チオール結合反応（conjugation reaction）を介して、それらの還元後にｍＡｂのＣｙｓに共有結合することができる。
抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、ペイロードとは連結基（ＣＧ）が異なり、この連結基（ＣＧ）は、ペイロード（ＣＧ）’ではＮＨＳ又はマレイミドであり、抗体コンジュゲートでは、ＮＨＳペイロード系（ＮＨＳペイロードベースの）ＡＤＣにおいては（ＣＧ）は存在せず、マレイミドペイロード系（マレイミドペイロードベースの）ＡＤＣにおいてはスクシンイミジル部分である。
また、スペーサー（Ｓ１）が存在する場合、スペーサー（Ｓ１）は、切断可能なものであってもよく、切断不可能なものであってもよい。プロテアーゼで切断可能な典型的なスペーサーは、バリン−シトルリン（Ｖａｌ−Ｃｉｔ）ジペプチドなどの、標的細胞における薬物の速やかな酵素遊離を特徴とする部分を含む。
切断可能なスペーサーの例は、
である。
切断不可能なスペーサーの例は、
（式中、ｎ＝０〜４）
である。
特許請求された抗体薬物コンジュゲートは、さらに、リンカー（Ｌ）を含んでいてもよく、リンカー（Ｌ）は、（ＣＨ２）ｑ−ＣＯ、ＮＨ−（ＣＨ２）ｒ−（ＰＥＧ）ｓ−（ＣＨ２）ｗ−ＣＯ、ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｒ−（ＰＥＧ）ｓ−Ｘ−（ＣＨ２）ｗ−ＣＯであってもよく、式中、Ｘは、存在しなくてもよいか、ＮＨ又はＯであってもよく、ｑは、２〜８であり、ｒは、存在しないか、又は１〜４であり、ｓは、存在しないか、又は１〜６であり、ｗは、存在しないか、又は１〜２である。
リンカー（Ｌ）の例は：
（式中、ｎ＝２〜５）
である。
特許請求された抗体薬物コンジュゲートは、さらに、抗体のシステインチオール基又はリシンアミノ基への結合後に形成された連結基（ＣＧ）を含んでいてもよく、この連結基は、存在しなくてもよいか、又は以下の部分の一つであってもよい：ＮＨＳ若しくは活性化アシル誘導体（１−ヒドロキシベンゾトリアゾールエステル、２−シアノ−２−（ヒドロキシイミノ）酢酸エチルエステル、Ｎ−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロ−キノリンエステル、ペンタフルオロフェニル（pentaflurophenyl）エステル、ｐ−ニトロ及び２，４−ジニトロフェノールエステル、チオフェノールエステル、アシルイミダゾール、イソブチルカルボナート、トリクロロ安息香酸無水物、ピバル酸無水物、３，５−ジメトキシトリアジンを含む）、又は下記式のマレイミド−若しくは３−メチレンスクシンイミド、３，４−ジブロモマレイミド又は｛アミノ−カルボニル｝−３−ブテン酸：
（式中、ｙは０〜８である）。
本明細書に記載の免疫グロブリンベクターは、チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）ファミリーの受容体に対するものである。チロシンキナーゼファミリーは、細胞増殖、生存、分化又は遊走に関与する基質タンパク質をリン酸化することによって細胞内シグナル伝達を媒介する膜貫通タンパク質のスーパーファミリーである。
特に、ヒト上皮成長因子受容体（ＨＥＲ）ファミリーは、ＲＴＫスーパーファミリーに属し、四つのメンバーを含む：ＥｒｂＢ１／ＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３及びＥｒｂＢ４。生理学的に、これらの受容体は、ＥＧＦファミリーのリガンドによって活性化される。
ＥＧＦＲは、多くの腫瘍型で観察される変異及び過剰発現を有する、多くのヒト癌腫の発生及び維持において因果的役割を果たす（Burgess AW 2008 Growth Factors 26: 263-74）。
ＥＧＦＲは、肺癌、頭頸部癌、結腸癌及び膵臓癌において広く使用されている抗体並びにチロシンキナーゼ阻害剤に対する臨床的に確証された標的となっている（Mendelsohn J 2006 Semin Oncol 33: 369-85；Feiner 2016 Exp Rev Proteomics, Sep 13: 817-32；Enrique AA 2012 Front Biosci 4: 12-22；Landi L 2014 Expert Opin Pharmacol Ther 15: 2293-305）。
これらの阻害剤の成功にもかかわらず、ＥＧＦＲ陽性腫瘍を有するかなりの数の患者は、一連の変異（例えば、ＥＧＦＲ、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＰＩ３Ｋ及びＰＴＥＮ）が内因性又は後天的耐性に寄与している可能性があるので、現在のＥＧＦＲ標的治療に応答できない（Chong CR 2013 Nat Med 19: 1389-400）。
ＥＧＦＲを標的とする微小管阻害剤系ＡＤＣは、下流のシグナル伝達変異によってなされる耐性を回避することによって抗ＥＧＦＲ抗体の活性を改善し得るという点で、疑問のある治療ストラテジーであるが、これらの抗体の公知の毒性（すなわち、皮膚発疹、下痢、便秘、口内炎、疲労及び電解質異常（electrolyte disturbances））のために（Li T 2009 Target Oncol 4: 107-19)、適用が限定されるかもしれない。驚くべきことに、低毒性ＨＤＡＣｉに結合した抗ＥＧＦＲファミリータンパク質抗体から作製されたＡＤＣは、有効な抗癌剤であることが見出された。
特許請求された抗体薬物コンジュゲートにおいて使用される抗体は、特に、ＥＧＦＲファミリータンパク質に対する抗体である。特に、抗体は、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２又はＥｒｂＢ３受容体に対するものでもよい。他の抗体に結合した同じペイロードは、腫瘍細胞によって内在化された他の受容体に対して、ＨＤＡＣｉを放出させることができる。
例えば、ＥＧＦＲと同様に、様々なヒト癌の成長（増殖）、生存及び拡散に関係し、異なる固形腫瘍において過剰発現されるｃ−Ｍｅｔは、ＨＧＦ（肝細胞増殖因子）結合に応答して内在化されて、ｃ−Ｍｅｔユビキチン化及び分解をもたらす（Mellman 2013 Cold Spring Harb Perspect Biol 5:a016949）。
さらに、インテグリンは、腫瘍−間質相互作用において大きな役割を有し、２５の異なるインテグリンヘテロ二量体の異常なリサイクリングは、腫瘍の成長（増殖）、浸潤、転移及びアポトーシスの回避に関与している（Mosesson 2008 Nat Rev Cancer 8: 835-50）。
一実施形態において、抗体は、トラスツズマブ、セツキシマブ、ベバシズマブ（Bevacizumab）、パニツムマブ（Panitumumab）、抗ＣＤ４又は抗ＣＤ３０抗体、及び関連するバイオシミラー（biosimilar）抗体から選択される。
抗体又は免疫グロブリンという用語は、より広い意味で互換可能に用いられてもよく、所望の生物学的活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単離された抗体、操作された抗体又は組換え抗体、全長又は無傷（intact）抗体、二重特異性抗体若しくはその抗体フラグメントなどの多価又は多重特異性抗体が挙げられる。生細胞内での組換えＤＮＡの発現の結果である組換え抗体の場合、抗体は任意の種に由来してもよく、好ましくはヒト、ラット、マウス及びウサギに由来する。抗体がヒト種以外の種に由来する場合、抗体は、好ましくは、当該分野において周知の技術に従って調製されたキメラ抗体又はヒト化（humanized）抗体である。
抗体はまた、化学的に合成された抗体であってもよい。
抗体は、問題となっている癌又は腫瘍細胞、特に、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２及び／又はＥｒｂＢ３受容体を発現する癌又は腫瘍細胞を標的とすることができる。特に、抗体は、前記癌又は腫瘍細胞を認識する性質、前記癌又は腫瘍細胞に結合する性質、及び腫瘍又は癌細胞に内在化する性質を有する。
前記抗体を調製する方法は、当該分野において周知である［すなわち、Chem. Soc. Rev., 2016, 45, 1691-1719；Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 26 (2016) 1542-1545］。
抗体の代わりに、抗原結合フラグメントを使用することもできる。抗原結合フラグメントは、抗体の標的（抗原）に結合する能力を保持する任意のペプチド、ポリペプチド又はタンパク質を示す。抗原結合フラグメントの例は、Ｆｖ、ＳｃＦｖ（Ｓｃは、一本鎖を意味する）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ＳｃＦｖ’、Ｆｃフラグメント若しくは二重特異性抗体（Diabodies）、又は半減期が化学修飾（例えば、ペグ化など）若しくはリポソームへの組み込み（incorporation）によって増大しているフラグメントである。
一実施形態において、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）又はその薬学的に許容可能な塩は、下記式を有する化合物によって選択される：
式Ｉの他の実施形態において、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）又はその薬学的に許容可能な塩などの、式（Ｉｆ）の化合物が提供される：
以下に、ＨＤＡＣｉ系（ＨＤＡＣｉベースの）ＡＤＣの一般的な図式を示す。活性薬物（Ｄ）は、ＳＴ７６１２ＡＡ１の活性薬物に対応するＳＴ７４６４ＡＡ１によって表される。ＳＴ７４６４ＡＡ１は、本発明に記載のＡＤＣ（式Ｉ）及びペイロード（式ＩＩ）における可能な薬物の一つである。
上記は、代表的なＨＤＡＣ阻害剤系（ＨＤＡＣ阻害剤ベースの）抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の一般的な図式である。
他の実施形態は、ペイロードの調製方法であって、この方法は、ＨＤＡＣ阻害剤のチオール、ヒドロキサム酸またはベンズアミド残基に対して、適切な連結ユニット（Ｃ．Ｕ．）を導入することを含み、この連結ユニットには、もしあればペイロードの他の成分を結合する。スペーサー（Ｓ１）［切断（又は解離）可能（通常、バリン−シトルリンジペプチド（Ｖａｌ−Ｃｉｔ）、酵素カテプシンの基質）であってもよく、切断可能でなくてもよい］、リンカー（Ｌ）、第２のスペーサー（Ｓ２）、及びリシン又はシステイン抗体への結合に適した末端基（ＣＧ）’。
他の実施形態は、ＨＤＡＣ阻害剤系抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の調製方法であって、この方法は、通常、分子のペイロード部分の残基（ＣＧ）’と、免疫グロブリン（Ａｂ）のリシン残基のアミノ基との間の結合反応（conjugation reaction）からなる。システインへの結合のために、免疫グロブリンのＳ−Ｓシスチン結合を、適切な還元剤で予め還元しなければならない。遊離システイン残基のスルフヒドリル基（−ＳＨ）については、適切な基（ＣＧ）’を有するペイロードとの結合の後続反応が進行する。
本発明はまた、上記抗体薬物コンジュゲートを含む医薬組成物に関する。前記医薬組成物は、少なくとも賦形剤及び／又は薬学的に許容可能なビヒクルを含む。この有効成分は、慣用の薬学的キャリアと混合して動物又はヒトに投与する単位形態（unit form）で投与することができる。投与の適切な単位形態は、経腸又は非経口投与の形態を含み、経腸投与は、経口、エアロゾル、直腸又は経頬経路を含み、非経口投与は、皮下、筋肉内又は静脈内及び皮内経路を含む。
医薬組成物は、経腸又は非経口投与用であってもよく、経腸投与は、経口、エアロゾル、直腸又は経頬経路を含み、非経口投与は、静脈内、筋肉内（intramuscolar）及び皮内経路を含む。
経口投与用の固形組成物は、錠剤、丸剤、散剤、カプセル剤又は顆粒剤であってもよい。これらの組成物において、本発明の抗体薬物コンジュゲートは、デンプン、セルロース、スクロース、ラクトース又はシリカなどの１又は複数の不活性希釈剤と混合される。これらの組成物はまた、ステアリン酸マグネシウム若しくはタルクなどの滑沢剤、又は着色剤、又はコーティング剤などの物質をさらに含んでもよい。
非経口投与用の殺菌（又は滅菌（sterile））組成物は、好ましくは、水性若しくは非水性液剤、懸濁剤又は乳剤であってもよい。使用される溶媒又はビヒクルは、水、プロピレングリコール若しくはポリエチレングリコール、植物油、注射可能な有機エステル又は他の適切な有機溶媒から作製されてもよい。これらの組成物はまた、アジュバント、特に、湿潤剤、等張化剤、乳化剤、分散剤及び安定剤を含んでもよい。
本発明は、新たなＡＤＣによって提供される有効性の実証におけるin vitro細胞増殖アッセイを報告する。
本発明の特定の実施形態は、噴霧（nebulization）による局所送達に適した処方物である。この関連で、本発明の抗体薬物コンジュゲートは、肺癌若しくは腹膜癌などの肺若しくは腹膜に関連する疾患、又は卵巣、子宮頸部−子宮内膜、胃、結腸、虫垂、腹膜偽粘液腫、膵臓、肝転移、まれな新生物（rare neoplasie）（消化管組織ではない腹部肉腫）由来の癌の治療に特に適している。
本発明はまた、癌、細胞増殖障害及びウイルス感染を治療する方法における使用のために、上記に定義した式（Ｉ）の化合物を提供する。
好ましくは、上記に定義した式（Ｉ）の化合物は、特定の型の癌を治療する方法において用いられ、特定の型の癌としては、膀胱癌、乳癌、結腸癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌（小細胞肺癌を含む）、食道癌、胆嚢癌、卵巣癌、膵臓癌、胃癌、子宮頸癌、甲状腺癌、前立腺癌及び皮膚癌（扁平上皮癌を含む）を含む癌腫；白血病、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、有毛細胞リンパ腫及びバーキットリンパ腫を含むリンパ系の造血器腫瘍；急性及び慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群並びに前骨髄球性白血病を含む骨髄細胞系の造血器腫瘍；線維肉腫及び横紋筋肉腫を含む間葉系に由来する腫瘍；星細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫及び神経鞘腫を含む中枢及び末梢神経系の腫瘍；並びに黒色腫（メラノーマ）、精上皮腫（セミノーマ）、奇形癌腫（テラトカルシノーマ）、骨肉腫、色素性乾皮症、ケラトキサントーマ（keratoxanthoma）、甲状腺濾胞癌、カポジ肉腫及び中皮腫を含む他の腫瘍などが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明は、新たなＡＤＣによって提供される有効性の実証におけるin vitro細胞増殖アッセイを報告する。
本発明の化合物は、遊離抗体と同等の様式で受容体に結合し、ＥｒｂＢ１及びＥｒｂＢ２発現腫瘍細胞へのＡＤＣの結合は、ＦＡＣＳ解析によって確認された。
蛍光分析により、本発明の化合物が、結合率（binding rate）を低下させることなく、それらの天然の対応抗体（counterpart antibodies）と同等の様式で腫瘍細胞に内在化できることが実証された。また、本発明のすべてのＡＤＣは、例えば、セツキシマブ又はトラスツズマブのようなＡＤＣに結合した天然の抗体と同等の効力で、それらの特異的な受容体と反応する。
本発明のＡＤＣは、噴霧されたときにそれらの完全性（integrity）を維持し、噴霧用の組成物中に含まれていてもよく、呼吸器疾患においてｍＡｂを送達するための強力な方法を表す。この方法は、肺への薬物の標的化に適した非侵襲的方法であり、第２の器官（secondary organs）への曝露を制限する。
本発明の化合物は、肺腺癌細胞に対して評価される場合、セツキシマブ単独のＩＣ５０値よりも低いＩＣ５０値で腫瘍細胞増殖を抑制し、従って、本発明の化合物の抗腫瘍有効性を確認する。
試験したすべてのＡＤＣは、ＨＤＡＣ６及びクラスＩ ＨＤＡＣそれぞれの直接的な酵素阻害により、試験したすべての腫瘍細胞株においてα−チューブリン及びヒストンＨ３の両方のアセチル化レベルの関連する増大を誘導した。
in vivo実験は、本発明の化合物が、セツキシマブ及びトラスツズマブ単独と比較して、肺腫瘍、結腸腫瘍、膵臓腫瘍、卵巣腫瘍の成長の抑制により効率的であることを実証した。
新たなＡＤＣは、加圧腹腔内エアロゾル化学療法（ＰＩＰＡＣ）に有用な、局所腫瘍に対するエアロゾル送達及び腹腔内経路によって抗腫瘍活性を示す。
（実施例）
以下の実施例を参照して、本発明をさらに記載する。当業者は、これらの実施例が単に例示を目的としたものであり、本発明の範囲を限定するように解釈されるべきではないことを理解するであろう。
実施例１：ペイロード（１）、ＳＴ８１２８ＡＡ１の合成及びキャラクタリゼーション
（Ｅ）−６−（３−カルボキシアクリルアミド）ヘキサン酸［３］
６−アミノカプロン酸［１］（２．６ｇ、１９．９ｍｍｏｌ）を氷酢酸（１０ｍＬ）に溶解した攪拌溶液に、無水マレイン酸［２］（１．９５ｇ、１９．９ｍｍｏｌ）を氷酢酸（１０ｍＬ）に溶解した溶液を滴下する。この混合物を、室温で３時間維持する。次いで、反応中に形成された沈殿物を濾過し、ジエチルエーテルで洗浄して、化合物［３］を白色固体４．３ｇ（９５％収率）として得る。この固体をさらに精製する必要はない。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ９．１０（ｓ，１Ｈ），６．３５（ｄ，Ｊ＝１２．６Ｈｚ，１Ｈ），６．１８（ｄ，Ｊ＝１２．６Ｈｚ，１Ｈ），３．１２（ｍ，２Ｈ），２．１５（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），１．４４（ｍ，４Ｈ），１．３３−１．１２（ｍ，２Ｈ）。
１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ１７４．８，１７２．４，１６５．８，１３３．５，１３２．２，３３．９，２８．５，２６．３，２４．５，２１．４。
６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサン酸［４］
化合物［３］（４．３ｇ、２０．３７ｍｍｏｌ）をジメチルアセトアミド（２０ｍＬ）に溶解した溶液に、無水酢酸（３．８ｍＬ、４０．７５ｍｍｏｌ）及び酢酸ナトリウム（４１８ｍｇ、５．０９ｍｍｏｌ）を、激しく攪拌しながら室温で添加し、次いで１００℃で２時間加熱する。次いで、この混合物を室温まで冷却し、ジクロロメタン（３５ｍＬ）で希釈し、ＨＣｌ ０．５Ｍで５〜６回（各１０ｍＬで６回（6 portions））洗浄して、ジメチルアセトアミドを除去する。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、溶媒を真空下で除去して、生成物［４］を無色油状物２．５ｇ（５８％収率）として得る。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ）δ９．８７（ｂｓ，１Ｈ），６．７６（ｄ，Ｊ＝１．６Ｈｚ，２Ｈ），３．５４−３．３８（ｍ，２Ｈ），２．５２−２．３９（ｍ，１Ｈ），２．３０−２．２６（ｍ，１Ｈ），１．７０−１．４６（ｍ，４Ｈ），１．３９−１．１９（ｍ，２Ｈ）。
１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ）δ１７９．４，１７１．１，１３３．９，３６．９，３３．２，２９．２，２４．１，２３．３。
６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサン酸２，５−ジオキソピロリジン−１−イル［５］
化合物［４］（２．５ｇ、１１．８４ｍｍｏｌ）を無水ジクロロメタン（１５ｍＬ）に溶解した攪拌溶液（stirrer solution）に、ジシクロヘキシルカルボジイミド（２．６８ｇ、１３．０２ｍｍｏｌ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１．３６ｇ、１１．８４ｍｍｏｌ）を室温で添加し、この混合物を室温で３時間攪拌する。白色固体をジクロロメタンで濾過してジシクロヘキシル尿素を除去し、有機相をＨＣｌ ０．１Ｎ及び水で洗浄し、次いで無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を回転蒸発（rotatory evaporation）によって除去する。得られた残渣を、中圧システムＳｅｐａｃｏｒｅ（セパコア）（登録商標）（ビュッヒ（Buchi））を用いてフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル；グラジエントＡ：石油エーテル／Ｂ：酢酸エチル；Ｂ％ ０〜８０／１５分）に供して、活性化酸［５］を白色固体２．４ｇ（７０％）として得る。ＭＳ：ｍ／ｚ ３０９［Ｍ＋Ｈ］＋。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ）δ６．７８（ｓ，２Ｈ），３．４９−３．４６（ｍ，２Ｈ），２．８２（ｓ，４Ｈ），２．６２−２．５９（ｍ，２Ｈ），１．７８−１．６５（ｍ，２Ｈ），１．６４−１．５０（ｍ，２Ｈ），１．４６−１．２６（ｍ，２Ｈ）。
１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ）δ１６９．８，１６９．０，１６７．３，１３２．５，３５．４，２８．６，２６．１，２３．８，２３．６，２２．３。
４−（（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド）メチル）シクロヘキサンカルボン酸［７］
化合物［５］（２．４６ｇ、７．９８ｍｍｏｌ）を氷酢酸（２０ｍＬ）に溶解した攪拌溶液に、ｔｒａｎｓ−４−（アミノメチル）−シクロヘキサンカルボン酸［６］（２．３８ｇ、１５．１７ｍｍｏｌ）を室温で添加し、この反応混合物を室温で１６時間攪拌する。酢酸を減圧下で除去し、残渣をジクロロメタンで希釈し、水で洗浄してＮ−ヒドロキシスクシンアミドを除去する。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、溶媒を真空下で除去する。残渣を、中圧システムＳｅｐａｃｏｒｅ（登録商標）（ビュッヒ）を用いてフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、石油エーテル中酢酸エチルのグラジエント０〜１００％／７分、及び酢酸エチル１００％／５分）に供して、化合物［７］を白色固体８０７ｍｇ（３０％収率）として得る。ＭＳ：ｍ／ｚ ３４９［Ｍ−Ｈ］＋。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ）δ１０．４７（ｂｓ，１Ｈ），７．８１（ｓ，１Ｈ），６．６６（ｄ，Ｊ＝２．３Ｈｚ，２Ｈ），３．３５（ｓ，２Ｈ），２．８８（ｓ，２Ｈ），２．０４（ｓ，２Ｈ），１．８６（ｄ，Ｊ＝１０．５Ｈｚ，２Ｈ），１．６８（ｄ，Ｊ＝１０．１Ｈｚ，２Ｈ），１．４７（ｓ，２Ｈ），１．３６−１．０３（ｍ，８Ｈ），０．８５（ｄ，Ｊ＝１１．７Ｈｚ，２Ｈ）。
１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ）δ１７６．８，１７３．０，１６９．５，１３２．４，４３．４，４１．５，３５．９，３５．５，３３．８，２７．９，２６．６，２５．９，２４．４，２３．６。
４−（（６−（２，５−ジオキソ−３−（（７−オキソ−６−（５−オキソピロリジン−２−カルボキサミド）−７−（フェニルアミノ）ヘプチル）チオ）ピロリジン−１−イル）ヘキサンアミド）メチル）シクロヘキサンカルボン酸（８）
ＳＴ７６１２ＡＡ１（１００ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）を脱気メタノールに溶解した溶液に、チオメチル酸ナトリウム１Ｍを脱気メタノール（１７ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ、０．２５０ｍＬ）に溶解した溶液を室温で添加する。この攪拌混合物を室温で３０分間維持する。この反応混合物をＮ２で５〜１０分間フラッシュしてＭｅＳＨを除去し、化合物７（８８ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）を添加する。この混合物を室温で１６時間保持する。次いで、溶媒を回転蒸発によって除去し、粗生成物を、カラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン中メタノールのグラジエント２〜２０％）によって精製する。化合物（８）は、白色固体１０２ｍｇ（５７％）として得られる。ＭＳ：ｍ／ｚ ７３７［Ｍ＋Ｎａ］＋。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ）δ９．９７（ｂｓ，ｓ），７．９２（ｍ ２Ｈ），７．６０（ｍ，２Ｈ），７．３４（ｍ，２Ｈ），７．１４（ｍ，１Ｈ），４．５７（ｍ，１Ｈ），４．３１（ｍ，１Ｈ），３．５４（ｍ，２Ｈ），３．０６（ｄ，Ｊ＝４．７Ｈｚ，２Ｈ），２．４９−２．１４（ｍ，４Ｈ），２．１０−２．０２（ｍ，７Ｈ），１．８７−１．６２（ｍ，１２Ｈ），１．７６−１．２３（ｍ，１２Ｈ），１．０１（ｄ，Ｊ＝１２．４Ｈｚ，２Ｈ）。
１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ）δ１７９．６，１７８．４，１７７．０，１７５．３，１７４．７，１７３．０，１７０．７，１２８．０（２Ｃ），１２３．７，１１９．５（２Ｃ），７７．６，５６．２，５３．５，４４．６（２Ｃ），４２．７，３８．６，３７．７，３５．５，３５．０，３１．４，３０．３，２９．１（２Ｃ），２８．９，２８．０（３Ｃ），２７．４，２６．４，２５．５，２５．０，２４．６，２４．４。
４−（（６−（２，５−ジオキソ−３−（（７−オキソ−６−（５−オキソピロリジン−２−カルボキサミド）−７−（フェニルアミノ）ヘプチル）チオ）ピロリジン−１−イル）ヘキサンアミド）メチル）シクロヘキサンカルボン酸２，５−ジオキソピロリジン−１−イル（１），ＳＴ８１２８ＡＡ１
Ｎ２下、５０ｍＬフラスコ中で、化合物［８］（１０２ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）を、０．１ｍＬの乾燥ジメチルホルムアミドを含む無水ジクロロメタン（５ｍＬ）に溶解する。Ｎ−ヒドロキシスクシンアミド（２４ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ）及びジシクロカルボジイミド（５０ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）を室温で添加し、この反応混合物を室温で１６時間攪拌する。溶媒を除去し、残渣をフラッシュクロマトグラフィー（ジクロロメタン中２〜６％メタノール）によって精製する。生成物ＳＴ８１２８ＡＡ１は、無色粘稠液；１０１ｍｇ（９０％収率）として得られる。ＭＳ：ｍ／ｚ ８１１［Ｍ＋Ｈ］＋；８３３［Ｍ＋Ｎａ］＋。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ９．４３（ｓ，１Ｈ），７．７８（ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，１Ｈ），７．５４（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），７．３５−７．１４（ｍ，２Ｈ），７．０８（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，１Ｈ），６．１２（ｓ，１Ｈ），４．６７（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，１Ｈ），４．２３（ｓ，１Ｈ），３．６９（ｓ，１Ｈ），３．４８（ｓ，２Ｈ），３．１７−２．９３（ｍ，３Ｈ），２．８３（ｓ，５Ｈ），２．２６−２．０３（ｍ，９Ｈ），１．９７−１．７１（ｍ，８Ｈ），１．７１−１．１８（ｍ，１６Ｈ），１．０２（ｄｄ，Ｊ＝２４．０，１１．７Ｈｚ，２Ｈ）。
１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１７８．９，１７６．７，１７６．４，１７４．４，１７３．２，１７２．７，１７０．５，１７０．３，１６８．９，１３７．４，１２８．４８（２Ｃ），１２４．０６，１１９．５８（２Ｃ），５３．９，４５．４，４５．１，４２．１，３９．２，３８．７，３８．３，３７．６，３７．３，３６．３，３２．１，３１．３（４Ｃ），２９．９，２８．８，２８．２，２７．２，２６．２，２５．３，１８．６，１７．３，１２．０。
実施例２：ペイロード（２）、ＳＴ８１５２ＡＡ１の合成及びキャラクタリゼーション
Ｎ−（７−（（１−（６−（（（４−（（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル）カルバモイル）シクロヘキシル）メチル）アミノ）−６−オキソヘキシル）−２，５−ジオキソピロリジン−３−イル）チオ）−１−オキソ−１−（フェニルアミノ）ヘプタン−２−イル）−５−オキソピロリジン−２−カルボキサミド（２）、ＳＴ８１５２ＡＡ１
Ｎ２下、５０ｍＬフラスコ中で、化合物［８］（８７ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）を、テトラヒドロフラン／ジメチルホルムアミド３：１（４ｍＬ）混合物に０℃で溶解する。次いで、トリフルオロ酢酸Ｎ−（２−アミノエチル）マレイミド塩（３３ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（２２ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（６１ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．０４８ｍＬ、０．２７ｍｍｏｌ）を添加し、この混合物を０℃で３０分間、次いで、室温で１６時間保持する。この反応混合物をジクロロメタンで希釈し、水で２回及びブライン（brine）で２回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を回転蒸発によって除去する。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン中２〜２０％メタノール）によって精製する。生成物ＳＴ８１５２ＡＡ１は、無色粘稠液５５ｍｇ（６０％収率）として得られる。ＭＳ：ｍ／ｚ ８５９［Ｍ＋Ｎａ］＋。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ９．４６（ｂｓ，１Ｈ），７．６０（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，２Ｈ），７．３６−７．２３（ｍ，２Ｈ），７．０９（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ），６．７２（ｓ，２Ｈ），６．４９（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），６．３２（ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，１Ｈ），４．６５（ｄ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，１Ｈ），４．３７−４．２４（ｍ，１Ｈ），３．８３−３．６０（ｍ，２Ｈ），３．６０−３．３７（ｍ，５Ｈ），３．２５−２．９７（ｍ，４Ｈ），２．８９−２．６１（ｍ，２Ｈ），２．６０−２．１１（ｍ，４Ｈ），２．００（ｍ，５Ｈ），１．９０−１．７２（ｍ，１３Ｈ），１．７２−１．１５（ｍ，８Ｈ），０．９４（ｄｄ，Ｊ＝２４．３，１１．４Ｈｚ，２Ｈ）。
実施例３：ペイロード（３）、ＳＴ８１３２ＡＡ１の合成及びキャラクタリゼーション
２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−メチルブタン酸（ｓ）−２，５−ジオキソピロリジン−１−イル［１０］
Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ［９］（１．５ｇ、４．４２ｍｍｏｌ）を無水ジクロロメタン（２５ｍＬ）に溶解した攪拌溶液に、ジシクロカルボジイミド（１．５５ｇ、７．５２ｍｍｏｌ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（７６２ｍｇ、６．６３ｍｍｏｌ）を室温で添加する。この混合物を室温で３時間保持する。この反応において形成した白色固体をジクロロメタンで濾過してジシクロヘキシル尿素を除去し、有機相をＨＣｌ ０．１Ｎ及び水で洗浄し、次いで無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を回転蒸発によって除去する。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン中１％メタノール）に供して、生成物［１０］を白色固体１．７ｇ（８９％収率）として得る。ＭＳ：ｍ／ｚ ４５９［Ｍ＋Ｎａ］＋。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．８０（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），７．６８−７．５５（ｍ，２Ｈ），７．４３（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），７．３４（ｄｄ，Ｊ＝１５．９，８．５Ｈｚ，２Ｈ），４．７０（ｄ，Ｊ＝４．６Ｈｚ，１Ｈ），４．５６−４．４０（ｍ，３Ｈ），４．２８（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，１Ｈ），２．８５（ｓ，４Ｈ），２．３７（ｄｄ，Ｊ＝１２．３，６．５Ｈｚ，１Ｈ），１．０８（ｄｄ，Ｊ＝１１．０，６．９Ｈｚ，６Ｈ）。
（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタン酸［１２］
テトラヒドロフランと水性炭酸水素ナトリウム（水１０ｍＬ中に３４４ｍｇ、４ｍｍｏｌ）との混合物にＬ−シトルリン［１１］（７００ｍｇ、４ｍｍｏｌ）を溶解した溶液に、ジメトキシエタン（１０ｍＬ）中の化合物［１０］（１．７ｇ、３．９ｍｍｏｌ）を添加する。この反応を室温で１６時間攪拌する。クエン酸１５％を水（５０ｍＬ）に溶解した溶液を添加し、この混合物を酢酸エチル中の１０％イソプロピルアルコールで抽出する（２×７５ｍＬ）。溶媒を回転蒸発によって除去する。ジエチルエーテル添加及び超音波照射の後、固体が形成される。濾過後、ジエチルエーテルで洗浄して、［１２］を白色固体８７０ｍｇ（４５％）として得た。ＭＳ：ｍ／ｚ ４９５［Ｍ−Ｈ］−。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ８．１９（ｂｍ ３Ｈ），７．８７（ｔ，Ｊ＝２５．１Ｈｚ，２Ｈ），７．７７（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），７．４９−７．２３（ｍ，４Ｈ），５．９９（ｓ，１Ｈ），５．４３（ｓ，２Ｈ），４．４５−４．０８（ｍ，４Ｈ），３．９７（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），２．９９（ｄ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，２Ｈ），２．０２（ｄ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，１Ｈ），１．７４（ｓ，１Ｈ），１．６１（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），１．４４（ｓ，２Ｈ），０．９１（ｄｄ，Ｊ＝１２．５，６．３Ｈｚ，６Ｈ）。
１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ１７３．４，１７１．３，１６９．８，１６７．８，１５８．８，１５６．０，１４３．８，１４０．７，１２７．６，１２７．０，６５．７，５９．８，５１．９，４６．７，３０．５，２６．６，１９．１８（２Ｃ）。
（（Ｓ）−１−（（（Ｓ）−１−（（４−（ヒドロキシメチル）フェニル）アミノ）−１−オキソ−５−ウレイドペンタン−２−イル）アミノ）−３−メチル−１−オキソブタン−２−イル）カルバミン酸（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル［１４］
ジクロロメタン／メタノール２：１（１５ｍＬ）中に化合物［１２］（８７０ｍｇ、１．７ｍｍｏｌ）とｐ−アミノベンジルアルコール（２２７ｍｇ、１．８ｍｍｏｌ）とを含む溶液に、ＥＥＤＱ（８４０ｍｇ、３．４ｍｍｏｌ）を添加する。この反応を、暗所中、室温で１６時間放置する。溶媒を除去し、得られた固体残渣を、ジエチルエーテルを用いて濾過して、生成物［１４］を白色固体６６０ｍｇ（６５％収率）として得る。ＭＳ：ｍ／ｚ ６２４［Ｍ＋Ｎａ］＋。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ１０．００（ｂｓ，１Ｈ），８．１３（ｍ，４Ｈ），７．９２（ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），７．７６（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），７．５８（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，２Ｈ），７．５１−７．１０（ｍ，２Ｈ），６．０２（ｓ，１Ｈ），５．４３（ｍ，４Ｈ），５．１３（ｓ，１Ｈ），４．４７（ｓ，３Ｈ），４．３１（ｍ ４Ｈ），３．１３−２．７４（ｍ，２Ｈ），２．０３（ｓ，１Ｈ），１．８３−１．５５（ｍ，２Ｈ），１．４３（ｓ，２Ｈ），０．９０（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，６Ｈ）。
１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ１７１．２，１７０．４，１５８．９３，１５６．１５，１４４．６，１４３．８，１４０．７，１３７．５，１２７．６，１２７．２（２Ｃ） １２５．３，１２０．１（２Ｃ），１１８．９，６５．７，６２．６，６０．１，５３．０，４６．７，３１．０，３０．５，２６．７，１９．６，１８．７。
（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−アミノ−３−メチルブタンアミド）−Ｎ−（４−（ヒドロキシメチル）フェニル）−５−ウレイドペンタンアミド［１５］
化合物［１４］（６６０ｍｇ，１．０９ｍｍｏｌ）を無水ジメチルホルムアミド（５ｍＬ）に溶解した溶液に、ピペリジン（２．２ｍＬ）を添加し、この反応を室温で３時間放置する。溶媒を真空下で除去し、残渣をジクロロメタンで処理して固体を得、この固体を濾過して生成物［１５］２４０ｍｇ（６０％ｍｇ）を得る。ＭＳ：ｍ／ｚ ３８０［Ｍ＋Ｈ］＋。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ１０．１１（ｓ，１Ｈ），８．２５（ｓ，１Ｈ），７．５８（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，２Ｈ），７．２７（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，２Ｈ），６．１０（ｓ，１Ｈ），５．４６（ｓ，２Ｈ），４．４８（ｍ，３Ｈ），３．２３−３．０９（ｍ，２Ｈ），３．１１−２．８８（ｍ，２Ｈ），１．９９（ｄｄ，Ｊ＝１２．２，６．４Ｈｚ，２Ｈ），１．９９（ｄｄ，Ｊ＝１２．２，６．４Ｈｚ，１Ｈ），１．８１−１．５５（ｍ，２Ｈ），１．５５−１．２８（ｍ，２Ｈ），１．０４−０．６８（ｍ，６Ｈ）。
１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ１７３．３，１７０．４，１５８．９，１３７．５，１２６．９（２Ｃ），１２５．３，１１９．９（２Ｃ），６２．６，５９．３，５２．６，３１．１，２９．９，２６．６，１９．３，１７．０（２Ｃ）。
７−（（（Ｓ）−１−（（（Ｓ）−１−（（４−（ヒドロキシメチル）フェニル）アミノ）−１−オキソ−５−ウレイドペンタン−２−イル）アミノ）−３−メチル−１−オキソブタン−２−イル）アミノ）−７−オキソヘプタン酸エチル［１７］
ジクロロメタン／メタノール２：１（２０ｍＬ）混合物中に化合物［１５］（２４０ｍｇ、０．６３ｍｍｏｌ）とピメリン酸モノエチル［１６］（０．１２３ｍＬ、０．６９ｍｍｏｌ）とを含む溶液に、ＥＥＤＱ（３１１ｍｇ、１．２６ｍｍｏｌ）を添加する。この反応を、暗所中、室温で１２時間放置する。溶媒を除去し、残渣をカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン中２〜２０％メタノール）によって精製して、生成物［１７］を粘稠固体１７０ｍｇ（４５％収率）として得る。ＭＳ：ｍ／ｚ ５７２［Ｍ＋Ｎａ］＋。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ）δ７．５９（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ），７．３４（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ），４．６５−４．４４（ｍ，４Ｈ），４．２５（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ），４．１５（ｄｄ，Ｊ＝１４．２，７．１Ｈｚ，２Ｈ），３．３０−３．０６（ｍ，２Ｈ），２．３４（ｄｄ，Ｊ＝１３．９，６．７Ｈｚ，２Ｈ），２．１３（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，１Ｈ），１．９２（ｄｄ，Ｊ＝１４．１，６．２Ｈｚ，２Ｈ），１．８９−１．７４（ｍ，２Ｈ），１．７４−１．３４（ｍ，１２Ｈ），１．３０（ｄｄ，Ｊ＝１８．０，１０．９Ｈｚ，３Ｈ），１．０６−０．８４（ｍ，８Ｈ）。
１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＭｅＯＤ）δ１７４．５，１７２．１，１７１．７，１７０．４，１５８．９，１３６．５，１２６．８（２Ｃ），１２４．１，１２０．９（２Ｃ），６２．９，５９．５，５８．６，５３．０，３８．４，３４．７，３３．０，２９．８，２９．２，２７．９，２７．２，２５．０，２３．６，１７．５，１６．９，１２．７。
７−（（（Ｓ）−１−（（（Ｓ）−１−（（４−（ブロモメチル）フェニル）アミノ）−１−オキソ−５−ウレイドペンタン−２−イル）アミノ）−３−メチル−１−オキソブタン−２−イル）アミノ）−７−オキソヘプタン酸エチル［１８］
化合物［１７］（１７０ｍｇ、０．３１ｍｍｏｌ）を無水テトラヒドロフラン（５ｍＬ）に溶解した溶液に、三臭化リン（０．０４３ｍＬ、０．４６ｍｍｏｌ）を０℃で添加する。この混合物を０℃で３時間保持する。この反応混合物を、フラッシュクロマトグラフィー（ジクロロメタン中１〜６％メタノール）による精製のためにシリカカラムに直接供して、生成物［１８］を白色固体１７０ｍｇ（９０％収率）として得る。ＭＳ：ｍ／ｚ ６１３［Ｍ＋Ｈ］＋；６３５［Ｍ＋Ｎａ］＋。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，アセトン−ｄ６）δ９．８５（ｄ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，１Ｈ），７．８５（ｄｄ，Ｊ＝２５．２，８．１Ｈｚ，２Ｈ），７．３９（ｄｔ，Ｊ＝４４．７，２２．３Ｈｚ，２Ｈ），４．９０−４．５４（ｍ，５Ｈ），４．１９−３．９７（ｍ，２Ｈ），３．５８（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，１Ｈ），３．３６（ｄ，Ｊ＝２０．６Ｈｚ，２Ｈ），２．４１（ｄｄ，Ｊ＝２１．３，６．３Ｈｚ，２Ｈ），２．３３−２．１６（ｍ，３Ｈ），２．１４−２．０２（ｍ，２Ｈ），２．０４−１．９３（ｍ，２Ｈ），１．９３−１．７３（ｍ，２Ｈ），１．７１−１．４６（ｍ，２Ｈ），１．４８−１．１３（ｍ，６Ｈ），１．１１−０．７７（ｍ，８Ｈ）。
７−（（（Ｓ）−３−メチル−１−オキソ−１−（（（Ｓ）−１−オキソ−１−（（４−（（（（Ｓ）−７−オキソ−６−（（Ｒ）−５−オキソ−ピロリジン−２−カルボキサミド）−７−（フェニルアミノ）ヘプチル）チオ）メチル）フェニル）アミノ）−５−ウレイドペンタン−２−イル）アミノ）ブタン−２−イル）アミノ）−７−オキソヘプタン酸エチル［１９］
ＳＴ７６１２ＡＡ１（１２５ｍｇ、０．３１ｍｍｏｌ）を、Ｎ２雰囲気下、５０ｍＬフラスコ中で脱気メタノール（８ｍＬ）に溶解する。この第１の溶液に、チオメチル酸ナトリウム１Ｍを脱気メタノール（２２ｍｇ、０．３１ｍｍｏｌ）に溶解した溶液を、室温で添加する。この攪拌混合物を室温で３０分間維持する。この溶液をＮ２で５〜１０分間フラッシュしてＭｅＳＨを除去し、次いで溶媒を回転蒸発によって除去する。最小限の無水ジメチルホルムアミドに溶解した化合物［１８］（１７０ｍｇ、０．３１ｍｍｏｌ）を残渣に添加し、この混合物を室温で１６時間保持する。溶媒を回転蒸発によって除去し、粗生成物をカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン中１〜４０％メタノール）によって精製して、［１９］を無定形固体（amorphous solid）；１０６ｍｇ（４０％収率）として得る。ＭＳ：ｍ／ｚ ８９６［Ｍ＋Ｈ］＋；９１８［Ｍ＋Ｎａ］＋。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ）δ７．６０（ｓ，４Ｈ），７．４３−７．１８（ｍ，４Ｈ），７．１３（ｓ，１Ｈ），４．５５（ｍ，４Ｈ），４．４０（ｍ，２Ｈ），４．１３（ｍ，２Ｈ），３．６６（ｍ，６Ｈ），３．１９（ｓ，４Ｈ），２．７５（ｓ，２Ｈ），２．３７（ｍ，６Ｈ），２．１１（ｓ，２Ｈ），１．９７（ｓ，１Ｈ），１．８２（ｓ，２Ｈ），１．６４（ｓ，７Ｈ），１．４２（ｓ，４Ｈ），１．２７（ｓ，４Ｈ），１．０１（ｓ，６Ｈ）。
７−（（（Ｓ）−３−メチル−１−オキソ−１−（（（Ｓ）−１−オキソ−１−（（４−（（（（Ｓ）−７−オキソ−６−（（Ｒ）−５−オキソピロリジン−２−カルボキサミド）−７−（フェニルアミノ）ヘプチル）チオ）メチル）フェニル）アミノ）−５−ウレイドペンタン−２−イル）アミノ）ブタン−２−イル）アミノ）−７−オキソヘプタン酸［２０］
［１９］（３００ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン／水／エタノール１：１：１混合物（１２ｍＬ）に溶解した溶液に、水酸化リチウム一水和物（４２ｍｇ、１ｍｍｏｌ）を添加する。この反応を室温で６時間保持し、次いで酢酸エチルで希釈し、ＨＣｌ １Ｎで洗浄する。粗生成物（１８０ｍｇ）を精製することなく次の工程に直接用いる。ＭＳ：ｍ／ｚ ８７４［Ｍ＋Ｌｉ］＋；８９０［Ｍ＋Ｎａ］＋。
７−（（（Ｓ）−３−メチル−１−オキソ−１−（（（Ｓ）−１−オキソ−１−（（４−（（（（Ｓ）−７−オキソ−６−（（Ｒ）−５−オキソピロリジン−２−カルボキサミド）−７−（フェニルアミノ）ヘプチル）チオ）メチル）フェニル）アミノ）−５−ウレイドペンタン−２−イル）アミノ）ブタン−２−イル）アミノ）−７−オキソヘプタン酸２，５−ジオキソピロリジン−１−イル（３），ＳＴ８１３２ＡＡ１
化合物［２０］（１８０ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）を無水ジメチルホルムアミド（３ｍＬ）に溶解した攪拌溶液に、ジシクロヘキシルカルボジイミド（７０ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（３４ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）を室温で添加する。この混合物を室温で１６時間保持する。この反応において形成した白色固体を濾過してジシクロヘキシル尿素を除去し、有機相をＨＣｌ ０．１Ｎ及び水で洗浄し、次いで無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を真空下で除去する。得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン中２〜２０％メタノール）に供して、活性化酸（３）を白色粘稠固体１０９ｍｇ（６０％収率）として得る。ＭＳ：ｍ／ｚ ９８７［Ｍ＋Ｎａ］＋。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ１０．１０（ｓ，４Ｈ），９．９５（ｓ，１Ｈ），７．５９（ｍ，４Ｈ），７．３３（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），７．２４（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，２Ｈ），７．０８（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），６．００（ｓ，１Ｈ），５．４２（ｓ，２Ｈ），４．４３（ｄ，Ｊ＝１４．３Ｈｚ，２Ｈ），３．６７（ｓ，１Ｈ），３．１２−２．９０（ｍ，２Ｈ），２．８４（ｓ，４Ｈ），２．６５（ｍ，５Ｈ），２．５３（ｓ，６Ｈ），２．１７（ｍ，２Ｈ），１．６３（ｍ，１０Ｈ），１．３６（ｓ，４Ｈ），０．９４−０．７５（ｍ，８Ｈ）。
実施例４：ペイロード（４）、ＳＴ８１９０ＡＡ１の合成及びキャラクタリゼーション
ｉ．トシル−Ｃｌ、ＴＥＡ、ＴＨＦ；
ｉｉ．ＮａＮ３、ＤＭＦ；
ｉｉｉ．クロロギ酸ｐ−ニトロフェニル、ＤＭＡＰ、ＤＣＭ；
ｉｖ．トリフルオロ酢酸Ｎ−（２−アミノエチル）マレイミド、ＤＢＵ、ＤＣＭ；
ｖ．ＰＰｈ３、ＴＨＦ；
ｖｉ．４−（（２，５−ジオキソ−３−（（（６Ｓ）−７−オキソ−６−（５−オキソピロリジン−２−カルボキサミド）−７−（フェニルアミノ）ヘプチル）チオ）ピロリジン−１−イル）メチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸 ＨＯＢｔ、ＨＢｔＵ、ＤＩＰＥＡ、ＴＨＦ。
２［−２−（２−｛２−［２−（２−ヒドロキシエトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エチルアジド［２１］
ヘキサエチレングリコール（５０ｇ、１７７ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（１４ｍＬ、１００ｍｍｏｌ）とをＴＨＦ（２５０ｍＬ）に溶解した溶液に、ＴＨＦ（２５０ｍＬ）中の塩化パラトルエンスルホニル（１３ｇ、７０ｍｍｏｌ）を添加し、この溶液を一晩攪拌する。次いで、この溶液をＣＨ２Ｃｌ２（２００ｍＬ）で希釈し、１Ｎ ＨＣｌ（３×１５０ｍＬ）及びブライン（１５０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥する。濾過して溶媒を真空蒸発（エバポレーション）させた後、残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカ、ＣＨ２Ｃｌ２中２％メタノール）によって精製して、モノトシル誘導体（２４．４ｇ、５６ｍｍｏｌ、ｐ−ＴｓＣｌと比較して８０％）を無色油状物として得る：ＴＬＣ（ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ ９５：５）：Ｒｆ＝０．３２。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ＝７．７９（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ），７．３３（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ），４．０９−４．０７（ｍ，２Ｈ），３．７４−３．５６（ｍ，２２Ｈ），２．９７（ｂｒ，１Ｈ，ＯＨ），２．４４（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ＝１４５．０，１３３．３，１３０．０，１２８．２，７２．７，７０．９−７０．５，６９．５，６８．９，６１．９，２１．８；ＭＳ：ｍ／ｚ ４３７［Ｍ＋Ｈ］＋。
次いで、ＤＭＦ（１５０ｍＬ）中の前記トシル誘導体（２０．４ｇ、５６ｍｍｏｌ）とＮａＮ３（３．７ｇ、５７ｍｍｏｌ）との混合物を、室温で一晩攪拌する。ＤＭＦを真空下で蒸発させ、残渣をＡｃＯＥｔに溶解し、Ｃｅｌｉｔｅ（セライト）（登録商標）で濾過する。ＡｃＯＥｔを減圧下で蒸発させて、純粋な［２１］（１４．６ｇ、４８ｍｍｏｌ、８５％）を得る：ＴＬＣ（ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ ９４：６）：Ｒｆ＝０．３８；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ＝３．７２−３．５７（ｍ，２２Ｈ），３．３８−３．３６（ｍ，２Ｈ），２．８０（ｂｓ，１Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ＝７２．８，７０．７−７０．１，６１．８，５０．７。
（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル）カルバミン酸１７−アジド−３，６，９，１２，１５−ペンタオキサヘプタデシル［２２］
［２１］（５００ｍｇ、１．６３ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍｌ）に溶解した溶液及びＤＭＡＰ（１ｇ、９ｍｍｏｌ）に、クロロギ酸４−ニトロフェニル（１．１５ｇ、５．７ｍｍｏｌ）を０℃で添加する。この混合物を室温で２時間攪拌する。次いで、この溶液をＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍＬ）で希釈し、１Ｎ ＨＣｌ（３×２５ｍＬ）及びブライン（５０ｍＬ）で洗浄し、乾燥Ｎａ２ＳＯ４で乾燥する。濾過して溶媒を真空蒸発させた後、残渣をカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ ９５：５）によって精製する。黄色固体を単離する（５０１ｍｇ ｇ、６１％）：Ｒｆ＝０．７５；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ＝８．２３（ｄｄ，Ｊ＝９．６，２．８Ｈｚ，２Ｈ），７．３５（ｄｄ，Ｊ＝９．５，２．９Ｈｚ，２Ｈ），４．４３−４．３５（ｍ，２Ｈ），３．８１−３．７４（ｍ，２Ｈ），３．７４−３．５２（ｍ，２４Ｈ），３．３４（ｄｄ，Ｊ＝６．６，３．５Ｈｚ，２Ｈ）；ＭＳ：ｍ／ｚ ４７１［Ｍ−Ｈ］−。このパラニトロ誘導体（５０１ｍｇ、１ｍｍｏｌ）及びＤＢＵ（１．５ｍｌ、１０ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２に溶解し、トリフルオロ酢酸Ｎ−（２−アミノエチル）マレイミド（２５４ｍｇ、１ｍｍｏｌ）を添加する。この反応混合物を室温で一晩攪拌する。次いで、この溶液をＣＨ２Ｃｌ２（２５ｍＬ）で希釈し、１Ｎ ＨＣｌ（３×１０ｍＬ）及びブライン（２０ｍＬ）で洗浄し、乾燥Ｎａ２ＳＯ４で乾燥する。濾過して溶媒を真空蒸発させた後、残渣をカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ ９５：５）によって精製して、白色固体（４７ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ、１０％）を得る。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：７．８０（ｓ，１Ｈ），３．９２−３．５０（ｍ，２４Ｈ），３．３８−３．３６（ｍ，４Ｈ）；１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ＝１７１．２，１５７．２，１３５．６，７２．８，７０．７−７０．１，６１．８，５０．７。ＭＳ：ｍ／ｚ ４７４［Ｍ＋Ｈ］＋。
（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル）カルバミン酸１７−アミノ−３，６，９，１２，１５−ペンタオキサヘプタデシル［２３］
［２２］（４７ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）を乾燥ＴＨＦ（１０ｍＬ）に溶解した溶液を、０℃に冷却する。トリフェニルホスフィン（５３ｇ、０．２ｍｍｏｌ）を添加し、この混合物を室温で２４時間攪拌する。次いで、Ｈ２Ｏ（５ｍＬ）を添加して中間リン付加物を加水分解し、この溶液を室温でさらに２４時間攪拌する。ＴＨＦを蒸発させ、固体残渣を水（１０ｍＬ）に懸濁する。不溶性の塩を濾過し、濾液をトルエン（５×５ｍＬ）で洗浄し、蒸発させて、［２３］（４４ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ、９９％）を淡黄色（pale yellow）油状物として得、この油状物をさらに精製することなく次の工程に使用する。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ＝７．８０（ｓ，１Ｈ），３．９２−３．５０（ｍ，２２Ｈ），３．３８−３．３６（ｍ，４Ｈ） ３．０１−３．１１（ｍ，２Ｈ），１．８１（ｂｓ，２Ｈ）；ＭＳ：ｍ／ｚ ４４８［Ｍ＋Ｈ］＋。
（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル）カルバミン酸１−（（１Ｓ，４Ｒ）−４−（（２，５−ジオキソ−３−（（（６Ｓ）−７−オキソ−６−（５−オキソピロリジン−２−カルボキサミド）−７−（フェニルアミノ）ヘプチル）チオ）ピロリジン−１−イル）メチル）シクロヘキシル）−１−オキソ−５，８，１１，１４，１７−ペンタオキサ−２−アザノナデカン−１９−イル（４），ＳＴ８１９０ＡＡ１
４−（（２，５−ジオキソ−３−（（（６Ｓ）−７−オキソ−６−（５−オキソピロリジン−２−カルボキサミド）−７−（フェニルアミノ）ヘプチル）チオ）ピロリジン−１−イル）メチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸（６０ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）を乾燥ＴＨＦ（１５ｍＬ）に溶解し、この反応混合物を０℃に冷却する。ＨＯＢｔ（２０ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（５７ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）、［２３］（４４ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（４８μＬ、０．２５ｍｍｏｌ）を添加し、この反応混合物を室温で一晩攪拌する。次いで、この溶液をＡｃＯＥｔ（１５ｍＬ）で希釈し、Ｈ２Ｏ（３×１０ｍＬ）で抽出する。有機相を乾燥Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過して溶媒を真空蒸発させた後、残渣をカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ ９８：２）によって精製して、ＳＴ８１９０ＡＡ１を無色油状物（３１ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ，１０％）として得る。ＭＳ：ｍ／ｚ １０３１［Ｍ＋Ｈ］＋。
実施例５：ペイロード（５）、ＳＴ８１８９ＡＡ１の合成及びキャラクタリゼーション
ｉ．ＥｔＯＣＯＣＨ２Ｂｒ、ＮａＨ、ＴＨＦ；
ｉｉ．ＬｉＯＨ、ＴＨＦ、Ｈ２Ｏ、ＥｔＯＨ；
ｉｉｉ．トリフルオロ酢酸Ｎ−（２−アミノエチル）マレイミド、ＤＢＵ、ＤＣＭ；
ｉｖ．ＰＰｈ３、ＴＨＦ；
ｖ．４−（（２，５−ジオキソ−３−（（（６Ｓ）−７−オキソ−６−（５−オキソピロリジン−２−カルボキサミド）−７−（フェニルアミノ）ヘプチル）チオ）−ピロリジン−１−イル）メチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸、ＨＯＢｔ、ＨＢｔＵ、ＤＩＰＥＡ、ＴＨＦ。
２０−アジド−３，６，９，１２，１５，１８−ヘキサオキサイコサン酸［２４］
鉱油（２９ｍｇ、０．３９ｍｍｏｌ）中のＮａＨ ６０重量％を乾燥ＴＨＦ（５ｍＬ）に懸濁し、［２１］（１００ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ）を乾燥ＴＨＦ（３ｍＬ）に溶解した溶液を０℃でゆっくり添加する。０℃で２０分間攪拌した後、ブロモ酢酸エチル（５３μＬ、０．４８ｍｍｏｌ）を乾燥ＴＨＦ（３ｍＬ）に溶解した溶液を添加し、この混合物を室温で一晩攪拌する。Ｈ２Ｏ（１ｍＬ）をゆっくり添加し、溶媒を減圧下で蒸発させる。得られた固体をフラッシュクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ ９５：５）によって精製して、淡バラ色（pale rose）油状物を定量的収率（５１ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）で得る。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ＝４．２８（ｓ，２Ｈ）；４．２１（ｑ，２Ｈ）；３．９２−３．５０（ｍ，２２Ｈ），３．３８−３．３６（ｍ，４Ｈ），２．０５−１．９８（ｍ，２Ｈ）；１．２３（ｔ，３Ｈ）；ＭＳ：ｍ／ｚ ３９４［Ｍ＋Ｈ］＋。このエチルエステル（５１ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）を、Ｈ２ＯとＴＨＦとＥｔＯＨとの１：１：１混合物（１５ｍＬ）に溶解し、ＬｉＯＨ一水和物を添加する（１６ｍｇ、０．３９ｍｍｏｌ）。この混合物を２時間還流攪拌し、次いでＨＣｌをｐＨ７になるまで添加する。溶媒を減圧下で蒸発させ、得られた固体をＥｔＯＨ（２×１０ｍＬ）で洗浄する。この溶液を蒸発させると無色油状物の［２４］（４７ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）が生じ、次の工程に直接使用する。ＭＳ：ｍ／ｚ ３６４［Ｍ＋Ｈ］＋。
２０−アミノ−Ｎ−（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル）−３，６，９，１２，１５，１８−ヘキサオキサイコサンアミド［２５］
［２４］の溶液（４７ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）を乾燥ＴＨＦ（１５ｍＬ）に溶解し、この反応混合物を０℃に冷却する。ＨＯＢｔ（２６ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）、ＨＢｔＵ（７６ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）、トリフルオロ酢酸Ｎ−（２−アミノエチル）マレイミド（３３ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（６３μＬ、０．３３ｍｍｏｌ）を添加し、この反応混合物を室温で一晩攪拌する。次いで、この溶液をＡｃＯＥｔ（１５ｍＬ）で希釈し、Ｈ２Ｏ（３×１０ｍＬ）で抽出する。有機相を乾燥Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過して溶媒を真空蒸発させた後、残渣をカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ ９８：２）によって精製して、無色油状物（４９ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）を得る。ＭＳ：ｍ／ｚ ４８８［Ｍ＋Ｈ］＋。
得られたアジド誘導体（４９ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）を０℃で乾燥ＴＨＦ（１０ｍＬ）に溶解する。トリフェニルホスフィン（５３ｇ、０．２ｍｍｏｌ）を添加し、この混合物を室温で２４時間攪拌する。次いで、Ｈ２Ｏ（５ｍＬ）を添加して中間リン付加物を加水分解し、この溶液を室温でさらに２４時間攪拌する。ＴＨＦを蒸発させ、固体残渣を水（１０ｍＬ）に懸濁する。不溶性の塩を濾過し、濾液をトルエン（５×５ｍＬ）で洗浄し、蒸発させて、淡黄色油状物として［２５］（４６ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ、９９％）を得、この油状物をさらに精製することなく次の工程に使用する。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ＝８．０３（ｂｓ，１Ｈ）；７．８０（ｓ，１Ｈ），４．２６（ｓ，２Ｈ）；３．９２−３．５０（ｍ，２６Ｈ），３．０３−３．０７（ｍ，２Ｈ），１．８１（ｂｓ，２Ｈ）；ＭＳ：ｍ／ｚ ４６２［Ｍ＋Ｈ］＋。
Ｎ−（（２Ｓ）−７−（（１−（（４−（（１−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−４−オキソ−６，９，１２，１５，１８，２１−ヘキサオキサ−３−アザトリコサン−２３−イル）カルバモイル）シクロヘキシル）メチル）−２，５−ジオキソピロリジン−３−イル）チオ）−１−オキソ−１−（フェニルアミノ）ヘプタン−２−イル）−５−オキソピロリジン−２−カルボキサミド（５），ＳＴ８１８９ＡＡ１
４−（（２，５−ジオキソ−３−（（（６Ｓ）−７−オキソ−６−（５−オキソピロリジン−２−カルボキサミド）−７−（フェニルアミノ）ヘプチル）チオ）ピロリジン−１−イル）メチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸（６０ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）を乾燥ＴＨＦ（１５ｍＬ）に溶解し、この反応混合物を０℃に冷却する。ＨＯＢｔ（２０ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）、ＨＢｔＵ（５７ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）、［２５］（４６ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（４８μＬ、０．２５ｍｍｏｌ）を添加し、この反応混合物を室温で一晩攪拌する。次いで、この溶液をＡｃＯＥｔ（１５ｍＬ）で希釈し、Ｈ２Ｏ（３×１０ｍＬ）で抽出する。有機相を乾燥Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過して溶媒を真空蒸発させた後、残渣をカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ ９８：２）によって精製して、ペイロードＳＴ８１８９ＡＡ１を無色油状物（２１ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ、２０％）として得る。ＭＳ：ｍ／ｚ １０４５［Ｍ＋Ｈ］＋。
実施例６：ペイロード（６）、ＳＴ８１９１ＡＡ１の合成及びキャラクタリゼーション
ｉ．ＰＰｈ３、ＴＨＦ；
ｉｉ．４−（（２，５−ジオキソ−３−（（（６Ｓ）−７−オキソ−６−（５−オキソピロリジン−２−カルボキサミド）−７−（フェニルアミノ）ヘプチル）チオ）−ピロリジン−１−イル）メチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸、ＤＣＣ、ＮＨＳ、ＤＣＭ；
ｉｉｉ．ＤＣＣ、ＮＨＳ、ＤＣＭ。
１−（４−（（２，５−ジオキソ−３−（（（６Ｓ）−７−オキソ−６−（５−オキソピロリジン−２−カルボキサミド）−７−（フェニルアミノ）ヘプチル）チオ）ピロリジン−１−イル）メチル）シクロヘキシル）−１−オキソ−５，８，１１，１４，１７，２０−ヘキサオキサ−２−アザドコサン−２２−酸［２６］
アジド［２４］（４９ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）を０℃で乾燥ＴＨＦ（１０ｍＬ）に溶解する。トリフェニルホスフィン（５３ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）を添加し、この混合物を室温で２４時間攪拌する。次いで、Ｈ２Ｏ（５ｍＬ）を添加して中間リン付加物を加水分解し、この溶液を室温でさらに２４時間攪拌する。ＴＨＦを蒸発させ、固体残渣を水（１０ｍＬ）に懸濁する。不溶性の塩を濾過し、濾液をトルエン（５×５ｍＬ）で洗浄し、蒸発させて、２０−アミノ−３，６，９，１２，１５，１８−ヘキサオキサイコサン酸（４６ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ、９９％）を淡黄色油状物として得、この油状物をさらに精製することなく次の工程に使用する。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ＝１２．０（ｂｓ，１Ｈ）；４．２６（ｓ，２Ｈ）；３．９２−３．５０（ｍ，２２Ｈ），３．０３−３．０７（ｍ，２Ｈ），１．８１（ｂｓ，２Ｈ）；ＭＳ：ｍ／ｚ ３４０［Ｍ＋Ｈ］＋。乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）中の４−（（２，５−ジオキソ−３−（（（６Ｓ）−７−オキソ−６−（５−オキソピロリジン−２−カルボキサミド）−７−（フェニルアミノ）ヘプチル）チオ）−ピロリジン−１−イル）メチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸（８０ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）を、乾燥ＣＨ２Ｃｌ２中にジシクロヘキシルカルボジイミド（０．１１ｍｍｏｌ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（０．１ｍｍｏｌ）とを含む溶液に室温で添加し、この混合物を室温で３時間攪拌する。白色固体をジクロロメタンで濾過してジシクロヘキシル尿素を除去し、有機相をＨＣｌ ０．１Ｎ及びＨ２Ｏで洗浄し、次いで、乾燥硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧下で除去する。得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製して、活性化酸を白色ワックス物質（収率９０％）として得る。この物質をジメトキシエタン（５ｍＬ）に溶解し、テトラヒドロフランと水性炭酸水素ナトリウム（水２ｍＬ中１５ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）との混合物に溶解した２０−アミノ−３，６，９，１２，１５，１８−ヘキサオキサイコサン酸（４６ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）で処理する。この反応を室温で１６時間攪拌する。クエン酸１５％を水（２．５ｍＬ）に溶解した溶液を添加し、この混合物を酢酸エチル中の１０％イソプロピルアルコールで抽出する（２×５ｍＬ）。溶媒を回転蒸発によって除去する。ジエチルエーテル添加及び超音波照射の後、固体が形成される。濾過後、ジエチルエーテルで洗浄して、［２６］を白色固体６５ｍｇ（７０％）として得た。ＭＳ：ｍ／ｚ ９１８［Ｍ−Ｈ］−。
１−（４−（（２，５−ジオキソ−３−（（（６Ｓ）−７−オキソ−６−（５−オキソピロリジン−２−カルボキサミド）−７−（フェニルアミノ）ヘプチル）チオ）ピロリジン−１−イル）メチル）シクロヘキシル）−１−オキソ−５，８，１１，１４，１７，２０−ヘキサオキサ−２−アザドコサン−２２−酸２，５−ジオキソピロリジン−１−イル（６）、ＳＴ８１９１ＡＡ１
ジシクロヘキシルカルボジイミド（０．１ｍｍｏｌ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（０．０７ｍｍｏｌ）との溶液に、乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）中の化合物［２６］（６５ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌ）を室温で添加し、この混合物を室温で３時間攪拌する。白色固体をジクロロメタンで濾過してジシクロヘキシル尿素を除去し、有機相をＨＣｌ ０．１Ｎ及びＨ２Ｏで洗浄し、次いで乾燥硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧下で除去する。得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製して、活性化酸を白色固体６１ｍｇ（８５％）として得る。ＭＳ：ｍ／ｚ １０２０［Ｍ＋Ｈ］＋。
実施例７：ペイロード（９）、ＳＴ８２１７Ａ１の合成及びキャラクタリゼーション
（１Ｒ，４Ｒ）−４−（（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド）メチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル［２７］
Ｎ２下、丸底フラスコ中で、塩化アセチル（１．０１ｍＬ、１４．２６ｍｍｏｌ）を、ＭｅＯＨ（５０ｍＬ）に酸［７］（１．００ｇ、２．８５ｍｍｏｌ）を溶解した溶液に添加する。得られた溶液を室温で３時間攪拌し、次いでこの溶液を真空濃縮する。残渣をＣＨ２Ｃｌ２（３０ｍＬ）に溶解し、水性炭酸水素ナトリウムの飽和溶液（３×１５ｍＬ）及びブライン（２×１５ｍＬ）で洗浄する。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、真空内で濃縮して、９５０ｍｇ（２．６１ｍｍｏｌ）の化合物［２７］を白色固体として得る（収率９２％）。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，δｐｐｍ，Ｊ Ｈｚ）：δ６．６５（ｓ，２Ｈ），３．６２（ｓ，３Ｈ），３．５０−３．４６（ｍ，２Ｈ），３．０７（ｔ，Ｊ＝６．４，２Ｈ），２．２３−２．１１（ｍ，３Ｈ），１．９７（ｄｄ，Ｊ＝１３．６，２．８，２Ｈ），１．７８（ｄｄ，Ｊ＝１２．８，２．０，２Ｈ），１．６６−１．５５（ｍ，４Ｈ），１．４４−１．２６（ｍ，５Ｈ），０．９９−０．９２（ｍ，２Ｈ）。ＭＳ：ｍ／ｚ ３６５［Ｍ＋１］＋；３８７［Ｍ＋２３］＋。ＴＬＣ Ｒｆ：０．７５（ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ ９：１）。
（１Ｒ，４Ｒ）−４−（（６−（３−（（４−（ヒドロキシメチル）フェニル）チオ）−２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）ヘキサンアミド）メチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル［２８］
Ｎ２雰囲気下、丸底フラスコ中で、（４−メルカプトフェニル）メタノール［３６］（５４８ｍｇ、３．９１ｍｍｏｌ）を、化合物［２７］（９５０ｍｇ、２．６１ｍｍｏｌ）をＣＨ３ＣＮ（２０ｍＬ）に溶解した溶液に添加する。得られた溶液を室温で３時間攪拌し、次いでこの溶液を真空濃縮する。粗反応混合物をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（石油エーテル：ＥｔＯＡｃ １：４）によって精製して、１０２４ｍｇ（２．０３ｍｍｏｌ）の化合物［２８］を淡黄色粘稠油状物として得る（収率７８％）。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，δｐｐｍ，Ｊ Ｈｚ）：δ７．４６（ｄ，Ｊ＝７．６，２Ｈ），７．３１（ｄ，Ｊ＝８．０，２Ｈ），５．８１（ｂｓ，１Ｈ），４．６７（ｓ，２Ｈ），３．９１−３．８９（ｍ，１Ｈ），３．６３（ｓ，３Ｈ），３．３８−３．３２（ｍ，２Ｈ），３．１６−３．０３（ｍ，４Ｈ），２．８２（ｂｓ，１Ｈ），２．２１−１．９６（ｍ，５Ｈ），１．７７（ｄ，Ｊ＝１２．８，２Ｈ），１．５０−１．２３（ｍ，９Ｈ），１．０２−０．９２（ｍ，２Ｈ）。ＭＳ：ｍ／ｚ ５２７［Ｍ＋２３］＋；５４３［Ｍ＋３９］＋。ＴＬＣ Ｒｆ：０．３（ＥｔＯＡｃ）。
（１Ｒ，４Ｒ）−４−（（６−（３−（（４−（ブロモメチル）フェニル）チオ）−２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）ヘキサンアミド）メチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸メチル［２９］
Ｎ２雰囲気下、丸底フラスコ中で、ＰＢｒ３（２８μＬ、０．３０ｍｍｏｌ）を、アルコール［２８］（１００ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）を乾燥ＴＨＦ（５ｍＬ）に溶解した溶液に０℃で添加する。得られた溶液を０℃で２時間攪拌し、次いで、室温に戻るまで放置する；ＣＨ２Ｃｌ２（１ｍＬ）の添加後、この溶液は橙色（orange）に変わり、真空濃縮される。粗反応混合物をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ １００％）によって精製して、明橙色（bright orange）油状物として７８ｍｇ（０．１４ｍｍｏｌ）の化合物［２９］を得る（収率７０％）。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，δｐｐｍ，Ｊ Ｈｚ）：δ７．５６（ｄ，Ｊ＝８，２Ｈ），７．３１（ｄ，Ｊ＝８．０，２Ｈ），４．６６（ｓ，２Ｈ），３．９２−３．８９（ｍ，１Ｈ），３．６０（ｓ，３Ｈ），３．３７−３．３２（ｍ，２Ｈ），３．１６−３．０５（ｍ，４Ｈ），２．２１−１．９９（ｍ，５Ｈ），１．７７（ｄ，Ｊ＝１２．４，２Ｈ），１．５０−１．２８（ｍ，９Ｈ），１．０１−０．９２（ｍ，２Ｈ）。ＭＳ：ｍ／ｚ ５８９，５９１［Ｍ＋２３］＋。ＴＬＣ Ｒｆ：０．６（ＥｔＯＡｃ）。
ｐ−｛［Ｎ−８−アニリノ−８−オキソオクタノイル（アミノオキシ）］メチル｝フェニルチオ）−２，５−ジオキソ−１−ピロリジニル］ヘキサノイルアミノ｝メチル）シクロヘキサンカルボン酸エステル［３０］
Ｎ２雰囲気下、バイアル中で、臭化物［２９］（７８ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）、ＳＡＨＡ（５０ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）及び１ｍＬの乾燥ＤＭＦを室温で混合する。新たに蒸留したＤＩＰＥＡ（４５ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）を滴下し、この溶液を室温で１２時間攪拌する。次いで、溶媒を回転蒸発（rotator evaporation）及び高真空によって除去する。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン中メタノールのグラジエント０〜２０％）によって精製して、生成物［３０］を白色固体４８ｍｇ、４５％収率として得る。ＭＳ：ｍ／ｚ ７５１．４［Ｍ＋Ｈ］＋。
４−（｛６−［３−（ｐ−｛［Ｎ−８−アニリノ−８−オキソオクタノイル（アミノオキシ）］メチル｝フェニルチオ）−２，５−ジオキソ−１−ピロリジニル］ヘキサノイルアミノ｝メチル）シクロヘキサンカルボン酸２，５−ジオキソ−１−ピロリジニル（９）、ＳＴ８２１７ＡＡ１
［３０］（４８ｍｇ、０．０６３ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン／水／エタノールの１：１：１混合物（６ｍＬ）に溶解した溶液に、水酸化リチウム一水和物（８ｍｇ、０，１８ｍｍｏｌ）を添加する。この反応を室温で２時間保持し、次いで酢酸エチルで希釈し、ＨＣｌ １Ｎで洗浄する。粗生成物（２５ｍｇ）を、さらに精製することなく次の工程に直接使用する。既に得た粗生成物（２５ｍｇ、０．０３４ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦ（０，８０ｍＬ）に溶解した攪拌溶液に、ジシクロカルボジイミド（１１ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（６ｍｇ、０．０４５ｍｍｏｌ）を室温で添加する。この混合物を室温で１６時間保持する。この反応において形成した白色固体をジクロロメタンで濾過してジクロロヘキシル尿素を除去し、有機相をＨＣｌ ０．１Ｎ及び水で洗浄し、次いで無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を回転蒸発によって除去する。得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン中メタノールのグラジエント０〜２％）に供して、活性化酸ＳＴ８２１７ＡＡ１を白色粘稠固体として得る；ＭＳ：ｍ／ｚ ８５６．４［Ｍ＋Ｎａ］＋。
実施例８：ペイロード（１０）、ＳＴ８２０１ＡＡ１の合成及びキャラクタリゼーション
７−（（（Ｓ）−３−メチル−１−オキソ−１−（（（Ｓ）−１−オキソ−１−（（４−（（（８−オキソ−８−（フェニルアミノ）オクタンアミド）オキシ）メチル）フェニル）アミノ）−５−ウレイドペンタン−２−イル）アミノ）ブタン−２−イル）アミノ）−７−オキソヘプタン酸エチル［３１］
Ｎ２雰囲気下、バイアル中で、臭化物［１８］（６０ｍｇ、０．０９ｍｍｏｌ）、ＳＡＨＡ（２８ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）及び１ｍＬの乾燥ＤＭＦを室温で混合する。新たに蒸留したＤＩＰＥＡ（２５ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）を滴下し、この溶液を室温で１２時間攪拌する。次いで、溶媒を回転蒸発及び高真空によって除去する。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン中メタノールのグラジエント０〜２０％）によって精製して、生成物［３１］を白色固体４８ｍｇ、６８％収率として得る。ＭＳ：ｍ／ｚ ７９５．９［Ｍ＋Ｈ］＋、８１８．０［Ｍ＋Ｎａ］＋。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ７．６３−７．５９８（ｍ，２Ｈ），７．５７（ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ，２Ｈ），７．３９（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），７．３１３（ｔ，Ｊ＝８Ｈｚ，２Ｈ），７．０９（ｔ，Ｊ＝８；１Ｈ），４，８９（ｓ，２Ｈ），４．５８（ｓ，２Ｈ），４．２０（ｄ，Ｊ＝７．２，１Ｈ），４．１４（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），４．１０（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ），３，５６−３，４５（ｍ，１Ｈ），３，３４（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，２Ｈ），２，４１−２，３７（ｍ，１Ｈ），２，３４−２，３０（ｍ，２Ｈ），２，１３−２，０６（ｍ，２Ｈ），１，７９−１，６０（ｍ，４Ｈ），１，４２−１，３６（ｍ，４Ｈ），１，２８−１，２４（ｍ，３Ｈ），１，０１−０，９７（ｍ，６Ｈ）。
７−（（（Ｓ）−３−メチル−１−オキソ−１−（（（Ｓ）−１−オキソ−１−（（４−（（（（Ｓ）−７−オキソ−６−（（Ｒ）−５−オキソピロリジン−２−カルボキサミド）−７−（フェニルアミノ）ヘプチル）チオ）メチル）フェニル）アミノ）−５−ウレイドペンタン−２−イル）アミノ）ブタン−２−イル）アミノ）−７−オキソヘプタン酸２，５−ジオキソピロリジン−１−イル（１０）、ＳＴ８２０１ＡＡ１
４０（４８ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン／水／エタノールの１：１：１混合物（６ｍＬ）に溶解した溶液に、水酸化リチウム一水和物（８ｍｇ、０，１８ｍｍｏｌ）を添加する。この反応を室温で６時間保持し、次いで酢酸エチルで希釈し、ＨＣｌ １Ｎで洗浄する。粗生成物（２５ｍｇ）を、さらに精製することなく次の工程に使用する。ＭＳ：ｍ／ｚ ７６５．７［Ｍ−Ｈ］−。既に得た粗生成物（２５ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦ（０，８０ｍＬ）に溶解した攪拌溶液に、ジシクロカルボジイミド（１１ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（６ｍｇ、０．０４５ｍｍｏｌ）を室温で添加する。この混合物を室温で１６時間保持する。この反応において形成した白色固体をジクロロメタンで濾過してジクロロヘキシル尿素を除去し、有機相をＨＣｌ ０．１Ｎ及び水で洗浄し、次いで無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を回転蒸発によって除去する。得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン中メタノールのグラジエント０〜２％）に供して、活性化酸ＳＴ８２０１ＡＡ１を白色粘稠固体として得る；ＭＳ：ｍ／ｚ ８８７．２［Ｍ＋Ｎａ］＋。
実施例９：ペイロード（２２）、ＳＴ８２２７ＡＡ１の合成及びキャラクタリゼーション
ペイロード（２２）、ＳＴ８２２７ＡＡ１の合成及びキャラクタリゼーション：０℃に冷却したバイアルに、Ｎ２雰囲気下で、化合物［１７］（５０ｍｇ、０．０９ｍｍｏｌ）及びクロロギ酸４−ニトロフェニル（６２ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）、３ｍＬの乾燥ＤＣＭ（乾燥ＤＭＦ一滴を含有する）及び４−ジメチルアミノピリジン（６０ｍｇ、０．４９ｍｍｏｌ）を一緒に混合する。次いで、この混合物を室温で攪拌し、ＴＬＣによってモニターする。［１７］の反応変換が完了した後、ＭＳ２７５（４０ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）を添加し、この反応を室温でさらに１２時間攪拌する。次いで、この混合物をジクロロメタンで希釈し、ＨＣｌ １Ｎで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を回転蒸発によって除去する。粗エステルをＨ２ＯとＴＨＦとＥｔＯＨとの１：１：１混合物（５ｍＬ）に溶解し、ＬｉＯＨ一水和物を添加する（８．２ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）。この混合物を２時間還流攪拌し、次いでＨＣｌをｐＨ７になるまで添加する。溶媒を減圧下で蒸発させ、得られた固体をＥｔＯＨ（２×１０ｍＬ）で洗浄する。この溶液を蒸発させて無色油状物を得る。粗エステルをＨ２ＯとＴＨＦとＥｔＯＨとの１：１：１混合物（５ｍＬ）に溶解し、ＬｉＯＨ一水和物を添加する（８．２ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）。この混合物を２時間還流攪拌し、次いでＨＣｌをｐＨ７になるまで添加する。溶媒を減圧下で蒸発させ、得られた固体をＥｔＯＨ（２×２ｍＬ）で洗浄する。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン中メタノールのグラジエント０〜２０％）によって精製して、生成物ＳＴ８２２７ＡＡ１を固体（１２ｍｇ、１３％収率）として得る。ＭＳ：ｍ／ｚ １０４４．３［Ｍ＋Ｎａ］＋。
実施例１０．ペイロード（７）、ＳＴ８１９７ＡＡ１の合成及びキャラクタリゼーション
Ｎ−フェニル−７−スルファニル−ヘプタンアミド（ＳＴ７６６０ＡＡ１）（６０ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）を脱気メタノール（１ｍＬ）に懸濁し；この攪拌混合物に化合物［７］（８４ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）を室温で添加すると、数分後に透明溶液になる。ＴＬＣモニタリングが［７］の完全な変換を示すまで、この溶液を室温で２０時間攪拌し続ける。次いで、溶媒を回転蒸発によって除去し、原料をカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン中メタノールのグラジエント２〜１０％）によって精製する。化合物［３３］は、白色固体１１５ｍｇ（８１％収率）として得られる。ＭＳ：ｍ／ｚ ６１０［Ｍ＋Ｎａ］＋。
１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１１．９７（ｂｓ，１Ｈ），９．８５（ｓ，１Ｈ），７．７２（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），７．５９（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，２Ｈ），７．２８（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，２Ｈ），７．０２（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，１Ｈ），３．９３（ｄｄ，Ｊ＝９．０，３．７Ｈｚ，１Ｈ），３．３５（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），３．１８（ｄｄ，Ｊ＝１８．３，９．０，１Ｈ），２．８８（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ），２．７９−２．６３（ｍ，２Ｈ），２．３０（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），２．１４−２．０５（ｍ，１Ｈ），２．０４（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），１．９２−１．８４（ｍ，２Ｈ），１．７４−１．６７（ｍ，２Ｈ），１．６３−１．１５（ｍ，１８Ｈ），０．９４−０．８３（ｍ，２Ｈ）。
０．１２ｍＬの乾燥ジメチルホルムアミドを含む無水ジクロロメタン（５．５ｍＬ）に、化合物［３３］（１１０ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）を懸濁する。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（３３ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）及びＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチル−カルボジイミド塩酸塩（６１ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ）を室温で添加し、この反応混合物を室温で２４時間攪拌する。この混合物をジクロロメタン（７０ｍＬ）で希釈し、水（４０ｍＬ）及びブライン（３０ｍＬ）で洗浄する。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、回転蒸発（rotary evaporation）によって濃縮する。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（ジクロロメタン中メタノール２〜６％）によって精製する。生成物ＳＴ８１９７ＡＡ１は、白色固体９７ｍｇ（７６％収率）として得られる。ＭＳ：ｍ／ｚ ７０７［Ｍ＋Ｎａ］＋。
１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ９．８３（ｓ，１Ｈ），７．７３（ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，１Ｈ），７．５９（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，２Ｈ），７．２８（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），７．０２（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，１Ｈ），３．９４（ｄｄ，Ｊ＝８．８，３．４Ｈｚ，１Ｈ），３．３６（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），３．１８（ｄｄ，Ｊ＝１８．３，８．８，１Ｈ），２．９１（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），２．８１（ｓ，４Ｈ），２．８０−２．６２（ｍ，３Ｈ），２．３０（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），２．１８−１．９７（ｍ，４Ｈ），１．８０−１．７２（ｍ，２Ｈ），１．６４−１．２７（ｍ，１６Ｈ），１．２７−１．１５（ｍ，２Ｈ），１．０６−０．９４（ｍ，２Ｈ）。
１３Ｃ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１７７．２，１７５．６，１７２．３，１７１．６，１７１．４，１７０．７，１３９．８，１２９．１，１２３．４，１１９．５，４４．８，３９．６，３８．５，３７．１，３６．８，３６．３，３５．６，３０．８，２９．３（４Ｃ），２９．０，２８．７，２８．６，２８．４，２７．３，２６．３，２５．９，２５．４，２５．３。
実施例１１：ペイロード（１１）、ＳＴ８２１５ＡＡ１及びペイロード１２、ＳＴ８２１６ＡＡ１の合成及びキャラクタリゼーション
６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−Ｎ−（プロプ−２−イン−１−イル）ヘキサンアミド［３５］：乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（２５ｍＬ）に化合物［３４］（５００ｍｇ、２，３７ｍｍｏｌ）を溶解した溶液を含むフラスコに、Ｎ２雰囲気下、プロパルギルアミン（１６２μＬ、２，３７ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ Ｈ２Ｏ（４３５ｍｇ、２，８４ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（１０７７ｍｇ、２，８４ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（１，２４ｍＬ、７，１０ｍｍｏｌ）を０℃で添加し、この混合物を室温で１６時間攪拌する。反応完了後、この混合物をジクロロメタンで希釈し、水、ＨＣｌ １Ｎ及びブラインで洗浄する。有機層を回収し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を回転蒸発によって除去する。得られた残渣を、中圧システムＳｅｐａｃｏｒｅ（登録商標）（ビュッヒ）を用いてフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル；グラジエント 石油エーテル／酢酸エチルＢ％ ０〜６５／４分、６５〜６５／７分，６５〜１００／２分）によって精製し、化合物［３５］（３１２ｍｇ、収率５３％）を白色固体として得る。ＭＳ：ｍ／ｚ ２７０．８［Ｍ＋Ｎａ］＋ １Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ６．６４（ｓ，２Ｈ），５．９５（ｓ，１Ｈ），３．９８（ｄｄ，Ｊ＝４，４Ｈｚ，２Ｈ），３．４５（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），２．１６（（ｄｔ，Ｊ＝１５．０，４．９Ｈｚ，２Ｈ），１．６８−１．４７（ｍ，４Ｈ），１．３１−１．１９（ｍ，２Ｈ）。
（４−メルカプトフェニル）メタノール［３６］：乾燥ＴＨＦ（２５ｍＬ）に４−メルカプト安息香酸（２．０ｇ、１３ｍｍｏｌ）を溶解した攪拌溶液に、Ｎ２雰囲気下、三つ口フラスコ中で、ＴＨＦ（３９ｍＬ，３９ｍｍｏｌ）中のＬｉＡｌＨ４ １Ｍを０℃で３０分で添加する。この混合物を室温で１２時間攪拌しておく。次いで、この反応を０℃に冷却し、３ｍＬの水でクエンチし、ＨＣｌ １ＭでｐＨ２まで酸性にする。酢酸エチルを添加し、有機層をＨ２Ｏ及びブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、溶媒を回転蒸発によって除去する。得られた残渣を、中圧システムＳｅｐａｃｏｒｅ（登録商標）（ビュッヒ）を用いてフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル；グラジエント 石油エーテル／酢酸エチルＢ％ ０〜２５／３分、２５〜２５／６分、２５〜１００／３分）によって精製して、アルコール［３６］（１．２ｍｇ、収率６６％）を黄色固体として得る。ＭＳ：ｍ／ｚ １４１．２［Ｍ＋Ｈ］＋ １Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．２５−７．０６（ｍ，４Ｈ），４．４３（ｓ，２Ｈ），３．７２（ｓ，１Ｈ），３．４８（ｓ，１Ｈ）。
６−（３−（（４−（ヒドロキシメチル）フェニル）チオ）−２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）−Ｎ−（プロプ−２−イン−１−イル）ヘキサンアミド［３７］：乾燥ＭｅＣＮ（８ｍＬ）にマレイミド［３５］（２００ｍｇ、０，８ｍｍｏｌ）を溶解した攪拌溶液に、チオール［３６］（１３５ｍｇ、０，９６ｍｍｏｌ）を添加し、この反応混合物をＮ２下、室温で４時間攪拌する。反応完了後、溶媒を回転蒸発によって除去し、残渣を、中圧システムＳｅｐａｃｏｒｅ（登録商標）（ビュッヒ）を用いてフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル；グラジエント 石油エーテル／酢酸エチルＢ％ ０〜８０／５分、８０〜９０／８分、９０〜１００／１分）によって精製して、［３７］（１３４ｍｇ、収率４３％）を黄色油状物として得る。ＭＳ：ｍ／ｚ ４１０．８［Ｍ＋Ｎａ］＋、４２６．９［Ｍ＋Ｋ］＋；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ）δ７．５８（ｄｄ，Ｊ＝１６．５，８．１Ｈｚ，２Ｈ），７．４４（ｄｄ，Ｊ＝１４．６，８．１Ｈｚ，２Ｈ），４．６８（ｓ，２Ｈ），４．２４（ｄｄ，Ｊ＝９．１，３．７Ｈｚ，１Ｈ），４．０１（ｄ，Ｊ＝４Ｈｚ，２Ｈ），３．４２（ｄｄ，Ｊ＝１５．１，７．９Ｈｚ，２Ｈ），３．２９（ｄｄ，Ｊ＝１８．７，９．１Ｈｚ，１Ｈ），２．７２（ｄｄ，Ｊ＝１８．７，３．７Ｈｚ，１Ｈ），２．２３（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，３Ｈ），１．６８−１．６０（ｍ，３Ｈ），１．５３−１．４４（ｍ，３Ｈ），１．３１−１．１６（ｍ，２Ｈ）。
６−（３−（（４−（ブロモメチル）フェニル）チオ）−２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）−Ｎ−（プロプ−２−イン−１−イル）ヘキサンアミド［３８］：乾燥ＴＨＦ（３ｍＬ）に化合物［３７］（２１０ｍｇ、０．５４ｍｍｏｌ）を溶解した溶液に、ＰＢｒ３（７６μＬ、０．８１ｍｍｏｌ）を０℃で添加し、この混合物を０℃で３時間保持する。溶媒の蒸発後、粗生成物を、フラッシュクロマトグラフィー（石油エーテル中酢酸エチルのグラジエント０〜６０％）によって精製して、生成物［３８］（２４５ｍｇ、収率＞９９％）を橙色固体として得る。ＭＳ：ｍ／ｚ ４７２．８［Ｍ＋Ｎａ］＋；４８８．９［Ｍ＋Ｋ］＋；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．４９（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，２Ｈ），７．３６（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，２Ｈ），４．４６（ｓ，２Ｈ），４．０４（ｓ，２Ｈ），３．５８−３．３４（ｍ，４Ｈ），３．１６（ｄｄ，Ｊ＝１８．７，９．２Ｈｚ，１Ｈ），２．６９（ｄｄ，Ｊ＝１８．８，４．０Ｈｚ，１Ｈ），２．３０−２．１２（ｍ，３Ｈ），１．７４−１．５８（ｍ，３Ｈ），１．５６−１．４３（ｍ，３Ｈ），１．２７（ｄｄ，Ｊ＝１６．０，８Ｈｚ，２Ｈ）。
Ｎ１−（（４−（（２，５−ジオキソ−１−（６−オキソ−６−（プロプ−２−イン−１−イルアミノ）ヘキシル）ピロリジン−３−イル）チオ）ベンジル）オキシ）−Ｎ８−フェニルオクタンジアミド［３９］：ＳＡＨＡ（９６ｍｇ、０，３６ｍｍｏｌ）を６ｍＬのＭｅＯＨに溶解し、ＮａＯＨ ４０％溶液（７６μＬ、０，７６ｍｍｏｌ）を添加する。１０分後、この溶液を、Ｎ２雰囲気下、臭化物［３８］（２４５ｍｇ、０，５４ｍｍｏｌ）を含むフラスコに混合する。直ちにこの溶液は紫色（purple）になり、５〜１０分後、ＴＬＣは生成物［３９］の形成を示す。このメタノールを速やかに濃縮し、反応粗生成物をジクロロメタンで希釈し、ＨＣｌ １Ｎで洗浄して、塩基を中和する。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、溶媒を回転蒸発によって除去する。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（石油エーテル中酢酸エチルのグラジエント０〜８０％）によって精製して、生成物［３９］（９０ｍｇ、収率４０％）を白色固体として得る。ＭＳ：ｍ／ｚ ６５６．８［Ｍ＋Ｎａ］＋。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ８．１６（ｓ，２Ｈ），７．５０（ｄ，Ｊ＝４Ｈｚ，２Ｈ），７．４１（ｄ，Ｊ＝４Ｈｚ，２Ｈ），７．３３−７．２３（ｍ，３Ｈ），７．０３（ｄ，Ｊ＝４Ｈｚ，２Ｈ），４．８４（ｓ，２Ｈ），３．９５（ｓ，２Ｈ），３．４０−３．３１（ｍ，２Ｈ），３．１０（ｄｄ，Ｊ＝２０，８Ｈｚ，１Ｈ），２．６４（ｄｄ，Ｊ＝１８．８，４．０Ｈｚ，１Ｈ），２．２９（ｓ，２Ｈ），２．１９（ｓ，２Ｈ），２．１１（ｓ，２Ｈ），１．６４−１．５７（ｍ，６Ｈ），１．２９−１．２２（ｍ，８Ｈ），１．１０（ｓ，２Ｈ），０．８３（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１７５．０２（ｓ），１７４．５８（ｄ，Ｊ＝８９．２Ｈｚ），１７２．５８（ｓ），１７１．５５（ｓ），１３７．８６（ｓ），１３７．８４（ｓ），１３４．３７−１２７．２９（ｍ），１２７．９８−１２７．２９（ｍ），１２３．６６（ｓ），１１９．５２（ｓ），７９．３０（ｓ），７１．０３（ｓ），４３．２８（ｓ），３６．６２（ｄｄ，Ｊ＝２０７．０，９２．０Ｈｚ），３５．７１（ｓ），３５．５９（ｄ，Ｊ＝２５．１Ｈｚ），３５．４６（ｓ），２９．２４（ｓ），２８．２０（ｄｄ，Ｊ＝１４８．７，９９．９Ｈｚ），２６．７４−２６．３４（ｍ），２６．３４−２４．４８（ｍ），２４．４９（ｓ），２４．４９（ｓ）。
６−アジドヘキサン酸［４０］：ジメチルホルムアミド５ｍＬ中の６−ブロモヘキサン酸（２００ｍｇ、１，０２ｍｍｏｌ）とアジ化ナトリウム（３３３ｍｇ、５，１２ｍｍｏｌ）とを、密封したバイアル中で、１００℃で１６時間加熱する。冷却後、この反応を酢酸エチルで希釈し、ＫＨＳＯ４ １Ｍ、Ｈ２Ｏ及びブラインで洗浄する。有機層を回収し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を回転蒸発によって除去する。生成物［４０］（１５８ｍｇ、９９％）は、褐色（brown）油状物として純粋に得られる。ＭＳ：ｍ／ｚ １５５．８［Ｍ−Ｈ］−；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１０．４９（ｓ，１Ｈ），３．２１−３．１８（ｍ，２Ｈ），２．２８（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），１．８４−１．４５（ｍ，４Ｈ），１．３８−１．３１（ｍ，２Ｈ）。
６−（４−（（６−（２，５−ジオキソ−３−（（４−（（（８−オキソ−８−（フェニルアミノ）オクタンアミド）オキシ）メチル）フェニル）チオ）ピロリジン−１−イル）ヘキサンアミド）メチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）ヘキサン酸［４１］：乾燥ＤＭＦ（１１ｍＬ）に化合物［４０］（１７ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）と化合物［３９］（９０ｍｇ、０，１４ｍｍｏｌ）とを溶解した攪拌溶液を、室温でアルゴン／真空サイクル（３×）によって脱気する。この溶液に、アルゴン／真空サイクルによって予め脱気して新たに調製したＣｕ（ＯＡｃ）２（７ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）とアスコルビン酸ナトリウム（１３ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌ）との水性混合物（５，５ｍＬ）を添加する。この反応混合物を再び脱気し、アルゴン下、室温で７２時間攪拌しておく。反応完了後、粗生成物を濃縮し、溶媒を回転蒸発によって除去する。得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン中メタノールのグラジエント０〜１６％）に供して、トリアゾール［４４１］（５５ｍｇ、収率６２％）を橙色固体として得る；ＭＳ：ｍ／ｚ ８１３．８［Ｍ＋Ｎａ］＋ １Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ）δ７．８６（ｓ，２Ｈ），７．５９−７．４６（ｍ，４Ｈ），７．３７（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），７．２６（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ），７．０４（ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，１Ｈ），４．３７（ｓ，２Ｈ），４．２１（ｓ，２Ｈ），３．３３（ｄｄ，Ｊ＝１２．９，４．９Ｈｚ，４Ｈ），３．１８（ｄｄ，Ｊ＝２０，８Ｈｚ，１Ｈ），２．６０（ｄｄ，Ｊ＝１８．８，４．０Ｈｚ，１Ｈ），２．４２−２．１２（ｍ，５Ｈ），２．０２（ｓ，２Ｈ），１．８８（ｓ，２Ｈ），１．７６−１．４７（ｍ，８Ｈ），１．４９−１．２３（ｍ，１０Ｈ），１．１７（ｓ，２Ｈ），０．８６（ｓ，１Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ）δ１４０．２９−１３９．１４（ｍ），１３９．１４−１３４．２６（ｍ），１３２．８６（ｓ），１３９．１４−１０８．９４（ｍ），１０７．３４（ｓ），７６．３１（ｓ），３５．２８（ｓ），２８．０４（ｓ），２５．１６（ｄ，Ｊ＝６１．４Ｈｚ），２４．５７（ｓ）。
６−（４−（（６−（２，５−ジオキソ−３−（（４−（（（８−オキソ−８−（フェニルアミノ）オクタンアミド）オキシ）メチル）フェニル）チオ）ピロリジン−１−イル）ヘキサンアミド）メチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）ヘキサン酸２，５−ジオキソピロリジン−１−イル（１１）、ＳＴ８２１５ＡＡ１：無水ジメチルホルムアミド（０，８０ｍＬ）に化合物［４１］（５５ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）を溶解した攪拌溶液に、ジシクロヘキシルカルボジイミド（２１ｍｇ、０，１０ｍｍｏｌ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１０ｍｇ、０，０９ｍｍｏｌ）を室温で添加する。この混合物を室温で１６時間保持する。この反応において形成した白色固体をジクロロメタンで濾過し、有機相を水で洗浄し、次いで、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、溶媒を回転蒸発によって除去する。得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン中メタノールのグラジエント０〜８％）に供して、活性化酸ＳＴ８２１５ＡＡ１を白色粘稠固体（２４ｍｇ、４５％）として得る；ＭＳ：ｍ／ｚ ９１０．８［Ｍ＋Ｎａ］＋；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ８．０７（ｓ，２Ｈ），７．５２（ｓ，２Ｈ），７．４４（ｓ，２Ｈ），７．３２（ｓ，２Ｈ），７．２３（ｓ，３Ｈ），７．０４（ｓ，１Ｈ），４．８７（ｓ，２Ｈ），４．４５（ｓ，２Ｈ），４．３１（ｓ，２Ｈ），３．３２（ｓ，２Ｈ），３．１３（ｓ，１Ｈ），２．７９（ｓ，４Ｈ），２．６５（ｓ，２Ｈ），２．５５（ｓ，２Ｈ），２．２９（ｓ，２Ｈ），２．１２（ｓ，２Ｈ），１．８９（ｓ，２Ｈ），１．７８−１．４８（ｍ，８Ｈ），１．４７−１．１２（ｍ，１０Ｈ），１．０７（ｓ，２Ｈ），０．８３（ｓ，１Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１３４．５０（ｓ），１２９．２４（ｓ），１２８．４９（ｓ），１２４．４７−１２３．７１（ｍ），１２１．４９（ｄ，Ｊ＝４２０．４Ｈｚ），４９．８９（ｓ），４３．３０（ｓ），３８．４８（ｓ），３６．８７（ｓ），３５．６５（ｓ），３４．３９（ｓ），３２．５４（ｓ），３０．２５（ｓ），２９．２５（ｓ），２８．０４（ｓ），２６．２３（ｄ，Ｊ＝１０７．２ Ｈｚ），２４．８４（ｓ），２５．３８−２３．３３（ｍ），２４．５５（ｓ），２４．９６−２３．３３（ｍ），２３．４７（ｓ）。
Ｎ１−（（４−（（１−（６−（（（１−（６−（（２−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル）アミノ）−６−オキソヘキシル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）アミノ）−６−オキソヘキシル）−２，５−ジオキソピロリジン−３−イル）チオ）ベンジル）オキシ）−Ｎ８−フェニルオクタンジアミド（１２）、ＳＴ８２１６ＡＡ１：乾燥ＴＨＦ／ＤＭＦの３：１混合物（１，３３ｍＬ）に［４１］（１５ｍｇ、０，０２ｍｍｏｌ）を溶解した攪拌溶液に、Ｎ２雰囲気下、Ｎ−（２−アミノエチル）マレイミド（３，３ｍｇ、０，０２ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ Ｈ２Ｏ（４ｍｇ、０，０３ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（１１ｍｇ、０，０３ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（７μＬ、０，０５ｍｍｏｌ）を０℃で添加する。添加後、この混合物を室温で１２時間保持し、次いで、ジクロロメタンで希釈し、水で洗浄する。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、溶媒を回転蒸発によって除去する。得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン中メタノールのグラジエント０〜８％）に供して、生成物ＳＴ８２１６ＡＡ１（１３ｍｇ、収率７２％）を白色粘稠固体として得る。ＭＳ：ｍ／ｚ ９３６．６［Ｍ＋Ｎａ］＋；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ）δ７．８６（ｓ，３Ｈ），７．６０−７．４２（ｍ，５Ｈ），７．３８−７．３５（ｍ，２Ｈ），７．２５（ｔ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，２Ｈ），７．０３（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ），６．７７（ｓ，２Ｈ），４．８６（ｓ，２Ｈ），４．３５（ｄｄ，Ｊ＝１５．７，８．７Ｈｚ，４Ｈ），３．６９（ｔ，Ｊ＝４Ｈｚ，２Ｈ），３．５６（ｔ，Ｊ＝４Ｈｚ，２Ｈ），３．４３−３．２８（ｍ，５Ｈ），３．２４−３．１３（ｍ，２Ｈ），２．３２（ｔ，Ｊ＝８Ｈｚ，２Ｈ），２．１５（ｄｄ，Ｊ＝１４．９，７．５Ｈｚ，２Ｈ），２．０４（ｄｄ，Ｊ＝１３．３，６．０Ｈｚ，２Ｈ），１．９２−１．７７（ｍ，２Ｈ），１．７７−１．５０（ｍ，８Ｈ），１．５０−１．１２（ｍ，１０Ｈ），０．８６（ｓ，１Ｈ）。
実施例１２：パノビノスタット系ペイロード及びダシノスタット系ペイロードについての一般的合成手順
ダシノスタット系ペイロード（１５）、ＳＴ８２３３ＡＡ１の合成及びキャラクタリゼーション
３−（ｐ−｛［Ｎ−（Ｅ）−３−［ｐ−（｛（２−ヒドロキシエチル）［２−（１Ｈ−インドール−３−イル）エチル］アミノ｝メチル）フェニル］アクリロイル（アミノオキシ）］メチル｝フェニルチオ）−１−［６−オキソ−６−（２−プロピニルアミノ）ヘキシル］−２，５−ピロリジンジオン［４２］：ＮａＯＨ（水中４０％、４０μＬ、０．４ｍｍｏｌ）を含むＭｅＯＨ ６ｍＬに、ダシノスタット（１００ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ）を溶解する。室温で１５分攪拌後、この溶液を、臭化物［３８］（１８１ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）を含むバイアルに添加する。室温で５〜１０分攪拌後、ＴＬＣ分析は、生成物の形成を示した。メタノールを速やかに蒸発させ、この反応粗生成物をジクロロメタンで希釈し、ＨＣｌ １Ｎで洗浄して塩基を中和し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、溶媒を回転蒸発によって除去する。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（石油エーテル中酢酸エチルのグラジエント０〜８０％）によって精製して、生成物［４２］（９５ｍｇ、収率４４％）を白色固体として得る。ＭＳ：ｍ／ｚ ７７２．６［Ｍ＋Ｎａ］＋。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ，７．８３−７．７２（ｍ，２Ｈ），７．６５−７．３０（ｍ，１０Ｈ），７．２５−７．０７（ｍ，２Ｈ），７．１３−７．０５（ｍ，１Ｈ），６．８１（ｍ，１Ｈ），６．６４（ｔ様，１Ｈ），４．８０（ｍ，１Ｈ），４．６９−４．５４（ｍ，２Ｈ），４．３４−４．１８（ｍ，２Ｈ），４．０５（ｍ，１Ｈ），３．９１−３．４５（ｍ，７Ｈ），３．３２−２．７７（ｍ，８Ｈ），２．６６（ｍ，１Ｈ），２．３６−２．１２（ｍ，４Ｈ），１．７６−１．２６（ｍ，８Ｈ）。
６−［４−（｛６−［３−（ｐ−｛［Ｎ−（Ｅ）−３−［ｐ−（｛（２−ヒドロキシエチル）［２−（１Ｈ−インドール−３−イル）エチル］アミノ｝メチル）フェニル］アクリロイル（アミノオキシ）］メチル｝フェニルチオ）−２，５−ジオキソ−１−ピロリジニル］ヘキサノイルアミノ｝メチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル］ヘキサン酸［４３］：
乾燥ＤＭＦ（１０ｍＬ）に化合物［４２］（４０ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）と６−アジドヘキサン酸（１６ｍｇ、０，１０ｍｍｏｌ）とを溶解した攪拌溶液を、室温でアルゴン／真空サイクル（３×）によって脱気する。この溶液に、アルゴン／真空サイクル（３×）によって予め脱気して新たに調製したＣｕ（ＯＡｃ）２（７ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）とアスコルビン酸ナトリウム（１３ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌ）との水性混合物（５，５ｍＬ）を添加する。この反応混合物を再び脱気し、アルゴン下、室温で７２時間攪拌しておく。反応完了後、粗生成物を濃縮し、溶媒を回転蒸発によって除去する。得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン中メタノールのグラジエント０〜１６％）によって精製して、トリアゾール［４３］（３５ｍｇ、収率７７％）を固体として得る。ＭＳ：ｍ／ｚ ９３０．７［Ｍ＋Ｎａ］＋。
ペイロード（１５）、ＳＴ８２３３ＡＡ１の合成：無水ＤＭＦ（０，８０ｍＬ）に化合物［４３］（３５ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）を溶解した攪拌溶液に、ジシクロヘキシルカルボジイミド（１６ｍｇ、０，０８ｍｍｏｌ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（７．７ｍｇ、０，０７ｍｍｏｌ）を室温で添加する。この混合物を室温で１６時間保持する。この反応において形成した白色固体をジクロロメタンで濾過し、有機相を水で洗浄し、次いで、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、溶媒を回転蒸発によって除去する。得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン中メタノールのグラジエント０〜８％）に供して、活性化酸ＳＴ８２３３ＡＡ１を白色粘稠固体（１４ｍｇ、３５％）として得る；ＭＳ：ｍ／ｚ １０２６．４［Ｍ＋Ｎａ］＋。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ９．９４（ｂｓ，１Ｈ），８．９２（ｂｓ，１Ｈ），７．９０（ｂｓ，１Ｈ），７．６１−７．４７（ｍ，１Ｈ），７．５０−７．３７（ｍ，１Ｈ），７．３３（ｍ，２Ｈ），７．２０（ｍ，１Ｈ），７．１５−６．８６（ｍ，１Ｈ），６．６９（ｍ，１Ｈ），４．８０（ｍ，１Ｈ），４．６９−４．５４（ｍ，１Ｈ），４．４９−４．１２（ｍ，２Ｈ），３．８４（ｍ １Ｈ），３．６９−３．５２（ｍ，１Ｈ），３．４３−２．８７（ｍ，３Ｈ），２．８８−２．３５（ｍ，３Ｈ），２．３５−２．０８（ｍ，１Ｈ），２．０２−１．２３（ｍ，５Ｈ）。
実施例１３：Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）に対するリシン残基のε−アミノ基への結合（conjugation）によるＡＤＣの合成及びキャラクタリゼーション
ここでは、例として、ＨＤＡＣから作製されたＡＤＣを、四つの異なる抗体［Ｔｒａｎｓｔｕｚｕｍａｂ Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（トラスツズマブ ハーセプチン）（登録商標） ロシュ（Roche）；Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ Ｅｒｂｉｔｕｘ（セツキシマブ アービタックス）（登録商標） メルク（Merck）；Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ Ａｖａｓｔｉｎ（ベバシズマブ アバスチン）（登録商標） ジェネンテック／ロシュ（Genentech/Roche）；Ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（パニツムマブ ベクティビックス）（登録商標） アムジェン（Amgen）］及び市販の二つのマウス抗ヒトＣＤ４抗体、クローンＳＫ３（Ｌｅｕ３ａとしても公知である）並びにクローンＲＰＡ−Ｔ４に結合する。詳細には、承認された抗体は、ＥｒｂＢ２を認識するトラスツズマブ、ＥｒｂＢ１を認識するセツキシマブ及びパニツムマブ、ＶＥＧＦＲを認識するベバシズマブである。
抗体を、１０ｋＤａカットオフ透析膜を用いて緩衝液交換してＰＢＳ ｐＨ７．４の抗体溶液を得て、妨害的な防腐剤を除去した。透析後の濃度は、ＯＤ２８０を測定して決定し、サンプルの吸光度の表示を１．３６で除した。
ＤＭＳＯ中にアミン反応性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳエステル）ペイロードを含む１０ｍＭのストック溶液を調製し、２０倍モル過剰のペイロードを各抗体溶液に添加した。
反応を穏やかに連続的に混合しながら室温でインキュベートし、１時間後に２０ｍＭグリシン水溶液を添加して反応をクエンチした。
次いで、過剰な未反応ペイロードを除去するために、最終生成物を、４℃で一晩、１０ｋＤａカットオフ膜を用いてＰＢＳ中で透析した。
ＤＡＲ（薬物−抗体比）は、ポジティブリニアモード（positive linear mode）で操作するＵｌｔｒａｆｌｅｘ ＩＩＩ質量分析装置（ブルカー ゲーエムベーハー（Bruker, GmbH））を用いて、ＭＡＬＤＩ質量分析法によって決定した。
簡潔には、１００μｌの未結合抗体及び得られたＡＤＣを、水中で溶出するＰＤ ｓｐｉｎ ｔｒａｐ Ｇ２５（ＧＥヘルスケア（GE Healthcare））を用いて脱塩した。
Ｈ２Ｏ：ＡＣＮ（５０：５０、ｖ／ｖ）に溶解した０．１％ＴＦＡ中に１０ｍｇ／ｍｌのｓ−ＤＨＢ ＭＡＬＤＩマトリックス溶液を調製した。２μｌのサンプル溶液（抗体又はＡＤＣ）を、二層サンプル蒸着法（double layer sample deposition method）を用いて、ＭＡＬＤＩ標的に対して蒸着した。マススペクトルを、５０ｋＤａから１８０ｋＤａまでの質量電荷範囲で取得した。
未結合抗体と結合抗体との質量差を用いて、ＤＡＲを決定した。
抗体トラスツズマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、ベバシズマブ並びに二つの抗ヒトＣＤ４抗体を、上記の実験条件下で結合反応のために使用した。３〜９の範囲のＤＡＲを有するＡＤＣが得られた。
合成したすべてのＡＤＣを、ＭＡＬＤＩマススペクトルによって特徴付けた。リシン系ＡＤＣの例及びシステイン系ＡＤＣの例を、図１〜２に示した。
ここでは、単なる例として、ＡＤＣ−（２４）、ＳＴ８１５４ＡＡ１−のＭＡＬＤＩマススペクトルを示す（図１）。
実施例１４：システイン残基でのマレイミド含有ペイロードとの結合によって調製されたＡＤＣの合成及びキャラクタリゼーション
抗体を、１０ｋＤａカットオフ透析膜を用いて緩衝液交換して、ＰＢＳ ｐＨ７．４の抗体溶液を得て、妨害的な防腐剤を除去した。透析後の濃度は、ＯＤ２８０を測定して決定し、サンプルの吸光度の表示を１．３６で除した。
抗体中の鎖間ジスルフィドの穏やかな還元により、還元型の不対システインが得られ、これは慣用のマレイミドリンカーとの結合に適し、２〜６個の薬物／抗体を有する均一なＡＤＣを得る。
この目的のために、水中に１ｍＭのＴＣＥＰ−ＨＣｌストック溶液を調製し、５倍モル過剰量を抗体溶液に添加した。反応を、穏やかに連続的に混合しながら３７℃で２時間維持した。この反応を冷却した。
ＴＣＥＰはチオールを含まない化合物であるので、過剰の還元（reducing）を除去する必要はなく、ＤＭＳＯ中に調製した２０倍モル過剰の１０ｍＭマレイミド系ペイロードストック溶液を各還元抗体溶液に添加した。
反応を穏やかに連続的に混合しながら室温でインキュベートし、１時間後に２０ｍＭシステイン水溶液を添加して反応をクエンチした。
次いで、過剰な未反応ペイロードを除去するために、最終生成物を、４℃で一晩、１０ｋＤａカットオフ膜を用いてＰＢＳ中で広範囲に透析した。
ＤＡＲ（薬物抗体比）は、ＭａｂＰａｃ ＨＩＣ−Ｂｕｔｙｌカラム１００ｍｍ×４．６ｍｍ、５μｍ（サーモフィッシャーサイエンティフィック（Thermo Fisher Scientific））を用いて疎水性クロマトグラフィーによって決定した。移動相Ａは、１．５硫酸アンモニウム、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７及びイソプロパノール（９５：５；ｖ／ｖ）であり、移動相Ｂは、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７及びイソプロパノール（８０：２０；ｖ／ｖ）であった。
注射後１分間、移動相Ａを１００％で維持し、次いで、移動相Ｂを３０分で１００％に上昇させ、５分間保持した。
ＵＶプロファイルは、２２０ｎｍ及び２８０ｎｍで記録された。本発明によるすべての抗体（トラスツズマブ及びセツキシマブなど）は、上記の実験条件下で結合反応を含む方法によって調製された。３．５〜４．６の範囲に平均ＤＡＲを有するＡＤＣが得られた。
ここでは、単なる例として、ＡＤＣ−（２８）、ＳＴ８１７６ＡＡ１−のＨＩＣクロマトグラムを示す（図２）。ＤＡＲは、ピーク面積を考慮して、下記式を適用して計算された：
実施例１５：腫瘍細胞に対するＥｒｂＢ１及びＥｒｂＢ２受容体に結合するＡＤＣの決定
ＥｒｂＢ１及びＥｒｂＢ２発現腫瘍細胞へのＡＤＣの結合を、ＦＡＣＳ解析によって確認した。肺（Ａ５４９、Ｈ１９７５）、胸部（ｓＫＢＲ３）、結腸（ＬＳ１７４Ｔ）、卵巣（ｓＫＯＶ３）、膵臓（ＣＡＰＡＮ１及びＭＩＡＰＡＣＡ−２）並びに胃（Ｎ８７）癌細胞株を含む、異なるレベルのＥＧＦＲ及びＥｒｂＢ２発現を有する様々な腫瘍細胞株を、実験に用いた。細胞ペレットを、ＰＢＳ中１０μｇ／ｍＬ抗体又はＡＤＣとともに４℃で１時間インキュベートし、次いで、ＰＢＳ中で２回洗浄した後、マウス抗ヒトＦＩＴＣ結合ＩｇＧ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて４℃で１時間染色した。さらに２回洗浄した後、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を添加し、細胞関連蛍光分析（cell-associated fluorescence analysis）をＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（ベクトン・ディッキンソン（Becton Dickinson））によって実施した。全ての化合物は、遊離の抗体セツキシマブ及びトラスツズマブと同等の様式で受容体に結合することが示された（表３並びに図３及び４を参照のこと）。
１６：腫瘍細胞による内在化の決定
同種受容体（cognate receptors）への結合後にＡＤＣが腫瘍細胞内へ内在化する能力を、Ｏｐｅｒｅｔｔａシステム（パーキンエルマー（Perkin Elmer））を介してＨＣＳ蛍光イメージングによって評価した。肺（Ａ５４９、Ｈ１９７５）、胸部（ＳＫＢＲ３）、結腸（ＬＳ１７４Ｔ）、卵巣（ＳＫＯＶ３）、膵臓（ＣＡＰＡＮ１）及び胃（Ｎ８７）癌細胞株を含むいくつかの腫瘍細胞型を試験した。細胞を、９６ウェルマイクロタイタープレート（０．５〜１×１０４／ウェル）に播種し、次いで、培地中、５μｇ／ｍＬ抗体とともに３７℃で３時間インキュベートした。２回洗浄した後、細胞を、ＰＢＳに溶解した４％ホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳ ０．２％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳ−Ｔ）で透過処理し、ＰＢＳ−Ｔに溶解した２％ ＢＳＡでブロックし、最終的にＦＩＴＣ結合マウス抗ヒトＩｇＧ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で染色した。蛍光を、ハイコンテントスクリーニング（ＨＣＳ）システムＯｐｅｒｅｔｔａ（パーキンエルマー）によって取得し分析した。細胞を、Ｄｒａｑ５染料（セル・シグナリング（Cell Signaling））を用いて対比染色した。
すべてのＡＤＣはそれらの同種受容体に結合し、それらの天然の対応抗体（セツキシマブ及びトラスツズマブ）と同等の様式で標的細胞によって内在化された（表３を参照のこと）。
実施例１７：ＥＬＩＳＡ及びＢｉａｃｏｒｅ（ビアコア）による受容体へのＡＤＣの結合の決定
ＡＤＣの免疫反応性を、抗原特異的ＥＬＩＳＡによって試験した。簡潔には、Ｉｍｍｕｎｏ ＭＡＸＩＳＯＲＰ ９６ウェルプレート（ヌンク（Nunc））を、５０ｎｇ／ウェルの組換えヒトＥＧＦ−Ｒ／ＥｒｂＢ１ Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ）又は組換えヒトＥｒｂＢ２／ＨＥＲ２タンパク質（シノ・バイオロジカル社（Sino Biological Inc.））とともに４℃で一晩コートした。ＰＢＳ／０．１％ Ｔｗｅｅｎ（ＰＴ）溶液で洗浄した後、プレートを１％ＢＳＡ（ＰＴＢ）含有ＰＴ溶液を用いて室温（ＲＴ）で２時間ブロックし、次いで、段階希釈した抗体とともに室温で１時間インキュベートした。さらに洗浄した後、ブロッキング溶液に１：１，０００で希釈した抗ヒトΚ軽鎖西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗体（シグマ・アルドリッチ（Sigma Aldrich））を室温で１時間添加した。ＰＴ溶液で４回洗浄した後、２００μＬ／ウェルのＴＭＢ基質（シグマ・アルドリッチ）を添加し、プレートを３７℃で３０分インキュベートした。１００μＬ／ウェルの０．５Ｍ Ｈ２ＳＯ４溶液を添加することによってこの反応をブロックし、４５０ｎｍでの光学密度をＥＬＩＳＡ分光光度計によって測定した。
試験したすべてのＡＤＣは、天然の抗体セツキシマブ及びトラスツズマブと同等の効力でそれらの特異的な受容体と反応することを示した（図５Ａ及び５Ｂ）。
ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ１ Ｆｃキメラタンパク質へのセツキシマブ並びにその対応するＡＤＣであるＳＴ８１５５ＡＡ１及びＳＴ８１５４ＡＡ１の結合親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ（ＧＥ）での表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析によって測定した。簡潔には、ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ１ Ｆｃキメラタンパク質を、製造元によって供給されたアミンカップリングキットを使用して、研究用グレードのカルボキシメチル化デキストランセンサーチップ（ＣＭ５、Ｂｉａｃｏｒｅ）にカップリングした。リガンドに有害な再生手順の広範な使用を回避するために、動態分析を、単一サイクル動態アッセイを用いて実施した（抗体は各サイクルの終わりに解離しなかったので、再生が必要であることが判明した）。抗体及びＡＤＣを、ｐＨ７．２のＰＢＳ泳動用緩衝液中に６．２５〜１００ｎＭの濃度範囲で注入した。これらの化合物を、１８０秒の接触時間と６００秒の解離時間との間で、低濃度から高濃度まで注入した。注入を、２５℃で３０μＬ／分の流速で実施した。センサーチップ表面を、ｐＨ２．５の１０ｍＭグリシン／ＨＣｌで１２〜２０秒間再生した。すべての実験を、２連で（in duplicate）実施した。報告したｋｏｎ値及びｋｏｆｆ値は、２つの実験から得られる値の平均である。ＫＤ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎ（表４を参照のこと）。
実施例１８：噴霧プロセス後のＡＤＣの完全性（integrity）の決定
近年、噴霧は呼吸器疾患におけるｍＡｂの有望な送達方法であることが示されており、薬物を直接的に肺へ標的化するのに適した非侵襲性方法を表し、第２の器官への曝露を制限する。
この前提に従って、本発明者らは、噴霧後のＡＤＣの回復（recovery）及び完全性をＨＰＬＣ分析によって評価しようとした。簡潔には、ＡＤＣの３００μｇ／ｍＬ溶液（ＰＢＳ中）とそれらの親抗体（parental antibodies）であるセツキシマブ及びトラスツズマブとを、慣用のジェットネブライザー（ＡｉｒＦａｍｉｌｙ（エアファミリー）システム、ピック・インドロール（Pic indolor））によって５分間噴霧した。次いで、噴霧した薬物を、その霧状物をファルコンチューブに入れることによって収集し、１００μＬの凝縮溶液を、噴霧前（pre-nebulized）サンプルと比較して、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ（ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷＸＬカラム、トーソー・バイオサイエンス（TOSOH Bioscience））によって分析した。
噴霧後の回復率は、噴霧前のサンプルに対して各相対ピークの面積を測定することによって計算され、セツキシマブ系ＡＤＣの場合、ＡＤＣについて５０％〜３０％、トラスツズマブ系ＡＤＣの場合、ＡＤＣについて４０％〜２０％の範囲であった。完全性及び凝集発生率（aggregation incidence）もまた、各クロマトグラムのプロファイルに従って各噴霧ＡＤＣについて評価し、非噴霧サンプルのプロファイルと比較した（表５を参照のこと）。
実施例１９：ＡＤＣが腫瘍細胞増殖を抑制する能力の決定
細胞増殖に対するＡＤＣの効果を、二つの肺腺癌細胞株（ＮＣＩ−Ｈ１９７５及びＣａｌｕ−３）に対して評価した。より詳細には、ＮＣＩ−Ｈ１９７５腫瘍細胞は、二重変異体（Ｌ８５８Ｒ、Ｔ７９０Ｍ）ＥｒｂＢ１遺伝子の過剰発現を特徴とし、一方、Ｃａｌｕ−３は、野生型のＥＧＦＲを発現するが、変異体Ｋ−Ｒａｓ（Ｇ１３Ｄ）遺伝子並びに変異体ＴＰ５３及びＣＤＫＮ２Ａ遺伝子を発現する。
細胞を、完全培地（complete culture medium）中の９６ウェルプレートに（３．０００〜５．０００細胞／ウェルで）播種し、次いで、５００〜６．２５ｎＭの範囲のスカラー濃度のＡＤＣとともに４連で（in quadruplicate）６日間インキュベートした。細胞増殖の抑制を、Ｖｅｒｉｔａｓ（ベリタス）ルミノメーター（プロメガ（Promega））を介して、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（プロメガ）によって測定した。データは、２つの独立した実験の抑制率の平均（±ＳＤ）として表した。ＩＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５．０ソフトウェアを用いて最終的に計算された。その結果、ＡＤＣ ＳＴ８１５４ＡＡ１は、セツキシマブ単独と比較して、両方の細胞株の腫瘍細胞増殖を有意に（ＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞に対してＩＣ５０値２５０ｎＭ、Ｃａｌｕ−３細胞に対してＩＣ５０値４５０ｎＭで）抑制すること、セツキシマブ単独はむしろ効果的でなかった（ＩＣ５０＞５００ｎＭ）ことが示された（図６〜７）。
実施例２０：腫瘍細胞におけるヒストンＨ３及びα−チューブリンのアセチル化に対するＡＤＣの活性の決定
典型的なＨＤＡＣ基質、すなわち、ヒストンＨ３及びα−チューブリンタンパク質のアセチル化に対するＡＤＣの効果を、異なる腫瘍細胞でのＨＣＳ蛍光イメージングによって評価した。肺（Ａ５４９、Ｈ１９７５）、胸部（ＳＫＢＲ３）、結腸（ＬＳ１７４Ｔ）、卵巣（ＳＫＯＶ３）、膵臓（ＣＡＰＡＮ１及びＭＩＡＰＡＣＡ−２）並びに胃（Ｎ８７）癌細胞株を含む、様々なレベルのＥＧＦＲ及びＨＥＲ２受容体を発現するいくつかの腫瘍細胞株を試験した。細胞を、完全培地中の９６ウェルマイクロタイタープレート（０．５〜１×１０４／ウェル）に播種し、その次の日、５μｇ／ｍＬ抗体又はＡＤＣとともに３７℃で３又は２４時間インキュベートした。ＰＢＳで２回洗浄した後、細胞を、ＰＢＳに溶解した４％ホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳ ０．２％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳ−Ｔ）で透過処理し、ＰＢＳ−Ｔに溶解した２％ ＢＳＡでブロックした。次いで、マウス抗アセチル化α−チューブリンＩｇＧ（シグマ・アルドリッチから入手したクローン６−１１Ｂ−１）又はウサギ抗アセチル化ヒストンＨ３ ＩｇＧ（アクティブ・モティフ（Active Motif）から入手した）をＰＢＳ−Ｔに添加し、細胞を室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳで２回洗浄した後、細胞を、使用した一次抗体に従って、最終的にＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウス又は抗ウサギＩｇＧ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）でさらに１時間染色した。蛍光を、ハイコンテントスクリーニング（ＨＣＳ）システムＯｐｅｒｅｔｔａ（パーキンエルマー）によって取得し分析した。細胞を、Ｄｒａｑ５染料（セル・シグナリング）を用いて対比染色した。
試験したすべてのＡＤＣは、ＨＤＡＣ６及びクラスＩ ＨＤＡＣそれぞれの直接酵素阻害の結果として、試験したすべての腫瘍細胞株においてα−チューブリン及びヒストンＨ３の両方のアセチル化レベルの関連する増大を誘導した（図８〜１１）。この結果は、ＳＴ７４６４ＡＡ１部分を放出するためにＡＤＣが内在化及び分解される能力と整合性を有していた。
α−チューブリン及びヒストンＨ４のアセチル化の増大を、異なる腫瘍細胞のタンパク質溶解物に対するウェスタンブロット解析によっても観察した。簡潔には、実験の前日に、腫瘍細胞を、完全培地中の６ウェルデッシュに播種した。次いで、細胞を３７℃で３時間、２０μｇ／ｍＬの試験抗体で処理した。処理後、細胞を氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、次いで、全細胞溶解物を、プロテアーゼ阻害剤を含む１Ｘ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（セル・シグナリング）とともに、氷上で１０分インキュベートすることによって調製した。細胞溶解物を超音波処理に供した後、細胞破片を除去するために４℃で１０分間、１４．０００×ｇで遠心分離した。タンパク質含有量は、製造元の説明書に従って、古典的な比色ブラッドフォード（Bradford）法（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイキット；Ｐｉｅｒｃｅ）によって決定した。アセチル化の程度を評価するために、各サンプルについて等量のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロース膜（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｃ ｅｘｔｒａ、アマシャム−ＧＥヘルスケア（Amersham-GE Healthcare））に移した。分子量は、分子量タンパク質マーカー（Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ Ｋａｌｅｉｄｏｓｃｏｐｅ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ；バイオ・ラッド（Bio-Rad））を用いた相対移動に基づいて推定した。次いで、この膜をＴＢＳ中の５％脱脂粉乳とともに４℃で一晩インキュベートすることによって、非特異的結合部位をブロックした。特異的な一次抗体（サンタクルーズ（Santa Cruz）から入手したウサギ抗アセチルヒストンＨ４抗体；セル・シグナリングから入手したマウス抗ヒストンＨ４モノクローナル抗体；シグマ・アルドリッチから入手したマウス抗アセチル化α−チューブリンモノクローナル抗体、アブカム（abcam）から入手したウサギ抗α−チューブリン抗体）を、５％脱脂粉乳／ＴＢＳＴ中、最適希釈でこの膜に４℃で一晩添加した。ＴＢＳＴ中で４回洗浄した後、膜を、５％脱脂粉乳／ＴＢＳＴ中、ＨＲＰ結合二次抗体とともに１時間インキュベートした。免疫反応性バンドを、ＥＣＬｐｌｕｓウェスタンブロッティング検出試薬（ＧＥヘルスケア）を用いる増強化学発光によって最終的に可視化し、ホスホイメージングシステム（ＳＴＯＲＭ、モレキュラー・ダイナミクス（Molecular Dynamics））によって分析した。代表的なブロットを図１２に示す。
実施例２１：ＮＣＩ−Ｈ１９７５非小細胞肺癌に対して腹腔内（ip）投与されたＳＴ８１５４ＡＡ１及びＳＴ８１５５ＡＡ１のin vivo抗腫瘍効果の決定
ヌードＮｕ／Ｎｕ雌マウス（イタリア国チャールス・リバー（Charles River）から入手）に、１０％ＦＢＳを含む１００μＬ細胞培地ＲＰＭＩに懸濁した５×１０６個のＮＣＩ−Ｈ１９７５非小細胞肺癌細胞の単回皮下注射を与えた。セツキシマブ及びＳＴ８１５４ＡＡ１及びＳＴ８１５５ＡＡ１は、５０ｍｇ／ｋｇの用量で４日ごとに４日間（ｑ４ｄｘ４）腹腔内投与し、一方、ＳＴ７６１２ＡＡ１は、ｑ４ｄｘ４スケジュールに従って１２０ｍｇ／ｋｇで腹腔内投与した。ビヒクル群はＰＢＳによって処置した。腫瘍成長はノギス（caliper）で測定し、腫瘍体積は式：長さ（ｍｍ）×幅２（ｍｍ）／２を用いて計算した。腫瘍の抑制は、式：％ＴＶＩ＝１００−（処置群の平均腫瘍体積／対照群の平均腫瘍体積）×１００に従って計算した。毒性は、体重減少に基づいて評価した。
腫瘍の体積が約１２００ｍｍ３に達したとき、ＣＯ２吸入によって動物を安楽死させた。
動物の収容（housing）及び取り扱いに採用されたすべての手順は、実験動物福祉に関するイタリア国及び欧州のガイドライン（Italian and European guidelines for Laboratory Animal Welfare）に厳密に準拠した。
結果は、ＡＤＣがセツキシマブよりも有意に有効であることを示した（Ｐ＜０．００１及びＰ＜０．０１）。特に、ＳＴ８１５５ＡＡ１は、７７％のセツキシマブと比較して腫瘍体積をより抑制することができ（図１３、表６）、一方、ＳＴ８１５４ＡＡ１は、セツキシマブに対して９５％の腫瘍成長を抑制することができた（図１３、表７）。ＨＤＡＣ阻害剤の最適スケジュールは毎日（ｑｄｘ５／ｗ）であるため、１２０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内（ｉｐ）、ｑ４ｄｘ４で単独投与した場合のＳＴ７６１２ＡＡ１（負荷毒素（loaded toxin）ＳＴ７４６４のプロドラッグ）は、完全に不活性であった（図１３）。
興味深いことに、ｍＡｂセツキシマブ上のｍＡｂに対する薬物ＳＴ８１５４ＡＡ１及びＳＴ８１５５ＡＡ１の負荷用量（loaded dose）は、約０．１ｍｇ／ｋｇであった。
実施例２２：Ａ５４９非小細胞肺癌に対して腹腔内（ip）投与されたＳＴ８１５４ＡＡ１のin vivo抗腫瘍効果の決定
ヌードマウスに、１０％ＦＢＳを含む１００μＬ細胞培地ＲＰＭＩに懸濁した５×１０６個のＡ５４９非小細胞肺癌細胞の皮下注射を与えた。セツキシマブ及びＳＴ８１５４ＡＡ１は、５０ｍｇ／ｋｇの用量で４日ごとに４日間（ｑ４ｄｘ４）腹腔内投与した。腫瘍測定及びデータは、実施例２１に示すとおりである。
処置は、ＳＴ８１５４ＡＡ１がセツキシマブよりも有意により有効であることを示した（Ｐ＜０．０５）（図１４、表７）。
実施例２３：転移性Ａ５４９非小細胞肺癌に対してエアロゾルによって送達されたＳＴ８１５４ＡＡ１のin vivo抗腫瘍効果の決定
５×１０６個のＡ５４９−ｌｕｃ−Ｃ８（Ａ５４９ｌｕｃ）細胞を免疫不全ＳＣＩＤ／ベージュマウスの尾静脈へ注射することによって、転移性肺癌を確立した。一週間後、マウスを無作為化し、ＡＤＣ又はセツキシマブ（３．５ｍＬの１００μｇ／ｍＬ溶液）を用いて全身エアロゾルによって（ＡｉｒＦａｍｉｌｙシステム、ピック・インドロールによって）処置した。処置を、ｑ７ｄｘ４スケジュールに従って繰り返した。ルシフェリン（１５０μｇ／マウス）の腹腔内（i.）注射の１５分後、腫瘍の生物発光イメージング（ＢＬＩ）を、Ｘｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ ２００（パーキンエルマー）によって、異なる時点で記録した。生物発光の評価は、ＡＤＣが、セツキシマブと比較して、そして腫瘍採取の異なる時点で、より高い効力で腫瘍転移を有意に抑制できることを示した（Ｐ＜０．０１及びＰ＜０．０５）（図１５、表７）。
実施例２４：ＣＡＰＡＮ−１膵臓癌に対して腹腔内（ip）送達されたＳＴ８１５４ＡＡ１のin vivo抗腫瘍効果の決定
ＳＴ８１５４ＡＡ１（４０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内（ip）、ｑ４ｄｘ４）、ＳＴ７６１２ＡＡ１（２００ｍｇ／ｋｇ、腹腔内（ip）、ｑ４ｄｘ４）及びセツキシマブ（４０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内（ip）、ｑ４ｄｘ４）の比較を、ＣＡＰＡＮ−１同所性膵臓腫瘍マウスモデルにおいて評価した。Ｃａｐａｎ−１（１×１０６）細胞を、実験群の膵臓に直接注射した。腫瘍接種の６日後に、ＳＴ８１５４ＡＡ１、ＳＴ７６１２ＡＡ１及びセツキシマブでの処置を開始し、腫瘍注射の９０日後にマウスを犠死させ、膵臓腫瘍の重量を分析した。ＳＴ８１５４ＡＡ１は、完全奏功（complete responses）を有するマウス１０匹中６匹で８４％の腫瘍成長を抑制することを示し、一方、セツキシマブは、完全奏功を有するマウス１０匹中２匹で４９％の腫瘍成長抑制を示した。ｑ４ｄｘ４はＨＤＡＣ阻害剤に最適なスケジュールではないので、ＳＴ７６１２ＡＡ１単独は、腫瘍成長に対して、より低い活性を示した（３２％）。腫瘍重量は、腫瘍注射の９０日後に評価し、平均及びＳＥＭ、Ｐ＜０．０５対Ｃｔｘとして表した（図１６、表７）。
実施例２５：ＰＤＸ（患者由来異種移植片）膵臓癌に対して腹腔内（ip）送達されたＳＴ８１５４ＡＡ１のin vivo抗腫瘍効果の決定
ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウス（ジャクソン研究所（Jackson Laboratories）から入手）に、患者ＰＡ５３６３ Ｐ２の細胞を５１０００細胞／１００μＬで等容量のＣｕｌｔｒｅｘ（カルトレックス）１０×スフェロイド形成（spheroid phomation）ＥＣＭに再懸濁して単回皮下注射した。
セツキシマブ及びＳＴ８１５４ＡＡ１は、４０ｍｇ／１０ｍＬ／ｋｇの用量で４日ごとに５日間（ｑ４ｄｘ５）腹腔内投与した。腫瘍成長測定及びデータは、実施例２０に示すとおりである。
処置は、ＳＴ８１５４ＡＡ１がセツキシマブよりも有意により有効であることを示した（Ｐ＜０．０５）（図１７、表７）。
実施例２６．ＳＫＯＶ−３卵巣癌に対して腹腔内（ip）投与されたＳＴ８１７８ＡＡ１及びＳＴ８１７６ＡＡ１のin vivo抗腫瘍効果の決定
ヌードＮｕ／Ｎｕ雌マウス（イタリア国チャールス・リバーから入手）に、１０％ＦＢＳを含む１００μＬ細胞培地ＲＰＭＩに懸濁した５×１０６個のＳＫＯＶ−３卵巣癌細胞の単回皮下注射を与えた。
各実験群のマウスを、１５ｍｇ／１０ｍＬ／ｋｇの用量で４日ごとに４回処置（ｑ４ｄｘ４）で腹腔内（ip）処置した。結果は、ＳＴ８１７８ＡＡ１及びＳＴ８１７６ＡＡ１がトラスツズマブよりも有意により有効であることを示した（Ｐ＜０．０５）（図１８〜１９、表８及び９）。腫瘍測定及びデータは、実施例２０に示すとおりである。これらのデータは、ＡＤＣが、腫瘍成長に対して、トラスツズマブと比較して２倍の効果を有することを示唆する。
実施例２７．同所移植したＳＫＯＶ−３卵巣癌に対して腹腔内（ip）投与したＳＴ８１７６ＡＡ１のin vivo抗腫瘍効果の決定
ヌードＮｕ／Ｎｕ雌マウス（イタリア国チャールス・リバーから入手）に、１０％ＦＢＳを含む２００μＬ細胞培地ＲＰＭＩに懸濁した１０×１０６個のＳＫＯＶ−３卵巣癌細胞の単回腹腔内注射を与えた。腫瘍注射の３日後から、マウスに、ＳＴ８１７６ＡＡ１、トラスツズマブ（４日に１回、１５ｍｇ／ｋｇの４回用量）又はビヒクル（ＰＢＳ）のいずれかを腹腔内（i.）注射した。トラスツズマブ又はＳＴ８１７６ＡＡ１のいずれも有効であったが、ＡＤＣは、マウス９匹のうち４匹が腫瘍移植から９０日後に治癒したことも示した（図２０、表９）。
実施例２８：腹腔内ＬＳ１７４−Ｔ結腸癌に対して腹腔内（ip）投与されたＳＴ８１７６ＡＡ１のin vivo抗腫瘍有効性の決定
ＡＤＣを、結腸癌、攻撃的な腫瘍異種移植片モデルなどの腹腔内腫瘍に対しても評価した。
この調査の目的は、癌性腹膜炎（peritoneal carcinomatosis）のような疾患を治療するためにＡＤＣが局所投与によっても使用され得ることを実証することであった。このような活性を実証するために、ＬＳ−１７４Ｔ結腸癌細胞を腹腔内（ip）注射した。細胞を採取し、ＰＢＳで２回洗浄した。１０００万個の細胞を、２０％のＭａｔｒｉｇｅｌＴＭ（マトリゲル（商標））を含有する０．２ｍＬのＥＭＥＭ培地に懸濁し、各マウスの腹膜に注射した。ＡＤＣによるすべての処置は、ｑ４ｄｘ４スケジュールに従って、腫瘍注射の３日後に２００μＬの容量で腹腔内（i.）注射によって実施した。
マウスの死亡率を毎日モニターしつつ、体重を週に２回記録した。不快感、窮迫又は瀕死状態の徴候を示す動物は、スタッフの獣医師又は許可された職員（authorized personnel）によって検査され、必要に応じて、過度の疼痛又は苦痛を最小限に抑えるために人道的に犠死させた。
死亡率データを、最も適切な統計分析に従って処理して、治療間の寿命の延長を測定し、カプランマイヤープロットを作成した。すべての統計分析は、ソフトウェアＧｒａｐｈＰａｄ−Ｐｒｉｓｍ６（グラフパッドプリズム６）を用いて実施した。
結果は、ビヒクル処置群及びトラスツズマブ処置群の両方において生存期間中央値（ＭＳＴ）が３７日であることを示した。対照的に、ＡＤＣ ＳＴ８１７６ＡＡ１は、生存期間中央値を５０日に有意に延長することを明らかにした（Ｐ＜０．０５）（図２１、表９）。
現在、姑息手術を伴うか又は伴わない全身化学療法からなる腹膜癌の伝統的な治療は、成果に関しては効果が低く、腹腔内への乏しい薬物分布及び腹膜結節（petitoneal nodules）への浸透に関しては薬理学的限界を示す（Oyais A 2014 Zentralbl Chir. 2014 141:421-4）。
対照的に、局所送達のＰＩＰＡＣ（加圧腹腔内エアロゾル化学療法）と称される最近の革新的な方法は、腹腔内化学療法の有効性を高めることが示されており（Solass W 2014 Ann Surg Oncol 21:553-9）、この処置は、治療後の腎臓又は肝臓への毒性がなく、安全であるという結果となった（Blanco 2014 20:2311-6；Solass 2013 Ann Surg Oncol 20: 3504-11）。
新規のＡＤＣは、局所腫瘍に対してエアロゾルによって及び腹腔内で抗腫瘍活性を示すので、これらのデータは、標準的な非経口投与に加えて本明細書に記載のＡＤＣのＰＩＰＡＣ使用を促進する。
ＰＩＰＡＣ（加圧腹腔内エアロゾル化学療法）は、腹腔内化学療法の有効性を高める局所送達の革新的な方法である（Solass W 2014 Ann Surg Oncol 21:553-9）。
この処置は、治療後の腎臓又は肝臓への毒性がなく、安全であるという結果となった（Blanco 2014 20:2311-6；Solassら、2013 Ann Surg Oncol 20: 3504-11）。
それとは異なり、腹膜癌の伝統的な治療は、姑息手術を伴うか又は伴わない全身化学療法からなり、成果に関しては効果が低い。別の問題は、腹腔内への乏しい薬物分布及び腹膜結節への浸透に関する薬理学的限界である（Oyais Aら、 2014 Zentralbl Chir. 2014 141: 421-4）。噴霧に関して本明細書に記載されているＡＤＣの安定性を確認する生化学分析及び腹腔内送達に関する有効性データに基づいて、ＡＤＣのＰＩＰＡＣ使用もまた正当化される。
実施例２９：ＬＳ−１７４Ｔ結腸癌に対して腹腔内（ip）投与されたＳＴ８１７６ＡＡ１のin vivo抗腫瘍効果の決定
５×１０６個のＬＳ１７４Ｔ結腸癌細胞の皮下（s.c.）注射後６日間、Ｎｕ／Ｎｕマウスに腫瘍を発生させた。病変発生及び抗体治療に対する応答を、デジタルノギスを用いてモニターした。マウスに、ＳＴ８１７６ＡＡ１、トラスツズマブ（４日に１回、１５ｍｇ／ｋｇの４回用量）又はビヒクル（ＰＢＳ）のいずれかを腹腔内（i.）注射した。ＡＤＣ ＳＴ８１７６ＡＡ１は、結腸癌の腫瘍成長を有意に抑制することが明らかとされた（Ｐ＜０．０５対トラスツズマブ）（図２２、表９）。
実施例３０：ＰＤＸ膵臓癌に対して腹腔内（ip）送達されたＳＴ８１７６ＡＡ１のin vivo抗腫瘍活性の決定
ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウス（ジャクソン研究所から入手）に、患者ＰＡ５３６３ Ｐ２の細胞を７７０００細胞／１００μＬで等容量のＣｕｌｔｒｅｘ（カルトレックス）１０ｘスフェロイド形成ＥＣＭに再懸濁して単回皮下注射した。
トラスツズマブ及びＳＴ８１７６ＡＡ１を、各群につき１０匹のマウスの実験群において１５ｍｇ／ｋｇの用量で４日ごとに５日間（ｑ４ｄｘ５）腹腔内投与した。腫瘍測定及びデータは、実施例２０に示すとおりである。
処置は、ＳＴ８１７６ＡＡ１がトラスツズマブ（Ｐ＜０．０５）及び対ビヒクル処置群（Ｐ＜０．０５）よりも有意により有効であることを示した（図２３、表９）。
実施例３１：Ａ５４９肺癌に対して、セツキシマブと、ｍＡｂへの負荷用量に対応する低用量のＳＴ７６１２ＡＡ１との組み合わせのin vivo抗腫瘍効果の決定
等モルの組み合わせ又はセツキシマブ及びＳＴ７６１２ＡＡ１と比較したＡＤＣ ＳＴ８１５４ＡＡ１の抗腫瘍効果もまた、Ａ５４９非小細胞肺癌のモデルに対して評価した。最適用量のＳＴ７６１２ＡＡ１又はセツキシマブも調査した。
ヒトＡ５４９肺癌細胞を、それらの適切な完全培地中で培養した。腫瘍注射の日に、細胞を、サブコンフルエントな（subconfluent）培養物からトリプシン処理によって採取し、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳに懸濁し、免疫不全マウスの右脇腹に皮下注射した（５×１０６個／１００μＬ）。腫瘍サイズが約８０ｍｍ３になったときに処置を開始し、マウスを実験群（マウス１０匹／群）に無作為化した。
研究中及び死後の腫瘍重量の間の較正によって評価されるように、ＳＴ８１５４ＡＡ１のｑ４ｄｘ４での腹腔内（ip）投与は腫瘍成長抑制を誘導し、一方、ＡＤＣ成分、セツキシマブ（４０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内（ip）、ｑ４ｄｘ４）及びＨＤＡＣｉ（０．１ｍｇ／ｋｇ、腹腔内（ip）、ｑ４ｄｘ４）の等モル混合物は、有効ではなかった（表１０）。
この実験において、セツキシマブ単独（４０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内（ip）、ｑ４ｄｘ４）は、抗腫瘍活性を示さなかった。
最適用量のセツキシマブ（４０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内（ip）、ｑ４ｄｘ４）とＳＴ７６１２ＡＡ１（４０ｍｇ／ｋｇ、経口（po）、ｑｄｘ５／ｗｘ３ｗ）との併用（association）は、ＳＴ７６１２ＡＡ１単独（４０ｍｇ／ｋｇ、経口（po） ｑｄｘ５／ｗｘ３ｗ）と同等の抗腫瘍効果を示した。
ＳＴ７６１２ＡＡ１は、４０ｍｇ／ｋｇ、経口（po） ｑｄｘ５／ｗｘ３ｗで、ＡＤＣ ＳＴ８１５４ＡＡ１と同様の抗腫瘍活性を示したが、ＳＴ７６１２ＡＡ１は、０．１ｍｇ／ｋｇ、腹腔内（ip） ｑ４ｄｘ４では、有効ではなかった（表１０）。

Claims (16)

  1. 式（Ｉ）
    Ｄ−（ＣＵ）ｍ−（Ｓ１）ｎ−Ｌ−（Ｓ２）ｏ−（ＣＧ）ｐ−Ａｂ
    （式Ｉ）
    の抗体薬物コンジュゲート又はその薬学的に許容可能な塩であって、式中、
    Ｄは、チオール系ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、ヒドロキサム酸系ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤又はベンズアミド系ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤から選択されるヒストン脱アセチル化酵素阻害剤薬物であり、
    ＣＵは、連結ユニットであって、存在しなくてもよいか、又は
    から選択され、
    Ｓ１は、スペーサーであって、存在しなくてもよいか、又は
    であり、
    Ｌは、リンカーであって、（ＣＨ２）ｑ−ＣＯ、ＮＨ−（ＣＨ２）ｒ−（ＰＥＧ）ｓ−（ＣＨ２）ｗ−ＣＯ、ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｒ−（ＰＥＧ）ｓ−Ｘ−（ＣＨ２）ｗ−ＣＯから選択され、式中、Ｘは、存在しなくてもよいか、ＮＨ又はＯであってもよく、ｑは、２〜８の整数であり、ｒは、存在しなくてもよいか、又は１〜４の整数であってもよく、ｓは、存在しなくてもよいか、又は１〜６の整数であってもよく、ｗは、存在しなくてもよいか、又は１〜２の整数であってもよく、
    Ｓ２は、スペーサーであって、存在しなくてもよいか、又は
    であり、
    ＣＧは、抗体のシステインチオール基又はリシンアミノ基への結合（conjugation）後に形成された連結基であって、存在しなくてもよいか、又は以下の部分：
    の一つであってもよく、式中、ｙは、０〜８の整数であり、
    Ａｂは、抗体又はその抗原結合性フラグメントであり、
    ｍ、ｎ、ｏ及びｐは、０又は１の整数を示す、
    抗体薬物コンジュゲート又はその薬学的に許容可能な塩。
  2. リンカーＬが、
    から選択される部分であり、式中、ｎが２〜５の整数である請求項１記載の抗体薬物コンジュゲート。
  3. ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤薬物及び式ＩのＤ−（ＣＵ）ｍ−（Ｓ１）ｎ−Ｌ−（Ｓ２）Ｏ−（ＣＧ）’ｐ−の構造を含むペイロードが、以下から選択される化合物：
    である請求項１記載の抗体薬物コンジュゲート。
  4. ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤薬物が、下記式
    を有するチオール系阻害剤ＳＴ７４６４ＡＡ１であり、
    ペイロードが、下記表から明らかな化合物：
    である請求項３記載の抗体薬物コンジュゲート。
  5. 連結ユニット（ＣＵ）が、以下：
    から選択される請求項１記載の抗体薬物コンジュゲート。
  6. 抗体が、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤に対してか、又は腫瘍細胞によって内在化された受容体に対して指向されて、ｃ−ｍｅｔ又はインテグリン受容体などのヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を放出する請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  7. 抗体が、抗ＥＧＦＲファミリータンパク質抗体である請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  8. 抗体が、トラスツズマブ（Trastuzumab）、セツキシマブ（Cetuximab）、ベバシズマブ（Bevacizumab）、パニツムマブ（Panitumumab）又は関連するバイオシミラー（biosimilar）から選択される請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  9. 以下から選択される式を有する請求項８記載の抗体薬物コンジュゲート。
  10. 薬剤としての使用のための請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲート。
  11. 有効な量の請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲートと、薬学的に許容可能な賦形剤とを含む医薬組成物。
  12. ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２又はＥｒｂＢ３から選択される受容体を発現する癌又は腫瘍の治療における使用のための、請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲート又は医薬組成物。
  13. 癌が、肺癌、腹膜癌、乳癌、結腸癌、脳癌、頭頸部癌、子宮内膜癌、子宮頸部−子宮内膜癌、腎臓癌、膵臓癌、胃癌、結腸癌、虫垂癌、食道癌、卵巣癌及び前立腺癌；又は白血病、腹膜偽粘液腫、肝転移及び非消化管組織の腹部肉腫から選択される請求項１２の使用のための、請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲート又は医薬組成物。
  14. ＨＩＶの治療におけるアジュバント治療薬としての使用のための、請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲート又は医薬組成物。
  15. 噴霧による局所送達に適した処方物中の、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲート又は医薬組成物。
  16. 肺癌、乳癌、結腸癌、脳癌、頭頸部癌、子宮内膜癌、腎臓癌、膵臓癌、胃癌、食道癌、卵巣癌及び前立腺癌並びに白血病の治療における使用のための、請求項１５記載の抗体薬物コンジュゲート又は医薬組成物。
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