CN112430229B

CN112430229B - 一种靶向降解parp蛋白的化合物及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN112430229B
Application number: CN202011328014.8A
Authority: CN
Inventors: 吴丽贤; 林珊珊; 刘洋; 余泽磊; 涂贵辉; 刘静文; 刘全裕; 黄秀旺; 林友文
Original assignee: Fujian Medical University
Current assignee: Fujian Medical University
Priority date: 2020-11-24
Filing date: 2020-11-24
Publication date: 2023-03-21
Anticipated expiration: 2040-11-24
Also published as: CN112430229A

Abstract

一种如X‑Y‑Z或X‑Z所示的靶向降解PARP蛋白的化合物，X表示PARP蛋白的配体，Z表示E3连接酶的配体，Y表示连接X和Z的链，该化合物可用于治疗或预防肿瘤。

Description

一种靶向降解PARP蛋白的化合物及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及抗肿瘤药物制备领域，具体涉及一种靶向降解PARP蛋白的化合物及其制备方法与应用。

背景技术

聚二磷酸腺苷核糖聚合酶[poly(ADP-ribose)polymerase,PARP]是一种与 DNA修复，尤其是DNA单链损伤BER修复密切相关的核酶，包括18种亚型，其中PARP-1在真核细胞内含量最高。当肿瘤细胞DNA受到化疗药物或电离辐射等损伤时，PARP-1很快被激活，并以NAD+为底物，将聚腺苷二磷酸核糖基 (ADP)转移到特定蛋白，PARP-1催化特定蛋白聚腺苷二磷酸核糖化(PAR化)，启动DNA修复过程。研究表明，PARP-1参与了BER、HR和NHEJ等DNA修复途径。

虽然PARP抑制剂在临床已取得惊人的成果，但PARP抑制剂仍是通过药物占用驱动的MOA控制蛋白功能，是通过保持高靶标占用率来实现的。 PARP抑制剂能够结合到PARP1(和/或PARP2)的NAD+结合口袋，造成构象异构，稳定了DNA-PARP的可逆解离，使PARP保持对DNA的结合，这个过程被称为DNA-PARP复合物的“捕获(trapping)”，这导致DNA-PARP复合物长期存在，无法进行后续的修复。尽管PARP捕获能力越强，PARP抑制剂的临床效果会越好，但对正常组织的毒性也越大。目前已经开发出许多针对PARP蛋白的小分子抑制剂，例如，talazoparib捕获PARP的能力比niraparib、rucaparib和 olaparib高2-3个数量级，但它的毒性也很大，二期临床数据证明它的推荐剂量要比后者低300至1200倍。因此，我们需要研发新作用机制的药物，以克服传统PARP抑制剂的缺点。

发明内容

基于以上问题的发现，发明人提出了一类新化合物，该化合物采用的是双功能分子结构，通过PROTAC(proteolysis-targeting chimeras)技术，即利用细胞内负责清除残次蛋白的泛素化降解系统，达到靶向降解目标蛋白的新技术。该类分子的一端的结构靶向结合E3连接酶CRBN，另外一端的结构靶向结合PARP蛋白，两端的结构通过链(linker)相连接，形成一个完整的化合物分子，该化合物通过E3连接酶CRBN泛素化目标蛋白并引导目标蛋白进入蛋白酶体降解系统，对目标蛋白的特异性降解作用。该化合物可在多种乳腺癌细胞中特异性降解PARP 蛋白，并且相比于PARP抑制剂尼拉帕尼，其对正常的乳腺细胞无细胞毒性和 DNA-trapping引起的基因毒性；同时，传统PARP小分子抑制剂并不能影响PARP 蛋白的含量，一旦停药，PARP蛋白可以很快恢复活性；而基于PROTAC技术的 PARP蛋白降解剂，即使停药之后，肿瘤细胞也需要一定时间来恢复核内PARP 蛋白的含量。因此在抗肿瘤领域有潜在的应用价值。已报道了几种PARP1/2降解剂，包括化合物1Zhao,Q.；Lan,T.；Su,S.；Rao,Y.Induction of apoptosis in MDA-MB-231breast cancer cells by a PARP1-targeting PROTAC small molecule. Chem.Comm.2019,55,369-372.化合物2(iRucaparib-AP5)，3(iRucaparib-AP6)，和4(iVeliparibAP6)Wang,S.；Han,L.；Han,J.；Li,P.；Ding,Q.；Zhang,Q.-J.；Liu, Z.-P.；Chen,C.；Yu,Y.Uncouplingof PARP1 trappingand inhibition using selective PARP1 degradation.Nat.Chem.Biol.2019,15,1223-1231.化合物5.Cao,C.-G.；Yang, J.；Chen,Y.-w.；Discovery of SK-575 as a HighlyPotent and Efficacious Proteolysis Targeting Chimera(PROTAC)Degrader of PARP1for Treating Cancers.J.Med.Chem 2020.DOI:10.1021/acs.jmedchem.0c00821。

基于niraparib衍生物和nutlin-3衍生物的化合物1在MDA-MB-231细胞中特异性诱导PARP1裂解和细胞凋亡。相比之下，据报道，通过使用不同长度的所有聚乙二醇(PEG)接头制备的化合物2和3是有效且有效的PARP1降解剂，其化合物对大鼠新生心肌细胞最大降解浓度(DC50)分别为36nM和82nM。但是，这些化合物不能完全降解细胞内PARP1蛋白，从而限制了它们的治疗效果。

为此，本发明一方面，提出了一种靶向PARP蛋白的化合物，其为式Ⅰ-1 或Ⅰ-2所示：

X-Y-Z(Ⅰ-1)或X-Z(Ⅰ-2)

其中，X表示PARP蛋白的配体，Z表示E3连接酶的配体，Y表示连接X和Z 的链；

所述X为式Ⅱ-1,所述Z为式Ⅱ-2所示的化合物，

所述Y为式Ⅲ-1或式Ⅲ-2所示的化合物，

n分别独立地为1-10之间的整数

m分别独立地为1-10之间的整数

所述靶向PARP蛋白的化合物可以是以下任意一种：

另一方面，本发明提供了上述靶向PARP蛋白的化合物的制备工艺，路线如下：

再一方面，本发明提供上述靶向PARP蛋白的化合物用于制备治疗或预防肿瘤的药物的用途。所述肿瘤包括乳腺癌或者卵巢癌。

附图说明

图1为根据本发明实施例3所示化合物对不同的肿瘤细胞系的PARP蛋白降解示意图。说明化合物CN2可显著降解乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7胞内PARP蛋白水平，10uMCN2就有降解作用。

图2为根据本发明实施例3所示化合物对不同的肿瘤细胞系迁移能力影响示意图，(a)对卵巢癌细胞SKOV3迁移能力的影响、(b)对卵巢癌细胞8910迁移能力的影响。

图3为根据本发明实施例1所示化合物对三阴性乳腺癌细胞系 MDA-MB-231的PARP蛋白降解示意图。说明化合物CN0可在12h浓度为0.5uM 时显著降解乳腺癌细胞MDA-MB-231胞内PARP蛋白水平。

具体实施方式

下面将进一步详细描述本发明的实施例，所述实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1式1-1所示的化合物的制备

将2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-4-氟异二氢吲哚-1,3-二酮(0.13mmol，35mg)，(S)-2-(4-(哌啶-3-基)苯基)-2H-吲唑-7-羧酰胺(0.15mmol，48.88mg)，DIEA (0.54mmol，70mg)的混合物置于圆底烧瓶的无水DMF(0.3mL)搅拌均匀。在90℃下保持3小时后用水淬灭反应。将混合物用饱和NaCl水溶液洗涤一次，用EtOAc萃取。该将有机层用无水Na₂SO₄干燥，并真空蒸发，得到粗产物，通过硅胶柱色谱法进一步纯化(DCM：MeOH＝40：1)得到产物。

¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ9.11–9.01(m,1H),8.58–8.43(m,1H), 8.39–8.24(m,2H),7.95–7.77(m,4H),7.62–7.57(m,1H),7.53(d,J＝8.4Hz, 2H),7.40(t,J＝6.9Hz,1H),7.28–7.19(m,2H),5.09–4.80(m,1H),3.92(d,J＝ 11.6Hz,1H),3.82–3.73(m,1H),3.62(d,J＝7.9Hz,2H),3.04–2.71(m,4H),2.59 (d,J＝7.9Hz,1H),2.42(t,J＝7.4Hz,1H),2.18(d,J＝10.9Hz,1H),2.03(d,J＝7.4 Hz,2H).[M+H]577.5。

实施例2式1-2所示的化合物的制备

将2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-4-氟异二氢吲哚-1,3-二酮(1.3mmol，350mg)，NH₂-PEG₁-COOtBu(1.5mmol，480.88mg)，DIEA(5.4mmol，700mg)的混合物置于圆底烧瓶的无水DMF(3mL)搅拌均匀。在90℃下保持3小时后用水淬灭反应。将混合物用饱和NaCl水溶液洗涤一次，用EtOAc萃取。该将有机层用无水Na₂SO₄干燥，并真空蒸发，得到粗产物，通过硅胶柱色谱法进一步纯化(DCM：MeOH＝40：1)得到一种Pomalidomide酯衍生物。

在0℃下，向溶于DCM(1mL)的Pomalidomide酯衍生物(140mg，0.020mmol) 溶液中加入TFA(2mL)。在室温下搅拌17小时后，将所得混合物用甲苯(10mL) 稀释并蒸发。通过快速柱色谱法(最初1：:33甲醇-二氯甲烷，分级至1：9 甲醇-二氯甲烷)纯化残余物，得到123mgPomalidomide酸中间体。

Pomalidomide酸中间体(123.31mg，0.25mmol)，HATU(70mg)和DIEA (90μL)的混合物将干燥的DMF(3.78mL)在圆底烧瓶中在室温下搅拌0.5小时。然后，加入尼拉帕尼(79mg)的0.5mL无水DMF溶液慢。将反应混合物在室温下搅拌12小时。通过淬灭反应将水和混合物用饱和NaCl水溶液洗涤一次，用乙醚萃取乙酸乙酯。将有机层用无水Na₂SO₄干燥，并蒸发真空得到粗产物，将其通过硅胶柱进一步纯化色谱法(DCM：MeOH＝40：1)，得到产物。

¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ9.06(d,J＝14.3Hz,1H),8.54(s,1H), 8.33(d,J＝7.0Hz,1H),7.89(dd,J＝31.5,8.4Hz,3H),7.61–7.32(m,3H),7.19– 6.99(m,1H),6.91(dd,J＝19.2,9.5Hz,1H),6.49(d,J＝8.5Hz,1H),6.17(d,J＝ 24.3Hz,1H),5.02–4.86(m,1H),4.77(dd,J＝22.3,13.0Hz,1H),4.03(dd,J＝21.8, 14.2Hz,1H),3.94–3.68(m,3H),3.54–3.42(m,2H),3.25–2.96(m,1H),2.95– 2.57(m,6H),2.15–2.08(m,1H),1.89(d,J＝17.0Hz,1H),1.84–1.55(m,7H). [M-H]690.4。

实施例3式1-3所示的化合物的制备(方法参照实施例2)

¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ9.06(d,J＝5.9Hz,1H),8.84(s,1H),8.53 (s,1H),8.32(d,J＝5.8Hz,1H),7.88(dd,J＝31.9,8.5Hz,3H),7.60–7.33(m,3H), 7.26(d,J＝7.7Hz,1H),7.07(dd,J＝26.7,7.1Hz,1H),6.89(dd,J＝27.5,8.6Hz, 1H),6.60–6.41(m,1H),6.26(s,1H),4.93(dd,J＝12.6,5.5Hz,1H),4.76(t,J＝ 12.5Hz,1H),4.00(dd,J＝30.1,13.5Hz,1H),3.86(t,J＝6.8Hz,2H),3.78–3.64 (m,6H),3.57–3.36(m,3H),3.08(t,J＝12.6Hz,1H),2.95–2.52(m,7H),2.30– 2.04(m,2H),1.76(dd,J＝12.1,3.5Hz,2H).[M+Na]758.4。

实施例4式1-4所示的化合物的制备(方法参照实施例2)

¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ9.20(d,J＝64.9Hz,2H),8.59(s,1H), 8.36(s,1H),8.04–7.83(m,3H),7.61–7.40(m,3H),7.15(s,1H),6.95(d,J＝20.0 Hz,1H),6.55(d,J＝19.1Hz,1H),6.39(s,1H),6.24(s,1H),5.36(s,1H),4.99(d,J ＝16.0Hz,1H),4.81(t,J＝14.2Hz,1H),4.10–3.89(m,2H),3.74(d,J＝8.4Hz, 10H),3.52(d,J＝19.2Hz,2H),3.16(d,J＝19.0Hz,1H),3.01–2.55(m,7H),1.95– 1.68(m,5H).[M+H]780.5。

实施例5式1-5所示的化合物的制备(方法参照实施例2)

¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ9.17(s,1H),9.08(s,1H),8.97(s,1H), 8.54(d,J＝9.5Hz,1H),8.31(d,J＝8.3Hz,1H),7.98–7.76(m,3H),7.45(dd,J＝21.0,7.8Hz,3H),7.25(s,1H),7.09(d,J＝14.2Hz,1H),6.90(dd,J＝11.1,8.6Hz, 1H),6.48(d,J＝19.7Hz,1H),6.32(s,1H),4.93(ddd,J＝12.5,5.4,2.1Hz,1H), 4.84–4.67(m,1H),4.07–3.90(m,1H),3.84(t,J＝6.8Hz,2H),3.76–3.56(m, 13H),3.48(d,J＝12.5Hz,4H),3.19–2.97(m,2H),2.94–2.52(m,7H),2.12(d,J＝ 10.4Hz,2H),1.70(dd,J＝47.5,13.8Hz,2H).[M+H]824.5。

实施例6式1-6所示的化合物的制备(方法参照实施例2)

¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ9.08(s,1H),8.62–8.49(m,1H),8.31(d, J＝5.5Hz,1H),7.99–7.78(m,3H),7.59–7.38(m,3H),7.30(s,1H),7.27(s,1H), 7.16–6.98(m,1H),6.96–6.84(m,1H),6.54(dd,J＝22.5,11.6Hz,1H),6.36– 6.02(m,1H),5.01–4.85(m,1H),4.88–4.66(m,1H),4.16–3.89(m,1H),3.83(t,J ＝11.6Hz,2H),3.78–3.55(m,16H),3.49(d,J＝15.2Hz,3H),3.10(t,J＝12.5Hz, 1H),2.97–2.53(m,6H),2.49–2.32(m,1H),2.22–2.05(m,3H),1.72(dd,J＝49.7, 12.3Hz,3H).[M+H]868.6。

实施例7式1-7所示的化合物的制备(方法参照实施例2)

¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ9.07(s,1H),8.56(dd,J＝10.7,3.5Hz, 1H),8.37–8.23(m,1H),8.00–7.78(m,3H),7.56–7.36(m,3H),7.30(s,1H),7.26 (s,1H),7.14–7.03(m,1H),6.91(q,J＝10.9,8.3Hz,1H),6.54(dd,J＝18.2,8.5Hz, 1H),6.23(d,J＝49.3Hz,1H),4.98–4.68(m,2H),4.02(dd,J＝22.3,12.9Hz,1H), 3.82(d,J＝13.5Hz,2H),3.74–3.60(m,23H),3.51–3.42(m,3H),3.10(t,J＝12.5 Hz,1H),2.87–2.55(m,5H),2.38(q,J＝7.1Hz,1H),2.13(d,J＝12.6Hz,2H),1.84 –1.59(m,2H).[M+H]912.6。

实施例8式1-8所示的化合物的制备(方法参照实施例2)

¹H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ9.10(s,1H),8.57(s,1H),8.35(d,J＝5.3 Hz,1H),8.04–7.79(m,3H),7.62–7.38(m,3H),7.12(t,J＝6.9Hz,1H),6.92(t,J ＝7.9Hz,1H),6.27(s,2H),5.35(s,1H),4.97(d,J＝16.0Hz,1H),4.88–4.72(m, 1H),3.98(d,J＝13.1Hz,1H),3.36–3.24(m,2H),3.16(q,J＝12.9Hz,1H),2.97– 2.65(m,4H),2.42(dt,J＝13.3,7.5Hz,2H),2.24–2.12(m,2H),1.87(dd,J＝42.3, 12.0Hz,3H),1.76–1.65(m,4H),1.57–1.11(m,8H).[M+Na]740.5。

实施例3和5本发明化合物对肿瘤细胞转移的影响。

1、实验组的设置：

组1、阳性对照组：尼拉帕尼和泊马度胺；

组2、实施例3和4所得化合物。

2、样品处理：

称取适量的受试化合物粉末，溶解于DMSO中，使得终浓度为10mmol/L， 10μl/管，-20℃避光保存，临用解冻，按所需浓度稀释。

RPMI 1640培养液：每袋RPMI 1640粉剂先溶于约800ml双蒸水，加入 1.5gNaHCO3，2.5g葡萄糖，0.11g丙酮酸钠，充分溶解，用双蒸水补充至1000ml。 0.22μm微孔滤膜过滤除菌，等量分装，4℃保存备用。使用前加入10％胎牛血清，1×双抗。

DMEM培养液：每袋DMEM粉剂先溶于约800ml双蒸水，加入1.5g NaHCO3，2.5g葡萄糖，0.11g丙酮酸钠，充分溶解，用双蒸水补充至1000ml。 0.22μm微孔滤膜过滤除菌，等量分装，4℃保存备用。使用前加入10％胎牛血清，1×双抗。

PBS缓冲液(pH 7.4)：称取NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na₂HPO4·12H₂O 1.44g，KH₂PO4·12H₂O 0.24g，溶于900ml双蒸水中，HCl调节pH至7.4，用双蒸水定容至1000ml，高压灭菌，室温储存。

3、免疫印迹分析检测细胞的蛋白表达量

(1)电泳：与10％的分离胶中(主要成份为ddH2O，30％聚丙烯酰胺，1.5M Tris-HCl(pH8.8)或1.0M Tris-HCl(pH6.8)，10％SDS，10％过硫酸铵，TEMED)，每孔蛋白上样量约40μg，100V恒压电泳，待溴酚蓝快跑到凝胶底部时结束电泳。

(2)转膜：电泳结束后，拆卸玻璃板取出凝胶，切去浓缩胶，再依目的蛋白分子量的大小对分离胶适当剪切后泡于预冷转膜液中以免变干，同时将滤纸与海绵也泡于预冷转膜液中。裁剪一块与凝胶大小相仿的PVDF膜于甲醇中浸泡 2min使膜活化，再按以下排列顺序制作“三明治”：负极上依次叠放1块海绵垫、 2张滤纸、凝胶、PVDF膜、2张滤纸、一块海绵垫。注意：PVDF膜贴于凝胶上之后必须赶走气泡。接着按正确的正负电极方向安装好电泳槽进行湿转，四周放上冰块进行降温，调整电压为恒流200V(1.5h)。

(3)封闭：转膜结束后将PVDF膜先于TBST中清洗5min，再放入5％的封闭液中于脱色摇床上封闭0.5-1h。

(4)抗体孵育：将一抗用封闭液或者一抗稀释液按1:500-1:1000稀释后覆盖于PVDF膜上于室温下孵育2h或4℃过夜，然后用TBST清洗三次，每次 5min。将二抗按1:5000稀释后，在摇床上与PVDF膜于室温下孵育1h，再用 TBST清洗三次，每次5min。

(5)化学发光，显影，定影：将A和B两试剂等体积混合，滴加到 ImageStation4000MM成像仪上，然后把PVDF膜正面朝下覆盖在ECL试剂上，按成像仪的操作说明进行曝光，得到蛋白条带结果。

4、本发明小分子化合物对PARP的降解活性如下:

在对不同来源的肿瘤细胞系或正常细胞中，经化合物CN2处理48h后，蛋白质免疫印迹结果分析，如图2所示，与阳性对照药尼拉帕尼相比可以明显观察到化合物CN2在不同剂量下对PARP蛋白的降解效果。由上述测试结果可以看出，化合物CN2能在一定浓度下降解PARP。同时，化合物CN2在MX-1乳腺癌细胞株中相比于尼拉帕尼显示出了较强的细胞增殖抑制作用,而在MCF-10A 正常乳腺细胞株中相比尼拉帕尼显示出较低的细胞毒性作用。

5、本发明化合物对不同来源的肿瘤细胞系的半数抑制率：

不同肿瘤细胞系：实验选取人源乳腺癌细胞系：MCF-7、HCC1937、 MDA-MB-231、SKBR3、MX-1；卵巢癌细胞SKOV3、8910以及人正常的乳腺细胞株MCF-10A，以便考察化合物CN2对不同来源的肿瘤细胞系的半数抑制率活性。将细胞株培养于含10％胎牛血清、青霉素100IU/ml和链霉素100μg/ml 的RPMI1640培养液中。细胞置于37℃，5％CO2饱和湿度培养箱中培养，取对数生长期的细胞用于实验。取对数生长期的细胞株，按4×104个/ml接种于96孔培养板中，每孔180μl。

实验组分别加入不同浓度的药物20μl，对照组不加药，每组设3个平行孔，37℃培养48h。加入5mg/ml的MTT溶液20μl/孔，继续培养4h后，去除上清液，加入150μl DMSO，微量振荡仪振荡10min，用酶标仪在570nm 波长处测吸光度(OD值)。根据吸光度计算细胞生长抑制率[细胞生长抑制率＝(对照组OD-实验组OD)/对照组OD×100％]，并用Logit法计算IC50值，实验重复3次，取平均值。

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，乳腺癌转移和复发是导致患者死亡的主要原因。研究有效抑制乳腺癌转移的药物是亟待解决的问题。我们通过刮擦试验评估了化合物CN2对卵巢癌细胞SKOV3和8910侵袭转移的影响(图2)。与对照组相比，经化合物CN2-处理的组的细胞活力明显降低，这表明化合物CN2- 可能抑制卵巢癌细胞SKOV3和8910的迁移能力。

6、本发明化合物对不同来源肿瘤细胞迁移能力的影响

不同肿瘤细胞系：实验选取人源卵巢癌细胞系SKOV3和8910，以便考察化合物CN2对不同来源的肿瘤细胞系的半数抑制率活性。先用marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀得划横线，大约每隔0.5～1cm一道，横穿过孔。每孔至少穿过5条线。在空中加入约5X10⁵个细胞，具体数量因细胞不同而不同，掌握为过夜能铺满。第二天用枪头比着直尺，尽量垂至于背后的横线划痕，枪头要垂直，不能倾斜。用PBS洗细胞3次，去处划下的细胞，加入无血清培养基。设置对照组，尼拉帕尼组，CN2组，放入37度5％CO2培养箱，培养。按0，12， 24,36,48小时取样，拍照。

表1本发明所得化合物对肿瘤细胞增殖活性的抑制作用

(化合物处理48h，化合物200uM作用下的最大抑制率或IC₅₀(uM)；NS：未测)