CN118085013A - 一种连接子、含连接子的抗体药物偶联物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
一种含连接子的抗体偶联药物，还涉及包含抗体偶联物的药物组合，以及连接子的用途，抗体偶联物在制备预防和/或治疗疾病药物中的用途。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于抗体药物偶联物的连接子以及由该连接子制备的抗体药物偶联物，包含抗体偶联药物的药物组合物，以及这些抗体偶联药物用于治疗和/或预防疾病的用途。
背景技术
目前，传统化疗仍然是恶性肿瘤的首选治疗手段，传统化疗以细胞毒药物为主，普遍存在靶向性差、安全窗窄、毒副作用强、易耐药等缺点。抗体偶联药物(Antibody-drugconjugates,ADC)的出现，为恶性肿瘤提供了一种全新的治疗手段。ADC结构包括3个部分：抗体(antibody)、小分子细胞毒药物(cytotoxin)以及实现前两者有机组合的连接子(linker)。ADC利用抗体的靶向性将细胞毒药物聚集在肿瘤靶部位以实现增效减毒，释放的细胞毒药物可进一步通过旁观者效应杀死周边肿瘤细胞。其兼具单抗药物的高靶向性以及细胞毒素在肿瘤组织中高活性的双重优点，可高效杀伤肿瘤细胞，较化疗药物副作用更低，较传统抗体类肿瘤药物具有更好的疗效。ADC药物活性高、毒副作用小、作用时间长的特征为肿瘤的“精准治疗”提供了一种全新的策略。
表观遗传失调通常与人类疾病有关，尤其是癌症。癌症中异常的表观遗传调控包括DNA甲基化、组蛋白甲基化、组蛋白乙酰化、非编码RNA和mRNA甲基化。表观遗传修饰可以在不改变DNA序列的情况下改变基因表达。表观遗传酶介导的癌基因或抑癌基因转录异常与肿瘤的发生、发展和预后密切相关。基于表观遗传机制的可逆性，靶向表观遗传调控的小分子化合物已成为有前景的治疗药物。这些化合物以表观遗传调控酶为靶标，包括组蛋白修饰物(甲基化和乙酰化)、DNA甲基化酶、特异性识别翻译后修饰的酶、染色质重塑酶和转录后调控物(Jin Y,Liu T,Luo H,Liu Y,Liu D.Targeting Epigenetic RegulatoryEnzymes for Cancer Therapeutics:Novel Small-Molecule EpidrugDevelopment.Front Oncol.2022；12:848221.Published 2022Mar 28.doi:10.3389/fonc.2022.848221)。表观遗传靶向药物已证明在血液系统恶性肿瘤的临床疗效和实体肿瘤的治疗潜力(Jin N,George TL,Otterson GA,et al.Advances in epigenetictherapeutics with focus on solid tumors.Clin Epigenetics.2021；13(1):83.)。外周T细胞淋巴瘤(PTCL)是典型的表观遗传相关疾病，对组蛋白去乙酰化酶(HDAC)和DNA甲基转移酶(DNMT)抑制剂(单独或联合)都具有独特的敏感性(Scotto L,Kinahan C,Douglass E,et al.Targeting the T-Cell Lymphoma Epigenome Induces Cell Death,CancerTestes Antigens,Immune-Modulatory Signaling Pathways.Mol Cancer Ther.2021；20(8):1422-1430)。
尽管在血液肿瘤中显示出临床效果，但表观遗传药物作为单一疗法在实体肿瘤中并没有显示出显著的疗效。最近的试验表明，当与化疗、激素治疗联合使用时，显示出疗效潜力。由于其机制的新颖性且极具治疗潜力，因此重新考虑最佳的患者选择、药物方案、研究设计和结果测量是很重要的(Juo YY,Gong XJ,Mishra A,et al.Epigenetic therapyfor solid tumors:from bench science to clinical trials.Epigenomics.2015；7(2):215-235.doi:10.2217/epi.14.73)
西达本胺(Chidamide、Tucidinostat)是组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂，已应用于临床治疗。有研究发现西达本胺处理胰腺癌细胞系显著降低其I型HDACs、Caspase-3和p21的表达，增加了Bax/Bcl-2的表达比例。研究结果提示，西达本胺可能通过下调I型HDACs和p21的表达来抑制胰腺肿瘤细胞的增殖，并以剂量依赖的方式促进线粒体凋亡通路依赖性细胞凋亡(Zhao B,He T.Chidamide,a histone deacetylase inhibitor,functions asa tumor inhibitor by modulating the ratio of Bax/Bcl-2and P21 in pancreaticcancer.Oncol Rep.2015；33(1):304-310.doi:10.3892/or.2014.3595)。
有团队研究发现西达本胺能够通过激活转录因子STAT1增加PD-L1基因的组蛋白乙酰化。HDAC基因家族在软组织肉瘤患者中被频繁扩增。基于药物靶基因集分析，11例脂肪肉瘤患者中有8例(73％)广泛扩增了HDAC基因家族，并且通过分析TCGA肉瘤队列，验证了76.65％(197/257)的病例扩增了HDAC基因家族。I类HDAC表达与软组织肉瘤患者的不良预后相关，抑制其表达可促进细胞凋亡和程序性细胞死亡配体1(PD-L1)的上调。HDAC I类抑制剂西达本胺能显著增加肿瘤微环境中PD-L1表达，增加CD8+T细胞浸润，减少MDSCs数量。在小鼠模型中，西达本胺与抗PD-1抗体的结合显著促进了肿瘤的消退并提高了生存率。此外，西达本胺联合抗PD-1抗体Toripalimab对晚期和转移性肉瘤患者有效，且副作用可耐受(Que Y,Zhang XL,Liu ZX,et al.Frequent amplification of HDAC genes andefficacy of HDAC inhibitor chidamide and PD-1blockade combination in softtissue sarcoma.J Immunother Cancer.2021；9(2):e001696.doi:10.1136/jitc-2020-001696)。
为了满足更多临床未被满足的实体瘤治疗需求，开发基于组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的抗体偶联药物很有必要。
发明内容
发明要解决的问题
首先，为开发多样性的稳定型ADC以满足各种不同的临床需求，新的连接子的稳定型ADC仍需进一步开发。经过不断努力，本申请发明人设计了具有通式(I)结构所示的连接子。
其次，本申请发明人提供具有优异抗肿瘤效果的通式(II)结构所示的偶联物。
用于解决问题的方案
本申请发明人已经尝试进行了深入研究并发现具有通式(I)结构所示的连接子，以及式(II)结构所示的偶联物能达到期望的目的，从而完成本发明。
即本发明涉及以下连接子及含该连接子的偶联物、或其立体异构体、或其互变异构体、或其药学上可接受的盐，或其氘代化合物、或其溶剂化物。
本发明的第一方面涉及一种式I所示的化合物或其立体异构体、或其互变异构体、或其药学上可接受的盐、或其氘代化合物、或其溶剂化物，
其中：
L1选自
优选地，L1的碳端与丁二酰亚胺的N相连接，羰基端与L2相连接；
m和t各自独立的选自：0、1、2、3、4、5、6、7和8；
q为0、1、2或3；
p为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15；
X选自：CH2、O和NH；
L2不存在，或为氨基酸残基，或为由2-10个氨基酸残基组成的肽残基；
优选地，L2的氨基端与L1相连接，羰基端与L3相连接；
优选地，所述氨基酸包括但不限定于苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、缬氨酸(V)、赖氨酸(K)、丝氨酸(S)、谷氨酸(E)、天冬氨酸(N)、精氨酸(R)、丙氨酸(A)、瓜氨酸、半胱氨酸(C)；
L3不存在，或选自
优选地，L3的氨基酸与L2相连接，羰基端或碳端与D相连接；
D为组蛋白脱乙酰基酶抑制剂药物，其选自基于硫醇的组蛋白脱乙酰基酶抑制剂、基于异羟肟酸的组蛋白脱乙酰基酶抑制剂或基于苯甲酰胺的组蛋白脱乙酰基酶抑制剂。
在一些实施方案中，所述L1选自：
在一些实施方案中，L1选自：
在一些实施方案中，m选自：0、1、2、3、4和5。在一些实施方案中，m选自1、3、4。
在一些实施方案中，t选自：0、1、2、3、4、5、6和7。在一些实施方案中，t选自1、2、3、7。
在一些实施方案中，q选自0、1、2。
在一些实施方案中，p选自10、11、12、13、14、15。在一些实施方案中，p选自11、12、13。在一些实施方案中，p为12。
在一些实施方案中，X选自O和NH。
在一些实施方案中，L1选自
在一些实施方案中，L1选自
在一些实施方案中，L1选自
在一些实施方案中，L1选自
在一些实施方案中，L1为
在一些实施方案中，L1为
在一些实施方案中，L1为
在一些实施方案中，L1为
在一些实施方案中，L2不存在，或为氨基酸残基，或为由2-4个氨基酸残基组成的肽残基。
在一些实施方案中，所述氨基酸包括但不限定于苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、缬氨酸(V)、丙氨酸(A)、瓜氨酸、半胱氨酸。
在一些实施方案中，所述氨基酸包括但不限定于苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、缬氨酸(V)、丙氨酸(A)、瓜氨酸。
在一些实施方案中，L2不存在，或为瓜氨酸残基，或选自以下肽残基：缬氨酸残基-丙氨酸残基、缬氨酸残基-瓜氨酸残基、甘氨酸氨基-甘氨酸残基-苯丙氨酸残基-甘氨酸残基、缬氨酸残基-丙氨酸残基-苯丙氨酸残基-甘氨酸残基、甘氨酸残基-甘氨酸残基-甘氨酸残基、甘氨酸残基-苯丙氨酸残基-甘氨酸残基、缬氨酸残基-半胱氨酸-苯丙氨酸残基-甘氨酸残基。
在一些实施方案中，L2不存在，或为瓜氨酸残基，或选自以下肽残基：缬氨酸残基-丙氨酸残基、缬氨酸残基-瓜氨酸残基、甘氨酸氨基-甘氨酸残基-苯丙氨酸残基-甘氨酸残基、缬氨酸残基-丙氨酸残基-苯丙氨酸残基-甘氨酸残基。
在一些实施方案中，所述L2不存在，或选自
在一些实施方案中，所述L2不存在，或选自
在一些实施方案中，L2不存在，或选自
在一些实施方案中，L2不存在，或选自在一些实施方案中，L2选自在一些实施方案中，L2为在一些实施方案中，L3为在一些实施方案中，D为基于苯甲酰胺的组蛋白脱乙酰基酶抑制剂。
在一些实施方案中，D选自
其中，
A为苯基或吡啶基，且所述苯基或吡啶基各自独立任选地被1-4个选自以下的取代基所取代：卤素、C1-C4烷基(如甲基、乙基)、C1-C4卤代烷基(如三氟甲基)；
优选地，A为苯基或吡啶基，且所述苯基或吡啶基各自独立任选地被1-2个选自以下的取代基所取代：卤素、C1-C4烷基(如甲基、乙基)、三氟甲基；
更优选地，A为吡啶基，且所述吡啶基任选地被1-2个选自以下的取代基所取代：C1-C4烷基；
进一步优选地，A为吡啶基；
最优选地，A为
B为亚苯基；
优选地，B为
Y为-CO-NH-CH2-；
优选地，Y的亚甲基端与B相连接，羰基端与烯基碳或O相连接；
R1、R2各自独立地选自氢、C1-C4烷基；
优选地，R1、R2均为氢；
X1、X2、X3、X4中，任意一个选自氢、卤素、C1-C4烷基，其余三个为氢；
优选地，X1、X2、X3、X4中，任意一个选自氢、卤素，其余三个为氢；
更优选地，X1、X2、X3、X4中，任意一个选自氢、氟，其余三个为氢；
最优选地，X2选自氢、氟，X1、X3、X4为氢。
在一些实施方案中，D选自
在一些实施方案中，D为
在一些实施方案中，所述化合物选自：
本发明的第二方面涉及前述的化合物或其立体异构体、或其互变异构体、或其药学上可接受的盐、或其氘代化合物、或其溶剂化物在制备配体药物偶联物(如抗体药物偶联物)中的用途。
本发明的第三方面涉及一种式II所示的配体药物偶联物或其立体异构体、或其互变异构体、或其药学上可接受的盐、或其氘代化合物、或其溶剂化物，
其中：
Ab为配体，选自蛋白、抗体、多肽、酶和小分子；
n为0.5至8.5之间的数；例如n为0.8至5之间的数，1至4之间的数，2至6之间的数，3至7之间的数，4至8之间的数，3.5至8.5之间的数，3.5至4.5之间的数，或6.5至8.5之间的数；优选地，n约为1、2、3、4、5、6、7或8；优选地，n约为2、3、4、5、6、7或8；优选地，n约为3、4、5、6、7或8；
L1选自
优选地，L1的碳端与丁二酰亚胺的N相连接，羰基端与L2相连接；
m和t各自独立的选自：0、1、2、3、4、5、6、7和8；
q为0、1、2或3；
p为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15；
X选自：CH2、O和NH；
L2不存在，或为氨基酸残基，或为由2-10个氨基酸残基组成的肽残基；
优选地，L2的氨基端与L1相连接，羰基端与L3相连接；
优选地，所述氨基酸包括但不限定于苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、缬氨酸(V)、赖氨酸(K)、丝氨酸(S)、谷氨酸(E)、天冬氨酸(N)、精氨酸(R)、丙氨酸(A)、瓜氨酸、半胱氨酸(C)；
L3不存在，或选自
优选地，L3的氨基酸与L2相连接，羰基端或碳端与D相连接；
D为组蛋白脱乙酰基酶抑制剂药物，其选自基于硫醇的组蛋白脱乙酰基酶抑制剂、基于异羟肟酸的组蛋白脱乙酰基酶抑制剂或基于苯甲酰胺的组蛋白脱乙酰基酶抑制剂
在一些实施方案中，所述L1选自：
在一些实施方案中，L1选自：
在一些实施方案中，m选自：0、1、2、3、4和5。在一些实施方案中，m选自1、3、4。
在一些实施方案中，t选自：0、1、2、3、4、5、6和7。在一些实施方案中，t选自1、2、3、7。
在一些实施方案中，q选自0、1、2。
在一些实施方案中，p选自10、11、12、13、14、15。在一些实施方案中，p选自11、12、13。在一些实施方案中，p为12。
在一些实施方案中，X选自O和NH。
在一些实施方案中，L1选自
在一些实施方案中，L1选自
在一些实施方案中，L1选自
在一些实施方案中，L1选自
在一些实施方案中，L1为
在一些实施方案中，L1为
在一些实施方案中，L1为在一些实施方案中，L1为
在一些实施方案中，L2不存在，或为氨基酸残基，或为由2-4个氨基酸残基组成的肽残基。
在一些实施方案中，所述氨基酸包括但不限定于苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、缬氨酸(V)、丙氨酸(A)、瓜氨酸、半胱氨酸。
在一些实施方案中，所述氨基酸包括但不限定于苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、缬氨酸(V)、丙氨酸(A)、瓜氨酸。
在一些实施方案中，L2不存在，或为瓜氨酸残基，或选自以下肽残基：缬氨酸残基-丙氨酸残基、缬氨酸残基-瓜氨酸残基、甘氨酸氨基-甘氨酸残基-苯丙氨酸残基-甘氨酸残基、缬氨酸残基-丙氨酸残基-苯丙氨酸残基-甘氨酸残基、甘氨酸残基-甘氨酸残基-甘氨酸残基、甘氨酸残基-苯丙氨酸残基-甘氨酸残基、缬氨酸残基-半胱氨酸-苯丙氨酸残基-甘氨酸残基。
在一些实施方案中，L2不存在，或为瓜氨酸残基，或选自以下肽残基：缬氨酸残基-丙氨酸残基、缬氨酸残基-瓜氨酸残基、甘氨酸氨基-甘氨酸残基-苯丙氨酸残基-甘氨酸残基、缬氨酸残基-丙氨酸残基-苯丙氨酸残基-甘氨酸残基。
在一些实施方案中，所述L2不存在，或选自
在一些实施方案中，所述L2不存在，或选自
在一些实施方案中，L2不存在，或选自
在一些实施方案中，L2不存在，或选自
在一些实施方案中，L2选自
在一些实施方案中，L2为
在一些实施方案中，L3为
在一些实施方案中，D为基于苯甲酰胺的组蛋白脱乙酰基酶抑制剂。
在一些实施方案中，D选自
其中，
A为苯基或吡啶基，且所述苯基或吡啶基各自独立任选地被1-4个选自以下的取代基所取代：卤素、C1-C4烷基(如甲基、乙基)、C1-C4卤代烷基(如三氟甲基)；
优选地，A为苯基或吡啶基，且所述苯基或吡啶基各自独立任选地被1-2个选自以下的取代基所取代：卤素、C1-C4烷基(如甲基、乙基)、三氟甲基；
更优选地，A为吡啶基，且所述吡啶基任选地被1-2个选自以下的取代基所取代：C1-C4烷基；
进一步优选地，A为吡啶基；
最优选地，A为
B为亚苯基；
优选地，B为
Y为-CO-NH-CH2-；
优选地，Y的亚甲基端与B相连接，羰基端与烯基碳或O相连接；
R1、R2各自独立地选自氢、C1-C4烷基；
优选地，R1、R2均为氢；
X1、X2、X3、X4中，任意一个选自氢、卤素、C1-C4烷基，其余三个为氢；
优选地，X1、X2、X3、X4中，任意一个选自氢、卤素，其余三个为氢；
更优选地，X1、X2、X3、X4中，任意一个选自氢、氟，其余三个为氢；
最优选地，X2选自氢、氟，X1、X3、X4为氢；
更优选地，D选自
在一些实施方案中，D为
在一些实施方案中，所述Ab为抗体，非限制性地选自：抗EGFR抗体、抗CD20抗体或抗PD-L1抗体。
在一些实施方案中，Ab非限制性地选自西妥昔单抗(Cxtuximab)，帕尼单抗(Panitumumab)，耐昔妥珠单抗(Necitumumab)，利妥昔单抗(Rituximab)，托西莫单抗(Tositumomab+Iodine 131Tositumomab)，奥法木单抗(Ofatumumab)，阿托珠单抗(Obinutuzumab),奥瑞珠单抗(Ocrelizumab)，阿替利珠单抗(Atezolizumab)，阿维鲁单抗(Avelumab)，度伐利尤单抗(Durvalumab)，西米普利单抗(Cemiplimab-rwlc)。
在一些实施方案中，Ab为阿替利珠单抗(Atezolizumab)、阿维鲁单抗(Avelumab)。
在一些实施方案中，所述配体药物偶联物选自：
在一些实施方案中，所述配体药物偶联物选自：
本发明的第四方面涉及一种药物组合物，其包含前述的化合物或其立体异构体、或其互变异构体、或其药学上可接受的盐、或其氘代化合物、或其溶剂化物；或者包含前述的配体药物偶联物或其立体异构体、或其互变异构体、或其药学上可接受的盐、或其氘代化合物、或其溶剂化物；任选地，还包含药学上可接受的载体或赋形剂。
本发明的第五方面涉及前述的化合物或其立体异构体、或其互变异构体、或其药学上可接受的盐、或其氘代化合物、或其溶剂化物，或者前述的配体药物偶联物或其立体异构体、或其互变异构体、或其药学上可接受的盐、或其氘代化合物、或其溶剂化物，或者前述的药物组合物在制备治疗或预防疾病的药物中的用途。
在一些实施方案中，所述疾病为肿瘤。
本发明的第六方面涉及前述的化合物或其立体异构体、或其互变异构体、或其药学上可接受的盐、或其氘代化合物、或其溶剂化物，或者前述的配体药物偶联物或其立体异构体、或其互变异构体、或其药学上可接受的盐、或其氘代化合物、或其溶剂化物，或者前述的药物组合物，其用于治疗或预防疾病。
在一些实施方案中，所述疾病为肿瘤。
本发明的第七方面涉及治疗或预防疾病的方法，其包括给予受试者有效量的前述的化合物或其立体异构体、或其互变异构体、或其药学上可接受的盐、或其氘代化合物、或其溶剂化物，或者前述的配体药物偶联物或其立体异构体、或其互变异构体、或其药学上可接受的盐、或其氘代化合物、或其溶剂化物，或者前述的药物组合物。
在一些实施方案中，所述疾病为肿瘤。
本发明的第八方面涉及一种制备式I所示的化合物或其立体异构体、或其互变异构体、或其药学上可接受的盐、或其氘代化合物、或其溶剂化物的方法，包括如下步骤：
由式I-1所示化合物与D’反应得式I所示化合物；或由式I-2所示化合物与H-L2-L3-D反应得式I所示化合物；或由式I-3所示化合物与H-L2-L3-D反应得式I所示化合物；
优选地，包括如下步骤：
由式I-1所示化合物与D’反应得式I所示化合物；或由式I-2所示化合物与H-L2-L3-D反应得式I所示化合物；
其中，LE为离去基团；优选地，LE为卤素、
D’为组蛋白脱乙酰基酶抑制剂药物，其选自基于硫醇的组蛋白脱乙酰基酶抑制剂、基于异羟肟酸的组蛋白脱乙酰基酶抑制剂或基于苯甲酰胺的组蛋白脱乙酰基酶抑制剂；
优选地，D’为基于苯甲酰胺的组蛋白脱乙酰基酶抑制剂；
更优选地，D’选自
其中，
A为苯基或吡啶基，且所述苯基或吡啶基各自独立任选地被1-4个选自以下的取代基所取代：卤素、C1-C4烷基(如甲基、乙基)、C1-C4卤代烷基(如三氟甲基)；
优选地，A为苯基或吡啶基，且所述苯基或吡啶基各自独立任选地被1-2个选自以下的取代基所取代：卤素、C1-C4烷基(如甲基、乙基)、三氟甲基；
更优选地，A为吡啶基，且所述吡啶基任选地被1-2个选自以下的取代基所取代：C1-C4烷基；
进一步优选地，A为吡啶基；
最优选地，A为
B为亚苯基；
优选地，B为
Y为-CO-NH-CH2-；
优选地，Y的亚甲基端与B相连接，羰基端与烯基碳或O相连接；
R1、R2各自独立地选自氢、C1-C4烷基；
优选地，R1、R2均为氢；
X1、X2、X3、X4中，任意一个选自氢、卤素、C1-C4烷基，其余三个为氢；
优选地，X1、X2、X3、X4中，任意一个选自氢、卤素，其余三个为氢；
更优选地，X1、X2、X3、X4中，任意一个选自氢、氟，其余三个为氢；
最优选地，X2选自氢、氟，X1、X3、X4为氢；
更优选地，D’选自(即西达本胺，Chidamide)、(即恩替诺特，Entinostat)；
进一步优选地，D’为(即西达本胺，Chidamide)；
L1、L2、L3、D的定义如前所述。
本发明的第九方面涉及一种制备式II所示的配体药物偶联物或其立体异构体、或其互变异构体、或其药学上可接受的盐、或其氘代化合物、或其溶剂化物的方法，包括如下步骤：
式I所示化合物或其立体异构体、或其互变异构体、或其药学上可接受的盐、或其氘代化合物、或其溶剂化物与Ab反应，得到式II所示的配体药物偶联物或其立体异构体、或其互变异构体、或其药学上可接受的盐、或其氘代化合物、或其溶剂化物；
优选地，所述反应在pH＝5～10，温度为0～40℃条件下进行；
其中：
Ab、n、L1、L2、L3、D的定义如前所述。
在一些实施方案中，式I所示的化合物选自：
在一些实施方案中，式II所示的配体药物偶联物选自：
在一些实施方案中，式II所示的配体药物偶联物选自：
本发明的有益效果：
1、本发明提供了新的稳定型ADC连接子，以及具备优异抗肿瘤效果的抗体偶联物。
2、在体外肿瘤细胞抑制实验中，相比于裸抗、小分子药物和联合用药，本发明的含新型稳定性连接子偶联物具有明显的抑制细胞生长的作用。
3、在体内小鼠药效实验中，相比裸抗和联合用药，本发明的含新型稳定性连接子偶联物具有明显的抑制肿瘤生长的作用。
4、本发明的含新型稳定性连接子偶联物具有良好的血浆稳定性。
5、本发明的含新型稳定性连接子偶联物具有优异的内吞作用。
6、本发明的含新型稳定性连接子偶联物对细胞组蛋白乙酰化有明显的促进作用。
附图说明
图1-1为ADC-1.1的RP-HPLC检测图；
图1-2为ADC-1.2的RP-HPLC检测图；
图1-3为ADC-1.3的RP-HPLC检测图；
图1-4为ADC-1.4的RP-HPLC检测图；
图1-5为ADC-1.5的RP-HPLC检测图；
图1-6为ADC-1.6的RP-HPLC检测图；
图2为ADC-2的RP-HPLC检测图；
图3-1为ADC-3.1的RP-HPLC检测图；
图3-2为ADC-3.2的RP-HPLC检测图；
图3-3为ADC-3.3的RP-HPLC检测图；
图3-4为ADC-3.4的RP-HPLC检测图；
图4为ADC-4的RP-HPLC检测图；
图5为ADC-5的RP-HPLC检测图；
图6为ADC-6的RP-HPLC检测图；
图7为ADC-7的RP-HPLC检测图；
图8为Ate抗体和ADC-3.3与hPD-L1-his亲和力检测结果图；
图9为Ate抗体与hPD-L1-his亲和力检测结果图；
图10为ADC-1.4与hPD-L1-his亲和力检测结果图；
图11为ADC-1.5与hPD-L1-his亲和力检测结果图；
图12为ADC-1.6与hPD-L1-his亲和力检测结果图；
图13为Ate抗体与Cyno PD-L1-his亲和力检测结果图；
图14为ADC-1.4与Cyno PD-L1-his亲和力检测结果图；
图15为ADC-1.5与Cyno PD-L1-his亲和力检测结果图；
图16为ADC-1.6与Cyno PD-L1-his亲和力检测结果图；
图17为Ate抗体与mPD-L1-his亲和力检测结果图；
图18为ADC-1.4与mPD-L1-his亲和力检测结果图；
图19为ADC-1.5与mPD-L1-his亲和力检测结果图；
图20为ADC-1.6与mPD-L1-his亲和力检测结果图；
图21为Ate抗体与Rat PD-L1-his亲和力检测结果图；
图22为ADC-1.4与Rat PD-L1-his亲和力检测结果图；
图23为ADC-1.5与Rat PD-L1-his亲和力检测结果图；
图24为ADC-1.6与Rat PD-L1-his亲和力检测结果图；
图25为ADC-1.4、ADC-1.5、ADC-1.6对NCI-H292细胞组蛋白H4乙酰化水平影响的检测结果图；
图26为ADC-1.4、ADC-1.5、ADC-1.6、ADC-3.3游离毒素检测结果图；
图27为ADC-1.6在人、食蟹猴、SD大鼠和C57小鼠血浆中稳定性检测结果图；
图28为ADC-1.6在肿瘤细胞中内吞率检测结果图；
图29为ADC-3.3对结直肠癌细胞系CT26 hPD-L1-EX细胞增殖抑制结果图；
图30为ADC-1.6对结直肠癌细胞系CT26 hPD-L1-EX的细胞增殖抑制结果图；
图31为ADC-1.6对人外周血单个核细胞PBMC和人恶性黑色素瘤细胞系A375共培养体系下人恶性黑色素瘤细胞系A375的细胞增殖抑制结果图；
图32为ADC-1.6对人外周血单个核细胞PBMC和人恶性黑色素瘤细胞系A375共培养体系下人恶性黑色素瘤细胞系A375的细胞增殖抑制结果图(样品浓度0.008μM)；
图33为ADC-1.6和裸抗在C57BL/6J小鼠MC38肿瘤模型抑瘤率结果图；
图34为ADC-1.6和联用在C57BL/6J小鼠MC38肿瘤模型抑瘤率结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
除非另有说明，否则如本文所用的以下术语和短语旨在具有以下含义。当本文中使用商标名称时，除非上下文中另有指明，否则商标名称包括所述商标名称产品的产品配方、通用药物和活性成分。
本发明中“抗体”指免疫球蛋白，是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，故其抗原性也不同。据此，可将免疫球蛋白分为五类，或称为免疫球蛋白的同种型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相应的重链分别为μ链、δ链、γ链、α链和ε链。同一类Ig根据其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别，又可分为不同的亚类，如IgG可分为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。轻链通过恒定区的不同分为κ链或λ链。五类Ig中每类Ig都可以有κ链或λ链。
术语“药物抗体比(DAR)”是指式II中每个Ab(如抗体)上加载的细胞毒性药物(即式I或式II中的D)的平均数量(例如式II中的n)，其可以为整数，也可以为小数。DAR的范围(例如通式II中的n)可以是每个Ab(如抗体)平均连接0.5至8.5个(即可以是选自0.5-8.5之间的包括端点0.5和8.5的任意整数或任意小数)细胞毒性药物(即式I或式II中的D)，例如，DAR(例如式II中的n)可以是0.5、1、1.5、1.94、2、2.5、3、3.37、3.5、4、4.08、4.5、4.71、4.74、4.99、5、5.26、5.43、5.5、6、6.34、6.46、6.5、7、7.08、7.5、7.66、7.77、7.80、7.81、8或8.5等。
术语“药学上可接受的盐”指本发明的化合物或偶联物的盐，这类盐用于哺乳动物体内时具有安全性和有效性，且具有应有的生物活性。例如本发明化合物或偶联物中的酸性基团与碱形成盐，非限制性实例包括：钠盐、钾盐、钙盐或镁盐等。也可以是本发明化合物或偶联物中的碱性基团与酸形成盐，非限制性实例包括：盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、柠檬酸盐、乙酸盐、琥珀酸盐、抗坏血酸盐、草酸盐、硝酸盐、梨酸盐、磷酸氢盐、磷酸二氢盐、水杨酸盐、柠檬酸氢盐、酒石酸盐、马来酸盐、富马酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐。
术语“溶剂化物”指本发明的化合物或偶联物与一种或多种溶剂分子形成可药用的溶剂化物，溶剂分子的非限制性实例包括水、乙醇、乙腈、异丙醇、DMSO、乙酸乙酯。
术语“立体异构体”指在有相同分子式的化合物分子中，原子或取代基互相连接的次序相同，但在空间的排列方式不同，属于有机化学范畴中的同分异构现象。
术语“互变异构体”指的是含有杂原子(如氮、氧或硫原子)的两个同分异构体，其结构差异仅在于质子和相应的双键的迁移，且这两个异构体共存于一个平衡体系中，以相当高的速率互相变换着，典型的示例如酮式-烯醇互变异构。
术语“氘代化合物”指本发明的化合物或偶联物中的一个或多个氢原子被氘原子所替代后形成的结构。
术语“氨基酸残基”指的是氨基酸的氨基失去一个氢、羧基失去一个羟基后，剩余的不完整的氨基酸结构，具有氨基端和羰基端。本发明中，L2为氨基酸残基或由2-10个(优选2-4个)氨基酸残基组成的肽残基，其中，2-10个(优选2-4个)氨基酸的种类相互之间可以相同，也可以不同。例如，若L2为由4个氨基酸残基组成的肽残基，且氨基酸选自甘氨酸、苯丙氨酸，则L2可以为以下肽残基：甘氨酸残基-甘氨酸残基-苯丙氨酸残基-甘氨酸残基(Gly-Gly-Phe-Gly)，具体可以为
本发明中，除非以其他方式明确指出，在本文中通篇采用的描述方式“…各自独立地选自”既可以是指在不同基团中，相同或不同的符号之间所表达的具体选项之间互相不影响，也可以表示在相同的基团中，相同或不同的符号之间所表达的具体选项之间互相不影响。
本发明化合物的取代基按照基团种类或范围公开。特别指出，本发明包括这些基团种类和范围的各个成员的每一个独立的次级组合。例如，术语“C1-C6烷基”特别指独立公开的甲基、乙基、C3烷基、C4烷基、C5烷基和C6烷基。
本发明中，“被取代的”或“被…所取代”是指指定原子或基团上的任一或多个氢被指定基团的选择替代，条件为不超过指定原子的正常价态。
本发明中，“任选地”表示可以选择，也可以不选择。例如，“A为吡啶基，且所述吡啶基任选地被1-2个选自以下的取代基所取代：C1-C4烷基”，其表示，A为吡啶基，且所述吡啶基可以不被取代基所取代，也可以被1-2个选自以下的取代基所取代：C1-C4烷基。
术语“卤素”指氟、氯、溴或碘。
术语“C1-C4烷基”是指具有1至4个碳原子的烷基，优选“C1-C3烷基”。烷基的实例包括但不限于甲基、乙基、丙基(例如正丙基和异丙基)、丁基(例如，正丁基、异丁基、叔丁基)等。
术语“C1-C4卤代烷基”指的是任意上述C1-C4烷基中的一个或多个氢原子被卤素(优选氟)替代得到的基团，实例包括单氟甲基、二氟甲基、二氟乙基、三氟甲基等。
术语“不存在”表示其两边的基团直接相连。例如，式I中，若L2不存在，则式I的结构式变为相应地，本领域技术人员可以理解，若L2存在，则L2的一端与L1相连接，另一端与L3相连接，但若L2不存在，则L1将与L3相连接。其余类似的定义可以参照前述内容进行理解。
术语“载体”指能改变药物进入人体的方式和在体内的分布、控制药物的释放速度并将药物输送到靶向器官的体系。药物载体释放和靶向系统能够减少药物降解及损失，降低副作用，提高生物利用度。如可作为载体的高分子表面活性剂由于其独特的两亲性结构，可以进行自组装，形成各种形式的聚集体，优选的实例如胶束、微乳液、凝胶、液晶、囊泡等。这些聚集体具有包载药物分子的能力，同时又对膜有良好的渗透性，可以作为优良的药物载体。
术语“赋形剂”指在药物制剂中除主药以外的附加物，也可称为辅料，辅料包括但不限于：离子交换剂，氧化铝，硬脂酸铝，卵磷脂，血清蛋白如人血白蛋白，缓冲物质如磷酸盐，甘油，山梨酸，山梨酸钾，饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物，水，盐或电解质，如硫酸鱼精蛋白，磷酸氢二钠，磷酸氢钾，氯化钠，锌盐，胶态氧化硅，三硅酸镁，聚乙烯吡咯烷酮，纤维素物质，聚乙二醇，羧甲基纤维素钠，聚丙烯酸酯，蜂蜡，羊毛脂等等。
术语“治疗”一般是指获得需要的药理和/或生理效应。该效应根据完全或部分地预防疾病或其症状，可以是预防性的；和/或根据部分或完全稳定或治愈疾病和/或由于疾病产生的副作用，可以是治疗性的。本文使用的“治疗”涵盖了对患者疾病的任何治疗，包括：(a)预防易感染疾病或症状但还没诊断出患病的患者所发生的疾病或症状；(b)抑制疾病的症状，即阻止其发展；或(c)缓解疾病的症状，即，导致疾病或症状退化。
术语“受试者”包括人或非人动物。示例性人受试者包括患有疾病(例如本文所述的疾病)的人(称为患者)或正常个体。本发明中术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如非哺乳动物(例如鸟类、两栖动物、爬行动物)和哺乳动物，例如非人灵长类、家畜和/或驯化动物(例如绵羊、犬、猫、奶牛、猪等)。
术语“有效量”指在必需的剂量和时间上有效实现期望的治疗或预防效果的量。本发明的化合物或偶联物的“治疗有效量”可根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重及该化合物或偶联物在个体中引发期望应答的能力等因素而变化。治疗有效量还涵盖该化合物或偶联物的治疗有益效果胜过任何有毒或有害后果的量。“预防有效量”指在必需的剂量和时间上有效实现期望的预防效果的量。通常而非必然，由于预防剂量是在疾病发作之前或在疾病的早期用于受试者的，因此预防有效量会低于治疗有效量。在癌症的情况中，药物的治疗有效量可减少癌细胞数；缩小肿瘤体积；抑制(即一定程度的减缓，优选停止)癌细胞浸润到周围器官中；抑制(即一定程度的减缓，优选停止)肿瘤转移；一定程度的抑制肿瘤生长；和/或一定程度的减轻与癌症有关的一种或多种症状。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，应理解，这些实施例只用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1连接子-毒素(化合物1)的制备
1)化合物1c的制备：
向式1a所示化合物(805mg,1.25mmol)的N，N-二甲基甲酰胺(12mL)溶液中加入1-羟基苯并三唑(506mg，3.7mmol),室温下反应2h后加入恩替诺特(1b，470mg,1.25mmol),室温继续反应72h。反应结束，浓缩反应液，反相柱层析纯化(乙腈/0.05％甲酸水溶液＝0：100％-50％：50％)，得到式1c所示化合物(200mg)。ESI-MS(m/z):882.3[M+H]+。
2)化合物1d的制备：
在冰浴下，向式1c所示化合物(200mg,0.23mmol)的二氯甲烷(10mL)溶液中缓慢滴加三氟乙酸(2mL),反应2h结束反应。浓缩反应液，反相柱层析纯化(乙腈/0.05％甲酸水溶液＝0:100％-40％:60％)，得到式1d所示化合物(80mg)。ESI-MS(m/z):782.4[M+H]+。
3)化合物1的制备：
向式1d所示化合物(80mg,0.23mmol)的N，N-二甲基甲酰胺(10mL)溶液中，加入1-{15-[(2,5-二氧三氢-1H-吡咯-1-基)氧基]-15-氧基-3,6,9,12-四氧基-1-基}吡咯-2,5-二酮(1e，26.5mg,0.06mmol),室温搅拌2h。浓缩反应液，反相柱层析纯化(乙腈/0.05％甲酸水溶液＝0：100％-50％：50％)，得到式1所示化合物1(27.7mg)。ESI-MS(m/z):1109.5[M+H]+。
实施例2连接子-毒素(化合物2)的制备
向50mL的圆底烧瓶中，依次加入4-((17S，20S)-1-(2,5-二氧-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-17-异丙基-15,18-二氧-20-(3-脲基丙基)-3,6,9,12-四氧杂-16,19-二氮杂环烷-21-氨基)苄基(4-硝基苯基)碳酸酯(2a，252mg，0.29mmol)、和DMA(2mL)，置换氮气三次，向其中加入HOBT(116mg，0.86mmol)反应混合物室温搅拌1小时。向反应混合物中加入西达本胺(2b，112mg，0.29mmol)，反应混合物室温搅拌反应96小时。所得反应液直接经反相硅胶柱层析纯化(洗脱剂：乙腈/0.05％甲酸水溶液＝0：100％-35％：65％)，得到式2所示化合物2(15mg)，ESI-MS(m/z):1123.7[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.99(s,1H),9.76(s,1H),9.17(s,1H),8.78–8.75(m,2H),8.56(dd,J＝4.8,1.6Hz,1H),8.10(d,J＝7.5Hz,1H),8.00(dt,J＝8.0,1.9Hz,1H),7.93(d,J＝8.2Hz,2H),7.85(d,J＝8.6Hz,1H),7.62–7.39(m,8H),7.33(d,J＝8.6Hz,2H),7.01–6.96(m,2H),6.82(d,J＝15.9Hz,1H),5.98(t,J＝5.6Hz,1H),5.40(s,2H),5.09(s,2H),4.49(d,J＝5.9Hz,2H),4.38(q,J＝8.1Hz,1H),4.23(dd,J＝8.5,6.8Hz,1H),3.65–3.41(m,18H),3.04–2.91(m,2H),2.51–2.32(m,2H),1.97–1.94(m,1H),1.70–1.57(m,2H),1.44–1.33(m,2H),0.86–0.82(m,6H)。
实施例3连接子-毒素(化合物3)的制备
向50mL的圆底烧瓶中，依次加入4-((S)-2-(S)-2-(6-(2,5-二氧基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)苄基(五氟苯基)碳酸酯(3a，202mg，0.29mmol)、和DMA(2mL)，置换氮气三次，向其中加入HOBT(116mg，0.86mmol)，反应混合物室温搅拌1小时。向反应混合物中加入西达本胺(2b，112mg，0.29mmol)，反应混合物室温搅拌反应96小时。所得反应液直接经反相硅胶柱层析纯化(洗脱剂：乙腈/0.05％甲酸水溶液＝0：100％-35％:65％)，得式3所示化合物3(22mg)，ESI-MS(m/z):903.4[M+H]+。
实施例4连接子-毒素(化合物4)的合成
向50mL的圆底烧瓶中，依次加入4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺)-3-甲基丁酰氨基)-5-脲基戊酰胺基)苄基(4-硝基苯基)碳酸酯(4a，200mg,0.27mmol)、和无水N,N-二甲基乙酰胺(1mL)，置换氮气三次，向其中加入HOBT(109mg,0.54mmol)，反应混合物室温搅拌2hr，向其中加入西达本胺(2b，105mg,0.27mmol)，反应混合物室温搅拌72hr。减压蒸除溶剂，所得残渣经反相硅胶柱层析纯化(乙腈/0.05％甲酸水溶液＝0：100％-35％：65％)，得式4所示化合物4(18mg)，ESI-MS(m/z):989.5[M+H]+。
实施例5连接子-毒素(化合物5)的制备
参照实施例4中的方法，用恩替诺特(1b)代替实施例4中的西达本胺(2b)，得到式5所示化合物5(65mg)，ESI-MS(m/z):975.5[M+H]+。
实施例6连接子-毒素(化合物6)的制备
参照实施例4中的方法，用4-((2S，5S)-19-(2,5-二氧-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-5-异丙基-4,7,17-三氧-2-(3-脲基丙基)-10,13-二氧-3,6,16-三氮烷酰胺)苄基(4-硝基苯基)碳酸酯(6a)代替实施例4中的4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺)-3-甲基丁酰氨基)-5-脲基戊酰胺基)苄基(4-硝基苯基)碳酸酯(4a)，得到式6所示化合物6(55mg)，ESI-MS(m/z):1092.5[M+H]+。
实施例7：连接子-毒素(化合物7)的制备
化合物7b的制备：
向化合物7a(200mg,0.28mmol)的N,N-二甲基乙酰胺(0.5mL)溶液中加入西达本胺(2b，107.6mg,0.28mmol)和1-羟基苯并三氮唑(18.6mg,0.14mmol)，加毕于25℃下反应48小时。反应完成后，反应液经反相柱层析(乙腈：0.05％碳酸氢铵水溶液＝0:100％-40％:60％)纯化得到7b(94mg)，ESI-MS(m/z):933.4[M+H]+。
化合物7c的制备：
向化合物7b(94mg)的N,N-二甲基甲酰胺(0.8mL)溶液中加入二乙胺(0.2mL,2.76mmol)，反应液在25℃下反应过夜。反应完成后，反应液经反相柱层析(乙腈：0.05％甲酸水溶液＝0:100％-40％:60％)纯化，得到7c(51mg),ESI-MS(m/z):710.28[M+H]+。
化合物7的制备：
向化合物7c(29mg,0.04mmol)的N,N-二甲基甲酰胺(0.5mL)溶液中加入化合物7d(18mg,0.04mmol)，2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(13mg,0.04mmol),N,N-二异丙基乙胺(5mg,0.04mmol)，加毕于25℃反应过夜。反应完毕后，反应液经反相制备液相纯化(乙腈：0.05％甲酸水溶液＝0:100％-40％:60％)，得到式7所示化合物7(15mg)，ESI-MS(m/z):1213.8[M+H]+。
实施例8：连接子-毒素(化合物8)的制备
向含有搅拌子的5mL茄形瓶中依次加入化合物7c(29mg,0.04mmol)、1e(18mg,0.04mmol)和N,N-二甲基乙酰胺(0.5mL)。向其中加入N,N-二异丙基乙胺(6mg,0.05mmol)。加完于室温搅拌3小时。所得反应液反相柱层析纯化(洗脱剂：乙腈：0.05％甲酸水溶液＝0:100％-45％:65％)，得到式8所示化合物8(20mg,0.02mmol,54.3％)。ESI-MS(m/z):1037.5[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO)δ9.96(s,1H),9.79(s,1H),9.21(s,1H),8.82–8.76(m,2H),8.58(dd,J＝4.8,1.6Hz,1H),8.49(s,1H),8.20(d,J＝7.2Hz,1H),8.04–7.84(m,4H),7.61–7.44(m,8H),7.35(d,J＝8.8Hz,2H),7.03–6.98(m,2H),6.84(d,J＝16Hz,1H),5.11(s,2H),4.51(d,J＝6Hz,2H),4.44–4.36(m,1H),4.22(dd,J＝8.8,6.8Hz,1H),3.65–3.44(m,18H),2.49–2.33(m,2H),2.02–1.94(m,1H),1.32(d,J＝7.2Hz,3H),0.87(dd,J＝15.2,6.8Hz,6H)。
实施例9：连接子-毒素(化合物9)的制备
化合物9b的制备：
向化合物9a(5000mg,6.52mmol)的N,N-二甲基乙酰胺(50mL)溶液中加入西达本胺(2b,2545.6mg,6.52mmol)，HOBt(528.6mg,3.91mmol)，加毕于25℃下反应72小时。反应完成后，反应液经反相柱层析(乙腈：0.05％碳酸氢铵水溶液＝0:100％-40％:60％)纯化得到化合物9b(750mg)，ESI-MS(m/z):509.7[M/2+H]+。
化合物9c的制备：
向化合物9b(550mg,0.54mmol)的N,N-二甲基甲酰胺(5mL)溶液中加入二乙胺(0.5mL),反应混合物在25℃下反应过夜。反应完成后，反应经反相制备液相纯化得到化合物9c。ESI-MS(m/z):398.91[M/2+H]+。
化合物9的制备：
向化合物9c(31mg,0.04mmol)的N,N-二甲基乙酰胺(2mL)溶液中加入化合物9d(25mg,0.04mmol)和N,N-二异丙基乙胺(0.02mL,0.11mmol)，加毕于25℃反应18小时。反应完毕后，反应液经反相柱层析(乙腈：0.05％甲酸水溶液＝0:100％-50％:50％)纯化，得到式9所示化合物9(3mg),ESI-MS(m/z):650.33[M/2+H]+。
实施例10抗体-药物偶联物制备
10.1抗PD-L1抗体Atezolizumab(Ate抗体)的制备：
Atezolizumab(DrugBank Accession Number：DB11595)抗体基因由上海生工生物工程有限公司进行CHO密码子优化及合成，构建质粒，得到表达质粒pXC-Atezolizumab。
使用电转染的方法将质粒转入CHO细胞。经细胞筛选，培养表达，收集细胞发酵液，进行亲和层析后，得到Atezolizumab抗体(本申请中简写为Ate抗体或Ate)。
表1-1Atezolizumab抗体序列：
10.2抗PD-L1抗体Avelumab(Ave)的制备：
Avelumab(DrugBank Accession Number：DB11945)抗体基因由上海生工生物工程有限公司进行CHO密码子优化及合成，构建质粒，得到表达质粒pXC-Avelumab。
使用电转染的方法将质粒转入CHO细胞。经细胞筛选，培养表达，收集细胞发酵液，进行亲和层析后，得到Avelumab抗体(本申请中简写为Ave抗体或Ave)。
表1-2Avelumab抗体序列：
10.3抗体-药物偶联反应
ADC-1.1的制备：
缓冲盐溶液的配制：
缓冲溶液-1(Buffer-1)：取4.65g的L-组氨酸，溶解于1L超纯水中，采用0.1mol/L的冰醋酸调其pH＝5.50左右；经0.22μm的滤膜过滤除菌后，装瓶并置于4℃下短期储存，待用。
缓冲溶液-2(Buffer-2)：取8.96g的Na2HPO4·12H2O和3.90g的NaH2PO4·2H2O，分别溶于500mL超纯水中，互调pH其pH＝8.0(±0.05)，经0.22μm的滤膜过滤除菌后，装瓶并置于4℃下短期储存，待用。
抗体Buffer的置换：将Ate抗体原液置于4℃缓慢融化，利用超滤法置换到Buffer-1中，终浓度＞10mg/mL，并通过紫外分光光度计对其浓度进行测定。
抗体的还原：用移液枪精准移取抗体(1eq)，并补加一定量的Buffer-1，使得抗体的终浓度约为5mg/mL，随后加入8eq的10mmol/L TCEP溶液，混匀后，25℃恒温混匀，反应120min。
抗体的偶联：精确移取所需加入有机溶剂(DMA或DMSO)的体积，使其占总体积的10％。在有机溶剂中加入式2小分子荷载(10eq)，混匀后，将其缓慢加入到已经还原的抗体反应液中。25℃继续缓慢搅拌，偶联反应60min。
产物初步纯化：待终止反应结束后，采用超滤法将产物置换到Buffer-1中，短期储存置于4℃下，长期储存置于-80℃，待用。
DAR值检测：采用RP-HPLC的方法进行DAR值检测。检测条件为：色谱柱PLRP-S 8μm4.6*150mm；柱温80℃；流速0.8mL/min；进样量20μg；检测波长214&280nm；梯度洗脱0min30％B，5min 35％B，25min 45％B，26～30min 90％B，31～40min 30％B，其中，B为含0.1％TFA的ACN。样品处理：将样品用对应buffer稀释至3mg/mL，加入终浓度为20mM的DTT，混匀后直接进样分析。
平均DAR值计算：①分别计算L0、L1峰面积百分比(L0+L1峰面积百分比之和为100％)和H0、H1、H2、H3峰面积百分比(H0+H1+H2+H3峰面积百分比之和为100％)；②计算各峰加权百分比，即峰面积百分比*偶联药物数量，如H3加权比例＝H3峰面积百分比*3；③平均DAR值＝各峰加权百分比之和*2/100。
测得n为7.08。具体详见图1-1。
ADC-1.2的制备：
ADC-1.2的制备参照ADC-1.1的制备步骤和DAR值检测方法，用Ave抗体替换Ate抗体。且在抗体的还原时，加入4eq的10mmol/L的TCEP溶液。抗体的偶联时，加入的6eq小分子，其余条件一致。
测得n为3.37。具体详见图1-2。
ADC-1.3的制备：
ADC-1.3的制备参照ADC-1.1的制备步骤和DAR值检测方法，区别仅在于用Ave抗体替换Ate抗体。
测得n为4.74。具体详见图1-3。
ADC-1.4的制备：
ADC-1.4的制备参照ADC-1.1的制备步骤和DAR值检测方法，区别在于抗体还原时加入1.2eq的TCEP，偶联时加入4eq的小分子荷载。
测得n为1.94。具体详见图1-4。
ADC-1.5的制备：
ADC-1.5的制备参照ADC-1.1的制备步骤和DAR值检测方法，区别在于抗体还原时加入4eq的TCEP，偶联时加入6eq的小分子荷载。
测得n为4.71。具体详见图1-5。
ADC-1.6的制备：
ADC-1.6的制备参照ADC-1.1的制备步骤和DAR值检测方法，区别在于抗体还原时加入10eq的TCEP，偶联时加入14eq的小分子荷载。
测得n为7.66。具体详见图1-6。
ADC-2的制备:
ADC-2的制备参考ADC-1.1的制备方法和DAR值检测方法，区别仅在于用
式3所示结构替换式2。
测得n为6.34。具体详见图2。
ADC-3.1的制备：
ADC-3.1的制备参照ADC-1.1的制备方法和DAR值检测方法，区别仅在于用式4所示结构替换式2。
测得n为6.46。具体详见图3-1。
ADC-3.2的制备:
ADC-3.2的制备参照ADC-3.1的制备步骤和DAR值检测，区别仅在于，抗体的还原时，加入4eq的10mmol/L的TCEP溶液；抗体的偶联时，加入的6eq小分子。
测得n为4.99。具体详见图3-2。
ADC-3.3的制备：
ADC-3.3的制备参照ADC-3.1的制备步骤和DAR值检测方法，区别仅在于，在抗体的还原时，加入12eq的10mmol/L的TCEP溶液；抗体的偶联时，加入的14eq小分子，其余条件一致。
测得n为7.80。具体详见图3-3。
ADC-3.4的制备：
ADC-3.4的制备参照ADC-3.1的制备步骤和DAR值检测方法，区别仅在于Ave抗体替换Ate抗体；且在抗体的还原时，加入4eq的10mmol/L的TCEP溶液；抗体的偶联时，加入的6eq小分子，其余条件一致。
测得n为4.08。具体详见图3-4。
ADC-4的制备：
ADC-4的制备参照ADC-1.1的制备步骤和DAR值检测方法，用式5所示结构替换式2，其余条件一致。
测得n为5.43。具体详见图4。
ADC-5的制备：
ADC-5的制备参照ADC-1.1的制备步骤和DAR值检测方法，区别在于用式7小分子替式2小分子，抗体还原时加入12eq的TCEP，偶联时加入10eq的小分子荷载。
测得n为7.77。具体详见图5。
ADC-6的制备：
ADC-6的制备参照ADC-1.1的制备步骤和DAR值检测方法，区别在于用式8小分子替式2小分子，抗体还原时加入12eq的TCEP，偶联时加入10eq的小分子荷载。
测得n为7.66。具体详见图6。
ADC-7的制备：
ADC-7的制备参照ADC-1.1的制备步骤和DAR值检测方法，区别在于用式9小分子替式2小分子，抗体还原时加入12eq的TCEP，偶联时加入10eq的小分子荷载。
测得n为7.50。具体详见图7。
实施例11抗体-药物偶联物聚体检测
ADC检测仪器为Thermo vanquishi core，色谱柱为BioCore SEC-300 5μm 4.6×300mm；流动相为1X PBS；流速0.3mL/min；等度洗脱，分析时间20min，检测波长280nm。结果见表2。
表2抗体-药物偶联样品与裸抗SEC比较
其中：/表示不存在或未检出。
结果显示，抗体-药物偶联样品(如ADC-1.4，ADC-1.5，ADC-1.6，ADC-3.3、ADC-5，ADC-6，ADC-7)的纯度与对应裸抗相当。
实施例12抗体-药物偶联样品亲和力测定
SPR法检测亲和力
用Biacore T200检测抗体-药物偶联样品(如ADC-1.4、ADC-1.5、ADC-1.6、ADC-3.3)/裸抗(如Ate抗体)与Cyno PD-L1-his、hPD-L1-his、mPD-L1-his、Rat PD-L1-his之间的亲和力之间的亲和力。
方法如下：CM5芯片用N-Hydroxysuccinimide(NHS)：1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride(EDC)＝1v：1v活化后，固定anti-hisantibody并封闭。
将1ug/mL hPD-L1-his捕获到芯片表面，用1x PBST 2倍稀释ADC-3.3和Ate抗体，共稀释9个浓度点，稀释范围为25nM-0.39nM，设置程序，放入样品跑程序，数据用BiacoreEvaluation Software软件按照1:1Binding模型，进行动力学拟合。结果见表3-1和图8。
表3-1抗体-药物偶联样品(如ADC-3.3)与Ate抗体亲和力比较
| 配体 | 分析物 | ka(1/Ms) | kd(1/s) | KD(M) |
| hPD-L1-His | Ate抗体 | 1.26E+06 | <10-5 | <1x10-12 |
| hPD-L1-His | ADC-3.3 | 1.02E+06 | <10-5 | <1x10-12 |
将2ug/mL Cyno PD-L1-his捕获到芯片表面，用1x PBST 2倍稀释抗体-药物偶联样品及裸抗样品，共7个浓度点，样品浓度均为25nM-0.39nM，设置程序，放入样品跑程序，数据用Biacore Evaluation Software软件按照1:1Binding模型，进行动力学拟合。重复以上步骤，分别将2μg/mL hPD-L1-his、5μg/mL mPD-L1-his、5μg/mL Rat PD-L1-his捕获到芯片表面，用1x PBST 2倍稀释以上4个样品，其中Ate抗体和ADC-1.4设置8个浓度点，浓度范围均为25nM-0.39nM，ADC-1.5、ADC-1.6设置9个点，浓度范围均为50nM-0.19nM，设置程序，放入样品跑程序，数据用Biacore Evaluation Software软件按照1:1Binding模型，进行动力学拟合。结果见表3-2和图9～图24。
表3-2抗体-药物偶联样品与Ate抗体亲和力比较
| 配体 | 分析物 | ka(1/Ms) | kd(1/s) | KD(M) |
| hPD-L1-His | Ate抗体 | 2.46E+06 | <1.00E-05 | <1.00E-12 |
| hPD-L1-His | ADC-1.4 | 1.88E+06 | <1.00E-05 | <1.00E-12 |
| hPD-L1-His | ADC-1.5 | 1.12E+06 | <1.00E-05 | <1.00E-12 |
| hPD-L1-His | ADC-1.6 | 1.09E+06 | <1.00E-05 | <1.00E-12 |
| Cyno PD-L1-His | Ate抗体 | 1.58E+06 | 1.30E-04 | 8.26E-11 |
| Cyno PD-L1-His | ADC-1.4 | 1.28E+06 | 9.49E-05 | 7.43E-11 |
| Cyno PD-L1-His | ADC-1.5 | 1.00E+06 | 4.24E-05 | 4.24E-11 |
| Cyno PD-L1-His | ADC-1.6 | 8.94E+05 | 1.96E-05 | 2.19E-11 |
| mPD-L1-His | Ate抗体 | 1.76E+06 | 1.19E-04 | 6.74E-11 |
| mPD-L1-His | ADC-1.4 | 1.39E+06 | 1.09E-04 | 7.87E-11 |
| mPD-L1-His | ADC-1.5 | 8.10E+05 | 9.57E-05 | 1.18E-10 |
| mPD-L1-His | ADC-1.6 | 8.01E+05 | 8.81E-05 | 1.10E-10 |
| Rat-PD-L1-His | Ate抗体 | 2.86E+06 | 9.81E-04 | 3.43E-10 |
| Rat-PD-L1-His | ADC-1.4 | 2.27E+06 | 1.00E-03 | 4.41E-10 |
| Rat-PD-L1-His | ADC-1.5 | 1.26E+06 | 9.32E-04 | 7.39E-10 |
| Rat-PD-L1-His | ADC-1.6 | 6.40E+05 | 7.80E-04 | 1.22E-09 |
由结果可知，本申请的抗体-药物偶联样品(如ADC-1.4、ADC-1.5、ADC-1.6、ADC-3.3)与Cyno PD-L1-his、hPD-L1-his、mPD-L1-his、Rat PD-L1-his间的亲和力与裸抗(如Ate抗体)相当。
实施例13抗体-药物偶联样品对细胞总乙酰化水平的影响
本申请的ADC分子(如ADC-1.4、ADC-1.5、ADC-1.6)对NCI-H292细胞组蛋白H4乙酰化水平影响的检测
①收集NCI-H292细胞，取20μL计数；②将细胞重悬至1×10^5个/mL；
③按100ul/孔加入48孔板中，37℃，5％ CO2过夜培养；④按照设定浓度稀释ADC分子，使加入的ADC分子携带的西达本胺浓度一致(均为19μM)，以100μL/孔加入对应孔中，37℃，5％ CO2培养48h；⑤吸弃上清，加入100μL/孔胰酶消化，300μL培养基终止，重悬细胞1.5mL离心管，室温300rcf离心5min；⑥每管加入固定液(4％多聚甲醛)200μL，立即吹打2-3次，4℃孵育15min；⑦每管加入1mL PBS洗一次，700rcf离心5min后弃上清；⑧每管加入50μL破膜液(1％ Triton X-100)，立即吹打2-3次，室温孵育15min；⑨加入Anti-acetyl-Histone H4Antibody-PE，0.5μL/管，室温避光孵育1h；⑩每管加入1mL破膜液洗一次，900rcf离心5分钟后弃上清；每管加入100μL破膜液，吹打混匀后利用流式细胞仪检测；数据通过Graphpad Prism 9.0处理，结果见图25。
由结果可知，本申请的抗体-药物偶联样品ADC(如ADC-1.4、ADC-1.5、ADC-1.6)对NCI-H292细胞组蛋白H4乙酰化有明显的促进作用。
实施例14游离毒素检测
RP-HPLC的方法检测抗体-药物偶联物样品(如ADC-1.4、ADC-1.5、ADC-1.6、ADC-3.3)中的游离连接子-毒素。
HPLC分析条件：
仪器：Waters e2695
色谱柱：C18 3.5μm,4.6×150mm column
流动相A：0.1％TFA in water
流动相B：0.1％TFA in ACN
检测波长：254nm
流速：0.5mL/min
洗脱梯度：0～30min 10％～80％B，31～35min 10％B
样品处理：取待测供试品(如ADC-1.4、ADC-1.5、ADC-1.6、ADC-3.3)85μg，用3μLDMSO混合样品5min，然后饱和氯化钠上清(溶于30％甲醇乙腈)60μL加入到供试品中，混匀10min，2000rpm离心2min，取上清液测试。
数据分析：连接子-毒素浓度分别为0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、5μg/mL作为标准品进样，绘制标准曲线。若样品中存在游离连接子-毒素，则将其峰面积带入线性方程，计算浓度。结果见图26。
由结果可知，本申请的抗体-药物偶联样品ADC(如ADC-1.4、ADC-1.5、ADC-1.6、ADC-3.3)未检测到游离的连接子-毒素。
实施例15血浆稳定性检测。
不同种属血浆中本申请的抗体-药物偶联物样品(如ADC-1.6)血浆稳定性检测
具体操作如下：
用无菌PBS将抗体-药物偶联物样品配制成浓度为1mg/mL的储备液，现配现用。配制过程在无菌环境中完成，所有试剂瓶或容器需经灭菌处理。
各种属(人、食蟹猴、SD大鼠、C57小鼠)血浆在室温下轻柔混匀，分别吸取3600μL各种属血浆，加入400μL的供试品工作液，配制成供试品终浓度为100μg/mL的样品，轻摇，混匀，待用。
本温孵实验的反应终体系为200μL，每个时间点样品重复2个。分别在37℃无菌条件下温孵0h、4h、8h、24h、48h、72h、120h和168h后收集样品。所有操作均在无菌和避光条件下进行。各终止时间点的样品冻存于-70℃～-90℃。
待取样完成，将样品用RP-HPLC的方法进行检测。
HPLC分析条件：
仪器：AB SCIEX TRIPLE QUADTM 4500液质联用仪
色谱柱：Bridge BEH C18,2.5μm,2.1×50mm，Waters
流动相A：0.1％FA 2mmol/L甲酸铵水溶液
流动相B：CAN
强洗溶液(SNW)：MeOH:ACN:IPA:DMSO＝1:1:1:1(含0.5％的FA)，v/v/v/v弱洗溶液(WNW)：MeOH:H2O＝1:1，v/v
样品处理步骤：
将样品涡旋混匀；按照Plate map分别转移20μL样品至96孔板中；向DB、Carryover样品中加入20μL ACN:H2O＝1:1，v/v；其余孔位中加入20μL内标工作液(1000.000ng/mL甲苯磺丁脲内标工作液)；涡旋1min后，向所有孔位中加入160μL含0.1％的FA的ACN:MeOH＝1:1；封膜，1000rpm下涡旋混匀5min在4℃，4700g条件下离心10min；按照Plate map分别对应转移100μL上清液至新的96孔板中；封膜，进样分析。计算结果见表4及图27。
表4抗体-药物偶联样品血浆稳定性
其中，NA表示未检测到
由结果可知，Ate抗体在不同种属血浆中未检测到小分子药物，本申请的抗体-药物偶联样品ADC(如ADC-1.6)在人、食蟹猴、SD大鼠、C57小鼠四个种属血浆中37℃孵育168h的脱落率＜1.0％，整体比较稳定。
实施例16抗体-药物偶联样品(ADC)在肿瘤细胞中的内吞检测
本申请的抗体-药物偶联物样品(如ADC-1.6)在人肺癌细胞系NCI-H292细胞中的内吞检测
①收集NCI-H292细胞，取20μL计数；②将细胞重悬至6×10^6个/mL，100μL/管加入2个1.5mL EP管中；③分别加入稀释好的抗体-药物偶联ADC组及抗体组样品，100μL/管，样品终浓度为150nM，混匀后，4℃避光孵育1h；④加入预冷的PBS洗2次，4℃，1200rpm离心5min，弃上清；⑤300μL/管加入完全培养基重悬细胞，吸取150μL细胞悬液放入新的EP管中，其中一管继续置于4℃，另一管置于37℃孵育；⑥于2h，4h和22h后分别从4℃和37℃管中取50μL细胞悬液，置于新的EP管中，每管加入1mL预冷的PBS，4℃，1200rpm离心5min后弃上清；⑦0.5μl/管加入二抗，混匀后，4℃避光孵育30min；⑧加入预冷的PBS洗一次，4℃，1200rpm离心5min，弃上清；⑨100μL/管加入预冷的PBS，重悬细胞后上机检测。⑩内吞率通过以下公式计算：Internalization(％)＝阳性率4℃(％)-阳性率37℃(％)，其中阳性率4℃(％)为置于4℃孵育的细胞的阳性率，阳性率37℃(％)为置于37℃孵育的细胞的阳性率，数据通过Graphpad Prism 9.0处理，结果见图28。
由结果可知，抗体-药物偶联ADC组(如ADC-1.6)及抗体组(如Ate抗体)肿瘤细胞内吞率随时间增加，抗体-药物偶联ADC组肿瘤细胞内吞率明显优于抗体组。
实施例17抗体-药物偶联样品对肿瘤细胞的抑制作用
17.1本申请的ADC(如ADC-3.3)分子对CT26-hPD-L1细胞增殖抑制检测
①收集CT26 hPD-L1-EX细胞，取20μL计数；②将细胞分别重悬至0.5×10^5个/mL和0.5×10^5个/mL各5mL；③按50μL/孔分别加入两块96孔板中，37℃，5％ CO2培养过夜；④按照设定浓度稀释ADC样品，100μL/孔加入孔板中，⑤37℃，5％ CO2培养48h；⑥先吸弃50ul培养液，然后再20μL/孔加入MTS试剂,37℃，5％ CO2继续培养1～4h；⑦490nm处读数。结果见图29和表5。
表5抗体-药物偶联样品ADC-3.3对CT26细胞的抑制
由结果可知，本申请的抗体-药物偶联样品ADC(如ADC-3.3)对CT26-hPD-L1细胞增殖有明显的抑制作用，且其抑制效果显著优于单独的小分子药物(如西达本胺、Chidamide)、单独的裸抗(如Ate抗体)、以及小分子药物和裸抗的联合作用(如Chidamide+Ate抗体，即Chi+Ate)。
17.2本申请的ADC分子(如ADC-1.6)对结直肠癌细胞系CT26细胞增殖抑制检测
①收集CT26 hPD-L1-EX细胞，取20μL计数；②将细胞重悬至2×10^5个/mL；③50μL/孔接种于96孔板中(1×10^4个细胞/孔)，37℃，5％CO2培养过夜；④次日，取出96孔板，用含10％ FBS的完全培养基稀释样品，50μL/孔加入板中，使样品终浓度为10μM，记为Day 0。37℃，5％CO2继续培养2天；⑤Day 2：显微镜下观察细胞生长状态后，10μL/孔加入CCK8,37℃，5％CO2继续培养4h；⑥实时于酶标仪上读取450nm处吸光度值(OD450)，结果见图30和表6。
表6抗体-药物偶联样品ADC-1.6对CT26细胞的抑制
由结果可知，抗体-药物偶联ADC组(如ADC-1.6)对CT26 hPD-L1-EX细胞增殖抑制效果大于小分子药物组(如西达本胺，Chidamide)、抗体组(如Ate抗体)和联用组(如Chidamide+Ate抗体，即Chi+Ate)。
17.3本申请的ADC分子(如ADC-1.6)对人外周血单个核细胞PBMC和人恶性黑色素瘤细胞系A375共培养体系下人恶性黑色素瘤细胞系A375的抑制作用的检测
具体操作如下：
将冻存的PBMC从液氮罐中取出，加入8mL预热的RPMI 1640培养基中，500g离心10min；弃上清，用少量RPMI 1640培养基重悬PBMC，稀释10倍，取20μL计数；将细胞重悬至5E6个/mL；收集A375-hPDL1-Luciferase细胞悬液，取20μL计数；将细胞重悬至1E6个/mL；等体积混合PBMC和A375-hPDL1-Luciferase细胞悬液，制备E:T＝5:1的细胞混合液，用RPMI1640完全培养基补齐至1500μL；将matrigel置于冰上融化，分别取1500μL的matrigel与细胞混合液混合，20μL/孔加入黑色384孔板中，置于37℃凝固10min；将ADC-1.6和Ate抗体稀释成5μM，1μM，0.2μM，0.04μM，0.008μM，0.0016μM，0μM的稀释液，Chidamide稀释成200μM，40μM，8μM，1.6μM，0.32μM，0.064μM，0.0128μM，0μM的稀释液；每个样品8个浓度梯度，3个重复，按30μL/孔加入384孔板中，37℃，5％CO2培养6天；取出384孔板，按20μL/孔加入Bio-LiteLuciferase Assay System，孵育5～10min，用多功能酶标仪检测，结果见图31、图32和表7。
表7抗体-药物偶联样品ADC-1.6对A375细胞的抑制
| Ate抗体 | ADC-1.6 | Combo(Chidamide:Ate抗体＝8:1) | Chidamide | |
| IC50(μM) | 1.09E+08 | ＜0.01 | 0.03206 | 0.8232 |
由结果可知，抗体-药物偶联ADC组(如ADC-1.6)组的IC50＜0.01μM；而Ate抗体组，Chidamide组和联用组(Chidamide：Ate抗体＝8:1)组的IC50都＞0.03μM。抗体-药物偶联ADC组(如ADC-1.6)相较于小分子组(如Chidamide)、抗体组(如Ate抗体)和联用组(如Chidamide+Ate抗体，即Chi+Ate)在更低浓度下对A375-hPDL1-Luciferase细胞有明显的增殖抑制效果。在0.008μM浓度下，抗体-药物偶联ADC组(如ADC-1.6)对A375-hPDL1-Luciferase细胞增殖抑制效果明显大于小分子药物组(如Chidamide)、抗体组(如Ate抗体)和联用组(如Chidamide+Ate抗体，即Chi+Ate)。
实施例18抗体-药物偶联样品ADC的抗肿瘤药效
使用C57BL/6J小鼠MC38肿瘤模型进行本申请抗体-药物偶联ADC(如ADC-1.6)的体内药效学研究
18.1具体方法如下：细胞接种当天每只C57BL/6J小鼠皮下接种3×105个MC38细胞(0.1mL/只)。当小鼠平均瘤体约为70-80mm3时进行分组，24只小鼠被分为3组，分组当天开始给药。给药周期为一周三次，给药方式为腹腔注射。裸抗组和药物偶联样品ADC组分别腹腔注射10mg/kg Ate抗体和ADC-1.6，溶媒对照组(Vehicle)腹腔注射等体积PBS溶液。开始给药后，每周测量体重和肿瘤体积三次，肿瘤体积计算方法：肿瘤体积(mm3)＝0.5×肿瘤长径×肿瘤短径2。给药后第7天结束实验，对所有小鼠进行安乐死处理，取肿瘤组织进行称重。抗体-药物偶联样品ADC的体内抗肿瘤效果见图33。
由结果可知，本申请的抗体-药物偶联样品ADC-1.6在给药后第7天肿瘤体积为455.74mm3，裸抗组和溶媒对照组肿瘤体积分别为701.09mm3、821.79mm3。抗体-药物偶联样品ADC-1.6组肿瘤抑制率TGI(％)为48.97％，较溶媒对照组有显著性差异(P<0.05)，且其抑制效果显著优于Ate抗体组(TGI＝16.26％)。
18.2具体方法如下：细胞接种当天每只C57BL/6J小鼠皮下接种3×105个MC38细胞(0.1mL/只)。当小鼠平均瘤体约为50-60mm3时进行分组，24只小鼠被分为3组，分组当天开始给药。给药周期为一周三次，给药方式为腹腔注射；联用组(Ate抗体+Chidamide)腹腔注射10mg/kg mAb和0.2mg/kg西达本胺；药物偶联样品ADC组腹腔注射10mg/kg ADC-1.6；溶媒对照组(Vehicle)腹腔注射等体积PBS溶液。开始给药后，每周测量体重和肿瘤体积三次，肿瘤体积计算方法：肿瘤体积(mm3)＝0.5×肿瘤长径×肿瘤短径2。给药后第7天结束实验，对所有小鼠进行安乐死处理，取肿瘤组织进行称重。抗体-药物偶联样品ADC的体内抗肿瘤效果见图34。
由结果可知，本申请的抗体-药物偶联样品ADC-1.6在给药后第7天肿瘤体积为329.63mm3，联用组和溶媒对照组肿瘤体积分别为457.35mm3、499.89mm3。抗体-药物偶联样品ADC-1.6TGI(％)为38.26％，较溶媒对照组有显著性差异(P<0.05)，且其抑制效果显著优于联用组(TGI＝9.63％)。
本发明已通过各个具体实施例作了举例说明。但是，本领域普通技术人员能够理解，本发明并不限于各个具体实施方式，普通技术人员在本发明的范围内可以作出各种改动或变型，并且在本说明书中各处提及的各个技术特征可以相互组合，而仍不背离本发明的精神和范围。这样的改动和变型均在本发明的范围之内。
Claims (15)
1.一种式I所示的化合物或其立体异构体、或其互变异构体、或其药学上可接受的盐、或其氘代化合物、或其溶剂化物，
其中：
L1选自
优选地，L1的碳端与丁二酰亚胺的N相连接，羰基端与L2相连接；
m和t各自独立的选自：0、1、2、3、4、5、6、7和8；
q为0、1、2或3；
p为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15；
X选自：CH2、O和NH；
L2不存在，或为氨基酸残基，或为由2-10个氨基酸残基组成的肽残基；
优选地，L2的氨基端与L1相连接，羰基端与L3相连接；
优选地，所述氨基酸包括但不限定于苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、缬氨酸(V)、赖氨酸(K)、丝氨酸(S)、谷氨酸(E)、天冬氨酸(N)、精氨酸(R)、丙氨酸(A)、瓜氨酸、半胱氨酸(C)；
L3不存在，或选自
优选地，L3的氨基酸与L2相连接，羰基端或碳端与D相连接；
D为组蛋白脱乙酰基酶抑制剂药物，其选自基于硫醇的组蛋白脱乙酰基酶抑制剂、基于异羟肟酸的组蛋白脱乙酰基酶抑制剂或基于苯甲酰胺的组蛋白脱乙酰基酶抑制剂。
2.根据权利要求1所述的化合物或其立体异构体、或其互变异构体、或其药学上可接受的盐、或其氘代化合物、或其溶剂化物，其特征在于，
所述L1选自：
优选地，L1选自：
优选地，m选自：0、1、2、3、4和5；更优选地，m选自1、3、4；
优选地，t选自：0、1、2、3、4、5、6和7；更优选地，t选自1、2、3、7；
优选地，q选自0、1、2；
优选地，p选自10、11、12、13、14、15；更优选地，p选自11、12、13；进一步优选地，p为12；
优选地，X选自O和NH；
更优选地，L1选自
更优选地，L1选自
进一步优选地，L1选自
更进一步优选地，L1为
更进一步优选地，L1为
3.根据权利要求1-2任一项所述的化合物、或其立体异构体、或其互变异构体、或其药学上可接受的盐、或其氘代化合物、或其溶剂化物，其特征在于，
L2不存在，或为氨基酸残基，或为由2-4个氨基酸残基组成的肽残基；
优选地，所述氨基酸包括但不限定于苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、缬氨酸(V)、丙氨酸(A)、瓜氨酸、半胱氨酸；
更优选地，所述氨基酸包括但不限定于苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、缬氨酸(V)、丙氨酸(A)、瓜氨酸；
优选地，L2不存在，或为瓜氨酸残基，或选自以下肽残基：缬氨酸残基-丙氨酸残基、缬氨酸残基-瓜氨酸残基、甘氨酸氨基-甘氨酸残基-苯丙氨酸残基-甘氨酸残基、缬氨酸残基-丙氨酸残基-苯丙氨酸残基-甘氨酸残基、甘氨酸残基-甘氨酸残基-甘氨酸残基、甘氨酸残基-苯丙氨酸残基-甘氨酸残基、缬氨酸残基-半胱氨酸-苯丙氨酸残基-甘氨酸残基；
更优选地，L2不存在，或为瓜氨酸残基，或选自以下肽残基：缬氨酸残基-丙氨酸残基、缬氨酸残基-瓜氨酸残基、甘氨酸氨基-甘氨酸残基-苯丙氨酸残基-甘氨酸残基、缬氨酸残基-丙氨酸残基-苯丙氨酸残基-甘氨酸残基；
进一步优选地，所述L2不存在，或选自
更进一步优选地，所述L2不存在，或选自
或者更进一步优选地，L2不存在，或选自
最优选地，L2不存在，或选自
4.根据权利要求1-3任一项所述的化合物、或其立体异构体、或其互变异构体、或其药学上可接受的盐、或其氘代化合物、或其溶剂化物，其特征在于，
D为基于苯甲酰胺的组蛋白脱乙酰基酶抑制剂；
优选地，D选自
其中，
A为苯基或吡啶基，且所述苯基或吡啶基各自独立任选地被1-4个选自以下的取代基所取代：卤素、C1-C4烷基(如甲基、乙基)、C1-C4卤代烷基(如三氟甲基)；
优选地，A为苯基或吡啶基，且所述苯基或吡啶基各自独立任选地被1-2个选自以下的取代基所取代：卤素、C1-C4烷基(如甲基、乙基)、三氟甲基；
更优选地，A为吡啶基，且所述吡啶基任选地被1-2个选自以下的取代基所取代：C1-C4烷基；
进一步优选地，A为吡啶基；
最优选地，A为
B为亚苯基；
优选地，B为
Y为-CO-NH-CH2-；
优选地，Y的亚甲基端与B相连接，羰基端与烯基碳或O相连接；
R1、R2各自独立地选自氢、C1-C4烷基；
优选地，R1、R2均为氢；
X1、X2、X3、X4中，任意一个选自氢、卤素、C1-C4烷基，其余三个为氢；
优选地，X1、X2、X3、X4中，任意一个选自氢、卤素，其余三个为氢；
更优选地，X1、X2、X3、X4中，任意一个选自氢、氟，其余三个为氢；
最优选地，X2选自氢、氟，X1、X3、X4为氢；
更优选地，D选自
5.根据权利要求1-4任一项所述的化合物或其立体异构体、或其互变异构体、或其药学上可接受的盐、或其氘代化合物、或其溶剂化物，其特征在于，所述化合物选自：
6.权利要求1-5任一项所示的化合物或其立体异构体、或其互变异构体、或其药学上可接受的盐、或其氘代化合物、或其溶剂化物在制备配体药物偶联物(如抗体药物偶联物)中的用途。
7.一种式II所示的配体药物偶联物或其立体异构体、或其互变异构体、或其药学上可接受的盐、或其氘代化合物、或其溶剂化物，
其中：
Ab为配体，选自蛋白、抗体、多肽、酶和小分子；
n为0.5至8.5之间的数；例如n为0.8至5之间的数，1至4之间的数，2至6之间的数，3至7之间的数，4至8之间的数，3.5至8.5之间的数，3.5至4.5之间的数，或6.5至8.5之间的数；优选地，n约为2、3、4、5、6、7或8；更优选地，n约为3、4、5、6、7或8；
L1选自
优选地，L1的碳端与丁二酰亚胺的N相连接，羰基端与L2相连接；
m和t各自独立的选自：0、1、2、3、4、5、6、7和8；
q为0、1、2或3；
p为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15；；
X选自：CH2、O和NH；
L2不存在，或为氨基酸残基，或为由2-10个氨基酸残基组成的肽残基；
优选地，L2的氨基端与L1相连接，羰基端与L3相连接；
优选地，所述氨基酸包括但不限定于苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、缬氨酸(V)、赖氨酸(K)、丝氨酸(S)、谷氨酸(E)、天冬氨酸(N)、精氨酸(R)、丙氨酸(A)、瓜氨酸、半胱氨酸(C)；
L3不存在，或选自
优选地，L3的氨基酸与L2相连接，羰基端或碳端与D相连接；
D为组蛋白脱乙酰基酶抑制剂药物，其选自基于硫醇的组蛋白脱乙酰基酶抑制剂、基于异羟肟酸的组蛋白脱乙酰基酶抑制剂或基于苯甲酰胺的组蛋白脱乙酰基酶抑制剂。
8.根据权利要求7所述的配体药物偶联物或其立体异构体、或其互变异构体、或其药学上可接受的盐、或其氘代化合物、或其溶剂化物，其特征在于，所述L1选自：
优选地，L1选自：
优选地，m选自：0、1、2、3、4和5；更优选地，m选自1、3、4；
优选地，t选自：0、1、2、3、4、5、6和7；更优选地，t选自1、2、3、7；
优选地，q选自0、1、2；
优选地，p选自10、11、12、13、14、15；更优选地，p选自11、12、13；进一步优选地，p为12；
优选地，X选自O和NH；
更优选地，L1选自
更优选地，L1选自
进一步优选地，L1选自
更进一步优选地，L1为
更进一步优选地，L1为
9.根据权利要求7-8任一项所述的配体药物偶联物或其立体异构体、或其互变异构体、或其药学上可接受的盐、或其氘代化合物、或其溶剂化物，其特征在于，
L2不存在，或为氨基酸残基，或为由2-4个氨基酸残基组成的肽残基；
优选地，所述氨基酸包括但不限定于苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、缬氨酸(V)、丙氨酸(A)、瓜氨酸、半胱氨酸；
更优选地，所述氨基酸包括但不限定于苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、缬氨酸(V)、丙氨酸(A)、瓜氨酸；
优选地，L2不存在，或为瓜氨酸残基，或选自以下肽残基：缬氨酸残基-丙氨酸残基、缬氨酸残基-瓜氨酸残基、甘氨酸氨基-甘氨酸残基-苯丙氨酸残基-甘氨酸残基、缬氨酸残基-丙氨酸残基-苯丙氨酸残基-甘氨酸残基、甘氨酸残基-甘氨酸残基-甘氨酸残基、甘氨酸残基-苯丙氨酸残基-甘氨酸残基、缬氨酸残基-半胱氨酸-苯丙氨酸残基-甘氨酸残基；
更优选地，L2不存在，或为瓜氨酸残基，或选自以下肽残基：缬氨酸残基-丙氨酸残基、缬氨酸残基-瓜氨酸残基、甘氨酸氨基-甘氨酸残基-苯丙氨酸残基-甘氨酸残基、缬氨酸残基-丙氨酸残基-苯丙氨酸残基-甘氨酸残基；
进一步优选地，所述L2不存在，或选自
更进一步优选地，所述L2不存在，或选自
或者更进一步优选地，L2不存在，或选自
最优选地，L2不存在，或选自
10.根据权利要求7-9任一项所述的配体药物偶联物或其立体异构体、或其互变异构体、或其药学上可接受的盐、或其氘代化合物、或其溶剂化物，其特征在于，
D为基于苯甲酰胺的组蛋白脱乙酰基酶抑制剂；
优选地，D选自
其中，
A为苯基或吡啶基，且所述苯基或吡啶基各自独立任选地被1-4个选自以下的取代基所取代：卤素、C1-C4烷基(如甲基、乙基)、C1-C4卤代烷基(如三氟甲基)；
优选地，A为苯基或吡啶基，且所述苯基或吡啶基各自独立任选地被1-2个选自以下的取代基所取代：卤素、C1-C4烷基(如甲基、乙基)、三氟甲基；
更优选地，A为吡啶基，且所述吡啶基任选地被1-2个选自以下的取代基所取代：C1-C4烷基；
进一步优选地，A为吡啶基；
最优选地，A为
B为亚苯基；
优选地，B为
Y为-CO-NH-CH2-；
优选地，Y的亚甲基端与B相连接，羰基端与烯基碳或O相连接；
R1、R2各自独立地选自氢、C1-C4烷基；
优选地，R1、R2均为氢；
X1、X2、X3、X4中，任意一个选自氢、卤素、C1-C4烷基，其余三个为氢；
优选地，X1、X2、X3、X4中，任意一个选自氢、卤素，其余三个为氢；
更优选地，X1、X2、X3、X4中，任意一个选自氢、氟，其余三个为氢；
最优选地，X2选自氢、氟，X1、X3、X4为氢；
更优选地，D选自
11.根据权利要求7-10任一项所述的配体药物偶联物或其立体异构体、或其互变异构体、或其药学上可接受的盐、或其氘代化合物、或其溶剂化物，其特征在于，
所述Ab为抗体，非限制性地选自：抗EGFR抗体、抗CD20抗体或抗PD-L1抗体；
优选地，Ab非限制性地选自西妥昔单抗(Cxtuximab)，帕尼单抗(Panitumumab)，耐昔妥珠单抗(Necitumumab)，利妥昔单抗(Rituximab)，托西莫单抗(Tositumomab+Iodine131Tositumomab)，奥法木单抗(Ofatumumab)，阿托珠单抗(Obinutuzumab),奥瑞珠单抗(Ocrelizumab)，阿替利珠单抗(Atezolizumab)，阿维鲁单抗(Avelumab)，度伐利尤单抗(Durvalumab)，西米普利单抗(Cemiplimab-rwlc)；
进一步优选地，Ab为阿替利珠单抗(Atezolizumab)、阿维鲁单抗(Avelumab)。
12.根据权利要求7-11任一项所述的配体药物偶联物或其立体异构体、或其互变异构体、或其药学上可接受的盐、或其氘代化合物、或其溶剂化物，其特征在于，所述配体药物偶联物选自：
13.根据权利要求7-12任一项所述的配体药物偶联物或其立体异构体、或其互变异构体、或其药学上可接受的盐、或其氘代化合物、或其溶剂化物，其特征在于，所述配体药物偶联物选自：
14.一种药物组合物，其包含至少一种权利要求1-5任一项所述的化合物或其立体异构体、或其互变异构体、或其药学上可接受的盐、或其氘代化合物、或其溶剂化物；或者包含至少一种权利要求7-13任一项所述的配体药物偶联物或其立体异构体、或其互变异构体、或其药学上可接受的盐、或其氘代化合物、或其溶剂化物；任选地，还包含药学上可接受的载体或赋形剂。
15.权利要求1-5任一项所述的化合物或其立体异构体、或其互变异构体、或其药学上可接受的盐、或其氘代化合物、或其溶剂化物，或者权利要求7-13任一项所述的配体药物偶联物或其立体异构体、或其互变异构体、或其药学上可接受的盐、或其氘代化合物、或其溶剂化物，或者权利要求14所述的药物组合物在制备治疗或预防疾病的药物中的用途；
优选地，所述疾病为肿瘤。
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