CN113292465B - 一种半胱氨酸衍生物及其合成方法、应用 - Google Patents

一种半胱氨酸衍生物及其合成方法、应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及抗肿瘤药物技术领域，具体涉及一种半胱氨酸衍生物、其合成方法，及其作为组蛋白去乙酰化酶抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。该半胱氨酸衍生物对HDAC有潜在抑制效果，在体内外均能明显抑制HDAC从而产生抗肿瘤活性；本发明合成原料相对便宜、成本较低，有望成为对HDAC高效抑制的新型HDAC抑制剂类抗肿瘤药物。

Description

一种半胱氨酸衍生物及其合成方法、应用
技术领域
本发明涉及抗肿瘤药物技术领域，具体涉及一种半胱氨酸衍生物及其合成方法，及其作为组蛋白去乙酰化酶抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂已经在临床上用于治疗肿瘤疾病，并表现出良好的临床应用前景。HDAC抑制剂对肿瘤细胞的主要作用是抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞周期阻滞、诱导肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤新血管的生成等。HDAC抑制剂作为一类新型的抗肿瘤药物具有非常重要的研发价值。
目前，HDAC抑制剂根据结构可分为：异羟肟酸(hydroxamic acid)类(如SAHA)、环氧酮结构的环四肽类(如trapoxinA)、苯甲酰胺(benzam ides)类(如M S-275)、不含环氧酮结构的环肽类、短链和芳香脂肪酸类(如丁酸钠、苯丁酸钠)及杂环化合物类(如depudecin)。其中已经上市的HDAC抑制剂包括Vorinostat(SAHA,Zolina)、romidepsin(Istodax,FK228,FR901228，depsipeptide)、belinostat(Beleodaq,PXD-101)、Panobinostat(LBH-589，Farydak)、西达本胺(Chidamide)。根据已经上市的HDAC抑制剂的结构特点，其主要包含锌离子鳌合部分(ZBG)、连接部分(Linker)和表面部分(SurfaceRecognition，Cap)三个部分。ZBG部分与活性口袋底部的锌离子进行配位，通常为异羟肟酸、苯甲酞胺、梭酸或亲电酮等。Linker主要占据疏水管状通道，以保证其他两部分的正确取向，通常为链状烷烃、肉桂酞基、芳香基或杂环芳香基等。Cap与结合口袋入口处的氨基酸残基紧密接触，产生相互作用。
虽然大多数HDAC抑制剂包括临床上和以上市的已显示出有效的抗癌活性，但是，它们通常仅限于血液肿瘤(如皮肤T细胞淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤等)的治疗，对实体肿瘤(如肺癌、乳腺癌等)往往显示出较弱的治疗作用，这严重限制了它们在癌症治疗中的应用。
发明内容
针对以上技术问题，本发明提供一种半胱氨酸衍生物，其是基于HDAC底物乙酰化赖氨酸设计的一类新的HDAC抑制剂，该衍生物在体外对HDAC具有抑制活性，并且在体内对实体肿瘤(乳腺癌和非小细胞肺癌)具有生长抑制作用。
本发明提供的半胱氨酸衍生物，其结构式如式(I)-(III)所示：
Figure BDA0003119675920000021
上述半胱氨酸衍生物能够用作组蛋白去乙酰化酶抑制剂。
上述半胱氨酸衍生物能够用于制备抗肿瘤的药物。
优选地，所述肿瘤为实体肿瘤。
优选地，所述肿瘤为乳腺癌、非小细胞肺癌、肝癌、宫颈癌或血液瘤。
本发明还提供了上述半胱氨酸衍生物的合成方法，包括以下步骤：
S1、取N-((苄氧基)羰基)-S-(4-(叔丁氧基)-4-氧代丁基)-L-半胱氨酸溶解后在催化剂A作用下与苯胺进行酰胺缩合反应，得到的产物除去溶剂后，依次洗涤、干燥、浓缩、柱层析纯化，得浅黄色固体；
S2、将所述浅黄色固体溶解后加入三氟乙酸，室温反应3-3.5h，除去溶剂，柱层析纯化，得到(R)-4-((2-((苄氧基)羰基)氨基)-3-羰基-3(苯氨基)丙基)硫代)丁酸；
S3、取所述(R)-4-((2-((苄氧基)羰基)氨基)-3-羰基-3(苯氨基)丙基)硫代)丁酸溶解后在催化剂B作用下与盐酸羟胺进行酰胺缩合反应，所得产物除去溶剂后，依次洗涤、干燥、浓缩、柱层析纯化，即得所述式(I)化合物；
所述式(II)化合物的合成方法与所述式(I)化合物的合成方法的不同仅在于将S1中的苯胺替换成1-萘胺进行反应；
所述式(III)化合物的合成方法与所述式(I)化合物的合成方法的不同仅在于将S1中的苯胺替换成苯甲酸进行反应。
优选地，S1中，所述催化剂A为N,N-二异丙基乙胺及O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐，且所述N-((苄氧基)羰基)-S-(4-(叔丁氧基)-4-氧代丁基)-L-半胱氨酸、所述N,N-二异丙基乙胺、所述O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐及所述苯胺的摩尔比为1：2-4：1.5-3：2-3。
优选地，S1中，所述酰胺缩合反应是将所述N-((苄氧基)羰基)-S-(4-(叔丁氧基)-4-氧代丁基)-L-半胱氨酸加入四氢呋喃溶解后，加入所述N,N-二异丙基乙胺，搅拌5-8min后加入所述O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐，搅拌15-20min后加入所述苯胺，室温反应3-3.5h。
优选地，S3中，所述催化剂B为三乙胺及氯甲酸异丁酯，且所述(R)-4-((2-((苄氧基)羰基)氨基)-3-羰基-3(苯氨基)丙基)硫代)丁酸、所述三乙胺、所述氯甲酸异丁酯及所述盐酸羟胺的摩尔比为1：2-5：2-3：5-20。
优选地，S3中，所述酰胺缩合反应是取(R)-4-((2-((苄氧基)羰基)氨基)-3-羰基-3(苯氨基)丙基)硫代)丁酸加入四氢呋喃溶解后，依次加入所述三乙胺及所述氯甲酸异丁酯，冰浴下搅拌1-1.5h，然后加入甲醇溶解的盐酸羟胺，转至室温继续反应3-4h。
对比现有技术，本发明的有益效果为：
本发明提供的半胱氨酸衍生物能够作为HDAC抑制剂，该HDAC抑制剂对多种癌细胞具有抑制作用，且对实体肿瘤乳腺癌和非小细胞肺癌的抗肿瘤活性明显，是对实体肿瘤具有治疗作用的新型HDAC抑制剂类抗肿瘤药物。
附图说明
图1是三个化合物对MCF-7肿瘤细胞组蛋白H3、H4和α-tubulin乙酰化水平的影响；
图2是不同浓度式(III)化合物对非小细胞肺癌A549细胞周期的影响；
图3是式(III)化合物对肺癌A549裸鼠体重及移植瘤生长的影响；A是A549裸鼠体重变化，B是给药21天后肿瘤的重量；
图4是肿瘤组织免疫组化染色。
具体实施方式
为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案能予以实施，下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明，但所举实施例不作为对本发明的限定。
下述方法中所涉及配料或材料，如无特殊说明，均为商业途径可获得。相关实验方法中如无特殊说明的均为本技术领域现有常规方法。其中的数值或数值比例，如无标注，均指质量数值或质量比例。
实施例1
式(I)化合物的具体合成方法，包括以下步骤：
S1、取N-((苄氧基)羰基)-S-(4-(叔丁氧基)-4-氧代丁基)-L-半胱氨酸和干燥的THF(四氢呋喃)搅拌溶解后加入DIEA(N,N-二异丙基乙胺)，搅拌5-8min后加入HBTU(O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐)，15-20min后加入苯胺，室温反应3-3.5h；得到的产物减压蒸除溶剂，加入二氯甲烷溶解，再分别用HCl溶液和饱和NaCl溶液洗涤有机层，收集有机层，无水Na2SO4干燥后浓缩有机层，最后经硅胶柱层析纯化得到浅黄色固体；
其中，各原料与催化剂的摩尔比为N-((苄氧基)羰基)-S-(4-(叔丁氧基)-4-氧代丁基)-L-半胱氨酸：DIEA：HBTU：苯胺＝1：2：1.5：2；
S2、将得到的全部浅黄色固体，加入二氯甲烷溶解，冰浴下加入等体积的TFA(三氟乙酸)，室温反应3-3.5h，以脱去叔丁基保护基、得到羧酸基团；得到的产物减压蒸除溶剂，经硅胶柱层析纯化得灰白色固体，即(R)-4-((2-((苄氧基)羰基)氨基)-3-羰基-3(苯氨基)丙基)硫代)丁酸；
S3、取(R)-4-((2-((苄氧基)羰基)氨基)-3-羰基-3(苯氨基)丙基)硫代)丁酸和干燥的THF冰浴下搅拌5-8min后，依次加入三乙胺(TEA)和氯甲酸异丁酯(IBCF)，冰浴下继续搅拌1-1.5h，然后加入甲醇溶解的盐酸羟胺溶液(此处只需保证盐酸羟胺在甲醇溶液中完全溶解即可)，转至室温继续反应3-4h；得到的产物减压蒸除溶剂，加入二氯甲烷溶解，用饱和NaCl溶液洗涤有机层，收集有机层，再用无水Na2SO4干燥后浓缩有机层，经硅胶柱层析纯化得浅黄色固体，即为式(I)化合物，
其中，所述(R)-4-((2-((苄氧基)羰基)氨基)-3-羰基-3(苯氨基)丙基)硫代)丁酸、所述三乙胺、所述氯甲酸异丁酯及所述盐酸羟胺的摩尔比为1：2：2：5。
合成路线如下所示：
Figure BDA0003119675920000061
式(II)化合物的合成方法与式(I)化合物的合成方法的不同仅在于将S1中的苯胺替换成1-萘胺进行反应，合成路线如下所示：
Figure BDA0003119675920000062
式(III)化合物的合成方法与式(I)化合物的合成方法的不同仅在于将S1中的苯胺替换成苯甲酸进行反应，合成路线如下所示：
Figure BDA0003119675920000063
式(I)-(III)化合物的13C-NMR、1H-NMR和HR-MS数据：
式(I)化合物：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.28(s,1H),10.02(s,1H),8.56(s,1H),7.56(d,J＝7.0Hz,3H),7.42–7.14(m,7H),7.03(d,J＝6.1Hz,1H),5.02(s,2H),4.30(s,1H),2.84(s,1H),2.79–2.64(m,1H),2.52(s,2H),2.01(s,2H),1.72(d,J＝6.2Hz,2H).13CNMR(100MHz,DMSO-d6)δ169.91,169.13,156.51,139.30,137.44,129.27,128.89,128.33,124.04,119.85,66.08,55.84,33.75,31.67,31.38,25.58.HRMS(ESI)m/z:[M+Na]+calcdfor C21H24N3NaO5S 454.1407,found 454.1401。
式(II)化合物：1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.41(s,1H),10.19(s,1H),8.72(s,1H),8.12–8.04(m,1H),7.98–7.91(m,1H),7.82–7.76(m,2H),7.61(d,J＝7.2Hz,1H),7.57–7.47(m,3H),7.36(dt,J＝21.1,6.7Hz,6H),5.09(s,2H),4.54(dd,J＝14.1,8.1Hz,1H),2.99(dd,J＝13.4,6.1Hz,1H),2.82(dd,J＝13.6,8.8Hz,1H),2.63(dd,J＝16.5,9.5Hz,2H),2.07(t,J＝7.3Hz,2H),1.79(dt,J＝14.2,7.0Hz,2H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ170.72,169.12,156.59,137.50,134.21,133.69,128.89,128.60,128.37,128.29,126.62,126.45,126.24,126.05,123.48,122.77,102.09,74.69,66.10,33.73,31.68,31.45,25.65.HRMS(ESI)m/z:[M+Na]+calcd for C25H26N3NaO5S 504.1564,found 504.1556。
式(III)化合物：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.36(s,1H),10.22(s,1H),8.71(d,J＝7.9Hz,1H),8.67(d,J＝1.5Hz,1H),7.92–7.84(m,2H),7.60(d,J＝7.7Hz,2H),7.51(dd,J＝8.4,6.2Hz,1H),7.44(t,J＝7.4Hz,2H),7.27(t,J＝7.9Hz,2H),7.02(t,J＝7.4Hz,1H),4.72(dd,J＝14.0,8.5Hz,1H),2.97(dd,J＝13.5,5.7Hz,1H),2.88(dd,J＝13.4,9.1Hz,1H),2.55(t,J＝7.1Hz,2H),2.01(t,J＝7.6Hz,2H),1.80–1.65(m,2H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ169.90,169.11,167.04,139.37,134.32,132.02,129.27,128.79,128.11,124.01,119.87,54.69,31.68,31.32,25.62.HRMS(ESI)m/z:[M+Na]+calcd forC20H22N3NaO4S 424.1301,found 424.1291。
实施例2
式(I)化合物的具体合成方法，与实施例1的不同在于S1中，所述N-((苄氧基)羰基)-S-(4-(叔丁氧基)-4-氧代丁基)-L-半胱氨酸、所述N,N-二异丙基乙胺、所述O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐及所述苯胺的摩尔比为1：4：1.5：2。
实施例3
式(I)化合物的具体合成方法，与实施例1的不同在于S1中，所述N-((苄氧基)羰基)-S-(4-(叔丁氧基)-4-氧代丁基)-L-半胱氨酸、所述N,N-二异丙基乙胺、所述O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐及所述苯胺的摩尔比为1：4：3：2。
实施例4
式(I)化合物的具体合成方法，与实施例1的不同在于S1中，所述N-((苄氧基)羰基)-S-(4-(叔丁氧基)-4-氧代丁基)-L-半胱氨酸、所述N,N-二异丙基乙胺、所述O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐及所述苯胺的摩尔比为1：4：3：3。
实施例5
式(I)化合物的具体合成方法，与实施例1的不同在于S3中，所述(R)-4-((2-((苄氧基)羰基)氨基)-3-羰基-3(苯氨基)丙基)硫代)丁酸、所述三乙胺、所述氯甲酸异丁酯及所述盐酸羟胺的摩尔比为1：5：2：5。
实施例6
式(I)化合物的具体合成方法，与实施例1的不同在于S3中，所述(R)-4-((2-((苄氧基)羰基)氨基)-3-羰基-3(苯氨基)丙基)硫代)丁酸、所述三乙胺、所述氯甲酸异丁酯及所述盐酸羟胺的摩尔比为1：5：3：5。
实施例7
式(I)化合物的具体合成方法，与实施例1的不同在于S3中，所述(R)-4-((2-((苄氧基)羰基)氨基)-3-羰基-3(苯氨基)丙基)硫代)丁酸、所述三乙胺、所述氯甲酸异丁酯及所述盐酸羟胺的摩尔比为1：5：3：20。
实施例8
式(I)化合物的具体合成方法，与实施例1的不同在于S3中，所述(R)-4-((2-((苄氧基)羰基)氨基)-3-羰基-3(苯氨基)丙基)硫代)丁酸、所述三乙胺、所述氯甲酸异丁酯及所述盐酸羟胺的摩尔比为1：2：3：20。
由于实施例1-8制备得到的半胱氨酸衍生物的性能基本相同，故以下仅以实施例1制备得到的半胱氨酸衍生物为例对其应用效果进行说明。
实施例9
半胱氨酸衍生物作为HDAC抑制剂在体外的HDAC制活性
将Buffer D(含1M Tis-HCl(pH＝8.0)、150mM NaCl、30mM KCl及10mM MgCl2)与荧光底物Boc-Lys(Ac)-AMC(100μM)混合，分别加入12.5nM、25nM、50nM、100nM、250nM、500nM、1000nM的待测化合物(1μL)混匀，加入4μL Hela核蛋白混匀，置于冰上，补加ddH2O至100μL，混匀后于37℃孵育1h，取出，置于冰上冷却，加入50μL 2×胰酶，混匀后于37℃孵育1h，加入Buffer E(含200mM HCl，300mM冰乙酸)终止反应，混匀后取180μL加入96孔荧光板，使用多功能酶标仪在360nm/460nm处检测荧光值，并计算IC50值。
式(I)-(III)化合物的HDAC抑制活性结果如表1。
表1式(I)-(III)化合物的HDAC抑制活性结果
Figure BDA0003119675920000101
由表1可知，式(I)-(III)化合物的IC50分别为75.10±0.67nM、72.37±10.59nM、52.74±11.12nM，其中，式(III)化合物的IC50与阳性药SAHA相当。
实施例10
半胱氨酸衍生物作为HDAC抑制剂对细胞组蛋白和α-tubulin乙酰化水平的影响
分别用浓度为1μM、10μM化合物及10μM临床上使用的抗肿瘤药物Vorinostat(SAHA)分别处理K562、A549、MCF-7细胞48h后，收集细胞，提取总蛋白，然后用乙酰化H3、H4抗体和乙酰化α-tubulin抗体进行Western blot检测，结果如图1(以MCF-7结果为例)。
结果发现，式(I)-(III)化合物明显呈剂量依赖使组蛋白H3、H4和α-tubulin乙酰化水平增加。
实施例11
半胱氨酸衍生物作为HDAC抑制剂对不同肿瘤细胞的抗肿瘤活性
采用公认的可用于大规模抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验测定的CCK-8法评价候选化合物对5种人癌细胞株的抗细胞增殖活性。测试化合物为式(I)-(III)化合物；阴性对照组为不加药组；阳性对照药为临床上使用的抗肿瘤药物Vorinostat(SAHA)。
5种人癌细胞株：人乳腺癌细胞MCF-7、人肝癌细胞HepG2、人肺癌细胞A549、人慢性髓系白血病细胞K562、宫颈癌细胞Hela。
细胞增殖抑制率＝(阴性对照组OD值-药物组OD值)*100％/阴性对照组OD值。通过化合物系列浓度的抑制率计算得到IC50值(单位为μM)，结果见表2。
表2 CCK-8法测定式(I)-(III)化合物对不同肿瘤细胞的IC50值(μM)
Figure BDA0003119675920000111
由表2可知，式(I)-(III)化合物对肿瘤细胞均有一定的抑制作用，与阳性药SAHA一样，对血液瘤细胞(K562)的抗增殖活性略优于实体瘤细胞(A549、HepG2、MCF-7、HeLa)，且式(I)-(III)化合物对A549细胞的抑制作用略优于阳性药SAHA。此外，对化合物进行了初步的体外代谢稳定性评估，发现式(III)化合物的稳定性优于式(I)化合物和式(II)化合物。
实施例12
不同浓度式(III)化合物对非小细胞肺癌A549细胞周期的影响
分别用1μM、5μM、10μM式(III)化合物(仅以该化合物为例，但并不代表只有该化合物具有此作用)及10μM临床上使用的抗肿瘤药物Vorinostat(SAHA)处理A549细胞24h后，收集细胞，清洗处理后，PI染色，流式细胞仪分析，并以不加药组作为对照组，结果如图2。
由图2可知，式(III)化合物可以浓度依赖诱导人肺癌A549细胞周期阻滞于G0/G1期。
实施例13
式(III)化合物对肺癌A549裸鼠移植瘤生长的影响
通过建立肺癌A549裸鼠异种移植肿瘤模型，当平均肿瘤体积达到100-150mm3时，选择肿瘤体积相近的30只小鼠随机分成3组：阴性对照组、高剂量组、低剂量组)，每组6只。阴性对照组尾静脉注射不添加药物的溶剂溶液(溶剂组成为二甲基乙酰胺DMA：聚乙二醇PEG400：生理盐水Saline＝1:4:2)，高剂量组(50mg/kg)和低剂量组(25mg/kg)分别尾静脉注射式(III)化合物(仅以该化合物为例，但并不代表只有该化合物具有此作用)，每周三次(隔天一次)，共三周。21天后检测动物体重和肿瘤重量(图3)，然后对肿瘤进行免疫组化染色，免疫组化检测结果如图4所示。
结果发现(如图3)，式(III)化合物显著抑制肿瘤生长(高剂量组抑制率为75.45％，低剂量组抑制率为61.99％)。
如图4所示，与阴性对照组小鼠相比，式(III)化合物治疗小鼠的肿瘤中a-微管蛋白和H3组蛋白的乙酰水平显著增加，表明式(III)化合物作为泛HDAC抑制剂可在体内有效抑制HDAC。
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

Claims (8)

1.一种半胱氨酸衍生物的合成方法，其特征在于，所述半胱氨酸衍生物的结构式如式（
Figure DEST_PATH_IMAGE001
）-（
Figure DEST_PATH_IMAGE002
）所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE003
如式（
Figure 887661DEST_PATH_IMAGE001
）-（
Figure 804802DEST_PATH_IMAGE002
）所示所述的半胱氨酸衍生物用作组蛋白去乙酰化酶抑制剂；
所述半胱氨酸衍生物的合成方法包括以下步骤：
S1、取N-((苄氧基)羰基)-S-(4-(叔丁氧基)-4-氧代丁基)-L-半胱氨酸溶解后在催化剂A作用下与苯胺进行酰胺缩合反应，得到的产物除去溶剂后，依次洗涤、干燥、浓缩、柱层析纯化，得浅黄色固体；
S2、将所述浅黄色固体溶解后加入三氟乙酸，室温反应3-3.5h，除去溶剂，柱层析纯化，得到(R)-4-((2-((苄氧基)羰基)氨基)-3-羰基-3(苯氨基)丙基)硫代)丁酸；
S3、取所述(R)-4-((2-((苄氧基)羰基)氨基)-3-羰基-3(苯氨基)丙基)硫代)丁酸溶解后在催化剂B作用下与盐酸羟胺进行酰胺缩合反应，所得产物除去溶剂后，依次洗涤、干燥、浓缩、柱层析纯化，即得所述式（
Figure 584539DEST_PATH_IMAGE001
）化合物；
所述式（
Figure DEST_PATH_IMAGE004
）化合物的合成路线如下所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE005
；
所述式（
Figure 510906DEST_PATH_IMAGE002
）化合物的合成路线如下所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE006
。
2.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述半胱氨酸衍生物用于制备抗肿瘤药物。
3.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，所述肿瘤为实体肿瘤。
4.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，所述肿瘤为乳腺癌、非小细胞肺癌、肝癌、宫颈癌或血液瘤。
5.根据权利要求1所述的半胱氨酸衍生物的合成方法，其特征在于，S1中，所述催化剂A为N,N-二异丙基乙胺及O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐，且所述N-((苄氧基)羰基)-S-(4-(叔丁氧基)-4-氧代丁基)-L-半胱氨酸、所述N,N-二异丙基乙胺、所述O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐及所述苯胺的摩尔比为1：2-4：1.5-3：2-3。
6.根据权利要求5所述的半胱氨酸衍生物的合成方法，其特征在于，S1中，所述酰胺缩合反应是将所述N-((苄氧基)羰基)-S-(4-(叔丁氧基)-4-氧代丁基)-L-半胱氨酸加入四氢呋喃溶解后，加入所述N,N-二异丙基乙胺，搅拌5-8min后加入所述O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐，搅拌15-20min后加入所述苯胺，室温反应3-3.5h。
7.根据权利要求1所述的半胱氨酸衍生物的合成方法，其特征在于，S3中，所述催化剂B为三乙胺及氯甲酸异丁酯，且所述(R)-4-((2-((苄氧基)羰基)氨基)-3-羰基-3(苯氨基)丙基)硫代)丁酸、所述三乙胺、所述氯甲酸异丁酯及所述盐酸羟胺的摩尔比为1：2-5：2-3：5-20。
8.根据权利要求7所述的半胱氨酸衍生物的合成方法，其特征在于，S3中，所述酰胺缩合反应是取(R)-4-((2-((苄氧基)羰基)氨基)-3-羰基-3(苯氨基)丙基)硫代)丁酸加入四氢呋喃溶解后，依次加入所述三乙胺及所述氯甲酸异丁酯，冰浴下搅拌1-1.5h，然后加入甲醇溶解的盐酸羟胺，转至室温继续反应3-4h。
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