JP2020504090A - 細胞膜透過ペプチドおよびこれを含む細胞内伝達体 - Google Patents
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Abstract
Description
[一般式I]
Cys−Xaa1−Xaa2−Cys−Xaa3−Xaa4−Xaa5−Gly−His−Xaa6−Xaa7−Xaa8−Xaa9−Cys
前記一般式において、Xaa1はAla、Val、Ile、Leu、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、AsnおよびGlnからなる群より選択され、
Xaa2はAla、Val、Ile、Leu、Met、Phe、Tyr、Trp、Arg、His、Lys、Asn、Ser、ThrおよびGlnからなる群より選択され、
Xaa3およびXaa4は互いに独立にAsp、Glu、Arg、His、Lys、Ser、Thr、Asn、GlnおよびGlyからなる群より選択され、
Xaa5はAsp、Glu、Arg、His、Lys、Ala、Val、Ile、Leu、Met、Phe、Tyr、TrpおよびProからなる群より選択され、
Xaa6およびXaa7は互いに独立にSer、Thr、Asn、Gln、Ala、Val、Ile、Leu、Met、Phe、TyrおよびTrpからなる群より選択され、
Xaa8はLys、AlaまたはArgであり、
Xaa9はAsp、Glu、Ser、Thr、AsnおよびGlnからなる群より選択されるアミノ酸である。
[一般式I]
Cys−Xaa1−Xaa2−Cys−Xaa3−Xaa4−Xaa5−Gly−His−Xaa6−Xaa7−Xaa8−Xaa9−Cys
前記一般式において、Xaa1はAla、Val、Ile、Leu、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、AsnおよびGlnからなる群より選択され、
Xaa2はAla、Val、Ile、Leu、Met、Phe、Tyr、Trp、Arg、His、Lys、Asn、Ser、ThrおよびGlnからなる群より選択され、
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Xaa5はAsp、Glu、Arg、His、Lys、Ala、Val、Ile、Leu、Met、Phe、Tyr、TrpおよびProからなる群より選択され、
Xaa6およびXaa7は互いに独立にSer、Thr、Asn、Gln、Ala、Val、Ile、Leu、Met、Phe、TyrおよびTrpからなる群より選択され、
Xaa8はLys、AlaまたはArgであり、
Xaa9はAsp、Glu、Ser、Thr、AsnおよびGlnからなる群より選択されるアミノ酸である。
1.NCペプチド発現のための組み換えベクター(recombinant vector)の作製
NCペプチドとEGFPが結合(conjugation)された組み換えタンパク質の発現有無を確認し、タンパク質を精製するために次のように組み換えベクターを作製した。
上記で作製されたpET21a NC−EGFPベクターのタンパク質発現有無を確認するために下記のように実験した。
3−1.細胞培養
HeLa、RAW264.7および293FT細胞は、10% FBSと100U/mlペニシリン/ストレプトマイシンが追加されたDMEM培地で培養し、MDCK細胞は、10% FBSと100U/mlペニシリン/ストレプトマイシンが追加されたEMEM培地(Hyclone、Logan、UT、USA)で培養した。THP−1およびCEM細胞は、10% FBSと100U/mlペニシリン/ストレプトマイシンが追加されたRPMI−1640培地(Hyclone、Logan、UT、USA)で培養した。全ての細胞は、37℃、5% CO2の加湿恒温器で培養した。
前記3−1で培養された様々な種類の細胞を1×106細胞/ウェルの密度で6−ウェルプレートに接種した後、24時間培養してプレートに細胞を付着させた。その後、ペプチド濃度(0.5、1.0、2.5、5.0および10μM)またはペプチド処理時間に差をおいて、FITCが結合(conjugation)されたNCペプチド(以下、「FITC−NCペプチド」と称する)、EGFPが結合されたNCペプチド(以下、「NC−EGFPペプチド」と称する)またはEGFPが結合されたTatペプチド(以下、「Tat−EGFPペプチド」と称する)を各々細胞に処理した。前記ペプチドは、chempeptide(中国)およびLife tein(米国)に注文して作製した。その後、細胞をPBSで3回洗浄し、トリプシン(trypsin)−EDTAで細胞を分離した後、2% FBS/0.1% ウシ血清アルブミン(bovine serum albumin、BSA)が含まれたPBSに懸濁させた。前記懸濁液を2,000rpmで2分間遠心分離して細胞ペレットを得、得た細胞を3.7% ホルムアルデヒド(formaldehyde)で20分間固定した。その後、2,000rpmで2分間遠心分離して細胞ペレットを得、PBSで2回洗浄した後、2% FBSおよび0.1% BSAが含まれたPBSに懸濁させた。蛍光活性化セルソーター(fluorescence−activated cell sorter;FACS Calibur、Beckon Dickinson、CA、USA)を用いて細胞をフローサイトメトリー(flow cytometry)により分析した。
HeLa細胞を1×105細胞/ウェルの密度でガラスが入った12−ウェルプレートに接種した後、24時間培養して細胞をガラスに付着させた。その後、FITC−NCペプチドを3mM濃度で細胞に3時間処理した。3時間後、細胞をPBSで3回洗浄した後、3.7% ホルムアルデヒドで20分間細胞を固定させ、0.2% Triton X−100が含まれたPBSを処理して細胞膜透過性を増加させた。その後、3% BSAで1時間ブロッキング(blocking)させた後、ラミン(lamin A/C)抗体(Sigma−Aldrich、米国)と常温で2時間反応させ、PBSで3回洗浄した。次に、Cy3二次抗体(Cy3−conjugated secondary antibody;Jackson ImmunoResearch、米国)を処理して常温で1時間反応させ、PBSで2回洗浄した後、DAPI(4’,6−diamidino−2−phenylindol)で10分間染色した。HeLa細胞が付着したガラスを取り外してスライドガラス上に載せ、共焦点レーザ走査顕微鏡(confocal laser scanning microscopy、LSM 700、Zeiss、Germany)で観察した。
RAW264.7細胞を5×104細胞/ウェルの密度で24−ウェルプレートに接種した後、24時間培養して細胞をプレートに付着させた。その後、Tat−EGFPペプチドおよびNC−EGFPペプチド各々を互いに異なる濃度で1時間処理した。1時間後、細胞をPBSで3回洗浄し、RIPA(radio−immunoprecipitation assay)バッファ100mlを添加して4℃で30分間細胞を溶解させた。前記細胞溶解液100mlを蛍光分析器用の96−ウェルプレートに移した後、蛍光分析器(Synergy MX、BIOTEK、米国)を用いてGFP蛍光を測定した。
MT4細胞を2×105細胞/ウェルの密度で24−ウェルプレートに接種し、37℃および5% CO2の加湿恒温器で24時間培養した。互いに異なる濃度のNCペプチド2μlとsiGLO(Green transfection indicator、Dharmacon、D−001630−01−05)40nMを混合して常温で30分間反応させた後、MT4細胞に処理した。24時間さらに培養した後、MT4細胞をPBSで3回洗浄し、蛍光活性化セルソーターを用いてフローサイトメトリーにより分析した。また、蛍光顕微鏡(Fluorescence inverted microscope、Olympus)で観察した。
3.2mg/100μl濃度のFITC−HIV−NCペプチドおよびFITC−Tatペプチドを30ゲージ(gauge)注射器を用いてマウス尾静脈に各々注射した。ペプチド投与して2時間後、マウスの腎臓(kidney)、肝臓(liver)、肺(lung)、心臓(heart)および脾臓(spleen)を摘出して4% パラホルムアルデヒドで1時間固定し、組織が沈むまで30% スクロース(sucrose)に浸しておいた。その後、OCTコンパウンド(OCT compound;Leica、Germany)を用いて各組織を冷凍させ、冷凍切片機で組織切片スライドを作製した。当業界で周知の方法により組織切片スライドをDAPIで10分間染色した後、共焦点レーザ走査顕微鏡で観察した。
1.様々なレトロウイルスNCペプチドの細胞膜透過活性の確認
NCペプチド配列の類似(similarity)程度に応じて細胞膜透過活性の程度の差があるか否かを確認するために、FITCが結合されたHIV、SIV、RSVおよびMLVのNCペプチドとTatペプチドを1.0μMの濃度でRAW264.7細胞に1時間処理した。その結果、図2に示すように、HIV、SIV、RSVおよびMLVのNCペプチドが細胞膜透過性に優れるのをFITC蛍光明るさを通じて確認し、FACS分析でもHIVのNCペプチドが96.8%、SIVのNCペプチドが54.0%、RSVのNCペプチドが24.2%、MLVのNCペプチドが5.7%の細胞において蛍光が現れるのを確認した。前記実験結果は、HIVをはじめとする種々のレトロウイルスのNCペプチドが既存のTatペプチドに比して細胞膜透過活性に優れることを意味する。また、図2に示すように、HIV、SIV、RSVおよびMLVのNCペプチドは、ジンクフィンガー(zinc finger)ドメインが保存配列(consensus sequence)として含まれているのを確認することができた。
前記実験において、細胞膜透過活性の最も高いHIV−NCペプチド(配列番号12)を対象に細胞膜透過活性を濃度別に確認するために、FITC−HIV−NCペプチドを0.5、1、2.5、5.0および10μMの濃度で1時間RAW264.7マクロファージに処理した。1時間後、蛍光顕微鏡(Leica Micoscope Systems、ドイツ)で細胞の蛍光程度を確認した結果、図3aに示すように、FITC−HIV−NCペプチドの濃度が増加するほど、ペプチドの細胞膜透過性が高くなるのを確認することができた。また、蛍光分析器により確認した結果、図3bに示すように、FITC−HIV−NCペプチドの濃度が増加するほど、蛍光信号が増加するのを確認して細胞膜透過性が増加することが分かった。
細胞の種類に応じてHIV−NCペプチドの細胞膜透過活性に差があるか否かを確認するために、RAW264.7、THP−1、CEM、MDCKおよび293FT細胞にFITC−HIV−NCペプチドを1.0、2.5および5.0μMの濃度で1時間または2時間処理した。その結果、図5a〜5eに示すように、FITC−HIV−NCペプチドの濃度が増加するに伴い、ペプチドの細胞膜透過性が有意に増加するのを蛍光顕微鏡およびFACS分析により確認することができた。図5aはRAW264.7(マウスマクロファージ)、図5bはTHP−1(ヒト単球細胞株)細胞の結果であり、図5cはCEM、図5dはMDCK(Madin−Darby canine kidney、イヌ腎臓由来細胞)および図5eは293FT(ヒト胎児腎臓細胞由来)の結果である。前記結果は、HIV−NCペプチドが癌細胞、免疫細胞、上皮細胞などの様々な細胞膜を透過できることを意味する。
HIV−NCペプチドの細胞膜透過活性の程度を確認するために、既存の細胞透過タンパク質として知られたTatペプチドとの比較実験を行った。緑色蛍光タンパク質(Green Fluorescence Protein、GFP)が結合されたHIV−NCペプチド(以下、GFP−HIV−NCペプチド)を0.25、0.5、1.0、2.5および5.0μMの濃度で、GFP−Tatペプチドを1.0、2.5、5.0および10μMの濃度で、各々1時間RAW264.7細胞に処理し、1時間後、ペプチドの蛍光程度を確認した。その結果、図6aおよび6bに示すように、GFP−HIV−NCペプチドは0.25μMの低い濃度で蛍光が現れる反面、GFP−Tatペプチドは10μMの高い濃度でも蛍光が微小に現れるのを確認することができた。また、細胞を回収してFACSで分析した結果、図6aおよび6bに示すように、GFP−HIV−NCペプチドは1μMの濃度で99.9%の細胞が蛍光を示すが、GFP−Tatペプチドは同一の濃度で4.3%の細胞が蛍光を示すのを確認した。
FITC−HIV−NCペプチド、FITC−Tatペプチド、FITC−MA11ペプチド、FITC−PTD−ysペプチド、FITC−TLMペプチド、FITC−TD1ペプチドをHeLa細胞に処理した後、各ペプチドの細胞膜透過程度を確認した。
実験結果1において多数種のレトロウイルスNCペプチドが細胞膜透過活性があるのを確認し、図2に示すように、HIV、SIV、RSVは2個、MLVは1個のジンクフィンガードメイン(zinc finger domain)があるのを確認した。
ポリペプチドをカーゴ(cargo)にしてHIV−NCペプチドによる細胞膜透過が可能であるか否かを確認するために、HIV−NCペプチドにヘキサペプチドを結合して細胞に処理して蛍光信号を観察した。その結果、図12に示すように、ヘキサペプチドそのものは細胞膜を透過することはできないが、HIV−NCペプチドと結合した場合には細胞膜透過が可能であり、濃度に比例して細胞膜透過活性が増加するのを確認することができた。
ポリヌクレオチドをカーゴ(cargo)にしてHIV−NCペプチドによる細胞膜透過が可能であるか否かを確認するために、HIV−NCペプチドとsiGLO RNAを結合してMT4細胞に処理した後に細胞を観察した。その結果、図13に示すように、HIV−NCペプチドの処理濃度に応じてGFP蛍光信号が増加するのを確認し、siGLOの細胞膜透過程度が増加したことが分かった。この結果は、HIV−NCペプチドがポリヌクレオチドの細胞膜透過程度を顕著に改善できることを意味する。
Claims (13)
- 次の一般式Iで表されるアミノ酸配列を含む細胞透過ペプチド:
[一般式I]
Cys−Xaa1−Xaa2−Cys−Xaa3−Xaa4−Xaa5−Gly−His−Xaa6−Xaa7−Xaa8−Xaa9−Cys
前記一般式において、Xaa1はAla、Val、Ile、Leu、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、AsnおよびGlnからなる群より選択され、
Xaa2はAla、Val、Ile、Leu、Met、Phe、Tyr、Trp、Arg、His、Lys、Asn、Ser、ThrおよびGlnからなる群より選択され、
Xaa3およびXaa4は互いに独立にAsp、Glu、Arg、His、Lys、Ser、Thr、Asn、GlnおよびGlyからなる群より選択され、
Xaa5はAsp、Glu、Arg、His、Lys、Ala、Val、Ile、Leu、Met、Phe、Tyr、TrpおよびProからなる群より選択され、
Xaa6およびXaa7は互いに独立にSer、Thr、Asn、Gln、Ala、Val、Ile、Leu、Met、Phe、TyrおよびTrpからなる群より選択され、
Xaa8はLys、AlaまたはArgであり、
Xaa9はAsp、Glu、Ser、Thr、AsnおよびGlnからなる群より選択されるアミノ酸である。 - 次の一般式Iで表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド末端に細胞内輸送対象のカーゴ(cargo)が結合された細胞内伝達体:
[一般式I]
Cys−Xaa1−Xaa2−Cys−Xaa3−Xaa4−Xaa5−Gly−His−Xaa6−Xaa7−Xaa8−Xaa9−Cys
前記一般式において、Xaa1はAla、Val、Ile、Leu、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、AsnおよびGlnからなる群より選択され、
Xaa2はAla、Val、Ile、Leu、Met、Phe、Tyr、Trp、Arg、His、Lys、Asn、Ser、ThrおよびGlnからなる群より選択され、
Xaa3およびXaa4は互いに独立にAsp、Glu、Arg、His、Lys、Ser、Thr、Asn、GlnおよびGlyからなる群より選択され、
Xaa5はAsp、Glu、Arg、His、Lys、Ala、Val、Ile、Leu、Met、Phe、Tyr、TrpおよびProからなる群より選択され、
Xaa6およびXaa7は互いに独立にSer、Thr、Asn、Gln、Ala、Val、Ile、Leu、Met、Phe、TyrおよびTrpからなる群より選択され、
Xaa8はLys、AlaまたはArgであり、
Xaa9はAsp、Glu、Ser、Thr、AsnおよびGlnからなる群より選択されるアミノ酸である。 - レトロウイルス(retrovirus)のNCペプチド末端に細胞内輸送対象のカーゴが結合された細胞内伝達体。
- 前記細胞内輸送対象のカーゴは、化学物質、ポリペプチド、核酸、炭水化物または脂質である、請求項2または3に記載の細胞内伝達体。
- 前記レトロウイルスは、HIV(Human immunodeficiency virus)、MLV(Murine leukemia virus)、SIV(Simian immunodeficiency virus)およびRSV(Rous sarcoma virus)からなる群より選択される、請求項3に記載の細胞内伝達体。
- 前記一般式Iで表されるアミノ酸配列を含むペプチドは、配列番号17〜配列番号23のアミノ酸配列を有するポリペプチドからなる群より選択される、請求項2に記載の細胞内伝達体。
- 前記NCペプチドは、配列番号12〜配列番号15のアミノ酸配列を有するポリペプチドからなる群より選択される、請求項3に記載の細胞内伝達体。
- 請求項2に記載の細胞内伝達体を細胞に接触させるステップを含む、細胞内輸送対象のカーゴを細胞内に伝達する方法。
- レトロウイルスのNCペプチド末端に細胞内輸送対象のカーゴが結合された細胞内伝達体を細胞に接触させるステップを含む、細胞内輸送対象のカーゴを細胞内に伝達する方法。
- 前記細胞内輸送対象のカーゴは、化学物質、ポリペプチド、核酸、炭水化物または脂質である、請求項8または9に記載の方法。
- 前記レトロウイルスは、HIV(Human immunodeficiency virus)、MLV(Murine leukemia virus)、SIV(Simian immunodeficiency virus)およびRSV(Rous sarcoma virus)からなる群より選択される、請求項9に記載の方法。
- 前記一般式Iで表されるアミノ酸配列を含むペプチドは、配列番号17〜配列番号23のアミノ酸配列を有するポリペプチドからなる群より選択される、請求項8に記載の方法。
- 前記NCペプチドは、配列番号12〜配列番号15のアミノ酸配列を有するポリペプチドからなる群より選択される、請求項9に記載の方法。
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