KR20180070496A - 세포막 투과 펩티드 및 이를 포함하는 세포내 전달체 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 세포막 투과 펩티드 및 이를 포함하는 세포내 전달체에 관한 것이다. 본 발명의 세포내 전달체는 바이러스로부터 유래된 세포 투과 펩티드와 비교할 때, 낮은 농도로도 효율적으로 물질을 세포 내로 전달할 수 있는 장점이 있다.
Description
본 발명은 세포막 투과 펩티드 및 이를 포함하는 세포내 전달체에 관한 것이다.
HIV(human immunodeficiency virus)의 뉴클레오캡시드 단백질(nucleocapsid, 이하, 'NC'라 명명함)은 바이러스 개체형성을 위한 구조적 역할뿐만 아니라, 바이러스의 생활주기(viral life cycle)에서 기능적으로도 중요한 역할을 하는데, 그 기능을 살펴보면 다음과 같다. 첫째, NC 펩티드는 바이러스의 유전적 포막(genomic encapsidation)에 관여한다. 이러한 기능은 독특한 CCHC 모티프로 구성되는 두 개의 징크핑거 도메인으로부터 기인하는데, 상기 도메인은 모든 레트로바이러스(retrovirus)에서 높은 보존성을 나타내며, HIV RNA 포장(packaging)과 감염성 바이러스 생산에 필수적인 것으로 알려져 있다. 둘째, NC 펩티드는 바이러스의 역전사 반응(reverse transcription, RT)동안 tRNA 프라이머 어닐링(annealing)과 가닥 이동(strand transfer)을 촉진한다고 알려져 있으며, 이로부터 NC 펩티드가 바이러스 복제(viral replication)에 중요한 기능을 한다는 것을 알 수 있다. 셋째, NC 펩티드는 바이러스의 생활주기에 필요한 핵산 샤페론(chaperone) 활성을 가지며. 최근에는 바이러스 DNA가 숙주세포 염색체에 삽입될 때에도 NC 펩티드가 소정의 역할을 담당한다고 보고되고 있다.
한편, 세포 투과 펩티드(Cell Penetrating Peptides: CPP)는 약 10-30개 정도의 짧은 펩티드로 이루어진 세포막 투과성 펩티드로 대부분 단백질-투과 도메인(protein-transduction domain)이나 막-이동 시퀀스(membrane-translocating sequence)로부터 유도된다. 외부 물질의 일반적인 세포 내 유입 경로와는 달리 CPP는 세포막을 손상시키지 않으면서 세포 내로 이동하고, 세포막을 통과하지 못하는 것으로 알려져 있는 DNA나 단백질까지도 세포 내로 전달시킬 수 있다고 알려져 있다. CPP로 가장 잘 알려진 펩티드는 Tat 펩티드가 있으며, 이는 인간 면역 결핍 바이러스(Human Immuno-deficiency Virus: HIV)로부터 유도되어 현재 세포 치료제나 진단시약 같은 다양한 방면에서 응용되어 사용되고 있다. 또한, 호메오도메인 전사 인자의 DNA-결합 도메인으로부터 유도된 페네트라틴(penetratin)은 인체에 유용한 단백질을 피부에 전달하는 용도로 이용되고 있다. 트랜스포탄(transportan)은 갈라닌(galanin)이라는 뉴로펩티드와 마스토파란(mastoparan)이라는 말벌의 독으로부터 분리된 펩티드 중 일부를 융합시켜 만든 펩티드로 세포사를 유도시키는 펩티드와 결합시켜 세포사 유도 펩티드로 이용되고 있다.
본 발명자들은 HIV NC 펩티드의 생리학적 활성을 연구하던 중, NC 펩티드가 세포막 투과 활성을 가지고 있다는 것을 확인하였으며, 이를 통해 세포 내 물질 전달이 가능한 약물 전달 시스템으로 이용할 수 있다는 점을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 일 목적은 다음의 일반식 I로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 세포 투과 펩티드를 제공하는 것이다:
[일반식 I]
Cys-Xaa1-Xaa2-Cys-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Gly-His-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Cys
상기 일반식에서 Xaa1는 Ala, Val, Ile, Leu, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Thr, Asn 및 Gln으로 이루어진 군으로부터 선택되고,
Xaa2는 Ala, Val, Ile, Leu, Met, Phe, Tyr, Trp, Arg, His, Lys, Asn, Ser, Thr 및 Gln으로 이루어진 군에서 선택되며,
Xaa3 및 Xaa4는 서로 독립적으로 Asp, Glu, Arg, His, Lys, Ser, Thr, Asn, Gln 및 Gly로 이루어진 군에서 선택되고,
Xaa5는 Asp, Glu, Arg, His, Lys, Ala, Val, Ile, Leu, Met, Phe, Tyr, Trp 및 Pro으로 이루어진 군에서 선택되며,
Xaa6 및 Xaa7은 서로 독립적으로 Ser, Thr, Asn, Gln, Ala, Val, Ile, Leu, Met, Phe, Tyr 및 Trp로 이루어진 군에서 선택되고,
Xaa8은 Lys, Ala 또는 Arg이며,
Xaa9은 Asp, Glu, Ser, Thr, Asn 및 Gln로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 세포 투과 펩티드 말단에 세포 내 운반 대상의 카고(cargo)가 결합되어 있는 세포내 전달체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 세포내 전달체를 세포에 접촉시키는 단계를 포함하는 세포 내 운반 대상의 카고를 세포 내로 전달하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 레트로바이러스(retrovirus)의 NC 펩티드 말단에 세포 내 운반 대상의 카고가 결합되어 있는 세포내 전달체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 레트로바이러스의 NC 펩티드 말단에 세포 내 운반 대상의 카고가 결합되어 있는 세포내 전달체를 세포에 접촉시키는 단계를 포함하는 세포 내 운반 대상의 카고를 세포 내로 전달하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 양상은 다음의 일반식 I로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 세포 투과 펩티드를 제공한다:
[일반식 I]
Cys-Xaa1-Xaa2-Cys-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Gly-His-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Cys
상기 일반식에서 Xaa1는 Ala, Val, Ile, Leu, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Thr, Asn 및 Gln으로 이루어진 군으로부터 선택되고,
Xaa2는 Ala, Val, Ile, Leu, Met, Phe, Tyr, Trp, Arg, His, Lys, Asn, Ser, Thr 및 Gln으로 이루어진 군에서 선택되며,
Xaa3 및 Xaa4는 서로 독립적으로 Asp, Glu, Arg, His, Lys, Ser, Thr, Asn, Gln 및 Gly로 이루어진 군에서 선택되고,
Xaa5는 Asp, Glu, Arg, His, Lys, Ala, Val, Ile, Leu, Met, Phe, Tyr, Trp 및 Pro으로 이루어진 군에서 선택되며,
Xaa6 및 Xaa7은 서로 독립적으로 Ser, Thr, Asn, Gln, Ala, Val, Ile, Leu, Met, Phe, Tyr 및 Trp로 이루어진 군에서 선택되고,
Xaa8은 Lys, Ala 또는 Arg이며,
Xaa9은 Asp, Glu, Ser, Thr, Asn 및 Gln로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산이다.
본 발명의 다른 양상은 상기 세포 투과 펩티드 말단에 세포 내 운반 대상의 카고(cargo)가 결합되어 있는 세포내 전달체를 제공하는 것이다.
본 명세서에서 용어, “세포내 전달체”는 세포막을 투과하여 조직까지 침투할 수 있는 전달체를 의미한다.
본 명세서에서 용어, "펩티드" 또는 "폴리펩티드"는 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미하며, 아미노산 잔기 4-70개, 바람직하게는 4-40개, 보다 바람직하게는 4-30개, 가장 바람직하게는 4-20개로 이루어져 있다.
상기 일반식 I로 표시되는 폴리펩티드는 다양한 레트로바이러스(예를 들어, HIV(Human immunodeficiency virus), MLV(Murine leukemia virus), SIV(Simian immunodeficiency virus), RSV(Rous sarcoma virus), FIV(Feline immunideficiency virus), EIV(Equine immunideficiency virus))의 NC 펩티드 내에 존재하는 징크 핑거 도메인(zinc finger domain)의 보존 서열(Cys-Xaa-Xaa-Cys-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-His-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Cys)을 나타내는 것으로, 본 발명자들은 실험을 통해 상기 서열을 포함하는 폴리펩티드가 세포막 투과 활성이 우수함을 확인하였으며, 이를 통해 세포내 물질 전달이 가능한 약물 전달 시스템으로 이용할 수 있다는 점을 밝혀내었다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 일반식 I(서열번호 16) 에서 상기 Xaa1는 소수성 아미노산인 Ala, Val, Ile, Leu, Met, Phe, Tyr 및 Trp과 극성 아미노산인 Ser, Thr, Asn 및 Gln로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이다. 보다 바람직하게는, 상기 Xaa1는 Phe, Trp, Tyr, Ala 및 Gln으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이다.
일 구체예에 따르면, 상기 Xaa2는 소수성 아미노산인 Ala, Val, Ile, Leu, Met, Phe, Tyr, Trp와 염기성 아미노산인 Arg, His, Lys, 극성 아미노산인 Ser, Thr, Asn 및 Gln로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이다. 보다 바람직하게는, 상기 Xaa2는 Asn, Thr, Lys, Leu 및 Tyr로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산이다.
또한, 일 구체예에 따르면 상기 Xaa3 및 Xaa4는 서로 독립적으로 친수성 아미노산인 Asp, Glu, Arg, His, Lys, Ser, Thr, Asn, Gln 및 Gly으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산이다. 보다 바람직하게는, 상기 Xaa3 는 Gly, Asp 및 Lys로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, Xaa4는 Arg, Ser, Gly 및 Glu 로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산이다.
또한, 본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 Xaa5는 극성 아미노산을 제외한 Asp, Glu, Arg, His, Lys, Ala, Val, Ile, Leu, Met, Phe, Tyr, Trp 및 Pro으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이다. 보다 바람직하게는, 상기 Xaa5는 Pro, Glu, Lys, Ile 및 Met으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산이다.
또한, 일 구체예에 따르면 상기 Xaa6 및 Xaa7은 서로 독립적으로 소수성 아미노산인 Ala, Val, Ile, Leu, Met, Phe, Tyr 및 Trp, 극성 아미노산인 Ser, Thr, Asn 또는 Gln으로 이루어진 군에서 선택되며, 보다 바람직하게는 Xaa6는 Thr, Asn, Gln, Met, Tyr 및 Trp로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이며, Xaa7은 Ala, Met, Gln 으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산이다.
또한, 일 구체예에 따르면 상기 Xaa8은 Lys, Ala 또는 Arg인 아미노산이며, Xaa9은 산성 아미노산인 Asp, Glu와 극성 아미노산인 Ser, Thr, Asn, Gln로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산이며, 바람직하게는 Asp, Glu, Asn 또는 Gln이다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 일반식 I로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드는 레트로바이러스의 징크 핑거(zinc finger) 도메인을 포함하는 폴리펩티드로서, 서열번호 17 내지 서열번호 23의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 다른 양상은 레트로바이러스(retrovirus)의 NC 펩티드 말단에 세포 내 운반 대상의 카고가 결합되어 있는 세포내 전달체를 제공한다.
본 명세서에서 용어, “NC 펩티드”는 레트로바이러스(retrovirus)의 뉴클레오캡시드(nucleocapsid)를 구성하는 폴리펩티드를 의미하는 것으로, 상기 폴리펩티드는 레트로바이러스의 게놈 RNA에 강하게 결합하여 리보 핵산단백질 코어 복합체(ribonucleoprotein core complex)를 형성하는 것으로 알려져 있다.
본 명세서에서 용어, “세포 투과 펩티드(cell penetrating peptide, CPP)”는 인 비트로(in vitro) 및/또는 인 비보(in vivo) 상에서 운반 대상의 카고(cargo)를 세포 내로 운반할 수 있는 능력을 가진 펩티드를 의미하는 것으로, 세포 투과 펩티드는 그 자체로 인지질 이중막의 세포막을 통과할 수 있는 아미노산 서열을 가지는 펩티드이다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 레트로바이러스는 HIV(Human immunodeficiency virus), MLV(Murine leukemia virus), SIV(Simian immunodeficiency virus) 및 RSV(Rous sarcoma virus)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 가장 바람직하게는 HIV일 수 있다.
본 명세서에서 용어, “카고(cargo)”는 세포막 투과 펩티드로서 작용하는 NC 펩티드에 결합하여 세포 내로 운반될 수 있는 화학물질, 작은 분자, 폴리펩티드, 핵산 등을 의미한다.
본 발명에서 일반식 I로 표시되는 펩티드 또는 레트로바이러스의 NC 펩티드 말단에 결합될 수 있는 물질, 즉 카고(cargo)가 될 수 있는 물질은 다양하며, 예를 들어, 단백질(폴리펩티드), 핵산(폴리뉴클레오티드), 화학 물질(약물) 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
예를 들어, 약물, 조영제(예를 들어, T1 조영제, 초상자성 물질과 같은 T2 조영제, 방사성 동위 원소 등), 형광 마커, 염색 물질 등이 될 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 폴리펩티드는 둘 또는 그 이상의 잔기로 구성되는 아미노산의 중합체로 펩티드 및 단백질을 포함한다. 폴리펩티드는 예를 들어, 세포 불멸에 관여하는 단백질(예를 들어, SV40 라지 T 항원 및 텔로머라아제), 항-아폽토틱 단백질(예를 들어, 돌연변이 p53 및 BclxL), 항체, 암유전자(예를 들어, ras, myc, HPV E6/E7 및 아데노바이러스 Ela), 세포 주기 조절 단백질(예를 들어, 사이클린 및 사이클린 의존성 인산화효소) 또는 효소(예를 들어, 녹색 형광 단백질, 베타-갈락토시다아제 및 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라아제)가 될 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다. 또한, 핵산은 예를 들어, RNA, DNA 또는 cDNA가 될 수 있으며, 핵산의 시퀀스는 암호화 부위 서열 또는 비암호화 부위 서열(예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 siRNA)이 될 수 있다. 핵산 카고로서의 뉴클레오티드는 표준 뉴클레오티드(예를 들어, 아데노신, 시토신, 구아닌, 티민, 이노신 및 우라실) 또는 아날로그(예를 들어, 포스포로티오에이트 뉴클레오티드)일 수 있다. 예를 들어, 핵산 카고는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드로 구성된 안티센스 시퀀스 또는 RNAi일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 본 발명의 일반식 I로 표시되는 펩티드 또는 NC 펩티드에 결합된 물질은 세포막을 매우 높은 효율로 투과하고, 세포 내에서 세포질 및 핵에 잔류하게 된다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 NC 펩티드는 하나 이상의 징크 핑거 도메인을 가질 수 있으며, 2개의 징크 핑거 도메인을 포함하는 것이 바람직하다. 일 구체예에 따르면, 상기 NC 펩티드는 서열번호 12 내지 서열번호 15의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양상은 상기 일반식 I로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 말단에 세포 내 운반 대상의 카고가 결합되어 있는 세포내 전달체, 또는 레트로바이러스의 NC 펩티드 말단에 세포 내 운반 대상의 카고가 결합되어 있는 세포내 전달체를 세포에 접촉시키는 단계를 포함하는 세포 내 운반 대상의 카고를 세포 내로 전달하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 상기 세포내 전달체들을 이용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
한편, 카고가 결합되어 있는 일반식 I로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드, 또는 카고가 결합되어 있는 NC 펩티드가 인 비트로 또는 인 비보에서 세포막과 접촉할 수 있는 기회가 부여되면 펩티드와 결합된 카고는 세포 내로 운반된다. 상기 세포내 전달체와 세포막의 접촉에서 특별하게 요구되는 조건, 예를 들어, 제한적인 시간, 온도 및 농도 등의 조건은 없으며, 당업계에서 세포막 투과에 적용되는 일반적인 조건으로 실시될 수 있다.
본 발명의 일반식 I로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 포함하는 세포내 전달체 또는 NC 펩티드를 포함하는 세포내 전달체는 기존의 바이러스로부터 유래된 펩티드와 비교할 때, 낮은 농도로도 효율적으로 물질을 세포 내로 전달할 수 있는 장점이 있다.
도 1은 NC-EGFP 단백질의 발현 여부를 SDS-PAGE로 확인한 결과를 보여준다.
도 2는 여러 레트로바이러스의 NC 펩티드 서열 및 FITC가 결합된 여러 NC 펩티드의 세포막 투과 활성을 비교한 결과를 보여준다. 붉은색 박스는 징크 핑거 도메인을 나타낸다.
도 3a 내지 도 3c는 RAW264.7 세포에서 FITC-HIV-NC 펩티드(nucleocapsid peptide)의 세포막 투과 활성을 농도 또는 시간 의존적으로 확인한 결과를 보여준다.
도 4는 HIV-NC 펩티드의 세포막 투과 여부를 면역염색법으로 확인한 결과를 보여준다.
도 5a 내지 도 5e는 FITC-HIV-NC 펩티드의 세포막 투과 활성을 농도 의존적으로 RAW264.7(도 5a), THP-1(도 5b), CEM(도 5c), MDCK(도 5d) 및 293FT(도 5e)에서 확인한 결과를 보여준다.
도 6a 내지 도 6c는 RAW264.7 세포에서 GFP-HIV-NC 펩티드 및 GFP-Tat 펩티드의 세포막 투과 활성을 농도 의존적으로 비교한 결과를 보여준다 .
도 7은 FITC-HIV-NC 펩티드, FITC-Tat 펩티드, FITC-MA11 펩티드, FITC-PTD-ys 펩티드, FITC-TLM 펩티드 및 FITC-TD1 펩티드의 세포막 투과 활성을 비교한 결과를 보여준다.
도 8은 FITC-13NC35 펩티드의 세포막 투과 활성 정도를 확인한 결과를 보여준다.
도 9는 FITC-29NC50 펩티드의 세포막 투과 활성 정도를 확인한 결과를 보여준다.
도 10은 HIV-NC 펩티드의 생체 내 조직 침투 후 조직 세포에의 분포 여부를 확인한 결과를 보여준다. 각 사진에서 스케일 바(scale bar)는 50 μm를 나타낸다.
도 11은 HIV-NC 펩티드의 안구 조직 침투 후 망막 세포에의 분포 여부를 확인한 결과를 보여준다: GCL는 신경절세포층(ganglion cell layer), INL은 속핵층(inner nuclear layer)을 의미하고, ONL은 외핵층(outer nuclear layer)을 의미한다.
도 12는 HIV-NC 펩티드와 결합된 헥사펩티드의 세포막 투과 활성을 나타내는 결과를 보여준다.
도 13은 HIV-NC 펩티드와 결합된 RNA의 세포막 투과 활성을 나타내는 결과를 보여준다.
도 2는 여러 레트로바이러스의 NC 펩티드 서열 및 FITC가 결합된 여러 NC 펩티드의 세포막 투과 활성을 비교한 결과를 보여준다. 붉은색 박스는 징크 핑거 도메인을 나타낸다.
도 3a 내지 도 3c는 RAW264.7 세포에서 FITC-HIV-NC 펩티드(nucleocapsid peptide)의 세포막 투과 활성을 농도 또는 시간 의존적으로 확인한 결과를 보여준다.
도 4는 HIV-NC 펩티드의 세포막 투과 여부를 면역염색법으로 확인한 결과를 보여준다.
도 5a 내지 도 5e는 FITC-HIV-NC 펩티드의 세포막 투과 활성을 농도 의존적으로 RAW264.7(도 5a), THP-1(도 5b), CEM(도 5c), MDCK(도 5d) 및 293FT(도 5e)에서 확인한 결과를 보여준다.
도 6a 내지 도 6c는 RAW264.7 세포에서 GFP-HIV-NC 펩티드 및 GFP-Tat 펩티드의 세포막 투과 활성을 농도 의존적으로 비교한 결과를 보여준다 .
도 7은 FITC-HIV-NC 펩티드, FITC-Tat 펩티드, FITC-MA11 펩티드, FITC-PTD-ys 펩티드, FITC-TLM 펩티드 및 FITC-TD1 펩티드의 세포막 투과 활성을 비교한 결과를 보여준다.
도 8은 FITC-13NC35 펩티드의 세포막 투과 활성 정도를 확인한 결과를 보여준다.
도 9는 FITC-29NC50 펩티드의 세포막 투과 활성 정도를 확인한 결과를 보여준다.
도 10은 HIV-NC 펩티드의 생체 내 조직 침투 후 조직 세포에의 분포 여부를 확인한 결과를 보여준다. 각 사진에서 스케일 바(scale bar)는 50 μm를 나타낸다.
도 11은 HIV-NC 펩티드의 안구 조직 침투 후 망막 세포에의 분포 여부를 확인한 결과를 보여준다: GCL는 신경절세포층(ganglion cell layer), INL은 속핵층(inner nuclear layer)을 의미하고, ONL은 외핵층(outer nuclear layer)을 의미한다.
도 12는 HIV-NC 펩티드와 결합된 헥사펩티드의 세포막 투과 활성을 나타내는 결과를 보여준다.
도 13은 HIV-NC 펩티드와 결합된 RNA의 세포막 투과 활성을 나타내는 결과를 보여준다.
이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실험방법
1. NC 펩티드 발현을 위한 재조합 벡터(recombinant vector) 제작
NC 펩티드와 EGFP가 결합(conjugation)된 재조합 단백질의 발현 여부를 확인하고, 단백질을 정제하기 위하여 다음과 같이 재조합 벡터를 제작하였다.
NC 펩티드 유전자의 N-말단에 제한효소(New England Biolabs; NEB, 미국)인 NdeI, C-말단에 BspEI이 작용할 수 있는 제한효소 인식서열(recognition sequence)을 추가하기 위하여 제한효소 인식서열을 포함하는 프라이머(primer)를 이용하여 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, 이하 PCR로 표기함)을 수행하였다. PCR에 사용한 프라이머 서열(서열번호 1 및 서열번호 2)과 PCR 조건을 하기 표 1 및 표 2에 기재하였다.
| 서열번호 | 서열 | |
| NC-NdeI | 서열번호 1 | CATATGCAGCGGGGAACTT |
| NC-BspEI | 서열번호 2 | TCCGGAGTTTGCCTGTCTC |
| PCR 반응물 | PCR 사이클 | |||
| dH2O | 37.5 ㎕ | 95℃ | 2분 | |
| dNTP (10X) | 4 ㎕ | 95℃ | 1분 | 30회 |
| F primer (10 μM) | 1 ㎕ | 65℃ | 30초 | |
| R primer (10 μM) | 1 ㎕ | 74℃ | 4분 | |
| NC 펩티드 유전자 | 1 ㎕ | 74℃ | 5분 | |
| DNA Taq polymerase | 0.5 ㎕ | 4℃ |
무한대 |
|
| buffer | 5 ㎕ | |||
| total | 50 ㎕ | |||
다음으로, EGFP(enhanced green fluorescent protein) 유전자의 N-말단에 BspEI, C-말단에 HindШ가 작용할 수 있는 제한효소 인식서열을 추가하기 위하여 상기 표 2와 동일한 조건으로 PCR을 진행하였다. 다만, 프라이머는 하기 표 3에 기재한 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머를 이용하였다.
| 서열번호 | 서열 | |
| EGFP-BspEI-F | 서열번호 3 | TCCGGAGTGAGCAAGGGCGA |
| EGFP- HindШ-R | 서열번호 4 | AAGCTTCTTGTACACTCTCGT |
상기와 같이 제한효소 인식서열을 추가한 NC 펩티드 유전자 및 EGFP 유전자를 16℃에서 12시간 동안 반응시켜 결합(라이게이션, ligation)시켰다. 결합된 NC 펩티드-EGFP 유전자(이하에서 'NC-EGFP 유전자'로 표기함)에 대하여 PCR을 수행(서열번호 1, 2, 3 및 4 프라이머 이용)하여 NC-EFGP 유전자 전체 서열을 수득하였다. NC-EGFP 유전자 결합 반응 조건을 하기 표 4에 기재하였다.
| dH2O | 6 ㎕ |
| T4 DNA Ligase buffer (10X) | 1 ㎕ |
| NC 펩티드 DNA (50 ng/㎕) | 1 ㎕ |
| EGFP 유전자 DNA (50 ng/㎕) | 1 ㎕ |
| T4 DNA Ligase (400 units/㎕) | 1 ㎕ |
| total | 10 ㎕ |
이후 pET21a(Novagen, 미국) 벡터를 NdeI 및 Hind III 제한효소로 절단한 후 PCR Purification Kit(Qiagen, 미국)를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 벡터 단편을 분리하였다. 제한효소 반응은 NEBuffer #2를 이용하여 37℃에서 2시간 동안 수행하였다. 상기 분리한 pET21a 벡터 단편과 NC-EGFP 유전자를 결합시킨 후 PCR Purification Kit를 이용하여 재조합 벡터를 분리하였으며, NC-EGFP 유전자가 삽입된 재조합 벡터를 pET21a NC-EGFP로 명명하였다.
pET21a NC-EGFP 벡터를 복제하기 위하여 대장균 DH5α에 상기 벡터를 형질전환하고, LB 액체배지에서 OD 0.5 내지 0.6이 될 때까지 37℃에서 진탕 배양(shake culture)하였다. 배양이 끝난 후 배양액을 원심분리하여 대장균 펠렛(pellet)을 수거하고, plasmid extraction kit(Qiagen)를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 수거한 대장균 펠렛에서 pET21a NC-EGFP 벡터를 분리하였다. 분리한 pET21a NC-EGFP 벡터는 UV법을 이용하여 농도를 정량한 후 확인하였다.
2. NC-
EGFP
발현 및 분리, 정제
상기에서 제작한 pET21a NC-EGFP 벡터의 단백질 발현 여부를 확인하기 위하여 하기와 같이 실험하였다.
BL21(DE3)(Thermo Fisher, 미국)에 pET21a NC-EGFP 벡터를 형질전환시키고, LB 플레이트에 도말하여 37℃에서 12시간 동안 배양하였다. 12시간 후 형성된 콜로니(colony)를 LB 액체배지에 접종하고, 37℃에서 추가로 배양하였다. 약 12시간 후 OD 0.5 내지 0.6에 도달한 배양액을 LB 액체배지 250 ㎖에 접종하고, 37℃에서 OD 0.5 내지 0.6이 되도록 3시간 내지 4시간 동안 배양하였다. 배양액의 OD가 0.5 내지 0.6이 되었을 때 배양액에 IPTG(Isopropyl β-D-thiogalactoside) 0.5 mM을 첨가하고, 25℃에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후 배양액을 원심분리하여 BL21 펠렛을 수득하고, 수득한 펠렛을 용해 버퍼(50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole 및 pH 8.0)에 현탁시킨 후 초음파 파쇄기를 이용하여 대장균을 파쇄(amplitude 40%)하였다.
상기 대장균 파쇄물을 원심분리하여 상층액과 침전물로 분리하고, 상층액을 0.45 ㎛ 필터를 이용하여 튜브에 충전시켰다. 튜브에 충전된 상층액을 Ni-NTA(nitrilotriacetic acid) 레진(resin)이 충진된 컬럼에 넣어 단백질과 레진을 서로 결합시켰다. 이후, 레진에 결합하지 않는 외래 단백질을 제거하기 위하여 세척 버퍼(50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 20 mM imidazole 및 pH 8.0)를 첨가하여 레진을 세척하였다. 이미다졸(imidazole)이 첨가된 버퍼(50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole 및 pH 8.0)를 이용하여 이동상 기울기(gradient mobile phase)로 최종 단백질을 수득하였다. 다음으로, 이미다졸을 제거하기 위하여 수득한 단백질을 멤브레인 튜브에 넣고, 이미다졸이 포함되지 않은 버퍼(20 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl 및 pH 7.2)를 이용하여 삼투압 작용에 의한 버퍼 교환을 진행하였다. 마지막으로, 이미다졸이 포함되지 않은 버퍼에 용해되어 있는 단백질을 Bradford assay를 통해 농도를 측정하여 NC-EGFP 단백질 발현을 확인하였다. 그 결과, NC 유전자 서열에 다른 서열이 결합하더라도 NC 펩티드의 발현에는 영향이 없는 것을 확인하였다.
도 1은 NC-EGFP 단백질을 SDS-PAGE로 확인한 결과를 보여주는 것으로, 약 35 kDa 크기의 NC-EGFP 단백질이 발현된 것을 확인할 수 있다.
3. NC 펩티드의 세포막 투과성 분석
3-1. 세포 배양
HeLa, RAW264.7 및 293FT 세포는 10% FBS와 100 U/㎖ 페니실린/스트렙토마이신이 추가된 DMEM 배지에서 배양하고, MDCK 세포는 10% FBS와 100 U/㎖ 페니실린/스트렙토마이신이 추가된 EMEM 배지(Hyclone, Logan, UT, USA)에서 배양하였다. THP-1 및 CEM 세포는 10% FBS와 100 U/㎖ 페니실린/스트렙토마이신이 추가된 RPMI-1640 배지(Hyclone, Logan, UT, USA)에서 배양하였다. 모든 세포는 37℃, 5% CO2의 가습 항온기에서 배양하였다.
3-2. NC 펩티드 세포막 투과성 분석-
FACS
(Fluorescence-activated cell sorting)
상기 3-1에서 배양한 다양한 종류의 세포를 1x106 세포/웰의 밀도로 6-웰 플레이트에 접종한 후, 24시간 동안 배양하여 플레이트에 세포를 부착시켰다. 이후, 펩티드 농도(0.5, 1.0, 2.5, 5.0 및 10 μM) 또는 펩티드 처리 시간에 차이를 두어 FITC가 결합(conjugation)된 NC 펩티드(이하 'FITC-NC 펩티드'로 표기함), EGFP가 결합된 NC 펩티드(이하 'NC-EGFP 펩티드'로 표기함) 또는 EGFP가 결합된 Tat 펩티드(이하 'Tat-EGFP 펩티드'로 표기함)를 각각 세포에 처리하였다. 상기 펩티드는 chempeptide(중국) 및 Life tein(미국)에 주문하여 제작하였다. 이후 세포를 PBS로 3회 세척하고, 트립신(trypsin)-EDTA로 세포를 분리한 다음, 2% FBS/0.1% 소혈청알부민(bovine serum albumin, BSA)이 포함된 PBS에 현탁시켰다. 상기 현탁액을 2,000 rpm에서 2분 동안 원심분리하여 세포 펠렛을 수득하고, 수득한 세포를 3.7% 포름알데하이드(formaldehyde)로 20분 동안 고정하였다. 이후, 2,000 rpm에서 2분 동안 원심분리하여 세포 펠렛을 수득하고, PBS로 2회 세척한 후, 2% FBS 및 0.1% BSA가 포함된 PBS에 현탁시켰다. 형광활성화 세포분류기(fluorescence-activated cell sorter; FACS Calibur, Beckon Dickinson, CA, USA)를 이용하여 세포를 유동세포 계수법(flow cytometry)으로 분석하였다.
3-3. NC 펩티드 세포막 투과성 분석-면역 염색(
immunostaining
)
HeLa 세포를 1x105 세포/웰의 밀도로 글라스가 들어있는 12-웰 플레이트에 접종한 후, 24시간 동안 배양하여 세포를 글라스에 부착시켰다. 이후, FITC-NC 펩티드를 3 mM 농도로 세포에 3시간 동안 처리하였다. 3시간 후 세포를 PBS로 3회 세척한 다음, 3.7% 포름알데하이드로 20분 동안 세포를 고정시키고, 0.2% Triton X-100이 포함된 PBS를 처리하여 세포막 투과성을 증가시켰다. 이후, 3% BSA로 1시간 동안 블로킹(blocking)시킨 후, 라민(lamin A/C) 항체(Sigma-Aldrich, 미국)와 상온에서 2시간 반응시키고, PBS로 3회 세척하였다. 다음으로, Cy3 2차 항체(Cy3-conjugated secondary antibody; Jackson ImmunoResearch, 미국)를 처리하여 상온에서 1시간 동안 반응시키고, PBS로 2회 세척한 다음, DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindol)로 10분 동안 염색하였다. HeLa 세포가 부착된 글라스를 떼어내어 슬라이드 글라스 위에 올려놓고, 공초점 레이저 주사현미경(confocal laser scanning microscopy, LSM 700, Zeiss, Germany)으로 관찰하였다.
또한, NC 펩티드와 다른 세포 투과 펩티드의 투과성을 비교하기 위해 하기와 같은 방법을 이용하였다.
HeLa 세포를 1x105 세포/웰의 밀도로 글라스가 들어있는 12-웰 플레이트에 접종한 후, 24시간 동안 배양하여 세포를 글라스에 부착시켰다. 이후, FITC-NC 펩티드, FITC-Tat 펩티드(trans-activating transcriptional activator peptide), FITC-MA11 펩티드, FITC-PTD-ys 펩티드(protein transduction domain-ys peptide), FITC-TLM 펩티드(translocation motif peptide) 및 FITC-TD1 펩티드를 HeLa 세포에 3시간 동안 처리하였다. 3시간 후 세포를 PBS로 3회 세척하고, 3.7% 포름알데하이드로 20분 동안 세포를 고정시켰다. 0.2% Triton X-100이 포함된 PBS를 처리하여 세포막 투과성을 증가시키고, 3% BSA로 1시간 동안 블로킹시켰다. 이후, 튜블린(tubulin) 항체(Santa Cruz Biotechnology, 미국)와 상온에서 2시간 반응시키고, PBS로 3회 세척하였다. Cy3 2차 항체를 처리하여 상온에서 1시간 동안 반응시키고, PBS로 2회 세척한 후 DAPI로 10분 동안 염색하였다. HeLa 세포가 부착된 글라스를 떼어내어 슬라이드 글라스 위에 올려 놓고, 공초점 레이저 주사현미경으로 관찰하였다.
또한, FITC-NC 펩티드에 의한 세포막 투과 활성 변화를 확인하기 위하여 상기와 동일한 방법으로 헥사펩티드(hexapeptide), FITC-헥사펩티드, FITC-NC-헥사펩티드, FITC-13NC35 펩티드 및 FITC-29NC50 펩티드를 HeLa 세포에 3시간 동안 처리하고, 공초점 레이저 주사현미경으로 관찰하였다. 한편, 상기 사용한 헥사펩티드, PTD-ys 펩티드, TLM 펩티드, TD1 펩티드, NC-헥사펩티드, 13NC35 펩티드 및 29NC50 펩티드의 아미노산 서열은 하기 표 5와 같다.
| 이름 | 서열번호 | 아미노산 서열 |
| 헥사펩티드 | 서열번호 5 | EEMQRR |
| PTD-ys 펩티드 | 서열번호 6 | YARVRRRGPRR |
| TLM 펩티드 | 서열번호 7 | PLSSIFSRIGDP |
| TD1 펩티드 | 서열번호 8 | KAMININKFLNQC |
| NC-헥사펩티드 | 서열번호 9 | VKCFNCGKEGHTARNCRAPRKKGCWKCGKEGHQMKDCTEEEMQRR |
| 13NC35 펩티드 | 서열번호 10 | VKCFNCGKEGHTARNCRAPRKKG |
| 29NC50 펩티드 | 서열번호 11 | RAPRKKGCWKCGKEGHQMKDCT |
3-4. NC 펩티드 세포막 투과성 분석-형광분석기(
fluorometer
)
RAW264.7 세포를 5x104 세포/웰의 밀도로 24-웰 플레이트에 접종한 후 24시간 동안 배양하여 세포를 플레이트에 부착시켰다. 이후, Tat-EGFP 펩티드 및 NC-EGFP 펩티드 각각을 서로 다른 농도로 1시간 동안 처리하였다. 1시간 후 세포를 PBS로 3회 세척하고, RIPA(radio-immunoprecipitation assay) 버퍼 100 ㎖를 첨가하여 4℃에서 30분 동안 세포를 용해시켰다. 상기 세포 용해액 100 ㎖를 형광분석기용 96-웰 플레이트로 옮긴 다음, 형광분석기(Synergy MX, BIOTEK, 미국)를 이용하여 GFP 형광을 측정하였다.
또한, 상기와 동일한 방법으로 FITC가 결합된 HIV(Human immunodeficiency virus), MLV(Murine leukemia virus), SIV(Simian immunodeficiency virus) 및 RSV(Rous sarcoma virus)의 NC 펩티드(이하, 각각 FITC-HIV-NC, FITC-MLV-NC, FITC-SIV-NC, FITC-RSV-NC)와 Tat 펩티드를 1.0 μM의 농도로 RAW264.7 세포에 1시간 동안 처리한 후 형광 신호를 측정하였다.
3-5. NC 펩티드에 의한 RNA 투과(transduction) 효율 변화
MT4 세포를 2x105 세포/웰의 밀도로 24-웰 플레이트에 접종하고, 37℃ 및 5% CO2의 가습 항온기에서 24시간 동안 배양하였다. 서로 다른 농도의 NC 펩티드 2 ㎕와 siGLO (Green transfection indicator, Dharmacon, D-001630-01-05) 40 nM을 혼합하여 상온에서 30분 동안 반응시킨 후 MT4 세포에 처리하였다. 24시간 동안 추가로 배양한 후 MT4 세포를 PBS로 3회 세척하고, 형광활성화 세포분류기를 이용하여 유동세포계수법으로 분석하였다. 또한, 형광현미경 (Fluorescence inverted microscope, Olympus)으로 관찰하였다.
4. NC 펩티드 생체 내 조직 침투 및 조직 세포에의 분포 여부
3.2 ㎎/100 ㎕ 농도의 FITC-HIV-NC 펩티드 및 FITC-Tat 펩티드를 30 게이지(gauge) 주사기를 이용하여 마우스 꼬리 정맥에 각각 주사하였다. 펩티드 투여 2시간 후 마우스의 신장(kidney), 간(liver), 폐(lung), 심장(heart) 및 비장(spleen)을 적출하여 4% 파라포름알데히드로 1시간 동안 고정하고, 조직이 가라앉을 때까지 30% 수크로스(sucrose)에 담가 두었다. 이후 OCT 컴파운드(OCT compound; Leica, Germany)를 이용하여 각 조직을 냉동시키고, 냉동 절편기로 조직 절편 슬라이드를 제작하였다. 당업계에 알려진 방법에 따라 조직 절편 슬라이드를 DAPI로 10분 동안 염색한 후 공초점 레이저 주사현미경으로 관찰하였다.
또한, FITC-HIV-NC 펩티드 100 μM 스톡(stock)을 유리체 내부(intravitreal)에 1 ㎕, 망막 하(subretinal)로 2 ㎕ 투여하고, 24시간 후 마우스 안구 조직을 적출하여 상기와 동일한 방법으로 안구 조직 절편 슬라이드를 제작하였다. 슬라이드를 DAPI로 10분 동안 염색한 후 공초점 레이저 주사현미경으로 관찰하였다.
실험결과
1. 다양한 레트로바이러스 NC 펩티드의 세포막 투과 활성 확인
NC 펩티드 서열의 유사(similarity) 정도에 따라 세포막 투과 활성 정도의 차이가 있는지 여부를 확인하기 위하여 FITC가 결합된 HIV, SIV, RSV 및 MLV의 NC 펩티드와 Tat 펩티드를 1.0 μM의 농도로 RAW264.7 세포에 1시간 동안 처리하였다. 그 결과, 도 2에 나타난 것과 같이 HIV, SIV, RSV 및 MLV의 NC 펩티드가 세포막 투과성이 우수한 것을 FITC 형광 밝기를 통하여 확인할 수 있었으며, FACS 분석에서도 HIV의 NC 펩티드가 96.8%, SIV의 NC 펩티드가 54.0%, RSV의 NC 펩티드가 24.2%, MLV의 NC 펩티드가 5.7%의 세포에서 형광이 나타나는 것을 확인하였다. 상기 실험 결과는 HIV를 비롯한 여러 레트로바이러스의 NC 펩티드가 기존의 Tat 펩티드와 비교하여 세포막 투과 활성이 우수함을 의미한다. 또한, 도 2에서 보는 바와 같이, HIV, SIV, RSV 및 MLV의 NC 펩티드는 징크 핑거(zinc finger) 도메인이 보존 서열(consensus sequence)로 포함되어 있는 것을 확인할 수 있었다.
한편, 상기 사용한 HIV, SIV, RSV 및 MLV의 NC 펩티드의 아미노산 서열은 하기 표 6과 같다.
| 이름 | 서열번호 | 아미노산 서열 |
| HIV-NC 펩티드 | 서열번호 12 | MQRGNFRNQRKIVKCFNCGKEGHTARNCRAPRKKGCWKCGKEGHQMKDCTERQAN |
| SIV-NC 펩티드 | 서열번호 13 | RGPLKCFNCGKFGHMQRECKAPRQIKCFKCGKIGHMAKDCKN |
| RSV-NC 펩티드 | 서열번호 14 | GQTGSGGRARGLCYTCGSPGHYQAQCPKKRKSGNSRERCQLCDGMGHNAKQCRKRDGNQGQRP |
| MLV-NC 펩티드 | 서열번호 15 | ATVVSGQKQDRQGGERRRSQLDRDQCAYCKEKGHWAKDCPKKPRGPRGPRPQTSLL |
2. HIV-NC 펩티드의 세포막 투과 활성 확인
상기 실험에서 세포막 투과 활성이 가장 높은 HIV-NC 펩티드(서열번호 12)를 대상으로 세포막 투과 활성을 농도별로 확인하기 위하여 FITC-HIV-NC 펩티드를 0.5, 1, 2.5, 5.0 및 10 μM의 농도로 1시간 동안 RAW264.7 대식세포에 처리하였다. 1시간 후 형광 현미경(Leica Micoscope Systems, 독일)으로 세포의 형광 정도를 확인한 결과, 도 3a에 나타난 것과 같이 FITC-HIV-NC 펩티드의 농도가 증가할수록 펩티드의 세포막 투과성이 높아지는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 형광분석기를 통해 확인한 결과 도 3b에 나타난 것과 같이 FITC-HIV-NC 펩티드의 농도가 증가할수록 형광신호가 증가하는 것을 확인하여 세포막 투과성이 증가함을 알 수 있었다.
또한, 처리 시간에 따른 FITC-HIV-NC 펩티드의 세포막 투과 정도를 확인하기 위하여 2.5 ㎛의 농도로 RAW264.7 세포에 20분, 40분 및 60분 동안 펩티드를 처리하였다. 그 결과, 도 3c에 나타난 것과 같이 FITC―HIV-NC 펩티드를 처리한 시간이 증가함에 따라 펩티드의 세포막 투과성이 유의하게 증가하는 것을 형광 현미경 및 FACS 분석을 통해 확인할 수 있었다.
또한, HIV-NC 펩티드의 세포막 투과성을 확인하기 위하여 HeLa 세포에 면역 염색을 수행하여 공초점 레이저 주사현미경으로 관찰하였다. 그 결과, 도 4에 나타난 것과 같이 다수의 HIV-NC 펩티드가 세포막, 세포질 및 핵막에 고루 분포하고, 일부 HIV-NC 펩티드는 핵 안쪽에 분포하는 것을 확인할 수 있었다. 상기 결과는 HIV-NC 펩티드가 낮은 농도에서 세포막을 투과할 수 있고, HIV-NC 펩티드의 세포막 투과가 빠른 시간 내에 이루어지는 것을 의미한다.
3. 다양한 세포에서 HIV-NC 펩티드의 세포막 투과 활성 확인
세포의 종류에 따라 HIV-NC 펩티드의 세포막 투과 활성에 차이가 있는지 여부를 확인하기 위하여 RAW264.7, THP-1, CEM, MDCK 및 293FT 세포에 FITC-HIV-NC 펩티드를 1.0, 2.5 및 5.0 μM의 농도로 1시간 또는 2시간 동안 처리하였다. 그 결과, 도 5a 내지 5e에 나타난 것과 같이 FITC-HIV-NC 펩티드의 농도가 증가함에 따라 펩티드의 세포막 투과성이 유의하게 증가하는 것을 형광현미경 및 FACS 분석을 통해 확인할 수 있었다. 도 5a는 RAW264.7(마우스 대식세포), 도 5b는 THP-1(인간 단핵구세포주) 세포의 결과고, 도 5c는 CEM, 도 5d는 MDCK(Madin-Darby canine kidney, 개 신장 유래 세포) 및 도 5e는 293FT(인간 태아 신장세포 유래)의 결과이다. 상기 결과는 HIV-NC 펩티드가 암세포, 면역세포, 상피세포 등의 다양한 세포막을 투과할 수 있음을 의미한다.
4. HIV-NC 펩티드와 Tat 펩티드의 세포막 투과 활성 비교
HIV-NC 펩티드의 세포막 투과 활성의 정도를 확인하기 위하여, 기존의 세포 투과 단백질로 알려진 Tat 펩티드와 비교 실험을 수행하였다. 녹색 형광 단백질(Green Fluorescence Protein, GFP)이 결합된 HIV-NC 펩티드(이하, GFP-HIV-NC 펩티드)를 0.25, 0.5, 1.0, 2.5 및 5.0 μM의 농도로, GFP-Tat 펩티드를 1.0, 2.5, 5.0 및 10 μM의 농도로 각각 1시간 동안 RAW264.7 세포에 처리하고, 1시간 후 펩티드의 형광 정도를 확인하였다. 그 결과, 도 6a 및 6b에 나타난 것과 같이 GFP-HIV-NC 펩티드는 0.25 μM의 낮은 농도에서 형광이 나타나는 반면, GFP-Tat 펩티드는 10 μM의 고농도에서도 형광이 미미하게 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 세포를 수거하여 FACS로 분석한 결과 도 6a 및 6b 에 나타난 것과 같이 GFP-HIV-NC 펩티드는 1 μM 농도에서 99.9%의 세포가 형광을 나타내지만, GFP-Tat 펩티드는 동일 농도에서 4.3%의 세포가 형광을 나타내는 것을 확인하였다.
또한, 형광 분석기를 통해 확인한 결과 도 6c에 나타난 것과 같이 GFP-HIV-NC 펩티드는 농도가 증가함에 따라 세포막 투과성 또한 증가하지만, GFP-Tat 펩티드는 처리 농도와 상관없이 세포막 투과성이 매우 낮은 것을 확인할 수 있었다. 상기 실험 결과는 기존의 세포 투과 단백질로 잘 알려진 Tat 펩티드와 비교하여 HIV-NC 펩티드가 고효율의 세포 투과 펩티드임을 의미한다.
5. HIV-NC 펩티드와 다른 세포 투과 펩티드의 세포 투과 활성 비교
FITC-HIV-NC 펩티드, FITC-Tat 펩티드, FITC-MA11 펩티드, FITC-PTD-ys 펩티드, FITC-TLM 펩티드, FITC-TD1 펩티드를 HeLa 세포에 처리한 후 각 펩티드의 세포막 투과 정도를 확인하였다.
그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이 FITC-TLM 펩티드 및 FITC-TD1 펩티드는 20 μM의 고농도로 처리하였음에도 불구하고 세포막을 거의 투과하지 못하였으나, FITC-HIV-NC 펩티드는 3 μM로 처리하여도 형광신호가 강하게 나타나 세포막 투과 활성이 현저히 우수한 것을 확인할 수 있었다. 또한, FITC-HIV-NC 펩티드의 세포막 투과 활성은 FITC-MA11 펩티드와 비교하여 약 2.5배, FITC-Tat 펩티드와 비교하여 약 7배, FITC-PTD-ys 펩티드와 비교하여 약 10배 정도 우수한 것을 확인할 수 있었다.
6. NC 펩티드 내
징크
핑거
도메인의 세포막 투과 활성 확인
실험결과 1에서 여러 종의 레트로바이러스 NC 펩티드가 세포막 투과 활성이 있음을 확인하였으며, 도 2에서 보는 바와 같이, HIV, SIV, RSV는 2개, MLV는 1개의 징크 핑거 도메인(zinc finger domain)이 있음을 확인하였다.
이에, 세포막 투과 활성이 여러 NC 펩티드 내의 보존 서열(consensus sequence)인 징크 핑거 도메인에 의해 나타나는 것인지 여부를 확인하기 위하여, HIV-NC 펩티드의 13번째 아미노산에서 35번째 아미노산으로 이루어진 첫번째 징크 핑거 도메인을 포함하는 펩티드(13NC35 펩티드, 서열번호 10)와 29번째 아미노산에서 50번째 아미노산으로 이루어진 두번째 징크 핑거 도메인을 포함하는 펩티드(29NC50 펩티드, 서열번호 11)을 대상으로 FITC를 결합시켜 HeLa 세포에서 세포막 투과 활성을 확인하였다.
그 결과, 도 8 및 도 9에서 보는 바와 같이 13NC35 펩티드와 29NC50 펩티드 모두 농도에 비례하여 형광신호가 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 이는 NC 펩티드의 징크 핑거 도메인이 세포막 투과 활성을 나타내는 중요한 부분임을 의미하는 결과이다.
한편, HIV, SIV, RSV 및 MLV의 NC 펩티드의 징크 핑거 도메인의 아미노산 서열을 하기 표 7에 표시하였다.
| 이름 | 서열번호 | 아미노산 서열 |
| HIV-NC 1st 징크 핑거 도메인 | 서열번호 17 | CFNCGKEGHTARNC |
| HIV-NC 2nd 징크 핑거 도메인 | 서열번호 18 | CWKCGKEGHQMKDC |
| SIV-NC 1st 징크 핑거 도메인 | 서열번호 19 | CFNCGKEGHMQREC |
| SIV-NC 2nd 징크 핑거 도메인 | 서열번호 20 | CFKCGKIGHMAKDC |
| RSV-NC 1st 징크 핑거 도메인 | 서열번호 21 | CYTCGSPGHYQAQC |
| RSV-NC 2nd 징크 핑거 도메인 | 서열번호 22 | CQLCDGMGHNAKQC |
| MLV-NC 징크 핑거 도메인 | 서열번호 23 | CAYCKEKGHWAKDC |
7. HIV-NC 펩티드 생체 내 조직 침투 및 조직 세포에의 분포 여부 확인
NC 펩티드가 생체 내 조직으로 침투하여 조직 세포에 고루 분포되는지 여부를 확인하기 위하여, 마우스 미정맥에 HIV-NC 펩티드를 투여한 결과, 도 10에 나타난 바와 같이 신장, 간, 폐, 심장 및 비장 조직 세포에 잘 분포하는 것을 알 수 있었다. 특히 신장, 간 및 폐 조직 세포에 대한 분포 효율이 현저히 우수하였다. 반면, Tat 펩티드는 신장을 제외한 다른 조직에는 거의 분포하지 못하는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 안구의 유리체 내와 망막 하 투여 경로를 통해 HIV-NC 펩티드를 투여한 결과, 도 11에 나타난 바와 같이 형광신호가 강하게 나타나는 것을 확인하여 HIV-NC 펩티드가 안구 투여 경로를 통해 안구 조직을 침투하여 망막 세포에 잘 분포하는 것을 알 수 있었다.
8. HIV-NC 펩티드에 의한 폴리펩티드의 세포막 투과 여부 확인
폴리펩티드를 카고(cargo)로 하여 HIV-NC 펩티드에 의한 세포막 투과가 가능한지 여부를 확인하기 위하여 HIV-NC 펩티드에 헥사펩티드를 결합하여 세포에 처리하여 형광신호를 관찰하였다. 그 결과, 도 12에 나타난 바와 같이 헥사펩티드 자체는 세포막을 투과하지 못하지만 HIV-NC 펩티드와 결합한 경우 세포막 투과가 가능하며, 농도에 비례하여 세포막 투과 활성이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
9. HIV-NC 펩티드에 의한 폴리뉴클레오티드의 세포막 투과 여부 확인
폴리뉴클레오티드를 카고(cargo)로 하여 HIV-NC 펩티드에 의한 세포막 투과가 가능한지 여부를 확인하기 위하여 HIV-NC 펩티드와 siGLO RNA를 결합하여 MT4 세포에 처리한 후 세포를 관찰하였다. 그 결과, 도 13에 나타난 바와 같이 HIV-NC 펩티드의 처리 농도에 따라 GFP 형광 신호가 증가하는 것을 확인하여 siGLO의 세포막 투과 정도가 증가한 것을 알 수 있었다. 이 결과는 HIV-NC 펩티드가 폴리뉴클레오티드의 세포막 투과 정도를 현저하게 개선시킬 수 있음을 의미한다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
<110> Avixgen Incorporation
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polynucleotide
<400> 1
catatgcagc ggggaactt 19
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<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polynucleotide
<400> 2
tccggagttt gcctgtctc 19
<210> 3
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polynucleotide
<400> 3
tccggagtga gcaagggcga 20
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polynucleotide
<400> 4
aagcttcttg tacactctcg t 21
<210> 5
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hexapeptide
<400> 5
Glu Glu Met Gln Arg Arg
1 5
<210> 6
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PTD-ys peptide
<400> 6
Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg
1 5 10
<210> 7
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TLM peptide
<400> 7
Pro Leu Ser Ser Ile Phe Ser Arg Ile Gly Asp Pro
1 5 10
<210> 8
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TD1 peptide
<400> 8
Lys Ala Met Ile Asn Ile Asn Lys Phe Leu Asn Gln Cys
1 5 10
<210> 9
<211> 45
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NC-hexapeptide
<400> 9
Val Lys Cys Phe Asn Cys Gly Lys Glu Gly His Thr Ala Arg Asn Cys
1 5 10 15
Arg Ala Pro Arg Lys Lys Gly Cys Trp Lys Cys Gly Lys Glu Gly His
20 25 30
Gln Met Lys Asp Cys Thr Glu Glu Glu Met Gln Arg Arg
35 40 45
<210> 10
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 13NC35 peptide
<400> 10
Val Lys Cys Phe Asn Cys Gly Lys Glu Gly His Thr Ala Arg Asn Cys
1 5 10 15
Arg Ala Pro Arg Lys Lys Gly
20
<210> 11
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 29NC50 peptide
<400> 11
Arg Ala Pro Arg Lys Lys Gly Cys Trp Lys Cys Gly Lys Glu Gly His
1 5 10 15
Gln Met Lys Asp Cys Thr
20
<210> 12
<211> 55
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HIV-NC peptide
<400> 12
Met Gln Arg Gly Asn Phe Arg Asn Gln Arg Lys Ile Val Lys Cys Phe
1 5 10 15
Asn Cys Gly Lys Glu Gly His Thr Ala Arg Asn Cys Arg Ala Pro Arg
20 25 30
Lys Lys Gly Cys Trp Lys Cys Gly Lys Glu Gly His Gln Met Lys Asp
35 40 45
Cys Thr Glu Arg Gln Ala Asn
50 55
<210> 13
<211> 42
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SIV-NC peptide
<400> 13
Arg Gly Pro Leu Lys Cys Phe Asn Cys Gly Lys Phe Gly His Met Gln
1 5 10 15
Arg Glu Cys Lys Ala Pro Arg Gln Ile Lys Cys Phe Lys Cys Gly Lys
20 25 30
Ile Gly His Met Ala Lys Asp Cys Lys Asn
35 40
<210> 14
<211> 63
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RSV-NC peptide
<400> 14
Gly Gln Thr Gly Ser Gly Gly Arg Ala Arg Gly Leu Cys Tyr Thr Cys
1 5 10 15
Gly Ser Pro Gly His Tyr Gln Ala Gln Cys Pro Lys Lys Arg Lys Ser
20 25 30
Gly Asn Ser Arg Glu Arg Cys Gln Leu Cys Asp Gly Met Gly His Asn
35 40 45
Ala Lys Gln Cys Arg Lys Arg Asp Gly Asn Gln Gly Gln Arg Pro
50 55 60
<210> 15
<211> 56
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MLV-NC peptide
<400> 15
Ala Thr Val Val Ser Gly Gln Lys Gln Asp Arg Gln Gly Gly Glu Arg
1 5 10 15
Arg Arg Ser Gln Leu Asp Arg Asp Gln Cys Ala Tyr Cys Lys Glu Lys
20 25 30
Gly His Trp Ala Lys Asp Cys Pro Lys Lys Pro Arg Gly Pro Arg Gly
35 40 45
Pro Arg Pro Gln Thr Ser Leu Leu
50 55
<210> 16
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic polypeptide
<220>
<221> UNSURE
<222> (2)
<223> Ala, Val, Ile, Leu, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Thr, Asn or Gln
<220>
<221> UNSURE
<222> (3)
<223> Ala, Val, Ile, Leu, Met, Phe, Tyr, Trp, Arg, His, Lys, Asn, Ser,
Thr or Gln
<220>
<221> UNSURE
<222> (5)
<223> Asp, Glu, Arg, His, Lys, Ser, Thr, Asn, Gln or Gly
<220>
<221> UNSURE
<222> (6)
<223> Asp, Glu, Arg, His, Lys, Ser, Thr, Asn, Gln or Gly
<220>
<221> UNSURE
<222> (7)
<223> Asp, Glu, Arg, His, Lys, Ala, Val, Ile, Leu, Met, Phe, Tyr, Trp
or Pro
<220>
<221> UNSURE
<222> (10)
<223> Ser, Thr, Asn, Gln, Ala, Val, Ile, Leu, Met, Phe, Tyr or Trp
<220>
<221> UNSURE
<222> (11)
<223> Ser, Thr, Asn, Gln, Ala, Val, Ile, Leu, Met, Phe, Tyr or Trp
<220>
<221> UNSURE
<222> (12)
<223> Lys, Ala or Arg
<220>
<221> UNSURE
<222> (13)
<223> Asp, Glu, Ser, Thr, Asn or Gln
<400> 16
Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Gly His Xaa Xaa Xaa Xaa Cys
1 5 10
<210> 17
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HIV-NC 1st zinc finger domain
<400> 17
Cys Phe Asn Cys Gly Lys Glu Gly His Thr Ala Arg Asn Cys
1 5 10
<210> 18
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HIV-NC 2nd zinc finger domain
<400> 18
Cys Trp Lys Cys Gly Lys Glu Gly His Gln Met Lys Asp Cys
1 5 10
<210> 19
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SIV-NC 1st zinc finger domain
<400> 19
Cys Phe Asn Cys Gly Lys Glu Gly His Met Gln Arg Glu Cys
1 5 10
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<211> 14
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<220>
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<400> 20
Cys Phe Lys Cys Gly Lys Ile Gly His Met Ala Lys Asp Cys
1 5 10
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<211> 14
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RSV-NC 1st zinc finger domain
<400> 21
Cys Tyr Thr Cys Gly Ser Pro Gly His Tyr Gln Ala Gln Cys
1 5 10
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<211> 14
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<220>
<223> RSV-NC 2nd zinc finger domain
<400> 22
Cys Gln Leu Cys Asp Gly Met Gly His Asn Ala Lys Gln Cys
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<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MLV-NC zinc finger domain
<400> 23
Cys Ala Tyr Cys Lys Glu Lys Gly His Trp Ala Lys Asp Cys
1 5 10
Claims (13)
- 다음의 일반식 I로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 세포 투과 펩티드:
[일반식 I]
Cys-Xaa1-Xaa2-Cys-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Gly-His-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Cys
상기 일반식에서 Xaa1는 Ala, Val, Ile, Leu, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Thr, Asn 및 Gln으로 이루어진 군으로부터 선택되고,
Xaa2는 Ala, Val, Ile, Leu, Met, Phe, Tyr, Trp, Arg, His, Lys, Asn, Ser, Thr 및 Gln으로 이루어진 군에서 선택되며,
Xaa3 및 Xaa4는 서로 독립적으로 Asp, Glu, Arg, His, Lys, Ser, Thr, Asn, Gln 및 Gly로 이루어진 군에서 선택되고,
Xaa5는 Asp, Glu, Arg, His, Lys, Ala, Val, Ile, Leu, Met, Phe, Tyr, Trp 및 Pro으로 이루어진 군에서 선택되며,
Xaa6 및 Xaa7은 서로 독립적으로 Ser, Thr, Asn, Gln, Ala, Val, Ile, Leu, Met, Phe, Tyr 및 Trp로 이루어진 군에서 선택되고,
Xaa8은 Lys, Ala 또는 Arg이며,
Xaa9은 Asp, Glu, Ser, Thr, Asn 및 Gln로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산이다.
- 다음의 일반식 I로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 말단에 세포 내 운반 대상의 카고(cargo)가 결합되어 있는 세포내 전달체:
[일반식 I]
Cys-Xaa1-Xaa2-Cys-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Gly-His-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Cys
상기 일반식에서 Xaa1는 Ala, Val, Ile, Leu, Met, Phe, Tyr, Trp, Ser, Thr, Asn 및 Gln으로 이루어진 군으로부터 선택되고,
Xaa2는 Ala, Val, Ile, Leu, Met, Phe, Tyr, Trp, Arg, His, Lys, Asn, Ser, Thr 및 Gln으로 이루어진 군에서 선택되며,
Xaa3 및 Xaa4는 서로 독립적으로 Asp, Glu, Arg, His, Lys, Ser, Thr, Asn, Gln 및 Gly로 이루어진 군에서 선택되고,
Xaa5는 Asp, Glu, Arg, His, Lys, Ala, Val, Ile, Leu, Met, Phe, Tyr, Trp 및 Pro으로 이루어진 군에서 선택되며,
Xaa6 및 Xaa7은 서로 독립적으로 Ser, Thr, Asn, Gln, Ala, Val, Ile, Leu, Met, Phe, Tyr 및 Trp로 이루어진 군에서 선택되고,
Xaa8은 Lys, Ala 또는 Arg이며,
Xaa9은 Asp, Glu, Ser, Thr, Asn 및 Gln로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산이다.
- 레트로바이러스(retrovirus)의 NC 펩티드 말단에 세포 내 운반 대상의 카고가 결합되어 있는 세포내 전달체.
- 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 세포 내 운반 대상의 카고는 화학물질, 폴리펩티드, 핵산, 탄수화물 또는 지질인 것인 세포내 전달체.
- 제3항에 있어서, 상기 레트로바이러스는 HIV(Human immunodeficiency virus), MLV(Murine leukemia virus), SIV(Simian immunodeficiency virus) 및 RSV(Rous sarcoma virus)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 세포내 전달체.
- 제2항에 있어서, 상기 일반식 I로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드는 서열번호 17 내지 서열번호 23의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 세포내 전달체.
- 제3항에 있어서, 상기 NC 펩티드는 서열번호 12 내지 서열번호 15의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 세포내 전달체.
- 제2항의 세포내 전달체를 세포에 접촉시키는 단계를 포함하는 세포 내 운반 대상의 카고를 세포 내로 전달하는 방법.
- 레트로바이러스의 NC 펩티드 말단에 세포 내 운반 대상의 카고가 결합되어 있는 세포내 전달체를 세포에 접촉시키는 단계를 포함하는 세포 내 운반 대상의 카고를 세포 내로 전달하는 방법.
- 제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 세포 내 운반 대상의 카고는 화학물질, 폴리펩티드, 핵산, 탄수화물 또는 지질인 것인 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 레트로바이러스는 HIV(Human immunodeficiency virus), MLV(Murine leukemia virus), SIV(Simian immunodeficiency virus) 및 RSV(Rous sarcoma virus)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 일반식 I로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드는 서열번호 17 내지 서열번호 23의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 NC 펩티드는 서열번호 12 내지 서열번호 15의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
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