JP2019537486A - 眼底の蛍光分析のための空間的超解像装置 - Google Patents

Abstract

サンプル眼の眼底分析のための蛍光顕微鏡装置であって、サンプル眼内にベッセルビームを生成するように構成された光学機器と、蛍光顕微鏡装置の全焦点距離を短くすることによって「対物レンズ−角膜−レンズ」アセンブリの開口数を増加させるように構成された対物レンズとの使用に基づき、従来の顕微鏡システムと比較して空間分解能の大幅な向上をも可能にする、蛍光顕微鏡装置。

Description

本発明は、診断を目的とした眼底分析用の蛍光顕微鏡に関し、ベッセルビームの使用に基づく顕微鏡装置に関する。この蛍光顕微鏡装置は、眼底を励起し、眼底での蛍光信号を空間的超解像で検出することを可能にし、走査ビームの開口数を制限せず、取得画像中のノイズ、特に、タンパク質、または眼の網膜で観察される他の特定の分子を識別するために使用可能なマーカに関連した信号に対する、眼内組織の自家蛍光によるバックグラウンドノイズのレベルを大幅に低減することができ、その結果、単純、効率的、確実、且つ安価な方法で、取得画像の分解能を上げることができる。

この数十年で、暗視野顕微鏡とも呼ばれる蛍光顕微鏡は、生物学的分野における研究活動のための基本的なツールとなった。緑色蛍光タンパク質、すなわちＧＦＰはインビボの蛍光顕微鏡検査も可能にするので、合成染料および、それに続いて、ＧＦＰを使用することによって、形態分析および機能分析の両方のために、細胞内部を高分解能で可視化できるようになった。

共焦点技術、主に共焦点レーザ走査型顕微鏡（ＣＬＳＭ）およびスピニングディスク型共焦点顕微鏡（ＳＤＣＭ）、ならびに、減少した蛍光細胞集団に基づく構造化光学顕微鏡および構造化光学顕微鏡技術などの超解像技術、例えば、光活性化局在顕微鏡（ＰＡＬＭ）および確率的光学再構成顕微鏡法（ＳＴＯＲＭ）は、さらなる前進を可能にし、横方向分解能「ｘ−ｙ」（光軸に直交する平面内、ｘ軸およびｙ軸はサンプルの平面内にあるものとする）および（サンプルの平面と直交する光軸に沿った）軸方向分解能「ｚ」を改善する可能性を生み、したがって、（数十ナノメートルに達することができる分解能によって）非常に高い詳細レベルで細胞の３Ｄ再構成を行う可能性をもたらした。

しかしながら、そのような共焦点技術および超解像技術にはいくつかの欠点がある。

第一に、サンプルの濁りによる拡散効果、および焦点が合っていない面による蛍光バックグラウンドのために、試料の厚さが制限される（一般に、２０マイクロメートルより厚いサンプルで測定を行うことは困難である）。

また、両方の技術で、分解能力は信号対ノイズ比、すなわちＳ／Ｎ比によって制限され、信号取得装置および周辺環境のノイズと、焦点が合っていない面およびサンプルの濁りによる蛍光バックグラウンドノイズとの両方が、全体のノイズに影響する。特に、この比率は、構造化光学超解像方法で使用される逆畳み込みアルゴリズムを形成する高次の多項式の使用を制限する。

さらに、焦点が合っていない面の蛍光信号は、励起光に対する依存性が、注目信号と同一であるため、励起強度または露光時間を増加させても、捕捉センサ、例えばＣＣＤ、またはｓＣＭＯＳ（科学的ＣＭＯＳ）センサの飽和による限界を超えて性能を改善することはできない。

このような状況において、本発明に従って提案された解決方法が導入されると、従来技術の解決方法における前述の問題を解決することができる。

したがって、本発明の目的は、眼球のような厚いサンプルを検査するための蛍光顕微鏡装置の焦点深度特性を高め、空間分解能を高めて、単純、効率的、確実、且つ安価な方法で、信号対ノイズ比を改善することである。

本発明の具体的な主題は、患者のサンプル眼の眼底を分析するための蛍光顕微鏡装置であって、
− 第１の光源から基本光ビームを受光し、励起光ビームを生成するように構成された生成光学ユニットと、
− 生成光学ユニットから励起光ビームを受光し、励起光ビームがサンプル眼の眼底の少なくとも一部分を走査するように構成された走査システムと、
− 走査システムから励起光ビームを受光し、蛍光ビーム内の、サンプル眼の蛍光分子の等方性放射を少なくとも部分的にコリメートするように構成された光学出射ユニットであって、焦点距離ｆ_ｏｂｊおよびＫ_ｏｂｊ＝１／ｆ_ｏｂｊ（式中、ｎは媒質の屈折率である）に等しい屈折力Ｋ_ｏｂｊを有する対物レンズを備える光学出射ユニット（１９）と、
− サンプル眼の角膜およびレンズを光学出射ユニットに向けて、頭部を支持し、サンプル眼を対物レンズから距離ｄ離れた出射位置に位置決めするように構成された、患者の頭部支持および位置決めユニットであって、出射位置において、光学出射ユニットならびにサンプル眼の角膜およびレンズは、

（式中、ｆ_ｅｆｆは光出射アセンブリの有効焦点距離であり、Ｋ_ｅｙｅは一定の屈折力の寄与率、ｎ_ｉはサンプル眼と対物レンズとの間の媒質の屈折率である）に等しい有効屈折力Ｋ_ｅｆｆを有する光出射アセンブリを形成する、患者の頭部支持および位置決めユニットと、
− 光学出射ユニットから出射する蛍光ビームを検出するように構成されたセンサデバイスと、
− 生成光学ユニットから出射する上記励起光ビームを透過して走査システムに向け、光学出射ユニットおよび走査システムから出射する上記蛍光ビームを透過してセンサデバイスに向けるように構成された１つ以上の光学部品と
を有し、
上記患者の頭部支持および位置決めユニットがサンプル眼を出射位置に位置決めすると、光学出射ユニットならびにサンプル眼の角膜およびレンズによって形成される上記光出射アセンブリは、励起光ビームをサンプル眼の眼底の上記少なくとも一部分に送るように構成され、生成光学ユニットは、励起光ビームが光出射アセンブリを通過した後に、光伝搬軸に直交する平面に対応するサンプル眼の内部のベッセルビームに合成されるように構成された位相関係を有する励起光ビームを生成するように構成され、
上記平面は、サンプル眼のレンズとサンプル眼の眼底の上記少なくとも一部分との間にあり、対物レンズの焦点距離ｆ_ｏｂｊは、ＮＡ_ｅｆｆ＝ｎ_ｅｙｅ・ｓｉｎ（Ｒ_ｅｙｅ／ｆ_ｅｆｆ）（式中、ｎ_ｅｙｅはサンプル眼の屈折率、Ｒ_ｅｙｅはサンプル眼の半径である）で与えられる上記光出射アセンブリの有効開口数ＮＡ_ｅｆｆが０．９以上の条件を満たす、
蛍光顕微鏡装置である。

本発明の追加の観点によれば、上記患者の頭部支持および位置決めユニットがサンプル眼を出射位置に位置決めするとき、対物レンズからサンプル眼までの距離ｄは、２０ｍｍ以下、任意選択的に１０ｍｍ以下、より任意選択的に５ｍｍ以下、さらにより任意選択的に２ｍｍ以下である。

本発明の別の観点によれば、上記蛍光顕微鏡装置は、励起光ビームから疑似蛍光バックグラウンドを除去するように構成された少なくとも１つの第１の狭帯域除去フィルタを含むことができる。

本発明のさらなる観点によれば、上記対物レンズは、単一または二重のアダプティブレンズ、任意選択的に接触式のアダプティブレンズであり、対物レンズからサンプル眼までの距離ｄはゼロである。

本発明の追加の観点によれば、上記蛍光顕微鏡装置は、上記蛍光ビームをセンサデバイス上に集束させるように構成された撮像光学ユニットを含むことができる。

本発明の別の観点によれば、上記センサデバイスは、光電子増倍管、アバランシェダイオード、ＣＣＤ、またはＳＣＭＯＳを含む群から選択される複数の検知素子を含むことができる。

本発明のさらなる観点によれば、上記蛍光顕微鏡装置は、センサデバイスの上流に配置された複数のマイクロレンズを含むことができ、各マイクロレンズは、センサデバイスの複数の検知素子のそれぞれの素子に双方向に（ｂｉｕｎｉｖｏｃａｌｌｙ）結合されている。

本発明の追加の観点によれば、上記蛍光顕微鏡装置は、生成光学ユニットによって生成された励起光ビームによって走査されるサンプル眼の少なくとも一部分を内部に含む、サンプル眼の少なくとも１つの追加部分を励起するように構成された追加の励起光ビームを生成する第２の光源を含むことができ、上記追加の励起光ビームは、サンプル眼の眼内組織の自家蛍光を飽和させるように構成されている。

本発明の別の観点によれば、上記生成光学ユニットは、光学出射ユニットのフーリエ面上に配置された静的光学位相フィルタ、任意選択的に複数の誘電体層からなる二次元格子、より任意選択的には位相マスクを備えたアキシコンレンズを含むことができる。

本発明のさらなる観点によれば、上記生成光学ユニットは、空間光変調器、任意選択的に位相空間光変調器、またはフーリエレンズを伴う振幅空間光変調器を含むことができる。

本発明の追加の観点によれば、上記走査システムは、２つの別々のモータによって独立して回転するように構成され、同期的に制御されるように構成された、第１および第２の楔形部分（ｗｅｄｇｅ）を含むことができ、２つの楔形部分は、任意選択的に、少なくとも１／５０度に等しい角度位置の分解能を有し、走査分解能は±１°の視野上で少なくとも１マイクロラジアンに等しい。

本発明の別の観点によれば、上記蛍光顕微鏡装置は、サンプル眼の網膜下構造を撮像するための近赤外（ＮＩＲ）で動作する広視野撮像システムと、走査システムと光学出射ユニットとの間に配置された追加の光学部品とを備えることができ、上記追加の光学部品は、近赤外の放射に対して透明であり、且つ走査システムからの励起光ビームを光学出射ユニットに向かって、光学出射ユニットからの蛍光光ビームを走査システムに向けて反射するように構成され、上記システムは、
− 上記追加の光学部品に送られる第１のＮＩＲ光ビームを生成するように構成された第３の光源と、
− サンプル眼の網膜下構造によって反射され、追加の光学部品から出射される第２の反射ＮＩＲ光ビームを検出するように構成された、任意選択的にはＣＣＤセンサまたはＳＣＭＯＳセンサであるＮＩＲセンサデバイス、任意選択的に１００フレーム／秒以上の周波数で動作するように構成されたＮＩＲセンサデバイスと、
− 第３の光源からの上記第１のＮＩＲ光ビームを透過して上記追加の光学部品に向け、上記追加の光学部品から出射される上記第２の反射ＮＩＲ光ビームを透過してＮＩＲセンサデバイスに向けるように構成された１つ以上のＮＩＲ光学部品と
を有する。

本発明のさらなる観点によれば、上記撮像システムは、第２のＮＩＲ光ビームをＮＩＲセンサデバイス上に集束させるように構成された撮像光学ユニットを含むことができる。

本発明の追加の観点によれば、上記装置は、上記第１のＮＩＲ光ビームから疑似蛍光バックグラウンドを除去するように構成された少なくとも１つの第２の狭帯域除去フィルタを含むことができる。

本発明は、対物レンズの後ろに配置され、蛍光顕微鏡の全焦点距離を短くすることによって「対物レンズ−角膜−レンズ」アセンブリの開口数を増加させるように構成された、ベッセルビームを生成するための光学機器の使用に基づく。

ベッセルビームの基本的な特性は、発散せずに伝搬すること（少なくとも人間の眼の内側の経路が約２４ｍｍに等しい場合）、ビーム径をλ／２（λは、ビーム波長）に制限できること（ビームを生成する光学システムの開口数に依存）、濁った流体中に存在するものなどの、散乱要素によってもたらされ得るあらゆる干渉を受けても再生できることである。これにより、従来技術に対して大きな利点を達成することを可能にし、例えば、本発明の装置が、眼底を走査することができ、蛍光領域の存在を角度的に分解することができる、高い角度空間分解能を有することを可能にする。本発明のさらなる利点は、蛍光領域のマッピング、蛍光領域がベッセルビームの直径よりも大きい場合における上記蛍光領域のサイズの測定、または、上記蛍光領域をサブ回折、すなわちビーム直径以下として定義することを達成できることである。本発明のさらに別の利点は、眼底全体または中心窩の２〜３倍に等しい領域の角度走査を可能にすることである。

ここで、本発明は、好ましい実施形態に従って、特に添付の図面を参照することによって、限定ではなく例示として説明される。

本発明による眼底分析用の蛍光顕微鏡装置の第１の実施形態の図を示す。 本発明による眼底分析用の蛍光顕微鏡装置の第２の実施形態の図を示す。 従来技術の装置（図３ａおよび図３ｃ）の異なるビーム集束モードと、本発明による装置（図３ａ）との比較を示す図である。 本発明による眼底分析用の蛍光顕微鏡装置の第３の実施形態の図を示す。 本発明による眼底分析用の蛍光顕微鏡装置の第４の実施形態の図を示す。 本発明による眼底分析用の蛍光装置顕微鏡の１つの実施形態の生成光学ユニットの図を示す。 本発明による眼底分析用の蛍光装置顕微鏡の他の１つの実施形態の生成光学ユニットの図を示す。 本発明による眼底分析用の蛍光装置顕微鏡の他の１つの実施形態の生成光学ユニットの図を示す。 本発明による眼底分析用の蛍光装置顕微鏡の他の１つの実施形態の生成光学ユニットの図を示す。 本発明による眼底分析用の蛍光顕微鏡装置の１つの実施形態の角度走査システムの図を示す。 本発明による眼底分析用の蛍光顕微鏡装置の他の１つの実施形態の角度走査システムの図を示す。

図面において、同様の要素には同一の参照番号が使用される。

図１は、本発明による眼底分析用の蛍光顕微鏡装置の第１の実施形態を概略的に示し、全体が参照番号１００で示される。蛍光顕微鏡装置１００は、サンプル眼７の眼底に存在する任意の蛍光分子を励起するような波長λを有する第１のレーザ光源１を備える。そのような第１の光源１は、空気または光ファイバを介して、基本光ビームを、蛍光励起光ビームを生成するように構成された生成光学ユニット２に送る。上記蛍光励起光ビームは、適切な光学出射ユニット１９を通過することによって、サンプル眼７のレンズ８を通過後数ミリメートルで、（少なくとも、サンプル眼７の眼底を含む、光軸に沿った空間範囲内で）ベッセルビーム、すなわち、回析および拡散なく伝搬し、サンプル眼７の濁った流体中で遭遇する可能性があるような散乱要素の干渉後に自己再生する特性を有するビームに合成されるような、位相関係を有する。特に、励起光ビームは、少なくとも１０・ｚ_Ｒよりも長いビーム伝搬軸（ｚ軸）に沿った距離にわたって、ベッセルビームに合成される。式中、ｚ_Ｒはシステムの開口数（ＮＡ）に反比例するレイリー長であり、ｚ_Ｒ∝λ／（π・ＮＡ^２）である。

励起光ビームは、励起光ビームから、他の光源による波長、およびレーザ光が、交差する光学部品（光ファイバ、光学レンズなど）を通過するときにレーザ光によって生成される可能性がある疑似蛍光バックグラウンドを除去するように構成された第１の狭帯域除去フィルタ３を（少なくとも）通過し、その後、励起光ビームを、励起光ビームの光伝搬軸（ｚ軸）に直交する「ｘ−ｙ」平面上の励起光ビームの位置を変えるように構成された走査システム５に向けて反射するように構成された第１のダイクロイックフィルタ４に入射し、それによってサンプル眼（７）の眼底の平面の走査を実行する。

励起光ビームは走査システム５から出射して、光学収差を最小にするように構成された、１つ以上の光学部品を有する対物レンズを含む光学出射ユニット１９を通過する。本発明による装置の動作中、すなわち本発明による装置がサンプル眼７に適用されるとき、光学出射ユニット１９は、サンプル眼７の角膜およびレンズ８と共に、光出射アセンブリを形成する。好ましい実施形態では、対物レンズは、単一レンズまたは二重レンズ（図１の参照番号６によって示されるものなど）であり得るアダプティブレンズであり、任意選択的に、サンプル眼７と接触するアダプティブレンズ（図２の参照番号６’で示されるものなど）である。上記光学出射ユニット１９は、レンズ８とサンプル眼７の眼底との間に配置され、任意選択的にサンプル眼７の眼底に配置された、光軸「ｚ」に直交する平面「ｘ−ｙ」に平行な平面Ａに対応して、サンプル眼７の内部で、ベッセルビームに励起光ビームを合成するように構成されている。

眼は通常、約２０ミリメートルに等しい焦点距離ｆ_ｅｙｅ（ｆ_ｅｙｅ＝２０ｍｍ）および約６ミリメートルに等しい半径Ｒ_ｅｙｅ（Ｒ_ｅｙｅ＝６ｍｍ）を有するレンズと同等に作用するため、眼は通常、レンズの半径と焦点距離の比で求められ、このレンズでは約０．３に等しい（ＮＡ_ｅｙｅ≒０．３）開口数ＮＡ_ｅｙｅを有する。実際には、人間の眼球は、約０．２に等しい（ＮＡ_ｅｙｅ≒０．２）、より低い開口数値も有し得る。光学出射ユニット１９の存在を無視すると、眼に入射するベッセルビームの横方向寸法ｔは、
ｔ＝λ／（２×ＮＡ_ｅｙｅ） ［１］
で表される。式中、λは第１の光源１の波長であり、サンプル眼７の開口数ＮＡ_ｅｙｅの値によって、λ／２に近いベッセルビームの横方向分解能は得られないだろう。このため、その対物レンズ６（または６’）は、サンプル眼７の角膜およびレンズ８に近い距離ｄに配置される。

このベッセルビームの横方向分解能を改善するために、対物レンズ６（または６’）は、眼の近傍に配置され、出射グループおよびサンプル眼７によって形成されるシステム全体の有効開口数ＮＡ_ｅｆｆを、前述のように約０．２に等しい（ＮＡ_ｅｙｅ≒０．２）眼の開口数ＮＡ_ｅｙｅの値から、０．９より大きい値（ＮＡ_ｅｙｅ＞０．９）まで増加させるように構成されている。実際、そのような有効開口数ＮＡ_ｅｙｅは、
ＮＡ_ｅｆｆ＝ｎ_ｅｙｅ・ｓｉｎ（Ｒ_ｅｙｅ／ｆ_ｅｆｆ） ［２］
と定義される。式中、ｎは媒質（すなわちサンプル眼７）の屈折率であり、Ｒ_ｅｙｅはサンプル眼７の半径であり、ｆ_ｅｆｆは光学出射ユニット１９ならびにサンプル眼７の角膜およびレンズ８によって形成される出射アセンブリの有効焦点距離である。

そのような有効開口数ＮＡ_ｅｆｆの定義は、対物レンズ６（または６’）に入射する励起光ビームの半径ｒがサンプル眼７の半径Ｒ_ｅｙｅよりも短くない、有利な使用モードを考慮に入れている。しかしながら、対物レンズ６（または６’）に入射する励起光ビームの半径ｒがサンプル眼７の半径Ｒ_ｅｙｅより短い場合、有効開口数はｎ_ｅｙｅ・ｓｉｎ（ｒ／ｆ_ｅｆｆ）に等しいことに留意されたい。

知られているように、互いに距離ｄ離れて配置された、屈折力Ｋ_ｏｂｊおよびＫ_ｅｙｅをそれぞれ有する２つの薄いレンズを含むシステムの有効屈折力Ｋ_ｅｆｆは、

に等しい。式中、
Ｋ_ｅｆｆ＝１／ｆ_ｅｆｆ ［４］
Ｋ_ｏｂｊ＝１／ｆ_ｏｂｊ ［５］
Ｋ_ｅｙｅ＝１／ｆ_ｅｙｅ ［６］
であり、ｎ_ｉは、眼のサンプル７と対物レンズ６（または６’）との間の媒質の屈折率であり、特に、空気の場合には、ｎ_ｉは１に等しいと推定することができ、一方、図２に示されるサンプル眼７と接触しているアダプティブレンズ６’の場合には、ｎ_ｉは、レンズ６’とサンプル眼７との間に介在する液体の屈折率に等しくなり得る（しかしながら、この場合、距離ｄはゼロ、すなわちｄ＝０であると推定することができ、寄与率ｄ・Ｋ_ｏｂｊ・Ｋ_ｅｙｅ／ｎ_ｉもゼロである）。

特に、サンプル眼に関するすべての光学特性、すなわち焦点距離ｆ_ｅｙｅ、半径Ｒ_ｅｙｅ、屈折率ｎ_ｅｙｅ、および結果として開口数ＮＡ_ｅｙｅ、および屈折力Ｋ_ｅｙｅは、例えば、母集団の平均値または制限値に等しい定数と考えることができる。

したがって、式［２］によって与えられる有効開口数ＮＡ_ｅｆｆを０．９よりも高い値とするために、本発明による装置は、焦点距離ｆ_ｏｂｊ、および結果として屈折力Ｋｏｂｊを有する対物レンズを、サンプル眼７から（すなわち_、サンプル眼７の角膜から）距離ｄ離れた位置に位置決めし、それによって、距離ｄ（またはその範囲）が与えられると、対物レンズの焦点距離ｆ_ｏｂｊの値は、式［３］によって決定される。

この目的のために、本発明による装置は、患者のサンプル眼７の角膜およびレンズ８が光学出射ユニット１９の対物レンズ６（または６’）に対面するように、頭部を支持するように構成され、患者のサンプル眼７を、サンプル眼７（すなわち、その角膜）が光学出射ユニット１９の対物レンズ６（または６’）から距離ｄ離れた発射位置に位置決めするように構成された、従来の患者の頭部支持および位置決めユニット（図示せず）を含み、このようにして、光学出射ユニット１９ならびにサンプル眼７の角膜およびレンズ８は、式［２］によって与えられる有効開口数ＮＡ_ｅｆｆを有する光出射アセンブリを形成する。サンプル眼７が出射位置にあるとき、光学出射ユニット１９の対物レンズ６（または６’）からサンプル眼７までの距離ｄは、２０ｍｍ以下、任意選択的に１０ｍｍ以下、より任意選択的に５ｍｍ以下、さらにより任意選択的に２ｍｍ以下（例えば、図２の場合、距離ｄはゼロ、すなわちｄ＝０）であることが有利である。限定ではなく例として、患者の頭部支持および位置決めユニットは、顎支持部および／または患者の前頭部支持部を含むことができ、任意選択的に、１つまたは複数のセンサ、例えば、光検出器および近接センサなどの、近接センサおよび接触センサを含む、またはそれらからなる群から選択されるセンサが、患者の頭部が動作位置（動作位置で、患者のサンプル眼７は出射位置にある）にあるか否かを示してもよい。

このような、光学出射ユニット１９の対物レンズ６（または６’）ならびにサンプル眼７の角膜およびレンズ８によって形成される出射アセンブリの構成は、励起光ビームの直径に依存する、システムの空間分解能を高めることを可能にし、λを第１の光源１の波長としたとき、サンプル眼７の眼底でλ／２に等しい分解能を提供し得る。提供し得る分解能は、任意選択的に、走査のオーバーサンプリング技術を使用し、オーバーサンプリングに適用されるデコンボリューションアルゴリズムなどのアルゴリズムを使用すると、λ／４に等しい。実際、上述のように、ベッセルビームは、その非回折性のおかげで、伝搬方向に関して約λ／（２・ＮＡ）に等しい横方向寸法を有し、ＮＡ＝１では約λ／２の直径が与えられる。ベッセルビームは発散することなく伝搬し、λ／２に等しい直径に到達することを可能にするため、そのような値は、サンプル眼７の眼底の平面を走査することができる、平面「ｘ−ｙ」における角度分解能α／βでもある。

図３は、従来技術の装置における異なる複数のモードの集束ビームと、本発明による装置における集束ビームとの比較を示す。図３ａは、従来技術の装置における（非ベッセル）励起ビームの集束の概略図を示し、ビームは、光学システムの集束面Ａ上に配置された、サンプル眼の網膜上に集束され、網膜上の励起スポットのサイズは、（光が瞳孔全体を満たすと仮定して）サンプル眼の瞳孔サイズおよび焦点距離に依存する。

図３ｂは、本発明による装置における励起ビームの集束の概略図を示し、光出射アセンブリは、瞳孔と網膜との間の平面Ａ上に励起ビームを集束させるように、光学出射ユニット１９の対物レンズ６（または６’）ならびにサンプル眼７の角膜およびレンズ８によって形成される。励起ビームは、眼の内部にベッセルビームを形成するように生成され、ベッセルビームは、発散することなく、平面Ａから網膜までλ／（２×ＮＡ_ｅｆｆ）に等しい直径（および横方向分解能ｔ）で伝搬する。上述のように、条件ＮＡ_ｅｆｆ＞０．９、および対物レンズ６（または６’）とサンプル眼７（すなわち、サンプル眼７の角膜）との間の距離ｄは、対物レンズ６（または６’）の特性、特に使用される対物レンズの焦点距離ｆ_ｏｂｊを一義的に決定する。この距離ｄは、アダプティブレンズ６’がサンプル眼７に接触している場合はゼロに等しく、単一または二重のアダプティブレンズ６の場合はいずれの場合も小さい。

図３ｃは、従来技術の装置における（非ベッセル）励起ビームの集束の概略図を示し、励起ビームは瞳孔と網膜との間の平面Ａ上に集束されている。網膜の照射範囲は、本発明による装置に対して明らかに大きく、その結果として分解能が低下することは明白である。

例えばクルクミン（本明細書で単に例として参照される）などの蛍光分子で標識された、タンパク質などの、眼底に含まれる光源の存在下では、蛍光分子は、光学ユニット１９を部分的に通過し光学ユニットから蛍光光ビームとして出射する励起光ビームの放射光よりも長い波長で、等方的に放射する。蛍光光ビームは励起光ビームと実質的に平行であり、眼の照射および励起蛍光ビームは同一の方向に沿って行われ、その際、本発明による装置は後方散乱システムに基づき、照射および検出は同一の長手方向軸に沿って行われる。第１のダイクロイックフィルタ４は、蛍光光ビームを透過し、干渉除去フィルタ９に向けるように構成されている。干渉除去フィルタ９は、眼内組織の自家蛍光に対する特定のマーカによる蛍光の波長、および励起光ビームの散乱および／または反射による残留バックグラウンドに対して、装置の感度を最大にすることを可能にする。

干渉除去フィルタ９を通過後、蛍光ビームは、光学ユニット１９の効果を補償し、且つセンサデバイス１１上に、蛍光ビームを集束するように構成された撮像光学ユニット１０（単純化のため単一レンズとして図１〜図２および図４に示される）を通過する。センサデバイス１１は、励起光ビームが走査システム５から出射する各角度位置α／βであって、サンプル眼７の網膜上の位置ｘ／ｙに対応する各角度位置α／βについて蛍光ビーム強度を検出するように構成されている。その後、走査システム５の、各々の個別位置で得られた信号を合成することによって、画像が得られ、したがってそれは数値計算された画像である（網膜の位置ｘ／ｙに応じた各位置α／βについて、蛍光強度信号が読まれ、その後、二次元画像を再構成するために、ｘ／ｙ位置と、強度とのマッピングが実行される）。このようなセンサデバイス１１は、例えば単一の光電子増倍管もしくは単一のアバランシェダイオードなどの単一の検知素子、あるいは例えば複数の光電子増倍管もしくは複数のアバランシェダイオードなどの複数の検知素子を含むことができ、検知素子は、「ｘ−ｙ」平面における分解能を改善することができる蛍光ビームの空間分布に関する情報を得て、共焦点顕微鏡法から借用したアルゴリズムを使用して、蛍光を発した分子の長手方向位置（「ｚ」軸）を定義するように構成されている。

図４は、本発明による蛍光顕微鏡装置の第３の実施形態を概略的に示しており、撮像センサ１１は、複数の検知素子を含み、各々が、空間フィルタリングマスクを構成する複数の１３個のマイクロレンズのうち、１つのマイクロレンズに双方向に結合される。任意選択的に、図４に概略的に表される第３の実施形態の撮像センサ１１は、ＣＣＤまたはＳＣＭＯＳタイプのアレイセンサを使用することによって作製される。上記第３の実施形態は、「ｚ」軸の特定の位置に対応してサンプル眼７内に配置されたマーカによって発せられる蛍光信号を検出するように構成されている。複数のマイクロレンズによって遮断されたフーリエ面内またはフーリエ面と焦点面（すなわち像面）との間の中間面内の光照射野の分布は、個々のセンサの信号強度またはＣＣＤもしくはＳＣＭＯＳアレイの画素を互いに関連づける、空間周波数のフーリエ解析または他のアルゴリズムによって、蛍光強度情報だけでなく、光源の「ｚ」位置に関連する情報も取得可能にし、それによって、本発明の装置が蛍光分子の３Ｄマッピングを再構成することを可能にする。

任意選択的に、前述の実施形態は、第１の光源１と平行な第２の光源（図示せず）を有してもよく、第２の光源は、ベッセルビームに合成された励起光ビームによって走査される部分よりも大きく（例えば１００×１００倍大きい）、そのように走査される部分を含む、サンプル眼７の追加部分を励起するように構成された追加励起光ビームを生成して、眼内組織の自家蛍光を飽和させる。実際、眼内組織の自家蛍光は、タンパク質、または網膜で観察される他の特定の分子の識別に使用可能なマーカの蛍光の減衰と比較して、非常に急速に減衰し、それによって、より広い視野での最初の露光を使用して、決定された走査部分の自家蛍光を飽和させ、次にその部分をベッセル励起ビームで分析して超解像マッピング（すなわちλ／２、任意選択的にλ／４）を作成することができる。換言すると、一旦励起されると、自家蛍光は飽和し、マーカの減衰時間よりもはるかに長い再生時間を必要とし、それによって、単一の非集束光パルスで一部分を励起し、次にベッセルビームで自家蛍光しない飽和部分を走査することができる。本発明の好ましい実施形態では、第１の光源１と平行な第２の光源は、眼内組織の自家蛍光の減衰時間に等しい周期を有する単一パルスで周期的に起動される。

図５は、本発明による蛍光顕微鏡装置の第４の実施形態を概略的に示しており、装置１００’は、サンプル眼７の網膜下構造を撮像するための近赤外（ＮＩＲ）で動作する広視野撮像システム４００を備え、広視野撮像システム４００は、視神経の位置またはサンプル眼７の識別可能な血管構造の位置などのマーキング点に対する励起光ビームの位置を参照しながら、走査システム５の空間基準を取得するように構成されている。本発明の上記第４の実施形態では、走査システム５から出射する励起光ビームは、その後、第２のダイクロイックフィルタ１２に入る。ダイクロイックフィルタ１２は、励起光ビームを光学出射ユニット１９に向けて反射し、光学出射ユニット１９から出射する蛍光光ビームを走査システム５に向けて反射するように構成されている。第２のダイクロイックフィルタ１２はまた、システム４００から出射する第１のＮＩＲ光ビーム（すなわち、０．７８〜３マイクロメートルの範囲の波長を有する近赤外帯域内の）を透過し、光学出射ユニット１９を通って、サンプル眼７に向かうようにし、サンプル眼７の網膜下構造によって反射され、光学出射ユニット１９を通過する第２のＮＩＲ光ビームを透過し、システム４００に向けるように構成されている。

近赤外で動作する広視野撮像システム４００は、第２の除去フィルタ１４を通過し、その後第３のダイクロイックフィルタ１５に入る第１のＮＩＲ光ビームを生成する第３の光源２９を含み、第３のダイクロイックフィルタ１５は、第１のＮＩＲ光ビームを反射し、第２のダイクロイックフィルタ１２および光学出射ユニット１９を通過してサンプル眼７に向かわせるように構成されている。サンプル眼７の網膜下構造はＮＩＲ光を反射し、その結果、第２の反射ＮＩＲ光ビームは、光学出射ユニット１９を通過して第２のダイクロイックフィルタ１２に向かって後方に戻り、第２のダイクロイックフィルタ１２は第２の反射ＮＩＲ光ビームを透過して第３のダイクロイックフィルタ１５に向け、次に、第３のダイクロイックフィルタ１５は、上記第２の反射ＮＩＲ光ビームを透過して第２の干渉除去フィルタ１６に向けるように構成されており、第２の干渉除去フィルタ１６は、第２の反射ＮＩＲ光ビームの波長に対して、装置の感度を最大にすることを可能にする。第２の干渉除去フィルタ１６を通過後、第２の反射ＮＩＲ光ビームは、撮像用の第３のレンズ１７を通過する。撮像用の第３のレンズ１７は、第２の反射ＮＩＲ光ビームを、任意選択的にはＣＣＤセンサまたはＳＣＭＯＳセンサである撮像用のＮＩＲセンサデバイス１８に集束させる。

任意選択的に、ＮＩＲセンサデバイス１８は、眼の位置の変動を数値で表示し、それによって一連の画像から、観察領域の追跡を計算して、励起光ビームの角度位置データを補償するために、少なくとも１００フレーム／秒の撮像周波数で作動される。

本発明による装置のベッセルビーム生成光学ユニット２は、有利には、図６Ａおよび図６Ｂにそれぞれ概略的に示されるように、複数の誘電体層からなる二次元格子などの、光学出射ユニット１９のフーリエ面上に配置された静的光学位相フィルタ、任意選択的にアキシコンレンズ２１、さらに任意選択に位相マスク２２を備えたアキシコンレンズを含むことができる。

あるいは、本発明による装置のベッセルビーム生成光学ユニット２は、有利には、空間光変調器（ＳＬＭ）などの、光学出射ユニット１９のフーリエ面上に配置された動的光学フィルタを含むことができる。空間光変調器（ＳＬＭ）は、図７Ａおよび図７Ｂにそれぞれ概略的に示されるように、第１の光源１によって出射されたビームのための位相ＳＬＭ変調器２３であってもよいし、第１の光源１によって出射されたビームのための振幅ＳＬＭ変調器２４であって、後方に、ＳＬＭ変調器２４から出射する光ビームの領域のフーリエ変換を可能にするフーリエレンズ２５を伴う、振幅ＳＬＭ変調器２４であってもよい。

図６および図７は、レンズ８とサンプル眼７の眼底との間に配置され、任意選択的にはサンプル眼７の眼底上に配置された平面Ａに対応するベッセルビーム内への、励起光ビームの合成を概略的に示し、平面Ａは、励起光ビームの方向と直交している（すなわち、ｚ軸としても示される光軸に対して直交している）。

本発明による装置の走査システム５は、例えばガルバノミラー２６を有する走査システムなどの、標準タイプのものとすることができ、図８Ａはその一例を概略的に示す。好ましい実施形態では、図８Ｂに概略的に示されるベッセルビーム走査システム５は、回転の往復変位によってサンプル眼７の異なる走査形状が得られるように、独立して回転するように構成された、第１および第２の楔形部分（参照番号２７、２８で示される楔形フィルタ）を含む。特に、走査システム５の２つの楔形部分２７、２８の独立して回転する性質は、それらの相互位置、および回転速度に任意の差を（連続的または段階的に）生じさせ、同心のらせん形または擬似ランダムな円形などの、異なる走査形状を形成することを可能にする。好ましい実施形態では、２つの楔形部分２７、２８の動きは、２つの楔形部分２７、２８の、少なくとも１／５０度に等しい角度位置の分解能と同期して制御される２つの別個のモータによって発生し、したがって走査分解能は、±１°の視域（視野）において少なくとも１マイクロラジアンである。この走査システム５は、生成光学システム２の開口数を制限することなく、ベッセルビーム生成光学システム２とサンプル眼７の外面（すなわち角膜の外面）との間の距離を最小にすることを可能にし、特に、走査が、楔形部分２７、２８の角度、使用されるガラスの屈折率、および回転角度に依存するため、小さい角度に対して極めて正確な走査を行うことを可能にし、最終的には、（ガルバノミラーを有する走査システムには存在する）往復運動が無いために、走査の結果として得られる画像の品質および精度を低下させ得る振動が排除される。

以上、本発明の好ましい実施形態について説明し、いくつかの変形形態を提案したが、当業者であれば、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の保護範囲から逸脱することなく、他の変形形態および変更形態をなし得ることを理解されたい。

Claims (14)

1. 患者のサンプル眼（７）の眼底を分析するための蛍光顕微鏡装置（１００、１００’）であって、
   − 第１の光源（１）から基本光ビームを受光して、励起光ビームを生成するように構成された生成光学ユニット（２）と、
   − 前記生成光学ユニット（２）から前記励起光ビームを受光して、前記励起光ビームに、前記サンプル眼（７）の前記眼底の少なくとも一部分を走査させるように構成された走査システム（５）と、
   − 前記走査システム（５）から前記励起光ビームを受光して、蛍光ビーム内の、前記サンプル眼（７）の蛍光分子の等方性放射を少なくとも部分的にコリメートするように構成された光学出射ユニット（１９）であって、前記光学出射ユニット（１９）は対物レンズ（６、６’）を含み、前記対物レンズ（６、６’）は、焦点距離ｆ_ｏｂｊ、および屈折力Ｋ_ｏｂｊであって、ｎが媒質の屈折率であるとき、
   Ｋ_ｏｂｊ＝１／ｆ_ｏｂｊ
   である屈折力Ｋ_ｏｂｊを有している、光学出射ユニット（１９）と、
   − 前記サンプル眼（７）の角膜およびレンズ（８）が前記光学出射ユニット（１９）に対面するように頭部を支持し、且つ前記サンプル眼（７）を前記対物レンズ（６、６’）から距離ｄ離れた出射位置に位置決めするように構成された、患者の頭部支持および位置決めユニットであって、前記出射位置において、前記光学出射ユニット（１９）ならびに前記サンプル眼（７）の前記角膜および前記レンズ（８）は、有効屈折力Ｋ_ｅｆｆを有する光出射アセンブリを形成し、前記有効屈折力Ｋ_ｅｆｆは、ｆ_ｅｆｆが前記光出射アセンブリの有効焦点距離であり、Ｋ_ｅｙｅが一定の屈折力の寄与率であり、ｎ_ｉがサンプル眼（７）と対物レンズ（６、６’）の間の媒質の屈折率であるとき、
   
   である、患者の頭部支持および位置決めユニットと、
   − 前記光発射ユニット（１９）から出射された前記蛍光ビームを検出するように構成されたセンサデバイス（１１）と、
   − 前記生成光学ユニット（２）から出射された前記励起光ビームを前記走査システム（５）に伝達し、また前記光学出射ユニット（１９）からの前記蛍光ビームであって、前記走査システム（５）から出射された前記蛍光ビームを、前記センサデバイス（１１）に伝達するように構成された１以上の光学部品（４、９）と
   を有する、蛍光顕微鏡装置（１００、１００’）において、
   前記患者の頭部支持および位置決めユニットが前記サンプル眼（７）を前記出射位置に位置決めしたとき、前記光学出射ユニット（１９）ならびに前記サンプル眼（７）の前記角膜およびレンズ（８）によって形成される前記光出射アセンブリは、前記励起光ビームを前記サンプル眼（７）の前記眼底の前記少なくとも一部分に送るように構成され、また前記生成光学ユニット（２）は、励起光ビームを生成するように構成され、前記励起光ビームは、前記光出射アセンブリを通過した後、前記励起光ビームが、光伝搬軸に直交する平面（Ａ）に対して前記サンプル眼（７）の内部でベッセルビームに合成されるように構成された位相関係を有し、
   前記平面（Ａ）は、前記サンプル眼（７）の前記レンズ（８）と、前記サンプル眼（７）の前記眼底の前記少なくとも一部分との間にあり、前記対物レンズ（６、６’）の前記焦点距離ｆ_ｏｂｊは、ｎ_ｅｙｅが前記サンプル眼（７）の屈折率であり、Ｒ_ｅｙｅが前記サンプル眼（７）の半径であるとき、ＮＡ_ｅｆｆ＝ｎ_ｅｙｅ・ｓｉｎ（Ｒ_ｅｙｅ／ｆ_ｅｆｆ）で与えられる前記光出射アセンブリの有効開口数ＮＡ_ｅｆｆが０．９以上であるという条件を満たす
   蛍光顕微鏡装置。
2. 前記患者の頭部支持および位置決めユニットが前記サンプル眼（７）を前記出射位置に位置決めしたとき、前記対物レンズ（６、６’）から前記サンプル眼（７）までの距離ｄが、２０ｍｍ以下、任意選択的に１０ｍｍ以下、より任意選択的に５ｍｍ以下、さらにより任意選択的に２ｍｍ以下である、請求項１に記載の装置（１００、１００’）。
3. 前記励起光ビームから疑似蛍光バックグラウンドを除去するように構成された少なくとも１つの第１の狭帯域除去フィルタ（３）をさらに含む、請求項１または２に記載の装置（１００、１００’）。
4. 前記対物レンズ（６）が、単一または二重のアダプティブレンズであり、また任意選択的に接触式のアダプティブレンズ（６’）であり、それにより前記対物レンズ（６、６’）から前記サンプル眼（７）までの距離ｄがゼロである、請求項１から３までのいずれか一項に記載の装置（１００、１００’）。
5. 前記蛍光ビームを前記センサデバイス（１１）上に集束させるように構成された撮像光学ユニット（１０）をさらに有する、請求項１から４までのいずれか一項に記載の装置（１００、１００’）。
6. 前記センサデバイス（１１）が、光電子増倍管、アバランシェダイオード、ＣＣＤ、またはＳＣＭＯＳを含む群から選択された複数の検知素子を含む、請求項１から５までのいずれか一項に記載の装置（１００、１００’）。
7. 前記センサデバイス（１１）の上流に配置された複数のマイクロレンズ（１３）を含み、前記マイクロレンズの各々が、前記センサデバイス（１１）の前記複数の検知素子のそれぞれの素子に双方向に結合されている、請求項６に記載の装置（１００、１００’）。
8. 前記生成光学ユニット（２）によって生成された前記励起光ビームによって走査される前記サンプル眼（７）の前記少なくとも一部分を内部に含む前記サンプル眼（７）の少なくとも１つの追加部分を励起するように構成された追加励起光ビームを生成する第２の光源を含み、前記追加励起光ビームが前記サンプル眼（７）の眼内組織の自家蛍光を飽和させるように構成されている、請求項１から７までのいずれか一項に記載の装置（１００、１００’）。
9. 前記生成光学ユニット（２）が、前記光学出射ユニット（１９）のフーリエ面上に配置された静的光学位相フィルタ（２１、２２）、任意選択的に複数の誘電体層からなる二次元格子、より任意選択的にはアキシコンレンズ（２１）、さらにより任意選択的には位相マスク（２２）を備えたアキシコンレンズを含む、請求項１から８までのいずれか一項に記載の装置（１００、１００’）。
10. 前記生成光学ユニット（２）が、空間光変調器、任意選択的に位相空間光変調器（２３）、または後方にフーリエレンズ（２５）を伴う振幅空間光変調器（２４）を含む、請求項１から８までのいずれか一項に記載の装置（１００、１００’）。
11. 前記走査システム（５）が、２つの別々のモータによって独立して回転するように構成され、同期的に制御されるように構成された、第１および第２の楔形部分（２７、２８）を含み、前記２つの楔形部分（２７、２８）が、任意選択的に、少なくとも１／５０度に等しい角度位置の分解能を有し、したがって走査分解能が±１°の視域において少なくとも１マイクロラジアンに等しい、請求項１から１０までのいずれか一項に記載の装置（１００、１００’）。
12. 前記サンプル眼（７）の網膜下構造を撮像するための近赤外（ＮＩＲ）で動作する広視野撮像システム（４００）と、前記走査システム（５）と前記光学出射ユニット（１９）の間に配置された追加の光学部品（１２）とを有し、前記追加の光学部品（１２）が、近赤外の放射に対して透明であり、且つ前記走査システム（５）からの前記励起光ビームを前記光学出射ユニット（１９）に向けて反射するように構成され、また前記システム（４００）が、
    − 前記追加の光学部品（１２）に送られる第１のＮＩＲ光ビームを生成するように構成された第３の光源（２９）と、
    − 前記サンプル眼（７）の網膜下構造によって反射され、前記追加の光学部品（１２）から出射される第２の反射ＮＩＲ光ビームを検出するように構成された、任意選択的にはＣＣＤセンサまたはＳＣＭＯＳセンサであるＮＩＲセンサデバイス（１８）であって、任意選択的に１００フレーム／秒以上の周波数で動作するように構成されたＮＩＲセンサデバイス（１８）と、
    − 前記第３の光源（２９）からの前記第１のＮＩＲ光ビームを透過して前記追加の光学部品（１２）に向け、前記追加の光学部品から出射される前記第２の反射ＮＩＲ光ビームを透過して前記ＮＩＲセンサデバイス（１８）に向けるように構成された１以上のＮＩＲ光学部品（１５、１６）と
    をさらに有する、請求項１から１１までのいずれか一項に記載の装置（１００、１００’）。
13. 前記システム（４００）が、前記第２のＮＩＲ光ビームを前記ＮＩＲセンサデバイス（１８）に集束させるように構成された撮像光学ユニット（１７）をさらに含む、請求項１２に記載の装置（１００、１００’）。
14. 前記第１のＮＩＲ光ビームから疑似蛍光バックグラウンドを除去するように構成された少なくとも１つの第２の狭帯域除去フィルタ（１４）を含む、請求項１２または１３に記載の装置（１００、１００’）。