WO2013089258A1 - 顕微鏡及び刺激装置 - Google Patents

Abstract

　簡単な構成で、従来よりも深い領域を光により刺激することが可能な顕微鏡及び刺激装置を提供する。　走査型顕微鏡１０は、第１の光源１０１からの光を、対物レンズ３０４を介して標本２０に照射してこの標本２０からの光を受光する第１の走査光学系１００と、第１の光源１０１からの光、又は第１の光源１０１とは異なる第２の光源２０１からの光を、対物レンズ３０４を介して標本２０に照射して特異現象を発現させる第２の走査光学系２００と、を有し、第２の走査光学系２００は、対物レンズ３０４を介して集光される、第１の光源１０１からの光、又は第２の光源２０１からの光の集光領域が、所定の条件を満たすように、第１の光源１０１からの光、又は第２の光源２０１からの光を整形するビーム整形光学系２０５を有することを特徴とする。

Description

顕微鏡及び刺激装置

　本発明は、顕微鏡及び刺激装置に関する。

　顕微鏡による標本の観察において、所定の波長のレーザ光を照射して標本上の特定の部位を刺激し、さらに、異なる波長のレーザ光を照射して励起させることによりこの標本で発生する蛍光を観察する方法が知られている。例えば、大脳皮質の樹上突起であるスパインにレーザ光を照射するとこのスパインをアンケイジングして蛍光観察をすることができるが、大脳皮質に厚みがあるため、観察面以外のスパインもアンケイジできると研究の幅が広がる。このスパインは１μｍ程度の突起であり、それ以外の場所は極力光刺激をしたくない。このような顕微鏡において、レーザ光により特異現象（上述のような光刺激による現象）を発現させることができる範囲は、対物レンズの焦点深度程度である。そのため、光刺激をする領域の深さ（光軸方向の幅）、すなわち、対物レンズの焦点深度を広げる方法として、対物レンズに入射するビームの径をビームエキスパンダにより可変にすることで、ビーム径を絞る構成が開示されている（例えば、特許文献１参照）。

米国発行特許発明第７１９６８４３号明細書

　しかしながら、刺激する光のビーム径を絞り、ＮＡを小さくすれば対物レンズの焦点深度は深くなるため、刺激する領域は光軸方向にある程度広がる（深くなる）が、ＮＡを小さくすると、平面方向（光軸と直交する面内）におけるスポットも大きくなってしまうという課題があった。このように刺激する光のスポットが大きくなると、上述のような脳細胞を観察する場合、特定のスパインを高精度に刺激することができなくなる。

　本発明はこのような課題に鑑みてなされたものであり、簡単な構成で、従来よりも深い領域を光により刺激することが可能な顕微鏡及び刺激装置を提供することを目的とする。

　前記課題を解決するために、本発明に係る顕微鏡は、第１の光源からの光を、対物レンズを介して標本に照射してこの標本からの光を受光する第１の光学系と、第１の光源からの光、又は第１の光源とは異なる第２の光源からの光を、対物レンズを介して標本に照射して特異現象を発現させる第２の光学系と、を有し、第２の光学系は、対物レンズを介して集光される、第１の光源からの光、又は第２の光源からの光の集光領域が、以下の条件を満たすように、第１の光源からの光、又は第２の光源からの光を整形するビーム整形光学系を有することを特徴とする。

　但し、
　　ΔＤ：第１の光源からの光、又は第２の光源からの光の集光領域の最大距離
　　λ　：第１の光源からの光、又は第２の光源からの光の波長
　　ＮＡ：対物レンズの開口数

　ここで、集光領域とは、集光された領域が連続的である場合は、最大強度の８割以上の強度を有する領域であり、集光された領域が断続的である場合は、各領域の中心間を結ぶ線の全て（各領域が集光点のときは、集光点の中心間を結ぶ線の全て）である。

　このような顕微鏡において、ビーム整形光学系は、第１の光源からの光、又は第２の光源からの光が、対物レンズを介して、第２の光学系の光軸を含む所定の断面内において互いに所定の距離離れ、互いに所定の角度をなす２光束となって集光されるように光を整形することが好ましい。

　また、このような顕微鏡において、ビーム整形光学系は、第１の光源からの光、又は第２の光源からの光が、対物レンズの瞳において光軸から所定の距離離れた領域を通過して対物レンズを介して集光されるように光の光軸に直交する面における形状を整形することが好ましい。

　また、このような顕微鏡において、ビーム整形光学系は、光の光軸に直交する面における形状を輪帯形状に整形することが好ましい。

　また、このような顕微鏡において、ビーム整形光学系は、互いの頂点が対向するように配置された２枚の円錐レンズで構成されることが好ましい。

　また、このような顕微鏡において、ビーム整形光学系は、互いの頂点が逆方向を向くように配置された２枚の円錐レンズで構成されることが好ましい。

　また、このような顕微鏡において、ビーム整形光学系は、円錐面がすり鉢状に形成された凹型の円錐レンズと、この円錐面と対向するように円錐面が配置された凸型の円錐レンズと、から構成されることが好ましい。

　また、このような顕微鏡は、円錐レンズ間の光軸方向の間隔を変化させて輪帯形状の光の外径を変化させることが好ましい。

　また、このような顕微鏡において、ビーム整形光学系は、光を反射する円錐面がすり鉢状に形成されるとともに、光軸上に貫通孔が形成された凹型の円錐ミラーと、光を反射する円錐面が形成され、貫通孔と位置整合して配置された凸型の円錐ミラーと、を有し、光源からの光を、貫通孔を通過させて凸型の円錐ミラーで反射させ、さらに、凹型の円錐ミラーで反射させるように構成されることが好ましい。

　また、このような顕微鏡は、円錐ミラー間の光軸方向の間隔を変化させて輪帯形状の光の外径を変化させることが好ましい。

　また、このような顕微鏡において、ビーム整形光学系は、光源側から順に、円錐レンズと、この円錐レンズを透過した光を反射し、さらに円錐レンズに入射させる平面ミラーと、光源からの光を円錐レンズに導き、円錐レンズからの光を標本に導く光路切換部材と、から構成されることが好ましい。

　また、このような顕微鏡は、円錐レンズと平面ミラーとの光軸方向の間隔を変化させて輪帯形状の光の外径を変化させることが好ましい。

　また、このような顕微鏡は、第１の光源又は第２の光源とビーム整形光学系との間、或いはビーム整形光学系と対物レンズとの間に配置され、光の径を変化させることにより、輪帯形状の光の輪帯幅を変化させるビームエキスパンダを有することが好ましい。

　また、このような顕微鏡において、ビーム整形光学系は、第１の光源からの光、及び第２の光源からの光のいずれか一方の光の一部と残りの光の少なくとも一部とに位相差を付与し、対物レンズを介して当該対物レンズの光軸上に複数の集光点を形成することが好ましい。

　また、このような顕微鏡において、ビーム整形光学系は、光を透過させる複数の透光部分を有し、該各透光部分のうち少なくとも一つの該透光部分を透過した光に他の透光部分を透過した光との間で位相差を付与することが好ましい。

　また、このような顕微鏡において、ビーム整形光学系は、板状部材であり、各透光部分における光の光学的光路長がそれぞれ異なるように形成されていることが好ましい。

　また、このような顕微鏡において、ビーム整形光学系は、空間光変調素子であり、各透光部分における光の光学的光路長が任意に切り替え可能であることが好ましい。

　また、このような顕微鏡において、各透光部分はそれぞれ光が入射する入射面を有し、該各入射面の面積は、該各入射面への入射光量がそれぞれ等しくなるように設定されていることが好ましい。

　また、このような顕微鏡は、光が対物レンズを介して集光される集光領域の大きさを入力する入力部と、集光領域の大きさに対応させて、ビーム整形光学系を制御する制御部と、を有することが好ましい。

　また、このような顕微鏡は、光が対物レンズを介して集光される集光領域の大きさを入力する入力部と、集光領域の大きさに対応させて、円錐レンズ位置、円錐ミラー位置の少なくとも１つを制御する制御部と、を有することが好ましい。

　また、このような顕微鏡は、光が対物レンズを介して集光される集光領域の大きさを入力する入力部と、集光領域の大きさに対応させて、円錐レンズの位置と平面ミラーの位置とを制御する制御部と、を有することが好ましい。

　また、このような顕微鏡は、光が対物レンズを介して集光される集光領域の大きさを入力する入力部と、集光領域の大きさに対応させて、ビームエキスパンダを制御する制御部と、を有することが好ましい。

　また、このような顕微鏡は、光が対物レンズを介して集光される集光領域の大きさを入力する入力部と、集光領域の大きさに対応させて、板状部材の切替を制御する、或いは空間光変調素子を制御する制御部と、を有することが好ましい。

　また、本発明に係る刺激装置は、対物レンズを介して励起光を標本に照射し、標本で発生した蛍光を集光する集光光学系を備えた顕微鏡に装着される刺激装置であって、励起光を出射した第１の光源からの光、又は第１の光源とは異なる第２の光源からの光を、対物レンズを介して標本に照射して特異現象を発現させる刺激光学系を有し、この刺激光学系は、対物レンズを介して集光される、第１の光源からの光、又は第２の光源からの光の集光領域が、以下の条件を満たすように、第１の光源からの光、又は第２の光源からの光を整形するビーム整形光学系を有することを特徴とする。

　但し、
　　ΔＤ：第１の光源からの光、又は第２の光源からの光の集光領域の最大距離
　　λ　：第１の光源からの光、又は第２の光源からの光の波長
　　ＮＡ：対物レンズの開口数

　本発明によれば、簡単な構成で、従来よりも深い領域を光により刺激することが可能な顕微鏡及び刺激装置を提供することができる。

顕微鏡の一例である走査型顕微鏡の構成を示す説明図である。 第１の実施形態における、励起する領域及び刺激する領域と対物レンズとの関係を説明するための説明図である。 第１の実施形態に係るビーム整形光学系の構成例を示すための説明図であって、（ａ）は凸型の円錐レンズを、互いの頂点が対向するように配置した場合を示し、（ｂ）は凸型の円錐レンズを、互いの頂点が逆方向を向くように配置した場合を示す。 第１の実施形態に係るビーム整形光学系の他の構成例を示すための説明図であって、（ａ）は２枚の円錐ミラーを組み合わせた場合を示し、（ｂ）は凸型と凹型の円錐レンズを組み合わせた場合を示す。 第１の実施形態に係るビーム整形光学系の他の構成例を示すための説明図であって、一枚の円錐レンズと平面ミラーとを組み合わせた場合を示す。 第１の実施形態における、帯状のレーザ光の外径及び内径のＮＡを説明するための説明図である。 第１の実施形態における、輪帯状のレーザ光による対物レンズの規格化したＮＡと焦点深度との関係を説明するためのグラフである。 第１の実施形態において、ビーム整形光学系における輪帯状のレーザ光の外径のＮＡを変化させる方法を示す説明図であって、（ａ）は基準状態を示し、（ｂ）はＮＡを大きくした状態を示し、（ｃ）はＮＡを小さくした状態を示す。 第１の実施形態において、ビームエキスパンダによりレーザ光の径を変化させたときの輪帯状のレーザ光の輪帯幅を説明するための説明図であって、（ａ）は、ビーム整形光学系に入射する光束の径が細いときを示し、（ｂ）は、ビーム整形光学系に入射する光束の径が太いときを示す。 第１の実施形態における、刺激用のレーザ光の断面形状の変形例を説明するための説明図である。 第１の実施形態における、輪帯状のレーザ光の断面形状と対物レンズの瞳との関係を示す説明図であって、（ａ）は対物レンズの瞳中心に略一致している場合を示し、（ｂ）は瞳中心にかかっている場合を示し、（ｃ）は瞳中心から外れている場合を示す。 第２の実施形態に係るビーム整形光学系の構成例を示すための説明図であって、（ａ）は平面図を示し、（ｂ）は（ａ）のＩ－Ｉ縦断面図である。 第２の実施形態に係るビーム整形光学系を説明するための説明図であって，（ａ）は式（８）を説明するための説明図であり、（ｂ）は標本上に集光されたレーザ光の光強度と光軸上の座標との関係を示すグラフである。 第２の実施形態において、対物レンズの光軸上に二つの集光点が形成された状態を概略的に示す説明図である。 上記二つの集光点のうち一方の光学的伝達関数の結果を示すグラフである。 三つの集光点を光軸上に形成するためのビーム整形光学系の構成例を示す説明図であって、（ａ）は平面図であり、（ｂ）は（ａ）のＩＩ－ＩＩ縦断面図である。 第２の実施形態において、対物レンズの光軸上に三つの集光点が形成された状態を概略的に示す説明図である。 第２の実施形態において、二つの集光点を形成するためのビーム整形光学系の変形例を示す説明図であって、（ａ）は平面図であり、（ｂ）は（ａ）のＩＩＩ－ＩＩＩ縦断面図である。 第２の実施形態において、二つの集光点を形成するためのビーム整形光学系の別の変形例を示す説明図であって、（ａ）は平面図であり、（ｂ）は（ａ）のＩＶ－ＩＶ縦断面図である。 第２の実施形態において、三つの集光点を形成するためのビーム整形光学系の変形例を示す説明図であって、（ａ）は平面図であり、（ｂ）は（ａ）のＶ－Ｖ縦断面図である。 第２の実施形態において、二つの集光点を形成するためのビーム整形光学系の別の変形例を示す説明図であって、（ａ）は平面図であり、（ｂ）は（ａ）のＶＩ－ＶＩ縦断面図である。

　以下、本発明の好ましい実施形態について図面を参照して説明する。まず、図１を用いて顕微鏡の一例である走査型顕微鏡１０の構成について説明する。この走査型顕微鏡１０は、第１の光源１０１から放射されたレーザ光を、対物レンズ３０４を介してステージ３０上に載置された標本２０に照射するとともに、このレーザ光を偏向して標本２０を走査する第１の走査光学系１００と、第２の光源２０１から放射されたレーザ光を、対物レンズ３０４を介して標本２０に照射するとともに、このレーザ光を偏向して標本２０を走査する第２の走査光学系２００と、上記対物レンズ３０４を含み、第１及び第２の走査光学系１００，２００から射出したレーザ光を標本２０上に集光するとともに、このレーザ光により刺激及び励起された標本２０から発生する蛍光を集光する結像光学系３００と、この蛍光を検出する第１の検出部４００及び第２の検出部５００と、を有して構成される。すなわち、この走査型顕微鏡１０において、第１の走査光学系１００、結像光学系３００、並びに、第１及び第２の検出部４００，５００は、標本２０に第１の光源１０１からのレーザ光を照射して励起させることにより発生する蛍光によりこの標本２０を観察する第１の光学系を構成し、第２の走査光学系２００及び結像光学系３００は、標本２０に第２の光源２０１からのレーザ光を照射して刺激することにより、この標本２０に特異現象を発現させる第２の光学系を構成している。また、この第２の走査光学系２００及び結像光学系３００は、対物レンズ３０４を介して励起光を標本２０に照射し、この標本２０で発生した蛍光を集光する集光光学系である結像光学系３００を備えた顕微鏡に装着される刺激光学系を有する刺激装置としても機能する。なお、第２の光源２０１の代わりに第１の光源１０１からの光を第２の走査光学系２００で集光して標本２０に照射するように構成しても良い。また、以降の説明において、結像光学系３００の光軸方向をｚ軸とし、このｚ軸に直交する面内で互いに直交する方向をｘ軸及びｙ軸とする。

　第１の走査光学系１００は、第１の光源１０１側から順に、レーザ導入光学系１０２と、第１の光路分割部材１０３と、第１の走査ユニット１０４と、から構成される。また、第２の走査光学系２００は、第２の光源２０１側から順に、光ファイバ２０２と、ファイバ射出端２０３と、コリメートレンズ２０４と、ビーム整形光学系２０５と、第２の走査ユニット２０６と、第２の光路分割部材２０７と、から構成される。また、結像光学系３００は、光源側から順に、瞳投影レンズ３０１と、第２対物レンズ３０２と、第３の光路分割部材３０３と、対物レンズ３０４と、から構成される。

　第１の光源１０１は、標本２０の多光子励起を誘発するための、所定の周期で射出される非常に短いパルス状のレーザ光（例えば、１００フェムト秒のパルス光であって、以下、「ＩＲパルス光」又は「励起光」と呼ぶ）を放射する。この第１の光源１０１から射出されたＩＲパルス光は、略平行光であって、レーザ導入光学系１０２を通過した後、第１の光路分割部材１０３を透過して第１の走査ユニット１０４に入射する。そして、このＩＲパルス光は第１の走査ユニット１０４で走査され、第２の光路分割部材２０７を透過して結像光学系３００に入射する。

　ここで、第１の光路分割部材１０３はダイクロイックミラー若しくはハーフミラーで構成されている。また、第１の走査ユニット１０４は、光軸に直交する方向（上述のｘ軸方向及びｙ軸方向）にＩＲパルス光を２次元的に走査するものであり、例えば、ＩＲパルス光を反射することによりこのＩＲパルス光を光軸に直交する面内で所定の方向（ｘ軸方向）に偏向させる第１の偏向素子と、第１の偏向素子で反射されたＩＲパルス光をさらに反射することにより、このＩＲパルス光を所定の方向と略直交する方向（ｙ軸方向）に偏向させる第２の偏向素子とにより構成される。

　また、第２の光源２０１は、標本２０を刺激するための可視レーザ光（以下、「可視光」又は「刺激光」と呼ぶ）を放射する。この第２の光源２０１から放射された可視光は、光ファイバ２０２を通過したのち、ファイバ射出端２０３から拡がりのある光として射出され、コリメートレンズ２０４で略平行光にされて、ビーム整形光学系２０５を通過して第２の走査ユニット２０６に入射する。そして、この可視光はこの第２の走査ユニット２０６で走査され、第２の光路分割部材２０７で反射されて、ＩＲパルス光と重ね合わされて結像光学系３００に入射する。

　ここで、第２の光路分割部材２０７もダイクロイックミラー若しくはハーフミラーで構成されている。また、第２の走査ユニット２０６も、光軸に直交する方向（上述のｘ軸方向及びｙ軸方向）に可視光を２次元的に走査するものであり、例えば、可視光を反射することによりこの可視光を光軸に直交する面内で所定の方向（ｘ軸方向）に偏向させる第１の偏向素子と、第１の偏向素子で反射された可視光をさらに反射することにより、この可視光を所定の方向と略直交する方向（ｙ軸方向）に偏向させる第２の偏向素子とにより構成される。

　第２の光路分割部材２０７を射出したＩＲパルス光及び可視光は、瞳投影レンズ３０１により一度集光された後、第２対物レンズ３０２により略平行光にされ、第３の光路分割部材３０３を透過して対物レンズ３０４に入射し、この対物レンズ３０４を介してステージ３０上に載置された標本２０に集光される。ここで、第３の光路分割部材３０３もダイクロイックミラー若しくはハーフミラーで構成されている。なお、第１の走査ユニット１０４及び第２の走査ユニット２０６の偏向素子は、それぞれ、瞳投影レンズ３０１により形成される対物レンズ３０４の瞳像と略一致するか、若しくはその近傍に配置されている。

　可視光により刺激され、ＩＲパルス光により励起されて標本２０から発生した蛍光は、対物レンズ３０４で集光され、第３の光路分割部材３０３に入射する。

　第３の光路分割部材３０３に入射する蛍光のうち、所定の波長の蛍光は、この第３の光路分割部材３０３で反射されて第１の検出部４００に入射する。この第１の検出部４００は、第３の光路分割部材３０３側から順に、第１の集光レンズ４０１と、第２の集光レンズ４０２と、第１の光電変換素子４０３と、から構成されている。第３の光路分割部材３０３で反射された蛍光は、第１及び第２の集光レンズ４０１，４０２で集光された後、第１の光電変換素子４０３に入射して電気信号に変換される。

　この第３の光路分割部材３０３で反射される蛍光は、励起光による２光子励起で生じる蛍光である。２光子励起は対物レンズ３０４の焦点面でしか発生しないため、第１の検出部４００に遮光板（ピンホール）を設ける必要はない。この第１の検出部４００は、ＮＤＤ（Non-Descan Detector）とも呼ばれる。

　一方、第３の光路分割部材３０３に入射する蛍光うち、上記所定の波長と異なる波長の蛍光は、この第３の光路分割部材３０３を透過し、第２対物レンズ３０２及び瞳投影レンズ３０１を通過し、さらに、第２の光路分割部材２０７を透過して第１の走査ユニット１０４に入射する。そして、この蛍光は第１の走査ユニット１０４でデスキャンされ、第１の光路分割部材１０３で反射されて第２の検出部５００に入射する。

　第２の検出部５００は、第１の光路分割部材１０３側から順に、第３の集光レンズ５０１と、対物レンズ３０４の標本側の焦点面と略共役な位置に配置された遮光版５０２と、第２の光電変換素子５０３と、から構成される。ここで、遮光板５０２にはピンホール５０２ａが設けられており、このピンホール５０２ａは、光軸を含むように配置されている。第１の光路分割部材１０３で反射された蛍光は、第３の集光レンズ５０１により遮光板５０２のピンホール５０２ａ上に集光され、このピンホール５０２ａを通過した光のみが第２の光電変換素子５０３で検出されて電気信号に変換される。

　上述のように、遮光板５０２のピンホール５０２ａは標本２０上の走査面に集光されたレーザ光（励起光）の点像と共役であり、標本２０上の照射領域（対物レンズ３０４の焦点面上）から出た蛍光はこのピンホール５０２ａを通過することができる。一方、標本２０上の他の領域から出た光のほとんどはこのピンホール５０２ａ上に集光されず、通過することができない。そのため、標本２０の像の深さ方向の分解能を向上させることができる。

　また、この走査型顕微鏡１０は、この走査型顕微鏡１０の作動を制御する制御部４０が接続されており、さらに、この制御部４０には、走査型顕微鏡１０を操作するための入力部５０、操作のためのメニューや第１及び第２の光電変換素子４０３，５０３で得られた標本２０の画像を表示するための出力部６０、及び、この画像を記憶するための記憶部７０が設けられている。

　以上より、制御部４０が第１及び第２の走査ユニット１０４，２０６の走査に同期して第１又は第２の光電変換素子４０３，５０３で検出された光信号（電気信号）を処理することにより、標本２０上のレーザ光が照射された座標と光信号から求められる輝度とを用いて、標本２０の走査面における二次元的な画像を得ることができる。これにより、この走査型顕微鏡１０は、高い分解能で標本２０の像を得ることができる。また、この走査型顕微鏡１０は、走査型多光子顕微鏡及び走査型共焦点顕微鏡の両方として使用することができる。

　それでは、以上のような構成の第２の走査光学系２００に配置されているビーム整形光学系２０５について２つの実施形態に基づいて説明する。

［第１の実施形態］
　まず、第１の実施形態に係るビーム整形光学系２０５について図２～図１１を用いて説明する。この第１の実施形態に係るビーム整形光学系２０５は、第２の光源２０１から放射されコリメートレンズ２０４で略平行光にされたレーザ光（刺激光）の断面形状（光軸に直交する面による断面の光束の形状）を、このレーザ光が、少なくとも対物レンズ３０４の瞳における光軸から所定の距離離れた領域を通過して対物レンズ３０４で集光されるように整形するものである。換言すると、ビーム整形光学系２０５によって整形されたレーザ光（刺激光）は、光軸を含む所定の面による断面において光軸に対して所定の角度をなす２光束であって、対物レンズ３０４を介して集光される。このようなレーザ光の断面形状としては、光軸を囲む輪帯形状がある。以下、レーザ光を輪帯形状に整形するビーム整形光学系２０５について説明する。

　レーザ光の断面形状を、少なくとも対物レンズ３０４の瞳における光軸から所定の距離離れた領域を通過するように整形すると、対物レンズ３０４の周辺部（光軸から所定の距離離れた領域）からこの対物レンズ３０４の焦点面に集光される。このように、対物レンズ３０４の周辺部からレーザ光を集光すると、このレーザ光により刺激される領域のうち、光軸方向の幅（深さ）、すなわち、対物レンズ３０４の焦点深度は深くなる。特に、ビーム整形光学系２０５によりレーザ光の断面形状を輪帯状にすると、対物レンズ３０４により集光されたレーザ光は、その断面の動径方向の強度分布が第１種ベッセル関数で表されるベッセルビームとなり、その焦点深度は非常に深くなる。つまり、光軸方向（深さ方向）に、より長い刺激光が形成される（深さ方向に広がった刺激光が形成される）。図２において、第１の走査光学系１００により集光され観察される平面はＡ１で示されており、第２の走査光学系２００からのベッセルビームにより刺激される領域（集光領域）はＡ２で示されている。このように、第１の走査光学系１００により平面Ａ１を観察しつつも、第２の走査光学系２００で形成されたベッセルビームにより、観察面では狭い１点の領域であるが、光軸方向のより深い領域を刺激することができる。そのため、この走査型顕微鏡１０は、上述したような脳細胞の観察に適している。

　図３（ａ）は、略平行のレーザ光（可視光又は刺激光）の断面形状を輪帯状に整形するビーム整形光学系２０５の構成の一例を示している。このビーム整形光学系２０５は、２つの透過型で凸型の円錐レンズ（アキシコンレンズ）２０５ａ，２０５ｂを、その頂点が対向するように配置している。なお、図３において、第２の光源２０１から射出されたレーザ光は、左から右に進む場合を示している。ビーム整形光学系２０５を、このような構成にすると、第２の光源２０１からの略平行のレーザ光が、第１の円錐レンズ２０５ａで拡散する輪帯状のレーザ光に変換され、さらに第２の円錐レンズ２０５ｂで略平行の輪帯状のレーザ光に変換される。なお、図３（ｂ）に示すように、第１及び第２の円錐レンズ２０５ａ，２０５ｂを、その頂点が互いに逆方向を向くように配置しても、図３（ａ）と同様に、輪帯状のレーザ光を得ることができる。

　また、図４（ａ）に示すように、光源側に頂点が向くように配置された凸型の第１の円錐ミラー２１５ａと、光軸を含む領域に貫通孔が形成され、その周囲にすり鉢状の円錐面が反射面として形成された凹型の第２の円錐ミラー２１５ｂとを組み合わせても、レーザ光の断面形状を輪帯状に整形することができる。この図４（ａ）の構成の場合、第２の光源２０１からの略平行のレーザ光は、第２の円錐ミラー２１５ｂの貫通孔を通過して第１の円錐ミラー２１５ａの反射面に入射する。そして、この第１の円錐ミラー２１５ａの反射面で反射されたレーザ光は、拡散する輪帯状のレーザ光に変換され、さらに、第２の円錐ミラー２１５ｂの反射面に入射し、この反射面で反射されて略平行の輪帯状のレーザ光に変換される。

　また、図４（ｂ）に示すように、すり鉢状の円錐面が形成された透過型で凹型の第１の円錐レンズ２２５ａと、凸型の第２の円錐レンズ２２５ｂとを、その頂点が光源側を向くように配置しても、レーザ光の断面形状を輪帯状に整形することができる。この図４（ｂ）の場合、第１の円錐ミラー２２５ａのすり鉢状の円錐面で、第２の光源２０１からの略平行のレーザ光が拡散する輪帯状のレーザ光に変換され、さらに第２の円錐レンズ２２５ｂで略平行の輪帯状のレーザ光に変換される。

　また、図５に示すように、標本側に頂点が向いた透過型で凸型の円錐レンズ２３５ａと、この円錐レンズ２３５ａを透過したレーザ光を反射する平面ミラー２３５ｂとを組み合わせても、レーザ光の断面形状を輪帯状に整形することができる。この図５の場合、円錐レンズ２３５ａの光源側には光軸に対して傾いた（例えば４５度傾いた）中空ミラー２３５ｃが配置されており、第２の光源２０１からの略平行のレーザ光はこの中空ミラー２３５ｃの中空部分を通過して円錐レンズ２３５ａに入射し、この円錐レンズ２３５ａで拡散する輪帯状のレーザ光に変換される。そして、平面ミラー２３５ｂで反射されて再度円錐レンズ２３５ａに入射して略平行の輪帯状のレーザ光に変換され、中空ミラー２３５ｃで反射されて射出される。このように、１枚の円錐ミラー２３５ａに１枚の平面ミラー２３５ｂを組み合わせることにより、このビーム整形光学系２０５において、高価な円錐レンズを１枚で構成することができる。また、中空ミラー２３５ｃを配置することにより、この中空ミラー２３５ｃを光路切換部材として機能させ、ビーム整形光学系２０５に対する入射光と射出光とを分離することができる。

　このようなビーム整形光学系２０５で整形されたレーザ光（ベッセルビーム）は、図６に示すように輪帯状の瞳形状ＩＡを有している。ここで、この輪帯状の瞳形状ＩＡの外径の開口数をＮＡとし、内径の開口数をＮＡ′とすると、開口数ＮＡ及びＮＡ′に対する波面収差φは、次式（１）及び（２）のように表される。なお、この式（１），（２）において、λは波長を示し、Δｚはデフォーカス量を示す。

　また、上述の図６に示す輪帯状のレーザ光（ベッセルビーム）の波面収差をΔφとすると、上記式（１），（２）の差として表されるため、以下の式（３）のようになる。

　ここで、波面収差がλ／４発生するところまでデフォーカスした領域をベッセルビームの焦点深度とし、この焦点深度の範囲をレーザ光により標本２０を刺激することができる領域であるとすると、上述の式（３）から、ベッセルビームの開口数と焦点深度との関係は図７のようになる。なお、この図７において、横軸は、規格化されたＮＡ、すなわち、ベッセルビームの内径の開口数ＮＡ′を外径の開口数ＮＡで除した値を示し、縦軸はこのベッセルビームに対する対物レンズ３０４の焦点深度を示している（ベッセルビームの焦点面からの光源側若しくは標本側の焦点深度）。なお、この図７に示すグラフの算出において、対物レンズ３０４は液浸系の対物レンズであって、標本２０及び浸液の屈折率はいずれも１．３５であるとする。また、レーザ光の波長は０．４０５μｍであるとする。また、図７のグラフは、ベッセルビームの外径の開口数ＮＡを０．１～１．３まで０．１刻みで変化させたときを表しており、最も上側の線がＮＡ＝０．１のときを示し、最も下側の線がＮＡ＝１．３のときを示している。

　このように、ビーム整形光学系２０５で整形されたレーザ光のビーム形状の外径のＮＡにより、対物レンズ３０４により集光されるスポットの径が決定され、また、外径のＮＡ及び規格化されたＮＡ（＝ＮＡ′／ＮＡ）により、焦点深度を決定することができる。

　なお、図８に示すように、第１及び第２の円錐レンズ２０５ａ，２０５ｂの光軸方向の間隔を変化させることにより、輪帯状のレーザ光の外径のＮＡを変化させることができる。また、図９に示すように、ビーム整形光学系２０５の光源側にビームエキスパンダ２０８を配置し、ビーム整形光学系２０５に入射する光束の径を変化させることにより、輪帯状のレーザ光の輪帯幅を変化させることができる。すなわち、第１及び第２の円錐レンズ２０５ａ，２０５ｂの間隔を広げると輪帯状のレーザ光の外径のＮＡを大きくすることでき、これらの間隔を狭めると外径のＮＡを小さくすることができる。また、ビームエキスパンダ２０８によりビーム整形光学系２０５に入射する光束の径を細くすることにより輪帯幅を狭くし、光束の径を太くすることにより輪帯幅を広くすることができる。円錐レンズ２２５ａ，２２５ｂや円錐ミラー２１５ａ，２１５ｂを組み合わせた構成、及び、円錐レンズ２３５ａと平面ミラー２３５ｂを組み合わせた構成でも同様である

　本実施形態に係る走査型顕微鏡１０は、ビーム整形光学系２０５に上述した円錐レンズ、円錐ミラー又は平面ミラーの位置を光軸方向に移動させるアクチュエータを設け、制御部４０でその作動を制御することにより、標本２０の所望の領域をレーザ光で刺激することができる。また、制御部４０でビームエキスパンダ２０８から出射する光束径を制御しても同様である。この場合、第２の光源２０１からのレーザ光が対物レンズ３０４を介して集光される集光領域の大きさを入力部５０を用いて制御部４０に設定し、制御部４０が上述したビーム整形光学系２０５のアクチュエータやビームエキスパンダ２０８の作動を制御することにより設定された集光領域を刺激する（照明する）ように構成される。なお、ビーム整形光学系２０５やビームエキスパンダ２０８の作動を制御するときの制御量（例えば、デフォーカス量Δｚ）は、上述した式等を用いて制御部４０で演算して求めても良いし、予め記憶部７０にこれらの関係をテーブルとして記憶しておき、制御部４０でその値を読み出しても良い。

　上述の式（３）から、刺激光の集光領域の光軸方向の距離、つまり、集光された光の最大強度の８割以上の強度を有する領域の光軸方向の距離ΔＤは、レーザ光の波長をλとすると、次式（４）のようになる。なお、集光された光の最大強度の８割以上の強度を有する領域の光軸方向の距離は、換言すると、対物レンズ３０４の焦点面を中心に、最大強度の８割の強度を有する光源側の位置から最大強度の８割の強度を有する光源と反対側の位置までの光軸方向の距離でもある。

　例えば、ＮＡ＝０．９、ＮＡ′＝０．８８とし、λ＝４８８ｎｍとすると、ΔＤ＝１．９９μｍとなる。

　一方、対物レンズ３０４に入射するビームの径をビームエキスパンダにより可変にする場合、刺激光の集光領域の光軸方向の距離、つまり、集光された光の最大強度の８割以上の強度を有する領域の光軸方向の距離ΔＤＳは、次式（５）のようになる。

　例えば、ＮＡ＝０．９とすると、ΔＤＳ＝０．４３μｍとなる。

　ここで、次式（６）の関係から、式（４）に示した、集光領域の光軸方向の距離ΔＤは、次式（７）の関係を有していると言える。

　なお、浸液がある対物レンズ３０４が液浸対物レンズの場合は、浸液の屈折率をｎとすると、上述の式（４）～（７）において、λをλ／ｎに置き換え、ＮＡをＮＡ／ｎに置き換える必要がある。

　また、刺激光の集光領域の光軸方向の距離ΔＤ、ΔＤＳは、対物レンズ３０４に入射するビームの中心が光軸に略一致し、光軸方向の距離が最大距離となるので、光軸方向の距離＝最大距離であるが、対物レンズ３０４に入射するビームの中心が、光軸に略一致しない場合は、光軸方向の距離が最大距離とはならないので、刺激光の集光領域の最大距離に置き換える必要がある。

　また、以上の説明では、観察用のレーザ光（励起光）をＩＲパルス光とし、刺激用のレーザ光（刺激光）を可視光とした場合について説明したが、励起光を可視光とし、刺激光をＩＲパルス光としても良いし、両方を可視光としても良いし、両方をＩＲパルス光としても良い。励起光を可視光とした場合、例えば脳細胞が標本２０の場合、浅い部分しか励起（観察）できないが、刺激光をＩＲパルス光とすることにより、深いところまで刺激することができる。また、励起光及び刺激光をＩＲパルス光とすると、標本２０の深部でも、励起（観察）及び刺激をすることができる。また、以上の説明では、第２の走査光学系２００にのみ、ビーム整形光学系２０５を設けた場合について説明したが、第１の走査光学系１００にもこのビーム整形光学系を設けることも可能である。また、対物レンズ３０４の焦点面と異なる面を中心に標本２０を刺激する場合には、第２の走査光学系２００に、刺激光の集光の中心が対物レンズ３０４の焦点面よりも標本側若しくは光源側にずれるように、結像位置を調整する光学系を設けても良い（例えば、略平行光である刺激光を、やや発散若しくは収斂させて対物レンズ３０４の焦点面よりも標本側若しくは像側に集光させる光学系を設ける）。もちろん、このビーム整形光学系は、上述の走査型顕微鏡１０だけでなく、その他の顕微鏡における刺激光の光学系にも適用することができる。

　また、以上の説明では、第２の走査光学系２００に配置されたビーム整形光学系２０５の光源側、すなわち、ビーム整形光学系２０５と第２の光源２０１（ファイバ射出端２０３）との間にビームエキスパンダ２０８を配置した場合について説明したが、このビームエキスパンダ２０８は、ビーム整形光学系２０５の標本側、すなわち、ビーム整形光学系２０５と対物レンズ３０４との間に配置しても良い。また、第１の走査光学系１００にビーム整形光学系を設ける場合も、このビーム整形光学系と第１の光源１０１との間、或いは、ビーム整形光学系と対物レンズ３０４との間にビームエキスパンダを配置することができる。

　また、以上の説明では、可視光（刺激光）を輪帯状のレーザ光（ベッセルビーム）に変換した場合について説明したが、図１０（ａ）に示すように、そのビーム形状ＩＡは、輪帯の一部が欠けた形状でも良い。また、図１０（ｂ）に示すように、複数の光源からの光、若しくは、一つ以上の光源からの光を分割して、それぞれを輪帯状に配置しても良い。図１０（ａ），（ｂ）のいずれの例も、ビーム整形光学系２０５によって整形されたレーザ光（刺激光）は、光軸を含む所定の面による断面において光軸に対して所定の角度をなす２光束である。また、円錐レンズや円錐ミラーを使用せず、ビーム整形光学系２０５として、輪帯状の開口部が形成された絞りを配置しても良い。

　また、ビーム整形光学系２０５で整形されたレーザ光は、その輪帯状の瞳形状ＩＭが、図１１（ａ）に示すように、対物レンズ３０４の瞳Ｐの中心に略一致していても構わないし、図１１（ｂ）に示すように、瞳Ｐの中心にかかっていても構わないし、図１１（ｃ）に示すように、瞳Ｐの中心から外れていても構わない。

［第２の実施形態］
　次に、第２の実施形態に係るビーム整形光学系２０５の構成について図１２～図２１を用いて説明する。この第２の実施形態に係るビーム整形光学系２０５は、図１２に示すように円盤状の光学部材として構成されている。このビーム整形光学系２０５の一方の面２２０ａには、図１２（ａ）の平面図及び（ｂ）の縦断面図に示すように、ビーム整形光学系２０５の周面２２０ｃに開放し且つビーム整形光学系２０５の周方向に伸びる段部２２１が形成されている。この段部２２１の深さ寸法ｈは、ガラス基盤の屈折率をｎとし、レーザ光の波長をλとすると、ｈ（ｎ－１）＝λ／２の関係を満たすように設定されている。従って、例えばレーザ光の波長がλ＝４８８ｎｍであり、屈折率がｎ＝１．５である場合、ｈ＝４８８ｎｍとなる。また、段部２２１は、例えば従来よく知られたリソグラフィ技術を用いて形成することができる。この段部２２１の形成により、ビーム整形光学系２０５の中央部には円柱状をなした第一の透光部分２２２が形成され、ビーム整形光学系２０５の周縁部には第一の透光部分２２２の板厚寸法よりも小さい板厚寸法を有する環状の第二の透光部分２２３が形成されている。

　第一及び第二の各透光部分２２２，２２３は、それぞれレーザ光が入射する入射面２２２ａ，２２３ａを有する。各入射面２２２ａ，２２３ａの大きさは、該各入射面への入射光量がそれぞれ等しくなるように設定されている。図示の例では、各入射面２２２ａ，２２３ａで構成されるビーム整形光学系２０５の他方の面２２０ｂにレーザ光が均一に照射されると考えて、各入射面２２２ａ，２２３ａの面積が互いに等しくなるように段部２２１が形成されている。すなわち、ビーム整形光学系２０５の他方の面２２０ｂの半径をＲとし、第一の透光部分２２２の半径をｒとすると、Ｒ及びｒは、Ｒ＝ｒ・２^1/2の関係を満たす。

　ビーム整形光学系２０５にその他方の面２２０ｂ側からレーザ光（刺激光）が照射されると、レーザ光の半分は第一の透光部分２２２を透過し、レーザ光の残りの半分は第二の透光部分２２３を透過する。このとき、段部２２１の深さ寸法ｈが、前記したように、ｈ（ｎ－１）＝λ／２の関係を満たすことから、第一及び第二の各透光部分２２２，２２３を透過した各レーザ光間に位相差πが付与される。位相差が生じた二つのレーザ光は、それぞれ第２の操作ユニット２０６及び第２の光路分割部材２０７を経た後、対物レンズ３０４で球面波に変換されて標本２０に向けて集光される。なお、図１２に示す位相差「０」及び「π」は一例であり逆でも良い。

　このときの対物レンズ３０４の光軸Ｌ上でのレーザ光の強度は、次式（８）で表される。この式（８）において、ＮＡは、対物レンズ３０４の開口数である。式（８）は、このＮＡが小さいときの近似式であり、図１３（ａ）で表される透過率を有する位相マスクをレーザ光が透過した後、対物レンズで集光されたときの光軸上の光強度分布を示している。（参考文献：Ｍ．Ｂｏｒｎ　ａｎｄ　Ｅ．Ｗｏｌｆ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ｏｆ　Ｏｐｔｉｃｓ（５ｔｈ．ｅｄ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ　Ｐｒｅｓｓ，１９７４））

　図１３（ｂ）は、式（８）をプロットしたグラフである。図１３（ｂ）のグラフの縦軸はレーザ光の光強度を示し、横軸は光軸Ｌ上の座標を示す。この図１３（ｂ）から明らかなように、光軸Ｌ上には、光強度が最大になる二つのピークが対物レンズ３０４の幾何光学焦点の前後に現れている。すなわち、互いに位相が異なる二つのレーザ光が対物レンズ３０４を通過したとき、光軸Ｌ上には、図１４に示すように、光強度の値が極大値をとる二つの集光点２２４，２２５が形成される。両集光点２２４，２２５の間隔は、図示の例では、レーザ光の波長をλとし、対物レンズ３０４の開口数をＮＡとすると、ＮＡが小さいとき、例えばＮＡ＜０．３である場合は、４．６λ／ＮＡ²となる。ＮＡが大きいとき、例えばＮＡ＝０．９である場合、両集光点２２４，２２５間の間隔は、約２λとなる。従って、例えばλ＝４８８ｎｍである場合、両集光点２２４，２２５間の間隔は約１μｍである。なお、ＮＡが大きいときは式（８）は成立せず、両集光点２２４，２２５の間隔は約２λ／ＮＡ²となる。すなわち、両集光点２２４，２２５の間隔（集光点の中心間の距離）をｄとすると、次式（９）の関係がある。

ｄ　＝　Ａ（ＮＡ）×λ／ＮＡ²　　　　　　　　　　　（９）

　但し、Ａ（ＮＡ）は比例係数であり、ＮＡの関数である。Ａ（ＮＡ）は、ＮＡが小さいとき値４．６となり、ＮＡ大きいとき値２となり、ＮＡが中程度のとき２と４．６との間の値となる。つまり、比例係数Ａ（ＮＡ）の範囲は、２≦Ａ（ＮＡ）≦４．６である。

　また、各集光点２２４，２２５に対応する光学的伝達関数（Ｏｐｔｉｃａｌ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎ：以下、ＯＴＦと称す。）は略同程度になった。図１５は、各集光点２２４，２２５のうち一方のＯＴＦの結果を示す。図１５の縦軸はＸＹ平面内の空間周波数を示し、横軸は光軸方向の空間周波数を示す。この図１５から明らかなように、十分な奥行き分解能を有することが分かる。奥行き分解能とは、従来よく知られているように、格子ベクトルを光軸方向にもつ三次元格子を分解する能力である。

　対物レンズ３０４を経た各レーザ光は、それぞれ標本２０に照射される。なお、この第２の実施形態においても、集光点２２４，２２５は、第２の走査ユニット２０６により走査される。

　この第２の実施形態によれば、上述したように、ビーム整形光学系２０５の一方の透光部分２２２を透過した光束と、他方の透光部分２２３を透過した光束との間に位相差が生じている。このことから、ビーム整形光学系２０５を経たレーザ光が対物レンズ３０４により集光されたとき、対物レンズ３０４の光軸Ｌ上には、位相差を有する透光部分２２２，２２３の個数と同数の集光点２２４，２２５がそれぞれレーザ光の波長に応じて規定される間隔をおいて形成される。これにより、標本２０の異なる高さ位置において対物レンズ３０４の光軸Ｌに直交する二つの断面上にそれぞれレーザ光を同時に照射することができる。

　また、両集光点２２４，２２５の間隔（集光点の中心間の光軸Ｌ上の距離）が、所定の距離ｄ離れることにより、光軸方向のより深い領域を刺激することができる。

　また、上述したように、第一及び第二の各透光部分２２２，２２３の入射面２２２ａ，２２３ａの大きさは、該各入射面への入射光量がそれぞれ等しくなるように設定されていることから、第一の透光部分２２２を透過するレーザ光の光量と第二の透光部分２２３を透過するレーザ光の光量とを等しくすることができる。これにより、各集光点２２４，２２５における標本２０に対する刺激を同じ条件で行うことができる。なお、レーザ光の光量分布が、光軸に直交する断面の動径方向にガウス分布を有する場合は、このガウス分布の比率を乗じて第１及び第２の透光部分２２２，２２３に入射する光量が等しくなるように入射面２２２ａ，２２３ａの大きさを決定する必要がある。第１及び第２の透光部分２２２，２２３の間の光量に差があると、２つの集光点２２４，２２５の間隔は変化しないが、これらの集光点２２４，２２５の光軸方向の外側に第３、第４の集光点が形成されて、また、２つの集光点２２４，２２５の光量のバランスも崩れてしまう。

　この第２の実施形態では、光軸Ｌ上に二つの集光点２２４，２２５が形成される例を示したが、これに代えて、三つ以上の集光点を光軸Ｌ上に形成することができる。例えば三つの集光点を光軸Ｌ上に形成する場合、図１６（ａ）及び（ｂ）に示すようなビーム整形光学系２０５を用いることができる。

　図１６に示す例では、ビーム整形光学系２０５の一方の面２２０ａには、このビーム整形光学系２０５の周面２２０ｃに開放し且つビーム整形光学系２０５の周方向に伸びる段部２３４に加えて、ビーム整形光学系２０５の中央部で凹部２３５が形成されている。段部２３４の深さ寸法ｈ１と凹部２３５の深さ寸法ｈ２とは互いに等しい。深さ寸法ｈ１及びｈ２は、それぞれｈ１・（ｎ－１）＝λ／２及びｈ２・（ｎ－１）＝λ／２の関係を満たすように設定されている。この段部２３４及び凹部２３５の形成により、ビーム整形光学系２０５には、その周縁部に第一の透光部分２３６が形成され、中央部に該第一の透光部分２３６の板厚寸法と等しい板厚寸法を有する第二の透光部分２３７が形成され、更に、第一及び第二の透光部分２３６，２３７間に該各透光部分の板厚寸法よりも大きい板厚寸法を有する環状の第三の透光部分２３８が形成されている。

　ここで、第一～第三の各透光部分２３６，２３７，２３８の入射面２３６ａ，２３７ａ,２３８ａの面積は、それぞれ等しい。すなわち、レーザ光の光量が光軸に直交する断面で均一である場合、第一～第三の透光部分２３６，２３７，２３８を透過する光量は等しくなる。

　また、入射面の面積が等しい必要は必ずしも無く、具体的には、このビーム整形光学系２０５の全体の半径、すなわち、第一の透光部分２３６の外周の半径をＲとし、凹部２３５の半径、すなわち、第二の透光部分２３７の外周の半径をｒ１とし、第三の透光部分２３８の外周の半径をｒ２としたとき、次式（１０）、（１１）が成り立つように、第一～第三の透光部分２３６，２３７，２３８の大きさを決定すると、よりコントラストが上がる。

ｒ１＝１７×Ｒ／２５　　　　　　　　　　　　　　　（１０）
ｒ２＝２０×Ｒ／２５　　　　　　　　　　　　　　　（１１）

　図１６に示す例によれば、第一の透光部分２３６を透過したレーザ光と第二の透光部分２３７を透過したレーザ光との間に位相差πが付与され、第二の透光部分２３７を透過したレーザ光と第三の透光部分２３８を透過したレーザ光との間に位相差πが付与される。なお、図１６に示す位相差「０」、「π」及び「０」は一例であり逆でも良い。

　この場合、上述した式（８）を用いて光軸方向に沿った光強度の分布を求めると、図１７に示す結果が得られる。この図１７から明らかなように、光軸Ｌ上には、対物レンズ３０４の幾何光学焦点上と該焦点の前後とにそれぞれ光強度の値が極大値をとる集光点２３９，２４０，２４１が現れている。すなわち、図１６に示すビーム整形光学系２０５を通過したレーザ光が対物レンズ３０４を通過したとき、光強度の値が極大値をとる三つの集光点２３９，２４０，２４１を光軸Ｌ上に形成することができる。従って、標本２０の三つの異なる高さ位置において対物レンズ３０４の光軸Ｌに直交する三つの断面上にそれぞれ光束を同時に照射することができる。なお、この場合も、上述したように、ビーム整形光学系２０５の第一～第三の透光部分２３６，２３７，２３８を透過する光量が等しくなるように構成されているため、３つの集光点２３９，２４０，２４１の光量もほぼ等しくなる。また、この集光点２３９，２４０，２４１も、第２の走査ユニット２０６により走査される。

　また、図１６に示すビーム整形光学系２０５の場合、対物レンズ３０４の開口数ＮＡが小さいときは３つの集光点が形成されない。一方、ＮＡが大きいときは、３つの集光点２３９，２４０，２４１の隣接する２つの集光点の間隔はそれぞれ、１．７５λ／ＮＡ²となる。ここで、３つの集光点２３９，２４０，２４１のうち、隣接する２つの集光点の間隔（集光点の中心間の距離）をｄとすると（換言すると、３つの集光点２３９，２４０，２４１のそれぞれの間隔ｄは）、前述の式（９）の関係となり、比例係数Ａ（ＮＡ）は、ＮＡが大きいとき値１．７５となり、ＮＡが中くらいのとき１．７５と４．６との間の値となるので、比例係数Ａ（ＮＡ）の範囲は、１．７５≦Ａ（ＮＡ）≦４．６となる。

　なお、距離ｄは、集光点が２つの場合の集光点の中心間の距離４．６λ／ＮＡ²より大きくなることはない。従って、集光点を結んだ直線全体の距離２ｄは、レーザ光の波長をλとすると、次式（１２）となる。

２ｄ　＝　２×Ａ（ＮＡ）×λ／ＮＡ²　　　　　　　　（１２）

　また、集光点が４つ以上あっても、各集光点の中心間の距離は、集光点が２つの場合の集光点の中心間の距離４．６λ／ＮＡ²より大きくなることはない。

　もちろん、レーザ光の光量がガウス分布を有する場合は、このガウス分布の比率を考慮する必要がある。なお、この図１６の構成の場合も、第一～第三の透光部分２３６，２３７，２３８の間の光量に差があると、第一～第三の集光点２３９，２４０，２４１の間隔は変化しないが、これらの集光点２３９，２４０，２４１の光軸方向の外側に第４、第５の集光点が形成され、また、３つの集光点２３９，２４０，２４１の光量のバランスも崩れてしまう。

　以上のように、この第２の実施形態に係るビーム整形光学系２０５において、第２の光源２０１からのレーザ光の光束径φを絞ると、対物レンズ３０４の焦点距離ｆとすると、φ＝２×ｆ×ＮＡから、標本２０に照射されるレーザ光のＮＡが小さくなる。この場合、集光点の光軸方向間隔は、上述した式（９）、（１２）から明らかなように、レーザ光のＮＡに比例するので、集光点の間隔は第２の光源２０１からのレーザ光の光束径に比例する。すなわち、ビーム整形光学系２０５により広がるレーザ光の集光領域（対物レンズ３０４の焦点面を中心光軸方向に広がる集光領域）は、第２の光源２０１からのレーザ光の光束径に比例することになる。

　また、図１２（ａ）及び（ｂ）に示す例では、ビーム整形光学系２０５の周縁部に段部２２１を形成することによりこのビーム整形光学系２０５に板厚寸法が異なる二つの透光部分２２２，２２３を形成した例を示した。これに代えて、例えば図１８（ａ）及び（ｂ）に示すように、ビーム整形光学系２０５の一方の面２２０ａの中央部に凹部２４２を形成することにより、このビーム整形光学系２０５に板厚寸法が異なる二つの透光部分２４３，２４４を形成することもできる。

　また、以上の説明では、ビーム整形光学系２０５に段部２２１,２３４及び凹部２３５を形成することにより、このビーム整形光学系２０５に板厚寸法が異なる複数の透光部分２２２，２２３，２３６，２３７，２３８を形成した例を示した。これに代えて、互いに大きさが異なる複数のガラス板を重ね合わせることより、板厚寸法が異なる複数の透光部分をビーム整形光学系２０５に形成することもできる。この場合、例えば図１９（ａ）及び（ｂ）に示すように、二つの集光点を形成すべく二つの透光部分をビーム整形光学系２０５に形成する場合、互いに径が異なる二つのガラス板２４５，２４６をそれぞれの間に間隔をおいて配置することもできる。

　また、この場合、図１６（ａ）及び（ｂ）に示す例では、三つの集光点２３９，２４０，２４１を光軸Ｌ上に形成するためにビーム整形光学系２０５に段部２３４及び凹部２３５を形成することにより三つの透光部分２３６，２３７，２３８を形成した例を示したが、これに代えて、例えば図２０（ａ）及び（ｂ）に示すように、径がそれぞれ異なる三つのガラス板２４７，２４８，２４９をその径の大きさに関係なく重ね合わせることにより、ビーム整形光学系２０５に三つの透光部分を形成することもできる。

　なお、図１９及び図２０に示したように複数のガラス板２４５，２４６，２４７，２４８，２４９を重ね合わせる場合、屈折力がそれぞれ等しいガラス板を用いることが好ましい。

　更に、以上に示す例では、ビーム整形光学系２０５が円盤状をなした例を示したが、これに代えて、例えば図２１（ａ）及び（ｂ）に示すように、矩形状をなすビーム整形光学系２０５を用いることも可能である。

　なお、ビーム整形光学系２０５として、ガラス板によって、入射したレーザ光に位相差を付与する例を説明したが、これに限らず、各透光部分における光の光学的光路長を任意に切り替えることにより、任意に位相差を付与可能な、いわゆる空間光変調素子を用いることが可能である。

　本実施形態に係る走査型顕微鏡１０は、ビーム整形光学系２０５に上述したガラス板を、切替制御する、或いは空間光変調素子を制御する制御部４０でその作動を制御することにより、標本２０の所望の領域をレーザ光で刺激することができる。この場合、第２の光源２０１からのレーザ光が対物レンズ３０４を介して集光される領域の大きさを入力部５０を用いて制御部４０に設定し、制御部４０が上述したビーム整形光学系２０５のアクチュエータやビームエキスパンダ２０８の作動を制御することにより設定された領域を刺激する（照明する）ように構成される。なお、ビーム整形光学系２０５の作動を制御するときの制御量（例えば、隣接する２つの集光点の間隔（集光点の中心間の距離ｄ）は、上述した式等を用いて制御部４０で演算して求めても良いし、予め記憶部７０にこれらの関係をテーブルとして記憶しておき、制御部４０でその値を読み出しても良い。

　上述の式（９）、（１２）から、複数の集光点を結んだ直線全体の距離ΔＤは、対物レンズ３０４の開口数をＮＡとし、レーザ光の波長をλとすると、次式（１３）のようになる。

ΔＤ　＝　（Ｎ－１）×Ａ（ＮＡ）×λ／ＮＡ²　　　　（１３）

　但し、Ａ（ＮＡ）は比例係数であり、ＮＡの関数であり、Ｎは集光点の数であり、比例係数Ａ（ＮＡ）の範囲は、１．５≦Ａ（ＮＡ）≦４．６である。

　例えば、ＮＡ＝０．９とし、λ＝４８８ｎｍとすると、ΔＤ＝１．２０μｍとなる。

　一方、対物レンズ３０４に入射するビームの径をビームエキスパンダにより可変にする場合、刺激光の集光領域の光軸方向の距離、つまり、集光された光の最大強度の８割以上の強度を有する領域の光軸方向の距離ΔＤＳは、波長をλとすると次式（１４）のようになる。

　例えば、ＮＡ＝０．９とし、λ＝４８８ｎｍとすると、ΔＤＳ＝０．４３μｍとなる。

　ここで、上述した複数の集光点を結んだ直線全体の距離ΔＤを刺激光の集光領域の最大距離とすると、ΔＤは、次式（１５）の関係を有していると言える。

　なお、浸液がある対物レンズ３０４が液浸対物レンズの場合は、浸液の屈折率をｎとすると、上述の式（１３）～（１５）において、λをλ／ｎに置き換え、ＮＡをＮＡ／ｎに置き換える必要がある。

　また、上述の各実施形態の要件は、適宜組み合わせることができる。また、一部の構成要素を用いない場合もある。また、法令で許容される限りにおいて、上述の各実施形態及び変形例で引用した装置などに関する全ての公開公報及び米国特許の開示を援用して本文の記載の一部とする。

１０　走査型顕微鏡（顕微鏡）　　２０　標本
４０　制御部　　５０　入力部
１００　第１の走査光学系（第１の光学系）　　１０１　第１の光源
２００　第２の走査光学系（第２の光学系）　　２０１　第２の光源
２０５　ビーム整形光学系
２０５ａ，２０５ｂ，２２５ａ，２２５ｂ，２３５ａ　円錐レンズ
２１５ａ，２１５ｂ　円錐ミラー　　２３５ｂ　平面ミラー
２３５ｃ　中空ミラー（光路切換部材）　　２０８　ビームエキスパンダ
３００　結像光学系　　３０４　対物レンズ

Claims (24)

1. 　第１の光源からの光を、対物レンズを介して標本に照射して前記標本からの光を受光する第１の光学系と、
   　前記第１の光源からの光、又は前記第１の光源とは異なる第２の光源からの光を、前記対物レンズを介して前記標本に照射して特異現象を発現させる第２の光学系と、を有し、
   　前記第２の光学系は、前記対物レンズを介して集光される、前記第１の光源からの前記光、又は前記第２の光源からの前記光の集光領域が、以下の条件を満たすように、前記第１の光源からの前記光、又は前記第２の光源からの前記光を整形するビーム整形光学系を有することを特徴とする顕微鏡。
   

   

   　但し、
   　　ΔＤ：前記第１の光源からの前記光、又は前記第２の光源からの前記光の前記集光領域の最大距離
   　　λ　：前記第１の光源からの前記光、又は前記第２の光源からの前記光の波長
   　　ＮＡ：前記対物レンズの開口数
2. 　前記ビーム整形光学系は、前記第１の光源からの前記光、又は前記第２の光源からの前記光が、前記対物レンズを介して、前記第２の光学系の光軸を含む所定の断面内において互いに所定の距離離れ、互いに所定の角度をなす２光束となって集光されるように前記光を整形することを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡。
3. 　前記ビーム整形光学系は、前記第１の光源からの前記光、又は前記第２の光源からの前記光が、前記対物レンズの瞳において前記光軸から所定の距離離れた領域を通過して前記対物レンズを介して集光されるように前記光の前記光軸に直交する面における形状を整形することを特徴とする請求項２に記載の顕微鏡。
4. 　前記ビーム整形光学系は、前記光の前記光軸に直交する面における形状を輪帯形状に整形することを特徴とする請求項３に記載の顕微鏡。
5. 　前記ビーム整形光学系は、互いの頂点が対向するように配置された２枚の円錐レンズで構成されることを特徴とする請求項４に記載の顕微鏡。
6. 　前記ビーム整形光学系は、互いの頂点が逆方向を向くように配置された２枚の円錐レンズで構成されることを特徴とする請求項４に記載の顕微鏡。
7. 　前記ビーム整形光学系は、円錐面がすり鉢状に形成された凹型の円錐レンズと、前記円錐面と対向するように円錐面が配置された凸型の円錐レンズと、から構成されることを特徴とする請求項４に記載の顕微鏡。
8. 　前記円錐レンズ間の光軸方向の間隔を変化させて前記輪帯形状の光の外径を変化させることを特徴とする請求項５～７のいずれか一項に記載の顕微鏡。
9. 　前記ビーム整形光学系は、光を反射する円錐面がすり鉢状に形成されるとともに、光軸上に貫通孔が形成された凹型の円錐ミラーと、光を反射する円錐面が形成され、前記貫通孔と位置整合して配置された凸型の円錐ミラーと、を有し、前記光源からの前記光を、前記貫通孔を通過させて前記凸型の円錐ミラーで反射させ、さらに、前記凹型の円錐ミラーで反射させるように構成されることを特徴とする請求項４に記載の顕微鏡。
10. 　前記円錐ミラー間の光軸方向の間隔を変化させて前記輪帯形状の光の外径を変化させることを特徴とする請求項９に記載の顕微鏡。
11. 　前記ビーム整形光学系は、光源側から順に、円錐レンズと、前記円錐レンズを透過した前記光を反射し、さらに前記円錐レンズに入射させる平面ミラーと、前記光源からの光を前記円錐レンズに導き、前記円錐レンズからの光を標本に導く光路切換部材と、から構成されることを特徴とする請求項４に記載の顕微鏡。
12. 　前記円錐レンズと前記平面ミラーとの光軸方向の間隔を変化させて前記輪帯形状の光の外径を変化させることを特徴とする請求項１１に記載の顕微鏡。
13. 　前記第１の光源又は前記第２の光源と前記ビーム整形光学系との間、或いは前記ビーム整形光学系と前記対物レンズとの間に配置され、前記光の径を変化させることにより、前記輪帯形状の光の輪帯幅を変化させるビームエキスパンダを有することを特徴とする請求項５～１２のいずれか一項に記載の顕微鏡。
14. 　前記ビーム整形光学系は、前記第１の光源からの前記光、及び前記第２の光源からの前記光のいずれか一方の前記光の一部と残りの前記光の少なくとも一部とに位相差を付与し、前記対物レンズを介して当該対物レンズの光軸上に複数の集光点を形成することを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡。
15. 　前記ビーム整形光学系は、前記光を透過させる複数の透光部分を有し、該各透光部分のうち少なくとも一つの該透光部分を透過した前記光に他の前記透光部分を透過した前記光との間で位相差を付与することを特徴とする請求項１４に記載の顕微鏡。
16. 　前記ビーム整形光学系は、板状部材であり、前記各透光部分における前記光の光学的光路長がそれぞれ異なるように形成されていることを特徴とする請求項１５に記載の顕微鏡。
17. 　前記ビーム整形光学系は、空間光変調素子であり、前記各透光部分における前記光の光学的光路長が任意に切り替え可能であることを特徴とする請求項１５に記載の顕微鏡。
18. 　前記各透光部分はそれぞれ前記光が入射する入射面を有し、該各入射面の面積は、該各入射面への入射光量がそれぞれ等しくなるように設定されていることを特徴とする請求項１６又は１７に記載の共焦点顕微鏡。
19. 　前記光が前記対物レンズを介して集光される前記集光領域の大きさを入力する入力部と、
    　前記集光領域の大きさに対応させて、前記ビーム整形光学系を制御する制御部と、を有することを特徴とする請求項１～１８のいずれか一項に記載の顕微鏡。
20. 　前記光が前記対物レンズを介して集光される前記集光領域の大きさを入力する入力部と、
    　前記集光領域の大きさに対応させて、前記円錐レンズ位置、前記円錐ミラー位置の少なくとも１つを制御する制御部と、を有することを特徴とする請求項５～１１のいずれか一項に記載の顕微鏡。
21. 　前記光が前記対物レンズを介して集光される前記集光領域の大きさを入力する入力部と、
    　前記集光領域の大きさに対応させて、前記円錐レンズの位置と前記平面ミラーの位置とを制御する制御部と、を有することを特徴とする請求項１２に記載の顕微鏡。
22. 　前記光が前記対物レンズを介して集光される前記集光領域の大きさを入力する入力部と、
    　前記集光領域の大きさに対応させて、前記ビームエキスパンダを制御する制御部と、を有することを特徴とする請求項１３に記載の顕微鏡。
23. 　前記光が前記対物レンズを介して集光される前記集光領域の大きさを入力する入力部と、
    　前記集光領域の大きさに対応させて、前記板状部材の切替を制御する、或いは前記空間光変調素子を制御する制御部と、を有することを特徴とする請求項１６又は１７に記載の顕微鏡。
24. 　対物レンズを介して励起光を標本に照射し、前記標本で発生した蛍光を集光する集光光学系を備えた顕微鏡に装着される刺激装置であって、
    　前記励起光を出射した第１の光源からの光、又は前記第１の光源とは異なる第２の光源からの光を、前記対物レンズを介して前記標本に照射して特異現象を発現させる刺激光学系を有し、
    　前記刺激光学系は、前記対物レンズを介して集光される、前記第１の光源からの前記光、又は前記第２の光源からの前記光の集光領域が、以下の条件を満たすように、前記第１の光源からの前記光、又は前記第２の光源からの前記光を整形するビーム整形光学系を有することを特徴とする刺激装置。
    

    

    　但し、
    　　ΔＤ：前記第１の光源からの前記光、又は前記第２の光源からの前記光の前記集光領域の最大距離
    　　λ　：前記第１の光源からの前記光、又は前記第２の光源からの前記光の波長
    　　ＮＡ：前記対物レンズの開口数

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