JP2019531757A - 目的物質の製造方法 - Google Patents
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- C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
- C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
- C12Y101/01001—Alcohol dehydrogenase (1.1.1.1)
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- C12Y113/00—Oxidoreductases acting on single donors with incorporation of molecular oxygen (oxygenases) (1.13)
- C12Y113/11—Oxidoreductases acting on single donors with incorporation of molecular oxygen (oxygenases) (1.13) with incorporation of two atoms of oxygen (1.13.11)
- C12Y113/11003—Protocatechuate 3,4-dioxygenase (1.13.11.3)
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- C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
- C12Y114/13—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with NADH or NADPH as one donor, and incorporation of one atom of oxygen (1.14.13)
- C12Y114/13082—Vanillate monooxygenase (1.14.13.82)
Abstract
Description
以下の工程:目的物質を生産する能力を有する微生物を利用して目的物質を製造すること
を含み、
前記微生物が、エノラーゼの活性が非改変株と比較して低下するように改変されており、
前記目的物質が、L−メチオニン、生合成にS−アデノシルメチオニンを要求する代謝物、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、方法を提供することである。
(a)配列番号129に示すアミノ酸配列を含むタンパク質;
(b)配列番号129に示すアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および/または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、エノラーゼ活性を有するタンパク質;および
(c)配列番号129に示すアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、エノラーゼ活性を有するタンパク質。
、前記方法を提供することである。
前記方法によりバニリン酸を製造すること;および
前記バニリン酸をバニリンに変換すること
を含む、方法を提供することである。
本明細書に記載の微生物は、エノラーゼ(enolase)の活性が低下するように改変された、目的物質を生産する能力を有する微生物である。目的物質を生産する能力を、「目的物質生産能」ともいう。
「目的物質生産能を有する微生物」とは、目的物質を生産することができる微生物を意味してよい。
of some mutant derivatives of Escherichia coli K-12, p. 2460-2488. Table 1. In F. D. Neidhardt (ed.), Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology/Second Edition, American Society for Microbiology Press, Washington, D.C.)に記載されたものが挙げられる。エシェリヒア属細菌としては、例えば、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)が挙げられる。エシェリヒア・コリとして、具体的には、例えば、W3110株(ATCC 27325)やMG1655株(ATCC 47076)等のエシェリヒア・コリK-12株;エシェリヒア・コリK5株(ATCC 23506);BL21(DE3)株等のエシェリヒア・コリB株;およびそれらの派生株が挙げられる。
トエア・シトレア(Pantoea citrea)が挙げられる。パントエア・アナナティスとして、具体的には、例えば、パントエア・アナナティスLMG20103株、AJ13355株(FERM BP-6614)、AJ13356株(FERM BP-6615)、AJ13601株(FERM BP-7207)、SC17株(FERM BP-11091)、SC17(0)株(VKPM B-9246)、及びSC17sucA株(FERM BP-8646)が挙げられる。なお、エンテロバクター属細菌やエルビニア属細菌には、パントエア属に再分類されたものもある(Int. J. Syst. Bacteriol., 39, 337-345(1989); Int. J. Syst. Bacteriol., 43, 162-173 (1993))。例えば、エンテロバクター・アグロメランスのある種のものは、最近、16S rRNAの塩基配列分析等に基づき、パントエア・アグロメランス、パントエア・アナナティス、パントエア・ステワルティイ等に再分類された(Int. J. Syst. Bacteriol., 39, 337-345(1989))。パントエア属細菌には、このようにパントエア属に再分類された細菌も包含されてよい。
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム(Corynebacterium acetoacidophilum)
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム(Corynebacterium acetoglutamicum)
コリネバクテリウム・アルカノリティカム(Corynebacterium alkanolyticum)
コリネバクテリウム・カルナエ(Corynebacterium callunae)
コリネバクテリウム・クレナタム(Corynebacterium crenatum)
コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)
コリネバクテリウム・リリウム(Corynebacterium lilium)
コリネバクテリウム・メラセコーラ(Corynebacterium melassecola)
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス(コリネバクテリウム・エフィシエンス)(Corynebacterium thermoaminogenes (Corynebacterium efficiens))
コリネバクテリウム・ハーキュリス(Corynebacterium herculis)
ブレビバクテリウム・ディバリカタム(コリネバクテリウム・グルタミカム)(Brevibacterium divaricatum (Corynebacterium glutamicum))
ブレビバクテリウム・フラバム(コリネバクテリウム・グルタミカム)(Brevibacterium
flavum (Corynebacterium glutamicum))
ブレビバクテリウム・イマリオフィラム(Brevibacterium immariophilum)
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム(コリネバクテリウム・グルタミカム)(Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum))
ブレビバクテリウム・ロゼウム(Brevibacterium roseum)
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム(Brevibacterium saccharolyticum)
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス(Brevibacterium thiogenitalis)
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス(コリネバクテリウム・スタティオニス)(Corynebacterium ammoniagenes (Corynebacterium stationis))
ブレビバクテリウム・アルバム(Brevibacterium album)
ブレビバクテリウム・セリナム(Brevibacterium cerinum)
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム(Microbacterium ammoniaphilum)
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806
Corynebacterium alkanolyticum ATCC 21511
Corynebacterium callunae ATCC 15991
Corynebacterium crenatum AS1.542
Corynebacterium glutamicum ATCC 13020, ATCC 13032, ATCC 13060, ATCC 13869, FERM BP-734
Corynebacterium lilium ATCC 15990
Corynebacterium melassecola ATCC 17965
Corynebacterium efficiens (Corynebacterium thermoaminogenes) AJ12340 (FERM BP-1539)
Corynebacterium herculis ATCC 13868
Brevibacterium divaricatum (Corynebacterium glutamicum) ATCC 14020
Brevibacterium flavum (Corynebacterium glutamicum) ATCC 13826, ATCC 14067, AJ12418(FERM BP-2205)
Brevibacterium immariophilum ATCC 14068
Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum) ATCC 13869
Brevibacterium roseum ATCC 13825
Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066
Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240
Corynebacterium ammoniagenes (Corynebacterium stationis) ATCC 6871, ATCC 6872
Brevibacterium album ATCC 15111
Brevibacterium cerinum ATCC 15112
Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354
Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of Americaまたはatcc.org)より分譲を受けることが出来る。すなわち各菌株に対応する登録番号が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受けることが出来る(atcc.org/参照)。各菌株に対応する登録番号は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。また、これらの菌株は、例えば、各菌株が寄託された寄託機関から入手することができる。
上記のような微生物に目的物質生産能を付与することにより、または、上記のような微生物の目的物質生産能を増強することにより、取得できる。
acteriaceae)の細菌やコリネ型細菌等の各種生物のものが挙げられる。DAHP synthaseとして、具体的には、E. coliのAroF、AroG、AroHタンパク質が挙げられる。E. coli K-12 MG1655株のaroG遺伝子の塩基配列を配列番号1に、同遺伝子がコードするAroGタンパク質のアミノ酸配列を配列番号2に示す。
dehydratase等)をコードする遺伝子の発現は、tyrR遺伝子にコードされるチロシンリプレッサーTyrRにより抑制される。よって、シキミ酸経路の酵素の活性は、チロシンリプレッサーTyrRの活性を低下させることによっても、増大させることができる。E. coli K-12
MG1655株のtyrR遺伝子の塩基配列を配列番号9に、同遺伝子がコードするTyrRタンパク質のアミノ酸配列を配列番号10に示す。
作用させた際に、例えば、モル比で、イソバニリンの3倍以上、5倍以上、10倍以上、15倍以上、20倍以上、25倍以上、または30倍以上のバニリンを生成することを意味してよい。メタ位の水酸基のメチル化を選択的に触媒するOMTとしては、本明細書に記載の「特定の変異」を有するOMTが挙げられる。
or positive side-chain charge at pH 7.4)に置換される変異が挙げられる。変異型OMTは、これらの変異のいずれか一方を有していてもよく、両方を有していてもよい。
Lys, Met, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyrから選択されるアミノ酸残基が挙げられ、さらに特には、Tyrが挙げられる。
Asn, Cys, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Valが挙げられる。「pH7.4において側鎖が無電荷または正電荷となるアミノ酸残基」としては、特に、AlaやGlnが挙げられる。
るかは、当該任意のOMTのアミノ酸配列と配列番号16に示すアミノ酸配列とのアライメントを行うことにより決定できる。アライメントは、例えば、公知の遺伝子解析ソフトウェアを利用して行うことができる。具体的なソフトウェアとしては、日立ソリューションズ製のDNASISや、ゼネティックス製のGENETYXなどが挙げられる(Elizabeth C. Tyler et
al., Computers and Biomedical Research, 24(1), 72-96, 1991;Barton GJ et al., Journal of molecular biology, 198(2), 327-37. 1987)。
T. A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367 (1987))が挙げられる。
No.1, p478-485)。Nocardia sp. NRRL 5646株は、Nocardia iowensisに分類されている。ACARとしては、さらに、Nocardia brasiliensisやNocardia vulneris等の、他のNocardia属細菌のACARも挙げられる。Nocardia brasiliensis ATCC 700358のACAR遺伝子の塩基配列を配列番号17に、同遺伝子がコードするACARのアミノ酸配列を配列番号18に示す。また、Nocardia brasiliensis ATCC 700358のバリアントACAR遺伝子の一例の塩基配列を配列番号19に、同遺伝子がコードするACARのアミノ酸配列を配列番号20に示す。
ルトランスフェラーゼ(acetylserotonin O-methyltransferase;EC 2.1.1.4)の作用により、順に、ヒドロキシトリプトファン(hydroxytryptophan)、セロトニン(serotonin)、N−アセチルセロトニン(N-acetylserotonin)、およびメラトニンへと変換され得る。すなわち、L−トリプトファンからメラトニンへの変換を触媒する酵素としては、これらの酵素が挙げられる。なお、acetylserotonin O-methyltransferaseは、SAMをメチル基供与体としてN−アセチルセロトニンをメチル化してメラトニンを生成するOMTの一例である。
sulfoxide)、ヘルシニル−L−システインスルホキシド(hercynyl-L-cysteine sulfoxide)、およびエルゴチオネインへと変換され得る。また、ヘルシニンは、egt1遺伝子にコードされるEgt1タンパク質の作用により、ヘルシニル−L−システインスルホキシドへと変換され得る。すなわち、L−ヒスチジンからエルゴチオネインへの変換を触媒する酵素としては、これらの酵素が挙げられる。なお、EgtDは、SAMをメチル基供与体としてヒスチジンをメチル化してヘルシニンを生成するSAM依存的ヒスチジン−N,N,N−メチルトランスフェラーゼ(S-adenosyl-l-methionine (SAM)-dependent histidine N,N,N-methyltransferase)である。
アミノトランスフェラーゼ(tyrosine amino transferase;tyrB)が挙げられる。コリスミ酸ムターゼおよびプレフェン酸デヒドロゲナーゼは、二機能酵素としてtyrA遺伝子にコードされてよい。L−フェニルアラニンは、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ(phenylalanine ammonia lyase;PAL;EC 4.3.1.24)の作用により桂皮酸(cinnamic acid)へ、次いで桂皮酸−4−ヒドロキシラーゼ(cinnamic acid 4-hydroxylase;C4H;EC 1.14.13.11)の作用によりp−クマル酸(p-coumaric acid)へと変換され得る。また、L−チロシンは、チロシンアンモニアリアーゼ(tyrosine ammonia lyase;TAL;EC 4.3.1.23)の作用により、p−クマル酸へと変換され得る。p−クマル酸は、ヒドロキシ桂皮酸−3−ヒドロキシラーゼ(hydroxycinnamic acid 3-hydroxylase;C3H)、O−メチルトランスフェラーゼ(O-methyltransferase;OMT)、フェルラ酸デカルボキシラーゼ(ferulic acid decarboxylase;FDC)、およびビニルフェノールレダクターゼ(vinylphenol reductase;VPR)の作用により、順に、コーヒー酸(caffeic acid)、フェルラ酸、4−ビニルグアイアコール、および4−エチルグアイアコールへと変換され得る。すなわち、L−フェニルアラニンまたはL−チロシンからフェルラ酸、4−ビニルグアイアコール、または4−エチルグアイアコールへの変換を触媒する酵素としては、これらの酵素が挙げられる。フェルラ酸、4−ビニルグアイアコール、または4−エチルグアイアコールを生産するためには、少なくともコーヒー酸を利用するOMTを用いることができる。
合成酵素としては、例えば、L−アルギニン生合成酵素、グリシン生合成酵素、およびL−アルギニンおよびグリシンからクレアチンへの変換を触媒する酵素も挙げられる。L−アルギニンおよびグリシンは、アルギニン:グリシンアミジノトランスフェラーゼ(arginine:glycine amidinotransferase;AGAT;EC 2.1.4.1)の作用により、結合してグアニジノ酢酸(guanidinoacetate)およびオルニチン(ornithine)を生成し得る。グアニジノ酢酸は、グアニジノ酢酸−N−メチルトランスフェラーゼ(guanidinoacetate N-methyltransferase;GAMT;EC 2.1.1.2)の作用により、SAMをメチル基供与体としてメチル化されクレアチンを生成し得る。すなわち、L−アルギニンおよびグリシンからクレアチンへの変換を触媒する酵素としては、これらの酵素が挙げられる。
副生に関与する酵素の活性を低下させる方法が挙げられる。そのような目的物質以外の物質を、「副生物」ともいう。そのような酵素を、「副生物生成酵素」ともいう。副生物生成酵素としては、例えば、目的物質の資化に関与する酵素や、目的物質の生合成経路から分岐して目的物質以外の物質を生成する反応を触媒する酵素が挙げられる。タンパク質(酵素等)の活性を低下させる手法については本明細書に記載する。タンパク質(酵素等)の活性は、例えば、同タンパク質をコードする遺伝子を破壊等することにより、低下させることができる。例えば、コリネ型細菌において、バニリンは、バニリン→バニリン酸→プロトカテク酸の順に代謝され、資化されることが報告されている(Current Microbiology, 2005, Vol.51, p59-65)。すなわち、副生物生成酵素として、具体的には、バニリンからプロトカテク酸への変換を触媒する酵素や、プロトカテク酸のさらなる代謝を触媒する酵素が挙げられる。そのような酵素としては、バニリン酸デメチラーゼ(vanillate demethylase)、プロトカテク酸3,4−ジオキシゲナーゼ(protocatechuate 3,4-dioxygenase)、およびプロトカテク酸3,4−ジオキシゲナーゼによる反応産物をスクシニルCoAとアセチルCoAまでさらに分解する各種酵素(Appl. Microbiol. Biotechnol., 2012, Vol.95, p77-89)が挙げられる。また、バニリンは、アルコールデヒドロゲナーゼ(alcohol dehydrogenase)の作用により、バニリルアルコールへと変換され得る(Kunjapur AM. et al., J. Am. Chem. Soc., 2014, Vol.136, p11644-11654.; Hansen EH. et al., App.
Env. Microbiol., 2009, Vol.75, p2765-2774.)。すなわち、副生物生成酵素として、具体的には、alcohol dehydrogenase(ADH)も挙げられる。また、バニリン生合成経路の中間体である3−デヒドロシキミ酸は、シキミ酸デヒドロゲナーゼ(shikimate dehydrogenase)の作用によりシキミ酸へと変換され得る。すなわち、副生物生成酵素として、具体的には、shikimate dehydrogenaseも挙げられる。
l., 2012, Vol.95, p77-89)。pcaG遺伝子およびpcaH遺伝子は、それぞれ、プロトカテク酸3,4−ジオキシゲナーゼのαサブユニットおよびβサブユニットをコードする。プロトカテク酸3,4−ジオキシゲナーゼ活性を低下させる場合、例えば、pcaGH遺伝子の両方を破壊等してもよく、片方のみを破壊等してもよい。C. glutamicum ATCC 13032株のpcaGH遺伝子の塩基配列を配列番号33と35に、同遺伝子がコードするPcaGHタンパク質のアミノ酸配列を配列番号34と36に、それぞれ示す。
genaseとしては、aroE遺伝子にコードされるAroEタンパク質が挙げられる。E. coli K-12
MG1655のaroE遺伝子の塩基配列を配列番号49に、同遺伝子がコードするAroEタンパク質のアミノ酸配列を配列番号50に示す。
terobacteriaceae)の細菌やコリネ型細菌等の各種生物のものが挙げられる。そのようなアクチベーターとして、具体的には、C. glutamicumのCysRタンパク質およびSsuRタンパク質が挙げられる。C. glutamicum ATCC 13869株のcysR遺伝子(NCgl0120)およびssuR遺伝子の塩基配列を配列番号104と106に、同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号105と107に、それぞれ示す。CysRタンパク質およびSsuRタンパク質の一方または両方の活性を増大させてよい。例えば、少なくとも、CysRタンパク質の活性を低下させてもよい。そのようなアクチベーターの活性は、例えば、同アクチベーターをコードする遺伝子の発現を増大させることにより、増大させることができる。
であってもよい。具体的には、例えば、目的物質生産能を有する微生物の育種に使用される遺伝子は、元の機能(例えば、酵素活性やトランスポーター活性等)が維持されている限り、上記例示したアミノ酸配列や公知のタンパク質のアミノ酸配列において、1若しくは数個の位置での1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。遺伝子およびタンパク質の保存的バリアントについては、本明細書に記載のenolase遺伝子およびenolaseの保存的バリアントに関する記載を準用できる。
微生物は、enolaseの活性が低下するように改変できる。具体的には、微生物は、enolaseの活性が非改変株と比較して低下するように改変できる。enolaseの活性が低下するように微生物を改変することによって、同微生物の目的物質生産能を向上させることができる、すなわち、同微生物を用いた目的物質の生産を増大させることができる。また、enolaseの活性が低下するように微生物を改変することによって、同微生物のSAMを生成または再生する能力を向上させることができ得る。すなわち、微生物の目的物質生産能の増大は、具体的には、同微生物のSAMを生成または再生する能力の増大によるものであってもよい。
ク質には、それぞれ、上記例示した遺伝子およびタンパク質に限られず、それらの保存的バリアントも包含されてよい。すなわち、「eno遺伝子(またはNCgl0935遺伝子)」という用語は、上記例示したeno遺伝子(例えば、配列番号128に示す塩基配列を有するeno遺伝子)に加えて、それらの保存的バリアントを包含してよい。同様に、「Enoタンパク質(またはNCgl0935タンパク質)」という用語は、上記例示したEnoタンパク質(例えば、配列番号129に示すアミノ酸配列を有するEnoタンパク質)に加えて、それらの保存的バリアントを包含してよい。保存的バリアントとしては、例えば、上記例示した遺伝子やタンパク質のホモログや人為的な改変体が挙げられる。
置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加等には、遺伝子が由来する生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異(mutant又はvariant)によって生じるものも含まれる。
SDS、より好ましくは68℃、0.1×SSC、0.1% SDSに相当する塩濃度および温度で、1回、好ましくは2〜3回洗浄する条件を挙げることができる。
タにより実行することができる。このようなプログラムとしては、特に限定されないが、PC/GeneプログラムのCLUSTAL(Intelligenetics, Mountain View, Calif.から入手可能)、ALIGNプログラム(Version 2.0)、並びにWisconsin Genetics Software Package, Version 8(Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Drive, Madison, Wis., USAから入手可能)のGAP、BESTFIT、BLAST、FASTA、及びTFASTAが挙げられる。これらのプログラムを用いたアライメントは、例えば、初期パラメーターを用いて行うことができる。CLUSTALプログラムについては、Higgins et al. (1988) Gene 73:237-244、Higgins et al. (1989) CABIOS 5:151-153、Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90、Huang et al. (1992) CABIOS 8:155-65、及びPearson et al. (1994) Meth. Mol. Biol. 24:307-331によく記載されている。
以下に、タンパク質の活性を増大させる手法について説明する。
場合の「活性」とは、タンパク質の触媒活性に限られず、タンパク質をコードする遺伝子の転写量(mRNA量)または翻訳量(タンパク質の量)を意味してもよい。また、「タンパク質の活性が増大する」ことには、もともと標的のタンパク質の活性を有する菌株において同タンパク質の活性を増大させることだけでなく、もともと標的のタンパク質の活性が存在しない菌株に同タンパク質の活性を付与することも包含される。また、結果としてタンパク質の活性が増大する限り、宿主が本来有する標的のタンパク質の活性を低下または消失させた上で、好適な標的のタンパク質の活性を付与してもよい。
1988, 73, 227-235)。さらに、RBSと開始コドンとの間のスペーサー領域、特に開始コドンのすぐ上流の配列(5’-UTR)における数個のヌクレオチドの置換、あるいは挿入、あるいは欠失がmRNAの安定性および翻訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られており、これらを改変することによっても遺伝子の翻訳効率を向上させることができる。
せで用いてもよい。
al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual/Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001)。mRNAの量は、例えば、非改変株
の、1.2倍以上、1.5倍以上、2倍以上、または3倍以上に上昇してよい。
以下に、enolase等のタンパク質の活性を低下させる手法について説明する。
下、20%以下、10%以下、5%以下、または0%に低下してよい。
y 26 116, 20833-20839(1991))。
本明細書に記載の方法は、本明細書に記載の微生物を利用して目的物質を製造する方法である。
目的物質は、例えば、本明細書に記載の微生物の発酵により製造することができる。すなわち、本明細書に記載の方法の一態様は、微生物の発酵により目的物質を製造する方法であってよい。この態様を、「発酵法」ともいう。また、本明細書に記載の微生物の発酵により目的物質を製造する工程を、「発酵工程」ともいう。
物等の有機窒素源、アンモニア、ウレアが挙げられる。pH調整に用いられるアンモニアガスやアンモニア水を窒素源として利用してもよい。窒素源としては、1種の窒素源を用いてもよく、2種またはそれ以上の窒素源を組み合わせて用いてもよい。
せで、培地に添加してもよい。これらの成分は、いずれも、1回または複数回添加されてもよく、連続的に添加されてもよい。初発培地に含有される成分の種類は、流加培地に含有される成分の種類と、同一であってもよく、そうでなくてもよい。また、初発培地に含有される各成分の濃度は、流加培地に含有される各成分の濃度と、同一であってもよく、そうでなくてもよい。また、含有する成分の種類および/または濃度の異なる2種またはそれ以上の流加培地を用いてもよい。例えば、複数回の流加が間欠的に行われる場合、各流加培地に含有される成分の種類および/または濃度は、同一であってもよく、そうでなくてもよい。
目的物質は、例えば、本明細書に記載の微生物を利用した生物変換により製造することもできる。すなわち、本明細書に記載の方法の別の態様は、微生物を利用した生物変換により目的物質を製造する方法であってよい。この態様を、「生物変換法」ともいう。また
、微生物を利用した生物変換により目的物質を製造する工程を、「生物変換工程」ともいう。
能を有し且つプロトカテク酸5位酸化酵素活性が低下または欠損した微生物を用いてプロトカテク酸をその前駆体から製造する方法(特開2010-207094号公報)が挙げられる。また、発酵法によるプロトカテク酸の製造法としては、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属に属する細菌を用いて酢酸を炭素源としてプロトカテク酸を製造する方法(特開昭50-89592号公報)や、3−ジヒドロシキミ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が導入されたエシェリヒア(Escherichia)属またはクレブシエラ(Klebsiella)属に属する細菌を用いてグルコースを炭素源としてプロトカテク酸を製造する方法(米国特許第5,272,073号明細書)が挙げられる。また、プロトカテクアルデヒドは、プロトカテク酸を前駆体として、ACARを利用した酵素法またはACARを有する微生物を利用した生物変換法により製造することができる。製造された前駆体は、そのまま、あるいは、適宜、濃縮、希釈、乾燥、溶解、分画、抽出、精製等の処理に供してから、生物変換法に利用できる。すなわち、前駆体としては、例えば、所望の程度に精製された精製品を用いてもよく、前駆体を含有する素材を用いてもよい。前駆体を含有する素材は、微生物が前駆体を利用できる限り特に制限されない。前駆体を含有する素材として、具体的には、例えば、前駆体生産能を有する微生物を培養して得られた培養液、該培養液から分離した培養上清、それらの濃縮物(例えば、濃縮液)や乾燥物等の処理物が挙げられる。
なくとも本培養の期間に生産されればよい。よって、前駆体は、少なくとも本培養の期間に、すなわち本培養の全期間または本培養の一部の期間に、培地に含有されていればよい。すなわち、前駆体は、種培養の期間には培地に含有されていてもよく、いなくてもよい。このような場合、培養についての記載(例えば、「培養期間(培養の期間)」や「培養開始」)は、本培養についてのものとして読み替えることができる。
、バッチ式で実施してもよく、カラム式で実施してもよい。バッチ式の場合は、例えば、反応容器内の反応液中で、微生物の菌体と前駆体とを混合することにより、変換反応を実施できる。変換反応は、静置して実施してもよく、撹拌や振盪して実施してもよい。カラム式の場合は、例えば、固定化菌体を充填したカラムに前駆体を含有する反応液を通液することにより、変換反応を実施できる。反応液としては、水や水性緩衝液等の水性媒体(水性溶媒)が挙げられる。
g/L以下、50 g/L以下、または20 g/L以下であってもよく、それらの組み合わせであってもよい。反応液中の菌体の濃度は、例えば、600nmにおける光学密度(OD)に換算して、1以上であってもよく、300以下であってもよく、それらの組み合わせであってもよい。
メチル基供与体等の成分を生成または再生することができる。例えば、具体的には、微生物はSAMを生成または再生する増強された能力を有していてもよく、同微生物により生成または再生されたSAMが変換反応に用いられてもよい。SAMの生成または再生は、SAMを生成または再生する他の手法との組み合わせによってさらに増強され得る。また、ATPを生成または再生する方法としては、例えば、コリネバクテリウム属細菌を利用して炭素源からATPを供給させる方法(Hori, H et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 48(6): 693-698 (1997))、酵母菌体とグルコースを利用してATPを再生する方法(Yamamoto, S et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. 69(4): 784-789 (2005))、ホスホエノールピルビン酸とピルビン酸キナーゼを利用してATPを再生する方法(C. Aug’e and Ch. Gautheron, Tetrahedron Lett. 29:789-790 (1988))、ポリリン酸とポリリン酸キナーゼを利用してATPを再生する方法(Murata, K et al., Agric. Biol. Chem. 52(6): 1471-1477 (1988))が挙げられる。
本明細書に記載の微生物を利用して(すなわち発酵法または生物変換法により)目的物質が製造される場合、製造された目的物質をさらに他の目的物質に変換することができる。すなわち、本発明は、微生物を利用して(すなわち発酵法または生物変換法により)第1の目的物質(すなわち、目的物質A)を製造する工程、および製造された第1の目的物質Aを第2の目的物質(すなわち、目的物質B)に変換する工程を含む、第2の目的物質Bを製造する方法を提供する。
は反応液、該培養液または反応液から分離した上清、それらの濃縮物(例えば、濃縮液)や乾燥物等の処理物が挙げられる。
。バニリン製造法における酵素反応については、例えば、生物変換法の第2の態様における変換反応に関する記載を準用できる。
コリネ型細菌において、バニリンは、バニリン→バニリン酸→プロトカテク酸の順に代謝され、資化されることが報告されている(Current Microbiology, 2005, Vol.51, p59-65)。バニリン酸からプロトカテク酸への変換反応は、バニリン酸デメチラーゼにより触媒される。vanA遺伝子およびvanB遺伝子は、それぞれバニリン酸デメチラーゼのサブユニットAおよびサブユニットBをコードする。vanK遺伝子は、バニリン酸取り込み系をコードし、vanAB遺伝子とvanABKオペロンを構成している(M. T. Chaudhry, et al., Microbiology, 2007. 153:857-865)。よって、まず、vanABKオペロンを欠損させることにより、C.
glutamicum 2256株からバニリンやバニリン酸等の目的物質の資化能を欠損した株(FKS0165株)を構築した。手順を以下に示す。
C. glutamicum 2256株のゲノムDNAを鋳型として、配列番号51および52の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、vanA遺伝子のN末端側コード領域を含むPCR産物を得た。一方、C. glutamicum 2256株のゲノムDNAを鋳型として、配列番号53および54の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、vanK遺伝子のC末端側コード領域を含むPCR産物を得た。配列番号52および53は一部が相補的な配列となっている。次にvanA遺伝子のN末端側コード領域を含むPCR産物およびvanK遺伝子のC末端側コード領域を含むPCR産物をそれぞれほぼ等モルとなるように混合し、In Fusion HD cloning kit(Clontech)を用いて、BamHIとPstIで処理をしたpBS4Sベクター(WO2007/046389)に挿入した。このDNAを用いてEs
cherichia coli JM109のコンピテントセル(タカラバイオ)を形質転換し、IPTG 100μM、X-Gal 40μg/mL、およびカナマイシン40μg/mLを含有するLB培地に塗布し、一晩培養した。その後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得た。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、目的のPCR産物が挿入されていたものをpBS4SΔvanABK56と命名した。
上記で得られたpBS4SΔvanABK56はコリネ型細菌の細胞内で自律複製可能とする領域を含まないため、本プラスミドでコリネ型細菌を形質転換した場合、極めて低頻度であるが本プラスミドが相同組換えによりゲノムに組み込まれた株が形質転換体として出現する。そこで、pBS4SΔvanABK56を電気パルス法にてC. glutamicum 2256株に導入した。菌体を、カナマイシン25μg/mLを含有するCM-Dex寒天培地(グルコース 5 g/L、Polypeptone 10
g/L、Yeast Extract 10 g/L、KH2PO41 g/L、MgSO4・7H2O 0.4 g/L、FeSO4・7H2O 0.01 g/L、MnSO4・7H2O 0.01 g/L、尿素 3 g/L、大豆加水分解物 1.2 g/L、ビオチン 10μg/L、寒天 15 g/L、NaOHでpH7.5に調整)に塗布し、31.5℃にて培養した。生育してきた株について、相同組換えによってゲノム上にpBS4SΔvanABK56が組み込まれた1回組換え株であることをPCRで確認した。該1回組換え株は、野生型のvanABK遺伝子群と欠損型のvanABK遺伝子群の両方を有する。
次いで、Corynebacterium glutamicum FKS0165株を親株として、アルコールデヒドロゲナーゼホモログ遺伝子であるNCgl0324遺伝子(adhC)、NCgl0313遺伝子(adhE)、NCgl2709遺伝子(adhA)を欠損した株(FKFC14株)を以下の手順で構築した。
<2−1−1>NCgl0324遺伝子欠損用プラスミドpBS4SΔ2256adhCの構築
C. glutamicum 2256株のゲノムDNAを鋳型として、配列番号57および58の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、NCgl0324遺伝子のN末端側コード領域を含むPCR産物を得た。一方、C. glutamicum 2256株のゲノムDNAを鋳型として、配列番号59および60の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、NCgl0324遺伝子のC末端側コード領域を含むPCR産物を得た。配列番号58および59は一部が相補的な配列となっている。次に、NCgl0324遺伝子のN末端側コード領域を含むPCR産物およびNCgl0324遺伝子のC末端側コード領域を含むPCR産物をそれぞれほぼ等モルとなるように混合し、In Fusion HD cloning kit(Clontech)を用いて、BamHIとPstIで処理をしたpBS4Sベクター(WO2007/046389)に挿入した。このDNAを用いてEscherichia coli JM109のコンピテントセル(タカラバイオ)を形質転換し、IPTG 100μM、X-Gal 40μg/mL、およびカナマイシン40μg/mLを含有するLB培地に塗布し、一晩培養した。その後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得た。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、目的のPCR産物が挿入されていたものをpBS4SΔ2256adhCと命名した。
上記で得られたpBS4SΔ2256adhCはコリネ型細菌の細胞内で自律複製可能とする領域を含まないため、本プラスミドでコリネ型細菌を形質転換した場合、極めて低頻度であるが本プラスミドが相同組換えによりゲノムに組み込まれた株が形質転換体として出現する。そこで、pBS4SΔ2256adhCを電気パルス法にてC. glutamicum FKS0165株に導入した。菌体を、カナマイシン25μg/mLを含有するCM-Dex寒天培地に塗布し、31.5℃にて培養した。生育してきた株について、相同組換えによってゲノム上にpBS4SΔ2256adhCが組み込まれた1回組換え株であることをPCRで確認した。該1回組換え株は、野生型のNCgl0324遺伝子と欠損型のNCgl0324遺伝子の両方を有する。
<2−2−1>NCgl0313遺伝子欠損用プラスミドpBS4SΔ2256adhEの構築
C. glutamicum 2256株のゲノムDNAを鋳型として、配列番号63および64の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、NCgl0313遺伝子のN末端側コード領域を含むPCR産物を得た。一方、C. glutamicum 2256株のゲノムDNAを鋳型として、配列番号65および66の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、NCgl0313遺伝子のC末端側コード領域を含むPCR産物を得た。配列番号64および65は一部が相補的な配列となっている。次に、NCgl0313遺伝子のN末端側コード領域を含むPCR産物およびNCgl0313遺伝子のC末端側コード領域を含むPCR産物をそれぞれほぼ等モルとなるように混合し、In Fusion HD cloning kit(Clontech)を用いて、BamHIとPstIで処理をしたpBS4Sベクター(WO2007/046389)に挿入した。このDNAを用いてEscherichia coli JM109のコンピテントセル(タカラバイオ)を形質転換し、IPTG 100μM、X-Gal 40μg/mL、およびカナマイシン40μg/mLを含有するLB培地に塗布し、一晩培養した。その後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得た。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、目的のPCR産物が挿入されていたものをpBS4SΔ2256adhEと命名した。
上記で得られたpBS4SΔ2256adhEはコリネ型細菌の細胞内で自律複製可能とする領域を含まないため、本プラスミドでコリネ型細菌を形質転換した場合、極めて低頻度であるが本プラスミドが相同組換えによりゲノムに組み込まれた株が形質転換体として出現する。そこで、pBS4SΔ2256adhEを電気パルス法にてC. glutamicum FKFC5株に導入した。菌体を、カナマイシン25μg/mLを含有するCM-Dex寒天培地に塗布し、31.5℃にて培養した。生育してきた株について、相同組換えによってゲノム上にpBS4SΔ2256adhEが組み込まれた1回組換え株であることをPCRで確認した。該1回組換え株は、野生型のNCgl0313遺伝子と欠損型のNCgl0313遺伝子の両方を有する。
<2−3−1>NCgl2709遺伝子欠損用プラスミドpBS4SΔ2256adhAの構築
C. glutamicum 2256株のゲノムDNAを鋳型として、配列番号69および70の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、NCgl2709遺伝子のN末端側コード領域を含むPCR産物を得た。一方、C. glutamicum 2256株のゲノムDNAを鋳型として、配列番号71および72の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、NCgl2709遺伝子のC末端側コード領域を含むPCR産物を得た。配列番号70および71は一部が相補的な配列となっている。次に、NCgl2709遺伝子のN末端側コード領域を含むPCR産物およびNCgl2709遺伝子のC末端側コード領域を含むPCR産物をそれぞれほぼ等モルとなるように混合し、In Fusion HD cloning kit(Clontech)を用いて、BamHIとPstIで処理をしたpBS4Sベクターに挿入した。このDNAを用いてEscherichia coli JM109のコンピテントセル(タカラバイオ)を形質転換し、IPTG 100μM、X-Gal 40μg/mL、およびカナマイシン40μg/mLを含有するLB培地に塗布し、一晩培養した。その後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得た。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、目的のPCR産物が挿入されていたものをpBS4SΔ2256adhAと命名した。
上記で得られたpBS4SΔ2256adhAはコリネ型細菌の細胞内で自律複製可能とする領域を含まないため、本プラスミドでコリネ型細菌を形質転換した場合、極めて低頻度であるが本プラスミドが相同組換えによりゲノムに組み込まれた株が形質転換体として出現する。そこで、pBS4SΔ2256adhAを電気パルス法にてC. glutamicum FKFC11株に導入した。菌体を、カナマイシン25μg/mLを含有するCM-Dex寒天培地に塗布し、31.5℃にて培養した。生育してきた株について、相同組換えによってゲノム上にpBS4SΔ2256adhAが組み込まれた1回組換え株であることをPCRで確認した。該1回組換え株は、野生型のNCgl2709遺伝子と欠損型のNCgl2709遺伝子の両方を有する。
次いで、Corynebacterium glutamicum FKFC14株を親株として、プロトカテク酸ジオキシゲナーゼαサブユニットおよびβサブユニットをコードするNCgl2314遺伝子(pcaG)およびNCgl2315遺伝子(pcaH)を欠損したFKFC14ΔpcaGH株を外注により構築した。FKFC14ΔpcaGH株は、以下の手順でも構築することができる。
pcaG遺伝子とpcaH遺伝子は隣接しており、まとめて欠損させることが可能である。C. glutamicum 2256株のゲノムDNAを鋳型として、配列番号75および76の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、NCgl2315遺伝子の上流領域を含むPCR産物を得る。一方、C. glutamicum 2256株のゲノムDNAを鋳型として、配列番号77および78の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、NCgl2314遺伝子の下流領域を含むPCR産物を得る。配列番号76および77は一部が相補的な配列となっている。次に、NCgl2315遺伝子の上流領域を含むPCR産物およびNCgl2314遺伝子の下流領域を含むPCR産物をそれぞれほぼ等モルとなるように混合し、In Fusion HD cloning kit(Clontech)を用いて、BamHIとPstIで処理をしたpBS4Sベクター(WO2007/046389)に挿入する。このDNAを用いてEscherichia coli JM109のコンピテントセル(タカラバイオ)を形質転換し、IPTG 100μM、X-Gal 40μg/mL、およびカナマイシン40μg/mLを含有するLB培地に塗布し、一晩培養する。その後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得る。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、目的のPCR産物が挿入されていたものをpBS4SΔ2256pcaGHと命名する
。
上記で得られたpBS4SΔ2256pcaGHはコリネ型細菌の細胞内で自律複製可能とする領域を含まないため、本プラスミドでコリネ型細菌を形質転換した場合、極めて低頻度であるが本プラスミドが相同組換えによりゲノムに組み込まれた株が形質転換体として出現する。そこで、pBS4SΔ2256pcaGHを電気パルス法にてC. glutamicum FKFC14株に導入する。菌体を、カナマイシン25μg/mLを含有するCM-Dex寒天培地に塗布し、31.5℃にて培養する。生育してきた株について、相同組換えによってゲノム上にpBS4SΔ2256pcaGHが組み込まれた1回組換え株であることをPCRで確認する。該1回組換え株は、野生型のNCgl2314およびNCgl2315遺伝子と、欠損型のNCgl2314およびNCgl2315遺伝子の両方を有する。
次いで、Corynebacterium glutamicum FKFC14ΔpcaGH株を親株として、Crpファミリーの発現制御タンパク質をコードするNCgl0120遺伝子(cysR)のプロモーター領域がP2プロモーターに置換され、以て該遺伝子の発現が増強されたAp1_0007株を外注により構築した。同株におけるP2プロモーターを含むゲノム領域の塩基配列を配列番号108(942-1034位がP2プロモーターに相当)に示す。Ap1_0007株は、以下の手順でも構築することができる。
C. glutamicum 2256株のゲノムDNAを鋳型として、配列番号81および82の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、NCgl0120遺伝子の上流領域を含むPCR産物を得る。一方、C.
glutamicum 2256株のゲノムDNAを鋳型として、配列番号83および84の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、NCgl0120遺伝子のN末端側コード領域を含むPCR産物を得る。また、P2プロモーター領域を含む配列番号85のDNA断片を人工遺伝子合成によって得る。次に、配列番号85のDNA断片を鋳型として、配列番号86および87の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、P2プロモーターを含むPCR産物を得る。配列番号82および86は一部が相補的な配列となっている。配列番号83および87は一部が相補的な配列となっている。次に、NCgl0120遺伝子の上流領域を含むPCR産物、NCgl0120遺伝子のN末端側コード領域を含むPCR産物、およびP2プロモーターを含むPCR産物をそれぞれほぼ等モルとなるように混合し、In Fusion HD cloning kit(Clontech)を用いて、BamHIとPstIで処理をしたpBS4Sベクター(WO2007/046389)に挿入する。このDNAを用いてEscherichia coli JM109のコンピテントセル(タカラバイオ)を形質転換し、IPTG 100μM、X-Gal 40μg/mL、およびカナマイシン40μg/mLを含有するLB培地に塗布し、一晩培養する。その後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得る。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、目的のPCR産物が挿入されていたものをpBS4SP2::NCgl0120と命名する。
上記で得られたpBS4SP2::NCgl0120はコリネ型細菌の細胞内で自律複製可能とする領域を含まないため、本プラスミドでコリネ型細菌を形質転換した場合、極めて低頻度であるが本プラスミドが相同組換えによりゲノムに組み込まれた株が形質転換体として出現する
。そこで、pBS4SP2::NCgl0120を電気パルス法にてC. glutamicum FKFC14ΔpcaGH株に導入する。菌体を、カナマイシン25μg/mLを含有するCM-Dex寒天培地に塗布し、31.5℃にて培養する。生育してきた株について、相同組換えによってゲノム上にpBS4SP2::NCgl0120が組み込まれた1回組換え株であることをPCRで確認する。
次いで、Corynebacterium glutamicum Ap1_0007株を親株として、NCgl2048遺伝子のプロモーター領域がP8プロモーターに置換され、以て該遺伝子の発現が弱化されたBp1_0112株を外注により構築した。同株におけるP8プロモーターを含むゲノム領域の塩基配列を配列番号110(901-1046位がP8プロモーターに相当)に示す。Bp1_0112株は、以下の手順でも構築することができる。
C. glutamicum 2256株のゲノムDNAを鋳型として、配列番号112および113の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、NCgl2048遺伝子の上流領域を含むPCR産物を得る。一方、C. glutamicum 2256株のゲノムDNAを鋳型として、配列番号114および115の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、NCgl2048遺伝子のN末端側コード領域を含むPCR産物を得る。また、P8プロモーター領域を含む配列番号116のDNA断片を人工遺伝子合成によって得る。次に、配列番号116のDNA断片を鋳型として、配列番号117および118の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、P8プロモーターを含むPCR産物を得る。配列番号113および117は一部が相補的な配列となっている。配列番号114および118は一部が相補的な配列となっている。次に、NCgl2048遺伝子の上流領域を含むPCR産物、NCgl2048遺伝子のN末端側コード領域を含むPCR産物、およびP8プロモーターを含むPCR産物をそれぞれほぼ等モルとなるように混合し、In Fusion HD cloning kit(Clontech)を用いて、BamHIとPstIで処理をしたpBS4Sベクター(WO2007/046389)に挿入する。このDNAを用いてEscherichia coli JM109のコンピテントセル(タカラバイオ)を形質転換し、IPTG
100μM、X-Gal 40μg/mL、およびカナマイシン40μg/mLを含有するLB培地に塗布し、一晩培養する。その後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得る。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、目的のPCR産物が挿入されていたものをpBS4SP8::NCgl2048と命名する。
上記で得られたpBS4SP8::NCgl2048はコリネ型細菌の細胞内で自律複製可能とする領域を含まないため、本プラスミドでコリネ型細菌を形質転換した場合、極めて低頻度であるが本プラスミドが相同組換えによりゲノムに組み込まれた株が形質転換体として出現する。そこで、pBS4SP8::NCgl2048を電気パルス法にてC. glutamicum Ap1_0007株に導入する。菌体を、カナマイシン25μg/mLを含有するCM-Dex寒天培地に塗布し、31.5℃にて培養する。生育してきた株について、相同組換えによってゲノム上にpBS4SP8::NCgl2048が組み込まれた1回組換え株であることをPCRで確認する。
次いで、Corynebacterium glutamicum Bp1_0112株を親株として、エノラーゼをコードするNCgl0935遺伝子(eno)のプロモーター領域がP4プロモーターに置換され、以て該遺伝子の発現が弱化されたDp2_0340株を外注により構築した。同株におけるP4プロモーターを含むゲノム領域の塩基配列を配列番号109(872-969位がP4プロモーターに相当)に示す。Dp2_0340株は、以下の手順でも構築することができる。
C. glutamicum 2256株のゲノムDNAを鋳型として、配列番号121および122の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、NCgl0935遺伝子の上流領域を含むPCR産物を得る。一方、C. glutamicum 2256株のゲノムDNAを鋳型として、配列番号123および124の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、NCgl0935遺伝子のN末端側コード領域を含むPCR産物を得る。また、P4プロモーターを含む配列番号125のDNA断片を人工遺伝子合成によって得る。次に、配列番号125のDNA断片を鋳型として、配列番号126および127の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、P4プロモーターを含むPCR産物を得る。配列番号122および126は一部が相補的な配列となっている。配列番号123および127は一部が相補的な配列となっている。次に、NCgl0935遺伝子の上流領域を含むPCR産物、NCgl0935遺伝子のN末端側コード領域を含むPCR産物、およびP4プロモーターを含むPCR産物をそれぞれほぼ等モルとなるように混合し、In Fusion HD cloning kit(Clontech)を用いて、BamHIとPstIで処理をしたpBS4Sベクター(WO2007/046389)に挿入する。このDNAを用いてEscherichia coli JM109のコンピテントセル(タカラバイオ)を形質転換し、IPTG 100μM、X-Gal 40μg/mL、およびカナマイシン40μg/mLを含有するLB培地に塗布し、一晩培養する。その後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得る。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、目的のPCR産物が挿入されていたものをpBS4SP4::NCgl0935と命名する。
上記で得られたpBS4SP4::NCgl0935はコリネ型細菌の細胞内で自律複製可能とする領域を含まないため、本プラスミドでコリネ型細菌を形質転換した場合、極めて低頻度であるが本プラスミドが相同組換えによりゲノムに組み込まれた株が形質転換体として出現する。そこで、pBS4SP4::NCgl0935を電気パルス法にてC. glutamicum Bp1_0112株に導入する。菌体を、カナマイシン25μg/mLを含有するCM-Dex寒天培地に塗布し、31.5℃にて培養する。生育してきた株について、相同組換えによってゲノム上にpBS4SP4::NCgl0935が組み込まれた1回組換え株であることをPCRで確認する。
プラスミドpVK9::PcspB-omt35を外注により得た。プラスミドpVK9::PcspB-omt35は、C.
glutamicumのコドン使用にコドン最適化されたNiastella koreensisのOMT遺伝子を保有する。この遺伝子を「omt35遺伝子」、この遺伝子にコードされるOMTを「OMT35」ともいう。omt35遺伝子の塩基配列を配列番号135に、OMT35のアミノ酸配列を配列番号131に示す。プラスミドpVK9::PcspB-omt35は、以下の手順でも構築することができる。
を得る。一方、omt35遺伝子を含む配列番号134のDNA断片を人工遺伝子合成によって得る。次に、このPCR産物およびこのDNA断片をIn Fusion HD cloning kit(Clontech)を用いて、BamHIとPstIで処理をしたpVK9ベクター(WO2007/046389)に挿入する。このDNAを用いてEscherichia coli JM109のコンピテントセル(タカラバイオ)を形質転換し、IPTG
100μM、X-Gal 40μg/mL、およびカナマイシン25μg/mLを含有するLB培地に塗布し、一晩培養する。その後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得る。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、目的の構造が挿入されていたものをpVK9::PcspB-omt35と命名する。
プラスミドpVK9::PcspB-omt35を有するC. glutamicum Bp1_0112/pVK9::PcspB-omt35株およびDp2_0340/pVK9::PcspB-omt35株を外注により構築した。これらの株は、以下の手順でも構築することができる。
Bp1_0112/pVK9::PcspB-omt35株およびDp2_0340/pVK9::PcspB-omt35株のグリセロールストック5μLを、それぞれ、カナマイシン25μg/mLを含有するCM-Dex w/o mameno培地4 mLを含む試験管に接種し、前培養として31.5℃で20時間振とう培養を行った。得られた前培養液0.5 mLを、カナマイシン25μg/mLを含有するCM-Dex w/o mameno培地50 mLを含むバッフル付き三角フラスコに接種し、31.5℃で20時間振とう培養を行った。得られた培養液を8000 rpmで5分間遠心し、上清を除去し、菌体を滅菌生理食塩水に懸濁した。菌体懸濁液の光学密度(OD)を測定し、600 nmでのODが50になるように生理食塩水で菌体懸濁液を希釈した。希釈した菌体懸濁液5 mLを、カナマイシン25μg/mLを含有するバニリン酸生産培地(グルコース 75 g/L、MgSO4・7H2O 0.6 g/L、(NH4)2SO4 6.3 g/L、KH2PO4 2.5 g/L、FeSO4・7H2O 12.5 mg/L、MnSO4・4-5H2O 12.5 mg/L、Yeast Extract 2.5 g/L、Vitamin B1
150μg/L、Biotin 150μg/L、プロトカテク酸 6.9 g/L、KOHでpH7に調整後、CaCO3 37.5
g/L(180℃で3時間乾熱滅菌したもの)と混合)20 mLを含むバッフル付き三角フラスコに接種し、31.5℃で24時間振とう培養を行った。
UPLC分析条件
カラム:KINETEX 2.6μm XB-C18 150 x 30 mm (Phenomenex)
オーブン温度: 40 ℃
移動相(A):0.1% トリフルオロ酢酸
移動相(B):0.1% トリフルオロ酢酸/80% アセトニトリル
グラジエントプログラム (time, A %, B %):(0, 90, 10)→(3, 80, 20)
流速:1.5 mL/min
次いで、Bp1_0112/pVK9::PcspB-omt35株およびDp2_0340/pVK9::PcspB-omt35株におけるNCgl0935遺伝子(eno)の発現量を定量PCRにより解析した。
Bp1_0112/pVK9::PcspB-omt35株およびDp2_0340/pVK9::PcspB-omt35株について実施例<
7>で培養開始から5時間後に取得した250μLの菌体を含む培養液を500μLのRNA Protect
Bacteria Reagent(QIAGEN)と混合し、-80℃に一旦保存した。凍結混合物を室温で融解後、リゾチームを含有する200μLのTE緩衝液(10mM トリス、1mM EDTA、pH8.0)および10μLのプロテアーゼK(20mg/mL)を添加して混合した後、室温で40分間インキュベートした。この後の作業はRNeasy Mini Kit(QIAGEN)を用いて実施した。処理物に1%2−メルカプトエタノールを含有するRLT緩衝液を700μL添加して混合し、遠心して上清を得た。上清に500μLのエタノールを添加して混合し、キット付属のカラムにアプライし、カラムを遠心した。カラムを350μLのRW1緩衝液で洗浄後、80μLのDNaseI溶液をカラムにアプライし、室温で15分間DNase処理を実施した。さらに、カラムを350μLのRW1緩衝液で洗浄し、500μLのRPE緩衝液で2回洗浄した後、RNaseフリーの滅菌水で溶出し、RNAを取た。得られたRNAをNanoDrop(Thermo Fisher Scientific)を用いて定量し、BioAnalyer(Agilent Technologies)とRNA 6000 Nano Kit(Agilent Technologies)を用いた電気泳動により分析し、得られたRNAが十分な純度であることを確認した。
逆転写には、PrimeScript RT Reatent Kit with gDNA Eraser(タカラバイオ)を用いた。RNA 1μgに1μLのgDNA Eraser、2μLの5×DNA Eraser Bufferを添加し、滅菌水で総量10μLにした後、42℃で2分間インキュベートし、染色体DNAを分解した。反応液に4μLの5×PrimeScript Buffer2、1μLのPrimeScript RT Emzyme MixI、1μLのRT Primer Mix、および4μLの滅菌水を加え、37℃で15分および85℃で5秒インキュベートし、cDNAを取た。
目的遺伝子としてNCgl0935遺伝子(eno)を以下の手順によりcDNAから増幅した:2μLのcDNA、10μLのPower SYBR Green PCR Master Mix(Life Technologies)、配列番号136と137のプライマー(それぞれ終濃度500nM)、および滅菌水を混合して総量20μLにした;7000 Real Time PCR(Applied Bio Systems)を用いてPCR(95℃で10分変性後、95℃で15秒および60℃で1分を40サイクル)を実施した。加えて、ハウスキーピング遺伝子として16SリボソーマルRNA遺伝子を、目的遺伝子の増幅と同一の手順(ただし、32倍希釈したcDNA2μLを鋳型とし、配列番号138と139のプライマーを用いた)によりcDNAから増幅した。増幅反応後、PCR産物を乖離曲線分析に供し、均一性を確認した。さらに、PCR産物をアガロース電気泳動により分析し、使用したプライマーで得られる長さであることを確認した。
NCgl0935遺伝子(eno)の発現量の解析には、ΔΔCt法(METHODS, 25, 402(2001))を用いた。NCgl0935遺伝子(eno)のCt値からハウスキーピング遺伝子のCt値を引いた値をΔCt値とした。ただし、ハウスキーピング遺伝子の増幅には32倍希釈(すなわち25倍希釈)したcDNAを用いたため、ハウスキーピング遺伝子のCt値としては、測定したハウスキーピング遺伝子のCt値に5を足した値を用いた。Dp2_0340/pVK9::PcspB-omt35株のΔCt値からBp1_0112/pVK9::PcspB-omt35株のΔCt値を引いた値をΔΔCt値とした。Dp2_0340/pVK9::PcspB-omt35株におけるNCgl0935遺伝子(eno)のBp1_0112/pVK9::PcspB-omt35株に対する相対発現量を、2-ΔΔCtとして算出した。
配列番号1:Escherichia coli MG1655のaroG遺伝子の塩基配列
配列番号2:Escherichia coli MG1655のAroGタンパク質のアミノ酸配列
配列番号3:Escherichia coli MG1655のaroB遺伝子の塩基配列
配列番号4:Escherichia coli MG1655のAroBタンパク質のアミノ酸配列
配列番号5:Escherichia coli MG1655のaroD遺伝子の塩基配列
配列番号6:Escherichia coli MG1655のAroDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号7:Bacillus thuringiensis BMB171のasbF遺伝子の塩基配列
配列番号8:Bacillus thuringiensis BMB171のAsbFタンパク質のアミノ酸配列
配列番号9:Escherichia coli MG1655のtyrR遺伝子の塩基配列
配列番号10:Escherichia coli MG1655のTyrRタンパク質のアミノ酸配列
配列番号11〜14:Homo sapiensのOMT遺伝子の転写バリアント1〜4の塩基配列
配列番号15:Homo sapiensのOMTアイソフォーム(MB-COMT)のアミノ酸配列
配列番号16:Homo sapiensのOMTアイソフォーム(S-COMT)のアミノ酸配列
配列番号17:Nocardia brasiliensisのACAR遺伝子の塩基配列
配列番号18:Nocardia brasiliensisのACARタンパク質のアミノ酸配列
配列番号19:Nocardia brasiliensisのACAR遺伝子の塩基配列
配列番号20:Nocardia brasiliensisのACARタンパク質のアミノ酸配列
配列番号21:Escherichia coli MG1655のentD遺伝子の塩基配列
配列番号22:Escherichia coli MG1655のEntDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号23:Corynebacterium glutamicum ATCC 13032のPPT遺伝子の塩基配列
配列番号24:Corynebacterium glutamicum ATCC 13032のPPTタンパク質のアミノ酸配列配列番号25:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のvanK遺伝子の塩基配列配列番号26:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のVanKタンパク質のアミノ酸配列
配列番号27:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のpcaK遺伝子の塩基配列配列番号28:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のPcaKタンパク質のアミノ酸配列
配列番号29:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のvanA遺伝子の塩基配列配列番号30:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のVanAタンパク質のアミノ酸配列
配列番号31:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のvanB遺伝子の塩基配列配列番号32:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のVanBタンパク質のアミノ酸配列
配列番号33:Corynebacterium glutamicum ATCC 13032のpcaG遺伝子の塩基配列
配列番号34:Corynebacterium glutamicum ATCC 13032のPcaGタンパク質のアミノ酸配列
配列番号35:Corynebacterium glutamicum ATCC 13032のpcaH遺伝子の塩基配列
配列番号36:Corynebacterium glutamicum ATCC 13032のPcaHタンパク質のアミノ酸配列
配列番号37:Escherichia coli MG1655のyqhD遺伝子の塩基配列
配列番号38:Escherichia coli MG1655のYqhDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号39:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のNCgl0324遺伝子の塩基配列
配列番号40:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のNCgl0324タンパク質のアミノ酸配列
配列番号41:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のNCgl0313遺伝子の塩基配列
配列番号42:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のNCgl0313タンパク質のアミノ酸配列
配列番号43:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のNCgl2709遺伝子の塩基配列
配列番号44:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のNCgl2709タンパク質のアミノ酸配列
配列番号45:Corynebacterium glutamicum ATCC 13032のNCgl0219遺伝子の塩基配列
配列番号46:Corynebacterium glutamicum ATCC 13032のNCgl0219タンパク質のアミノ酸配列
配列番号47:Corynebacterium glutamicum ATCC 13032のNCgl2382遺伝子の塩基配列
配列番号48:Corynebacterium glutamicum ATCC 13032のNCgl2382タンパク質のアミノ酸配列
配列番号49:Escherichia coli MG1655のaroE遺伝子の塩基配列
配列番号50:Escherichia coli MG1655のAroEタンパク質のアミノ酸配列
配列番号51〜84:プライマー
配列番号85:P2プロモーター領域を含むDNA断片の塩基配列
配列番号86および87:プライマー
配列番号88:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のcysI遺伝子の塩基配列配列番号89:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のCysIタンパク質のアミノ酸配列
配列番号90:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のcysX遺伝子の塩基配列配列番号91:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のCysXタンパク質のアミノ酸配列
配列番号92:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のcysH遺伝子の塩基配列配列番号93:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のCysHタンパク質のアミノ酸配列
配列番号94:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のcysD遺伝子の塩基配列配列番号95:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のCysDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号96:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のcysN遺伝子の塩基配列配列番号97:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のCysNタンパク質のアミノ酸配列
配列番号98:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のcysY遺伝子の塩基配列配列番号99:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のCysYタンパク質のアミノ酸配列
配列番号100:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のcysZ遺伝子の塩基配列
配列番号101:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のCysZタンパク質のアミノ酸配列
配列番号102:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のfpr2遺伝子の塩基配列
配列番号103:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のFpr2タンパク質のアミノ酸配列
配列番号104:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のcysR遺伝子の塩基配列
配列番号105:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のCysRタンパク質のアミノ酸配列
配列番号106:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のssuR遺伝子の塩基配列
配列番号107:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のSsuRタンパク質のアミノ酸配列
配列番号108:P2プロモーターを含む塩基配列
配列番号109:P4プロモーターを含む塩基配列
配列番号110:P8プロモーターを含む塩基配列
配列番号111:P3プロモーターを含む塩基配列
配列番号112〜115:プライマー
配列番号116:P8プロモーター領域を含むDNA断片の塩基配列
配列番号117および118:プライマー
配列番号119:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のNCgl2048遺伝子の塩基配列
配列番号120:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のNCgl2048タンパク質のアミノ酸配列
配列番号121〜124:プライマー
配列番号125:P4プロモーター領域を含むDNA断片の塩基配列
配列番号126および127:プライマー
配列番号128:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のeno遺伝子の塩基配列
配列番号129:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のEnoタンパク質のアミノ酸配列
配列番号130:Niastella koreensisのOMT遺伝子の塩基配列
配列番号131:Niastella koreensisのOMTのアミノ酸配列
配列番号132および133:プライマー
配列番号134:omt35遺伝子を含むDNA断片の塩基配列
配列番号135:omt35遺伝子(コドン最適化されたNiastella koreensisのOMT遺伝子)の塩基配列
配列番号136〜139:プライマー
Claims (30)
- 目的物質の製造方法であって、
以下の工程:目的物質を生産する能力を有する微生物を利用して目的物質を製造すること
を含み、
前記微生物が、エノラーゼの活性が非改変株と比較して低下するように改変されており、
前記目的物質が、L−メチオニン、生合成にS−アデノシルメチオニンを要求する代謝物、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、方法。 - 前記製造が、炭素源を含有する培地で前記微生物を培養し、前記目的物質を該培地中に生成蓄積させることを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記製造が、前記微生物を利用して前記目的物質の前駆体を該目的物質に変換することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記変換が、前記前駆体を含有する培地で前記微生物を培養し、前記目的物質を該培地中に生成蓄積させることを含む、請求項3に記載の方法。
- 前記変換が、前記微生物の菌体を反応液中の前記前駆体に作用させ、前記目的物質を該反応液中に生成蓄積させることを含む、請求項3に記載の方法。
- 前記菌体が、前記微生物の培養液に含まれる菌体、該培養液から回収された菌体、該培養液の処理物に含まれる菌体、該回収された菌体の処理物に含まれる菌体、またはそれらの組み合わせである、請求項5に記載の方法。
- 前記前駆体が、プロトカテク酸、プロトカテクアルデヒド、L−トリプトファン、L−ヒスチジン、L−フェニルアラニン、L−チロシン、L−アルギニン、L−オルニチン、グリシン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項3〜6のいずれか1項に記載の方法。
- さらに、前記目的物質を回収することを含む、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記エノラーゼが、eno遺伝子にコードされるタンパク質である、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記eno遺伝子が、下記からなる群より選択されるタンパク質をコードする、請求項9に記載の方法:
(a)配列番号129に示すアミノ酸配列を含むタンパク質;
(b)配列番号129に示すアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および/または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、エノラーゼ活性を有するタンパク質;および
(c)配列番号129に示すアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、エノラーゼ活性を有するタンパク質。 - 前記エノラーゼの活性が、エノラーゼをコードする遺伝子の発現を弱化させること、または該遺伝子を破壊することにより低下した、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記エノラーゼをコードする遺伝子の発現が、該遺伝子の発現調節配列を改変することによって弱化した、請求項11に記載の方法。
- 前記微生物が、腸内細菌科(Enterobacteriaceae)に属する細菌、コリネ型細菌、または酵母である、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 前記微生物が、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属細菌である、請求項13に記載の方法。
- 前記微生物が、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)である、請求項14に記載の方法。
- 前記微生物が、エシェリヒア(Escherichia)属細菌である、請求項13に記載の方法。
- 前記微生物が、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)である、請求項16に記載の方法。
- 前記代謝物が、バニリン、バニリン酸、メラトニン、エルゴチオネイン、ムギネ酸、フェルラ酸、ポリアミン、グアイアコール、4−ビニルグアイアコール、4−エチルグアイアコール、およびクレアチンからなる群より選択される、請求項1〜17のいずれか1項に記載の方法。
- 前記微生物が、さらに、前記目的物質の生合成に関与する酵素の活性が非改変株と比較して増大するように改変されている、請求項1〜18のいずれか1項に記載の方法。
- 前記目的物質の生合成に関与する酵素が、3−デオキシ−D−アラビノ−ヘプツロソン酸−7−リン酸シンターゼ、3−デヒドロキナ酸シンターゼ、3−デヒドロキナ酸デヒドラターゼ、3−デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ、O−メチルトランスフェラーゼ、芳香族アルデヒドオキシドレダクターゼ、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項19に記載の方法。
- 前記微生物が、さらに、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼの活性が非改変株と比較して増大するように改変されている、請求項1〜20のいずれか1項に記載の方法。
- 前記微生物が、さらに、前記目的物質以外の物質の副生に関与する酵素の活性が非改変株と比較して低下するように改変されている、請求項1〜21のいずれか1項に記載の方法。
- 前記目的物質以外の物質の副生に関与する酵素が、バニリン酸デメチラーゼ、プロトカテク酸3,4−ジオキシゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、シキミ酸デヒドロゲナーゼ、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項22に記載の方法。
- 前記微生物が、さらに、L−システイン生合成酵素の活性が非改変株と比較して増大するように改変されている、請求項1〜23のいずれか1項に記載の方法。
- 前記L−システイン生合成酵素が、cysI遺伝子、cysX遺伝子、cysH遺伝子、cysD遺伝子、cysN遺伝子、cysY遺伝子、cysZ遺伝子、fpr2遺伝子、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される遺伝子にコードされるタンパク質である、請求項24に記載の方法。
- 前記L−システイン生合成酵素の活性が、cysR遺伝子にコードされるタンパク質の活性を増大させることにより、増大した、請求項24または25に記載の方法。
- 前記微生物が、さらに、NCgl2048遺伝子にコードされるタンパク質の活性が非改変株と比較して低下するように改変されている、請求項1〜26のいずれか1項に記載の方法。
- バニリンの製造方法であって、
請求項1〜27のいずれか1項に記載の方法によりバニリン酸を製造すること;および
前記バニリン酸をバニリンに変換すること
を含む、方法。 - 前記微生物が、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属細菌である、請求項28に記載の方法。
- 前記微生物が、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)である、請求項28に記載の方法。
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