JP2019528456A - 循環腫瘍細胞を同定及び単離するためのリン酸化エーテル類似体 - Google Patents

循環腫瘍細胞を同定及び単離するためのリン酸化エーテル類似体 Download PDF

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Abstract

本発明は、循環腫瘍細胞を同定する、単離する、及びその下流解析を可能とする方法に関し、対象の血液又は血清試料を、発光分子又は磁性ビーズと結合させたリン脂質エーテル類似体を含有する組成物と接触させる工程、及び当該血液又は血清試料をフローサイトメトリー又は磁性単離に供する工程、を含む。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本願は、2016年6月14日に出願されたU.S. Provisional Patent Application No. 62/349,713に基づく優先権を主張し、当該米国出願の全内容が、本願において参照により援用される。
循環腫瘍細胞(CTC)は、癌の検出及び進行において予測的及び予後的重要性を有すると仮説される、血液ベースのマーカーである。特に、CTCは、原発性腫瘍及び転移部位の両方からの最小限に侵襲的な腫瘍細胞源と定式化されている(Alix-Panabieres C, et al., Challenges in circulating tumour cell research, Nat Rev Cancer, 2014 Sep, 14(9), 623-31 and Yap T, et al., Circulating tumor cells: a multifunctional biomarker, Clin Cancer Res, 2014 May 15, 20(10), 2553-68.)。多発性骨髄腫を含む多くの種類の癌が、CTCを生じさせることが知られ、又は予測されている(Paiva B, et al., Detailed characterization of multiple myeloma circulating tumor cells shows unique phenotypic, cytogenetic, functional, and circadian distribution profile, Blood, 2013 Nov 21, 122(22), 3591-3598)。更に、予後的重要性を有すると予測される他の癌細胞型である癌幹細胞(CSC)は、CTCの下位集団と定式化されている(Scatena R et al., Circulating tumour cells and cancer stem cells: a role for proteomics in defining the interrelationships between function, phenotype and differentiation with potential clinical applications, Biochim Biophys Acta, 2013 Apr; 1835(2), 129-143; Faltas B. Cornering metastases: therapeutic targeting of circulating tumor cells and stem cells, Front Oncol, 2012 Jul 3, (2)68)。定義により、CTCは、有核、CD45陰性、上皮細胞接着分子(EpCAM)陽性及び汎サイトケラチン陽性の細胞である。しかしながら、全血からのCTCの同定及び単離は、CTCが非常に希少で、血液7.5mL中に僅か1個(即ち細胞数十億個中1個)しか含まれないため、技術的に困難である。
現在、CTCの許容され認証された唯一の指標は、癌進行の予後的マーカーとしての計数である。CellSearch(登録商標)System(CellSearchは、Johnson & Johnson Corpの登録商標)は、現在、CTCを計数するものとしてFDAに認可された唯一のアッセイである(Ignatiadas M, et al., Circulating tumor cells and circulating tumor DNA for precision medicine: dream or reality?, Ann Oncol, 2014 Dec, 25(12), 2304-13、及びToss A, et al., CTC enumeration and characterization: moving toward personalized medicine, Ann Transl Med, 2014 Nov, 2(11):108, 1-16.)。残念ながら、CellSearch(登録商標)は、転移性乳癌、直腸結腸癌及び前立腺癌においてのみ認可されている(Hayes DF, et al., Circulating tumor cells at each follow-up time point during therapy of metastatic breast cancer patients predict progression-free and overall survival, Clin Cancer Res, 2006 Jul 15, 12(1), 4218-24; Cristofanilli M, et al., Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer, N Engl J Med, 2004 Aug 19, 351(8), 781-91; De Bono JS, et al., Circulating tumor cells predict survival benefit from treatment in metastatic castration-resistant prostate cancer, Clin Cancer Res, 2008 Oct 1, 14(19), 6302-9;及びCohen SJ, et al., Relationship of circulating tumor cells to tumor response, progression-free survival, and overall survival in patients with metastatic colorectal cancer, J Clin Oncol, 2008 Jul 1, 26(19), 3213-21.)。
現在の定義下でCTCを同定する試みは続いている。第一に、EpCAM−陽性の循環上皮細胞により、擬陽性の可能性が有る。第二に、上皮マーカーの発言の減少をもたらす上皮から間葉系への転移を行う腫瘍細胞により、偽陰性が起こり得る(Yu M, et al., Circulating breast tumor cells exhibit dynamic changes in epithelial and mesenchymal composition, Science, 2013 Feb 1, 339(6119), 580-4.)。第三に、全てのCTCがEpCAMを発現するわけではなく、腎臓癌等の幾つかの種類の癌はEpCAMの低い又は多様な発言を示すという知見が増えている(Eichelberg C, et al., Epithelial cell adhesion molecule is an independent prognostic marker in clear cell renal carcinoma, Int J Cancer, 2013 Jun 15, 132(12), 2948-55及びSpizzo G, et al., EpCAM expression in primary tumour tissues and metastases: an immunohistochemical analysis, J Clin Pathol, 2011 May, 64(5):415-20.)。従って、バイアス無しで潜在的に全てのCTCを同定できる広範な腫瘍マーカーを使用する経済的かつ強力なアッセイの臨床的需要が存在する。癌標的化アルキルホスホコリン(APC)類似体は、区範囲の様々な種類の癌からのCTCを同定及び単離する新しい方法を提示する。
本発明は、１つ以上の循環腫瘍細胞を同定する方法に関し、当該方法は：
(i)対象に由来する血液又は血清試料を、発光分子及び磁性ビーズからなる群から選択される物質と結合させたリン脂質エーテル(PLE)類似体を含有する組成物と接触させる工程；
(ii)当該血液又は血清試料を蛍光顕微鏡又はフローサイトメトリーに供する工程；
を含み、当該物質が磁性ビーズである場合、当該物質はリンカーを介してPLEと結合する。
更に、本発明は、１つ以上の循環腫瘍細胞(CTC)を単離する方法に関し、当該方法は：
(i)対象に由来する血液又は血清試料を、発光分子及び磁性ビーズからなる群から選択される物質と結合させたリン脂質エーテル(PLE)類似体を含有する組成物と接触させる工程；
(ii)当該血液又は血清試料をフローサイトメトリー又は磁場に供する工程；
を含み、当該物質が磁性ビーズである場合、当該物質はリンカーを介してPLEと結合し、当該血液又は血清試料は磁場に供され、そして当該物質が発光分子である場合、当該血液又は血清試料はフローサイトメトリーに供される。
一つの態様において、前記１つ以上の循環腫瘍細胞は、癌幹細胞を含む。
好ましい態様において、本発明の物質が結合したPLEは、式(I)〜(IV)：
Figure 2019528456
 からなる群から選択され、ここで：
nは16〜30の整数であり；
Yは-H, -OH, -OR1, -C(O)OH,及び-OC(O)R1からなる群から選択され、ここでR1はアルキルであり；かつ
Xは発光分子又は磁性ビーズである。
好ましい態様において、前記発光分子がフルオロフォアであり、より好ましくは、前記フルオロフォアが、以下：
Figure 2019528456
 からなる群から選択され、ここで各Rは、H, CH3, C2H5及びC3H7から独立して選択され、最も好ましくは、前記フルオロフォアは、以下：
Figure 2019528456
 からなる群から選択される。
他の好ましい態様において、前記磁性ビーズが、ナノ磁性ビーズ、マイクロ磁性ビーズ、常磁性ビーズ、及び超常磁性ビーズからなる群から選択され、当該磁性ビーズが、ビオチン-ストレプトアビジンリンカー、アゼチジノンリンカー、及びアミン-、アジド、アルキン-、カルボキシル-及びヒドロキシル基リンカー並びにそれらの組合せからなる群から選択されるリンカーを介してPLE類似体と結合する。
他の好ましい態様において、本発明の１つ以上の循環腫瘍細胞が、乳癌、肺癌、胸腺癌、子宮頸癌、扁平上皮癌、前立腺癌、膵臓癌及び直腸結腸癌細胞、多発性骨髄腫細胞、及び癌幹細胞からなる群から選択され、好ましくは乳癌、肺癌、胸腺癌、子宮頸癌、扁平上皮癌、前立腺癌、膵臓癌及び直腸結腸癌細胞からなる群から選択され、より好ましくは、前立腺癌又は膵臓癌細胞である。
他の好ましい態様において、本発明の方法は、限定されないが、タンパク質単離、RNA単離、DNA単離、遺伝子転移解析、遺伝子増幅解析及び蛍光in-situハイブリダイゼーションを含む、更なる下流データ取得技術に利用され得る。
図１は、患者108(直腸結腸癌)から単離されたCD45-、CD34-細胞のプロット解析を示す。パネルAは、CD14以外の全てのマーカーで染色した細胞を示す。パネルBは、全てのマーカーで染色した細胞を示す。左上区画はCD14-/CLR1501+細胞、右上区画はCD14+/CLR1501+、右下区画はCD14+/CLR1501-、左下区画はCD14-/CLR1501-を示す。
発明の詳細な説明
PLE類似体は、全ての種類のCTCを同定し、単離し、そして下流解析を可能とする特性を有する。癌細胞は、健康な細胞よりも５〜１０倍多くの脂質ラフトを有する。脂質ラフトは、高濃度のコレステロール及びスフィンゴ脂質を含有し、細胞表面及び細胞内のシグナル分子(例えば増殖因子及びサイトカイン受容体、ホスファチジルイノシトール3-キナーゼ(PI3K)/Akt生存経路)を組織化する膜リン脂質二重層の特定の領域である。脂質ラフトがPLEの侵入の門となることを示唆するデータが有る。癌細胞と非癌細胞におけるこれらの化合物の顕著な選択性は、コレステロールに対するPLEの高い親和性及び癌細胞におけるコレステロールに富む脂質ラフトの存在に起因する。脂質ラフトによる重要な役割は、脂質ラフト構造の破壊がPLEの癌細胞への取込みを抑制するという事実によって裏付けられる。脂質ラフトの形成がブロックされるとPLEの取込みが60%減少することが示されている。
55例以上の異種移植及び自然発生腫瘍モデルにおいて得た予備的結果は、CLR1404が腫瘍において選択的取り込まれ保持が延長することを普遍的に示している(Weichert, JP et al., Alkylphosphocholine analogs for broad-spectrum cancer imaging and therapy, Sci Transl Med, 2014, Jun 11, 6(240ra75))。従来知られていなかったことは、PLE類似体が、CTCが同定及び単離される程度にCTCによって取り込まれ得るかどうかということであった。
本発明は、１つ以上の循環腫瘍細胞を同定する方法に関し、当該方法は：
(i)対象に由来する血液又は血清試料を、発光分子及び磁性ビーズからなる群から選択される物質と結合させたリン脂質エーテル(PLE)類似体を含有する組成物と接触させる工程；
(ii)当該血液又は血清試料を蛍光顕微鏡又はフローサイトメトリーに供する工程；
を含み、当該物質が磁性ビーズである場合、当該物質はリンカーを介してPLEと結合する。
更に、本発明は、１つ以上の循環腫瘍細胞(CTC)を単離する方法に関し、当該方法は：
(i)対象に由来する血液又は血清試料を、発光分子及び磁性ビーズからなる群から選択される物質と結合させたPLE類似体を含有する組成物と接触させる工程；
(ii)当該血液又は血清試料をフローサイトメトリー、好ましくは蛍光活性化細胞ソーティング又は磁場に供する工程；
を含み、当該物質が磁性ビーズである場合、当該物質はリンカーを介してPLEと結合し、当該血液又は血清試料は磁場に供され、そして当該物質が発光分子である場合、当該血液又は血清試料はフローサイトメトリーに供される。
好ましい態様において、本発明の物質が結合したPLEは、式(I)〜(IV)：
Figure 2019528456
 からなる群から選択され、ここで：
nは16〜30の整数、好ましくは18であり；
Yは-H, -OH, -OR1, -C(O)OH,及び-OC(O)R1からなる群から選択され、ここでR1はアルキルであり；かつ
Xは発光分子又は磁性ビーズである。
好ましい態様において、前記発光分子がフルオロフォアであり、より好ましくは、前記フルオロフォアが、以下：
Figure 2019528456
 からなる群から選択され、ここで各Rは、H, CH3, C2H5及びC3H7から独立して選択され、最も好ましくは、前記フルオロフォアは、以下：
Figure 2019528456
 からなる群から選択される。
他の好ましい態様において、前記磁性ビーズが、ナノ磁性ビーズ、マイクロ磁性ビーズ、常磁性ビーズ、及び超常磁性ビーズからなる群から選択され、当該磁性ビーズが、ビオチン-ストレプトアビジンリンカー、アゼチジノンリンカー、及びアミン-、アジド、アルキン-、カルボキシル-及びヒドロキシル基リンカー並びにそれらの組合せからなる群から選択されるリンカーを介してPLE類似体と結合する。
他の好ましい態様において、本発明の１つ以上の循環腫瘍細胞が、乳癌、肺癌、胸腺癌、子宮頸癌、扁平上皮癌、前立腺癌、膵臓癌及び直腸結腸癌細胞、多発性骨髄腫細胞、及び癌幹細胞及び悪性プラズマ細胞からなる群から選択され、好ましくは、前立腺癌又は膵臓癌細胞である。他の好ましい態様において、本発明の方法は、限定されないが、タンパク質単離、RNA単離、DNA単離、遺伝子転移及び／又は増幅解析及び蛍光in-situハイブリダイゼーションを含む、更なる下流データ取得技術に利用され得る。
定義
一般に、「循環腫瘍細胞」は、単一の細胞を示すことを意図するが、「複数の循環腫瘍細胞」又は「循環腫瘍細胞の群」は、２つ以上の癌細胞を示すことを意図する。しかしながら、当業者は、「複数の循環腫瘍細胞」が１つ以上の循環腫瘍細胞を含む循環腫瘍細胞の集団を含むことを意図し、一方「循環腫瘍細胞」が、２つ以上循環腫瘍細胞を含み得ることを理解し得る。
「循環腫瘍細胞」又は「複数の循環腫瘍細胞」は、本明細書中、対象の血液又は血清試料中に見られる何らかの癌細胞又は癌細胞の群を示す。また、CTCは、対象の血液又は血清試料中に見られる癌幹細胞又は癌幹細胞の群を含み又はこれからなり得る。
本明細書中、「癌幹細胞」は、悪性腫瘍中に見られる、自己複製し様々な種類の癌細胞に分化し得る癌細胞を示す。
本明細書中、「癌」は、限定されないが、乳癌、例えば男性の乳癌；消化器／胃腸癌、例えば肛門癌、虫垂癌、肝外胆管癌、消化管カルチノイド腫瘍、結腸癌、食道癌、胆嚢癌、胃癌、胃腸間質腫瘍(gist)、島細胞腫、成人原発性肝癌、小児肝癌、膵臓癌、直腸癌、小腸癌及び胃癌；内分泌及び神経内分泌癌、例えば膵臓腺癌、副腎皮質癌、膵臓神経内分泌腫瘍、メルケル細胞癌、非小細胞肺神経内分泌腫瘍、小細胞肺神経内分泌腫瘍、副甲状腺癌、褐色細胞腫、下垂体部腫瘍及び甲状腺癌；眼球癌、例えば眼内黒色腫及び網膜芽腫；泌尿生殖器癌、例えば膀胱癌、腎臓(腎細胞)癌、陰茎癌、前立腺癌、移行細胞腎盂及び尿管癌、睾丸癌、尿道癌及びウィルムス腫瘍；胚細胞癌、例えば小児中枢神経系癌、小児頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、卵巣胚細胞腫瘍；婦人科癌、例えば子宮頸癌、子宮内膜癌、妊娠性絨毛腫瘍、上皮性卵巣癌、卵巣胚細胞腫瘍、子宮肉腫、膣癌及び外陰癌；頭部及び頸部癌、例えば下咽頭癌、喉頭癌、唇及び口腔癌、原発不明の転移性頸部扁平上皮癌、口腔癌、鼻咽腔癌、口腔咽頭癌、副鼻腔及び鼻腔癌、副甲状腺癌、咽頭癌、唾液腺癌及び咽喉癌；白血病、例えば成人急性リンパ性白血病、小児性急性リンパ性白血病、成人急性骨髄性白血病、小児性急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病及び有毛細胞白血病；多発性骨髄腫、例えば悪性プラズマ細胞；リンパ腫、例えばAIDS-関連リンパ腫、皮膚t-細胞リンパ腫、成人ホジキンリンパ腫、小児性ホジキンリンパ腫、妊娠中のホジキンリンパ腫、菌状息肉腫、成人非ホジキンリンパ腫、小児性非ホジキンリンパ腫、妊娠中の非ホジキンリンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、セザリー症候群及びヴァルデンストレームマクログロブリン血症；筋骨格癌、例えばユーイング肉腫、骨肉腫及び骨の悪性線維性組織球腫、小児性横紋筋肉腫及び軟組織肉腫；神経癌、例えば成人脳腫瘍、小児性脳腫瘍、星細胞腫、脳幹グリオーマ、中枢神経系非定型奇形／横紋筋様腫瘍、中枢神経系胚芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、神経芽腫、原発性中枢神経系(CNS)リンパ腫；呼吸器／胸部癌、例えば非小細胞肺癌、小細胞肺癌、悪性中皮腫、胸腺腫及び胸腺癌；並びに皮膚癌、例えばカポジ肉腫、黒色腫及び扁平細胞癌を示す。
本明細書中、「試料」は、本発明により提供される方法に適した任意の試料を示す。試料は、検出に適した循環腫瘍細胞を含有する任意の試料であり得る。試料の供給源は、全血、骨髄、胸膜液、腹水、中心脊髄液、尿、唾液及び気管支洗浄液を含む。一つの側面において、試料は血液であり、例えば全血又はその任意の画分若しくは成分である。本発明での使用に適した血液試料は、血液細胞又はその成分を含有することが知られる、例えば動脈、静脈、抹消組織、臍帯等の任意の供給源から抽出したものであり得る。例えば、試料は、周知かつ慣用の臨床的方法(例えば全血を吸引及び処理する手順)を用いて取得及び処理される。一つの態様において、例示的方法は、癌患者からの末梢血の吸引であり得る。
本明細書中、「同定する」又は「同定」は、CTCの存在を可視化することを示す。
本明細書中、「単離する」又は「単離」は、対象の試料中に見られる他の細胞種からCTCを物理的に分離することを示す。
本明細書中、「接触する」又は「接触」は、本発明のPLE類似体と、対象、組織、器官又は細胞を接触させることを示す。本明細書中、接触は、ex vivo又はin vitro、即ち試験管中で、生きた生物、例えば人間の細胞又は組織において行われ得る。「患者」又は「対象」は本明細書中で同等に用いられ、哺乳類、好ましくは人間を示す。
本明細書中、「アルキル」は、他の言及が無い限り、１〜２４個の炭素原子(C1-C24)の飽和炭化水素基からなる分岐又は直鎖アルキルを示す。
本明細書中、「アミン」は、孤立電子対を有する窒素原子を含有する官能基を示す。
本明細書中、「アジド」は、３つの連続的な窒素原子を有する官能基を示す。
本明細書中、「アルキン」は、互いに三重結合している２つの炭素原子を有する官能基を示す。
本明細書中、「カルボキシル」は、C(O)O構造を有する官能基を示す。
本明細書中、「ヒドロキシル」は、OHを有する官能基を示す。
本明細書中、「n」は、１６〜３０の整数である。
本明細書中、「Y」は、-H, -OH, -OR, -C(O)OH, 及び-OC(O)Rからなる群から選択される。
本明細書中、「R」はアルキルである。
本明細書中、「R」は、H, CH3, C2H5及びC3H7である。
本明細書中、「X」は、蛍光分子又はリンカーに結合した磁性ビーズである。
本発明に有用なフローサイトメトリーは、限定されないが、蛍光活性化細胞ソーティング(FACS)及びマルチカラーフローサイトメトリーである。
本発明に有用な磁性ビーズは、限定されないが、ナノ磁性ビーズ、ナノメートル範囲のサイズを有し、磁性ナノ粒子とも表記される、例えば50nm MACS(登録商標)ビーズ(MACSはMiltenyi Biotec GmbHの登録商標であり、同社から入手出来る)、マイクロ磁性ビーズ、マイクロメートル範囲のサイズを有し、例えば1〜3μM Dynabeads(登録商標)(DynabeadsはInvitrogen Dynal AS Corpの登録商標であり、同社から入手出来る)、常磁性ビーズ及び超常磁性ビーズを含む。
本発明に有用な発光分子はフルオロフォアを含む。
フルオロフォアは、限定されないが、Alexa Fluor(登録商標)(Alex FluorはMolecular Probes, Inc.の登録商標であり、同社から入手出来る) 350, 405, 430, 488, 532, 546, 555, 568, 594, 610, 633, 635, 647, 660, 680, 700, 750及び790、Brilliant VioletTM (Brilliant VioletはBioLegend(登録商標)から入手出来る) 420, 510, 605, 650, 711及び786、Brilliant Ultra-VioletTM (Brilliant Ultra-VioletはBD Biosciences, Inc.) 395及び737 nm、Dylight(登録商標)(DylightはPierce Biotechnology, Inc.の登録商標であり、同社から入手出来る)350, 405, 488, 550, 594, 633, 650, 680, 755及び800、Violetfluor(登録商標)450及びRedfluor(登録商標)710(Violetfluor及びRedfluorはTonbo Biotechnologies Corporationの登録商標であり、同社から入手出来る)、アロフィコシアニン(APC)、APC Alexa Fluor(登録商標)750、APC-Cy7、ペリジニン-クロロフィルタンパク質(PerCP)、PerCP-Cy5、PerCP-Cy5.5、PerCP-Cy7、プロビジウムヨーダイド(PI)、フィコエリトリン(PE)、PE-Cy5、PE-Cy5.5、PE-Cy7、PE-Texas Red(登録商標)(Texas RedはMolecular Probes, Inc.の登録商標)、フルオレセイン(FITC)、アミノメチルクマリン(AMCA)、Marina Blue(登録商標)及びCscade Blue(登録商標)(Marina Blue及びCascade BlueはMolecular Probes, Inc.の登録商標であり、同社から入手出来る)、Cascade Yellow, Pacific Blue, Qdot(登録商標)605 (QdotはLife Technologies Corpの登録商標)、テトラメチルローダミン(TRlTC)、Cy3、Cy5、Cy5.5、Texas Red(登録商標)、及び以下：
Figure 2019528456
 (式中、RはH, CH3, C2H5及びC3H7から独立して選択される)の化合物を含む。
本発明に有用なリンカーは、限定されないが、結合、ビオチン-ストレプトアビジンリンカー、アゼチジノンリンカー、及びアミン-、アジド、アルキン-、カルボキシル-、ヒドロキシル基リンカー並びにそれらの組合せを含む。
以下の好ましい態様は例示のみを目的として提供され、如何なる場合の本発明を限定することを意味しない。
好ましい態様において、本発明は、循環前立腺癌細胞を同定する方法に関し、当該方法は：
(i)対象に由来する血液又は血清試料を、式(V)
Figure 2019528456
 又は式(VI)
Figure 2019528456
 の化合物を含有する組成物と接触させる工程；及び
(ii)当該血液又は血清試料を蛍光顕微鏡又はフローサイトメトリーに供する工程；
を含む。
好ましい態様において、本発明は、循環前立腺癌細胞を同定する方法に関し、当該方法は：
(i)対象に由来する血液又は血清試料を、式(V)
Figure 2019528456
 又は式(VI)
Figure 2019528456
 の化合物と接触させる工程；及び
(ii)当該血液又は血清試料を蛍光活性化細胞ソーティングに供する工程；
を含む。
以下の実施例は例示のみを目的として提供され、如何なる場合も本発明を限定することを意図しない。
実施例１−PLE-磁性ビーズコンジュゲートの合成
まず、本明細書中に記載されるような式I〜IVのPLE及び磁性ビーズの両方をそれぞれそれ自体の官能基と結合させる。官能基は、クリック化学によって結合される。一例として、本発明の式IのPLEはアジド官能基と結合され得、磁性ビーズはアルキン官能基と結合され得る。そしてアザイド及びアルキン官能基はCopper-Catalzyed Azide-Alkyne Cycloaddition(CuAAC)等のクリック化学によって結合され得る。一般に、官能基が結合した磁性ビーズは、「官能化磁性ビーズ」として知られ、Nanocs, Inc.等の複数の供給源から入手出来る。
CLR1401アジドの合成
Figure 2019528456
 反応容器中の脱気したエタノール(28ml)及び水(12ml)の混合物中に、18-(p-ヨードフェニル)オクタデシルホスホコリン(4.01 g, 6.3 mmol)、アジ化ナトリウム(818 mg, 12.6 mmol)及びアスコルビン酸ナトリウム(140 mg, 0.71 mmol)を溶解した。この反応混合物に、ヨウ化銅(I) (120 mg, 0.63 mmol)及びN,N’-ジメチル-エチレンジアミン(0.1 ml, 0.94 mmol)を添加した。反応容器を密封し、混合物を80℃で45分間撹拌した。反応混合物を室温に冷却し、水(60ml)を添加し、この混合物を大気中で30分間撹拌した。この混合物を分液漏斗に移し、クロロホルム(80ml)及びメタノール(52ml)を添加し、撹拌によって抽出を実施した。クロロホルム層を抜き取り、抽出を繰り返した(クロロホルム80ml×2)。クロロホルム抽出物を纏め、0.01NのHClで洗浄し、Na2SO4で脱水し、濾過及び蒸発乾燥させた。残留物をクロロホルム(4ml)に溶解し、アセトン(170ml)を撹拌しながらゆっくり添加した。混合物を30分間撹拌し、濾過した。産物をフィルター上でアセトンで濯ぎ、高度な真空下で乾燥させて、3.31g(95％)のアジドフェニル）18-(p-オクタデシルホスホコリンを得た。
PLE-アジドとアルキン官能化磁性ビーズとの結合
Figure 2019528456
 CLR1401を、クリック化学によって、アルキン官能化磁性ビーズと結合させる。上記はCuAACの一例である。CuAACは、Himo F, et al., Copper(I)-catalyzed synthesis of azoles. DFT study predicts unprecedented reactivity and intermediates, J Am Chem Soc, 2005 Jan 12, 127(1), 210-216に記載されており、この文献は、全て参照により援用される。要するに、アルキン官能化磁性ビーズ及びCLR1401アジドを、酸化銅(Cu(I))触媒の存在下、1：1の水及びtert-ブチルアルコール中で、6〜12時間混合する。任意でこの混合物にアスコルビン酸ナトリウムが添加される。最終的にPLE-磁性ビーズは、単純な濾過又は抽出手段を用いて溶液から単離され得る。
PLE-アセチレンとアジド官能化磁性ビーズとの結合
Figure 2019528456
 CLR1401−アセチレンを、クリック化学によって、アジド官能化磁性ビーズと結合させる。上記のCLR1401アジドとアルキン官能化磁性ビーズとの結合に用いたのと同じCuAAC反応が使用され得る。
カルボキシ-PLEとアミン官能化磁性ナノ粒子との結合
Figure 2019528456
 カルボキシCLR1401を、クリック化学によって、アミン官能化磁性ナノ粒子と結合させる。アミド結合は、アミド結合の形成に適した任意のカップリング試薬を用いて達成され得、そのような試薬は、例えばペプチド合成に用いられる試薬であり、限定されないが、(2-(1H-ベンゾトリアゾル-1-yl)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート)(HBTU)、(1-[Bis(ジメチルアミノ)メチレン]-1H-1,2,3-トリアゾロ[4,5-b]ピリジニウム3-オキシドヘキサフルオロホスファート)(HATU)、COMU(登録商標)(COMUはSigma Aldrich Co, LLCから入手可能であり、Luxembourg Biotechnologies Ltd.の登録商標である)及びプロパンホスホン酸無水物(PPAA又はT3P(登録商標)、T3PはEuticals SPAから入手可能で同社の登録商標である)等である。
PLEカルボキシ-AZDとアミン官能化磁性ナノ粒子との結合
Figure 2019528456
 上記アミド結合に代えて、アミン官能化磁性ナノ粒子が、アゼチジノン(AZD)リンカーを通じてカルボキシ-PLEと結合し得る。一例として、CLR1401カルボキシ-AZDは、AZDリンカーを介してアミン官能化磁性ナノ粒子と結合し得る。AZDリンカーはRoberts LR et al., Kappa agonist CovX-Bodies, Bioorg Med Chem Lett, 2012 Jun 15, 22(12), 4173-4178及びSato S et al., Chemically Programmed Antibodies AS HIV-1 Attachment Inhibitors, ACS Med Chem Lett, 2013 May 9, 4(5), 460-465に記載されている。
実施例２−蛍光PLE類似体を用いた、肺癌、胸腺癌、乳癌、子宮頸癌、扁平上皮細胞癌及び直腸結腸癌患者の循環腫瘍細胞の同定及び計数
方法
治療の前(ドロー１)及び可能な場合後(ドロー２)に、7名の肺癌(患者101及び103)、胸腺癌(患者102)、乳癌(患者106)、子宮頸癌(患者104)、扁平上皮細胞癌(患者107)及び直腸結腸癌(患者108)の患者の全血を、Cell Save(登録商標)回収チューブ又はエチレンジアミン四酢酸(EDTA)回収チューブ中に回収した。Ficoll-Paque密度勾配を用いて全血から単核細胞を単離した。各患者からの細胞をFcブロッカーと共にインキュベーションした。そして細胞を、蛍光標識したCD45, CD14, CD34, EpCAM,及び汎サイトケラチン(CK)に対する抗体、並びに蛍光PLE類似体(CLR1501)で30分間染色した。そして細胞をフローサイトメトリーで解析して、特定のマーカーが陽性及び／又は陰性であった各全血試料中の細胞の数を同定した。現在の定義において、CTCはCD45-, CD14-, CD34-, CK+,及びEpCAM+であった生きた細胞として同定された(定義による)。CD14＋単核球／マクロファージを用いた過去の経験(図１)から、CLR1501の高度に取り込むCD14+細胞は解析から除かれた。CD34+正常上皮細胞も、解析から除かれた。これに対し、同じ患者の残りのCD45+及びCD34+細胞は、CLR1501を顕著に取り込まない。この解析の結果は下記に説明され、表１及び２に纏められる。
表１及び２の１行目は、各患者の血液中の、CDCの定義：CD45-, CD14-, CD34-, CK+,及びEpCAM+を満たし核を有する細胞の数を示す。２行目は、各患者の血液中の、CD45-, CD14-, CD34-, CK+であり核を有する細胞の数を示す。３行目は、各患者の血液中の、CLR 1501+, CD45-, CD14-, CD34-, CK+であり核を有する細胞の数を示す。
４行目は、各患者の血液中の、CD45-, CD14-, CD34-,及びEpCAM+であり核を有する細胞の数を示す。
５行目は、各患者の血液中の、CLR 1501+, CD45-, CD14-, CD34-,及びEpCAM+であり核を有する細胞の数を示す。
６行目は、各患者の血液中の、CLR 1501+, CD45-, CD14-, CD34-, CK-,及びEpCAM-であり核を有する細胞の数を示す。
表１．Cell Save(登録商標)回収チューブ中に回収した様々な癌種を有する患者の血液試料中の循環腫瘍細胞の同定及び計数
Figure 2019528456
 表２．EDTA回収チューブ中に回収した様々な癌種を有する患者の血液試料中の循環腫瘍細胞の同定及び計数
Figure 2019528456
結果
7名の患者全てが、CLR1501の取込みが陽性である検出可能なCTC(定義による)を含有していた(表１及び２の１行目と３、５及び６行目を比較する)。患者8の血液試料のCD14+細胞におけるCLR1501の高度の取込みを示す代表的なフローサイトメトリー画像を図１に示す。図１において、左上区画はCD14-/CLR1501+細胞、右上区画はCD14+/CLR1501+、右下区画はCD14+/CLR1501-、左下区画はCD14-/CLR1501-を示す。パネルAにおいて、患者108の血液から単離されたCD45及びCD34が陰性である(即ち循環腫瘍細胞の可能性がある)細胞は、Brilliant Violet 785(商標)CD14を除き全てのマーカーで染色されたことを示す。CD14標識が陽性の細胞はX軸上に、CLR1501が陽性の細胞はY軸上に示される。パネルAは、Brilliant Violet 785(商標)CD14陽性細胞におけるゲートを設定する対照として使用された。パネルBにおいて、患者108の血液から単離されたCD45及びCD34陰性細胞は、Brilliant Violet 785(商標)CD14を含む全てのマーカーで染色されたことを示す。示されるように、CD14+が陽性の細胞の99.7%が、CLR1501も陽性である。図１のパネルBとパネルAを比較されたい。
更に、CLR1501は、いずれの血液回収チューブが用いられたかに拘らず、全ての癌種において、~99-100%のCK+細胞(表１又は２の２行と３行を比較)及び~35-100%のEpCAM+(表１又は２の４行又は５行を比較)を同定出来た。驚くべきことに、CLR 1501+であるがCK-, EpCAM-, CD45-, CD14-, CD34-であり核を有する(表１及び２の６行)多くの細胞が存在した。表１及び２の６行目に示す細胞は血液細胞種ではないが、EpCAM及びCKの発現が低く又は発現しない他の腫瘍細胞であり得る。多くの癌が他の腫瘍マーカーを発現し、EpCAM及び／又はCKの不均一な発現を有し、又は上皮−間質移行(EMT)を行うことにより上皮マーカーの発現を喪失することが報告されている(Yu 2013, Eichelberg 2013及びSpizzo 2011)。従って、CLR1501は、現在の単一又は複合マーカーアッセイにおいて検出されない循環腫瘍細胞を同定出来る。
患者101、102、104及び108は、治療前後に採取された血液を有していた(ドロー１及び２)。患者101は治療に対し非常に良好な部分的応答を有していたが；ドロー１及び２から、この患者の定義によるCTCのカウントは0から10に増大し、これは癌の進行を示唆する(表1)。もしCKだけが腫瘍細胞のマーカーとして用いられていたら、患者101の腫瘍細胞カウントは、470万から10に減少していた(表１のドロー１と２の比較)。もしEpCAMだけが腫瘍細胞のマーカーとして用いられていたら、患者101の腫瘍細胞カウントは、20から41に増大していた(表１のドロー１と２の比較)。しかしながら、患者101の全腫瘍細胞カウント(CK+かつEpCAM+の数)はドロー１からドロー２で減少しており、これは、別のマーカーが臨床的応答のより正確な測定となり得ること、及び患者101の癌細胞がCK及びEpCAMの不均一な発現を描くことを示唆する。更に、患者101の全てのCLR1501+細胞のカウントは、ドロー１から２で劇的に低下した。この蛍光は、患者101におけるEDTA血液回収チューブにおいても見られる(表２)。従って、CLR1501単独は、EpCAM及びCKの両方を同定する必要を無くしつつ、現在のアッセイよりも正確な臨床的応答の測定手段となり得る。
以上のように、蛍光PLE類似体CLR1501は、肺癌、胸腺癌、乳癌、子宮頸癌、扁平上皮細胞癌及び直腸結腸癌患者からCTCを同定するのにうまく使用された。

Claims (21)

  1. １つ以上の循環腫瘍細胞を同定する方法であって：
    (i)対象に由来する血液又は血清試料を、発光分子及び磁性ビーズからなる群から選択される物質と結合させたリン脂質エーテル(PLE)類似体を含有する組成物と接触させる工程；
    (ii)当該血液又は血清試料を蛍光顕微鏡又はフローサイトメトリーに供する工程；
    を含み、当該物質が磁性ビーズである場合、当該物質はリンカーを介してPLEと結合する、方法。
  2. 前記物質が結合したPLEが、式(I)〜(IV)：
    Figure 2019528456
     からなる群から選択され、ここで：
    nは16〜30の整数であり；
    Yは-H, -OH, -OR, -C(O)OH, 及び-OC(O)Rからなる群から選択され、ここでRはアルキルであり；かつ
    Xは発光分子又は磁性ビーズである、請求項１に記載の方法。
  3. 前記Xが発光分子である、請求項２に記載の方法。
  4. 前記発光分子がフルオロフォアである、請求項３に記載の方法。
  5. 前記フルオロフォアが、以下：
    Figure 2019528456
     からなる群から選択され、ここで各Rは、H, CH3, C2H5及びC3H7から独立して選択される、請求項４に記載の方法。
  6. 前記物質が結合したPLE類似体が式(II)の化合物であり、前記フルオロフォアが、以下：
    Figure 2019528456
     からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
  7. 前記Xが磁性ビーズである、請求項２に記載の方法。
  8. 前記磁性ビーズが、ナノ磁性ビーズ、マイクロ磁性ビーズ、常磁性ビーズ、及び超常磁性ビーズからなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
  9. 前記リンカーが、ビオチン-ストレプトアビジンリンカー、アゼチジノンリンカー、及びアミン-、アジド、アルキン-、カルボキシル-及びヒドロキシル基リンカー並びにそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  10. 前記１つ以上の循環腫瘍細胞が、乳癌、肺癌、胸腺癌、子宮頸癌、扁平上皮癌、前立腺癌、膵臓癌及び直腸結腸癌細胞、多発性骨髄腫細胞、及び癌幹細胞からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  11. １つ以上の循環腫瘍細胞(CTC)を単離する方法であって：
    (i)対象に由来する血液又は血清試料を、発光分子及び磁性ビーズからなる群から選択される物質と結合させたリン脂質エーテル(PLE)類似体を含有する組成物と接触させる工程；
    (ii)当該血液又は血清試料をフローサイトメトリー又は磁場に供する工程；
    を含み、当該物質が磁性ビーズである場合、当該物質はリンカーを介してPLEと結合し、当該血液又は血清試料は磁場に供され、そして当該物質が発光分子である場合、当該血液又は血清試料はフローサイトメトリーに供される、方法。
  12. 前記物質が結合したPLEが、式(I)〜(IV)：
    Figure 2019528456
     からなる群から選択され、ここで：
    nは16〜30の整数であり；
    Yは-H, -OH, -OR1, -C(O)OH, 及び-OC(O)R1からなる群から選択され、ここでR1はアルキルであり；かつ
    Xは発光分子又は磁性ビーズである、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記Xが発光分子である、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記発光分子がフルオロフォアである、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記フルオロフォアが、以下：
    Figure 2019528456
     からなる群から選択され、ここで各Rは、H, CH3, C2H5及びC3H7から独立して選択される、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記物質が結合したPLE類似体が式(II)の化合物であり、前記フルオロフォアが、以下：
    Figure 2019528456
     からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記Xが磁性ビーズである、請求項１２に記載の方法。
  18. 前記磁性ビーズが、ナノ磁性ビーズ、マイクロ磁性ビーズ、常磁性ビーズ、及び超常磁性ビーズからなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記リンカーが、ビオチン-ストレプトアビジンリンカー、アゼチジノンリンカー、及びアミン-、アジド、アルキン-、カルボキシル-及びヒドロキシル基リンカー並びにそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
  20. 前記１つ以上のCTCが、乳癌、肺癌、胸腺癌、子宮頸癌、扁平上皮癌、前立腺癌、膵臓癌及び直腸結腸癌細胞、多発性骨髄腫細胞、及び癌幹細胞からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
  21. 前記１つ以上の単離されたCTCが、タンパク質単離、RNA単離、DNA単離、遺伝子転移解析、遺伝子増幅解析及び蛍光in-situハイブリダイゼーションからなる群から選択される方法において利用される、請求項１１に記載の方法。
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