BR112018077197A2 - análogos de éter de fosfolipídio para identificação e isolamento de células tumorais circulantes - Google Patents

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Pinchuk Anatoly
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Pak Chorom
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Abstract

análogos de éter de fosfolipídio para identificação e isolamento de células tumorais circulantes a presente invenção é direcionada a um método para identificar, isolar e possibilitar a análise a jusante de células tumorais circulantes compreendendo colocar uma amostra de sangue ou de soro sanguíneo de um indivíduo em contato com uma composição compreendendo um análogo de éter de fosfolipídio ligado a uma molécula luminescente ou uma esfera magnética e submeter a amostra de sangue ou soro sanguíneo do indivíduo a microscopia fluorescente, citometria de fluxo ou isolamento magnético.

Description

ANÁLOGOS DE ÉTER DE FOSFOLIPÍDIO PARA IDENTIFICAÇÃO E ISOLAMENTO DE CÉLULAS TUMORAIS CIRCULANTES
REFERÊNCIA CRUZADA À PEDIDO(S) RELACIONADO(S) [0001] O presente pedido reivindica prioridade ao pedido de Patente Provisório Norte-Americano No. 62/349,713, depositado em 14 de junho de 2016, cujos conteúdos totais são integralmente incorporados aqui por referência.
ANTECEDENTES [0002] Células tumorais circulantes (CTCs) são marcadores baseados no sangue que hipoteticamente possuem valor preditivo e prognóstico na detecção e progressão do câncer. Especificamente, As CTCs são teorizadas como sendo uma fonte minimamente invasiva de células tumorais tanto do tumor primário quanto dos sítios metastáticos. (AlixPanabiens C., et al., Challenges in circulating tumour cell research, Nat Rev Cancer, Setembro de 2014, 14(9), 623-31 e Yap T., et al., Circulating tumor cells: a multifunctional biomarker, Clin Cancer Res, 15 de Maio de 2014, 20(10), 255368). Muitos tipos de câncer são conhecidos ou previstos para dar origem às CTCs, incluindo mieloma múltiplo. Paiva B., et al., Detailed characterization of multiple myeloma circulating tumor cells shows unique phenotypic, cytogenetic, functional, and circadian distribution profile, Blood, 21 de Novembro de 2013, 122(22), 3591-3598. Além disso, as células-tronco tumorais (CSC), outro possível tipo de célula tumoral com previsão de possuir valor prognóstico, são teorizadas como sendo uma subpopulação de CTCs. Scatena R. et al., Circulating tumour cells and cancer stem cells: a role for proteomics in defining the interrelationships
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2/31 between function, phenotype and differentiation with potential clinical applications, Biochim Biophys Acta, Abril de 2013; 1835(2), 129-143; Faltas B., Cornering metastases: therapeutic targeting of circulating tumor cells and stem cells, Front Oncol, 03 de Julho de 2012, (2)68. Por definição, uma CTC é uma célula nucleada, positiva para CD45, positiva para molécula de adesão celular epitelial (EpCAM) e positiva para pancitoqueratina. No entanto, a identificação e isolamento de CTCs de sangue total são tecnicamente desafiadores, uma vez que as CTCs são extremamente raras e podem apresentar concentrações muito baixas, na ordem de 1 célula em 7,5 mililitros (mL) de sangue (ou seja, 1 em vários bilhões de células) .
[0003] Atualmente, a única indicação aceita e aprovada para as CTCs é a enumeração como marcador prognóstico da progressão do câncer. O sistema CellSearch® (CellSearch é uma marca registrada da Johnson & Johnson Corp.) é atualmente o único ensaio aprovado pela Food and Drug Administration (FDA) para enumerar as CTCs. (Ignatiadas M., et al., Circulating tumor cells and circulating tumor DNA for precision medicine: dream or reality?, Ann Oncol, Dezembro de 2014, 25(12), 2304-13 e Toss A., et al., CTC enumeration and characterization: moving toward personalized medicine, Ann Transl Med, Novembro de 2014, 2(11):108, 116) . Infelizmente, o CellSearch® é aprovado apenas para câncer de mama, colorretal e próstata metastático. (Hayes D.
F., et al., Circulating tumor cells at each follow-up time point during therapy of metastatic breast cancer patients predict progression-free and overall survival, Clin Cancer
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3/31
Res, 15 de Julho de 2006, 12(1), 4218-24; Cristofanilli M, et al., Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer, N Engl J Med, 19 de Agosto de 2004, 351(8), 781-91; De Bono J. S., et al., Circulating tumor cells predict survival benefit from treatment in metastatic castration-resistant prostate cancer, Clin Cancer Res, 01 de Outubro de 2008, 14(19), 63029 e Cohen S. J., et al., Relationship of circulating tumor cells to tumor response, progression-free survival, and overall survival in patients with metastatic colorectal cancer, J Clin Oncol, 1 de Julho de 2008, 26(19), 3213-21).
[0004] Ainda existem desafios para identificar CTOs em acordo com a definição atual. Primeiramente, há potencial para resultados falso-positivos devido às células epiteliais circulantes positivas para EpCAM. Em segundo lugar, os resultados falso-negativos podem ocorrer devido a células tumorais serem submetidas a uma transição epitéliomesênquima, resultando na redução da expressão de marcadores epiteliais (Yu M., et al. , Circulating breast tumor cells exhibit dynamic changes in epithelial and mesenchymal composition, Science, 01 de Fevereiro de 2013, 339(6119), 580-4). Em terceiro lugar, existem evidências crescentes na literatura de que nem todas as CTCs expressam EpCAM e que certos tipos de câncer, tais como o câncer renal, têm expressão baixa ou heterogênea de EpCAM (Eichelberg C, et al., Epithelial cell adhesion molecule is an independent prognostic marker in clear cell renal carcinoma, Int J Cancer, 15 de Julho de 2013, 132(12), 2948-55 e Spizzo G., et al., EpCAM expression in primary tumour tissues and
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4/31 metastases: an immunohistochemical analysis, J Clin Pathol, Maio de 2011, 64(5):415-20. Assim, existe uma necessidade clínica para um ensaio econômico e robusto usando um amplo marcador tumoral que possa potencialmente identificar todas as CTCs sem viés. Os análogos de alquilf osf ocolina (APC) direcionados ao câncer oferecem um novo processo para identificação e isolamento de CTCs a partir de uma ampla gama de diferentes tipos de câncer.
SUMARIO DA INVENÇÃO [0005] A presente invenção é direcionada a um processo de identificação de uma ou mais células tumorais circulantes, processo que compreende:
(i) colocar uma amostra de sangue ou soro sanguíneo de um indivíduo em contato com uma composição que compreende um análogo de éter fosfolipidico (PLE) ligado a um artigo selecionado a partir do grupo constituído de uma molécula luminescente e uma esfera magnética; e (ii) submeter a amostra de sangue ou soro sanguíneo de um indivíduo à microscopia fluorescente ou citometria de fluxo, em que, se o artigo for uma esfera magnética, o artigo é ligado ao PLE através de um ligante.
[0006] A presente invenção é adicionalmente direcionada a um processo de isolamento de uma ou mais células tumorais circulantes, processo que compreende as etapas de:
(1) administrar uma composição que inclui um análogo de PLE ligado a um artigo selecionado a partir do grupo
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5/31 constituído de uma molécula luminescente e uma esfera magnética, a um indivíduo; e (ii) submeter a amostra de sangue ou soro sanguíneo de um indivíduo à citometria de fluxo ou um campo magnético, em que, se o artigo for uma esfera magnética, o artigo é ligado ao PLE através de um ligante, e a amostra de sangue ou soro sanguíneo de um indivíduo é submetida a um campo magnético, e em que, se o artigo é uma molécula luminescente, então a amostra de sangue ou soro sanguíneo de um indivíduo é submetida à citometria de fluxo.
[0007] Em uma modalidade, a uma ou mais células tumorais circulantes compreendem células-tronco tumorais.
[0008] Em uma modalidade preferencial, o análogo de PLE ligado a um artigo da presente invenção é um composto selecionado a partir do grupo que compreende:
X-(CH2)n
O n -OPOCH
I
O„ ©
-CH2N(CH3)3 f ó rmula (I) ;
© (CH2)n -OPOCH2CH2N(CH3)3 f ó rmula (II);
o ô
Y 0
B , f órmula (III); e /—\ .. . . ....... .
¥ o , fórmula (IV), em que:
n é um número inteiro de 16 a 30, preferivelmente 18;
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6/31
Y é selecionado a partir do grupo que compreende -H, OH, -OR1, -0(0) OH, e -OC(O)RX, em que R1 é uma alquila; e
X é uma molécula luminescente ou uma esfera magnética.
[0009] Em uma modalidade preferencial, a molécula luminescente é um fluoróforo, mais preferivelmente o fluoróforo é selecionado a partir do grupo que compreende:
independentemente selecionado a partir de H, CH3, C2H5 e C3H7, mais preferivelmente:
[0010] Em outra modalidade preferencial, a esfera magnética é selecionada a partir do grupo que compreende esferas nanomagnéticas, esferas micromagnéticas, esferas paramagnéticas e esferas superparamagnéticas, em que a esfera magnética é ligada ao análogo de PLE através de um ligante selecionado a partir do grupo que compreende um ligante de biotina-estreptavidina, um ligante de azetidinona
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7/31 e um ligante de grupo amina, azida, alquino, carboxila e hidroxila e combinações dos mesmos.
[0011] Em outra modalidade preferencial, a uma ou mais células tumorais circulantes da presente invenção são selecionadas a partir do grupo que compreende câncer de mama, câncer de pulmão, câncer de tireoide, câncer cervical, carcinoma de células escamosas, câncer de próstata, câncer de pâncreas e uma célula de câncer colorretal, uma célula de mieloma múltiplo, célula-tronco tumoral, preferencialmente câncer de mama, câncer de pulmão, câncer de tiroide, câncer cervical, carcinoma de célula escamosa, câncer de próstata, uma célula de câncer de pâncreas e uma célula de câncer colorretal e mais preferencialmente uma célula de câncer de próstata ou uma célula de câncer de pâncreas. Em outra modalidade preferencial, os processos da presente invenção podem ser utilizados em tecnologias adicionais de aquisição de dados à jusante incluindo, mas não se limitando a, isolamento de proteínas, isolamento de RNA, isolamento de DNA, análise de translocação e/ou de amplificação de genes e hibridização fluorescente in situ.
BREVE DESCRIÇÃO DA FIGURA [0012] Figura 1 - Plotagem da análise de células CD45-, CD34- isoladas a partir do paciente 108 (câncer colorretal). O painel A mostra células coradas com todos os marcadores, exceto CD14. O painel B mostra células coradas com todos os marcadores. O quadrante superior esquerdo indica células CD14-/CLR1501+, o quadrante superior direito indica células CD14+/CLR1501+, o quadrante inferior direito indica
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8/31 células CD14+/CLR1501- e o quadrante inferior esquerdo indica células CD14-/CLR1501.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [0013] Os análogos de PLE têm a capacidade de identificar, isolar e permitir análises à jusante de CTCs de todos os tipos. As células tumorais têm cinco a dez vezes mais balsas lipídicas em comparação às células saudáveis. As balsas lipídicas são regiões especializadas de bicamada fosfolipídica da membrana que contêm altas concentrações de colesterol e esfingolipídeos, e servem para organizar a superfície celular e moléculas de sinalização intracelular (por exemplo, fatores de crescimento e receptores de citocina, a via de sobrevivência de fosfatidilinositol 3quinase (PI3K)/Akt). Os dados sugerem que as balsas lipídicas servem como portais de entrada para os PLEs. A seletividade marcada destes compostos para células tumorais contra células não tumorais é atribuída à alta afinidade dos PLEs para colesterol e à abundância de balsas lipídicas ricas em colesterol nas células tumorais. O papel fundamental desempenhado pelas balsas lipídicas é ressaltado pelo fato de que a ruptura da arquitetura da balsa lipídica suprime a absorção de PLEs nas células tumorais. Foi demonstrado que a absorção de PLEs é reduzida em 60% quando as balsas lipídicas são impedidas de se formar.
[0014] Os resultados preliminares obtidos em mais de 55 modelos de xenoenxerto e de tumor espontâneo mostraram universalmente que CLR1404 é submetido à captação seletiva e retenção prolongada nos tumores. Weichert, J. P. et al., Alkylphosphocholine analogs for broad-spectrum cancer
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9/31 imaging and therapy, Sci Transi Med, 11 de Junho de 2014, 6(240ra75) . O que não se sabia anteriormente, era se os análogos de PLE eram capazes de serem absorvidos pelas CTCs na medida em que as CTCs pudessem ser identificadas e isoladas.
[0015] A presente invenção é direcionada a um processo de identificação de uma ou mais células tumorais circulantes, processo que compreende:
(i) colocar uma amostra de sangue ou soro sanguíneo de um indivíduo em contato com uma composição que compreende um análogo de éter fosfolipidico (PLE) ligado a um artigo selecionado a partir do grupo constituído de uma molécula luminescente e uma esfera magnética; e (ii) submeter a amostra de sangue ou soro sanguíneo de um indivíduo à microscopia fluorescente ou citometria de fluxo, em que, se o artigo for uma esfera magnética, o artigo é ligado ao PLE através de um ligante.
[0016] A presente invenção é adicionalmente direcionada a um processo de isolamento de uma ou mais células tumorais circulantes, processo que compreende as etapas de:
(i) colocar uma amostra de sangue ou soro sanguíneo de um indivíduo em contato com uma composição que inclua um análogo de PLE ligado a um artigo selecionado a partir do grupo constituído de uma molécula luminescente e uma esfera magnética; e (ii) submeter uma amostra de sangue ou soro sanguíneo de um indivíduo à citometria de fluxo, preferivelmente
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10/31 triagem de células ativadas por fluorescência ou um campo magnético, em que, se o artigo for uma esfera magnética, o artigo é ligado ao PLE através de um ligante e a amostra de sangue ou soro sanguíneo de um indivíduo é submetida a um campo magnético e em que, se o PLE estiver ligado a uma molécula luminescente, então a amostra de sangue ou soro sanguíneo de um indivíduo é submetida à citometria de fluxo.
[0017] Em uma modalidade preferencial, o análogo de PLE ligado a um artigo da presente invenção é um composto selecionado a partir do grupo que compreende:
*-(CH2)n o
-OPOCH ©
2CH2N(CH3)3 f ó rmu1a (I) ;
X
H © (CH2)n -QPOCH2ÇH2N(CH3)3 °G f ó rmu1a (II);
Ο Ρΐ
X ”{CHa)n -O ~ C HgCHC HjfO ~ P ÜCM2C H2N(CH3 v 4
R>' , f ó rmu 1 a (III); e
----1 Q ,-s /—\ a
X ——/HCH4rO -CH2GHCH-jO -F -OCHjCH^CH 3 h <·. ··. · ? - 1
Y em que:
n é um número inteiro de
Y é selecionado a partir
OH, -OR1, -0(0) OH, e -00 (0) R1,
Q-.
, fórmula (IV) a 30, preferivelmente 18; do grupo que compreende -H, em que R1 é uma alquila; e
X é uma molécula luminescente ou uma esfera magnética.
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11/31
Em uma modalidade preferencial, a molécula luminescente mais preferivelmente o é um fluoróforo
selecionado partir a
de H
CH3, C2H5 e C3H7, mais preferivelmente
R N ¥
/ \
F N fí
modalrdade preferencial
Em outra esfera magnética é selecionada a partir do grupo que compreende esferas nanomagnéticas esferas micromagnéticas, esferas paramagnéticas e esferas superparamagnéticas, em que esfera magnética é ligada ao análogo de PLE através de um ligante selecionado a partir do grupo que compreende um ligante de biotina-estreptavidina, um ligante de azetidinona e um ligante de grupo amina, azida, alquino, carboxila e hidroxila e combinações dos mesmos.
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12/31 [0020] Em outra modalidade preferencial, a uma ou mais células tumorais circulantes da presente invenção são selecionadas a partir do grupo que compreende câncer de mama, câncer de pulmão, câncer de tireoide, câncer cervical, carcinoma de células escamosas, câncer de próstata, câncer de pâncreas e uma célula de câncer colorretal, e uma célulatronco tumoral e uma célula plasmática maligna, preferivelmente, uma célula tumoral da próstata ou uma célula tumoral do pâncreas.
[0021] Em outra modalidade preferencial, os processos da presente invenção podem ser utilizados em tecnologias adicionais de aquisição de dados à jusante incluindo, mas não se limitando a, isolamento de proteínas, isolamento de RNA, isolamento de DNA, análise de translocação e/ou de amplificação de genes e hibridização fluorescente in situ.
Definições [0022] Em geral, a referência a uma célula tumoral circulante pretende referir-se a uma única célula, enquanto a referência a células tumorais circulantes ou aglomerado de células tumorais circulantes pretende referir-se a mais de uma célula tumoral. Contudo, um técnico na arte compreendería que a referência a células tumorais circulantes pretende incluir uma população de células tumorais circulantes, incluindo uma ou mais células tumorais circulantes, enquanto a referência a uma célula tumoral circulante pode incluir mais do que uma célula tumoral circulante.
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13/31 [0023] O termo célula tumoral circulante ou células tumorais circulantes, tal como aqui utilizado, se refere a qualquer célula tumoral ou aglomerado de células tumorais que se encontram no sangue ou amostra de soro sanguíneo de um indivíduo. As CTCs também podem conter ou compreender uma célula-tronco tumoral ou um aglomerado de células-tronco tumorais encontradas na amostra de sangue ou soro sanguíneo de um indivíduo.
[0024] Tal como aqui utilizado, o termo célulatronco tumoral se refere a uma célula tumoral capaz de autorenovação e diferenciação em diferentes tipos de células tumorais encontradas em um tumor maligno.
[0025] O termo câncer, tal como aqui utilizado, se refere a, mas não está limitado a, uma variedade de tipos de câncer, incluindo câncer de mama, incluindo câncer de mama masculino, cânceres digestivos/gastrointestinais, incluindo câncer anal, câncer do apêndice, câncer do duto biliar extrahepático, tumor carcinoide gastrointestinal, câncer do cólon, câncer de esôfago, câncer da vesícula biliar, câncer gástrico, tumores estremais gastrointestinais (gist), tumores de células das ilhotas, câncer primário de fígado em adultos, câncer de fígado em infantes, câncer pancreático, câncer retal, câncer de intestino delgado e câncer do estômago (gástrico); cânceres endocrine e neuroendocrine, incluindo adenocarcinoma pancreático, carcinoma adrenocortical, tumores neuroendócrinos pancreáticos, carcinoma de células de Merkel, tumor neuroendocrine de pulmão de células não pequenas, tumor neuroendocrine de pulmão de células pequenas, câncer da glândula paratireoide,
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14/31 feocromocitoma, tumor da hipófise e câncer da tireoide; cânceres do olho, incluindo melanoma intraocular e retinoblastoma; câncer geniturinário, incluindo câncer da bexiga, câncer de rim (células renais), câncer do pênis, câncer de próstata, câncer de pélvis renal de células transicionais e câncer do ureter, câncer de testículo, câncer da uretra e tumor de Wilms; cânceres de células germinativas, incluindo câncer do sistema nervoso central em infantes, tumor de células germinativas extracranianas em infantes, tumor de células germinativas extragonadal, tumor de células germinativas do ovário e câncer testicular; cânceres ginecológicos, incluindo câncer cervical, câncer endometrial, tumor trofoblástico gestacional, câncer epitelial dos ovários, tumor de células germinais dos ovários, sarcoma uterino, câncer vaginal e câncer vulvar; cânceres de cabeça e pescoço, incluindo câncer hipofaríngeo, câncer de laringe, câncer labial e câncer de cavidade oral, carcinoma espinocelular metastático com câncer oculto primário, câncer bucal, câncer de nasofaringe, câncer de orofaringe, câncer de seio paranasal e de cavidades nasais, câncer de paratireoide, câncer de faringe, câncer de glândula salivar e câncer de garganta; leucemias, incluindo leucemia linfoblástica aguda em adultos, leucemia linfoblástica aguda em infantes, leucemia mieloide aguda em adultos, leucemia mieloide aguda em infantes, leucemia linfocítica crônica, leucemia mielogênica crônica e leucemia das células pilosas; mieloma múltiplo, incluindo células plasmáticas malignas; linfomas, incluindo linfoma relacionado à AIDS, linfoma cutâneo de células T, linfoma de Hodgkin em adultos, linfoma
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15/31 de Hodgkin em infantes, linfoma de Hodgkin durante a gravidez, micose fungdide, linfoma não-Hodgkin em adultos, linfoma não-Hodgkin em infantes, linfoma não-Hodgkin durante a gravidez, linfoma do sistema nervoso, síndrome de Sézary e Waldenstrom macroglobulinemia; cânceres musculoesqueléticos, incluindo sarcoma de Ewing, osteossarcoma e histiocitoma fibroso maligno ósseo, rabdomiossarcoma e sarcoma dos tecidos moles em infantes; cânceres neurológicos, incluindo tumor cerebral em adultos, tumor cerebral em infantes, astrocitoma, glioma do tronco cerebral, 0 tumor rabdóide/teratóide atípico do sistema nervoso central, tumores embrionários do sistema nervoso central, craniofaringioma, ependimoma, neuroblastoma, linfoma do sistema nervoso central primário (CNS); cânceres respiratórios/torácicos, incluindo câncer do pulmão de células não pequenas, câncer do pulmão de células pequenas, mesotelioma maligno, timoma e carcinoma do time; e cânceres de pele, incluindo sarcoma de Kaposi, melanoma e carcinoma de células escamosas.
[0026] Tal como aqui utilizado, o termo amostra se refere a qualquer amostra adequada para os processos fornecidos pela presente invenção. A amostra pode ser qualquer amostra que inclua células tumorais circulantes adequadas para detecção. As fontes de amostras incluem sangue total, medula óssea, líquido pleural, líquido peritoneal, líquido espinhal central, urina, saliva e lavagens brônquicas. Em um aspecto, a amostra é uma amostra de sangue, incluindo, por exemplo, sangue total ou qualquer fração ou componente do mesmo. Uma amostra de sangue, adequada para
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16/31 utilização com a presente invenção, pode ser extraída a partir de qualquer fonte conhecida que inclua células sanguíneas ou seus componentes, tais como veias, artérias, periféricas, tecidos, cordão umbilical e semelhantes. Por exemplo, uma amostra pode ser obtida e processada usando processos clínicos bem conhecidos e rotineiros (por exemplo, procedimentos para extrair e processar sangue total). Em uma modalidade, uma amostra exemplificativa pode incluir sangue periférico extraído a partir de um indivíduo com câncer.
[0027] Tal como aqui utilizado, o termo identificar ou identificação se refere à visualização da existência de uma CTC.
[0028] Tal como aqui utilizado, o termo isolar ou isolamento se refere a separar fisicamente CTCs de outros tipos de células encontradas na amostra de um indivíduo.
[0029] Tal como aqui utilizado, o termo contato ou contatando se refere a fazer com que um indivíduo, tecido, órgão ou células entre em contato com um análogo de PLE da presente invenção. Tal como aqui utilizado, o contato pode ser realizado ex vivo ou in vitro, isto é, em um tubo de ensaio, em células ou tecidos de organismos vivos, por exemplo, humanos. Um paciente ou indivíduo, aqui utilizado equivalentemente se refere a um mamífero, preferivelmente um ser humano.
[0030] Tal como aqui utilizado, o termo alquila se refere a um grupo alquila ramificado ou de cadeia linear que compreende um grupo hidrocarboneto saturado de 1 a 24 átomos de carbono (C/-C24) , a menos que indicado de outra forma. O grupo alquila pode ser cíclico ou acíclico.
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17/31 [0031] Tal como aqui utilizado, o termo amina se refere a um grupo funcional que compreende um átomo de nitrogênio com um único par de elétrons.
[0032] Tal como aqui utilizado, o termo azida se refere a um grupo funcional que compreende três átomos de nitrogênio consecutivos.
[0033] Tal como aqui utilizado, o termo alquino se refere a um grupo funcional que compreende dois átomos de carbono que possuem ligações triplas entre si.
[0034] Tal como aqui utilizado, o termo carboxila se refere a um grupo funcional que compreende uma estrutura C(O)O.
[0035] Tal como aqui utilizado, o termo hidroxila se refere a um grupo funcional que compreende um OH.
[0036] Tal como aqui utilizado, ' Λη é um inteiro de
16 a 30.
[0037] Tal como aqui utilizado, Y é selecionado a
partir do grupo que compreende H, -OH, -OR, -0(0) OH, e -
OC(0)R.
[0038] Tal como aqui utilizado, ' R se refere a uma
alquila.
[0039] Tal como aqui utilizado, o termo R se refere
a um H, CH3, C2H5 e c3h7.
[0040] Tal como aqui utilizado, X é uma molécula
luminescente ou uma esfera magnética ligada a um ligante.
[0041] A i citometria de fluxo útil na presente
invenção inclui, mas não se limita a, separação de células ativadas por fluorescência (FACS) e citometria de fluxo multicores.
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18/31 [0042] Esferas magnéticas úteis na presente invenção incluem, mas não estão limitadas a, esferas nanomagnéticas que possuem um tamanho na gama dos nanometres e que são, por vezes, referidas como nanoparticuias magnéticas, por exemplo, esferas MACS® de 50 Nm, (MACS é uma marca registrada e está disponível a partir da Miltenyi Biotec GmbH), esferas micromagnéticas com um tamanho na gama dos micrometros, por exemplo, esferas Dynabeads® de 1 μΜ a 3 μΜ (Dynabeads é uma marca registrada e está disponível a partir da Invitrogen Dynal AS Corp), esferas paramagnéticas e esferas superparamagnéticas.
[0043] Moléculas luminescentes úteis na presente invenção incluem fluoróforos.
[0044] Fluoróforos incluem, mas não estão limitados a, compostos Alexa Fluor® (Alex Fluor é uma marca comercial registrada a partir da Molecular Probes, Inc.), incluindo compostos Brilliant Violet™ 350, 405, 430, 488, 532, 546, 555, 568, 594, 610, 633, 635, 647, 660, 680, 700, 750 e 790 (Brilliant Violet está disponível a partir da BioLegend®), incluindo compostos Brilliant Ultra-Violet™ 420, 510, 605, 650, 711 e 786, (Brilliant Ultra-Violet está disponível a partir da BD Biosciences, Inc.), incluindo aqueles de frequência 395 e 737 nm, compostos Dylight® (Dylight é uma marca comercial registrada e está disponível a partir da Pierce Biotechnology, Inc.), incluindo 350, 405, 488, 550, 594, 633, 650, 680, 755 e 800, Violetfluor® 450, Redfluor® 710, (Violetfluor e Redfluor são marcas registradas e estão disponíveis a partir da Tonbo Biotechnologies Corporation), aloficocianina (APC), APC Alexa Fluor® 750, APC-Cy7,
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19/31 proteína clorofila peridinina (PerCP), PerCP-Cy5, PerCPCy5.5, PerCP-Cy7, iodeto de propídeo (PI), ficoeritrina (PE), PE-Cy5, PE-Cy5.5, PE-Cy7, PE-exas RED® (Texas Red é uma marca registrada a partir da Molecular Probes, Inc.), fluoresceína (FITC), amino metil cumarina (AMCA), Marina Blue®, Cascade Blue® (Marina Blue e Cascade Blue são marcas registradas e disponíveis a partir da Molecular Probes,
Inc.), Cascade Yellow, Pacific Blue, Qdot® 605 (Qdot é uma marca comercial registrada a partir da Life Technologies
Corp), tetrametilrodamina (TR1TC), Cy3, Cy5, Cy5.5, Texas
Red® e compostos das seguintes estruturas:
independentemente selecionado a partir de H, CH3, C2H5 e C3H7.
[0045] Os ligantes úteis na presente invenção incluem, mas não estão limitados a, uma ligação, ligante de biotina-estreptavidina, um ligante de azetidinona e um ligante de grupo amina, azida, alquino, carboxila e hidroxila e combinações dos mesmos.
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20/31 [0046] As seguintes modalidades preferenciais são fornecidas apenas para fins ilustrativos e não se destinam, de qualquer maneira, limitar a invenção.
Modalidades Preferenciais [0047] Em uma modalidade preferencial, a presente invenção é direcionada a um processo de identificação de uma célula tumoral circulante de próstata, processo que compreende:
(i) colocar uma amostra de sangue ou soro sanguíneo de um indivíduo em contato com uma composição que compreende um composto de:
(ii) submeter a amostra de sangue ou soro sanguíneo de um indivíduo à microscopia fluorescente ou citometria de fluxo.
[0048] Em uma modalidade preferencial, a presente invenção é direcionada a um processo de isolamento de uma célula tumoral circulante de próstata, processo que compreende:
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21/31 (i) um indivíduo composto de:
colocar uma amostra de sangue ou soro sanguíneo de em contato com uma composição que compreende um
(ii) submeter a amostra de fórmula (V) CLR1501 ou fórmula (VI) CLR1502; e sangue ou soro sanguíneo de um indivíduo à triagem de células ativadas por fluorescência.
[0049] Os exemplos seguintes são fornecidos apenas para fins ilustrativos e não pretendem, de qualquer maneira, limitar a invenção.
EXEMPLOS
Exemplo 1 - Síntese de um conjugado de esferas maqnéticas-PLE [0050] Primeiramente, tanto um PLE de fórmula I-IV, como uma esfera magnética, tal como aqui descrita, estão ligados ao seu próprio grupo funcional. Os grupos funcionais são então ligados por meio de química click. Como um exemplo, um PLE de fórmula I da presente invenção pode ser ligado a um grupo funcional azida e uma esfera magnética pode ser ligada a um grupo funcional alquino. Os grupos funcionais azida e alquino podem então ser ligados através de química click, tal como cicloadição azida-alquino
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22/31 catalisada por cobre (CuAAC). Em geral, as esferas magnéticas ligadas a um grupo funcional são conhecidas como esferas magnéticas funcionalizadas e estão disponíveis a partir de várias fontes, tais como Nanocs, Inc.
II ® (CH2)18OPOCH2CH2NMe3
NaN3,
CLR1401
Cul, Ascorbato de Na EtOH-H2O, 80 °C, 95%
O 0
N3—(ch2)1 8OPOCH2CH2NMe3
Azida CLR1401
O II
H2, Pd/C
MeOH, 87%
Θ
H2N—(CH2)18OPOCH2CH2NMe3
Azida CLR1401
Síntese de azida CLR1401 [0051] 18-(p-iodofenil)octadecil fosfocolina (4,01 g, 6,3 mmol), azida de sódio (818 mg, 12,6 mmol) e ascorbato de sódio (140 mg, 0,71 mmol) foram dissolvidos na mistura de etanol desgaseifiçado (28 mL) e água (12 mL) no recipiente reacional. lodeto de cobre (I) (120 mg, 0,63 mmol) e N,N'dimetil-etilenodiamina (0,1 ml, 0,94 mmol) forma adicionados à mistura reacional. O recipiente reacional foi fechado firmemente e a mistura foi agitada a 80°C durante 45 minutos. A mistura reacional foi arrefecida até a temperatura ambiente, água (60 mL) foi adicionada e a mistura foi agitada durante 30 minutos aberta ao ar. A mistura foi transferida para funil de separação, clorofórmio (80 mL) e metanol (52 mL) foram adicionados e a extração foi realizada por agitação. A camada de clorofórmio foi removida e a extração foi repetida (2x 80 mL de clorofórmio). Extratos de clorofórmio combinados foram lavados com HC1 a 0,01 N, secos sobre Na2SO4, filtrados e evaporados até à secura. O resíduo foi dissolvido em clorofórmio (4 mL) e acetona (170 mL) foi adicionada lentamente com agitação. A mistura foi agitada
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23/31 durante 30 minutos e filtrada. O produto foi enxaguado no filtro com acetona e seco sob alto vácuo para originar 3,31 g (95%) de
18-(p-iodofenil)octadecil fosfocolina.
Ligação de um PLE-azida a uma esfera magnética funcionalizada com alquino +
Esferas magnéticas, função alcina /=\ °® CUO
N3—4 Ò— (CH2)18OPOCH2CH2NMe3 ---4
Azida ÇLR14Q1 _ O@ \ ,N (CH2)18OPOCH2CH2NMe3
N=NQ, [0052]
Azida CLR1401 é ligada a uma esfera magnética funcionalizada com alquino através de química
Um exemplo de CuAAC é apresentado acima. A CuAAC é descrita em
Himo F., et al., Copper (1)-catalyzed synthesis of azoles.
DET study predicts unprecedented reactivity and intermediates,
J Am Chem Soc, 12 de Janeiro de 2005, 127(1),
210-216, que é incorporado por referência em sua totalidade.
Resumidamente, a esfera magnética funcionalizada com alquino e a azida CLR1401 são misturados em uma proporção de 1:1 de água e álcool terc-butilico na presença de um catalisador de óxido de cobre (Cu(I)) durante 6 a 12 horas. Opcionalmente, ascorbato de sódio é adicionado à mistura. A esfera magnética-PLE final pode então ser isolada da solução usando filtragem ou extração simples.
,N.
H· /=\ ° ® Cli(I) (CH2)18OPOCH2CH2NMe3 ---Esferas magnéticas, função azida
CLR1401 acetileno ©
'(CH2)18OPOCH2CH2NMe3
Ligação de um PLE-acetileno a uma esfera magnética funcionalizada com azida
Acetileno CLR1401 é ligado a uma esfera magnética funcionalizada com azida através da química
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24/31 click. A mesma reação de CuAAC utilizada para ligação de azida CLR1401 a uma esfera magnética funcionalizada com
Agent© de alquinos pode ser utilizada cc acoplamento ito acima.
coupling.. ~ /=\ θ ® agent v θ /=\ 11® χ- NH2 + HO-C—A Λ— (CH2)18OPOCH2CH2NMe3 --------- χ-Ν-C—(CH2)18OPOCH2CH2NMe3
4%
Nanopartículas magnéticas,° função amina carboxj CLR1401
Ligação de um PLE-carboxi a uma nanoparticula magnética funcionalizada com amina [0054] Carboxi CLR1401 é ligado a uma nanoparticula magnética funcionalizada com amina através de ligação amida. A ligação amida pode ser conseguida através de qualquer reagente de acoplamento adequado para formação de uma ligação amida, tal como reagentes utilizados para sintese de peptídeos incluindo, mas não se limitando a, hexafluorofosfato de (2-(IH-benzotriazol-l-il)-1,1,3,3tetrametilurônio) (HBTU), hexafluorofosfato de 3-óxido (1[bis(dimetilamino)metileno]-1H-1,2,3-triazol[4,5b]piridínio) (HATU), COMU® (COMU está disponível a partir da
Sigma Aldrich Co, LLC e é uma marca
Biotechnologies Ltd.) e anidrido do (PPAA ou T3P®, T3P está disponível registrada da Luxembourg ácido propano fosfônico e é uma marca comercial registrada da Euticals SPA).
o.
χ-ΝΗ2 + í? ® _____ (CH2)i8OPOCH2CH2NMe3 --0 0 /=\ θ e Y_NA^N4-H^J^íCH2)1aOPOCH2CH2NMe3 Λ Η Η Οθ
Nanopartículas magnéticas, função amina
Carboxi-AZD CLR1401
Ligação de um PLE carboxi-AZD a uma nanoparticula magnética funcionalizada com amina
Alternativamente à ligação amida descrita acima, as nanopartículas magnéticas funcionalizadas com amina podem ser ligadas a um carboxi-PLE através de um
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25/31 ligante de azetidinona (AZD). Como exemplo, carboxi CLR1401AZD pode ser ligado a uma nanopart!cuia magnética funcionalizada com amina através de urn ligante de AZD. A ligação de AZD é descrita em Roberts L. R. et al., Kappa agonist CovX-Bodies, Bioorg Med Chem Lett, 15 de Junho de 2012, 22(12), 4173-4178 e Sato S. et al., Chemically Programmed Antibodies AS HIV-1 Attachment Inhibitors, ACS Med Chem Lett, 09 de Maio de 2013, 4(5), 460-465.
Exemplo 2 - Identificação e contagem de células tumorais circulantes de câncer de pulmão, tiroide, mama, cervical, carcinoma das células escamosas, e colorretal em pacientes utilizando um análogo de PLE fluorescente
Processos [0056] O sangue total foi recolhido em tubos de coleta Cell Save® ou tubos de coleta com ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA) a partir de sete pacientes com câncer de pulmão (pacientes 101 e 103), tireoide (paciente 102), mama (paciente 106), cervical (paciente 104), carcinoma de células escamosas (paciente 107), e colorretal (paciente 108) antes (coleta 1) e depois (coleta 2) da terapia, quando disponível. Células mononucleares foram isoladas a partir do sangue total usando gradiente de densidade Ficoll-Paque. As células de cada paciente foram então incubadas com um bloqueador Fc. As células foram então coradas com anticorpos marcados com fluorescência para CD45, CD14, CD34, EpCAM e pancitoqueratina (CK), e um análogo de PLE fluorescente (CLR1501) durante 30 minutos. As células foram então analisadas por citometria de fluxo para indicar o número de células de cada amostra de sangue total que eram positivas
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26/31 e/ou negativas para um marcador particular. De acordo com a definição atual, as CTCs foram identificadas como células vivas que eram CD45-, CD14-, CD34-, CK+ e EpCAMf (por definição). Devido à experiência anterior com monócitos / macrófagos CD14+ (Figura 1), as células CD14+ foram removidas das análises devido à alta captação de CLR1501. Células epiteliais normais CD34+ também foram removidas das análises. Em comparação, as células CD45+ e CD34+ remanescentes no mesmo paciente não utilizarão CLR1501 em grande medida. Os resultados desta análise são explicados abaixo e resumidos nas Tabelas 1 e 2.
[0057] A primeira linha das Tabelas 1 e 2 mostra o número de células da coleta de sangue de cada paciente que preencheram a definição de uma CTC: CD45-, CD14-, CD34-, CK+ e EpCAMf, e continha um núcleo. A segunda linha mostra o número de células da coleta de sangue de cada paciente que eram CD45-, CD14-, CD34-, CK+, e continha um núcleo. A terceira linha mostra o número de células da coleta de sangue de cada paciente que eram CLR 1501+, CD45-, CD14-, CD34-, CK+, e continha um núcleo. A quarta linha mostra o número de células da coleta de sangue de cada paciente que eram CD45, CD14-, CD34- e EpCAMf, e continha um núcleo. A quinta linha mostra o número de células da coleta de sangue de cada paciente que eram CLR 1501+, CD45-, CD14-, CD34- e EpCAMf,
e continha um núcleo. A sexta linha mostra o número de
células da coleta de sangue de cada paciente que eram CLR
1501+, CD45 -, CD14-, CD34-, CK· - e EpCAM-, e continha um
núcleo.
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Tabela 1. Identificação e Enumeração de Células Tumorais Circulantes em Amostras de Sangue de Pacientes com Vários Tipos de Câncer, Coletadas em Tubos de Coleta Cell Save®
Cell Save® (número) Câncer de Pulmão Câncer de Pulmão Câncer de Tireoide Câncer de Tireoide Câncer de Pulmão Câncer Cervical
101 (1) 101 (2) 102 (1) 102 (2) 103 104 (1)
CTCs (por definição) 0 10 29,980 22,246 6,380 944
CK+ 4,7 M 10 1,0 M 3,5 M 3,3 M 6,8 M
CK+/CLR. 1501+ 4,7 M 10 1,0 M 3,3 M 3,3 M 6,8 M
EpCAM+ 20 41 38,594 24,674 10,610 1,087
EpCAM+/CLR 1501+ 20 31 37,355 24,919 11,139 998
CK-/EpCAM-/CLR15 01+ 1,4 M 121,696 6,7 M 7,9 M 5,3 M 1,3 M
Cell Save® (número) Câncer Cervical Câncer de Mama Carcinoma Câncer Colorretal Câncer Colorretal
104 (2) 106 107 108 (1) 108 (2)
CTCs (por definição) 26 30 1,034 5 30
CK+ 789 60 54,661 5 15,423
GK+/CLR 1501+ 789 60 54,391 5 15,418
EpCAM+ 1069 105 6,968 40 222
EpCAM+/CLR 1501+ 942 75 6, 686 15 109
CK-/EpCAM-/CLR1501+ 36,4 M 278 611,622 1,062 1,1 M
M denota milhões
Tabela 2. Identificação e Enumeração de Células Tumorais Circulantes em Amostras de Sangue de Pacientes com Vários Tipos de Câncer, Coletadas em Tubos de Coleta com EDTA
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EDTA (número) Câncer de Pulmão Câncer de Pulmão Câncer de Tireoide Câncer de Tireoide Câncer de Pulmão
101 (1) 101 (2) 102 (1) 102 (2) 103
CTCs (por definição) 26 0 730 8,808 192
CK+ 1,8 M 0 46,155 16,797 13,290
CK+/CDR 1501+ 1,8 M 0 46,132 16,755 13,012
EpCAM+ 178 0 2,353 10,236 1,517
EpCAM+/CDR 1501+ 153 0 2,720 10,375 1,896
CK-/EpCAM-/CLR1501+ 1,8 M 30,222 1,5 M 10,9 M 2,5 M
EDTA (número) Câncer Cervical Câncer de Mama Carcinoma Câncer Colorretal Câncer Colorretal
104 106 107 108 (1) 108 (2)
CTCs (por definição) 22,965 12 1,896 0 76
CK+ 9,6 M 98 13,805 76 968
CK+/CDR. 1501+ 9,6 M 86 13,788 76 917
EpCAM+ 24,722 17 8,088 662 433
EpCAM+/CDR 1501+ 23,493 17 9,469 382 229
CK-/EpCAM-/CIjR1501+ 4,0 M 19,585 147,641 29,584 753,387
M denota milhões
Resultados [0058] Todas as sete amostras continham CTCs (por definição) detectáveis que apresentaram captação positiva de CLR1501 (comparar linha 1 com as linhas 3, 5 e 6 nas Tabelas 1 e 2) . Uma imagem ilustrativa de citometria de fluxo representando alta captação de CLR1501 em células CD14+ de amostras de sangue do paciente 8 é mostrada na Figura 1. Na Figura 1, o quadrante superior esquerdo indica CD14
Petição 870190036514, de 16/04/2019, pág. 38/81
29/31 /CLR1501+, o quadrante superior direito indica CD14+/CLR1501+, o quadrante inferior direito indica CD14+/CLR1501- e o quadrante inferior esquerdo indica CD14/CLR1501-. No painel A, células negativas para CD45 e CD34 (isto é, possíveis células tumorais circulantes), isoladas a partir do sangue retirado do paciente 108, são mostradas coradas com todos os marcadores, exceto Brilliant Violet™ 785 CD14. As células positivas para CD14 marcadas são mostradas no eixo x e as células positivas para CLR1501 são mostradas no eixo y. O painel A foi utilizado como controle para definir os portões para células positivas Brilliant Violet™ 785 CD14. No painel B, as células negativas para CD45 e CD34, isoladas a partir do sangue retirado do paciente 108, são coradas com todos os marcadores, incluindo Brilliant Violet™ 785 CD14. Tal como mostrado, 99,7% das células positivas para CD14+ também são positivas para CLR1501. Compare a Figura 1, Painel B ao Painel A.
[0059] Além disso, CLR 1501 foi capaz de identificar ~99%-100% de células CK+ (comparar linha 2 e linha 3 da Tabela 1 ou 2) e ~35%-100% de células EpCAM+ (comparar linhas 4 ou linha 5 da Tabela 1 ou 2), em todos os tipos de câncer, independentemente de qual tubo de coleta de sangue foi utilizado. Surpreendentemente, existiu um grande número de células que eram CLR 1501+, mas CK-, EpCAM-, CD45-, CD14-, CD34-, e continham um núcleo (linha 6, Tabelas 1-2) . As células indicadas na linha 6 das Tabelas 1 e 2 não são tipos de células sanguíneas, mas podem ser outras células tumorais que podem possuir expressão diminuída ou inexistente de EpCAM e CK. Muitos cânceres são relatados para expressar marcadores
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30/31 tumorais alternativos, têm expressão heterogênea de EpCAM e/ou CK, ou podem estar passando por transição epitéliomesênquima (EMT) e, assim, perdendo expressão de marcadores epiteliais, Yu (2013), Eichelberg (2013) e Spizzo (2011). Assim, CLR1501 é capaz de identificar células tumorais circulantes que, de outra forma, não seriam detectadas em ensaios únicos e multi-marcadores atuais.
[0060] Os pacientes 101, 102, 104 e 108 tiveram coletas de sangue obtidas antes e depois da terapia (coleta 1 e 2, respectivamente) . O paciente 101 teve uma resposta parcial muito boa à terapia; no entanto, entre as coletas 1 e 2, a contagem de CTC, por definição, deste paciente aumentou de 0 para 10, indicando progressão do câncer (Tabela 1) . Se apenas CK fosse utilizada como um marcador de células tumorais, a contagem de células tumorais do paciente 101 decresceu de 4,7 milhões para 10 (Tabela 1, comparar a coleta 1 com a coleta 2) . Se apenas EpCAM fosse utilizada como marcador de células tumorais, a contagem de células tumorais do paciente 101 aumentou de 20 para 41 (Tabela 1, comparar a contagem 1 com a contagem 2). No entanto, a contagem total de células tumorais do paciente 101 (números CK+ e EpCAM+) diminuiu entre as coletas 1 e 2, indicando que marcadores separados podem representar uma medida mais precisa no que tange a resposta clínica, e que as células tumorais do paciente 101 retratam a expressão heterogênea de CK e EpCAM. Além disso, a contagem do paciente 101 para todas as células CLR 1501+ diminuiu drasticamente entre as coletas 1 e 2. Esta tendência também é vista nos tubos de coleta de sangue com EDTA para o paciente 101 (Tabela 2) . Assim, CLR 1501
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31/31 sozinho pode ser uma medida mais precisa no que tange a resposta clínica em comparação aos ensaios atuais, negando a necessidade de identificação de EpCAM e CK.
[0061] Em geral, o análogo de PLE fluorescente CLR1501 foi usado com sucesso para identificar CTCs a partir de pacientes com câncer de pulmão, tiroide, mama, cervical, carcinoma de células escamosas e colorretal.

Claims (4)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1·Λ<< BlEddói pddBi B®'· :®· /õtdBl® turgotaiíi· sci'rc:úlantbs·; caracterizado pelo fato de que óâmpbeendèir çqlwÕAf·: qtíj q®3íÍBWgv®®:)iB'd um indivíduo em contate com uma composição compreendendo um dnOõgç dét Wdrt fg* :fwfbÍB®did/ ΙΡ-ΟΕ/ι l/igadhl ar EB /biElgd SElçO®®®:/ :Bõ? OB®·: wf E®' /®B· luaiinescsnte e u®a esfera magnética; e :{ii) submeter a afiaostra. de- sangue « á®» sanguíneo .dò indivíduo à microscopic fluorescente ou citometria de em Gue, se o artigo for uita esfera inaqnetica, o amqo é...ligado Αο.,.ίίΒ atravé®' 'dé....úm.. lígant-ê,..
  2. 2. Método, de acordo com a relvindicação I, caracterizado pelo fato de que o airáiogo de PLE ligado a um artigo é selecionado do grupo gue consiste em um compostc
    X.....(CH?)n OPQCH2CH2N(CH.p3
    CL· de fórmula ..(£U. θ (X®.. fóçmula
    X—Ç /)—(CHu(! -OPOCHjCHjNíCH,^ ' '' CL· (11 i , v .() 11:) , fórmula {111) x -(0Μ;>να ~ch2chc HjO-p -och?ch2n(Ch3 h ¥
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    .....v®/<<
    IQC/Qj-'O BsíB VwàSS:â;l;qÚ'|l:â'Í· :<é Xí®·' ®a// wq®® ®® e χ^··· ^x;/® í®á;< W®|úT®3 ?
  3. 3 . .MêtOdOr, di'i dCO.cdc C'OHi. H it S: 1 */.:. : :d 1 Ο·:;ζ:3Ό £../.
    caracterizado ptslo fato de que X é LiXíba rtioléculd loriine s c: e n te. ♦
  4. 4, Método, do acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a molécula luminescente é ura f IcoxótQ.IO .
    P é selecionado independentemenr.® dentre H,
    MétOílo, de ácdrdd dós·: á rèiOúdi ó&gâo caracterizado pele fato de que o análogo de PLe ligado a u;a
    caracterizado pelo fato de que a esfera magnética e sei “C ã onaca <io g r up ? q'.?e ec-ns.:. ?, t e de sstçrss nano-
    caracterizado pelo fato de que o ligante é selecionado do grupo qua consiste era nr:· ligante biotina-escreptavidina, ura ^1/igántes/âcé/pi-díhohâs .........1/igahté/.....Oisgfupe/ wmírw><<· tSÍ®|s a a 1 q u :i. η o, - c a r b c; x 11 a e h 1 d r o x i 1 a e s u s s c omb 1 n a ç c- e s .
    ;clfO Metodõ·/ S:S:: :dei: sAlistes·1' úõiwS: sái: s/rfôiwndihBqâdc :-Ty caracterizado pelo fato de que a unia ou mais células tumorais circulantes são selecionadas do grupo que consiste em câncer dfc mama, câncer de- pulmão, câncer de tireoide, câncer cervical, carcinoma de células escaratsas, câncer de próstata, câncer de pâncreas e célula de câncer colorretal, péiu lússde/-3síbdpâja mói'díp lp··· ®”sué<lú'la<--1τcncc dd/ câiicprc-:
    Método· pWâ: dú.....IBS.....dÉlúâ:aB<<
    circulantes :CTCs) caracterizado pelo fato de que ppmpOêhdés/íãp/ pbqpasssdpgs /11s qpSSAs dáhgúd' Au( ddrM^ídadgúÁhéd/ AA (UM d)ndÍYÍdqp)(<dFÍ::WdntdL®/-dqm(/úisa) ?d©ígpõiá'lgl'®s.....S^t|SO®S·.....Oi <áqá)lqgq íiet /|p§:AÍl®AlllA/ tÚliV ?|i)gqdó'::::<Af:® ?<oBigo ;qéÉ®clgriBdg( <d>·........gilapos (dué) ^cdOWdtA) íüi iÚO? /OTlriOÁí /|·θ4ΑΒ:ο«θΑ//Α//ίϊκο:/ΑΑΤΑ^::θ^ηθΑCAí/ -A íq:}<s <$qhjíípúq;p. :p/ aangud··:.....AW ;AAO-&á /(.-dd· ;Sgrps sarigulnqp/ :dsi .indivíduo a citometria de fluxo ou a usn campo magnético, em que, se o .artigo for uma esfera magnética, c artigo é ligado ao PLE; através de um liquate e a amostra de sangue ou soro do indxvíduo é submetida a um campo magnético e εκ que, se o artigo ê uma molécula luminescente, então a amos t rs oe sangue ou soro sanguíneo Oo irdivuluo e (dé) fluMpls <<........ ............ s<<
    Método, de acordo com a reivindicação caracter!kado pelo fato de que o análogo de. PLE ligado a um artigo é selecionado do grupo que consiste ea um compost.o η1Φ x -~(CH2)n •••OPOCH2CH2N(CH5)3
    4^ th- dAOWle........................................ tidr-.........forOila y—-λ0<::
    X.....,J>.......(CH2)n “OPOCH?CH2N(CH3)3 « .......--·' ...
    X -(CH^ O-CHáCHCHzO-P-OCHgCHíNfCHàh ¥4
    Ο (III) e fóoiuls:
    Οθ x ™ς z>—.(CH zX, -0 “CHjjCHCHja ~P -OCHíCH2N(CH3h 'W'y 4 (ff- >edr(<qneu
    'O3 1/ ÍU/B1® #j-Rs j >>|-ÍÍÁf qgoj
    RÀ é uma alquila; e
    X ·? .nu molécula luminescent^ ou uma esfera magnév.ica.
    13. Método, de acordo com <a reivindicação 1.2, caracterizado pelo faro de que X é uma molécula •Lum ines c. e.n t e <
    14. Método, de· acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a molécula luminescente è uxt flnoróforo.
    15. Método, de acordo cora a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o fluoróforo e selecionadc
    era que cada R é selecionado independenteraente dentre
    16, Método, da acordo com a re i vindicação IS, caracterizado pelo fato de que o análogo de PLE ligado a ur artigo é um composto de fórmula ill; e o fluoróforo é
    caracterizado pelo tato de que X è nina esfera magnética <
    caracterizado pelo fato do que a esfera magnética ]' ,/1'' <’·, ' * < ' 1° t' t ~ m 'í ” · < , '* ' ff ' I Cr’ - ‘ t l
    MSzstCdO::/·:·: ·:·ί1:Ρ' HC©E®:: <ÇQtt< 3<< d/SÇ:
    caracterizado pelo fate de que o Liqante é selecionado do
    ImíjantV' /a-seitadiipona-srSí' -um·' iagaúLes: de /grupo?' ssjrjjwi skskjrj,· ~· ãd®U-dõv-s edappovi/la/se: óíli®WlTa/ :és::vtlé-Ss dqsífâ:ihg:ç8êbis':·
    1® idds-Ã s dê<s teddbdp] [οόίκ]s A) d?®viúddtelçltí/ dtt,: caracterizado pelo f«to de que a υσ>& ou mais CTCs è d®/ oúiít&di dâúcétí :dé< Kfdfd®'dv;<< vfeúst/ .....
    de células escamosas, câncer de próstata, câncer de pâncreas e ama célula de cancer color ratai., uma célula de MÍÍVrpma</:trÚdiiúp.I?p-%é3:':um,g:: ·ρ;ό·1:ύ1Β·: VVbhcpl/dd': vâncéri/, ;Mé:tpdpÇ:; d|>7 apõr-dó/< Bbri· -W ΑΙ:,· caracterizado pelo fato de que a uma ou mais CTCs isc· 1 adas
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