JP2019517266A - 操作されたウイルスベクターは炎症および免疫応答の誘導を低減する - Google Patents

Abstract

改変されたウイルスゲノムは、炎症および免疫抗ウイルス性応答の誘導を低減することができる。このことは、ＮＦ−ｋＢ活性の低減、ウイルス形質導入速度の増加、および導入遺伝子発現の増加において現れる。ウイルスゲノムは、ＴＬＲ９に結合できるがその活性化を誘導しない１つまたは複数のオリゴヌクレオチド配列を取り込むことによって改変される。オリゴヌクレオチド配列は、合成、細菌、ヒト、または任意の他の供給源由来であってもよい。

Description

[01] 本発明は、国立衛生研究所（National Institutes of Health）によって授与されたＨＧ００８５２５に基づく政府支援を受けてなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。

関連出願データ
[02] 本出願は、全ての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み入れられる２０１６年６月８日付けで出願された米国仮出願第６２／３４７，３０２号の優先権を主張する。

発明の技術分野
[03] 本発明は、ウイルスベースの療法の分野に関する。特に、本発明は、組換えウイルスに関する。

[04] 遺伝子療法は、複数のヒト疾患を予防し、処置し、治癒する計り知れない可能性を有する［１］。２０１２年に、Ｇｌｙｂｅｒａ（商標）（アリポジーン・チパルボベック）が、西欧諸国での使用において承認を受けた最初のウイルス遺伝子療法になった［２］。Ｇｌｙｂｅｒａ（商標）は、ウイルスベクターとしてアデノ随伴ウイルス（AAV）を利用して、ヒトリポタンパク質リパーゼ（LPL）遺伝子をＬＰＬ欠損患者の筋肉細胞に送達する［３］。米国および欧州では、多くのＡＡＶ臨床試験が現在進行中であるかまたは計画中である［４〜６］。

[05] ＡＡＶは、およそ５ｋｂの長さの一本鎖直鎖状ＤＮＡゲノムをパッケージングする小型の非エンベロープウイルスであり、遺伝子移入の媒体としての使用に適合されている［４］。ＡＡＶのコード領域は、両端に逆方向末端反復（ITR）を有し、これはＤＮＡ複製の起点として作用し、一次パッケージングシグナルとして役立つ［７、８］。プラスおよびマイナス鎖の両方が、等しく良好にビリオンにパッケージングされ、感染が可能である［９〜１１］。加えて、２つのＩＴＲの一方における小さい欠失があると、自己相補的なベクターのパッケージングが可能になり、ウイルスが脱外被した後にゲノムが自己アニールする。この結果、細胞のより効率的な形質導入が起こるが、コード化能力は半分に低下する［１２、１３］。ＡＡＶはいかなるヒト疾患にも関連しないが、ヒトの＞７０％が、１つのまたはほとんどの血清型に関して血清陽性である［１４、１５］。ＡＡＶベクターの典型的な経路投与としては、静脈内、筋肉内、網膜下および頭蓋内注射が挙げられる。ＡＡＶ遺伝子療法は、ほとんどの場合、野生型遺伝子を送達して単一遺伝子による疾患を処置するために使用されており、ＡＡＶベクターは、肝臓、骨格および心筋、網膜ならびに中枢神経系中の細胞を形質導入するのに使用されてきた［１６〜２６］。加えて現在、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９遺伝子編集を送達したり、またはヒト免疫不全ウイルス（HIV）およびインフルエンザＡウイルスなどの感染症に対する広域中和抗体を送達したりするためにＡＡＶを使用することに関心が高まりつつある［２７〜３２］。

[06] 遺伝子療法における数々の進歩にもかかわらず、主要な懸念は、ウイルスベクターによって惹起される炎症応答である［３３、３４］。これは、１９９９年にＪｅｓｓｅ Ｇｅｌｓｉｎｇｅｒが臨床試験中にアデノウイルスでの遺伝子療法の４日後に過剰な炎症により死亡したときの広く報道された症例によって最もよく例示される［３５］。ＡＡＶは、アデノウイルスと比較してかなり弱い炎症を惹起することが示されているが［３６、３７］、Ｇｌｙｂｅｒａ（商標）療法はそれでもなお、Ｇｌｙｂｅｒａ（商標）投与の３日前から始める１２週間の免疫抑制を包含する［３８］。これらの免疫抑制薬および抗炎症薬（サイクロスポリンＡ、ミコフェノール酸モフェチル、およびメチルプレドニゾロン）は、処置中に患者の免疫系を弱めるが、それでもなお全ての患者が、ＡＡＶキャプシドに対する中和抗体を発生させ、将来的な再投与の妨げになる。さらに、多くのＡＡＶ遺伝子療法の臨床試験は、免疫抑制を予防的に利用しておらず、炎症または組織の傷害の兆候があるときにコルチコステロイドを投与するだけであり、これが、治療効能のばらつきに関連してきた［２２、２３］。興味深いことに、ＡＡＶベクターは、炎症および免疫応答を誘発するその能力に従って、感染症およびがんに対するワクチン媒体としても開発されている［３９〜４１］。

[07] 炎症は、成功したＡＡＶ媒介導入遺伝子発現の重要な決定要素としての関連が示されている。マウスにＡＡＶを投与した後、腫瘍壊死因子（TNF）の上方調節などの全身性炎症を人工的に誘導すると、肝臓における導入遺伝子発現の低下が起こったことが研究から見出された［４２］。これは、十分な炎症応答がある場合、ＡＡＶによってコードされた導入遺伝子に対する免疫寛容が壊される可能性があることを示す。別の研究は、ＡＡＶ感染後のマウス肝臓における炎症を特徴付け、血清中の肝臓の酵素における一過性の増加を見出しており、肝臓の病理も、門脈および小葉の炎症と一致している［４３］。驚いたことに、著者は、ＡＡＶｒｈ．３２．３３ウイルスの使用は、他の試験されたＡＡＶ血清型より高次の肝臓酵素を誘導したが、導入遺伝子発現の検出レベル未満への低下も引き起こすことを観察しており、ここでも炎症および免疫応答は、導入遺伝子発現の不良に関連があることが示唆される。

[08] 血友病Ｂの臨床試験において、患者のサブセットは、肝臓酵素の増加を呈示したこと、およびこの一過性の高トランスアミナーゼ血症は、導入遺伝子によってコードされた第ＩＸ因子のレベルの低下を伴っていたことが観察されている［２２、２３］。高トランスアミナーゼ血症を有する患者に、コルチコステロイド療法の漸減コースを使用したところ、それに続いて血清中のアミノトランスフェラーゼレベルが正常化し、第ＩＸ因子発現のさらなる低下が元に戻った。総合すると、これらの観察は、ＡＡＶによって形質導入された肝細胞の免疫介在性の破壊と合致しており、ＡＡＶ投与によって誘発された炎症および免疫応答は、安全性に対する懸念であり、ヒトにおける治療効能を妨げる可能性があることが実証される。したがって、本質的に炎症の惹起を回避するウイルスベクターを開発することが有利であると予想される。さらに、薬物を用いた全身性の免疫抑制の代わりに、特異的な免疫応答の誘発を回避することは有益であると予想される。

[09] これまでに、ＡＡＶのＤＮＡゲノムは、ＡＡＶがエンドサイトーシス経路を介して細胞に侵入している間にＴｏｌｌ様受容体９（TLR9）によって感知されることが示されている［３６、４４］。ＴＬＲ９は、Ｂ細胞、単球、マクロファージおよび形質細胞様樹状細胞などの免疫細胞のエンドソームの膜で見出されるパターン認識受容体（PRR）であり、ＡＡＶゲノムに見出される非メチル化ＣｐＧモチーフに結合する［４５、４６］。これはＴＬＲ９の二量体化を引き起こし、ＮＦ−ｋＢ（p52-RelA複合体としても公知）を活性化するシグナル伝達のカスケードを誘発し、Ｉ型インターフェロン（IFN）を誘導する。ＮＦ−ｋＢは順に、炎症および免疫細胞動員を引き起こすＴＮＦなどの複数の炎症促進性サイトカインの転写の上方調節を駆動させ、一方で分泌されたＩＦＮは、多数のインターフェロン刺激遺伝子（ISG）の発現を誘導し、抗ウイルス性の状況を確立する。重要なことに、マウスにおけるＴＬＲ９の遺伝学的除去は、肝臓におけるＡＡＶ処置の際の炎症性サイトカインの誘導をなくし、ＡＡＶに対する抗体およびＴ細胞の形成も低減する［３６］。したがって、ＴＬＲ９は、ＡＡＶ感染中の初期の炎症および自然免疫応答を刺激することにおいて重要な役割を果たし、これはまた、適応免疫の刺激にも寄与する。最終的に、２つの他のパターン認識受容体であるＴＬＲ２およびＴＬＲ４が、ＡＡＶ構造タンパク質に対する応答の誘発に関与している［４７、４８］。

[10] ＴＬＲ９の分野において、細胞培養中のＴＬＲ９活性化を遮断するのに一般的に使用されるツールは、ＴＬＲ９と結合するがそれを活性化しない短い一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドである［４９、５０］。数々のこのような配列が公知であり、その一部は合成の配列や生物由来の他の配列であるが、これらは配列相同性を有さないことが多い［５１〜５９］。構造的な研究から、いかにして阻害性オリゴヌクレオチドがＴＬＲ９と固く結合する一方で、ＴＬＲ９活性化および下流のシグナル伝達に必要なＴＬＲ９の二量体化を誘発しないかが解明された［６０］。ＴＬＲ９と直接結合してその活性化を弱めることに加えて、ＴＬＲ９活性化またはＴＬＲ９によって媒介される炎症を遮断する他のメカニズムが仮定されたり、または他のＴＬＲ９阻害性オリゴヌクレオチドに関して示されたりしている［４９で総説されている］。そのようなメカニズムとしては、受容体媒介エンドサイトーシスもしくは貪食に関する競合、ＴＬＲ９トラフィッキングもしくは機能的に活性な生成物へのＴＬＲ９プロセシングの阻害、エンドソームでの酸性化もしくはエンドソーム中の主要なプロテアーゼの活性の阻害、またはＴＬＲ９下流におけるシグナル伝達タンパク質の遮断が挙げられる。これらの阻害性オリゴヌクレオチドが、細胞培養培地中でＴＬＲ９リガンド（例えばDNAウイルス、またはCpG含有オリゴヌクレオチドなど）と共にイントランスで供給される場合、それらはエンドサイトーシスによって取り込まれ、ＴＬＲ９に結合することができ、刺激性リガンドによってその活性化を予防する。イントランスでの阻害性オリゴヌクレオチドの補充は、免疫学実験で広く採用されているが、ウイルスゲノムにこれらの配列を取り込むことが、炎症および免疫応答の惹起を回避することを可能にするかどうかは、当分野では不明である。

[11] ＡＡＶは、アデノウイルスと比較してかなり弱い炎症応答を惹起することが示されているが、Ｇｌｙｂｅｒａ（商標）アリポジーン・チパルボベック処置はそれでもなお、Ｇｌｙｂｅｒａ（商標）アリポジーン・チパルボベック投与の３日前から始める１２週間の免疫抑制を包含する。これらの免疫抑制薬はＴ細胞活性化を強く妨げることから、処置中に患者の免疫系を弱める。投与のときに、炎症応答を回避し、低減された炎症応答を惹起するかまたは炎症応答を惹起しないウイルスベクターを操作することが有利であると予想される。さらに、免疫抑制が全身性ではないこと、およびそれが一過性であることが有益であると予想される。炎症および免疫応答を予防することはまた、導入遺伝子発現を改善することができ、将来的な目的のためにウイルスベクターの再投与することも許容する可能性がある。

[12] 当技術分野において生物学的な生成物の療法およびインビボにおける生産に関するウイルスベクターの効能を改善することが引き続き必要である。

[13] 本発明の一態様によれば、核酸分子が提供される。核酸分子は、ＴＬＲ９に結合するがＴＬＲ９の活性化を誘発しない阻害性核酸配列に共有結合で連結されたウイルスゲノムを含む。

[14] 別の態様によれば、哺乳動物細胞に所望の機能を送達するための組換えウイルスが提供される。組換えウイルスは、ＴＬＲ９に結合するがＴＬＲ９の活性化を誘発しない阻害性核酸配列に共有結合で連結されたウイルスゲノムを含む。

[15] 別の実施態様は、哺乳動物を処置する態様である。本方法は、組換えウイルスをそれを必要とする哺乳動物に投与する工程を含む。組換えウイルスは、ＴＬＲ９に結合するがＴＬＲ９の活性化を誘発しない阻害性核酸配列に共有結合で連結されたウイルスゲノムを含む。

[16] さらに別の態様は、組換えウイルスのウイルスゲノムを作製する方法である。阻害性核酸配列は、ウイルスゲノムに挿入されている。阻害性核酸配列は、ＴＬＲ９に結合するがＴＬＲ９の活性化を誘発しない。

[17] 一態様によれば、核酸分子が提供される。核酸分子は、逆方向末端反復（ITR）およびＴＬＲ９によって媒介される炎症を阻害する核酸配列を含む。

[18] 本発明の別の態様は、核酸分子である。前記分子は、ＴＬＲ９によって媒介される炎症を阻害する阻害性核酸配列に共有結合で連結されたウイルスゲノムを含む。

[19] 本発明のさらに別の態様は、哺乳動物細胞に所望の機能を送達するための組換えウイルスである。組換えウイルスは、ＴＬＲ９によって媒介される炎症を阻害する阻害性核酸配列を含むウイルスゲノムを含む。

[20] 本発明のさらに別の態様は、組換えウイルスのウイルスゲノムを作製する方法である。核酸配列が、ウイルスゲノムに挿入される。核酸配列は、ＴＬＲ９によって媒介される炎症を阻害する。

[21] 本発明の別の態様によれば、核酸ベクターが提供される。前記ベクターは、少なくとも１つの核酸配列を含む。前記核酸配列は、ＴＬＲ９によって媒介される炎症を阻害することが可能である。

[22] 本発明の別の態様は、ゲノムを有する改変されたウイルスの免疫原性を低減する方法である。本方法は、ゲノムに核酸配列を挿入する工程を含む。核酸配列は、ＴＬＲ９によって媒介される炎症を阻害する。改変されたウイルスは、阻害性配列を含有しないウイルスと比較して、宿主における炎症応答の低減を引き起こす。

[23] 本発明のさらに別の態様は、ウイルスによって導入された導入遺伝子の宿主細胞における発現を増加させる方法である。本方法は、ゲノムを有する改変されたウイルスを宿主に導入する工程を含む。ゲノムは、核酸配列を含む。核酸配列は、ＴＬＲ９によって媒介される炎症を阻害する。改変されたウイルスは、阻害性配列を含有しないウイルスと比較して、宿主細胞におけるより高い導入遺伝子発現をもたらす。

[24] 本発明のさらに別の態様は、ＴＬＲ９によって媒介される炎症を阻害する核酸配列をキャプシド封入しているウイルスキャプシドを含む組成物である。

[25] 当業者が明細書を読めば明らかであると予想されるこれらのおよび他の態様および実施態様は、ウイルスベクターおよびビリオンで哺乳動物をよりよく処置するための、さらに、宿主細胞、宿主組織、および宿主動物中で導入遺伝子の生成物を生産するためにウイルスベクターおよびビリオンをよりよく使用するためのツールを当技術分野に提供する。

[26] 上述した様々な態様は、以下の特徴のいずれとも組み合わせることができる。

[27] ウイルスゲノムは、アデノ随伴ウイルス（AAV）ゲノムであってもよい。

[28] ウイルスゲノムは、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、水痘、天然痘ウイルス、Ｂ型肝炎、サイトメガロウイルス、ＪＣポリオーマウイルス、ＢＫポリオーマウイルス、サル痘ウイルス、帯状疱疹、エプスタイン−バーウイルス、ヒトヘルペスウイルス７型、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス、およびヒトパルボウイルスＢ１９からなる群から選択することができる。

[29] ウイルスゲノムは、一本鎖であってもよい。

[30] ウイルスゲノムは、ビリオン中にパッケージングされていてもよい。

[31] ウイルスゲノムは、ヒト細胞中で発現可能な遺伝子を含んでいてもよい。

[32] ウイルスゲノムは、標的腫瘍細胞を溶解するための細胞毒性ウイルスであってもよい。

[33] 阻害性核酸配列は、ｃ４１オリゴヌクレオチド配列ＴＧＧＣＧＣＧＣＡＣＣＣＡＣＧＧＣＣＴＧ（配列番号１）を含んでいてもよい。

[34] 阻害性核酸配列は、ｃ４１配列（配列番号１）の複数のコピーを含んでいてもよい。

[35] 阻害性核酸配列は、リンカー配列によって分離されたｃ４１配列（配列番号１）の２つのコピーを含んでいてもよい。

[36] リンカー配列は、ＡＡＡＡＡ（配列番号８）である。

[37] 阻害性核酸配列は、
ODN 2088: TCC TGG CGG GGA AGT（配列番号２）；
ODN 4084-F: CCTGGATGGGAA（配列番号３）；
ODN INH-1: CCTGGATGGGAATTCCCATCCAGG（配列番号４）；
ODN INH-18: CCT GGA TGG GAA CTT ACC GCT GCA（配列番号５）；
ODN TTAGGG: TT AGG GTT AGG GTT AGG GTT AGG G（配列番号６）；および
G-ODN: CTC CTA TTG GGG GTT TCC TAT（配列番号７）
からなる群から選択することができる。

[38] 阻害性核酸配列は、細菌配列であってもよい。

[39] ウイルスゲノム、組換えウイルス、ベクター、または核酸配列は、非ヒト遺伝子を含んでいてもよい。

[40] 阻害性核酸配列は、ウイルスゲノムの３’非翻訳領域の下流またはその中に挿入されていてもよい。

[41] ウイルスゲノムは、ホスホジエステル結合によって阻害性核酸配列に共有結合で連結されていてもよい。

[42] ウイルスゲノム、組換えウイルス、ベクター、または核酸配列は、検出可能なマーカーを含んでいてもよい。

[43] 検出可能なマーカーは、誘導性であってもよい。

[44] 阻害性核酸配列は、配列番号９に示されるヒトテロメア配列を含んでいてもよい。

[45] ウイルスゲノムは、自己相補的であってもよい。

[46] ウイルスゲノムは、複数の阻害性核酸配列に共有結合で連結されていてもよい。

[47] 複数の阻害性核酸配列は、阻害性配列およびその逆相補物を含んでいてもよい。

[48] 阻害性核酸配列は、ｃ４１配列（配列番号１）の３つのコピーを含んでいてもよく、各コピーは、リンカー配列によって分離されている。

[49] 阻害性核酸配列は、
ODN 2114: TCCTGGAGGGGAAGT（配列番号１６）；
ODN 4024: TCCTGGATGGGAAGT（配列番号１７）；
ODN INH-4: TTCCCATCCAGGCCTGGATGGGAA（配列番号１８）；
ODN INH-13: CTTACCGCTGCACCTGGATGGGAA（配列番号１９）；
ODN Poly-G: GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG（配列番号２０）；
ODN GpG: TGACTGTGAAGGTTAGAGATGA（配列番号２１）；
ODN IRS-869: TCCTGGAGGGGTTGT（配列番号２２）；
ODN IRS-954: TGCTCCTGGAGGGGTTGT（配列番号２３）；および
ODN 21158: CCTGGCGGGG（配列番号２４）
からなる群から選択することができる。

[50] 阻害性核酸配列は、ＯＤＮ ＴＴＡＧＧＧ（配列番号６）であってもよい。

[51] 阻害性配列は、リンカーに共有結合で連結されていてもよい。

[52] 阻害性配列は、リンカーの上流にあってもよい。

[53] 阻害性核酸配列は、ＯＤＮ ＴＴＡＧＧＧ（配列番号６）の複数のコピーを含んでいてもよい。

[54] ＯＤＮ ＴＴＡＧＧＧ（配列番号６）の複数のコピーはそれぞれ、リンカーによって分離されていてもよい。

[55] 阻害性核酸配列は、ＯＤＮ ＴＴＡＧＧＧ（配列番号６）の、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つのコピーを含んでいてもよく、各コピーは、リンカーによって分離されている。

[56] 阻害性核酸配列は、ヒト配列であってもよい。

[57] ウイルスゲノム、組換えウイルス、ベクター、または核酸配列は、非ヒト核酸配列を含んでいてもよい。

[58] ウイルスゲノム、組換えウイルス、ベクター、または核酸配列は、ヒト遺伝子を含んでいてもよい。

[59] ウイルスゲノム、組換えウイルス、ベクター、または核酸配列は、ヒト核酸配列を含んでいてもよい。

[60] 阻害性核酸配列は、ウイルスゲノムの５’非翻訳領域中に挿入されていてもよい。

[61] 阻害性核酸配列は、ウイルスゲノムのプロモーターの上流に挿入されていてもよい。

[62] ウイルスゲノム、組換えウイルス、ベクター、または核酸配列は、誘導性プロモーターを含んでいてもよい。

[63] 阻害性核酸配列は、配列番号１の２つの反復した単量体を含んでいてもよい。

[64] 阻害性核酸配列は、配列番号１の３つの反復した単量体を含んでいてもよい。

[65] 阻害性核酸配列は、配列番号６または配列番号９を含んでいてもよい。

[66] 阻害性核酸配列は、配列番号６または配列番号９の３つの反復した単量体を含んでいてもよい。

[67] 阻害性核酸配列は、配列番号６または配列番号９の５つの反復した単量体を含んでいてもよい。

[68] 投与する工程は、反復されてもよい。

ウイルスゲノムは、ビリオン中にパッケージングされていてもよい。

[70] 挿入する工程は、ＤＮＡリガーゼを利用してもよい。

[71] ウイルスゲノムは、ビリオン中にあるときに一本鎖であってもよい。

[72] 組換えウイルスのウイルスゲノムは、ヒト細胞への送達およびヒト細胞中での発現のための遺伝子を含んでいてもよい。

[73] ウイルスゲノム、組換えウイルス、ベクター、または核酸配列は、核酸配列のそれぞれを分離するリンカーを含んでいてもよい。

[74] ウイルスゲノム、組換えウイルス、ベクター、または核酸配列は、核酸配列の、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つのコピーを含んでいてもよい。

[75] 阻害性核酸は、遺伝子に共有結合で連結されていてもよい。

[76] 阻害性核酸配列は、ｃ４１オリゴヌクレオチド配列ＴＧＧＣＧＣＧＣＡＣＣＣＡＣＧＧＣＣＴＧ（配列番号１）と９５％同一であってもよい。

[77] 阻害性核酸配列は、配列番号９と９５％同一であってもよい。

[78] 阻害性核酸配列は、
ODN 2088: TCC TGG CGG GGA AGT（配列番号２）；
ODN 4084-F: CCTGGATGGGAA（配列番号３）；
ODN INH-1: CCTGGATGGGAATTCCCATCCAGG（配列番号４）；
ODN INH-18: CCT GGA TGG GAA CTT ACC GCT GCA（配列番号５）；
ODN TTAGGG: TT AGG GTT AGG GTT AGG GTT AGG G（配列番号６）；および
G-ODN: CTC CTA TTG GGG GTT TCC TAT（配列番号７）
からなる群から選択される配列と９５％同一であってもよい。

[79] 阻害性核酸配列は、
ODN 2114: TCCTGGAGGGGAAGT（配列番号１６）；
ODN 4024: TCCTGGATGGGAAGT（配列番号１７）；
ODN INH-4: TTCCCATCCAGGCCTGGATGGGAA（配列番号１８）；
ODN INH-13: CTTACCGCTGCACCTGGATGGGAA（配列番号１９）；
ODN Poly-G: GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG（配列番号２０）；
ODN GpG: TGACTGTGAAGGTTAGAGATGA（配列番号２１）；
ODN IRS-869: TCCTGGAGGGGTTGT（配列番号２２）；
ODN IRS-954: TGCTCCTGGAGGGGTTGT（配列番号２３）；および
ODN 21158: CCTGGCGGGG（配列番号２４）
からなる群から選択される配列と９５％同一であってもよい。

[80] 阻害性核酸配列は、配列番号６および／または配列番号９の複数のコピーを含んでいてもよい。

[81] 阻害性核酸配列は、リンカー配列によって分離された配列番号６および／または配列番号９の２つのコピーを含んでいてもよい。

[82]ウイルス遺伝子療法ならびに炎症および免疫応答の概略図である。 [83]ＴＬＲ９がウイルス侵入ならびに炎症および免疫応答の間にＡＡＶのＤＮＡを感知することを示す概略図である。Ｒｏｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，“Ｉｎｎａｔｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ＡＡＶ Ｖｅｃｔｏｒｓ，”ｖｏｌ．２，ａｒｔｉｃｌｅ １９４より。 [84]一本鎖オリゴヌクレオチドであるｃ４１（配列番号１）のヌクレオチド配列を示す図である。 ＡＡＶ−ｅＧＦＰおよびＡＡＶ−ｅＧＦＰ−ｃ４１ゲノムの構成を示す図である。ＩＴＲ、逆方向末端反復；ＬＰＡ、後期ポリアデニル化シグナル。このケースにおいて描写された目的の導入遺伝子は、ｅＧＦＰである。挿入は、ｃ４１配列の挿入である。図３Ｂに描写されたスペーサーは、配列番号８に示される。 [85]模擬感染させた、またはＡＡＶウイルス（DJキャプシド、自己相補的なAAVゲノム、eGFPをコードする）で感染させたＨＥＫ２９３ ＴＬＲ９細胞におけるＮＦ−ｋＢ活性を示す図である。^＊＊、ｐ＜０．００５；ｎ．ｓ．、有意ではない。この実験は粗製ウイルス調製物を使用した。 [86]模擬感染させた、またはｃ４１含有もしくは非含有のＡＡＶウイルスで感染させたＨＥＫ２９３ ＴＬＲ９細胞におけるＧＦＰ発現を示すフローサイトメトリーのヒストグラムを示す図である。この実験は粗製ウイルス調製物を使用した。 [87]「テロメア」（配列番号９）のヌクレオチド配列を示す図であり、これは、哺乳動物テロメア由来の（ＴＴＡＧＧＧ）_４（配列番号６）モチーフを含有する一本鎖オリゴヌクレオチドである。 ＡＡＶ−ｅＧＦＰ−テロメアのゲノムの構成を示す図である。挿入は、「テロメア」配列の挿入である。図６Ｂに示されるスペーサーは、配列番号８である。 [88]フローサイトメトリーによって分析された、類似の量の示されたＡＡＶウイルスを用いたＢ細胞株感染の２日後の形質導入された細胞（GFP+）のパーセンテージを示す図である。 ＥＬＩＳＡによってアッセイされた、感染の１８時間後における初代ヒトＣＤ１４＋単球の上清中のＴＮＦ産生を示す図である。 [89]自己相補的なＡＡＶベクターの操作を示す図である。「ｃ４１」および「テロメア」のＤＮＡ配列。 自己相補的なＡＡＶベクターの操作を示す図である。ＡＡＶベクター（scAAV-eGFP）および改変されたベクターのゲノム構成。ＬｐＡ：ポリＡシグナル。 [90]インビトロでのヒト免疫細胞における様々なＡＡＶベクターに対する炎症応答を示す図である。初代ヒトマクロファージをＡＡＶ２ウイルス（MOI：１０^５ｖｇ／細胞）で感染させ、１８時間後に上清を収集し、ＥＬＩＳＡによってＴＮＦレベルに関して分析した。５ｕＭのＯＤＮ２００６は、陽性対照として役立つＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドである。 ２人の異なるドナーからの初代ヒトＣＤ１４＋単球を（Ａ）と同様にして感染させ、ＴＮＦレベルに関して分析した。示したデータは、ｎ＝３の技術的反復の平均±ｓ．ｄ．である。^＊ｓｃＡＡＶ−ｅＧＦＰと比較した場合のＰ＜０．０５（対応のないt検定）。 ２人の異なるドナーからの初代ヒトＣＤ１４＋単球を（Ａ）と同様にして感染させ、ＴＮＦレベルに関して分析した。示したデータは、ｎ＝３の技術的反復の平均±ｓ．ｄ．である。^＊ｓｃＡＡＶ−ｅＧＦＰと比較した場合のＰ＜０．０５（対応のないt検定）。 [91]ＡＡＶベクターのさらなる特徴付けを示す図である。「対照」のＤＮＡ配列。 改変されたベクターのゲノム構成を示す図である。 初代ヒトマクロファージを（図９Ａ）と同様にしてＡＡＶ２ウイルスで感染させ、ＥＬＩＳＡによってＴＮＦレベルに関して分析した。 初代ヒト単球を（図９Ｂ、図９Ｃ）と同様にして感染させ、ＥＬＩＳＡによってＴＮＦレベルに関して分析した。示したデータ（図１０Ｃ、図１０Ｄ）は、ｎ＝３の技術的反復の平均±ｓ．ｄ．である。^＊ｓｃＡＡＶ−ｅＧＦＰと比較した場合のＰ＜０．０５（対応のないt検定）。 成体Ｃ５７ＢＬ／６マウスを（図１２Ａ、図１２Ｂおよび図１２Ｃ）と同様にして示されたＡＡＶ２ウイルスで感染させ、肝臓の断片を、ｑＲＴ−ＰＣＲによって、示された遺伝子発現に関して分析した。示したデータは、条件１つ当たりｎ＝５匹のマウスの平均±ｓ．ｄ．であり、ただしｓｃＡＡＶ−ｅＧＦＰ−３×対照の場合はｎ＝３匹のマウスである。^＊食塩水条件と比較した場合のＰ＜０．０５（対応のないt検定）。ｎ．ｓ．：有意ではない（Ｐ＞０．０５）。 [92]両方のＡＡＶ２ウイルスの異なるロットを使用した初代ヒトマクロファージを（図９Ａ）と同様にして感染させ、ＴＮＦレベルに関して分析した。 ＨｅＬａ細胞に示されたＭＯＩでＡＡＶ２ウイルスを感染させ、４８時間後細胞を回収し、フローサイトメトリーによってＧＦＰ発現に関して分析した。ＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージが示され、示されたデータは、ｎ＝３の技術的反復の平均±ｓ．ｄ．である。^＊ｓｃＡＡＶ−ｅＧＦＰと比較した場合のＰ＜０．０５（対応のないt検定）。 [93]インビボでの成体マウスにおける様々なＡＡＶベクターの静脈内投与に対する炎症応答を示す図である。（図１２Ａ、図１２Ｂおよび図１２Ｃ）成体Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、尾静脈注射により、示されたＡＡＶ２ウイルス（マウス１匹当たり１０^１１ｖｇ）で感染させた。２時間後、動物を安楽死させ、肝臓の断片を、ｑＲＴ−ＰＣＲによって、示された遺伝子発現に関して分析した。食塩水注射を、各遺伝子につき１倍の発現に設定した。示したデータは、条件１つ当たりｎ＝３匹のマウス（図１２Ａ）または条件１つ当たりｎ＝４匹のマウス（図１２Ｂおよび図１２Ｃ）の平均±ｓ．ｄ．である。^＊食塩水条件と比較した場合のＰ＜０．０５（対応のないt検定）。ｎ．ｓ．：有意ではない（Ｐ＞０．０５）。 [94]一本鎖ＡＡＶベクター（ssAAV-eGFP）およびｓｓＡＡＶ−ｅＧＦＰ−５ｘテロメアのゲノム構成を示す図である。 [95]インビボでの新生児マウスにおける様々なＡＡＶベクターの網膜下投与後の炎症および免疫応答を示す図である。（図１４Ａ、図１４Ｂおよび図１４Ｃ）新生児ＣＤ１マウス（P1）に、網膜下注射によって示されたＡＡＶ８ウイルス（マウスの眼１つ当たり１．８×１０^８ｖｇ）を与えた。Ｐ２１で動物を安楽死させ、解剖して眼杯を取り出した。網膜と眼杯の残部を、ｑＲＴ−ＰＣＲによって、示された遺伝子発現に関して分析した。各遺伝子につき、食塩水注射を１倍の発現に設定した。三角形はそれぞれ動物を表す。示したデータは、ｎ＝３匹のマウス（食塩水）およびｎ＝５匹のマウス（各ウイルスにつき）であり、平均値が示される。 [96]インビボでの新生児マウスにおける様々なＡＡＶベクターの網膜下投与後の網膜中の免疫細胞マーカーの分析を示す図である。（図１５Ａ、図１５Ｂおよび図１５Ｃ）（図１４Ａ〜１４Ｃ）と同様に、網膜を、ｑＲＴ−ＰＣＲによって、示された遺伝子発現に関して分析した。Ａｉｆ１（Iba1）は、小グリア細胞で発現されることが公知であり、一方でＣｄ４およびＣｄ８ａは、それぞれヘルパーおよび細胞溶解性Ｔ細胞のマーカーである。各遺伝子につき、食塩水注射を１倍の発現に設定した。三角形はそれぞれ動物を表す。示したデータは、ｎ＝３匹のマウス（食塩水）およびｎ＝５匹のマウス（各ウイルスにつき）であり、平均値が示される。 [97]眼におけるＧＦＰ発現を示す図である。新生児ＣＤ１マウス（P1）に、網膜下注射によって示されたＡＡＶ８ウイルス（マウスの眼１つ当たり１．８×１０^８ｖｇ）を与えた。Ｐ３０で動物を安楽死させ、平坦にマウントした眼杯中のＧＦＰ発現を可視化した。示したデータは、条件１つ当たりｎ＝２匹のマウスである。 [98]一本鎖オリゴヌクレオチドであるｃ４１（配列番号１）のヌクレオチド配列を示す図である。 ＡＡＶ−ｅＧＦＰおよびＡＡＶ−ｅＧＦＰ−ｃ４１ゲノムの構成を示す図である。ＩＴＲ、逆方向末端反復；ＬＰＡ、後期ポリアデニル化シグナル。このケースにおいて描写された目的の導入遺伝子は、ｅＧＦＰである。挿入は、ｃ４１配列の挿入である。図１７Ｂに描写されたスペーサーは、配列番号８に示される。 [99]「テロメア」（配列番号９）のヌクレオチド配列を示す図であり、これは、哺乳動物テロメア由来の（ＴＴＡＧＧＧ）_４（配列番号６）モチーフを含有する一本鎖オリゴヌクレオチドを示す図である。 ＡＡＶ−ｅＧＦＰ−テロメアのゲノムの構成を示す図である。挿入は、「テロメア」配列の挿入である。図１８Ｂに示されるスペーサーは、配列番号８である。

[100] 本発明者らは、宿主免疫および炎症系に対するそれら自身の保護を含むウイルスベクターおよびビリオンを開発した。これらのベクターおよびビリオンは、哺乳動物細胞において炎症および免疫応答を活性化する宿主タンパク質であるＴｏｌｌ様受容体９（TLR9）の活性化を阻害する短い核酸配列を有する。

[101] ＴＬＲ９阻害のための短いヌクレオチド配列は、任意の起源のものでもよい。このような配列は、細菌、ヒト、合成、または他の供給源由来であってもよい。１つの特定の配列は、２０ヌクレオチドの長さを有する緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）由来の「ｃ４１」［ＴＧＧＣＧＣＧＣＡＣＣＣＡＣＧＧＣＣＴＧ（配列番号１）］である。別の特定の配列は、ヒトテロメア由来の配列であり、（ＴＴＡＧＧＧ）_４（配列番号６）を含む。他の阻害性配列は、配列番号２〜５、７、９、および１６〜２４に示される。これらの配列と少なくとも８０％の相同性／同一性を有する阻害性配列も使用することができる。これらの配列と、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、および／または少なくとも９９％の相同性／同一性を有する阻害性配列も使用することができる。阻害性配列の複数のコピーは、タンデム式のアレイで、またはウイルスベクター中においてスペーサーもしくはリンカー配列またはウイルスゲノムの他の部分によって分離された状態のいずれかで使用することができる。一部の実施態様において、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、１５個、または２０個のコピーが使用される。一部の実施態様において、阻害性配列の１つまたは複数のコピーがウイルスゲノムのプラス鎖上にあり、一部がウイルスゲノムのマイナス鎖上にある。

[102] 阻害性オリゴヌクレオチド配列は、別々の物質としてではなく、ウイルスゲノムまたはビリオンの一部として宿主細胞に導入される。それにより、オリゴヌクレオチド配列の作用は、全身性ではなく局所的になる。さらに、数週間続く可能性がある薬物での免疫抑制とは異なり、免疫回避は、ＡＡＶまたは他のウイルスが侵入する間に起こることから一過性である。加えて、有益なアンタゴニスト活性が、ウイルスまたはウイルスゲノムの近傍で起こる必要性がある場所で生じることが確認されている。宿主細胞中でウイルスまたはウイルスゲノムが複製されない場合、オリゴヌクレオチドの作用は一過性ということになる。ウイルスまたはウイルスゲノムが複製される場合、その作用は、複製と同一の領域で生じているということになる。

[103] 阻害性核酸配列は、組換えＤＮＡ工学の任意の手段を使用してウイルスゲノムに挿入することができる。これは、インビトロまたはインビボでの組換えを含んでいてもよい。インビトロでの組換えは、例えば、ＤＮＡリガーゼまたは他の核酸を合体させる酵素を使用して達成することができる。インビボでの組換えは、相同性を有する別々のドナー分子で宿主細胞を共形質転換し、それにより宿主細胞の機構を使用してそれらを組み換えることによって達成することができる。代替として、インビボで、単一のドナー分子を宿主細胞配列で組み換えてもよい。これらのアプローチの組合せも使用することができる。典型的には、挿入は、１つのデオキシリボヌクレオチドの別のデオキシリボヌクレオチドへの標準的な連結（ホスホジエステル結合）を含むと予想される。しかしながら、阻害性核酸配列とウイルスゲノムの残部との間に標準的ではない連結が使用される環境もあり得る。任意選択により、阻害性核酸配列は、ウイルスゲノムの非翻訳領域中に配置される。

[104] ゲノムは、任意選択により治療的遺伝子および／またはマーカー遺伝子を含有していてもよい。典型的には、この遺伝子は、非ウイルス遺伝子、またはウイルスゲノム中に天然に存在しない遺伝子であると予想される。このような遺伝子は、哺乳動物宿主細胞または動物中で発現可能であってもよい。発現は、ウイルスプロモーターまたは遺伝子と共に導入されるプロモーターの制御下であってもよい。発現は、例として、誘導性、抑制性、条件応答性、または構成的であってもよい。治療的遺伝子は、宿主に有益なＲＮＡまたはタンパク質生成物をコードするものである。利益は、例えば、健康状態を改善すること、感染から保護すること、または欠陥を是正することであり得る。マーカーは、ウイルスまたはその生成物もしくは構成要素の、配置、複製のレベル、伝播のレベル、転写のレベル、または翻訳のレベルを追跡することを可能にする。好適なマーカーとしては、容易に検出可能なもの、例えば蛍光タンパク質、クロモジェニックタンパク質などが挙げられる。任意選択により、マーカータンパク質の検出のために、または検出可能な物質の顕出のために、第２の薬剤を使用または添加することができる。導入された遺伝子は、ヒトまたは非ヒトであってもよいし、異種（別の種由来）または相同（同じ種由来）または内因性（同じ対象由来）であってもよい。

[105] 一本鎖かまたは二本鎖かにかかわらず、任意のＤＮＡウイルスゲノムを使用することができる。使用可能な好適なウイルスの例としては、これらに限定されないが、アデノ随伴ウイルス（AAV）、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、水痘、天然痘ウイルス、Ｂ型肝炎、サイトメガロウイルス、ＪＣポリオーマウイルス、ＢＫポリオーマウイルス、サル痘ウイルス、帯状疱疹、エプスタイン−バーウイルス、ヒトヘルペスウイルス７型、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス、ヒトパルボウイルスＢ１９、およびエンテロウイルスの野生型またはバリアントが挙げられる。ウイルスは、限定されないが、細胞毒性、細胞溶解性であってもよいし、または潜伏感染を引き起こすものでもよい。ウイルスゲノムが改変されたウイルスベクターも使用することができる。一例として、より少ないウイルスタンパク質をコードするように改変されているゲノムが使用される場合もある。さらなる例として、ウイルスタンパク質をコードしないように改変されているウイルスゲノムが使用される場合もある。ウイルスゲノムとしては、非限定的な例として、逆方向末端反復および／または操作されたウイルスゲノムのキャプシドへのパッケージングを容易にする他の非コード遺伝学的エレメントを挙げることができる。

[106] ウイルスゲノムは、裸のＤＮＡとして、リポソーム中で、ポリマーに複合体化して、濃縮または圧縮した状況で、金粒子中で、ビリオン中で、または適用に好適な任意の他の手段で、哺乳動物宿主細胞に送達することができる。典型的には、完全なウイルスゲノムが投与されると予想されるが、いくつかの状況において、部分的なゲノムを使用することが望ましい場合がある。部分的なゲノムは、宿主細胞または別のゲノムもしくはウイルスの存在によって提供されるヘルパー機能によって補うことができる。部分的なゲノムは、例えば治療的ペイロードが大きく、パッケージングのために一部の必須のウイルス機能を割愛しなければならない場合に使用される可能性がある。

[107] 組換えウイルスは、目的に有効な任意の経路に従って哺乳動物または哺乳動物細胞に投与することができる。投与は、例えば血液を介して、全身性であってもよい。組換えウイルスは、経口的、皮下、局所、バッカル、肛門、筋肉内、静脈内、腫瘍内、頭蓋内、クモ膜下、網膜下などに送達することができる。任意の好適な担体または媒体も投与に使用することができる。細胞または哺乳動物を組換えウイルスに対してより透過性にしたり、または組換えウイルスを受け入れやすくするためにそれらを前処理したりすることが望ましい場合がある。組換えウイルスを「必要とする」哺乳動物は、ウイルスが有益であると予想される哺乳動物であり得る。そのような哺乳動物は、疾患または欠損を有する哺乳動物であり得る。そのような哺乳動物は、診断または分析がなされると予想される哺乳動物であってもよい。そのような哺乳動物は、疾患または欠損を有していないとしても、投与される組換えウイルスによって利益を得る可能性がある哺乳動物であってもよい。

[108] 総合すると、本発明者らの結果は、ＡＡＶゲノムへのｃ４１またはヒトテロメア配列の取り込みが、（ａ）ウイルスのパッケージングおよび感染力を低めず、（ｂ）ＴＬＲ９によって媒介される炎症を予防し、（ｃ）炎症促進性サイトカインの誘導を低減し、（ｄ）導入遺伝子発現を増加させることを示す。ＴＬＲ９活性化はインターフェロン発現も誘導し、それにより抗ウイルス性の状況を誘発することから、導入遺伝子発現の増加は、低減した免疫応答に起因する可能性がある。本発明者らにより以下に示される操作された免疫回避特性は、特異的であり（TLR9に対して）、一過性であり（例えば、ウイルス侵入の間に起こる可能性がある）、全身性免疫抑制を引き起こさない（AAV感染した免疫細胞のみを標的化する）。

[109] 本発明者らが使用した阻害性核酸配列に加えて当技術分野において公知の他のものも、ＡＡＶのように、ヒトおよび他の哺乳動物にとって潜在的な有用性を有するが、望ましくない可能性がある炎症／免疫応答を惹起する他のウイルスに取り入れることができる。例えば、がん細胞に優先的に感染しそれを溶解する腫瘍溶解性ウイルスを使用して、腫瘍を殺したりまたは収縮させたりする。これらのウイルスは複製可能であるため（遺伝子療法に使用されるAAVベクターとは異なり）、それらは、新しいビリオンを放出して、残存する腫瘍を収縮させることができる。例としては、単純ヘルペスウイルス、アデノウイルス、およびエンテロウイルスの野生型またはバリアントが挙げられる。一部の報告によれば、免疫系は通常、腫瘍溶解性ウイルスを不活性化しようと試み、それによりそのウイルスががん細胞に感染することが予防されるため、化学療法による免疫抑制は、腫瘍溶解性ウイルス療法を増強できることが示されている。それゆえに、単純ヘルペスウイルスのような腫瘍溶解性ウイルスのゲノム中に阻害性オリゴヌクレオチドを取り込むことは、その免疫クリアランスを回避し、より長く腫瘍崩壊を持続することを可能にすると考えられる。

[110] 上記の開示は、本発明を一般的に説明するものである。本明細書で開示された全ての参考文献は、参照により明示的に組み入れられる。より十分な理解は、以下の具体的な実施例を参照することにより達成することができ、これらの実施例は、単に例示のために本明細書で提供され、本発明の範囲を限定することは意図されない。本発明の開示は、特許請求の範囲で明示的に列挙された全ての実施態様を包含する。加えて、従属請求項で開示された全ての特徴は、それらの従属先である独立請求項にも等しく適用され、他の独立請求項も同様である。したがってこのような従属請求項と他の独立請求項との組合せは、明示的に企図され開示される。

実施例１−改変されたウイルスゲノムの構築
[111] 免疫細胞中でＴＬＲ９活性化を特異的に回避する能力を有するＡＡＶベクターを操作するために、本発明者らは、増強緑色蛍光タンパク質（eGFP）をコードするＡＡＶベクターの３’非翻訳領域に、５ヌクレオチド長のスペーサー（AAAAA；配列番号８）によって分離されたｃ４１の２つのコピーを挿入した（図３Ｂ）。その後、本発明者らは、野生型ＡＡＶ−ｅＧＦＰウイルスおよびＡＡＶ−ｅＧＦＰ−ｃ４１ウイルス（２つのc41の挿入を内包する）を生産した。両方のウイルスの感染力価は同等であったことから（約１０^９感染単位／ｍｌ、HeLa細胞での力価測定によって決定した場合）、ウイルスゲノムへのｃ４１の付加は、遺伝子療法のために大量生産しなければならないウイルスベクターにとって重要な検討事項であるウイルスのパッケージングおよび感染力を妨げなかったことが示唆される。

実施例２−改変されたウイルスゲノムはＮＦ−ｋＢ活性化を低減する
[112] 炎症応答を測定するために、本発明者らは、ＡＡＶのＤＮＡゲノムを感知するＴＬＲ９を安定して発現することに加えて、ＮＦ−ｋＢの転写制御下でアルカリホスファターゼも発現するＨＥＫ２９３細胞（HEK293 TLR9細胞）を使用した。ＮＦ−ｋＢが活性化されると、これは炎症を示すが、培地にアルカリホスファターゼが分泌され、提供された基質に作用して、培地の色に、プレートリーダーで測定可能な変化をもたらす。本発明者らは、ＨＥＫ２９３ ＴＬＲ９細胞を模擬感染させ、またはそれらをＡＡＶ−ｅＧＦＰまたはＡＡＶ−ｅＧＦＰ−ｃ４１のいずれかで感染させた。文献と一致して、ＡＡＶ−ｅＧＦＰ感染は、ＮＦ−ｋＢ活性において小さいが統計学的に有意な増加を誘導した（図４）。対照的に、ＡＡＶ−ｅＧＦＰ−ｃ４１感染は模擬感染細胞と比較して有意差はなかったことから、このウイルスは炎症応答の惹起を回避できたことが示される。

実施例３−改変されたウイルスゲノムはより多くの細胞に形質導入され、より多くの導入遺伝子を発現する
[113] 本発明者らは、フローサイトメトリーを使用して、上記の３つの条件（図４に記載される）をｅＧＦＰ発現に関して分析した。本発明者らは、ＡＡＶ−ｅＧＦＰ−ｃ４１が、ＡＡＶ−ｅＧＦＰより多くの細胞に形質導入されたこと（３４．６％ＧＦＰ＋と比較して、５２．７％ＧＦＰ＋）を見出した（図５）。加えて、ＡＡＶ−ｅＧＦＰ−ｃ４１感染からのＧＦＰ＋細胞は、ＡＡＶ−ｅＧＦＰ感染からのＧＦＰ＋細胞より約２倍多くのｅＧＦＰを発現した（平均蛍光強度［MFI］が、２７４９に対して５３３５であった）。

[114] まとめると、本発明者らは、ウイルスゲノム中に阻害性オリゴヌクレオチドを取り込むことによってＴＬＲ９によって媒介される炎症を回避するようにＡＡＶベクターを操作した。

実施例４−ＡＡＶゲノム中にｃ４１またはテロメア配列を取り込むことにより、より多くの細胞が形質導入され、ＴＮＦ誘導が低減された。
[115] 本発明者らは、ＴＬＲ９シグナル伝達を遮断することが示されている抑制性（ＴＴＡＧＧＧ）_４モチーフ（配列番号６）を含有する哺乳動物テロメア由来配列である「テロメア」の３つのコピーを挿入した（図６Ａおよび図６Ｂ）。ＡＡＶ−ｅＧＦＰ−テロメアウイルスは、ＨｅＬａ細胞で力価測定した場合、ＡＡＶ−ｅＧＦＰおよびＡＡＶ−ｅＧＦＰ−ｃ４１と類似のウイルス力価を生じたことから、「テロメア」の取り込みは、ウイルスのパッケージングおよび感染力を妨げないことが実証される。

[116] 本発明者らが、Ｂ細胞株を、類似の量のＡＡＶ−ｅＧＦＰまたはＡＡＶ−ｅＧＦＰ−ｃ４１またはＡＡＶ−ｅＧＦＰ−テロメアウイルスで感染させたところ、ＡＡＶ−ｅＧＦＰ−ｃ４１とＡＡＶ−ｅＧＦＰ−テロメアウイルスの両方が、ＡＡＶ−ｅＧＦＰより多くの細胞に形質導入された（図７Ａ）。この発見はさらに、ＡＡＶのゲノム中に阻害性配列を取り込むことは、導入遺伝子発現を増加させることも示唆する。

[117] その後、本発明者らは、血液から初代ヒトＣＤ１４＋単球を回収し、それらを上述した条件と類似の感染条件に供した。ＴＮＦはＮＦ−ｋＢ活性化により誘導される原型的な炎症促進性サイトカインであるため、本発明者らは、上清にＥＬＩＳＡを実行して、ＴＮＦ産生を分析した。ＡＡＶ−ｅＧＦＰ感染は、模擬感染と比較してＴＮＦ産生を増加させたが、ＡＡＶ−ｅＧＦＰ−ｃ４１およびＡＡＶ−ｅＧＦＰ−テロメア感染は、ＴＮＦ産生において増加を示さないかまたはわずかな増加しか示さなかったことから（図７Ａ〜７Ｂ）、これら２つのウイルスは炎症応答の惹起を回避できたことが示される。

実施例５−自己相補的なＡＡＶベクターの操作
[118] 研究者は、細胞培養においてＴＬＲ９シグナル伝達を弱めるために、短い阻害性オリゴヌクレオチド（典型的には１０〜３０ヌクレオチドの長さ）を使用することが多い。しかしながら、これらの阻害性オリゴヌクレオチドが、それより一層大きいウイルスゲノムの状況で（すなわち、配列が、それより一層長い配列に両方の末端において共有結合で連結されている）、官能性を保持するかどうかは不明である。この可能性を試験するために、本発明者らは、増強緑色蛍光タンパク質（eGFP）をコードする自己相補的な（sc）ＡＡＶベクターを利用して、ベクターゲノムを内包するプラスミドに、それぞれ細菌および哺乳動物のテロメア由来の「ｃ４１」または「テロメア」の３つコピーを挿入した［５２、５７、５８、６１］（図８Ａおよび８Ｂ）。ｓｃＡＡＶベクターは、マウス肝臓中でＴＬＲ９活性化を誘発し、一本鎖（ss）ＡＡＶベクターより多くの炎症を誘導するのにより効率的であることが示されていることから、本発明者らはｓｃＡＡＶベクターから始めた。「ｃ４１」および「テロメア」は強い二次構造を有すると予測されるため、本発明者らは、阻害性オリゴヌクレオチドのコピー間にＡＡＡＡＡリンカーを使用した。加えて、３×ｃ４１および３×テロメア配列は、ウイルス侵入の間にＤＮＡゲノム中に存在するが、形質導入が成功したときにその後のｍＲＮＡ転写物から排除されると予想されるため、３×ｃ４１および３×テロメア配列を、ポリＡ配列の後と右の逆方向末端反復（ITR）の上流に配置した（「scAAV-eGFP-3×c41」および「scAAV-eGFP-3×テロメア」）。最終的に、ウイルスゲノム中の阻害性オリゴヌクレオチドの配置が問題になるかどうかを決定するために、本発明者らはまた、左のＩＴＲとプロモーターの間に３×テロメアが配置されたベクター（「scAAV-3×テロメア-eGFP」）も作り出した。

実施例６−インビトロでの初代ヒトマクロファージおよび単球における炎症応答
[119] 本発明者らは、様々なＡＡＶベクターをＡＡＶ２血清型にパッケージングし、初代ヒト単球由来マクロファージを１０^５ウイルスゲノム（vg）／細胞の重複感染度（MOI）で感染させた。予想通りに、本発明者らは、マクロファージのｓｃＡＡＶ−ｅＧＦＰ感染が、発熱、アポトーシスおよび炎症の刺激における役割がよく説明されており、ＴＬＲ９シグナル伝達およびＮＦ−ｋＢ活性化の際に生産される原型的な炎症性サイトカインであるＴＮＦのロバストな誘導を上清中で惹起したことを見出した（図９Ａ）。対照的に、ｓｃＡＡＶ−ｅＧＦＰ−３×４１およびｓｃＡＡＶ−ｅＧＦＰ−３×テロメアの両方は、ＴＮＦ誘導を９５％を超えて著しく減少させたことから、これらのウイルス中への「ｃ４１」または「テロメア」の取り込みは、野生型（WT）ベクターと比較して炎症応答の惹起を回避できたことが示される。さらに、ｓｃＡＡＶ−３×テロメア−ｅＧＦＰも９５％を超えてＴＮＦ誘導を防ぐことができたことから、挿入された阻害性オリゴヌクレオチドは、ウイルスゲノムの他の部分中に配置でき、炎症を遮断する能力を保持できることが実証される。リン酸緩衝食塩水（PBS）での模擬感染、およびＴＬＲ９／ＮＦ−ｋＢおよび炎症を強く活性化することが公知の市販のＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドであるＯＤＮ２００６での処理は、それぞれ陰性および陽性対照として役立った。本発明者らが初代ヒトＣＤ１４＋単球を試験したところ、この場合でもｓｃＡＡＶ−ｅＧＦＰがロバストなＴＮＦ誘導を誘発し、一方でｓｃＡＡＶ−ｅＧＦＰ−３×ｃ４１およびｓｃＡＡＶ−ｅＧＦＰ−３×テロメアがＴＮＦ誘導のほとんどを無効にしたことを見出した（図９Ｂ）。ｓｃＡＡＶ−３×テロメア−ｅＧＦＰも同様にＴＮＦ誘導を低減したが、阻害は約８５％であり、これは、細胞型またはドナー組織間の差に起因する可能性がある。別のドナーから得られた初代ＣＤ１４＋単球においてもＴＮＦ誘導の回避が再現された（図９Ｃ）。

[120] さらなる特徴付けとして、本発明者らは、ＴＬＲ９を遮断しないランダムな配列である「対照」の３つのコピー、または「テロメア」の１つのコピーをベクターゲノムを内包するプラスミドに挿入した（図１０Ａ、図１０Ｂ）。本発明者らは、配列「対照」を、ＴＬＲ９実験において陰性対照オリゴヌクレオチドとして使用されたものと同様にして選んだ。本発明者らは、ヒトマクロファージにおいて、ｓｃＡＡＶ−ｅＧＦＰ−１×テロメアが、ｓｃＡＡＶ−ｅＧＦＰと比較してＴＮＦ誘導を低減できたが、ｓｃＡＡＶ−ｅＧＦＰ−３×テロメアほど効率的ではなかったことを見出した（図１０Ｃ）。これは、テロメアの１つのコピーが炎症を低減することができることを示す。本発明者らはまた、ｓｃＡＡＶ−ｅＧＦＰ−３×対照が、ヒト単球におけるｓｃＡＡＶ−ｅＧＦＰと同程度に効率的にＴＮＦ分泌を惹起したことも観察したが、これは、ＴＬＲ９を阻害する配列の挿入が炎症を遮断するのに必要であることを示唆している（図１０Ｄ）。

[121] ＡＡＶベクターが生物製剤とみなされ、ロット間変動を呈示する可能性があるため、本発明者らは、ｓｃＡＡＶ−ｅＧＦＰおよびｓｃＡＡＶ−ｅＧＦＰ−３×テロメアＡＡＶ２ウイルスの両方の別のバッチを生産したところ、ｓｃＡＡＶ−ｅＧＦＰ−３×テロメアが、ＷＴベクターと比較して、ＴＮＦ誘導の約７５％を低減できたことを見出した（図１１Ａ）。複数のウイルス調製物ならびにドナー単球およびマクロファージに基づいて（図９Ａ〜９Ｃ、図１０Ａ〜１０Ｅおよび図１１Ａ〜１１Ｂ）、本発明者らは、本発明者らの「ｃ４１」または「テロメア」の３つのコピーを含有する操作されたベクターは、ＴＮＦ誘導を、ＷＴベクターと比較しておよそ７５〜９８％低減すると結論付けている。平均して、ｓｃＡＡＶ−ｅＧＦＰ−３×テロメアは、ｓｃＡＡＶ−ｅＧＦＰと比較して、ＴＮＦ誘導の約８５％を低減した。重要なことに、本発明者らは、上記のＡＡＶ２ベクターのどちらの生産から得られたウイルスの力価においても差を観察しなかったことから（ウイルスゲノムのqPCRによってアッセイした）、操作されたベクターは、パッケージングにおいて欠陥がないことが示唆される（データは示されていない）。さらに、本発明者らが、ＡＡＶ感染力の力価を測定するのに広く使用される複製可能な細胞株であるＨｅＬａ細胞を様々なＭＯＩのｓｃＡＡＶ−ｅＧＦＰおよびｓｃＡＡＶ−ｅＧＦＰ−３×テロメアで感染させたところ、本発明者らは、ウイルス力価の４ｌｏｇにわたり形質導入の差（%GFP+細胞）を観察しなかったことから、操作されたベクターは、細胞を形質導入する能力を等しく有することが実証される（図１１Ｂ）。

実施例７−インビボでのマウスの肝臓組織における炎症応答
[122] 遺伝子療法のために肝細胞を形質導入するためには、ＡＡＶの静脈内送達が使用されることが多い。以前の研究から、ＡＡＶの静脈内投与の際に、マウスの肝臓におけるクッパー細胞（常在する肝臓の抗原提示細胞）は、ｓｃＡＡＶゲノムを感知し、１〜９時間後に炎症および自然免疫応答を誘発することが可能であることが示されている［３６］。これらの応答は、炎症促進性サイトカイン、例えばＴＮＦおよびＩＬ６、ならびにＩ型インターフェロン、例えばＩＦＮ−βなどの誘導を包含する。ＴＬＲ９−／−マウスは、肝臓においてこれらの炎症および自然免疫応答を呈示しないことから、インビボにおける自然免疫センサーとしてのＴＬＲ９の中心的な役割が実証される。加えて、好中球、マクロファージおよびナチュラルキラー（NK）細胞などの免疫細胞は、ＡＡＶ投与の２時間後に肝臓に浸潤する。本発明者らの操作されたベクターが、インビボで肝臓における炎症を低減できるかどうかを決定するために、本発明者らは、ＰＢＳまたは等量のｓｃＡＡＶ−ｅＧＦＰもしくはｓｃＡＡＶ−ｅＧＦＰ−３×テロメアを尾静脈注射により投与した。「テロメア」はヒト配列由来であり、臨床用途に好ましい可能性があるため、本発明者らは、インビボでの特徴付けのためにｓｃＡＡＶ−ｅＧＦＰ−３×テロメアを選択した。以前の研究と一致して、ｓｃＡＡＶ−ｅＧＦＰは、肝臓において、炎症を示すＴｎｆおよびＩｌ６発現の増加（食塩水と比較しておよそ３〜１０倍）を刺激した（図１２Ａ）。対照的に、ｓｃＡＡＶ−ｅＧＦＰ−３×テロメアは、炎症性マーカーにおける増加をほとんど示さなかったことを示した。それに続く実験で本発明者らがより多くのマウスを試験したところ、ｓｃＡＡＶ−ｅＧＦＰは、肝臓において、食塩水と比較して統計学的に有意なＴｎｆ誘導を刺激したが、ｓｃＡＡＶ−ｅＧＦＰ−３×テロメアおよびｓｃＡＡＶ−ｅＧＦＰ−３×ｃ４１は有意なＴｎｆ誘導を刺激しなかったことが見出されたことから（図１２Ｂおよび１２Ｃ）、それらの肝臓における炎症の惹起を回避する能力が実証される。最終的に、本発明者らは、ｓｃＡＡＶ−ｅＧＦＰ−３×対照は、ｓｃＡＡＶ−ｅＧＦＰと比較して肝臓における炎症を予防できないことを確認した（図１０Ｅ）。

実施例８−一本鎖ＡＡＶベクターの操作およびインビボにおけるマウスの眼の組織における炎症応答の決定
[123] 次に本発明者らは、一本鎖ＡＡＶベクターであるｓｓＡＡＶ−ｅＧＦＰを、プラスミドに、ＡＡＡＡＡリンカーを有する「テロメア」の５つのコピーを挿入し、続いて別の５つのコピーを、ただしアンチセンス方向で挿入することによって操作し、ｓｓＡＡＶ−ｅＧＦＰ−５×テロメアを得た（図１３）。それによって、ウイルスゲノムのプラスおよびマイナス鎖の両方が等しくウイルス粒子にパッケージングされる可能性が高いため、それぞれのパッケージングされたウイルスゲノムが「テロメア」の５つのコピーを正しい方向で有することが確認される。２つのＡＡＶ８ウイルスを生産し精製した。この場合でも本発明者らは２つのベクター間で力価における差を観察しなかったことから、類似のパッケージング効率が示唆される（データは示されていない）。ｓｓＡＡＶ−ｅＧＦＰは、これまでにもマウスにおいて網膜下注射に使用されてきており、眼中の光受容体を効率的に形質導入することから、ｓｓＡＡＶ−ｅＧＦＰを選択した［６２］。

[124] 数々の研究から、眼および脳におけるＡＡＶ遺伝子療法は一般的に安全であると考えられることが示唆されている［６３］。眼は免疫特権部位であると仮定されることが多いが、ＴＬＲ９を発現しＣｐＧモチーフに応答することが報告されている中枢神経系の在住マクロファージである小グリア細胞を内包することが公知である［６４〜６７］。マカク属のカニクイザルに網膜下注射によってＡＡＶベクターを送達する近年の研究は、動物における用量依存性の前区および後区の炎症と、重度の眼の炎症のためにマカクを早急に安楽死させたことを報告している［６８］。さらに、安楽死させた動物の硝子体からの吸引液は、好中球およびマクロファージの存在を実証した。イヌモデルを利用した別の研究からも同様に、ＡＡＶベクターの網膜下注射による前区および後区のブドウ膜炎が観察され、１７個の眼のうち３個が多病巣性網脈絡膜炎を発生させ、これも同様により高いベクター用量に関連していた［６９］。これらの発見は、ＡＡＶベクターが眼中の自然の免疫監視にさらされ、有害な炎症および免疫応答を誘発する可能性があることを強く示唆する。

[125] 食塩水または類似の量のｓｓＡＡＶ−ｅＧＦＰまたはｓｓ−ＡＡＶ−ｅＧＦＰ−５×テロメアを、網膜下注射により新生児の眼に送達し、炎症性および免疫遺伝子の発現を測定した。食塩水注射を受けた３匹のマウスは、網膜中でのＴｎｆ発現が一様に低く、これを、１倍の発現に設定した（図１４Ａ）。対照的に、ｓｓＡＡＶ−ｅＧＦＰを受けた５匹のマウスのうち、２匹がＴｎｆの中程度の上方調節（１．９倍および８．３倍）を呈示したが、３匹の動物は、Ｔｎｆの大きい誘導（６２．２倍、５３４倍、および１００３倍）を実証し、５匹の動物の平均は３２１倍であった。この発見は、炎症にはばらつきがあるものの、一部の動物が、ｓｓＡＡＶ−ｅＧＦＰ網膜下注射により網膜中で非常に強い炎症応答を起こすことを示す。このばらつきは、各注射手順または各動物の免疫のステータスにおける差に起因する可能性がある。印象的なことに、ｓｓＡＡＶ−ｅＧＦＰ−５×テロメアを受けた５匹の動物は、平均５．６倍のＴｎｆ誘導を有し、ばらつきはかなり少なかったことから、ｓｓＡＡＶ−ｅＧＦＰ−５×テロメアは強い炎症の惹起を回避できたことが示唆される。類似の結果が眼杯の残部でもより低い規模ではあるが観察されたことから、炎症は網膜に限定されなかったことが示される（図１４Ｂ）。本発明者らはまた、網膜中で、抗ウイルス性免疫応答にとって重要なＩＩ型インターフェロンであるＩｆｎｇ発現も測定したところ［７０］、類似のパターンが観察された（図１４Ｃ）。先行の研究では、ＡＡＶの網膜下注射は、眼において免疫細胞の浸潤を誘発する可能性があることが示唆されている。それゆえに、本発明者らはまた、異なるタイプの免疫細胞で特異的に発現されることが公知である遺伝子の発現も分析した。本発明者らは、ｓｓＡＡＶ−ｅＧＦＰ注射で、食塩水と比較して１８．２倍多くのＡｉｆ１（Iba1をコードする、小グリア細胞の特異的なマーカー［７１、７２］）の発現を見出したが、これは、網膜における小グリア細胞の増殖および／または活性化を示唆している（図１５Ａ）。対照的に、ｓｓＡＡＶ−ｅＧＦＰ−５×テロメアが示したＡｉｆ１発現の誘導は、わずか１．９倍であった。加えて、本発明者らは、ｓｓＡＡＶ−ｅＧＦＰによる、それぞれＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞およびＣＤ８＋細胞溶解性Ｔ細胞のマーカーであるＣｄ４およびＣｄ８ａの４５．８倍および４１．８倍の誘導を見出し、一方でｓｓＡＡＶ−ｅＧＦＰ−５×テロメアは、１．５倍および３．４倍の誘導しか示さなかった（図１５Ｂおよび１５Ｃ）。この場合でもｓｓＡＡＶ−ｅＧＦＰで処理したマウス間で顕著なばらつきがあり、動物の部分集合がロバストな誘導を示した。これらの結果は、ｓｓＡＡＶ−ｅＧＦＰの網膜下注射による投与が、網膜においてＴ細胞の浸潤を刺激する可能性があるが、ｓｓＡＡＶ−ｅＧＦＰ−５×テロメアは強くそれを少なくしたことを実証する。総合すると、本発明者らのデータから、ｓｓＡＡＶ−ｅＧＦＰは網膜と執念組織においてロバストな炎症および免疫応答を誘導し、有意なばらつきが観察されているが、ｓｓＡＡＶ−ｅＧＦＰ−５×テロメアは、これらの応答の大部分を軽減することが可能であることが示される。

[126] インビトロとインビボの両方での炎症における著しい差を考慮すれば、本発明者らは、長期の遺伝子発現において何らかの差があるかどうかの決定を試みた。本発明者らは、マウスの網膜下注射の２９日後に、Ｐ３０で平坦にマウントした眼杯を検査したところ、より多くの細胞がＧＦＰ＋であり、ｓｓＡＡＶ−ｅＧＦＰ−５×テロメアで処理した眼におけるＧＦＰ発現がｓｓＡＡＶ−ｅＧＦＰと比較してより強かったことを見出した。これは、遺伝子発現の増強を示唆する（図１６）。したがって、操作されたベクターは、網膜において炎症および免疫応答を低減することができ、さらに導入遺伝子発現も増大させることができる。

実施例９−材料および方法
動物
[127] Ｃ５７ＢＬ／６マウス（雄、７〜９週齢）をＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入し、ＣＤ１マウスをＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。

ＡＡＶベクター
[128] この研究では、自己相補的な（sc）または一本鎖（ss）ＡＡＶベクターが使用された。自己相補的なベクターは、１つのＩＴＲにおいて末端分解配列（terminal resolution sequence）を欠如している。全てのベクターゲノムの端部には、ＡＡＶ２のＩＴＲが配置されていた。ｓｃＡＡＶ−ｅＧＦＰは、Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ（VPK-430）から購入し、以前に説明されている［７３］。ｓｃＡＡＶ−ｅＧＦＰは、サイトメガロウイルス（CMV）プロモーターから増強型緑色蛍光タンパク質（eGFP）を発現させ、ＳＶ４０イントロンおよびＳＶ４０ポリＡ配列を包含していた。ｓｓＡＡＶ−ｅＧＦＰは以前に説明されており［６２］、元々はＨａｒｖａｒｄ ＤＦ／ＨＣＣ ＤＮＡ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｏｒｅから得られたものである（クローン番号：EvNO00061595）。ｓｓＡＡＶ−ｅＧＦＰは、ＣＭＶエンハンサー／プロモーター、ヒトβ−グロビンのイントロン、ｅＧＦＰ、およびβ−グロビンのポリＡ配列を含有していた。緑膿菌由来の「ｃ４１」（5'-TGGCGCGCACCCACGGCCTG-3'；配列番号１）および哺乳動物テロメア由来の「テロメア」（5'-TTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG-3'；配列番号９；最初のＴヌクレオチドは、機能に応じて任意選択である）の配列は、説明されている［５２、５７、５８、６１］。広く使用されている「テロメア」オリゴヌクレオチド（Invivogen製造、カタログコード「tlrl-ttag」）は、公開された研究と比較して追加のＴ（太字）を内包していたため、配列中に包含された。この研究の経過中に、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎは、それらの製造済みの「テロメア」オリゴヌクレオチド（カタログコード「tlrl-ttag151」）中の追加のＴを除去した。加えて、「対照」（5'-GCTAGATGTTAGCGT-3'；配列番号３４）を、ＴＬＲ９活性化を阻害しない陰性対照配列として使用した（Invivogen、カタログコード「tlrl-2088c」）。

[129] ｓｃＡＡＶ−ｅＧＦＰを操作するために、配列を右のＩＴＲの５’に隣接して見出される固有のＳｐｅＩ部位に挿入した。サブクローニングを容易にするために、挿入された配列の５’に隣接して固有のＣｌａＩ部位を作り出すことによって、配列のＣｌａＩ／ＳｐｅＩのサブクローニングを可能にした。ＡＡＡＡＡリンカーによって分離された「ｃ４１」、「テロメア」、または「対照」の３つのコピーを挿入し、それぞれｓｃＡＡＶ−ｅＧＦＰ−３×ｃ４１、ｓｃＡＡＶ−ｅＧＦＰ−３×テロメアおよびｓｃＡＡＶ−ｅＧＦＰ−３×対照を得た。代替として、「テロメア」の１つのコピーをＡＡＡＡＡリンカー（配列番号８）と共に挿入して、ｓｃＡＡＶ−ｅＧＦＰ−１×テロメアを得た。本発明者らはまた、固有のＡｖｒＩＩ部位を使用して左のＩＴＲとＣＭＶプロモーターの間に３×テロメアも挿入して、ｓｃＡＡＶ−３×テロメア−ｅＧＦＰを得た。

[130] ｓｓＡＡＶ−ｅＧＦＰを操作するために、右のＩＴＲの隣のＸｂａＩ部位の５’に隣接してＫｐｎＩ−５×テロメア（センス）−５×テロメア（アンチセンス）−ＮｈｅＩを挿入した。この場合でも、「テロメア」のコピー間にＡＡＡＡＡをリンカーとして使用した。一本鎖ＡＡＶベクターは、ウイルスゲノムのプラスまたはマイナス鎖をパッケージングする等しい機会があるため、「テロメア」のセンス配列とアンチセンス配列の両方が付加された。このようにして確実に全てのパッケージングされたＡＡＶゲノムが、正しい方向で「テロメア」の５つのコピーを含むようになる。

[131] 自己相補的なベクターを、ＨＥＫ２９３細胞の三重のトランスフェクションによってＡＡＶ２（Vigene Biosciences）にパッケージングし、イオジキサノール勾配超遠心分離を使用して精製し、次いでＰＢＳ中でＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５カラムを使用して５００ｕｌに濃縮した。精製したウイルスを、ＩＴＲ由来のプライマーおよびＡＡＶ標準を使用したｑＰＣＲによって力価測定した。ウイルスの最終的な収量は、０．５〜３×１０^１３ｖｇの範囲であった。

[132] 一本鎖ベクターを、これまでに記載されたプロトコールに基づきＡＡＶ８にパッケージングした［７４、７５］。簡単に言えば、ＡＡＶベクター、ｒｅｐ２−ｃａｐ８パッケージングプラスミドおよびアデノウイルスヘルパープラスミドをポリエチレンイミンを用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、トランスフェクションの７２時間後に上清を収集した。ＡＡＶ８ウイルスを８．５％ｗ／ｖのＰＥＧ８０００および０．４ＭのＮａＣｌを用いて沈殿させ、７０００ｇで遠心分離した。ペレットを溶解緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌおよび２０ｍＭトリス、ｐＨ８．０）に再懸濁し、ＭｇＣｌ２を１ｍＭの最終濃度まで添加した。再懸濁したウイルスを２５Ｕ／ｍｌベンゾナーゼ（Sigma）と共に３７℃で１５分インキュベートし、イオジキサノール勾配で泳動した。回収したＡＡＶベクターを、Ａｍｉｃｏｎ １００Ｋカラム（EMD Millipore）を使用してＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳ１００〜５００ｕｌに濃縮した。比較のために事前のＡＡＶ標準の連続希釈を使用して、タンパク質のゲルを泳動してウイルス力価を決定した。

インビトロでの研究のための初代ヒト単球および単球由来マクロファージ
[133] 身元不明の健康なドナーからのヒト末梢血単核細胞（PBMC）を購入した（ZenBio）。この研究は、ハーバード大学医学部（Harvard Medical School）の倫理上のガイドラインに従ってなされた。ＣＤ１４＋単球を、抗ＣＤ１４磁気マイクロビーズを製造元の説明書（Miltenyi Biotec）に従って使用してＰＢＭＣから陽性選択するか、またはＳｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。単球由来マクロファージを得るために、単球を、５０ｎｇ／ｍｌの組換えヒトマクロファージコロニー刺激因子（rhM-CSF、Peprotechから購入）と共に５〜６日培養して、マクロファージに分化させた。単球およびマクロファージを、新鮮なまま使用するか、またはその後の研究のために低温保存した。

[134] １×１０^５個の単球またはマクロファージを、それぞれ９６ウェルの丸底プレートまたは９６ウェルの平底プレート中のウェル１つ当たり１９０ｕｌのＲＰＭＩ成長培地中に播種し、ＰＢＳ中、１０ｕｌのＡＡＶ２ウイルスを示されたＭＯＩで感染させた。模擬感染（PBS １０ｕｌの添加）、およびＴＬＲ９を活性化し炎症を誘発することが公知のＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドであるＯＤＮ２００６（５ｕＭの最終濃度、Invivogen）を、陰性および陽性対照として利用した。感染の１８時間後、上清を収集し、低速の遠心分離によって透明化し、それに続いてヒトＴＮＦに関してＥＬＩＳＡ（Thermo Scientific）を行った。

ＨｅＬａ細胞の感染
[135] ＨｅＬａ細胞は、ＡＡＶ２ベクターに関して高度に複製可能であり、ＡＡＶ２ベクター調製物の形質導入力価を決定するのに一般的に使用されている［７６］。簡単に言えば、ＨｅＬａ細胞を１２ウェル中に播種して一晩おいたところ、感染時にはおよそ８０％の集密度であった（約３×１０^５個の細胞）。ウイルスを連続的に１０倍希釈したもので細胞を示されたＭＯＩで感染させ、４８時間インキュベートし、その後、ＰＢＳ中の１％パラホルムアルデヒドで固定し、続いてＧＦＰ＋細胞に関してフローサイトメトリー分析を行った。ＰＢＳ模擬感染細胞を使用して、ＧＦＰ＋シグナルを決定した。

インビボでの肝臓の研究
[136] 成体Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、これまでに記載されたようにして、ＰＢＳ１００ｕｌを静脈内注射するか、またはＡＡＶ２ウイルス（１０^１１ｖｇ／動物）を尾静脈注射した［３６］。２時間後、動物を殺し、肝臓の右中間葉の一部をＲＮＡｌａｔｅｒ溶液（Thermo Scientific）中で保存した。１０〜３０ｍｇの機械的に崩壊させた肝臓サンプルから、ＲＮＡ抽出キット（OMEGA Bio-Tek）を使用することによって全ＲＮＡを抽出した。大容量ＲＮＡ−ｔｏ−ｃＤＮＡキット（Thermo Scientific）を用いて類似の量のＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、ＴａｑＭａｎファストアドバンストマスターミックス（Thermo Scientific）および市販の予め設計されたプライマー／プローブを示された標的遺伝子（IDT）に対するＦＡＭレポーター色素と共に使用した定量ＰＣＲ（qPCR）で、類似の量のｃＤＮＡをアッセイした。ΔΔＣＴ方法を使用してハウスキーピング遺伝子のＡｃｔｂまたはＧａｐｄｈに対して正規化することによって各遺伝子の発現レベルを計算し、食塩水が注射されたマウスと比較した倍率レベルとして表した。全てのｑＰＣＲ反応をリアルプレックス^４マスターサイクル（Eppendorf）で行った。

インビボでの眼の研究
[137] 生後１日目（P1）のＣＤ１新生児の眼への網膜下注射を、これまでに記載されたようにして実行した［７４、７５］。およそ０．２ｕｌのＡＡＶ８ウイルス（眼１つ当たり１．８×１０^８ｖｇ）を、ＦｅｍｔｏＪｅｔ（Eppendorf）によって制御された引き角度の（pulled angled）ガラスピペットを使用して網膜下のスペースに導入した。Ｐ２１で、動物を殺し、解剖して眼杯を取り出した。網膜と眼杯の残部を、肝臓における研究で記載されたようにＲＮＡ抽出、逆転写、およびｑＰＣＲに供した。ＧＦＰ発現を組織学的方法で可視化するために、Ｐ３０で眼を切り出し、４％パラホルムアルデヒド中で２時間固定し、ＰＢＳ中で３回洗浄した。角膜、レンズ、虹彩、ガラス体および末梢の筋肉を除去することによって眼杯を解剖して取り出した。Ｋｅｙｅｎｃｅ ＢＺ−×７００顕微鏡で１０倍の対物を使用して平坦にマウントした眼杯の画像を撮った。同じ画像化設定において同じ画像化設定で、グループ間の比較に使用する画像を撮った。

統計
[138] 全てのケースにおいて、対応のないスチューデントの両側ｔ検定を使用して、２つの対応のない実験グループ間の差を比較した。＜０．０５のＰ値を統計学的に有意とみなした。予め特定された効果量を仮定せず、各条件につき一般的に３から５回の反復を使用した。

参考文献
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Claims (90)

1. ＴＬＲ９に結合するがＴＬＲ９の活性化を誘発しない阻害性核酸配列に共有結合で連結されたウイルスゲノム
   を含む核酸分子。
2. 哺乳動物細胞に所望の機能を送達するための組換えウイルスであって、
   ＴＬＲ９に結合するがＴＬＲ９の活性化を誘発しない阻害性核酸配列に共有結合で連結されたウイルスゲノム
   を含む、組換えウイルス。
3. ウイルスゲノムが、アデノ随伴ウイルス（AAV）ゲノムである、請求項２に記載の組換えウイルス。
4. ウイルスゲノムが、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、水痘、天然痘ウイルス、Ｂ型肝炎、サイトメガロウイルス、ＪＣポリオーマウイルス、ＢＫポリオーマウイルス、サル痘ウイルス、帯状疱疹、エプスタイン−バーウイルス、ヒトヘルペスウイルス７型、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス、およびヒトパルボウイルスＢ１９からなる群から選択される、請求項２に記載の組換えウイルス。
5. ウイルスゲノムが、一本鎖である、請求項２に記載の組換えウイルス。
6. ウイルスゲノムが、ビリオン中にパッケージングされている、請求項２に記載の組換えウイルス。
7. ウイルスゲノムが、ヒト細胞中で発現可能な遺伝子を含む、請求項２に記載の組換えウイルス。
8. ウイルスゲノムが、標的腫瘍細胞を溶解するための細胞毒性ウイルスである、請求項２に記載の組換えウイルス。
9. 阻害性核酸配列が、ｃ４１オリゴヌクレオチド配列ＴＧＧＣＧＣＧＣＡＣＣＣＡＣＧＧＣＣＴＧ（配列番号１）を含む、請求項２に記載の組換えウイルス。
10. 阻害性核酸配列が、ｃ４１配列（配列番号１）の複数のコピーを含む、請求項２に記載の組換えウイルス。
11. 阻害性核酸配列が、リンカー配列によって分離されたｃ４１配列（配列番号１）の２つのコピーを含む、請求項１０に記載の組換えウイルス。
12. リンカー配列が、ＡＡＡＡＡ（配列番号８）である、請求項１１に記載の組換えウイルス。
13. 阻害性核酸配列が、
    ODN 2088: TCC TGG CGG GGA AGT（配列番号２）；
    ODN 4084-F: CCTGGATGGGAA（配列番号３）；
    ODN INH-1: CCTGGATGGGAATTCCCATCCAGG（配列番号４）；
    ODN INH-18: CCT GGA TGG GAA CTT ACC GCT GCA（配列番号５）；
    ODN TTAGGG: TT AGG GTT AGG GTT AGG GTT AGG G（配列番号６）；および
    G-ODN: CTC CTA TTG GGG GTT TCC TAT（配列番号７）
    からなる群から選択される、請求項２に記載の組換えウイルス。
14. 阻害性核酸配列が、細菌配列である、請求項２に記載の組換えウイルス。
15. ウイルスゲノムが、非ヒト遺伝子を含む、請求項２に記載の組換えウイルス。
16. 阻害性核酸配列が、ウイルスゲノムの３’非翻訳領域の下流またはその中に挿入されている、請求項２に記載の組換えウイルス。
17. ウイルスゲノムが、ホスホジエステル結合によって阻害性核酸配列に共有結合で連結されている、請求項２に記載の組換えウイルス。
18. 検出可能なマーカーをさらに含む、請求項２に記載の組換えウイルス。
19. 検出可能なマーカーが、誘導性である、請求項１８に記載の組換えウイルス。
20. 阻害性核酸配列が、配列番号９に示されるヒトテロメア配列を含む、請求項２に記載の組換えウイルス。
21. ウイルスゲノムが、自己相補的である、請求項２に記載の組換えウイルス。
22. ウイルスゲノムが、複数の阻害性核酸配列に共有結合で連結されている、請求項２に記載の組換えウイルス。
23. 複数の阻害性核酸配列が、阻害性配列およびその逆相補物を含む、請求項２２に記載の組換えウイルス。
24. 阻害性核酸配列が、ｃ４１配列（配列番号１）の３つのコピーを含み、各コピーは、リンカー配列によって分離されている、請求項１０に記載の組換えウイルス。
25. 阻害性核酸配列が、
    ODN 2114: TCCTGGAGGGGAAGT（配列番号１６）；
    ODN 4024: TCCTGGATGGGAAGT（配列番号１７）；
    ODN INH-4: TTCCCATCCAGGCCTGGATGGGAA（配列番号１８）；
    ODN INH-13: CTTACCGCTGCACCTGGATGGGAA（配列番号１９）；
    ODN Poly-G: GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG（配列番号２０）；
    ODN GpG: TGACTGTGAAGGTTAGAGATGA（配列番号２１）；
    ODN IRS-869: TCCTGGAGGGGTTGT（配列番号２２）；
    ODN IRS-954: TGCTCCTGGAGGGGTTGT（配列番号２３）；および
    ODN 21158: CCTGGCGGGG（配列番号２４）
    からなる群から選択される、請求項２に記載の組換えウイルス。
26. 阻害性核酸配列が、ＯＤＮ ＴＴＡＧＧＧ（配列番号６）である、請求項１３に記載の組換えウイルス。
27. 阻害性配列が、リンカーに共有結合で連結されている、請求項２６に記載の組換えウイルス。
28. 阻害性配列が、リンカーの上流にある、請求項２６に記載の組換えウイルス。
29. 阻害性核酸配列が、ＯＤＮ ＴＴＡＧＧＧ（配列番号６）の複数のコピーを含む、請求項２に記載の組換えウイルス。
30. ＯＤＮ ＴＴＡＧＧＧ（配列番号６）の複数のコピーがそれぞれ、リンカーによって分離されている、請求項２９に記載の組換えウイルス。
31. 阻害性核酸配列が、ＯＤＮ ＴＴＡＧＧＧ（配列番号６）の、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つのコピーを含み、各コピーは、リンカーによって分離されている、請求項３０に記載の組換えウイルス。
32. リンカーが、ＡＡＡＡＡである、請求項３０に記載の組換えウイルス。
33. 阻害性核酸配列が、ヒト配列である、請求項２に記載の組換えウイルス。
34. ウイルスゲノムが、非ヒト核酸配列を含む、請求項２に記載の組換えウイルス。
35. ウイルスゲノムが、ヒト遺伝子を含む、請求項２に記載の組換えウイルス。
36. ウイルスゲノムが、ヒト核酸配列を含む、請求項２に記載の組換えウイルス。
37. 阻害性核酸配列が、ウイルスゲノムの５’非翻訳領域中に挿入されている、請求項２に記載の組換えウイルス。
38. 阻害性核酸配列が、ウイルスゲノムのプロモーターの上流に挿入されている、請求項２に記載の組換えウイルス。
39. 誘導性プロモーターをさらに含む、請求項２に記載の組換えウイルス。
40. 阻害性核酸配列が、配列番号１の２つの反復した単量体を含む、請求項２に記載の組換えウイルス。
41. 阻害性核酸配列が、配列番号１の３つの反復した単量体を含む、請求項２に記載の組換えウイルス。
42. 阻害性核酸配列が、配列番号６または配列番号９を含む、請求項２に記載の組換えウイルス。
43. 阻害性核酸配列が、配列番号６または配列番号９の３つの反復した単量体を含む、請求項２に記載の組換えウイルス。
44. 阻害性核酸配列が、配列番号６または配列番号９の５つの反復した単量体を含む、請求項２に記載の組換えウイルス。
45. 哺乳動物を処置する方法であって、
    請求項２に記載の組換えウイルスを、それを必要とする哺乳動物に投与する工程
    を含む、方法。
46. ウイルスゲノムが、アデノ随伴ウイルス（AAV）ゲノムである、請求項４５に記載の方法。
47. ウイルスゲノムが、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、水痘、天然痘ウイルス、Ｂ型肝炎、サイトメガロウイルス、ＪＣポリオーマウイルス、ＢＫポリオーマウイルス、サル痘ウイルス、帯状疱疹、エプスタイン−バーウイルス、ヒトヘルペスウイルス７型、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス、およびヒトパルボウイルスＢ１９からなる群から選択される、請求項４５に記載の方法。
48. ウイルスゲノムが、一本鎖である、請求項４５に記載の方法。
49. ウイルスゲノムが、ビリオン中にパッケージングされている、請求項４５に記載の方法。
50. ウイルスゲノムが、ヒト細胞に発現可能な遺伝子を送達するための遺伝子療法用ベクターである、請求項４５に記載の方法。
51. ウイルスゲノムが、標的腫瘍細胞を溶解するための細胞毒性ウイルスである、請求項４５に記載の方法。
52. 阻害性核酸配列が、ｃ４１オリゴヌクレオチド配列（配列番号１）を含む、請求項４５に記載の方法。
53. 阻害性核酸配列が、ｃ４１配列（配列番号１）の複数のコピーを含む、請求項４５に記載の方法。
54. 阻害性核酸配列が、リンカー配列によって分離されたｃ４１配列（配列番号１）の２つのコピーを含む、請求項４５に記載の方法。
55. リンカー配列が、ＡＡＡＡＡ（配列番号８）である、請求項５４に記載の方法。
56. 阻害性核酸配列が、細菌配列である、請求項４５に記載の方法。
57. ウイルスゲノムが、ヒト細胞への送達およびヒト細胞中での発現のための遺伝子を含む、請求項４５に記載の方法。
58. 投与する工程が反復される、請求項４５に記載の方法。
59. 組換えウイルスのウイルスゲノムを作製する方法であって、
    ウイルスゲノムに阻害性核酸配列を挿入する工程
    を含み、阻害性核酸配列は、ＴＬＲ９に結合するがＴＬＲ９の活性化を誘発しない、方法。
60. ウイルスゲノムをビリオン中にパッケージングする工程
    をさらに含む、請求項５９に記載の方法。
61. 挿入する工程が、ＤＮＡリガーゼを利用する、請求項５９に記載の方法。
62. ウイルスゲノムが、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、水痘、天然痘ウイルス、Ｂ型肝炎、サイトメガロウイルス、ＪＣポリオーマウイルス、ＢＫポリオーマウイルス、サル痘ウイルス、帯状疱疹、エプスタイン−バーウイルス、ヒトヘルペスウイルス７型、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス、およびヒトパルボウイルスＢ１９からなる群から選択される、請求項５９に記載の方法。
63. ウイルスゲノムが、ビリオン中にあるときに一本鎖である、請求項５９に記載の方法。
64. ウイルスゲノムが、ヒト細胞に発現可能な遺伝子を送達するための遺伝子療法用ベクターである、請求項５９に記載の方法。
65. ウイルスゲノムが、標的腫瘍細胞を溶解するための細胞毒性ウイルスである、請求項５９に記載の方法。
66. 阻害性核酸配列が、ｃ４１オリゴヌクレオチド配列（配列番号１）を含む、請求項５９に記載の方法。
67. 阻害性核酸配列が、ｃ４１配列（配列番号１）の複数のコピーを含む、請求項５９に記載の方法。
68. 阻害性核酸配列が、リンカー配列によって分離されたｃ４１配列（配列番号１）の２つのコピーを含む、請求項５９に記載の方法。
69. リンカー配列が、ＡＡＡＡＡ（配列番号８）である、請求項６８に記載の方法。
70. 阻害性核酸配列が、細菌配列である、請求項５９に記載の方法。
71. 組換えウイルスのウイルスゲノムが、ヒト細胞への送達およびヒト細胞中での発現のための遺伝子を含む、請求項５９に記載の方法。
72. 逆方向末端反復（ITR）およびＴＬＲ９によって媒介される炎症を阻害する核酸配列
    を含む核酸分子。
73. 哺乳動物細胞に所望の機能を送達するための組換えウイルスであって、
    ＴＬＲ９によって媒介される炎症を阻害する核酸配列を含むウイルスゲノム
    を含む、組換えウイルス。
74. 組換えウイルスのウイルスゲノムを作製する方法であって、
    ウイルスゲノムに核酸配列を挿入する工程
    を含み、前記核酸配列は、ＴＬＲ９によって媒介される炎症を阻害する、方法。
75. ＴＬＲ９によって媒介される炎症を阻害することが可能な少なくとも１つの核酸配列を含む核酸ベクター。
76. 複数の前記核酸配列を含む、請求項７５に記載の核酸ベクター。
77. リンカーが、前記核酸配列のそれぞれを分離している、請求項７５に記載の核酸ベクター。
78. 前記核酸配列の、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つのコピーを含む、請求項７５に記載の核酸ベクター。
79. 前記核酸が、遺伝子に共有結合で連結されている、請求項７５に記載の核酸ベクター。
80. ゲノムを有する改変されたウイルスの免疫原性を低減する方法であって、ゲノムに核酸配列を挿入する工程を含み、阻害性核酸配列は、ＴＬＲ９によって媒介される炎症を阻害し、それによって、改変されたウイルスは、前記核酸配列を含有しないウイルスと比較して、宿主における炎症応答の低減を引き起こす、方法。
81. ウイルスによって導入された導入遺伝子の宿主細胞における発現を増加させる方法であって、ゲノムを有する改変されたウイルスを宿主に導入する工程を含み、前記ゲノムは、核酸配列を含み、前記核酸配列は、ＴＬＲ９によって媒介される炎症を阻害し、それによって、改変されたウイルスは、前記核酸配列を含有しないウイルスと比較して、宿主細胞におけるより高い導入遺伝子発現をもたらす、方法。
82. ＴＬＲ９によって媒介される炎症を阻害する核酸配列をキャプシド封入しているウイルスキャプシドを含む組成物。
83. 阻害性核酸配列が、ｃ４１オリゴヌクレオチド配列ＴＧＧＣＧＣＧＣＡＣＣＣＡＣＧＧＣＣＴＧ（配列番号１）と９５％同一である、請求項２に記載の組換えウイルス。
84. 阻害性核酸配列が、配列番号９と９５％同一である、請求項２に記載の組換えウイルス。
85. 阻害性核酸配列が、
    ODN 2088: TCC TGG CGG GGA AGT（配列番号２）；
    ODN 4084-F: CCTGGATGGGAA（配列番号３）；
    ODN INH-1: CCTGGATGGGAATTCCCATCCAGG（配列番号４）；
    ODN INH-18: CCT GGA TGG GAA CTT ACC GCT GCA（配列番号５）；
    ODN TTAGGG: TT AGG GTT AGG GTT AGG GTT AGG G（配列番号６）；および
    G-ODN: CTC CTA TTG GGG GTT TCC TAT（配列番号７）
    からなる群から選択される配列と９５％同一である、請求項２に記載の組換えウイルス。
86. 阻害性核酸配列が、
    ODN 2114: TCCTGGAGGGGAAGT（配列番号１６）；
    ODN 4024: TCCTGGATGGGAAGT（配列番号１７）；
    ODN INH-4: TTCCCATCCAGGCCTGGATGGGAA（配列番号１８）；
    ODN INH-13: CTTACCGCTGCACCTGGATGGGAA（配列番号１９）；
    ODN Poly-G: GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG（配列番号２０）；
    ODN GpG: TGACTGTGAAGGTTAGAGATGA（配列番号２１）；
    ODN IRS-869: TCCTGGAGGGGTTGT（配列番号２２）；
    ODN IRS-954: TGCTCCTGGAGGGGTTGT（配列番号２３）；および
    ODN 21158: CCTGGCGGGG（配列番号２４）
    からなる群から選択される配列と９５％同一である、請求項２に記載の組換えウイルス。
87. 阻害性核酸配列が、配列番号６または配列番号９を含む、請求項４５に記載の方法。
88. 阻害性核酸配列が、配列番号６および／または配列番号９の複数のコピーを含む、請求項４５に記載の方法。
89. 阻害性核酸配列が、リンカー配列によって分離された配列番号６および／または配列番号９の２つのコピーを含む、請求項４５に記載の方法。
90. 阻害性核酸配列が、ヒト配列である、請求項４５に記載の方法。