JP2019514417A5

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Publication number: JP2019514417A5
Application number: JP2018559814A
Authority: JP
Filing date: 2017-05-11
Publication date: 2020-06-18
Anticipated expiration: 2037-05-11

Claims

ａ）第一のポリペプチドをコードする第一の核酸と、
ｂ）第二のポリペプチドをコードする第二の核酸であって、前記第二のポリペプチドが選択マーカーの最初の変異サブユニットである第二の核酸とを含み、
前記第一の核酸の転写物が前記第二の核酸の転写物に作動可能に連結され、
さらに、
ｃ）第三のポリペプチドをコードする第三の核酸であって、前記第三のポリペプチドが前記第一のポリペプチドと会合してヘテロマー複合体を形成することができる第三の核酸と、
ｄ）第四のポリペプチドをコードする第四の核酸であって、前記第四のポリペプチドが前記選択マーカーの相補的変異サブユニットである第四の核酸とを含み、
前記第三の核酸の転写物が前記第四の核酸の転写物に作動可能に連結され、
前記選択マーカーの最初の変異サブユニット及び前記相補的変異サブユニットは相互作用して選択活性を付与し、さらに、前記ベクターが哺乳類細胞にトランスフェクトされることができ、トランスフェクトされた細胞の選択を向上させることができる、前記ベクター。
ａ）選択マーカーの最初の変異サブユニットである第二のポリペプチドをコードする第二の核酸に作動可能に連結される第一のポリペプチドをコードする第一の核酸を含むバイシストロニック転写物をコードする第一のベクターと、
ｂ）第四のポリペプチドをコードする第四の核酸に作動可能に連結される第三のポリペプチドをコードする第三の核酸を含むバイシストロニック転写物をコードする第二のベクターを含む発現システムであって、前記第四のポリペプチドが前記選択マーカーの相補的変異サブユニットであり、前記選択マーカーの最初の変異サブユニットと会合して選択活性を付与することができ、さらに、前記第三のポリペプチドが前記第一のポリペプチドと会合してヘテロマー複合体を形成することができ、
さらに、前記発現システムが哺乳類細胞にトランスフェクトされることができ、前記細胞の選択を向上させることができる、前記発現システム。
前記ヘテロマー複合体が免疫グロブリンである、請求項１または２に記載のベクターまたは発現システム。
前記第一の核酸が免疫グロブリン重鎖をコードし、前記第三の核酸が免疫グロブリン軽鎖をコードする、請求項１〜３のいずれか一項に記載のベクターまたは発現システム。
前記選択マーカーが、グルタミンシンセターゼ、アルギノコハク酸リアーゼ、アデニロコハク酸シンセターゼ及びグルタミン酸デヒドロゲナーゼからなる群から選択される代謝酵素である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のベクターまたは発現システム。
ａ）前記第一の核酸と前記第二の核酸との間の部位、
ｂ）前記第三の核酸と前記第四の核酸との間の部位、
ｃ）第一と第二の核酸との間、及び第三と第四の核酸との間、の両方の部位、
からなる群から選択される部位に、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）が現れる、請求項１〜５のいずれか一項に記載のベクターまたは発現システム。
前記配列内リボソーム進入部位が配列番号２３を含む、請求項６に記載のベクターまたは発現システム。
前記選択マーカーの最初の変異サブユニットがグルタミンシンセターゼのＮ末端変異体（ｍｕｔＧＳ−ＮＴ）であり、且つ、前記選択マーカーの相補的変異サブユニットがグルタミンシンセターゼのＣ末端変異体（ｍｕｔＧＳ−ＣＴ）である、請求項１〜７のいずれか一項に記載のベクターまたは発現システム。
前記ｍｕｔＧＳ−ＮＴが、Ｗ６０ＡＮ６１ＡＤ６３ＡＤ６３ＲＳ６６Ａ及びＤ７６Ａからなる群から選択される２つまたはそれ以上の変異を含み、且つ、前記ｍｕｔＧＳ−ＣＴが、Ｅ１３４ＡＥ１３６ＡＥ１９６ＡＥ２０３ＡＮ２４８ＡＨ２５３ＡＮ２５５ＡＲ３１９Ａ及びＲ３２４Ａからなる群から選択される１つ以上の変異を含む請求項８に記載のベクターまたは発現システム。
前記ｍｕｔＧＳ−ＮＴが、Ｗ６０ＡＮ６１ＡＤ６３Ａ（ｍｕｔＧＳ−ＮＴ１；配列番号６）、Ｗ６０ＡＮ６１ＡＤ６３ＡＳ６６Ａ（ｍｕｔＧＳ−ＮＴ２；配列番号１０）、Ｗ６０ＡＮ６１ＡＤ６３ＡＳ６６ＡＤ７６Ａ（ｍｕｔＧＳ−ＮＴ３；配列番号２５）及びＷ６０ＡＮ６１ＡＤ６３ＲＳ６６Ａ（ｍｕｔＧＳ−ＮＴ４；配列番号１９）からなる群から選択され、且つ、前記ｍｕｔＧＳ−ＣＴが、Ｅ１３４ＡＥ１３６ＡＥ１９６ＡＥ２０３Ａ（ｍｕｔＧＳ−ＣＴ１；配列番号２１）及びＮ２４８ＡＨ２５３ＡＮ２５５Ａ（ｍｕｔＧＳ−ＣＴ２；配列番号２２）からなる群から選択される、請求項８または９に記載のベクターまたは発現システム。
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の前記ベクターまたは発現システムによりトランスフェクト、形質転換または形質導入された、単離された宿主細胞。
ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、Ｃｏｓ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、骨髄腫細胞株及びＷＩ３８細胞からなる群から選択される、請求項１１に記載の宿主細胞。
ヘテロマー複合体の産生方法であって、前記ヘテロマー複合体が請求項１１または１２に記載の前記宿主細胞によって発現される条件下で前記宿主細胞を培養する工程を含む、前記ヘテロマー複合体の産生方法。
前記宿主細胞が、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の前記ベクターにより形質転換または形質導入された場合、前記ヘテロマー複合体が抗体である、請求項１３に記載の方法。
前記ヘテロマー複合体を単離することをさらに含む、請求項１３または１４に記載の方法。
Ｎ末端変異グルタミンシンセターゼ（ｍｕｔＧＳ−ＮＴ）をコードする第二の核酸に作動可能に連結される抗体の重鎖をコードする第一の核酸を含む第一のベクターと、Ｃ末端変異グルタミンシンセターゼ（ｍｕｔＧＳ−ＣＴ）をコードする第四の核酸に作動可能に連結される抗体の軽鎖をコードする第三の核酸を含む第二のベクターと、を含む発現システムであって、グルタミンシンセターゼの各変異サブユニットが単独発現時には選択活性を持たず、ｍｕｔＧＳ−ＮＴとｍｕｔＧＳ−ＣＴとの共発現では、グルタミンシンセターゼ活性を付与し、前記発現システムが哺乳類細胞にトランスフェクトされることができ、トランスフェクトされた細胞の選択を向上させることができる、前記発現システム。
前記ｍｕｔＧＳ−ＮＴが、Ｗ６０ＡＮ６１ＡＤ６３ＡＤ６３ＲＳ６６Ａ及びＤ７６Ａからなる群から選択される２つまたはそれ以上の変異を含み、且つ、前記ｍｕｔＧＳ−ＣＴが、Ｅ１３４ＡＥ１３６ＡＥ１９６ＡＥ２０３ＡＮ２４８ＡＨ２５３ＡＮ２５５ＡＲ３１９Ａ及びＲ３２４Ａからなる群から選択される１つ以上の変異を含む、請求項１６に記載の発現システム。
前記ｍｕｔＧＳ−ＮＴが、Ｗ６０ＡＮ６１ＡＤ６３Ａ（ｍｕｔＧＳ−ＮＴ１；配列番号６）、Ｗ６０ＡＮ６１ＡＤ６３ＡＳ６６Ａ（ｍｕｔＧＳ−ＮＴ２；配列番号１０）、Ｗ６０ＡＮ６１ＡＤ６３ＡＳ６６ＡＤ７６Ａ（ｍｕｔＧＳ−ＮＴ３；配列番号２５）及びＷ６０ＡＮ６１ＡＤ６３ＲＳ６６Ａ（ｍｕｔＧＳ−ＮＴ４；配列番号１９）からなる群から選択され、且つ、前記ｍｕｔＧＳ−ＣＴが、Ｅ１３４ＡＥ１３６ＡＥ１９６ＡＥ２０３Ａ（ｍｕｔＧＳ−ＣＴ１；配列番号２１）及びＮ２４８ＡＨ２５３ＡＮ２５５Ａ（ｍｕｔＧＳ−ＣＴ２；配列番号２２）からなる群から選択される、請求項１６または１７に記載の発現システム。
選択マーカーの最初の変異サブユニットをコードする第二の核酸に作動可能に連結される所望のポリペプチドをコードする第一の核酸を含むバイシストロニック転写物をコードする第一のベクターと、選択マーカーの相補的変異サブユニットをコードする第四の核酸に作動可能に連結される第三の核酸を含むバイシストロニック転写物をコードする第二のベクターと、を含む発現システムであって、前記選択マーカーの第一及び相補的変異サブユニットが会合して選択活性を付与し、前記発現システムが哺乳類細胞にトランスフェクトされることができ、前記トランスフェクトされた細胞の選択を向上させることができ、さらに、前記第一の核酸が抗体重鎖をコードし、前記第三の核酸が抗体軽鎖をコードする、前記発現システム。
前記選択マーカーがグルタミンシンセターゼである、請求項１９に記載の発現システム。
前記グルタミンシンセターゼの最初の変異サブユニットが、Ｗ６０ＡＮ６１ＡＤ６３ＡＳ６６Ａ及びそれらの組み合わせからなる群より選択される変異を持つＮ末端変異体であり、且つ、前記グルタミンシンセターゼの相補的変異サブユニットが、Ｅ１３４ＡＥ１３６ＡＥ１９６ＡＥ２０３ＡＮ２４８ＡＨ２５３ＡＮ２５５ＡＲ３１９ＡＲ３２４Ａ及びこれらの組み合わせからなる群より選択される変異を持つＣ末端変異体である、請求項２０に記載の発現システム。
前記ｍｕｔＧＳ−ＮＴが、Ｗ６０ＡＮ６１ＡＤ６３Ａ（ｍｕｔＧＳ−ＮＴ１；配列番号６）、Ｗ６０ＡＮ６１ＡＤ６３ＡＳ６６Ａ（ｍｕｔＧＳ−ＮＴ２；配列番号１０）、Ｗ６０ＡＮ６１ＡＤ６３ＡＳ６６ＡＤ７６Ａ（ｍｕｔＧＳ−ＮＴ３；配列番号２５）及びＷ６０ＡＮ６１ＡＤ６３ＲＳ６６Ａ（ｍｕｔＧＳ−ＮＴ４；配列番号１９）からなる群から選択され、且つ、前記ｍｕｔＧＳ−ＣＴが、Ｅ１３４ＡＥ１３６ＡＥ１９６ＡＥ２０３Ａ（ｍｕｔＧＳ−ＣＴ１；配列番号２１）及びＮ２４８ＡＨ２５３ＡＮ２５５Ａ（ｍｕｔＧＳ−ＣＴ２；配列番号２２）からなる群から選択される、請求項２１に記載の発現システム。
請求項１６〜２２のいずれか一項に記載の発現システムによりトランスフェクト、形質転換または形質導入された、単離された宿主細胞。