JP2023554593A

JP2023554593A - フローサイトメトリー減弱レポーター発現（ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙａｔｔｅｎｕａｔｅｄｒｅｐｏｒｔｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）（ｆｌａｒｅ）マルチレポーター系およびその使用方法

Info

Publication number: JP2023554593A
Application number: JP2023530173A
Authority: JP
Inventors: ヴィクター・アール・ケアンズ; ダヴィド・レーチェック; ジェイソン・ヴィトゥコ
Original assignee: Genzyme Corp
Current assignee: Genzyme Corp
Priority date: 2020-11-19
Filing date: 2021-11-18
Publication date: 2023-12-28
Also published as: TW202237829A; KR20230109683A; EP4247947A1; AU2021381372A1; CN116615655A; US20240035022A1; MX2023005938A; WO2022109172A1; IL302786A; CA3199001A1

Abstract

哺乳動物宿主細胞において複数の標的ポリペプチドを高レベルで発現するための組成物および方法を提供する。各標的ポリペプチドは、一意的細胞表面マーカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列および一意的標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド上でコードされ、一意的細胞表面マーカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列および一意的標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の両方は、同じｍＲＮＡ上で転写される。各哺乳動物宿主細胞は、細胞が、複数の一意的標的ポリペプチドおよび複数の一意的細胞表面マーカーポリペプチドを発現することが可能であるように、複数の異なるポリヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、複数の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、ＣＤ５２のバリアントである。組成物および方法は、多量体標的タンパク質、例えば、交差二重可変ドメイン（ＣＯＤＶ）トリアボディを発現するために有用である。

Description

関連出願
本出願は、その全内容を参照によって本明細書に組み入れる、２０２０年１１月１９日に出願された米国特許出願第６３／１１６，０９４号の利益を主張する。

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子提出されていて、その全体を参照によって本明細書に組み入れる配列表を含む。前記ＡＳＣＩＩコピーは、２０２１年１１月２日に作成され、名称は７２３３３６＿ＳＡ９－２７１ＰＣ＿ＳＴ２５．ｔｘｔであり、サイズは１６，７２７バイトである。

本開示は、一般的に、治療タンパク質および診断タンパク質の産生にとって有用な高産生クローンを同定するためのハイスループット系および方法に関する。

治療タンパク質の商業的産生は、安定な高発現の組換え細胞株を必要とする。先行技術の方法は一般的に、タンパク質（複数可）を産生するクローン性細胞株を製造するために、ジヒドロ葉酸レダクターゼ欠乏（ＤＨＦＲ）チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株に依存している。トランスフェクトした細胞プールにメトトレキサート（ＭＴＸ）などの作用物質を使用して繰り返し選択に基づく増幅を行うと、高産生クローンが得られる。このプロセスは時間がかかり、労働集約型であり、タンパク質を高レベルで産生するクローンを特異的に同定しない。

蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を含むフローサイトメトリーは、高産生ＣＨＯ細胞株の開発および選択を改善するために使用されている。この技術は、不均一なトランスフェクト細胞集団からの高産生クローンの迅速な同定および単離を有効にし、それによってランダムクローニング方法に関連する労働および時間を節約する。これは、プールをＭＴＸによって繰り返し増幅する必要がなく、所望の細胞を同定することができる。

単細胞クローンは、ＦＡＣＳに基づく選別方法を介して単離されているが、安定な高産生細胞株を単離するために適切な数のクローンをスクリーニングすることはなおも時間のかかるプロセスである。したがって、非常に効率的で正確なスクリーニング方法は、この段階の細胞株作製において極めて有利である。加えて、例えば９６ウェルプレートのクローン作製段階でスクリーニングを実行することは、それが高い生産性を有するクローンのみをさらに増大させることに重点を置いていることから望ましい。細胞培養培地回収物の解析は、一般的に、高レベルの治療タンパク質を分泌するクローンを同定するために使用されている。しかしこの方法は、ウェル間の細胞密度または培地体積の差を説明しないことから最適ではない。そのため、これは高い特異的生産性および高い力価を有するクローンを正確に予測しないことがある。同様に、目的の各新規治療タンパク質に関する新規アッセイを開発および最適化するためにたびたび努力しなければならない。

商業目的のタンパク質は、共有結合および／または非共有結合により会合した２つまたはそれ以上のポリペプチド鎖で構成されることが多い。ヘテロ二量体の４量体であるＩｇＧ抗体およびその誘導体は、そのようなタンパク質の例である。多重鎖タンパク質の産生は典型的に、個々のポリペプチド鎖の同時発現およびタンパク質全体の単離を伴う。

特許文献１は、目的のポリペプチドを安定かつ高度に発現する組換え真核生物宿主細胞のクローン集団を同定、選択、および産生するための、治療タンパク質のハイスループット開発のためのＦＡＣＳおよびレポータータンパク質に基づく系を開示している。

特許文献２は、標的ポリペプチドを発現する産生細胞をバッチ選択するための蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）の方法を開示している。

ＷＯ２００８／０３６２５５ＷＯ２０１７／０６２７２２

目的の多重鎖タンパク質の高レベルを安定に産生する組換え細胞株を選択するためのクローン集団をスクリーニングするための組成物および方法が当技術分野でなおも必要である。本発明は、この必要性を満たし、関連する利点も提供する。

目的の多量体ポリペプチド（「標的ポリペプチド」）を、標的ポリペプチドの開発および大規模産生にとって好適な高レベルで安定に発現する組換え哺乳動物宿主細胞を同定、選択、および産生するために有用な方法および組成物を、本明細書に開示する。方法および組成物は、例えば交差二重可変ドメイン（ＣＯＤＶ）Ｉｇ様タンパク質を含む、操作された抗体の作製および大規模産生に利用される。ＳｔｅｉｎｍｅｔｚＡ．ら（２０１６）ＭＡｂ８（５）：８６７～８７８頁。

本開示の一態様は、複数の標的ポリペプチドを高レベルで発現させるための方法であって：
（ａ）各々が複数の組換えポリヌクレオチドを含む、複数の哺乳動物宿主細胞を培養する工程であって、
各組換えポリヌクレオチドが、プロモーター、一意的細胞表面マーカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および一意的標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、一意的細胞表面マーカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列および一意的標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の両方が同じｍＲＮＡ上で転写され、
培養する工程が、哺乳動物宿主細胞の表面上での各一意的細胞表面マーカーポリペプチドの発現および各一意的標的ポリペプチドの発現を許容する条件下で行われる工程；
（ｂ）工程（ａ）の培養哺乳動物宿主細胞を、各々が哺乳動物宿主細胞の表面上に発現される一意的細胞表面マーカーポリペプチドの１つまたはそれ以上に一意的に結合することが可能である複数の検出可能作用物質と接触させる工程；
（ｃ）工程（ｂ）からの接触させた細胞において少なくとも１ラウンドの蛍光活性化細胞選別を行い、それによって複数の検出可能作用物質の少なくとも１つが一意的に結合した１つまたはそれ以上の哺乳動物宿主細胞を選択する工程；
（ｄ）工程（ｃ）で選択された哺乳動物宿主細胞の１つまたはそれ以上のクローン集団を調製する工程；
（ｅ）前記クローン集団の各々における少なくとも２つの一意的細胞表面マーカーポリペプチドの発現レベルを検出することによって、工程（ｄ）からの１つまたはそれ以上のクローン集団を分析する工程；
（ｆ）少なくとも２つの一意的細胞表面マーカーポリペプチドの高い発現レベルを有する１つまたはそれ以上のクローン集団を選択する工程；ならびに
（ｇ）複数の標的ポリペプチドの高レベルでの発現を許容する条件下で、工程（ｆ）で選択された１つまたはそれ以上のクローン集団を培養する工程
を含む方法である。

ある特定の実施形態では、工程（ｃ）は、工程（ｂ）からの少なくとも第１の検出可能作用物質および第２の検出可能作用物質と接触させた細胞において１ラウンドの蛍光活性化細胞選別を行い、それによって第１の検出可能作用物質および第２の検出可能作用物質の少なくとも両方が一意的に結合した１つまたはそれ以上の哺乳動物宿主細胞を選択する工程を含む。

ある特定の実施形態では、工程（ｃ）は、
（ｃ１）少なくとも第１の細胞表面マーカーポリペプチドについて第１のラウンドの蛍光活性化細胞選別を行い、それによって少なくとも第１の検出可能作用物質が結合した１つまたはそれ以上の哺乳動物宿主細胞を選択する工程；ならびに
（ｃ２）工程（ｃ１）で選択された細胞において、少なくとも第２の細胞表面マーカーポリペプチドについて第２のラウンドの蛍光活性化細胞選別を行い、それによって第１の検出可能作用物質および第２の検出可能作用物質の少なくとも両方が結合した１つまたはそれ以上の哺乳動物宿主細胞を選択する工程
を含む。

ある特定の実施形態では、工程（ｅ）は、工程（ｄ）の７～２８日後に行われる。

ある特定の実施形態では、工程（ｅ）における分析する工程は、フローサイトメトリーを含む。

ある特定の実施形態では、工程（ｆ）における複数の一意的細胞表面マーカーポリペプチドの少なくとも１つの発現レベルは、工程（ｅ）で分析した少なくとも７０％のクローン集団の対応する発現レベルより高い。

ある特定の実施形態では、工程（ｆ）における複数の一意的細胞表面マーカーポリペプチドの各々の発現レベルは、工程（ｅ）で分析した少なくとも７０％のクローン集団の対応する発現レベルより高い。

ある特定の実施形態では、工程（ｆ）における複数の一意的細胞表面ポリペプチドの少なくとも第１の発現レベルは、工程（ｆ）における複数の一意的細胞表面ポリペプチドの少なくとも第２の発現レベルより高い。

ある特定の実施形態では、工程（ｆ）における複数の一意的細胞表面ポリペプチドの第１の発現レベルは、工程（ｆ）における複数の一意的細胞表面ポリペプチドの第２の発現レベルより高い。

ある特定の実施形態では、方法は：
（ｈ）工程（ｇ）において発現された少なくとも第１の一意的標的ポリペプチドおよび第２の一意的標的ポリペプチドを、１つもしくはそれ以上の選択されたクローン集団から、または１つもしくはそれ以上の選択されたクローン集団を培養する細胞培養培地から単離する工程
をさらに含む。

ある特定の実施形態では、複数の一意的標的ポリペプチドは、２～８個の一意的標的ポリペプチドを含む。

ある特定の実施形態では、複数の一意的標的ポリペプチドは、２～４個の一意的標的ポリペプチドを含む。

ある特定の実施形態では、複数の一意的標的ポリペプチドは、２つの一意的標的ポリペプチドを含む。

ある特定の実施形態では、複数の一意的標的ポリペプチドは、３つの一意的標的ポリペプチドを含む。

ある特定の実施形態では、複数の一意的標的ポリペプチドは、４つの一意的標的ポリペプチドを含む。

ある特定の実施形態では、各組換えポリヌクレオチドは、５’から３’に、プロモーター、一意的細胞表面マーカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および一意的標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。

ある特定の実施形態では、各組換えポリヌクレオチドは、１～４個のプロモーター、各々が一意的細胞表面マーカーポリペプチドをコードする１～４個のヌクレオチド配列、および各々が一意的標的ポリペプチドをコードする１～４個のヌクレオチド配列を含み、一意的細胞表面マーカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の１つは、一意的標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の１つと同じｍＲＮＡ上で転写される。

ある特定の実施形態では、各組換えポリヌクレオチドは、２つのプロモーターおよび各々が一意的標的ポリペプチドをコードする２つのヌクレオチド配列を含み、各々が一意的細胞表面マーカーポリペプチドをコードする１つまたは２つのヌクレオチド配列をさらに含む、バイシストロニックポリヌクレオチドである。

ある特定の実施形態では、各バイシストロニックポリヌクレオチドは、一意的細胞表面マーカーポリペプチドをコードする単一のヌクレオチド配列を含む。

ある特定の実施形態では、各バイシストロニックポリヌクレオチドは、各々が一意的細胞表面マーカーポリペプチドをコードする２つのヌクレオチド配列を含み、一意的細胞表面マーカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の各々１つは、一意的標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の１つと同じｍＲＮＡ上で転写される。

ある特定の実施形態では、各組換えポリヌクレオチドは、５’から３’に、１～４個のプロモーターのうちの１つ、一意的細胞表面マーカーポリペプチドをコードする１～４個のヌクレオチド配列のうちの１つ、および一意的標的ポリペプチドをコードする１～４個のヌクレオチド配列のうちの１つを含む。ある特定の実施形態では、各組換えポリヌクレオチドは、１つのプロモーター、一意的細胞表面マーカーポリペプチドをコードする１つのヌクレオチド配列、および一意的標的ポリペプチドをコードする１つのヌクレオチド配列を含み、一意的細胞表面マーカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、一意的標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と同じｍＲＮＡ上で転写される。

ある特定の実施形態では、各組換えポリヌクレオチドは、一意的細胞表面マーカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の３’および一意的標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の５’に位置する配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）をさらに含む。

ある特定の実施形態では、各組換えポリヌクレオチドは、一意的細胞表面マーカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の翻訳開始のための代替（非ＡＴＧ）開始コドン、および一意的標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の翻訳開始のためのＡＴＧ開始コドンをさらに含む。

ある特定の実施形態では、各代替（非ＡＴＧ）開始コドンは、ＣＴＧ、ＧＴＧ、ＴＴＧ、ＡＴＴ、ＡＴＡ、およびＡＣＧからなる群から独立して選択される。

ある特定の実施形態では、各代替（非ＡＴＧ）開始コドンは、ＧＴＧおよびＴＴＧからなる群から独立して選択される。

ある特定の実施形態では、一意的細胞表面マーカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、いかなるＡＴＧトリプレットも欠如している。

ある特定の実施形態では、少なくとも第１の組換えポリヌクレオチドは、５’から３’に、第１のプロモーター、第１の一意的細胞表面マーカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および第１の一意的標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み；ならびに少なくとも第２の組換えポリヌクレオチドは、５’から３’に、第２のプロモーター、第２の一意的標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および第２の一意的細胞表面マーカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。

ある特定の実施形態では、第１の組換えポリヌクレオチドは、第１の一意的細胞表面マーカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の３’および第１の一意的標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の５’に位置する配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）をさらに含む。

ある特定の実施形態では、第１の組換えポリヌクレオチドは、第１の一意的細胞表面マーカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の翻訳開始のための代替（非ＡＴＧ）開始コドン、および第１の一意的標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の翻訳開始のためのＡＴＧ開始コドンをさらに含む。

ある特定の実施形態では、代替（非ＡＴＧ）開始コドンは、ＣＴＧ、ＧＴＧ、ＴＴＧ、ＡＴＴ、ＡＴＡ、およびＡＣＧからなる群から選択される。

ある特定の実施形態では、代替（非ＡＴＧ）開始コドンは、ＧＴＧおよびＴＴＧからなる群から選択される。

ある特定の実施形態では、第１の一意的細胞表面マーカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、いかなるＡＴＧトリプレットも欠如している。

ある特定の実施形態では、第２の組換えポリヌクレオチドは、第２の一意的標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の３’および第２の一意的細胞表面マーカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の５’に位置する配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）をさらに含む。

ある特定の実施形態では、各組換えポリヌクレオチドは、５’から３’に、プロモーター、一意的標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および一意的細胞表面マーカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。

ある特定の実施形態では、各組換えポリヌクレオチドは、一意的標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の３’および一意的細胞表面マーカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の５’に位置する配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）をさらに含む。

ある特定の実施形態では、少なくとも１つのプロモーターは、β－アクチンプロモーターである。

ある特定の実施形態では、各プロモーターは、β－アクチンプロモーターである。

ある特定の実施形態では、少なくとも１つのプロモーターは、ハムスターβ－アクチンプロモーターである。

ある特定の実施形態では、各プロモーターは、ハムスターβ－アクチンプロモーターである。

ある特定の実施形態では、少なくとも第１の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、ＣＤ２０、ＣＤ５２、ＣＤ５９、およびそのバリアントからなる群から選択される。

ある特定の実施形態では、少なくとも第２の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、ＣＤ２０、ＣＤ５２、ＣＤ５９、およびそのバリアントからなる群から選択される。

ある特定の実施形態では、各一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、ＣＤ２０、ＣＤ５２、ＣＤ５９、およびそのバリアントからなる群から選択される。

ある特定の実施形態では、少なくとも第１の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、ヒトＣＤ５２およびそのバリアントからなる群から選択される。

ある特定の実施形態では、少なくとも第２の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、ヒトＣＤ５２およびそのバリアントからなる群から選択される。

ある特定の実施形態では、各一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、ヒトＣＤ５２およびそのバリアントからなる群から選択される。

ある特定の実施形態では、少なくとも第１の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、ＣＤ２０、ＣＤ５２、およびＣＤ５９からなる群から選択される。

ある特定の実施形態では、少なくとも第２の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、ＣＤ２０、ＣＤ５２、およびＣＤ５９からなる群から選択される。

ある特定の実施形態では、各一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、ＣＤ２０、ＣＤ５２、およびＣＤ５９からなる群から選択される。

ある特定の実施形態では、少なくとも第１の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、ヒトＣＤ５２である。

ある特定の実施形態では、少なくとも第２の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、ヒトＣＤ５２である。

ある特定の実施形態では、少なくとも１つの一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号１９（ＧＸ_２ＮＤＴＳＱＴＳＳＰＳ）に記載のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２であり、式中Ｘ_２は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、およびＶからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、Ｘ_２はＡである。

ある特定の実施形態では、少なくとも１つの一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号２０（ＧＱＮＸ_４ＴＳＱＴＳＳＰＳ）に記載のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２であり、式中Ｘ_４は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、およびＶからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、Ｘ_４はＡである。

ある特定の実施形態では、少なくとも１つの一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号２１（ＧＱＮＤＴＳＸ_７ＴＳＳＰＳ）に記載のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２であり、式中Ｘ_７は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、およびＶからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、Ｘ_７はＡである。

ある特定の実施形態では、少なくとも１つの一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号２２（ＧＱＮＤＴＳＱＸ_８ＳＳＰＳ）に記載のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２であり、式中Ｘ_８は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、およびＶからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、Ｘ_８はＡである。

ある特定の実施形態では、少なくとも１つの一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号２３（ＧＱＮＤＴＳＱＸ_８Ｘ_９ＳＰＳ）に記載のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２であり、式中Ｘ_８およびＸ_９の各々は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、およびＶからなる群から独立して選択される。ある特定の実施形態では、Ｘ_８およびＸ_９の各々はＡである。

ある特定の実施形態では、少なくとも１つの一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号２４（ＧＱＮＤＴＳＱＸ_８ＳＸ_１０ＰＳ）に記載のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２であり、式中Ｘ_８およびＸ_１０の各々は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、およびＶからなる群から独立して選択される。ある特定の実施形態では、Ｘ_８およびＸ_１０の各々はＡである。

ある特定の実施形態では、少なくとも１つの一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号２５（ＧＱＮＤＴＳＱＸ_８Ｘ_９Ｘ_１０ＰＳ）に記載のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２であり、式中Ｘ_８、Ｘ_９、およびＸ_１０の各々は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、およびＶからなる群から独立して選択される。ある特定の実施形態では、Ｘ_８、Ｘ_９、およびＸ_１０の各々はＡである。

ある特定の実施形態では、少なくとも１つの一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号２６（ＧＸ_２ＮＤＴＳＱＸ_８Ｘ_９ＳＰＳ）に記載のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２であり、式中Ｘ_２、Ｘ_８、およびＸ_９の各々は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、およびＶからなる群から独立して選択される。ある特定の実施形態では、Ｘ_２、Ｘ_８、およびＸ_９の各々はＡである。

ある特定の実施形態では、少なくとも１つの一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号２７（ＧＸ_２ＮＤＴＳＱＸ_８ＳＸ_１０ＰＳ）に記載のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２であり、式中Ｘ_２、Ｘ_８、およびＸ_１０の各々は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、およびＶからなる群から独立して選択される。ある特定の実施形態では、Ｘ_２、Ｘ_８、およびＸ_１０の各々はＡである。

ある特定の実施形態では、少なくとも１つの一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号２８（ＧＱＮＤＴＳＸ_７Ｘ_８Ｘ_９ＳＰＳ）に記載のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２であり、式中Ｘ_７、Ｘ_８、およびＸ_９の各々は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、およびＶからなる群から独立して選択される。ある特定の実施形態では、Ｘ_７、Ｘ_８、およびＸ_９の各々はＡである。

ある特定の実施形態では、少なくとも１つの一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号２９（ＧＱＮＤＴＳＸ_７Ｘ_８ＳＸ_１０ＰＳ）に記載のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２であり、式中Ｘ_７、Ｘ_８、およびＸ_１０の各々は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、およびＶからなる群から独立して選択される。ある特定の実施形態では、Ｘ_７、Ｘ_８、およびＸ_１０の各々はＡである。

ある特定の実施形態では、少なくとも第１の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号１９（ＧＸ_２ＮＤＴＳＱＴＳＳＰＳ）に記載のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２を含み、式中Ｘ_２は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、およびＶからなる群から選択され；ならびに少なくとも第２の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号２０（ＧＱＮＸ_４ＴＳＱＴＳＳＰＳ）および配列番号２１（ＧＱＮＤＴＳＸ_７ＴＳＳＰＳ）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２を含み、式中Ｘ_４およびＸ_７の各々は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、およびＶからなる群から独立して選択される。

ある特定の実施形態では、少なくとも第１の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号１９（ＧＸ_２ＮＤＴＳＱＴＳＳＰＳ）に記載のアミノ酸配列からなるバリアントヒトＣＤ５２からなり、式中Ｘ_２は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、およびＶからなる群から選択され；ならびに少なくとも第２の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号２０（ＧＱＮＸ_４ＴＳＱＴＳＳＰＳ）および配列番号２１（ＧＱＮＤＴＳＸ_７ＴＳＳＰＳ）からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるバリアントヒトＣＤ５２からなり、式中Ｘ_４およびＸ_７の各々は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、およびＶからなる群から独立して選択される。

ある特定の実施形態では、少なくとも第１の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号２（ＧＡＮＤＴＳＱＴＳＳＰＳ）に記載のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２を含み；ならびに少なくとも第２の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号４（ＧＱＮＡＴＳＱＴＳＳＰＳ）および配列番号７（ＧＱＮＤＴＳＡＴＳＳＰＳ）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２を含む。

ある特定の実施形態では、少なくとも第１の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号２（ＧＡＮＤＴＳＱＴＳＳＰＳ）に記載のアミノ酸配列からなるバリアントヒトＣＤ５２からなり；ならびに少なくとも第２の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号４（ＧＱＮＡＴＳＱＴＳＳＰＳ）および配列番号７（ＧＱＮＤＴＳＡＴＳＳＰＳ）からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるバリアントヒトＣＤ５２からなる。

ある特定の実施形態では、少なくとも第１の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号２（ＧＡＮＤＴＳＱＴＳＳＰＳ）に記載のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２を含み；および少なくとも第２の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号４（ＧＱＮＡＴＳＱＴＳＳＰＳ）に記載のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２を含む。

ある特定の実施形態では、少なくとも第１の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号２（ＧＡＮＤＴＳＱＴＳＳＰＳ）に記載のアミノ酸配列からなるバリアントヒトＣＤ５２からなり；および少なくとも第２の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号４（ＧＱＮＡＴＳＱＴＳＳＰＳ）に記載のアミノ酸配列からなるバリアントヒトＣＤ５２からなる。

ある特定の実施形態では、少なくとも第１の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号２（ＧＡＮＤＴＳＱＴＳＳＰＳ）に記載のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２を含み；および少なくとも第２の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号７（ＧＱＮＤＴＳＡＴＳＳＰＳ）に記載のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２を含む。

ある特定の実施形態では、少なくとも第１の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号２（ＧＡＮＤＴＳＱＴＳＳＰＳ）に記載のアミノ酸配列からなるバリアントヒトＣＤ５２からなり；および少なくとも第２の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号７（ＧＱＮＤＴＳＡＴＳＳＰＳ）に記載のアミノ酸配列からなるバリアントヒトＣＤ５２からなる。

ある特定の実施形態では、少なくとも第１の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号４（ＧＱＮＡＴＳＱＴＳＳＰＳ）に記載のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２を含み；および少なくとも第２の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号７（ＧＱＮＤＴＳＡＴＳＳＰＳ）に記載のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２を含む。

ある特定の実施形態では、少なくとも第１の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号２０（ＧＱＮＸ_４ＴＳＱＴＳＳＰＳ）に記載のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２を含み；少なくとも第２の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号２３（ＧＸ_２ＮＤＴＳＱＸ_８Ｘ_９ＳＰＳ）に記載のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２を含み；および少なくとも第３の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号２８（ＧＱＮＤＴＳＸ_７Ｘ_８Ｘ_９ＳＰＳ）に記載のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２を含み、式中Ｘ_４、Ｘ_７、Ｘ_８、およびＸ_９の各々は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、およびＶからなる群から独立して選択される。

ある特定の実施形態では、少なくとも第１の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号２０（ＧＱＮＸ_４ＴＳＱＴＳＳＰＳ）に記載のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２を含み；少なくとも第２の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号２７（ＧＸ_２ＮＤＴＳＱＸ_８ＳＸ_１０ＰＳ）に記載のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２を含み；および少なくとも第３の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号２９（ＧＱＮＤＴＳＸ_７Ｘ_８ＳＸ_１０ＰＳ）に記載のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２を含み、式中Ｘ_４、Ｘ_７、Ｘ_８、およびＸ_１０の各々は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、およびＶからなる群から独立して選択される。

ある特定の実施形態では、少なくとも第１の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号４（ＧＱＮＡＴＳＱＴＳＳＰＳ）に記載のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２を含み；少なくとも第２の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号１５（ＧＡＮＤＴＳＱＡＡＳＰＳ）に記載のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２を含み；および少なくとも第３の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号１７（ＧＱＮＤＴＳＡＡＡＳＰＳ）に記載のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２を含む。

ある特定の実施形態では、少なくとも第１の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号４（ＧＱＮＡＴＳＱＴＳＳＰＳ）に記載のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２を含み；少なくとも第２の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号１６（ＧＡＮＤＴＳＱＡＳＡＰＳ）に記載のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２を含み；および少なくとも第３の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号１８（ＧＱＮＤＴＳＡＡＳＡＰＳ）に記載のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２を含む。

ある特定の実施形態では、少なくとも１つの一意的標的ポリペプチドは、治療ポリペプチドまたは治療タンパク質を含む。

ある特定の実施形態では、少なくとも１つの一意的標的ポリペプチドは、多重鎖タンパク質のポリペプチドである。

ある特定の実施形態では、各一意的標的ポリペプチドは、多重鎖タンパク質のポリペプチドである。

ある特定の実施形態では、少なくとも１つの一意的標的ポリペプチドは、抗体のポリペプチドである。

ある特定の実施形態では、各一意的標的ポリペプチドは、抗体のポリペプチドである。

ある特定の実施形態では、少なくとも１つの一意的標的ポリペプチドは、交差二重可変ドメイン（ＣＯＤＶ）Ｉｇ様タンパク質のポリペプチドである。

ある特定の実施形態では、各一意的標的ポリペプチドは、交差二重可変ドメイン（ＣＯＤＶ）Ｉｇ様タンパク質のポリペプチドである。

ある特定の実施形態では、少なくとも１つの一意的標的ポリペプチドは、ＣＯＤＶトリアボディのポリペプチドである。

ある特定の実施形態では、各一意的標的ポリペプチドは、ＣＯＤＶトリアボディのポリペプチドである。

ある特定の実施形態では、組換え哺乳動物宿主細胞はＣＨＯ細胞である、

本開示のさらなる態様は、複数の組換えポリヌクレオチドを含む操作された哺乳動物宿主細胞であって、各組換えポリヌクレオチドが、プロモーター、一意的細胞表面マーカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および一意的標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、一意的細胞表面マーカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列および一意的標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の両方が同じｍＲＮＡ上で転写される、操作された哺乳動物宿主細胞である。

ある特定の実施形態では、各プロモーターはβ－アクチンプロモーターである。

ある特定の実施形態では、少なくとも第１の一意的細胞表面マーカーポリペプチドはヒトＣＤ５２である。

ある特定の実施形態では、少なくとも第２の一意的細胞表面マーカーポリペプチドはヒトＣＤ５２である。

ある特定の実施形態では、組換え哺乳動物宿主細胞は、ＣＨＯ細胞である。

本開示のさらなる態様は、配列番号１９（ＧＸ_２ＮＤＴＳＱＴＳＳＰＳ）からなるアミノ酸配列を含む単離されたバリアントヒトＣＤ５２であり、式中Ｘ_２は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、およびＶからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、Ｘ_２はＡである。

本開示のさらなる態様は、配列番号２０（ＧＱＮＸ_４ＴＳＱＴＳＳＰＳ）からなるアミノ酸配列を含む単離されたバリアントヒトＣＤ５２であり、式中Ｘ_４はＡ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、およびＶからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、Ｘ_４はＡである。

なお本開示のさらなる態様は、配列番号２２（ＧＱＮＤＴＳＱＸ_８ＳＳＰＳ）からなるアミノ酸配列を含む単離されたバリアントヒトＣＤ５２であり、式中Ｘ_８は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、およびＶからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、Ｘ_８はＡである。

本開示に従う組換えポリヌクレオチドおよび対応するｍＲＮＡ転写物の概略図である。この図では、単一の代表的な組換えポリヌクレオチドのみを示す。一意的細胞表面マーカーポリペプチド（レポーター）をコードするヌクレオチド配列は、ＴＴＧ開始コドンを有し、一意的標的ポリペプチド（治療タンパク質）をコードするヌクレオチド配列はＡＴＧ開始コドンを有する。野生型ｈＣＤ５２（ＷＴ）、および各々がＷＴの表記のアミノ酸をアラニン（Ａ）に置換したｈＣＤ５２の１０個の単一の点突然変異体の各々を発現するＣＨＯ細胞に対するｍＡｂ４Ｂ１０および７Ｆ１１の結合を表すグラフである。非トランスフェクトＣＨＯ細胞（ＣＨＯ親）に対する結合も示す。野生型ｈＣＤ５２（ＷＴ）、および各々がＷＴの表記のアミノ酸をアラニン（Ａ）に置換したｈＣＤ５２の１０個の単一の点突然変異体の各々を発現するＣＨＯ細胞に対するｍＡｂＣＦ１Ｄ１２、５Ｆ７、３Ｇ７、４Ｇ７、９Ｄ９、および１１Ｃ１１の結合を表すグラフである。非トランスフェクトＣＨＯ細胞（ＣＨＯ親）に対する結合も示す。野生型ｈＣＤ５２（ＷＴ）、および各々がＷＴの表記のアミノ酸をアラニン（Ａ）に置換したｈＣＤ５２の１０個の単一の点突然変異体の各々を発現するＣＨＯ細胞に対するｍＡｂＣａｍｐａｔｈ－１Ｈ、２Ｃ３、１２Ｇ６、および２３Ｅ６の結合を表すグラフである。非トランスフェクトＣＨＯ細胞（ＣＨＯ親）に対する結合も示す。天然（野生型）ｈＣＤ５２（配列番号３０）、ならびに最適なコザック構成を有する非ＡＵＧ（代替）開始コドン、全ての内部ＡＴＧコドンの突然変異、除去されたスプライス部位、およびｈＣＤ５２の４位のアミノ酸のアスパラギン酸をアラニンに置換した単一の点突然変異を含む、操作された突然変異体ｈＣＤ５２（Ｍｕｔ４；配列番号３１）の配列アライメントを表す図である。Ｍｕｔ４には、Ｃａｍｐａｔｈ－１Ｈ（Ｃ－１Ｈ）が結合するが、ｍＡｂ９Ｄ９は結合しない。示される部分的アミノ酸配列は配列番号４に対応する。天然（野生型）ｈＣＤ５２（配列番号３０）、ならびに最適なコザック構成を有する非ＡＵＧ（代替）開始コドン、全ての内部ＡＴＧコドンの突然変異、除去されたスプライス部位、およびｈＣＤ５２の８位のアミノ酸のトレオニンをアラニンに置換した単一の点突然変異を含む、操作された突然変異体ｈＣＤ５２（Ｍｕｔ８；配列番号３２）の配列アライメントを表す図である。Ｍｕｔ８には、ｍＡｂ９Ｄ９が結合するが、Ｃａｍｐａｔｈ－１Ｈ（Ｃ－１Ｈ）は結合しない。示される部分的アミノ酸配列は配列番号８に対応する。天然（野生型）ｈＣＤ５２（配列番号３０）、ならびに最適なコザック構成を有する非ＡＵＧ（代替）開始コドン、全ての内部ＡＴＧコドンの突然変異、除去されたスプライス部位、およびｈＣＤ５２の８位のアミノ酸のトレオニンをアラニンに置換し、ｈＣＤ５２の１０位のアミノ酸のセリンをアラニンに置換した２つの点突然変異を含む、操作された突然変異体ｈＣＤ５２（Ｍｕｔ８／１０；配列番号３３）の配列アライメントを表す図である。Ｍｕｔ８／１０には、ｍＡｂ９Ｄ９が結合するが、Ｃａｍｐａｔｈ－１Ｈ（Ｃ－１Ｈ）は結合しない。示される部分的アミノ酸配列は配列番号１３に対応する。ｈＣＤ５２の各突然変異体をコードするポリヌクレオチドがＡＴＧ開始コドンを有する、ｈＣＤ５２の表記の突然変異体に対するＣａｍｐａｔｈ－１Ｈまたは９Ｄ９の結合を表す４つのフローサイトメトリーヒストグラムの図である。ｈＣＤ５２の各突然変異体をコードするポリヌクレオチドがＡＴＧ開始コドンを有する、ｈＣＤ５２の表記の突然変異体に対するＣａｍｐａｔｈ－１Ｈまたは９Ｄ９の結合を表す４つのフローサイトメトリーヒストグラムの図である。ｈＣＤ５２の各突然変異体をコードするポリヌクレオチドが表記の開始コドン（ＡＴＧ、ＣＴＧ、ＧＴＧ、またはＴＴＧ）を有する、ｈＣＤ５２の表記の突然変異体に対するＣａｍｐａｔｈ－１Ｈまたは９Ｄ９の結合を表す４つのフローサイトメトリーヒストグラムの図である。各ｈＣＤ５２突然変異体が、表記の開始コドン（ＡＴＧ、ＣＴＧ、ＧＴＧ、またはＴＴＧ）を有するポリヌクレオチドによってコードされる、Ｃａｍｐａｔｈ－１Ｈまたは９Ｄ９によるＭｕｔ４（左のグラフ）およびＭｕｔ８（右のグラフ）の相対的結合を表す一対の棒グラフの図である。レポーターの開始コドン（ＡＴＧ／ＡＵＧ、ＣＴＧ／ＣＵＧ、ＧＴＧ、またはＴＴＧ）の選択に応じたレポーター発現および目的の遺伝子（ＧＯＩ）発現の相対的レベルを表すフローサイトメトリーヒストグラムの図である。表される部分的配列は配列番号３５～３８に対応する。表記のｈＣＤ５２突然変異体（Ｍｕｔ４、Ｍｕｔ２／８／９、およびＭｕｔ７／８／９）および表記の抗体（７Ｆ１１、９Ｄ９、およびＣａｍｐａｔｈ－１Ｈ）を図１１－１の続き。図１１－２の続き。表記のｈＣＤ５２突然変異体（Ｍｕｔ４、Ｍｕｔ２／８／１０、およびＭｕｔ７／８／１０）および表記の抗体（７Ｆ１１、９Ｄ９、およびＣａｍｐａｔｈ－１Ｈ）を使用する３レポーター系のスキームを表す一連の棒グラフの図である。図１２－１の続き。図１２－２の続き。ＣＯＤＶトリアボディをコードする４つのベクターを表す概略図である。この系では２つのレポーターが存在する。ＣＯＤＶトリアボディをコードする２つのバイシストロニックベクターを表す概略図である。この系では２つのレポーターが存在する。

本開示を通して、様々な刊行物、特許および公開された特許明細書が、識別する引用によって参照されている。これらの刊行物、特許、および公開された特許明細書の開示は、本発明が属する技術の現状をより十分に説明するために本開示にこれにより参照によって本明細書に組み入れる。

本明細書で使用される場合、ある特定の用語は以下の定義された意味を有する。

Ｉ．定義
本発明の実施は、特に示していない限り、当業者の範囲内である、免疫学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、および組換えＤＮＡの通常の技術を使用する。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、第２版（１９８９）；ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、（１９８７））；ｔｈｅｓｅｒｉｅｓＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．）：ＰＣＲ２：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ．Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＧ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ編（１９９５））、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ編（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、ａｎｄＡｎｉｍａｌＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編（１９８７））を参照されたい。

本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、その文脈が明白に指示していない限り複数形を含む。例えば、「１つの細胞」という用語は、その混合物を含む複数の細胞を含む。

本明細書で使用される場合、「含む」という用語は、組成物および方法が列挙された要素を含むが、他の要素を除外しないことを意味すると意図される。組成物および方法を定義するために使用する場合の「から本質的になる」は、組合せに対して本質的に重要な何らかの他の要素を除外することを意味する。このように、本明細書において定義される、要素から本質的になる組成物は、単離および精製方法からの微量の夾雑物、ならびにリン酸緩衝食塩水、保存剤などのような薬学的に許容される担体を除外しない。「からなる」は、他の成分の微量を超える要素および本発明の組成物を投与するための実質的な方法工程を超えるものを除外することを意味する。これらの転換語の各々によって定義された実施形態は、本発明の範囲内である。

本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」、または「ヌクレオチド配列」という用語は、任意の長さのヌクレオチドのポリマー型を意図し、その例としては、これらに限定されないが、遺伝子または遺伝子断片、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、組換えポリヌクレオチド、分枝状ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマーが挙げられる。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログのような改変ヌクレオチドを含んでもよい。

本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」という用語は、任意の長さのアミノ酸またはアミノ酸アナログのポリマー型を指し、その例は、全長の一本鎖ポリペプチド、全長の一本鎖タンパク質、全長の一本鎖ポリペプチドの断片、全長の一本鎖タンパク質の断片；全長の多重鎖ポリペプチド、全長の多重鎖タンパク質、全長の多重鎖ポリペプチドの断片、全長の多重鎖タンパク質の断片；ならびに多重鎖ポリペプチドの全長の一本鎖、多重鎖タンパク質の全長の一本鎖、全長の多重鎖ポリペプチドの一本鎖の断片、および全長の多重鎖タンパク質の一本鎖の断片を含む。

本明細書で使用される場合、「多重鎖ポリペプチド」または「多重鎖タンパク質」は、２つまたはそれ以上の一本鎖ポリペプチドで構成される任意のポリペプチドまたはタンパク質を指す。２つまたはそれ以上の一本鎖ポリペプチドは、共有結合、例えばジスルフィド結合、および／または非共有結合、例えばイオン結合もしくは水素結合の任意の組合せによって会合することができる。例えば、従来のＩｇＧ抗体は、ヒンジ領域において１つまたはそれ以上のジスルフィド結合によって連結された２つの重鎖および２つの軽鎖で構成され、各軽鎖は、そのそれぞれの可変軽鎖（ＶＬ）ドメインと可変重鎖（ＶＨ）ドメインの間の１つまたはそれ以上のジスルフィド結合によって単一の重鎖に連結されている。別の例として、ＣＯＤＶトリアボディは、２つの異なる重鎖（ＣＯＤＶ重鎖およびＦａｂ重鎖、相互のノブとホールを有する）、および２つの異なる軽鎖（ＣＯＤＶ軽鎖およびＦａｂ軽鎖）で構成される。

多量体タンパク質とも呼ばれる多重鎖タンパク質の追加の例としては、これらに限定されないが、ある特定の酵素、イオンチャネル、受容体、細胞接着分子、電位依存性カリウムチャネル、および治療タンパク質（例えば、インスリンおよびα－ガラクトシダーゼ）を含む、ホモマーおよびヘテロマーの多量体タンパク質が挙げられる。多くの可溶性および膜タンパク質が、細胞においてホモ多量体複合体を形成し、タンパク質データバンクにおけるタンパク質の大部分がホモ多量体である。原核生物におけるタンパク質のおよそ６５％および真核細胞におけるタンパク質の５５％が二量体または高次複合体として存在する（細胞骨格、リボソームなどのような高度高次構造を含まない）。複合体の中で、ホモマーは、単細胞種ではヘテロマーより約４倍高い頻度であるが、２つのタイプは脊椎動物では等しい頻度である。その結果、ヘテロマーは、単細胞種ではタンパク質の約１０％を構成するが、脊椎動物ではほぼ３０％を構成する。ＬｙｎｃｈＭ、ＭｏｌＢｉｏｌＥｖｏｌ．２９（５）：１３５３～１３６６頁（２０１２）。ホモオリゴマーは、多くの経路の多様性および特異性の一因であり、それらは遺伝子発現、酵素の活性、イオンチャネル、受容体、および細胞接着プロセスを媒介および調節し得る。ニューロンの細胞質膜における電位依存性カリウムチャネルは、４０個の公知のアルファサブユニットのうちの４つで構成されるヘテロ多量体タンパク質である。

本明細書で使用される場合、「ＩＲＥＳ」または「ＩＲＥＳの生物活性を有するポリヌクレオチド」という用語は、真核細胞におけるキャップ部位の利益がなくとも、ＩＲＥＳに作動可能に連結されたポリヌクレオチドの翻訳を開始することができるポリヌクレオチドまたはその逆転写体のような任意の分子を含むと意図される。ＩＲＥＳまたはＩＲＥＳの生物活性を有するポリヌクレオチドは、ピコルナウイルスＩＲＥＳのような、天然に見出される配列と同一であり得るか、またはそれらは好適な宿主細胞に導入された場合に、同じ機能を行う天然に存在しないもしくは非天然の配列であり得る。

本明細書で使用される場合、「代替開始コドン」という用語は、ＡＴＧ開始コドンと比較して低減された効率で翻訳開始のための開始部位として機能する任意の非ＡＴＧポリヌクレオチド（典型的にトリプレット）を含むと意図される。天然に存在する代替開始コドンの使用は当技術分野で公知であり、例えばＫｏｚａｋ（１９９１）ＪＣｅｌｌＢｉｏｌ．１１５（４）：８８７～９０３頁；Ｍｅｈｄｉら（１９９０）Ｇｅｎｅ９１：１７３～１７８頁；Ｋｏｚａｋ（１９８９）ＭｏｌＣｅｌｌＢｉｏｌ．９（１１）：５０７３～５０８０頁に記載されている。一般的に、代替開始コドンは、ＡＴＧと比較して減少した翻訳効率を有する；例えば、代替開始コドンＧＴＧは、ＡＴＧの効率（１００％）と比較して３～５％の翻訳効率を有し得る。代替開始コドンの翻訳効率はまた、その配列構成によっても影響を受け得る：例えば、最適なコザックコンセンサス配列は、代替開始コドンでの翻訳開始に対して正の効果を有することが報告されている。Ｍｅｈｄｉら（１９９０）Ｇｅｎｅ９１：１７３～１７８頁；Ｋｏｚａｋ（１９８９）ＭｏｌＣｅｌｌＢｉｏｌ．９（１１）：５０７３～５０８０頁。完全なコザックコンセンサス配列は、ＧＣＣＲＣＣＡＴＧＧ（配列番号３４）であり、ここで開始コドンＡＴＧを太字のフォントで示し、ＡＴＧ開始コドンのＡを＋１位として指定し、－３位の「Ｒ」はプリン（ＡまたはＧ）である。２つの最も高度に保存された位置はプリン、好ましくは－３位のＡおよび＋４位のＧである（Ｋｏｚａｋ（１９９１）ＪＣｅｌｌＢｉｏｌ．１１５（４）：８８７～９０３頁）。代替開始コドンの使用は、米国特許出願公開第２００６／０１７２３８２号および米国特許出願公開第２００６／０１４１５７７号において選択可能マーカーの減弱した発現に関して記載されている。当業者は、本明細書においてＤＮＡとして記載される配列が、ＲＮＡ分子として相関する配列を有すること、例えばＤＮＡ配列ＡＴＧは、例えばＲＮＡ配列ＡＵＧに対応することを認識する。

本明細書で使用される場合、「高い発現レベル」は、分析した総細胞の少なくとも５０、７０、８０、９０、９５、または９９％の発現レベルより高い発現レベルを指す。

本明細書で使用される場合、「ＣＤ２０」は、プレＢ細胞段階で始まるＢ細胞の表面上に発現され、骨髄および末梢の成熟Ｂ細胞においても発現される４回膜貫通型タンパク質を指す。ＣＤ２０は、３つの表面露出抗原性領域を提示する。ヒトおよびマウスＣＤ２０のｃＤＮＡおよびアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ、例えば受託番号ＮＭ＿１５２８６６、ＮＭ＿０２１９５０、およびＮＭ＿１５２８６７（ヒト）；ＮＭ＿００７６４１（マウス）；ＮＰ＿０６８７６９、ＮＰ＿６９０６０５、およびＮＰ＿６９０６０６（ヒト）；ならびにＮＰ＿０３１６６７（マウス）から入手可能である。全長のヒトＣＤ２０は、２９７アミノ酸長であり、全長のマウスＣＤ２０は、２９１アミノ酸長である。

ＣＤ５２は、Ｃａｍｐａｔｈ－１Ｈ抗原としても知られ、成熟リンパ球上に発現される短い糖タンパク質を指す；その機能は十分には知られていないが、細胞接着を阻害すると考えられている。ヒトおよびマウスＣＤ５２のｃＤＮＡおよびアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ、例えば受託番号ＢＣ０００６４４（ヒト）；ＮＭ＿０１３７０６（マウス）；ＡＡＨ００６４４（ヒト）；およびＥＤＬ３００３５（マウス）から入手可能である。全長のヒトＣＤ５２は、４２アミノ酸のシグナル配列を含む６１アミノ酸長であり、全長のマウスＣＤ５２は、２３アミノ酸のシグナル配列を含む７４アミノ酸長である。

ＣＤ５９は、膜攻撃複合体（ＭＡＣ）阻害タンパク質およびプロテクチンとしても知られ、補体成分Ｃ９が重合化して膜攻撃複合体を形成するのを阻害する細胞表面糖タンパク質である。ヒトおよびマウスＣＤ５９のｃＤＮＡおよびアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ、例えば受託番号ＮＭ＿２０３３３１、ＮＭ＿０００６１１１、ＮＭ＿００１１２７２２３、ＮＭ＿００１１２７２２５、およびＮＭ＿００１１２７２２６（ヒト）；ＮＭ＿１８１８５８およびＮＭ＿００１３６８２１５（マウス）；ＮＰ＿０００６０２、ＮＰ＿００１１２０６９５、ＮＰ＿００１１２０６９７、ＮＰ＿００１１２０６９８、およびＮＰ＿００１１２０６９９（ヒト）；ならびにＮＰ＿８６２９０６およびＮＰ＿００１３５５１４４（マウス）から入手可能である。全長のヒトＣＤ５９は、２５アミノ酸のシグナル配列を含む１２８アミノ酸長であり、全長のマウスＣＤ５９は、２３アミノ酸のシグナル配列を含む１２９アミノ酸長である。

本明細書で使用される場合、「治療ポリペプチド」または「治療タンパク質」は、宿主細胞および本明細書で例証される態様において産生することができる任意のタンパク質またはポリペプチドを指し、それらは、治療薬もしくは薬物、例えば抗体、抗体断片、抗体様分子（例えば、交差二重可変ドメイン（ＣＯＤＶ）Ｉｇ様タンパク質）、または酵素としてのその潜在能のために選択される。

ＩＩ．方法
本開示の一態様は、複数の標的ポリペプチドを高レベルで発現させるための方法であって：
（ａ）各々が複数の組換えポリヌクレオチドを含む、複数の哺乳動物宿主細胞を培養する工程であって、
各組換えポリヌクレオチドが、プロモーター、一意的細胞表面マーカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および一意的標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、一意的細胞表面マーカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列および一意的標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の両方が同じｍＲＮＡ上で転写され、
培養する工程が、哺乳動物宿主細胞の表面上での各一意的細胞表面マーカーポリペプチドの発現および各一意的標的ポリペプチドの発現を許容する条件下で行われる工程；
（ｂ）工程（ａ）の培養哺乳動物宿主細胞を、各々が哺乳動物宿主細胞の表面上に発現される一意的細胞表面マーカーポリペプチドの１つまたはそれ以上に一意的に結合することが可能である複数の検出可能作用物質と接触させる工程；
（ｃ）工程（ｂ）からの接触させた細胞において少なくとも１ラウンドの蛍光活性化細胞選別を行い、それによって複数の検出可能作用物質の少なくとも１つが一意的に結合した１つまたはそれ以上の哺乳動物宿主細胞を選択する工程；
（ｄ）工程（ｃ）で選択された哺乳動物宿主細胞の１つまたはそれ以上のクローン集団を調製する工程；
（ｅ）前記クローン集団の各々における少なくとも２つの一意的細胞表面マーカーポリペプチドの発現レベルを検出することによって、工程（ｄ）からの１つまたはそれ以上のクローン集団を分析する工程；
（ｆ）少なくとも２つの一意的細胞表面マーカーポリペプチドの高い発現レベルを有する１つまたはそれ以上のクローン集団を選択する工程；ならびに
（ｇ）複数の標的ポリペプチドの高レベルでの発現を許容する条件下で、工程（ｆ）で選択された１つまたはそれ以上のクローン集団を培養する工程
を含む方法である。

複数の哺乳動物宿主細胞は、哺乳動物宿主細胞集団、例えば哺乳動物細胞の細胞株の細胞集団であり得る。複数の細胞または細胞集団は典型的に、工程（ａ）で、１００個もしくはそれ以上、５００個もしくはそれ以上、１，０００個もしくはそれ以上、１０，０００個もしくはそれ以上、５０，０００個もしくはそれ以上、１００，０００個もしくはそれ以上、５００，０００個もしくはそれ以上、または１０^６個もしくはそれ以上の細胞を含む。細胞は典型的に、全て１つのタイプの細胞であり、例えばＣＨＯ細胞、ＨＥＫ－２９３細胞、ＢＨＫ－２１細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＢＡＥ－１細胞、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞、骨髄腫細胞、ハイブリドーマ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＷＥＨＩ２３１細胞、ＹＡＣ細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ならびにその派生細胞、例えばＣＨＯ－Ｋ１細胞およびＣＨＯ／ＤＨＦＲ^－細胞である。

哺乳動物宿主細胞の表面上での各一意的細胞表面マーカーポリペプチドの発現および各一意的標的ポリペプチドの発現を許容する条件下での培養する工程は、組織培養での哺乳動物細胞に典型的であり、例えば場合により仔ウシ胎児血清（ＦＣＳ）またはウシ胎児血清（ＦＢＳ）、Ｌ－グルタミン、およびペニシリン／ストレプトマイシンを補充した、ＤＭＥＭ、Ｈａｍ’ｓＦ１２、または無血清培地のような好適な培地中、５％ＣＯ_２を補充した３７℃の加湿空気中などの条件を含むことができる。培養する工程は、任意の好適なフォーマット、例えばマルチウェルプレート培養、培養皿培養、バルク培養、またはバイオリアクター培養で起こり得る。培養する工程は、細胞表面マーカーポリペプチドの発現のための時間ならびに細胞集団が増大するための時間を許容し得る。

複数の組換えポリヌクレオチドは、２つまたはそれ以上の異なる組換えポリヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、複数の組換えポリヌクレオチドは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個またはそれ以上の異なる組換えポリヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、複数の組換えポリヌクレオチドは、２つの異なる組換えポリヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、複数の組換えポリヌクレオチドは、３つの異なる組換えポリヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、複数の組換えポリヌクレオチドは、４つの異なる組換えポリヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、複数の組換えポリヌクレオチドは、５つの異なる組換えポリヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、複数の組換えポリヌクレオチドは、６つの異なる組換えポリヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、複数の組換えポリヌクレオチドは、７つの異なる組換えポリヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、複数の組換えポリヌクレオチドは、８つの異なる組換えポリヌクレオチドを含む。

当然、各哺乳動物宿主細胞は、１コピー超の各組換えポリヌクレオチドを含み得る。例えば、各哺乳動物宿主細胞は、約１０^１～約１０^６コピーの各組換えポリヌクレオチドを含み得る。

加えて、各哺乳動物宿主細胞は、ほぼ同じコピー数またはあるいは異なるコピー数の各組換えポリヌクレオチドを含み得る。ある特定の実施形態では、各哺乳動物宿主細胞は、ほぼ同じコピー数の少なくとも２つの異なる組換えポリヌクレオチドを含むことが好ましい。ある特定の実施形態では、各哺乳動物宿主細胞は、ほぼ同じコピー数の各組換えポリヌクレオチドを含むことが好ましい。ある特定の他の実施形態では、各哺乳動物宿主細胞は、異なるコピー数の少なくとも２つの異なる組換えポリヌクレオチドを含むことが好ましい。ある特定の他の実施形態では、各哺乳動物宿主細胞は、異なるコピー数の各組換えポリヌクレオチドを含むことが好ましい。各異なる組換えポリヌクレオチドのコピー数は、多様であり得て、異なる組換えポリヌクレオチドを宿主哺乳動物細胞に導入するために使用される条件に基づいて選択することができる。

各組換えポリヌクレオチドは、プロモーター、一意的細胞表面マーカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および一意的標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、一意的細胞表面マーカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列および一意的標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の両方が同じｍＲＮＡ上で転写される。

各組換えポリヌクレオチドが一意的細胞表面マーカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むことから、ならびに一意的細胞表面マーカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列および一意的標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の両方が同じｍＲＮＡ上で転写されることから、各哺乳動物宿主細胞は、存在する異なる組換えポリヌクレオチドと同数の一意的、すなわち異なる細胞表面マーカーポリペプチドを発現することができる。例えば、２つの異なる組換えポリヌクレオチドをトランスフェクトした哺乳動物宿主細胞は、２つの一意的、すなわち異なる細胞表面マーカーポリペプチドを発現することができる。同様に、３つの異なる組換えポリヌクレオチドをトランスフェクトした哺乳動物宿主細胞は、３つの一意的、すなわち異なる細胞表面マーカーポリペプチドを発現することができる等々である。一意的、すなわち異なる細胞表面マーカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の数が何であれ、そのような各細胞表面マーカーポリペプチドの発現は、対応する一意的、すなわち異なる標的ポリペプチドの発現に関連する。

同様に、各組換えポリヌクレオチドが一意的標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むことから、ならびに一意的細胞表面マーカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列および一意的標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の両方が同じｍＲＮＡ上で転写されることから、各哺乳動物宿主細胞は、存在する異なる組換えポリヌクレオチドの数と同数の一意的、すなわち異なる標的ポリペプチドを発現することができる。例えば、２つの異なる組換えポリヌクレオチドをトランスフェクトした哺乳動物宿主細胞は、２つの一意的、すなわち異なる標的ポリペプチドを発現することができる。同様に３つの異なる組換えポリヌクレオチドをトランスフェクトした哺乳動物宿主細胞は、３つの一意的、すなわち異なる標的ポリペプチドを発現することができる等々である。一意的、すなわち異なる標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の数が何であれ、各々のそのような標的ポリペプチドの発現は、対応する一意的、すなわち異なる細胞表面マーカーポリペプチドの発現に関連する。

工程（ｂ）は、工程（ａ）の培養哺乳動物宿主細胞を、各々が哺乳動物宿主細胞の表面上に発現された一意的細胞表面マーカーポリペプチドの１つまたはそれ以上に結合することが一意的に可能である複数の検出可能作用物質と接触させることを伴う。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの一意的検出可能作用物質は、１つのみの一意的細胞表面マーカーポリペプチドに結合することが可能である。ある特定の実施形態では、各一意的検出可能作用物質は、１つのみの一意的細胞表面マーカーポリペプチドに結合することが可能である。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの一意的検出可能作用物質は、１つ超の一意的細胞表面マーカーポリペプチドに結合することが可能である；例えば、そのような一意的検出可能作用物質は、２つの異なる、すなわち一意的細胞表面マーカーポリペプチドに結合することが可能であり得る。

工程（ｃ）は、工程（ｂ）からの接触させた細胞において少なくとも１ラウンドの蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を行い、それによって複数の検出可能作用物質の少なくとも１つが一意的に結合した１つまたはそれ以上の哺乳動物宿主細胞を選択することを伴う。ある特定の実施形態では、工程（ｃ）は、工程（ｂ）からの少なくとも第１の検出可能作用物質および第２の検出可能作用物質と接触させた細胞において１ラウンドのＦＡＣＳを行い、それによって第１の検出可能作用物質および第２の検出可能作用物質の少なくとも両方が一意的に結合した１つまたはそれ以上の哺乳動物宿主細胞を選択することを含む。ある特定の実施形態では、工程（ｃ）は、工程（ｂ）からの３つまたはそれ以上の検出可能作用物質と接触させた細胞において１ラウンドのＦＡＣＳを行い、それによって３つまたはそれ以上の検出可能作用物質が一意的に結合した１つまたはそれ以上の哺乳動物宿主細胞を選択することを含む。ある特定の実施形態では、工程（ｃ）は、工程（ｂ）からの３つの検出可能作用物質と接触させた細胞において１ラウンドのＦＡＣＳを行い、それによって３つの検出可能作用物質が一意的に結合した１つまたはそれ以上の哺乳動物宿主細胞を選択することを含む。

ある特定の実施形態では、工程（ｃ）は、工程（ｂ）からの４つの検出可能作用物質と接触させた細胞において１ラウンドのＦＡＣＳを行い、それによって４つの検出可能作用物質が一意的に結合した１つまたはそれ以上の哺乳動物宿主細胞を選択することを含む。ある特定の実施形態では、工程（ｃ）は、工程（ｂ）からの５つの検出可能作用物質と接触させた細胞において１ラウンドのＦＡＣＳを行い、それによって５つの検出可能作用物質が一意的に結合した１つまたはそれ以上の哺乳動物宿主細胞を選択することを含む。ある特定の実施形態では、工程（ｃ）は、工程（ｂ）からの６つの検出可能作用物質と接触させた細胞において１ラウンドのＦＡＣＳを行い、それによって６つの検出可能作用物質が一意的に結合した１つまたはそれ以上の哺乳動物宿主細胞を選択することを含む。ある特定の実施形態では、工程（ｃ）は、工程（ｂ）からの７つの検出可能作用物質と接触させた細胞において１ラウンドのＦＡＣＳを行い、それによって７つの検出可能作用物質が一意的に結合した１つまたはそれ以上の哺乳動物宿主細胞を選択することを含む。ある特定の実施形態では、工程（ｃ）は、工程（ｂ）からの８つの検出可能作用物質と接触させた細胞において１ラウンドのＦＡＣＳを行い、それによって８つの検出可能作用物質が一意的に結合した１つまたはそれ以上の哺乳動物宿主細胞を選択することを含む。

当然、ある特定の実施形態では、なお追加のラウンドのＦＡＣＳを行い、それによって任意の数の特異的検出可能作用物質が結合した１つまたはそれ以上の哺乳動物宿主細胞を選択する。例えば、ある特定の実施形態では、工程（ｃ）は、
（ｃ３）工程（ｃ２）で選択された細胞において、少なくとも第３の細胞表面マーカーポリペプチドについて第３のラウンドのＦＡＣＳを行い、それによって少なくとも第１、第２、および第３の検出可能作用物質が結合した１つまたはそれ以上の哺乳動物宿主細胞を選択する工程
をさらに含む。

同様に、ある特定の実施形態では、工程（ｃ）は、
（ｃ４）工程（ｃ３）で選択された細胞において、少なくとも第４の細胞表面マーカーポリペプチドについて第４のラウンドのＦＡＣＳを行い、それによって少なくとも第１、第２、第３、および第４の検出可能作用物質が結合した１つまたはそれ以上の哺乳動物宿主細胞を選択する工程
をさらに含む。

ある特定の実施形態では、工程（ｅ）は、工程（ｄ）の７～２８日後に行われる。ある特定の実施形態では、工程（ｅ）は、工程（ｄ）の７～２１日後に行われる。ある特定の実施形態では、工程（ｅ）は、工程（ｄ）の７～１４日後に行われる。ある特定の実施形態では、工程（ｅ）は、工程（ｄ）の７～１３日後に行われる。ある特定の実施形態では、工程（ｅ）は、工程（ｄ）の７～１２日後に行われる。ある特定の実施形態では、工程（ｅ）は、工程（ｄ）の７～１１日後に行われる。ある特定の実施形態では、工程（ｅ）は、工程（ｄ）の７～１０日後に行われる。ある特定の実施形態では、工程（ｅ）は、工程（ｄ）の７～９日後に行われる。ある特定の実施形態では、工程（ｅ）は、工程（ｄ）の７～８日後に行われる。ある特定の実施形態では、工程（ｅ）は、工程（ｄ）の７～９日後に行われる。ある特定の実施形態では、工程（ｅ）は、工程（ｄ）の７日後に行われる。

ある特定の実施形態では、工程（ｅ）は、工程（ｄ）の８～２８日後に行われる。ある特定の実施形態では、工程（ｅ）は、工程（ｄ）の８～２１日後に行われる。ある特定の実施形態では、工程（ｅ）は、工程（ｄ）の８～１４日後に行われる。ある特定の実施形態では、工程（ｅ）は、工程（ｄ）の８～１３日後に行われる。ある特定の実施形態では、工程（ｅ）は、工程（ｄ）の８～１２日後に行われる。ある特定の実施形態では、工程（ｅ）は、工程（ｄ）の８～１１日後に行われる。ある特定の実施形態では、工程（ｅ）は、工程（ｄ）の８～１０日後に行われる。ある特定の実施形態では、工程（ｅ）は、工程（ｄ）の８～９日後に行われる。ある特定の実施形態では、工程（ｅ）は、工程（ｄ）の８日後に行われる。

ある特定の実施形態では、工程（ｅ）は、工程（ｄ）の９～２８日後に行われる。ある特定の実施形態では、工程（ｅ）は、工程（ｄ）の９～２１日後に行われる。ある特定の実施形態では、工程（ｅ）は、工程（ｄ）の９～１４日後に行われる。ある特定の実施形態では、工程（ｅ）は、工程（ｄ）の９～１３日後に行われる。ある特定の実施形態では、工程（ｅ）は、工程（ｄ）の９～１２日後に行われる。ある特定の実施形態では、工程（ｅ）は、工程（ｄ）の９～１１日後に行われる。ある特定の実施形態では、工程（ｅ）は、工程（ｄ）の９～１０日後に行われる。ある特定の実施形態では、工程（ｅ）は、工程（ｄ）の９日後に行われる。

ある特定の実施形態では、工程（ｅ）は、工程（ｄ）の１０～２８日後に行われる。ある特定の実施形態では、工程（ｅ）は、工程（ｄ）の１０～２１日後に行われる。ある特定の実施形態では、工程（ｅ）は、工程（ｄ）の１０～１４日後に行われる。ある特定の実施形態では、工程（ｅ）は、工程（ｄ）の１０～１３日後に行われる。ある特定の実施形態では、工程（ｅ）は、工程（ｄ）の１０～１２日後に行われる。ある特定の実施形態では、工程（ｅ）は、工程（ｄ）の１０～１１日後に行われる。ある特定の実施形態では、工程（ｅ）は、工程（ｄ）の１０日後に行われる。

ある特定の実施形態では、工程（ｅ）は、工程（ｄ）の１１～２８日後に行われる。ある特定の実施形態では、工程（ｅ）は、工程（ｄ）の１１～２１日後に行われる。ある特定の実施形態では、工程（ｅ）は、工程（ｄ）の１１～１４日後に行われる。ある特定の実施形態では、工程（ｅ）は、工程（ｄ）の１１～１３日後に行われる。ある特定の実施形態では、工程（ｅ）は、工程（ｄ）の１１～１２日後に行われる。ある特定の実施形態では、工程（ｅ）は、工程（ｄ）の１１日後に行われる。

ある特定の実施形態では、工程（ｅ）は、工程（ｄ）の１２～２８日後に行われる。ある特定の実施形態では、工程（ｅ）は、工程（ｄ）の１２～２１日後に行われる。ある特定の実施形態では、工程（ｅ）は、工程（ｄ）の１２～１４日後に行われる。ある特定の実施形態では、工程（ｅ）は、工程（ｄ）の１２～１３日後に行われる。ある特定の実施形態では、工程（ｅ）は、工程（ｄ）の１２日後に行われる。

ある特定の実施形態では、工程（ｅ）は、工程（ｄ）の１３～２８日後に行われる。ある特定の実施形態では、工程（ｅ）は、工程（ｄ）の１３～２１日後に行われる。ある特定の実施形態では、工程（ｅ）は、工程（ｄ）の１３～１４日後に行われる。ある特定の実施形態では、工程（ｅ）は、工程（ｄ）の１３日後に行われる。

ある特定の実施形態では、工程（ｅ）は、工程（ｄ）の１４～２８日後に行われる。ある特定の実施形態では、工程（ｅ）は、工程（ｄ）の１４～２１日後に行われる。ある特定の実施形態では、工程（ｅ）は、工程（ｄ）の１４日後に行われる。

ある特定の実施形態では、工程（ｅ）は、工程（ｄ）の１５～２８日後に行われる。ある特定の実施形態では、工程（ｅ）は、工程（ｄ）の１５～２１日後に行われる。ある特定の実施形態では、工程（ｅ）は、工程（ｄ）の１５日後に行われる。

ある特定の実施形態では、工程（ｅ）は、工程（ｄ）の１６～２８日後に行われる。ある特定の実施形態では、工程（ｅ）は、工程（ｄ）の１６～２１日後に行われる。ある特定の実施形態では、工程（ｅ）は、工程（ｄ）の１６日後に行われる。

ある特定の実施形態では、工程（ｅ）は、工程（ｄ）の１７～２８日後に行われる。ある特定の実施形態では、工程（ｅ）は、工程（ｄ）の１７～２１日後に行われる。ある特定の実施形態では、工程（ｅ）は、工程（ｄ）の１７日後に行われる。

ある特定の実施形態では、工程（ｅ）は、工程（ｄ）の１８～２８日後に行われる。ある特定の実施形態では、工程（ｅ）は、工程（ｄ）の１８～２１日後に行われる。ある特定の実施形態では、工程（ｅ）は、工程（ｄ）の１８日後に行われる。

ある特定の実施形態では、工程（ｅ）は、工程（ｄ）の１９～２８日後に行われる。ある特定の実施形態では、工程（ｅ）は、工程（ｄ）の１９～２１日後に行われる。ある特定の実施形態では、工程（ｅ）は、工程（ｄ）の１９日後に行われる。

ある特定の実施形態では、工程（ｅ）は、工程（ｄ）の２０～２８日後に行われる。ある特定の実施形態では、工程（ｅ）は、工程（ｄ）の２０～２１日後に行われる。ある特定の実施形態では、工程（ｅ）は、工程（ｄ）の２０日後に行われる。

ある特定の実施形態では、工程（ｅ）は、工程（ｄ）の２１～２８日後に行われる。ある特定の実施形態では、工程（ｅ）は、工程（ｄ）の２１日後に行われる。

ある特定の実施形態では、工程（ｅ）は、工程（ｄ）の２２～２８日後に行われる。ある特定の実施形態では、工程（ｅ）は、工程（ｄ）の２２日後に行われる。

ある特定の実施形態では、工程（ｅ）は、工程（ｄ）の２３～２８日後に行われる。ある特定の実施形態では、工程（ｅ）は、工程（ｄ）の２３日後に行われる。

ある特定の実施形態では、工程（ｅ）は、工程（ｄ）の２４～２８日後に行われる。ある特定の実施形態では、工程（ｅ）は、工程（ｄ）の２４日後に行われる。

ある特定の実施形態では、工程（ｅ）は、工程（ｄ）の２５～２８日後に行われる。ある特定の実施形態では、工程（ｅ）は、工程（ｄ）の２５日後に行われる。

ある特定の実施形態では、工程（ｅ）は、工程（ｄ）の２６～２８日後に行われる。ある特定の実施形態では、工程（ｅ）は、工程（ｄ）の２６日後に行われる。

ある特定の実施形態では、工程（ｅ）は、工程（ｄ）の２７～２８日後に行われる。ある特定の実施形態では、工程（ｅ）は、工程（ｄ）の２７日後に行われる。

ある特定の実施形態では、工程（ｅ）は、工程（ｄ）の２８日後に行われる。

ある特定の実施形態では、工程（ｅ）の分析する工程は、フローサイトメトリーを含む。ある特定の実施形態では、工程（ｅ）のフローサイトメトリーによって分析する工程は、細胞選別を含む。ある特定の他の実施形態では、工程（ｅ）のフローサイトメトリーによって分析する工程は、細胞選別を含まない。

ある特定の実施形態では、工程（ｆ）の複数の一意的細胞表面マーカーポリペプチドの少なくとも１つの発現レベルは、工程（ｅ）で分析される少なくとも７０％のクローン集団の対応する発現レベルより高い。例えば、複数の一意的細胞表面マーカーポリペプチドの１つがＣＤ５２である場合、工程（ｆ）のＣＤ５２の発現レベルは、工程（ｅ）で分析される少なくとも７０％のクローン集団のＣＤ５２発現レベルより高くなり得る。ある特定の実施形態では、工程（ｆ）の複数の一意的細胞表面マーカーポリペプチドの少なくとも１つは、１つの一意的細胞表面マーカーである。ある特定の他の実施形態では、工程（ｆ）の複数の一意的細胞表面マーカーポリペプチドの少なくとも１つは、２つの一意的細胞表面マーカーポリペプチドである。ある特定の他の実施形態では、工程（ｆ）の複数の一意的細胞表面マーカーポリペプチドの少なくとも１つは、３つの一意的細胞表面マーカーポリペプチド、４つの一意的細胞表面マーカーポリペプチド等である。同じ原理が、任意の数の一意的細胞表面マーカーポリペプチドについてしかるべき変更を加えて当てはまる。

ある特定の実施形態では、工程（ｆ）の複数の一意的細胞表面マーカーポリペプチドの各々の発現レベルは、工程（ｅ）で分析した少なくとも７０％のクローン集団の対応する発現レベルより高い。

ある特定の実施形態では、工程（ｆ）の複数の一意的細胞表面マーカーポリペプチドの少なくとも第１の発現レベルは、工程（ｆ）の複数の一意的細胞表面マーカーポリペプチドの少なくとも第２の発現レベルより高い。例えば、複数の一意的細胞表面マーカーポリペプチドの１つが第１のＣＤ５２バリアントであり、複数の一意的細胞表面マーカーポリペプチドの他方が第２のＣＤ５２バリアントである場合、工程（ｆ）の少なくとも第１のＣＤ５２バリアントの発現レベルは、工程（ｆ）の少なくとも第２のＣＤ５２バリアントの発現レベルより高くなり得る。同様に、複数の一意的細胞表面マーカーポリペプチドの１つが第１のＣＤ５２バリアントであり、複数の一意的細胞表面マーカーポリペプチドの他方が第２のＣＤ５２バリアントであり、および複数の一意的細胞表面マーカーポリペプチドのさらに他方が第３のＣＤ５２バリアントである場合、工程（ｆ）の少なくとも第１のＣＤ５２バリアントの発現レベルは、工程（ｆ）の第２のＣＤ５２バリアントおよび第３のＣＤ５２バリアントの両方の発現レベルより高くなり得る。別の例として、複数の一意的細胞表面マーカーポリペプチドの１つが第１のＣＤ５２バリアントであり、複数の一意的細胞表面マーカーポリペプチドの他方が第２のＣＤ５２バリアントであり、および複数の一意的細胞表面マーカーポリペプチドのさらに他方が第３のＣＤ５２バリアントである場合、工程（ｆ）の少なくとも第１のＣＤ５２バリアントの発現レベルおよび第２のＣＤ５２バリアントの発現レベルは、工程（ｆ）の第３のＣＤ５２バリアントの発現レベルより高くなり得る。同じ原理が、任意の数の一意的細胞表面マーカーポリペプチドに関してについてしかるべき変更を加えて当てはまる。

ある特定の実施形態では、工程（ｆ）の複数の一意的細胞表面ポリペプチドの第１の発現レベルは、工程（ｆ）の複数の一意的細胞表面ポリペプチドの第２の発現レベルより高い。

ある特定の実施形態では、方法は：
（ｈ）工程（ｇ）で発現された少なくとも第１の一意的標的ポリペプチドおよび第２の一意的標的ポリペプチドを、１つもしくはそれ以上の選択されたクローン集団から、または１つもしくはそれ以上の選択されたクローン集団を培養する細胞培養培地から単離する工程をさらに含む。所望の発現された標的ポリペプチドを単離または精製するために任意の好適な方法を使用することができる。例えば、ある特定の実施形態では、単離する工程は、アフィニティクロマトグラフィー、ゲル濾過／サイズ排除、疎水性相互作用クロマトグラフィー、免疫沈降、イオン交換クロマトグラフィー、またはそのいずれかの組合せを伴い得る。分泌される標的ポリペプチドの場合、単離または精製する工程は、細胞培地から、または透析液から直接行うことができ、および／またはそこから濃縮することができる。他の標的ポリペプチドの場合、単離または精製する工程は、細胞溶解工程または膜破壊工程を含み得る。そのような一般的な単離および精製方法は当業者に周知である。

ある特定の実施形態では、複数の一意的標的ポリペプチは、３つの一意的標的ポリペプチドを含む。

ある特定の実施形態では、複数の一意的標的ポリペプチドは、５つの一意的標的ポリペプチドを含む。

ある特定の実施形態では、複数の一意的標的ポリペプチドは、６つの一意的標的ポリペプチドを含む。

ある特定の実施形態では、複数の一意的標的ポリペプチドは、７つの一意的標的ポリペプチドを含む。

ある特定の実施形態では、複数の一意的標的ポリペプチドは、８つの一意的標的ポリペプチドを含む。

ある特定の実施形態では、複数の一意的標的ポリペプチドは、８つまたはそれ以上の一意的標的ポリペプチドを含む。

ある特定の実施形態では、各代替（非ＡＴＧ）開始コドンは、ＣＴＧ、ＧＴＧ、ＴＴＧ、ＡＴＴ、ＡＴＡ、およびＡＣＧからなる群から独立して選択される。すなわち、代替（非ＡＴＧ）開始コドンは、同じまたは異なり得る；一部もしくは全てが同じであり得る、または一部もしくは全てが異なり得る。

ある特定の実施形態では、少なくとも１つの代替開始コドンはＣＴＧである。

ある特定の実施形態では、少なくとも１つの代替開始コドンはＧＴＧである。

ある特定の実施形態では、少なくとも１つの代替開始コドンはＴＴＧである。

ある特定の実施形態では、少なくとも１つの代替開始コドンはＡＴＴである。

ある特定の実施形態では、少なくとも１つの代替開始コドンはＡＴＡである。

ある特定の実施形態では、少なくとも１つの代替開始コドンはＡＣＧである。

ある特定の実施形態では、各代替（非ＡＴＧ）開始コドンは、ＧＴＧおよびＴＴＧからなる群から独立して選択される。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの代替開始コドンはＧＴＧである。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの代替開始コドンはＴＴＧである。ある特定の実施形態では、各代替（非ＡＴＧ）開始コドンはＧＴＧである。ある特定の他の実施形態では、各代替（非ＡＴＧ）開始コドンはＴＴＧである。

ある特定の実施形態では、少なくとも第１の組換えポリヌクレオチドは、５’から３’に、第１のプロモーター、第１の一意的細胞表面マーカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および第１の一意的標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み；ならびに少なくとも第２の組換えポリヌクレオチドは、５’から３’に、第２のプロモーター、第２の一意的標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および第２の一意的細胞表面マーカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。上記で指摘したように、本開示は、これらに限定されないが、対応するエレメントと共に少なくとも第３の組換えポリヌクレオチド、対応するエレメントと共に少なくとも第４の組換えポリヌクレオチド、対応するエレメントと共に少なくとも第５の組換えポリヌクレオチド、対応するエレメントと共に少なくとも第６の組換えポリヌクレオチド、対応するエレメントと共に少なくとも第７の組換えポリヌクレオチド、および対応するエレメントと共に少なくとも第８の組換えポリヌクレオチドをさらに含み得る実施形態も企図する。

ある特定の実施形態では、代替（非ＡＴＧ）開始コドンはＣＴＧである。

ある特定の実施形態では、代替（非ＡＴＧ）開始コドンはＧＴＧである。

ある特定の実施形態では、代替（非ＡＴＧ）開始コドンはＴＴＧである。

ある特定の実施形態では、代替（非ＡＴＧ）開始コドンはＡＴＴである。

ある特定の実施形態では、代替（非ＡＴＧ）開始コドンはＡＴＡである。

ある特定の実施形態では、代替（非ＡＴＧ）開始コドンはＡＣＧである。

プロモーターの各々は、任意の他のプロモーターから独立して選択される。ある特定の実施形態では、２つのプロモーターは同じではない。ある特定の実施形態では、少なくとも２つのプロモーターは同じである。ある特定の実施形態では、全てのプロモーターが同じである。

本明細書で使用される場合、特に示していない限り、ＣＤ２０、ＣＤ５２、およびＣＤ５９は、ヒト型および非ヒト型の両方のＣＤ２０、ＣＤ５２、およびＣＤ５９を包含する。ある特定の実施形態では、ＣＤ２０はヒトＣＤ２０（ｈＣＤ２０）である。ある特定の実施形態では、ＣＤ５２はヒトＣＤ５２（ｈＣＤ５２）である。ある特定の実施形態では、ＣＤ５９はヒトＣＤ５９（ｈＣＤ５９）である。非ヒト型のＣＤ２０、ＣＤ５２、およびＣＤ５９としては、これらに限定されないが、マウス、ラット、および非ヒト霊長類型のＣＤ２０、ＣＤ５２、およびＣＤ５９が挙げられる。

本明細書で使用される場合、「バリアント」は、少なくとも１つのアミノ酸残基が野生型分子とは異なる、指定された分子の突然変異版を指す。例えば、「バリアント」は、バリアントを宿主哺乳動物細胞の表面上に発現することができる限り、野生型ポリペプチドと比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個の点突然変異を含み得る。２つまたはそれ以上の点突然変異を有するバリアントの場合、前記突然変異は、互いに隣接してもよく、または隣接しなくてもよい。一部の実施形態では、少なくとも２つの点突然変異は、互いに隣接する。ある特定の他の実施形態では、２つの点突然変異は互いに隣接しない。一部の実施形態では、一部の点突然変異は、互いに隣接し、他方の点突然変異は互いに隣接しない。

ある特定の実施形態では、第１の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、ＣＤ２０またはそのバリアントである。

ある特定の実施形態では、第１の一意的細胞表面マーカーポリペプチドはＣＤ２０である。

ある特定の実施形態では、第１の一意的細胞表面マーカーポリペプチドはバリアントＣＤ２０である。

ある特定の実施形態では、第１の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、ＣＤ５２またはそのバリアントである。

ある特定の実施形態では、第１の一意的細胞表面マーカーポリペプチドはＣＤ５２である。

ある特定の実施形態では、第１の一意的細胞表面マーカーポリペプチドはバリアントＣＤ５２である。

ある特定の実施形態では、第１の一意的細胞表面マーカーポリペプチドはＣＤ５９またはそのバリアントである。

ある特定の実施形態では、第１の一意的細胞表面マーカーポリペプチドはＣＤ５９である。

ある特定の実施形態では、第１の一意的細胞表面マーカーポリペプチドはバリアントＣＤ５９である。

ある特定の実施形態では、少なくとも第２の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、ＣＤ２０、ＣＤ５２、ＣＤ５９、およびそのバリアントからなる群から選択される。そのような実施形態では、第１および第２の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、互いに異なる。例えば、第１の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、野生型ＣＤ５２であり得て、第２の一意的細胞表面マーカーポリペプチドはバリアントＣＤ５２であり得る。別の例として、第１の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、第１のバリアントＣＤ５２であり得て、第２の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、第２のバリアントＣＤ５２であり得て、第１および第２のバリアントＣＤ５２分子は異なる。

ある特定の実施形態では、少なくとも第２の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、ヒトＣＤ５２およびそのバリアントからなる群から選択される。そのような実施形態では、第１および第２の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは互いに異なる。例えば、第１の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは野生型ヒトＣＤ５２であり得て、第２の一意的細胞表面マーカーポリペプチドはバリアントヒトＣＤ５２であり得る。別の例として、第１の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは第１のバリアントヒトＣＤ５２であり得て、第２の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは第２のバリアントヒトＣＤ５２であり得て、第１および第２のバリアントヒトＣＤ５２分子は異なる。

ある特定の実施形態では、少なくとも１つの一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号２７（ＧＸ_２ＮＤＴＳＱＸ_８ＳＸ_１０ＰＳ）に記載のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２であり、Ｘ_２、Ｘ_８、およびＸ_１０の各々は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、およびＶからなる群から独立して選択される。ある特定の実施形態では、Ｘ_２、Ｘ_８、およびＸ_１０の各々はＡである。

ある特定の実施形態では、少なくとも１つの一意的標的ポリペプチドは、交差二重可変ドメイン（ＣＯＤＶ）Ｉｇ様タンパク質のポリペプチドである。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの一意的標的ポリペプチドは、交差二重可変ドメイン（ＣＯＤＶ）Ｉｇ様タンパク質トリアボディのポリペプチドである。

ある特定の実施形態では、各一意的標的ポリペプチドは、交差二重可変ドメイン（ＣＯＤＶ）Ｉｇ様タンパク質のポリペプチドである。ある特定の実施形態では、各一意的標的ポリペプチドは、交差二重可変ドメイン（ＣＯＤＶ）Ｉｇ様タンパク質トリアボディのポリペプチドである。

組換え哺乳動物宿主細胞は、本明細書に開示される方法および／または組成物に従って、標的ポリペプチド（複数可）を発現することが可能な任意の哺乳動物細胞または細胞株であり得る。ある特定の実施形態では、組換え哺乳動物宿主細胞は、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ－２９３細胞、ＢＨＫ－２１細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＢＡＥ－１細胞、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞、骨髄腫細胞（例えば、Ｓｐ２／０－Ａｇ１４）、ハイブリドーマ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＷＥＨＩ２３１細胞、ＹＡＣ細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、およびその派生細胞、例えば、ＣＨＯ－Ｋ１細胞およびＣＨＯ／ＤＨＦＲ^－細胞から選択される。ある特定の実施形態では、組換え哺乳動物宿主細胞はＣＨＯ細胞である。

ＩＩＩ．組成物
本開示のさらなる態様は、複数の組換えポリヌクレオチドを含む操作された哺乳動物宿主細胞であって、各組換えポリヌクレオチドが、プロモーター、一意的細胞表面マーカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および一意的標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、一意的細胞表面マーカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列および一意的標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の両方が同じｍＲＮＡ上で転写される、操作された哺乳動物宿主細胞である。

ある特定の実施形態では、各組換えポリヌクレオチドは、一意的細胞表面マーカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の翻訳開始のための代替（非ＡＴＧ）開始コドンおよび一意的標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の翻訳開始のためのＡＴＧ開始コドンをさらに含む。

ある特定の実施形態では、少なくとも１つの一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号２３（ＧＱＮＤＴＳＱＸ_８Ｘ_９ＳＰＳ）に記載のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２であり、式中、Ｘ_８およびＸ_９の各々は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、およびＶからなる群から独立して選択される。ある特定の実施形態では、Ｘ_８およびＸ_９の各々はＡである。

ある特定の実施形態では、組換え哺乳動物宿主細胞はＣＨＯ細胞である。

なお本開示のさらなる態様は、配列番号２０（ＧＱＮＸ_４ＴＳＱＴＳＳＰＳ）からなるアミノ酸配列を含む単離されたバリアントヒトＣＤ５２であり、式中Ｘ_４は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、およびＶからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、Ｘ_４はＡである。

なお本開示のさらなる態様は、配列番号２１（ＧＱＮＤＴＳＱＸ_８ＳＳＰＳ）からなるアミノ酸配列を含む単離されたバリアントヒトＣＤ５２であり、式中Ｘ_８は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、およびＶからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、Ｘ_８はＡである。

新規抗ｈＣＤ５２モノクローナル抗体の作製および特徴付け
マウスを、ヒトＣＤ５２（ｈＣＤ５２）によって免疫した後、マウスモノクローナル抗ｈＣＤ５２抗体を発現する１１個のクローンを、通常の方法を使用して結合抗体から調製した。次に、これらの１１個のモノクローナル抗体を、再度通常の方法を使用して、マウス可変領域およびヒト定常領域を有するキメラモノクローナル抗体に変換した。ｈＣＤ５２ペプチドミメトープに及ぼす１１個のクローンの親和性を行った。１１個のクローンを表１に表す。

次に、クローンをｈＣＤ５２ペプチドミメトープの一連の切断型およびアラニンスキャン型についてＥＬＩＳＡに基づく結合プロファイルに関して特徴付けた。Ｃａｍｐａｔｈ－１Ｈ（Ｃ－１Ｈ）と比較した。結果を表２および３に示す。表２は、Ｃ－１ＨがｈＣＤ５２のＣ末端領域に優先的に結合するが、９Ｄ９、１１Ｃ１１、３Ｇ７、およびＣＦ１Ｄ１２は、ｈＣＤ５２のＮ末端領域に優先的に結合することを示す。これらの結果は、表３に示されるデータとほぼ一貫し、すなわちｈＣＤ５２のＣ末端領域のアラニンスキャンはＣ－１Ｈによる結合を破壊したが、ｈＣＤ５２のＮ末端領域のアラニンスキャンは、９Ｄ９、１１Ｃ１１、および３Ｇ７による結合を破壊した。

これらのクローン（抗体）のある特定のものをまた、そのＦＡＣＳに基づく結合プロファイルに関しても特徴付けた。簡単に説明すると、ｈＣＤ５２および表３のペプチドミメトープに対応するｈＣＤ５２の個々のアラニンスキャンバリアントを、ＣＨＯ細胞によって個別に発現させた後、本実施例に記載される選択された抗体（４Ｂ１０、７Ｆ１１、ＣＦ１Ｄ１２、５Ｆ７、３Ｇ７、４Ｇ７、９Ｄ９、１１Ｃ１１、Ｃａｍｐａｔｈ－１Ｈ、２Ｃ３、１２Ｇ８、および２３Ｅ６）を使用してＦＡＣＳによって分析した。試験抗原のアミノ酸配列は以下の通りであった：
Ｍｕｔ１ＡＱＮＤＴＳＱＴＳＳＰＳ配列番号１
Ｍｕｔ２ＧＡＮＤＴＳＱＴＳＳＰＳ配列番号２
Ｍｕｔ３ＧＱＡＤＴＳＱＴＳＳＰＳ配列番号３
Ｍｕｔ４ＧＱＮＡＴＳＱＴＳＳＰＳ配列番号４
Ｍｕｔ５ＧＱＮＤＡＳＱＴＳＳＰＳ配列番号５
Ｍｕｔ６ＧＱＮＤＴＡＱＴＳＳＰＳ配列番号６
Ｍｕｔ７ＧＱＮＤＴＳＡＴＳＳＰＳ配列番号７
Ｍｕｔ８ＧＱＮＤＴＳＱＡＳＳＰＳ配列番号８
Ｍｕｔ９ＧＱＮＤＴＳＱＴＡＳＰＳ配列番号９
Ｍｕｔ１０ＧＱＮＤＴＳＱＴＳＡＰＳ配列番号１０
ＷＴＧＱＮＤＴＳＱＴＳＳＰＳ配列番号１１

結果を図２Ａ～２Ｃに示し、これは、Ｃａｍｐａｔｈ－１Ｈおよびクローン９Ｄ９が、細胞表面に提示されたｈＣＤ５２アラニン突然変異体４（ＧＱＮＡＴＳＱＴＳＳＰＳ；配列番号４）および８（ＧＱＮＤＴＳＱＡＳＳＰＳ；配列番号８）の間を明らかに識別したことを示す。

これらの試験の結果は、対応する一意的細胞表面マーカーポリペプチドの発現を評価することによって、個々の細胞において複数の異なる標的ポリペプチドの同時発現をモニタリングするための系を開発する潜在性に関する原理証明を提供した。

一意的細胞表面マーカーポリペプチドとして有用な例示的なｈＣＤ５２突然変異体をコードするポリヌクレオチド構築物
最適なコザック構成を有する非ＡＵＧ（代替）開始コドン、全ての内部ＡＴＧコドンの突然変異、除去されたスプライス部位、およびｈＣＤ５２の選択されたアミノ酸をアラニンに置換する単一の点突然変異を含む、ｈＣＤ５２の様々な突然変異体版をコードするポリヌクレオチドを調製した。

図３は、天然の（野生型）ｈＣＤ５２（配列番号３０）、ならびに最適なコザック構成を有する非ＡＵＧ（代替）開始コドン、全ての内部ＡＴＧコドンの突然変異、除去されたスプライス部位、およびｈＣＤ５２の４位のアミノ酸のアスパラギン酸をアラニンに置換する単一の点突然変異を含む、操作された突然変異体ｈＣＤ５２（Ｍｕｔ４；配列番号３１）の配列アライメントを表す。Ｍｕｔ４には、Ｃａｍｐａｔｈ－１Ｈ（Ｃ－１Ｈ）が結合したが、ｍＡｂ９Ｄ９は結合しなかった。

図４は、天然の（野生型）ｈＣＤ５２（配列番号３０）、ならびに最適なコザック構成を有する非ＡＵＧ（代替）開始コドン、全ての内部ＡＴＧコドンの突然変異、除去されたスプライス部位、およびｈＣＤ５２の８位のアミノ酸のトレオニンをアラニンに置換する単一の点突然変異を含む、操作された突然変異体ｈＣＤ５２（Ｍｕｔ８；配列番号３２）の配列アライメントを表す。Ｍｕｔ８には、ｍＡｂ９Ｄ９が結合したが、Ｃａｍｐａｔｈ－１Ｈ（Ｃ－１Ｈ）は結合しなかった。

図５は、天然の（野生型）ｈＣＤ５２（配列番号３０）、ならびに最適なコザック構成を有する非ＡＵＧ（代替）開始コドン、全ての内部ＡＴＧコドンの突然変異、除去されたスプライス部位、およびｈＣＤ５２の８位のアミノ酸のトレオニンをアラニンに置換し、ｈＣＤ５２の１０位のアミノ酸のセリンをアラニンに置換する２つの点突然変異を含む、操作された二重突然変異体ｈＣＤ５２（Ｍｕｔ８／１０；配列番号３３）の配列アライメントを表す。Ｍｕｔ８と同様に、Ｍｕｔ８／１０には、ｍＡｂ９Ｄ９が結合したが、Ｃａｍｐａｔｈ－１Ｈ（Ｃ－１Ｈ）は結合しなかった。

一意的細胞表面マーカーポリペプチドとして有用な例示的なｈＣＤ５２突然変異体をコードする追加のポリヌクレオチド構築物
ＣＨＯ細胞に、ｈＣＤ５２の以下の突然変異体：Ｍｕｔ４、Ｍｕｔ８、Ｍｕｔ８／９、Ｍｕｔ８／１０、およびＭｕｔ８／９／１０をコードするポリヌクレオチドをトランスフェクトした。全ての突然変異体はＡＴＧ開始コドンを有した。細胞を、フルオロフォア標識Ｃａｍｐａｔｈ－１Ｈおよび９Ｄ９抗体を使用してＦＡＣＳによってアッセイした。結果を図６および図７に示す。

図６は、ｈＣＤ５２のＭｕｔ４（配列番号４）またはＭｕｔ８／１０（配列番号１３）を発現する細胞に対するＣａｍｐａｔｈ－１Ｈまたは９Ｄ９の結合を表す４つのフローサイトメトリーヒストグラムであり、ここでｈＣＤ５２の各突然変異体をコードするポリヌクレオチドは、ＡＴＧ開始コドンを有する。図は、Ｍｕｔ４突然変異体およびＭｕｔ８／１０突然変異体が、Ｃａｍｐａｔｈ－１Ｈおよび９Ｄ９を使用して容易に識別可能であったことを示す。

図７は、ｈＣＤ５２のＭｕｔ４（配列番号４）、Ｍｕｔ８（配列番号８）、Ｍｕｔ８／９（配列番号１２）、Ｍｕｔ８／１０（配列番号１３）、またはＭｕｔ８／９／１０（配列番号１４）を発現する細胞に対するＣａｍｐａｔｈ－１Ｈまたは９Ｄ９の結合を表す４つのフローサイトメトリーヒストグラムであり、ここでｈＣＤ５２の各突然変異体をコードするポリヌクレオチドはＡＴＧ開始コドンを有する。図は、Ｍｕｔ４突然変異体および４つ全てのＭｕｔ８を含む突然変異体が、Ｃａｍｐａｔｈ－１Ｈおよび９Ｄ９を使用して容易に識別可能であったことを示す。

非ＡＴＧ開始コドン使用の効果
ＣＨＯ細胞に、各々がＡＴＧ、ＣＴＧ、ＧＴＧ、またはＴＴＧ開始コドンを有するｈＣＤ５２突然変異体Ｍｕｔ４およびＭｕｔ８をコードするポリヌクレオチドをトランスフェクトした。細胞を、フルオロフォア標識Ｃａｍｐａｔｈ－１Ｈおよび９Ｄ９抗体を使用してＦＡＣＳによってアッセイした。結果を図８および図９に示す。

図８は、開始コドンに従って個々に、Ｍｕｔ４（配列番号４）またはＭｕｔ８（配列番号８）を発現する細胞に対するＣａｍｐａｔｈ－１Ｈまたは９Ｄ９の結合を表す４つのフローサイトメトリーヒストグラムである。図は、Ｍｕｔ４およびＭｕｔ８の各々の発現が、パターンＡＴＧ＞ＣＴＧ＞ＧＴＧ＞ＴＴＧ＞偽に従ったことを示す。

図９は、特にＡＴＧ、ＣＴＧ、またはＧＴＧ開始コドンを有するＭｕｔ４およびＭｕｔ８突然変異体が、Ｃａｍｐａｔｈ－１Ｈおよび９Ｄ９を使用して容易に識別可能であったことを示す図８からのデータの棒グラフ表示である。

標的ポリペプチドの発現に及ぼす細胞表面マーカー開始コドンの効果
代替開始レポーターおよび可溶性受容体－Ｆｃ融合タンパク質を同時発現する安定にトランスフェクトしたＣＨＯプールを、フローサイトメトリー法を使用して分析した。各レポーターを、開始コドンとしてＵＵＧ、ＧＵＧ、ＣＵＧ、またはＡＵＧを使用して発現させた。ヒストグラムを重ねることによって、開始コドンの３’の全てのＡＵＧが突然変異したＣＤ５２またはＣＤ５９の細胞表面発現レベルを示した。Ｃａｉｒｎｓら（２０１１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１０８：２６１１～２２頁。代表的な結果を図１０に示す。図は、レポーター（細胞表面マーカー）発現と目的の遺伝子（ＧＯＩ；標的ポリペプチド）の発現の間に逆相関があったことを示し、これはレポーターをコードするポリヌクレオチドにおける開始コドンに従って変動した。結果は、ＴＴＧが、ＧＯＩに対するリボソームのより大きいリードスルーを可能にする最も低い検出可能レベルのＣＤ５２発現を実証したことを示した。最終的に、重要であるのはレポーターではなくて標的タンパク質の発現であることから、図は、ＴＴＧのような最適下の非ＡＴＧ開始コドンの選択が十分であり、好ましいことを示す。

３つのレポーターを有効にし得るｈＣＤ５２アラニン突然変異体の組合せ
さらなる原理証明として、図１１は、ある特定のｈＣＤ５２アラニン突然変異体の特定の組合せが、３つの一意的レポーターをどのように有効にし得るかを例証する。図１１に示すように、ｈＣＤ５２突然変異体４（ＧＱＮＡＴＳＱＴＳＳＰＳ；配列番号４）は、Ｃａｍｐａｔｈ－１Ｈ（Ｃ－１Ｈ）によって同定されたが、９Ｄ９または７Ｆ１１によって同定されなかった。ｈＣＤ５２突然変異体Ｍｕｔ２／８／９（ＧＡＮＤＴＳＱＡＡＳＰＳ；配列番号１５）は、９Ｄ９に対する結合によって同定されたが、Ｃ１Ｈまたは７Ｆ１１に対する結合によって同定されなかった。ｈＣＤ５２突然変異体Ｍｕｔ７／８／９（ＧＱＮＤＴＳＡＡＡＳＰＳ；配列番号１７）は、７Ｆ１１に対する結合によって同定されたが、Ｃ１Ｈまたは９Ｄ９に対する結合によって同定されなかった。

３つのレポーターを有効にし得る追加のｈＣＤ５２アラニン突然変異体の組合せ
なおさらなる原理証明として、図１２は、ある特定のｈＣＤ５２アラニン突然変異体の特定の組合せが、３つの一意的レポーターをどのように有効にし得るかを例証する。図１２に示されるように、ｈＣＤ５２突然変異体４（ＧＱＮＡＴＳＱＴＳＳＰＳ；配列番号４）は、Ｃａｍｐａｔｈ－１Ｈ（Ｃ－１Ｈ）によって同定されたが、９Ｄ９または７Ｆ１１によって同定されなかった。ｈＣＤ５２突然変異体Ｍｕｔ２／８／１０（ＧＡＮＤＴＳＱＡＳＡＰＳ；配列番号１６）は、９Ｄ９に対する結合によって同定されたが、Ｃ１Ｈまたは７Ｆ１１に対する結合によって同定されなかった。ｈＣＤ５２突然変異体Ｍｕｔ７／８／９（ＧＱＮＤＴＳＡＡＳＡＰＳ；配列番号１８）は、７Ｆ１１に対する結合によって同定されたが、Ｃ１Ｈまたは９Ｄ９に対する結合によって同定されなかった。

ＣＯＤＶトリアボディ発現に使用するための二重レポーター系
ＣＯＤＶトリアボディを説明してきたが、その産生は極めて難しかった。これらの構築物は４つの異なるポリペプチド鎖を有した：２つの異なる重鎖（ＣＯＤＶ重鎖および相互のノブとホールを有するＦａｂ重鎖）および２つの異なる軽鎖（ＣＯＤＶ軽鎖およびＦａｂ軽鎖）。これらの４つの個々のポリペプチド鎖のバランスの取れた発現は難しく、過剰な遊離の重鎖は、それらを発現する細胞に対して毒性となり得た。

一実施形態では、各重鎖は、単一のｍＲＮＡ上にコードされる一意的細胞表面マーカーポリペプチドと共にその自身の個別の発現ベクターから発現され、各軽鎖は、その自身の個別の発現ベクターからいかなる一意的細胞表面マーカーポリペプチドもなくとも発現された。対応する重鎖および軽鎖（ＣＯＤＶ重鎖および軽鎖、ならびにＦａｂ重鎖および軽鎖）は、自己会合して所望のＣＯＤＶトリアボディを形成した。図１３Ａを参照されたい。

特に、この方法は、各アームに関して独立してクローンを単離およびスクリーニングする能力を提供し、産物の品質（すなわち、均一な三特異的発現）に関する所望のスクリーニングを提供し得る。

別の実施形態では、対応する重鎖および軽鎖が単一のバイシストロニックベクター上でコードされることを例外として、類似のアプローチをとることができる。図１３Ｂを参照されたい。

Claims

複数の標的ポリペプチドを高レベルで発現させるための方法であって：
（ａ）各々が複数の組換えポリヌクレオチドを含む、複数の哺乳動物宿主細胞を培養する工程であって、
各組換えポリヌクレオチドは、プロモーター、一意的細胞表面マーカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および一意的標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、一意的細胞表面マーカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列および一意的標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の両方は同じｍＲＮＡ上で転写され、
培養する工程は、哺乳動物宿主細胞の表面上での各一意的細胞表面マーカーポリペプチドの発現および各一意的標的ポリペプチドの発現を許容する条件下で行われる、工程；
（ｂ）工程（ａ）の培養哺乳動物宿主細胞を、各々が哺乳動物宿主細胞の表面上に発現される一意的細胞表面マーカーポリペプチドの１つまたはそれ以上に一意的に結合することが可能である複数の検出可能作用物質と接触させる工程；
（ｃ）工程（ｂ）からの接触させた細胞において少なくとも１ラウンドの蛍光活性化細胞選別を行い、それによって複数の検出可能作用物質の少なくとも１つが一意的に結合した１つまたはそれ以上の哺乳動物宿主細胞を選択する工程；
（ｄ）工程（ｃ）で選択された哺乳動物宿主細胞の１つまたはそれ以上のクローン集団を調製する工程；
（ｅ）前記クローン集団の各々における少なくとも２つの一意的細胞表面マーカーポリペプチドの発現レベルを検出することによって、工程（ｄ）からの１つまたはそれ以上のクローン集団を分析する工程；
（ｆ）少なくとも２つの一意的細胞表面マーカーポリペプチドの高い発現レベルを有する１つまたはそれ以上のクローン集団を選択する工程；ならびに
（ｇ）複数の標的ポリペプチドの高レベルでの発現を許容する条件下で、工程（ｆ）で選択された１つまたはそれ以上のクローン集団を培養する工程
を含む方法。
工程（ｃ）は、工程（ｂ）からの少なくとも第１の検出可能作用物質および第２の検出可能作用物質と接触させた細胞において１ラウンドの蛍光活性化細胞選別を行い、それによって第１の検出可能作用物質および第２の検出可能作用物質の少なくとも両方が一意的に結合した１つまたはそれ以上の哺乳動物宿主細胞を選択する工程を含む、請求項１に記載の方法。
工程（ｃ）は、
（ｃ１）少なくとも第１の細胞表面マーカーポリペプチドについて第１のラウンドの蛍光活性化細胞選別を行い、それによって少なくとも第１の検出可能作用物質が結合した１つまたはそれ以上の哺乳動物宿主細胞を選択する工程；ならびに
（ｃ２）工程（ｃ１）で選択された細胞において、少なくとも第２の細胞表面マーカーポリペプチドについて第２のラウンドの蛍光活性化細胞選別を行い、それによって第１の検出可能作用物質および第２の検出可能作用物質の少なくとも両方が結合した１つまたはそれ以上の哺乳動物宿主細胞を選択する工程
を含む、請求項１に記載の方法。
工程（ｅ）は工程（ｄ）の７～２８日後に行われる、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
工程（ｅ）における分析する工程は、フローサイトメトリーを含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
工程（ｆ）における複数の一意的細胞表面マーカーポリペプチドの少なくとも１つの発現レベルは、工程（ｅ）で分析した少なくとも７０％のクローン集団の対応する発現レベルより高い、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
工程（ｆ）における複数の一意的細胞表面マーカーポリペプチドの各々の発現レベルは、工程（ｅ）で分析した少なくとも７０％のクローン集団の対応する発現レベルより高い、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
工程（ｆ）における複数の一意的細胞表面ポリペプチドの少なくとも第１の発現レベルは、工程（ｆ）における複数の一意的細胞表面ポリペプチドの少なくとも第２の発現レベルより高い、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
工程（ｆ）における複数の一意的細胞表面ポリペプチドの第１の発現レベルは、工程（ｆ）における複数の一意的細胞表面ポリペプチドの第２の発現レベルより高い、請求項８に記載の方法。
（ｈ）工程（ｇ）において発現された少なくとも第１の一意的標的ポリペプチドおよび第２の一意的標的ポリペプチドを、１つもしくはそれ以上の選択されたクローン集団から、または１つもしくはそれ以上の選択されたクローン集団を培養する細胞培養培地から単離する工程
をさらに含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
複数の一意的標的ポリペプチドは、２～８個の一意的標的ポリペプチドを含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
複数の一意的標的ポリペプチドは、２～４個の一意的標的ポリペプチドを含む。請求項１１に記載の方法。
複数の一意的標的ポリペプチドは、２つの一意的標的ポリペプチドを含む、請求項１２に記載の方法。
複数の一意的標的ポリペプチドは、３つの一意的標的ポリペプチドを含む、請求項１２に記載の方法。
複数の一意的標的ポリペプチドは、４つの一意的標的ポリペプチドを含む、請求項１２に記載の方法。
各組換えポリヌクレオチドは、５’から３’に、プロモーター、一意的細胞表面マーカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および一意的標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。
各組換えポリヌクレオチドは、１～４個のプロモーター、各々が一意的細胞表面マーカーポリペプチドをコードする１～４個のヌクレオチド配列、および各々が一意的標的ポリペプチドをコードする１～４個のヌクレオチド配列を含み、一意的細胞表面マーカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の１つは、一意的標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の１つと同じｍＲＮＡ上で転写される、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。
各組換えポリヌクレオチドは、２つのプロモーターおよび各々が一意的標的ポリペプチドをコードする２つのヌクレオチド配列を含み、各々が一意的細胞表面マーカーポリペプチドをコードする１つまたは２つのヌクレオチド配列をさらに含む、バイシストロニックポリヌクレオチドである、請求項１７に記載の方法。
各バイシストロニックポリヌクレオチドは、一意的細胞表面マーカーポリペプチドをコードする単一のヌクレオチド配列を含む、請求項１８に記載の方法。
各バイシストロニックポリヌクレオチドは、各々が一意的細胞表面マーカーポリペプチドをコードする２つのヌクレオチド配列を含み、一意的細胞表面マーカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の各々１つは、一意的標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の１つと同じｍＲＮＡ上で転写される、請求項１８に記載の方法。
各組換えポリヌクレオチドは、５’から３’に、１～４個のプロモーターのうちの１つ、一意的細胞表面マーカーポリペプチドをコードする１～４個のヌクレオチド配列のうちの１つ、および一意的標的ポリペプチドをコードする１～４個のヌクレオチド配列のうちの１つを含む、請求項１７～２０のいずれか１項に記載の方法。
各組換えポリヌクレオチドは、１つのプロモーター、一意的細胞表面マーカーポリペプチドをコードする１つのヌクレオチド配列、および一意的標的ポリペプチドをコードする１つのヌクレオチド配列を含み、一意的細胞表面マーカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、一意的標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と同じｍＲＮＡ上で転写される、請求項１７に記載の方法。
各組換えポリヌクレオチドは、一意的細胞表面マーカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の３’および一意的標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の５’に位置する配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）をさらに含む、請求項１６または２１に記載の方法。
各組換えポリヌクレオチドは、一意的細胞表面マーカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の翻訳開始のための代替（非ＡＴＧ）開始コドン、および一意的標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の翻訳開始のためのＡＴＧ開始コドンをさらに含む、請求項１～２３のいずれか１項に記載の方法。
各代替（非ＡＴＧ）開始コドンは、ＣＴＧ、ＧＴＧ、ＴＴＧ、ＡＴＴ、ＡＴＡ、およびＡＣＧからなる群から独立して選択される、請求項２４に記載の方法。
各代替（非ＡＴＧ）開始コドンは、ＧＴＧおよびＴＴＧからなる群から独立して選択される、請求項２４に記載の方法。
一意的細胞表面マーカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、いかなるＡＴＧトリプレットも欠如している、請求項２４～２６のいずれか１項に記載の方法。
少なくとも第１の組換えポリヌクレオチドは、５’から３’に、第１のプロモーター、第１の一意的細胞表面マーカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および第１の一意的標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み；ならびに
少なくとも第２の組換えポリヌクレオチドは、５’から３’に、第２のプロモーター、第２の一意的標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および第２の一意的細胞表面マーカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。
第１の組換えポリヌクレオチドは、第１の一意的細胞表面マーカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の３’および第１の一意的標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の５’に位置する配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）をさらに含む、請求項２８に記載の方法。
第１の組換えポリヌクレオチドは、第１の一意的細胞表面マーカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の翻訳開始のための代替（非ＡＴＧ）開始コドン、および第１の一意的標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の翻訳開始のためのＡＴＧ開始コドンをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
代替（非ＡＴＧ）開始コドンは、ＣＴＧ、ＧＴＧ、ＴＴＧ、ＡＴＴ、ＡＴＡ、およびＡＣＧからなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
代替（非ＡＴＧ）開始コドンは、ＧＴＧおよびＴＴＧからなる群から選択される、請求項３１に記載の方法。
第１の一意的細胞表面マーカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、いかなるＡＴＧトリプレットも欠如している、請求項２８～３２のいずれか１項に記載の方法。
第２の組換えポリヌクレオチドは、第２の一意的標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の３’および第２の一意的細胞表面マーカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の５’に位置する配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）をさらに含む、請求項２８に記載の方法。
各組換えポリヌクレオチドは、５’から３’に、プロモーター、一意的標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および一意的細胞表面マーカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。
各組換えポリヌクレオチドは、一意的標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の３’および一意的細胞表面マーカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の５’に位置する配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）をさらに含む、請求項３５に記載の方法。
少なくとも１つのプロモーターは、β－アクチンプロモーターである、請求項１～３６のいずれか１項に記載の方法。
各プロモーターは、β－アクチンプロモーターである、請求項１～３６のいずれか１項に記載の方法。
少なくとも１つのプロモーターは、ハムスターβ－アクチンプロモーターである、請求項１～３６のいずれか１項に記載の方法。
各プロモーターは、ハムスターβ－アクチンプロモーターである、請求項１～３６のいずれか１項に記載の方法。
少なくとも第１の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、ＣＤ２０、ＣＤ５２、ＣＤ５９、およびそのバリアントからなる群から選択される、請求項１～４０のいずれか１項に記載の方法。
少なくとも第２の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、ＣＤ２０、ＣＤ５２、ＣＤ５９、およびそのバリアントからなる群から選択される、請求項１～４１のいずれか１項に記載の方法。
各一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、ＣＤ２０、ＣＤ５２、ＣＤ５９、およびそのバリアントからなる群から選択される、請求項１～４２のいずれか１項に記載の方法。
少なくとも第１の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、ヒトＣＤ５２およびそのバリアントからなる群から選択される、請求項１～４０のいずれか１項に記載の方法。
少なくとも第２の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、ヒトＣＤ５２およびそのバリアントからなる群から選択される、請求項１～４０および４４のいずれか１項に記載の方法。
各一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、ヒトＣＤ５２およびそのバリアントからなる群から選択される、請求項４５に記載の方法。
少なくとも第１の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、ＣＤ２０、ＣＤ５２、およびＣＤ５９からなる群から選択される、請求項１～４０のいずれか１項に記載の方法。
少なくとも第２の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、ＣＤ２０、ＣＤ５２、およびＣＤ５９からなる群から選択される、請求項１～４０および４７のいずれか１項に記載の方法。
各一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、ＣＤ２０、ＣＤ５２、およびＣＤ５９からなる群から選択される、請求項４８に記載の方法。
少なくとも第１の一意的細胞表面マーカーポリペプチドはヒトＣＤ５２である、請求項１～４０のいずれか１項に記載の方法。
少なくとも第２の一意的細胞表面マーカーポリペプチドはヒトＣＤ５２である、請求項１～４０のいずれか１項に記載の方法。
少なくとも１つの一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号１９（ＧＸ_２ＮＤＴＳＱＴＳＳＰＳ）に記載のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２であり、式中Ｘ_２は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、およびＶからなる群から選択される、請求項１～４０のいずれか１項に記載の方法。
Ｘ_２はＡである、請求項５２に記載の方法。
少なくとも１つの一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号２０（ＧＱＮＸ_４ＴＳＱＴＳＳＰＳ）に記載のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２であり、式中Ｘ_４は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、およびＶからなる群から選択される、請求項１～４０のいずれか１項に記載の方法。
Ｘ_４はＡである、請求項５４に記載の方法。
少なくとも１つの一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号２１（ＧＱＮＤＴＳＸ_７ＴＳＳＰＳ）に記載のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２であり、式中Ｘ_７は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、およびＶからなる群から選択される、請求項１～４０のいずれか１項に記載の方法。
Ｘ_７はＡである、請求項５６に記載の方法。
少なくとも１つの一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号２２（ＧＱＮＤＴＳＱＸ_８ＳＳＰＳ）に記載のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２であり、式中Ｘ_８は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、およびＶからなる群から選択される、請求項１～４０のいずれか１項に記載の方法。
Ｘ_８はＡである、請求項５８に記載の方法。
少なくとも１つの一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号２３（ＧＱＮＤＴＳＱＸ_８Ｘ_９ＳＰＳ）に記載のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２であり、式中Ｘ_８およびＸ_９の各々は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、およびＶからなる群から独立して選択される、請求項１～４０のいずれか１項に記載の方法。
Ｘ_８およびＸ_９の各々はＡである、請求項６０に記載の方法。
少なくとも１つの一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号２４（ＧＱＮＤＴＳＱＸ_８ＳＸ_１０ＰＳ）に記載のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２であり、式中Ｘ_８およびＸ_１０の各々は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、およびＶからなる群から独立して選択される、請求項１～４０のいずれか１項に記載の方法。
Ｘ_８およびＸ_１０の各々はＡである、請求項６２に記載の方法。
少なくとも１つの一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号２５（ＧＱＮＤＴＳＱＸ_８Ｘ_９Ｘ_１０ＰＳ）に記載のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２であり、式中Ｘ_８、Ｘ_９、およびＸ_１０の各々は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、およびＶからなる群から独立して選択される、請求項１～４０のいずれか１項に記載の方法。
Ｘ_８、Ｘ_９、およびＸ_１０の各々はＡである、請求項６４に記載の方法。
少なくとも１つの一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号２６（ＧＸ_２ＮＤＴＳＱＸ_８Ｘ_９ＳＰＳ）に記載のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２であり、式中Ｘ_２、Ｘ_８、およびＸ_９の各々は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、およびＶからなる群から独立して選択される、請求項１～４０のいずれか１項に記載の方法。
Ｘ_２、Ｘ_８、およびＸ_９の各々はＡである、請求項６６に記載の方法。
少なくとも１つの一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号２７（ＧＸ_２ＮＤＴＳＱＸ_８ＳＸ_１０ＰＳ）に記載のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２であり、式中Ｘ_２、Ｘ_８、およびＸ_１０の各々は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、およびＶからなる群から独立して選択される、請求項１～４０のいずれか１項に記載の方法。
Ｘ_２、Ｘ_８、およびＸ_１０の各々はＡである、請求項６８に記載の方法。
少なくとも１つの一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号２８（ＧＱＮＤＴＳＸ_７Ｘ_８Ｘ_９ＳＰＳ）に記載のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２であり、式中Ｘ_７、Ｘ_８、およびＸ_９の各々は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、およびＶからなる群から独立して選択される、請求項１～４０のいずれか１項に記載の方法。
Ｘ_７、Ｘ_８、およびＸ_９の各々はＡである、請求項７０に記載の方法。
少なくとも１つの一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号２９（ＧＱＮＤＴＳＸ_７Ｘ_８ＳＸ_１０ＰＳ）に記載のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２であり、式中Ｘ_７、Ｘ_８、およびＸ_１０の各々は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、およびＶからなる群から独立して選択される、請求項１～４０のいずれか１項に記載の方法。
Ｘ_７、Ｘ_８、およびＸ_１０の各々はＡである、請求項７２に記載の方法。
少なくとも第１の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号１９（ＧＸ_２ＮＤＴＳＱＴＳＳＰＳ）に記載のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２を含み、式中Ｘ_２は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、およびＶからなる群から選択され；ならびに少なくとも第２の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号２０（ＧＱＮＸ_４ＴＳＱＴＳＳＰＳ）および配列番号２１（ＧＱＮＤＴＳＸ_７ＴＳＳＰＳ）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２を含み、式中Ｘ_４およびＸ_７の各々は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、およびＶからなる群から独立して選択される、請求項１～４０のいずれか１項に記載の方法。
少なくとも第１の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号１９（ＧＸ_２ＮＤＴＳＱＴＳＳＰＳ）に記載のアミノ酸配列からなるバリアントヒトＣＤ５２からなり、式中Ｘ_２は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、およびＶからなる群から選択され；ならびに少なくとも第２の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号２０（ＧＱＮＸ_４ＴＳＱＴＳＳＰＳ）および配列番号２１（ＧＱＮＤＴＳＸ_７ＴＳＳＰＳ）からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるバリアントヒトＣＤ５２からなり、式中Ｘ_４およびＸ_７の各々は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、およびＶからなる群から独立して選択される、請求項１～４０のいずれか１項に記載の方法。
少なくとも第１の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号２（ＧＡＮＤＴＳＱＴＳＳＰＳ）に記載のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２を含み；ならびに少なくとも第２の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号４（ＧＱＮＡＴＳＱＴＳＳＰＳ）および配列番号７（ＧＱＮＤＴＳＡＴＳＳＰＳ）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２を含む、請求項１～４０のいずれか１項に記載の方法。
少なくとも第１の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号２（ＧＡＮＤＴＳＱＴＳＳＰＳ）に記載のアミノ酸配列からなるバリアントヒトＣＤ５２からなり；ならびに少なくとも第２の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号４（ＧＱＮＡＴＳＱＴＳＳＰＳ）および配列番号７（ＧＱＮＤＴＳＡＴＳＳＰＳ）からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるバリアントヒトＣＤ５２からなる、請求項１～４０のいずれか１項に記載の方法。
少なくとも第１の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号２（ＧＡＮＤＴＳＱＴＳＳＰＳ）に記載のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２を含み；および少なくとも第２の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号４（ＧＱＮＡＴＳＱＴＳＳＰＳ）に記載のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２を含む、請求項１～４０のいずれか１項に記載の方法。
少なくとも第１の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号２（ＧＡＮＤＴＳＱＴＳＳＰＳ）に記載のアミノ酸配列からなるバリアントヒトＣＤ５２からなり；および少なくとも第２の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号４（ＧＱＮＡＴＳＱＴＳＳＰＳ）に記載のアミノ酸配列からなるバリアントヒトＣＤ５２からなる、請求項１～４０のいずれか１項に記載の方法。
少なくとも第１の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号２（ＧＡＮＤＴＳＱＴＳＳＰＳ）に記載のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２を含み；および少なくとも第２の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号７（ＧＱＮＤＴＳＡＴＳＳＰＳ）に記載のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２を含む、請求項１～４０のいずれか１項に記載の方法。
少なくとも第１の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号２（ＧＡＮＤＴＳＱＴＳＳＰＳ）に記載のアミノ酸配列からなるバリアントヒトＣＤ５２からなり；および少なくとも第２の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号７（ＧＱＮＤＴＳＡＴＳＳＰＳ）に記載のアミノ酸配列からなるバリアントヒトＣＤ５２からなる、請求項１～４０のいずれか１項に記載の方法。
少なくとも第１の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号４（ＧＱＮＡＴＳＱＴＳＳＰＳ）に記載のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２を含み；および少なくとも第２の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号７（ＧＱＮＤＴＳＡＴＳＳＰＳ）に記載のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２を含む、請求項１～４０のいずれか１項に記載の方法。
少なくとも第１の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号２０（ＧＱＮＸ_４ＴＳＱＴＳＳＰＳ）に記載のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２を含み；少なくとも第２の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号２３（ＧＸ_２ＮＤＴＳＱＸ_８Ｘ_９ＳＰＳ）に記載のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２を含み；および少なくとも第３の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号２８（ＧＱＮＤＴＳＸ_７Ｘ_８Ｘ_９ＳＰＳ）に記載のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２を含み、式中Ｘ_４、Ｘ_７、Ｘ_８、およびＸ_９の各々は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、およびＶからなる群から独立して選択される、請求項１～４０のいずれか１項に記載の方法。
少なくとも第１の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号２０（ＧＱＮＸ_４ＴＳＱＴＳＳＰＳ）に記載のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２を含み；少なくとも第２の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号２７（ＧＸ_２ＮＤＴＳＱＸ_８ＳＸ_１０ＰＳ）に記載のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２を含み；および少なくとも第３の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号２９（ＧＱＮＤＴＳＸ_７Ｘ_８ＳＸ_１０ＰＳ）に記載のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２を含み、式中Ｘ_４、Ｘ_７、Ｘ_８、およびＸ_１０の各々は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、およびＶからなる群から独立して選択される、請求項１～４０のいずれか１項に記載の方法。
少なくとも第１の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号４（ＧＱＮＡＴＳＱＴＳＳＰＳ）に記載のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２を含み；少なくとも第２の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号１５（ＧＡＮＤＴＳＱＡＡＳＰＳ）に記載のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２を含み；および少なくとも第３の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号１７（ＧＱＮＤＴＳＡＡＡＳＰＳ）に記載のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２を含む、請求項１～４０のいずれか１項に記載の方法。
少なくとも第１の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号４（ＧＱＮＡＴＳＱＴＳＳＰＳ）に記載のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２を含み；少なくとも第２の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号１６（ＧＡＮＤＴＳＱＡＳＡＰＳ）に記載のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２を含み；および少なくとも第３の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号１８（ＧＱＮＤＴＳＡＡＳＡＰＳ）に記載のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２を含む、請求項１～４０のいずれか１項に記載の方法。
少なくとも１つの一意的標的ポリペプチドは、治療ポリペプチドまたは治療タンパク質を含む、請求項１～８６のいずれか１項に記載の方法。
少なくとも１つの一意的標的ポリペプチドは、多重鎖タンパク質のポリペプチドである、請求項１～８６のいずれか１項に記載の方法。
各一意的標的ポリペプチドは、多重鎖タンパク質のポリペプチドである、請求項１～８６のいずれか１項に記載の方法。
少なくとも１つの一意的標的ポリペプチドは、抗体のポリペプチドである、請求項１～８６のいずれか１項に記載の方法。
各一意的標的ポリペプチドは、抗体のポリペプチドである、請求項１～８６のいずれか１項に記載の方法。
少なくとも１つの一意的標的ポリペプチドは、交差二重可変ドメイン（ＣＯＤＶ）Ｉｇ様タンパク質のポリペプチドである、請求項１～８６のいずれか１項に記載の方法。
各一意的標的ポリペプチドは、交差二重可変ドメイン（ＣＯＤＶ）Ｉｇ様タンパク質のポリペプチドである、請求項９２に記載の方法。
少なくとも１つの一意的標的ポリペプチドは、ＣＯＤＶトリアボディのポリペプチドである、請求項９２に記載の方法。
各一意的標的ポリペプチドは、ＣＯＤＶトリアボディのポリペプチドである、請求項９２に記載の方法。
組換え哺乳動物宿主細胞はＣＨＯ細胞である、請求項１～９５のいずれか１項に記載の方法。
複数の組換えポリヌクレオチドを含む操作された哺乳動物宿主細胞であって、各組換えポリヌクレオチドは、プロモーター、一意的細胞表面マーカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および一意的標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、一意的細胞表面マーカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列および一意的標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の両方は同じｍＲＮＡ上で転写される、操作された哺乳動物宿主細胞。
複数の一意的標的ポリペプチドは、２～８個の一意的標的ポリペプチドを含む、請求項９７に記載の操作された哺乳動物宿主細胞。
複数の一意的標的ポリペプチドは、２～４個の一意的標的ポリペプチドを含む、請求項９８に記載の操作された哺乳動物宿主細胞。
複数の一意的標的ポリペプチドは、２つの一意的標的ポリペプチドを含む、請求項９９に記載の操作された哺乳動物宿主細胞。
複数の一意的標的ポリペプチドは、３つの一意的標的ポリペプチドを含む、請求項９９に記載の操作された哺乳動物宿主細胞。
複数の一意的標的ポリペプチドは、４つの一意的標的ポリペプチドを含む、請求項９９に記載の操作された哺乳動物宿主細胞。
各組換えポリヌクレオチドは、５’から３’に、プロモーター、一意的細胞表面マーカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および一意的標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項９７～１０２のいずれか１項に記載の操作された哺乳動物宿主細胞。
各組換えポリヌクレオチドは、１～４個のプロモーター、各々が一意的細胞表面マーカーポリペプチドをコードする１～４個のヌクレオチド配列、および各々が一意的標的ポリペプチドをコードする１～４個のヌクレオチド配列を含み、一意的細胞表面マーカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の１つは、一意的標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の１つと同じｍＲＮＡ上で転写される、請求項９７～１０２のいずれか１項に記載の操作された哺乳動物宿主細胞。
各組換えポリヌクレオチドは、２つのプロモーターおよび各々が一意的標的ポリペプチドをコードする２つのヌクレオチド配列を含み、各々が一意的細胞表面マーカーポリペプチドをコードする１つまたは２つのヌクレオチド配列をさらに含む、バイシストロニックポリヌクレオチドである、請求項１０４に記載の操作された哺乳動物宿主細胞。
各バイシストロニックポリヌクレオチドは、一意的細胞表面マーカーポリペプチドをコードする単一のヌクレオチド配列を含む、請求項１０５に記載の操作された哺乳動物宿主細胞。
各バイシストロニックポリヌクレオチドは、各々が一意的細胞表面マーカーポリペプチドをコードする２つのヌクレオチド配列を含み、一意的細胞表面マーカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の各々１つは、一意的標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の１つと同じｍＲＮＡ上で転写される、請求項１０５に記載の操作された哺乳動物宿主細胞。
各組換えポリヌクレオチドは、５’から３’に、１～４個のプロモーターのうちの１つ、一意的細胞表面マーカーポリペプチドをコードする１～４個のヌクレオチド配列のうちの１つ、および一意的標的ポリペプチドをコードする１～４個のヌクレオチド配列のうちの１つを含む、請求項１０４～１０７のいずれか１項に記載の操作された哺乳動物宿主細胞。
各組換えポリヌクレオチドは、１つのプロモーター、一意的細胞表面マーカーポリペプチドをコードする１つのヌクレオチド配列、および一意的標的ポリペプチドをコードする１つのヌクレオチド配列を含み、一意的細胞表面マーカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、一意的標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と同じｍＲＮＡ上で転写される、請求項１０４に記載の操作された哺乳動物宿主細胞。
各組換えポリヌクレオチドは、一意的細胞表面マーカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の３’および一意的標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の５’に位置する配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）をさらに含む、請求項１０３または１０８に記載の操作された哺乳動物宿主細胞。
各組換えポリヌクレオチドは、一意的細胞表面マーカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の翻訳開始のための代替（非ＡＴＧ）開始コドン、および一意的標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の翻訳開始のためのＡＴＧ開始コドンをさらに含む、請求項９７～１１０のいずれか１項に記載の操作された哺乳動物宿主細胞。
各代替（非ＡＴＧ）開始コドンは、ＣＴＧ、ＧＴＧ、ＴＴＧ、ＡＴＴ、ＡＴＡ、およびＡＣＧからなる群から独立して選択される、請求項１１１に記載の操作された哺乳動物宿主細胞。
各代替（非ＡＴＧ）開始コドンは、ＧＴＧおよびＴＴＧからなる群から独立して選択される、請求項１１１に記載の操作された哺乳動物宿主細胞。
一意的細胞表面マーカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、いかなるＡＴＧトリプレットも欠如している、請求項１１１～１１２のいずれか１項に記載の操作された哺乳動物宿主細胞。
少なくとも第１の組換えポリヌクレオチドは、５’から３’に、第１のプロモーター、第１の一意的細胞表面マーカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および第１の一意的標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み；ならびに
少なくとも第２の組換えポリヌクレオチドは、５’から３’に、第２のプロモーター、第２の一意的標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および第２の一意的細胞表面マーカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項９７～１０３のいずれか１項に記載の操作された哺乳動物宿主細胞。
第１の組換えポリヌクレオチドは、第１の一意的細胞表面マーカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の３’および第１の一意的標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の５’に位置する配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）をさらに含む、請求項１１５に記載の操作された哺乳動物宿主細胞。
第１の組換えポリヌクレオチドは、第１の一意的細胞表面マーカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の翻訳開始のための代替（非ＡＴＧ）開始コドン、および第１の一意的標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の翻訳開始のためのＡＴＧ開始コドンをさらに含む、請求項１１５に記載の操作された哺乳動物宿主細胞。
代替（非ＡＴＧ）開始コドンは、ＣＴＧ、ＧＴＧ、ＴＴＧ、ＡＴＴ、ＡＴＡ、およびＡＣＧからなる群から選択される、請求項１１７に記載の操作された哺乳動物宿主細胞。
代替（非ＡＴＧ）開始コドンは、ＧＴＧおよびＴＴＧからなる群から選択される、請求項１１８に記載の操作された哺乳動物宿主細胞。
第１の一意的細胞表面マーカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、いかなるＡＴＧトリプレットも欠如している、請求項１１５～１１９のいずれか１項に記載の操作された哺乳動物宿主細胞。
第２の組換えポリヌクレオチドは、第２の一意的標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の３’および第２の一意的細胞表面マーカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の５’に位置する配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）をさらに含む、請求項１１５に記載の操作された哺乳動物宿主細胞。
各組換えポリヌクレオチドは、５’から３’に、プロモーター、一意的標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および一意的細胞表面マーカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項９７～１０２のいずれか１項に記載の操作された哺乳動物宿主細胞。
各組換えポリヌクレオチドは、一意的標的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の３’および一意的細胞表面マーカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の５’に位置する配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）をさらに含む、請求項１２２に記載の操作された哺乳動物宿主細胞。
少なくとも１つのプロモーターは、β－アクチンプロモーターである、請求項９７～１２３のいずれか１項に記載の操作された哺乳動物宿主細胞。
各プロモーターは、β－アクチンプロモーターである、請求項９７～１２３のいずれか１項に記載の操作された哺乳動物宿主細胞。
少なくとも１つのプロモーターは、ハムスターβ－アクチンプロモーターである、請求項９７～１２３のいずれか１項に記載の操作された哺乳動物宿主細胞。
各プロモーターは、ハムスターβ－アクチンプロモーターである、請求項９７～１２３のいずれか１項に記載の操作された哺乳動物宿主細胞。
少なくとも第１の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、ＣＤ２０、ＣＤ５２、ＣＤ５９、およびそのバリアントからなる群から選択される、請求項９７～１２７のいずれか１項に記載の操作された哺乳動物宿主細胞。
少なくとも第２の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、ＣＤ２０、ＣＤ５２、ＣＤ５９、およびそのバリアントからなる群から選択される、請求項９７～１２８のいずれか１項に記載の操作された哺乳動物宿主細胞。
各一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、ＣＤ２０、ＣＤ５２、ＣＤ５９、およびそのバリアントからなる群から選択される、請求項９７～１２９のいずれか１項に記載の操作された哺乳動物宿主細胞。
少なくとも第１の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、ヒトＣＤ５２およびそのバリアントからなる群から選択される、請求項９７～１２７のいずれか１項に記載の操作された哺乳動物宿主細胞。
少なくとも第２の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、ヒトＣＤ５２およびそのバリアントからなる群から選択される、請求項９７～１２７および１３１のいずれか１項に記載の操作された哺乳動物宿主細胞。
各一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、ヒトＣＤ５２およびそのバリアントからなる群から選択される、請求項１３２に記載の操作された哺乳動物宿主細胞。
少なくとも第１の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、ＣＤ２０、ＣＤ５２、およびＣＤ５９からなる群から選択される、請求項９７～１２７のいずれか１項に記載の操作された哺乳動物宿主細胞。
少なくとも第２の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、ＣＤ２０、ＣＤ５２、およびＣＤ５９からなる群から選択される、請求項９７～１２７および１２４のいずれか１項に記載の操作された哺乳動物宿主細胞。
各一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、ＣＤ２０、ＣＤ５２、およびＣＤ５９からなる群から選択される、請求項１３５に記載の操作された哺乳動物宿主細胞。
少なくとも第１の一意的細胞表面マーカーポリペプチドはヒトＣＤ５２である、請求項９７～１２７のいずれか１項に記載の操作された哺乳動物宿主細胞。
少なくとも第２の一意的細胞表面マーカーポリペプチドはヒトＣＤ５２である、請求項９７～１２７のいずれか１項に記載の操作された哺乳動物宿主細胞。
少なくとも１つの一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号１９（ＧＸ_２ＮＤＴＳＱＴＳＳＰＳ）に記載のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２であり、式中Ｘ_２は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、およびＶからなる群から選択される、請求項９７～１２７のいずれか１項に記載の操作された哺乳動物宿主細胞。
Ｘ_２はＡである、請求項１３９に記載の操作された哺乳動物宿主細胞。
少なくとも１つの一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号２０（ＧＱＮＸ_４ＴＳＱＴＳＳＰＳ）に記載のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２であり、式中Ｘ_４は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、およびＶからなる群から選択される、請求項９７～１２７のいずれか１項に記載の操作された哺乳動物宿主細胞。
Ｘ_４はＡである、請求項１４１に記載の操作された哺乳動物宿主細胞。
少なくとも１つの一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号２１（ＧＱＮＤＴＳＸ_７ＴＳＳＰＳ）に記載のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２であり、式中Ｘ_７は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、およびＶからなる群から選択される、請求項９７～１２７のいずれか１項に記載の操作された哺乳動物宿主細胞。
Ｘ_７はＡである、請求項１４３に記載の操作された哺乳動物宿主細胞。
少なくとも１つの一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号２２（ＧＱＮＤＴＳＱＸ_８ＳＳＰＳ）に記載のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２であり、式中Ｘ_８は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、およびＶからなる群から選択される、請求項９７～１２７のいずれか１項に記載の操作された哺乳動物宿主細胞。
Ｘ_８はＡである、請求項１４５に記載の操作された哺乳動物宿主細胞。
少なくとも１つの一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号２３（ＧＱＮＤＴＳＱＸ_８Ｘ_９ＳＰＳ）に記載のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２であり、式中Ｘ_８およびＸ_９の各々は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、およびＶからなる群から独立して選択される、請求項９７～１２７のいずれか１項に記載の操作された哺乳動物宿主細胞。
Ｘ_８およびＸ_９の各々はＡである、請求項１４７に記載の操作された哺乳動物宿主細胞。
少なくとも１つの一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号２４（ＧＱＮＤＴＳＱＸ_８ＳＸ_１０ＰＳ）に記載のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２であり、式中Ｘ_８およびＸ_１０の各々は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、およびＶからなる群から独立して選択される、請求項９７～１２７のいずれか１項に記載の操作された哺乳動物宿主細胞。
Ｘ_８およびＸ_１０の各々はＡである、請求項１４９に記載の操作された哺乳動物宿主細胞。
少なくとも１つの一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号２５（ＧＱＮＤＴＳＱＸ_８Ｘ_９Ｘ_１０ＰＳ）に記載のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２であり、式中Ｘ_８、Ｘ_９、およびＸ_１０の各々は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、およびＶからなる群から独立して選択される、請求項９７～１２７のいずれか１項に記載の操作された哺乳動物宿主細胞。
Ｘ_８、Ｘ_９、およびＸ_１０の各々はＡである、請求項１５１に記載の操作された哺乳動物宿主細胞。
少なくとも１つの一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号２６（ＧＸ_２ＮＤＴＳＱＸ_８Ｘ_９ＳＰＳ）に記載のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２であり、式中Ｘ_２、Ｘ_８、およびＸ_９の各々は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、およびＶからなる群から独立して選択される、請求項９７～１２７のいずれか１項に記載の操作された哺乳動物宿主細胞。
Ｘ_２、Ｘ_８、およびＸ_９の各々はＡである、請求項１５３に記載の操作された哺乳動物宿主細胞。
少なくとも１つの一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号２７（ＧＸ_２ＮＤＴＳＱＸ_８ＳＸ_１０ＰＳ）に記載のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２であり、式中Ｘ_２、Ｘ_８、およびＸ_１０の各々はＡ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、およびＶからなる群から独立して選択される、請求項９７～１２７のいずれか１項に記載の操作された哺乳動物宿主細胞。
Ｘ_２、Ｘ_８、およびＸ_１０の各々はＡである、請求項１５５に記載の操作された哺乳動物宿主細胞。
少なくとも１つの一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号２８（ＧＱＮＤＴＳＸ_７Ｘ_８Ｘ_９ＳＰＳ）に記載のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２であり、式中Ｘ_７、Ｘ_８、およびＸ_９の各々は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、およびＶからなる群から独立して選択される、請求項９７～１２７のいずれか１項に記載の操作された哺乳動物宿主細胞。
Ｘ_７、Ｘ_８、およびＸ_９の各々はＡである、請求項１５７に記載の操作された哺乳動物宿主細胞。
少なくとも１つの一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号２９（ＧＱＮＤＴＳＸ_７Ｘ_８ＳＸ_１０ＰＳ）に記載のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２であり、式中Ｘ_７、Ｘ_８、およびＸ_１０の各々は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、およびＶからなる群から独立して選択される、請求項９７～１２７のいずれか１項に記載の操作された哺乳動物宿主細胞。
Ｘ_７、Ｘ_８、およびＸ_１０の各々はＡである、請求項１５９に記載の操作された哺乳動物宿主細胞。
少なくとも第１の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号１９（ＧＸ_２ＮＤＴＳＱＴＳＳＰＳ）に記載のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２を含み、式中Ｘ_２は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、およびＶからなる群から選択され；ならびに少なくとも第２の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号２０（ＧＱＮＸ_４ＴＳＱＴＳＳＰＳ）および配列番号２１（ＧＱＮＤＴＳＸ_７ＴＳＳＰＳ）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２を含み、式中Ｘ_４およびＸ_７の各々は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、およびＶからなる群から独立して選択される、請求項９７～１２７のいずれか１項に記載の操作された哺乳動物宿主細胞。
少なくとも第１の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号１９（ＧＸ_２ＮＤＴＳＱＴＳＳＰＳ）に記載のアミノ酸配列からなるバリアントヒトＣＤ５２からなり、式中Ｘ_２は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、およびＶからなる群から選択され；ならびに少なくとも第２の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号２０（ＧＱＮＸ_４ＴＳＱＴＳＳＰＳ）および配列番号２１（ＧＱＮＤＴＳＸ_７ＴＳＳＰＳ）からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるバリアントヒトＣＤ５２からなり、式中Ｘ_４およびＸ_７の各々は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、およびＶからなる群から独立して選択される、請求項９７～１２７のいずれか１項に記載の操作された哺乳動物宿主細胞。
少なくとも第１の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号２（ＧＡＮＤＴＳＱＴＳＳＰＳ）に記載のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２を含み；ならびに少なくとも第２の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号４（ＧＱＮＡＴＳＱＴＳＳＰＳ）および配列番号７（ＧＱＮＤＴＳＡＴＳＳＰＳ）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２を含む、請求項９７～１２７のいずれか１項に記載の操作された哺乳動物宿主細胞。
少なくとも第１の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号２（ＧＡＮＤＴＳＱＴＳＳＰＳ）に記載のアミノ酸配列からなるバリアントヒトＣＤ５２からなり；ならびに少なくとも第２の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号４（ＧＱＮＡＴＳＱＴＳＳＰＳ）および配列番号７（ＧＱＮＤＴＳＡＴＳＳＰＳ）からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるバリアントヒトＣＤ５２からなる、請求項９７～１２７のいずれか１項に記載の操作された哺乳動物宿主細胞。
少なくとも第１の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号２（ＧＡＮＤＴＳＱＴＳＳＰＳ）に記載のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２を含み；および少なくとも第２の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号４（ＧＱＮＡＴＳＱＴＳＳＰＳ）に記載のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２を含む、請求項９７～１２７のいずれか１項に記載の操作された哺乳動物宿主細胞。
少なくとも第１の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号２（ＧＡＮＤＴＳＱＴＳＳＰＳ）に記載のアミノ酸配列からなるバリアントヒトＣＤ５２からなり；および少なくとも第２の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号４（ＧＱＮＡＴＳＱＴＳＳＰＳ）に記載のアミノ酸配列からなるバリアントヒトＣＤ５２からなる、請求項９７～１２７のいずれか１項に記載の操作された哺乳動物宿主細胞。
少なくとも第１の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号２（ＧＡＮＤＴＳＱＴＳＳＰＳ）に記載のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２を含み；および少なくとも第２の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号７（ＧＱＮＤＴＳＡＴＳＳＰＳ）に記載のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２を含む、請求項９７～１２７のいずれか１項に記載の操作された哺乳動物宿主細胞。
少なくとも第１の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号２（ＧＡＮＤＴＳＱＴＳＳＰＳ）に記載のアミノ酸配列からなるバリアントヒトＣＤ５２からなり；および少なくとも第２の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号７（ＧＱＮＤＴＳＡＴＳＳＰＳ）に記載のアミノ酸配列からなるバリアントヒトＣＤ５２からなる、請求項９７～１２７のいずれか１項に記載の操作された哺乳動物宿主細胞。
少なくとも第１の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号４（ＧＱＮＡＴＳＱＴＳＳＰＳ）に記載のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２を含み；および少なくとも第２の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号７（ＧＱＮＤＴＳＡＴＳＳＰＳ）に記載のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２を含む、請求項９７～１２７のいずれか１項に記載の操作された哺乳動物宿主細胞。
少なくとも第１の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号２０（ＧＱＮＸ_４ＴＳＱＴＳＳＰＳ）に記載のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２を含み；少なくとも第２の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号２３（ＧＸ_２ＮＤＴＳＱＸ_８Ｘ_９ＳＰＳ）に記載のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２を含み；および少なくとも第３の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号２８（ＧＱＮＤＴＳＸ_７Ｘ_８Ｘ_９ＳＰＳ）に記載のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２を含み、式中Ｘ_４、Ｘ_７、Ｘ_８、およびＸ_９の各々は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、およびＶからなる群から独立して選択される、請求項９７～１２７のいずれか１項に記載の操作された哺乳動物宿主細胞。
少なくとも第１の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号２０（ＧＱＮＸ_４ＴＳＱＴＳＳＰＳ）に記載のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２を含み；少なくとも第２の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号２７（ＧＸ_２ＮＤＴＳＱＸ_８ＳＸ_１０ＰＳ）に記載のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２を含み；および少なくとも第３の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号２９（ＧＱＮＤＴＳＸ_７Ｘ_８ＳＸ_１０ＰＳ）に記載のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２を含み、式中Ｘ_４、Ｘ_７、Ｘ_８、およびＸ_１０の各々は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、およびＶからなる群から独立して選択される、請求項９７～１２７のいずれか１項に記載の操作された哺乳動物宿主細胞。
少なくとも第１の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号４（ＧＱＮＡＴＳＱＴＳＳＰＳ）に記載のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２を含み；少なくとも第２の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号１５（ＧＡＮＤＴＳＱＡＡＳＰＳ）に記載のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２を含み；および少なくとも第３の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号１７（ＧＱＮＤＴＳＡＡＡＳＰＳ）に記載のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２を含む、請求項９７～１２７のいずれか１項に記載の操作された哺乳動物宿主細胞。
少なくとも第１の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号４（ＧＱＮＡＴＳＱＴＳＳＰＳ）に記載のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２を含み；少なくとも第２の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号１６（ＧＡＮＤＴＳＱＡＳＡＰＳ）に記載のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２を含み；および少なくとも第３の一意的細胞表面マーカーポリペプチドは、配列番号１８（ＧＱＮＤＴＳＡＡＳＡＰＳ）に記載のアミノ酸配列を含むバリアントヒトＣＤ５２を含む、請求項９７～１２７のいずれか１項に記載の操作された哺乳動物宿主細胞。
少なくとも１つの一意的標的ポリペプチドは、治療ポリペプチドまたは治療タンパク質を含む、請求項９７～１７３のいずれか１項に記載の操作された哺乳動物宿主細胞。
少なくとも１つの一意的標的ポリペプチドは、多重鎖タンパク質のポリペプチドである、請求項９７～１７３のいずれか１項に記載の操作された哺乳動物宿主細胞。
各一意的標的ポリペプチドは、多重鎖タンパク質のポリペプチドである、請求項９７～１７３のいずれか１項に記載の操作された哺乳動物宿主細胞。
少なくとも１つの一意的標的ポリペプチドは、抗体のポリペプチドである、請求項９７～１７３のいずれか１項に記載の操作された哺乳動物宿主細胞。
各一意的標的ポリペプチドは、抗体のポリペプチドである、請求項９７～１７３のいずれか１項に記載の操作された哺乳動物宿主細胞。
少なくとも１つの一意的標的ポリペプチドは、交差二重可変ドメイン（ＣＯＤＶ）Ｉｇ様タンパク質のポリペプチドである、請求項９７～１７３のいずれか１項に記載の操作された哺乳動物宿主細胞。
各一意的標的ポリペプチドは、交差二重可変ドメイン（ＣＯＤＶ）Ｉｇ様タンパク質のポリペプチドである、請求項１７９に記載の操作された哺乳動物宿主細胞。
少なくとも１つの一意的標的ポリペプチドは、ＣＯＤＶトリアボディのポリペプチドである、請求項９７～１７３のいずれか１項に記載の操作された哺乳動物宿主細胞。
各一意的標的ポリペプチドは、ＣＯＤＶトリアボディのポリペプチドである、請求項９７～１７３のいずれか１項に記載の操作された哺乳動物宿主細胞。
組換え哺乳動物宿主細胞はＣＨＯ細胞である、請求項９７～１８２のいずれか１項に記載の操作された哺乳動物宿主細胞。
配列番号１９（ＧＸ_２ＮＤＴＳＱＴＳＳＰＳ）からなるアミノ酸配列を含む単離されたバリアントヒトＣＤ５２であって、式中Ｘ_２は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、およびＶからなる群から選択される、単離されたバリアントヒトＣＤ５２。
Ｘ_２はＡである、請求項１８４に記載の単離されたバリアントヒトＣＤ５２。
配列番号２０（ＧＱＮＸ_４ＴＳＱＴＳＳＰＳ）からなるアミノ酸配列を含む単離されたバリアントヒトＣＤ５２であって、式中Ｘ_４は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、およびＶからなる群から選択される、単離されたバリアントヒトＣＤ５２。
Ｘ_４はＡである、請求項１８６に記載の単離されたバリアントヒトＣＤ５２。
配列番号２２（ＧＱＮＤＴＳＱＸ_８ＳＳＰＳ）からなるアミノ酸配列を含む単離されたバリアントヒトＣＤ５２であって、式中Ｘ_８は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、およびＶからなる群から選択される、単離されたバリアントヒトＣＤ５２。
Ｘ_８はＡである、請求項１８８に記載の単離されたバリアントヒトＣＤ５２。