KR20230109683A - 유세포 분석 감쇠 리포터 발현(플레어) 다중 리포터 시스템 및 이의 사용 방법 - Google Patents
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Abstract
포유류 숙주 세포에서 복수의 표적 폴리펩티드를 높은 수준으로 발현시키는 조성물 및 방법이 제공된다. 각각의 표적 폴리펩티드는 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 및 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 상에서 암호화되고, 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 둘 다 동일한 mRNA 상에 전사된다. 각각의 포유류 숙주 세포는 세포가 복수의 고유한 표적 폴리펩티드 및 복수의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 발현할 수 있도록 복수의 상이한 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 특정 구현예에서, 복수의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 CD52의 변이체이다. 이 조성물 및 방법은 다량체 표적 단백질, 예를 들어 교차 이중가변 도메인(CODV) 트리아바디를 발현시키는 데 유용하다.
Description
관련 출원
본 출원은 2020년 11월 19일에 출원된 미국 특허출원 63/116,094호의 이익을 주장하며, 그 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
서열 목록
본 출원에는 ASCII 형식으로 전자 제출되었고 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 서열 목록이 포함된다. 2021년 11월 2일에 생성된 상기 ASCII 사본의 파일명은 723336_SA9-271PC_ST25.txt이고 크기는 16,727 바이트이다.
기술분야
본 발명은 일반적으로 치료 및 진단용 단백질의 생산에 유용한 고생산성 클론을 식별하기 위한 고처리량 시스템 및 방법에 관한 것이다.
치료용 단백질의 상업적 생산은 안정적인 고발현 재조합 세포주를 필요로 한다. 종래 기술의 방법은 일반적으로 단백질(들)을 생산하는 클론 세포주를 제조하기 위해 디하이드로폴레이트 환원효소 결핍(DHFR) 중국 햄스터 난소(CHO) 세포주에 의존해 왔다. 고생산성 클론은 메토트렉세이트(MTX)와 같은 제제를 사용한 형질감염 세포 풀의 반복적 선택 기반 증폭 후에 얻어진다. 이 공정은 시간이 많이 소요되고 노동 집약적이며, 높은 수준의 단백질을 생산할 클론을 구체적으로 식별하지 않는다.
고생산성 CHO 세포주의 개발 및 선택을 개선하기 위해, 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 포함한 유세포 분석이 사용되어 왔다. 이 기술은 이종 형질감염 세포 집단으로부터 고생산성 클론을 신속하게 식별하고 단리할 수 있게 하여, 무작위 복제 방법과 관련된 작업과 시간을 줄였다. 이로써 풀의 반복적 MTX 증폭 필요 없이 원하는 세포를 식별할 수 있다.
그러나, FACS 기반 분류 방법을 통해 단일세포 클론이 일단 단리되면, 안정적인 고생산성 세포주를 단리하기 위해 적절한 수의 클론을 스크리닝하는 것은 여전히 시간이 많이 소요되는 공정으로 남는다. 따라서, 매우 효율적이고 정확한 스크리닝 방법이 이러한 세포주 개발 단계에서 매우 유리하다. 또한, 클론 개발의 96웰 플레이트 단계에서 스크리닝을 구현하는 것이, 예를 들어 이러한 고생산성 클론에만 추가 확장을 집중시키므로 바람직하다. 높은 수준의 치료용 단백질을 분비하는 클론을 식별하기 위해 일반적으로 세포 배양 채취물의 분석이 사용된다. 그러나, 이 방법은 웰간 세포 밀도 또는 배지 부피의 차이를 고려하지 않기 때문에 최적이 아니다. 따라서, 높은 비생산성 및 높은 역가를 갖는 클론을 정확하게 예측하지 못할 수 있다. 또한, 각각의 새로운 관심 치료용 단백질에 대한 새로운 분석법을 개발하고 최적화하기 위해 종종 노력을 기울여야 한다.
상업적 관심 단백질은 공유 및/또는 비공유 회합된 2개 이상의 폴리펩티드쇄로 흔히 구성된다. 이종이합 사량체인 IgG 항체 및 이의 유도체는 이러한 단백질의 예이다. 다중쇄 단백질의 생산은 일반적으로 개별 폴리펩티드쇄의 공동 발현 및 전체 단백질의 단리를 수반한다.
WO 2008/036255는 관심 폴리펩티드를 안정적으로 고도로 발현하는 재조합 진핵 숙주 세포의 클론 집단을 식별, 선택, 및 생산하기 위한 치료용 단백질의 고처리량 개발용 FACS- 및 리포터 단백질-기반 시스템을 개시한다.
WO 2017/062722는 표적 폴리펩티드를 발현하는 생산자 세포를 일괄 선택하기 위한 형광 활성화 세포 분류(FACS) 방법을 개시한다.
높은 수준의 관심 다중쇄 단백질을 안정적으로 생산하는 재조합 세포주를 선택하기 위해 클론 집단을 스크리닝하기 위한 조성물 및 방법에 대한 요구가 당업계에 여전히 존재한다. 본 발명은 이러한 요구를 만족시키고 관련 이점도 제공한다.
표적 폴리펩티드의 개발 및 대규모 생산에 적합한 높은 수준으로 관심 다량체 폴리펩티드("표적 폴리펩티드")를 안정적으로 발현하는 재조합 포유류 숙주 세포를 식별, 선택, 및 생산하는 데 유용한 방법 및 조성물이 본원에 개시된다. 이 방법 및 조성물은 예를 들어 교차 이중가변 도메인(CODV) Ig-유사 단백질을 포함하는 조작된 항체의 개발 및 대규모 생산에 사용될 것이다. Steinmetz A. et al. (2016) MAbs 8(5): 867-878.
본 발명의 일 양태는 복수의 표적 폴리펩티드를 높은 수준으로 발현시키는 방법으로서,
(a) 복수의 포유류 숙주 세포(각각은 복수의 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함함)를 배양하는 단계
(각각의 재조합 폴리뉴클레오티드는 프로모터, 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 및 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 둘 다 동일한 mRNA 상에 전사되고,
배양은 포유류 숙주 세포 표면 상의 각각의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드의 발현 및 각각의 고유한 표적 폴리펩티드의 발현을 가능하게 하는 조건하에 이루어짐);
(b) 단계 (a)의 배양된 포유류 숙주 세포를 복수의 검출가능한 제제(각각은 포유류 숙주 세포 표면 상에 발현된 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드 중 하나 이상에 고유하게 결합할 수 있음)와 접촉시키는 단계;
(c) 단계 (b)로부터의 접촉된 세포에 대해 적어도 한 회차의 형광 활성화 세포 분류를 수행함으로써, 복수의 검출가능한 제제 중 적어도 하나에 의해 고유하게 결합된 하나 이상의 포유류 숙주 세포를 선택하는 단계;
(d) 단계 (c)에서 선택된 포유류 숙주 세포의 하나 이상의 클론 집단을 준비하는 단계;
(e) 상기 클론 집단 각각에서 적어도 2개의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드의 발현 수준을 검출함으로써 단계 (d)로부터의 하나 이상의 클론 집단을 분석하는 단계;
(f) 적어도 2개의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드의 높은 발현 수준을 갖는 하나 이상의 클론 집단을 선택하는 단계; 및
(g) 높은 수준의 복수의 표적 폴리펩티드 발현을 가능하게 하는 조건하에 단계 (f)에서 선택된 하나 이상의 클론 집단을 배양하는 단계를 포함하는 방법이다.
특정 구현예에서, 단계 (c)는 단계 (b)로부터의 접촉된 세포에 대한 단회의 형광 활성화 세포 분류를 적어도 제1 검출가능한 제제 및 제2 검출가능한 제제를 사용하여 수행함으로써, 적어도 제1 검출가능한 제제 및 제2 검출가능한 제제 둘 다에 의해 고유하게 결합된 하나 이상의 포유류 숙주 세포를 선택하는 단계를 포함한다.
특정 구현예에서, 단계 (c)는
(c1) 적어도 제1 세포 표면 마커 폴리펩티드에 대해 1회차 형광 활성화 세포 분류를 수행함으로써 적어도 제1 검출가능한 제제에 의해 결합된 하나 이상의 포유류 숙주 세포를 선택하는 단계; 및
(c2) 단계 (c1)에서 선택된 세포에서 적어도 제2 세포 표면 마커 폴리펩티드에 대해 2회차 형광 활성화 세포 분류를 수행함으로써 적어도 제1 검출가능한 제제 및 제2 검출가능한 제제 둘 다에 의해 결합된 하나 이상의 포유류 숙주 세포를 선택하는 단계를 포함한다.
특정 구현예에서, 단계 (e)는 단계 (d) 이후 7~28일 후에 수행된다.
특정 구현예에서, 단계 (e)의 분석 단계는 유세포 분석을 포함한다.
특정 구현예에서, 단계 (f)에서의 복수의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드 중 적어도 하나의 발현 수준은 단계 (e)에서 분석된 클론 집단 중 적어도 70%의 상응하는 발현 수준보다 높다.
특정 구현예에서, 단계 (f)에서의 복수의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드 각각의 발현 수준은 단계 (e)에서 분석된 클론 집단 중 적어도 70%의 상응하는 발현 수준보다 높다.
특정 구현예에서, 단계 (f)에서의 복수의 고유한 세포 표면 폴리펩티드 중 적어도 제1 폴리펩티드의 발현 수준은 단계 (f)에서의 복수의 고유한 세포 표면 폴리펩티드 중 적어도 제2 폴리펩티드의 발현 수준보다 높다.
특정 구현예에서, 단계 (f)에서의 복수의 고유한 세포 표면 폴리펩티드 중 제1 폴리펩티드의 발현 수준은 단계 (f)에서의 복수의 고유한 세포 표면 폴리펩티드 중 제2 폴리펩티드의 발현 수준보다 높다.
특정 구현예에서, 상기 방법은
(h) 단계 (g)에서 발현된 적어도 제1 고유한 표적 폴리펩티드 및 제2 고유한 표적 폴리펩티드를 하나 이상의 선택된 클론 집단으로부터 또는 하나 이상의 선택된 클론 집단이 배양되는 세포 배양 배지로부터 단리하는 단계를 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, 복수의 고유한 표적 폴리펩티드는 2 내지 8개의 고유한 표적 폴리펩티드를 포함한다.
특정 구현예에서, 복수의 고유한 표적 폴리펩티드는 2 내지 4개의 고유한 표적 폴리펩티드를 포함한다.
특정 구현예에서, 복수의 고유한 표적 폴리펩티드는 2개의 고유한 표적 폴리펩티드를 포함한다.
특정 구현예에서, 복수의 고유한 표적 폴리펩티드는 3개의 고유한 표적 폴리펩티드를 포함한다.
특정 구현예에서, 복수의 고유한 표적 폴리펩티드는 4개의 고유한 표적 폴리펩티드를 포함한다.
특정 구현예에서, 각각의 재조합 폴리뉴클레오티드는 5'에서 3'으로, 프로모터, 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 및 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 각각의 재조합 폴리뉴클레오티드는 1 내지 4개의 프로모터, 1 내지 4개의 뉴클레오티드 서열(각각은 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화함), 및 1 내지 4개의 뉴클레오티드 서열(각각은 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화함)을 포함하고, 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 중 하나는 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 중 하나와 동일한 mRNA 상에 전사된다.
특정 구현예에서, 각각의 재조합 폴리뉴클레오티드는 2개의 프로모터, 및 2개의 뉴클레오티드 서열(각각은 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화함)을 포함하고, 1개 또는 2개의 뉴클레오티드 서열(각각은 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화함)을 추가로 포함하는 바이시스트론 폴리뉴클레오티드이다.
특정 구현예에서, 각각의 바이시스트론 폴리뉴클레오티드는 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 단일 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 각각의 바이시스트론 폴리뉴클레오티드는 2개의 뉴클레오티드 서열(각각은 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화함)을 포함하고, 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 각각은 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 중 하나와 동일한 mRNA 상에 전사된다.
특정 구현예에서, 각각의 재조합 폴리뉴클레오티드는 5'에서 3'으로, 1~4개의 프로모터 중 하나, 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 1~4개의 뉴클레오티드 서열 중 하나, 및 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 1~4개의 뉴클레오티드 서열 중 하나를 포함한다. 특정 구현예에서, 각각의 재조합 폴리뉴클레오티드는 하나의 프로모터, 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 하나의 뉴클레오티드 서열, 및 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 동일한 mRNA 상에 전사된다.
특정 구현예에서, 각각의 재조합 폴리뉴클레오티드는 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 3' 및 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 5'에 위치하는 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, 각각의 재조합 폴리뉴클레오티드는 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 번역 개시를 위한 대체(비-ATG) 시작 코돈, 및 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 번역 개시를 위한 ATG 시작 코돈을 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, 각각의 대체(비-ATG) 시작 코돈은 CTG, GTG, TTG, ATT, ATA, 및 ACG로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
특정 구현예에서, 각각의 대체(비-ATG) 시작 코돈은 GTG 및 TTG로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
특정 구현예에서, 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에는 ATG 트리플릿이 전혀 없다.
특정 구현예에서, 적어도 제1 재조합 폴리뉴클레오티드는 5'에서 3'으로, 제1 프로모터, 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 및 제1 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고; 적어도 제2 재조합 폴리뉴클레오티드는 5'에서 3'으로, 제2 프로모터, 제2 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 및 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 제1 재조합 폴리뉴클레오티드는 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 3' 및 제1 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 5'에 위치하는 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, 제1 재조합 폴리뉴클레오티드는 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 번역 개시를 위한 대체(비-ATG) 시작 코돈, 및 제1 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 번역 개시를 위한 ATG 시작 코돈을 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, 대체(비-ATG) 시작 코돈은 CTG, GTG, TTG, ATT, ATA, 및 ACG로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 대체(비-ATG) 시작 코돈은 GTG 및 TTG로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에는 ATG 트리플릿이 전혀 없다.
특정 구현예에서, 제2 재조합 폴리뉴클레오티드는 제2 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 3' 및 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 5'에 위치하는 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, 각각의 재조합 폴리뉴클레오티드는 5'에서 3'으로, 프로모터, 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 및 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 각각의 재조합 폴리뉴클레오티드는 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 3' 및 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 5'에 위치하는 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 프로모터는 β-액틴 프로모터이다.
특정 구현예에서, 각각의 프로모터는 β-액틴 프로모터이다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 프로모터는 햄스터 β-액틴 프로모터이다.
특정 구현예에서, 각각의 프로모터는 햄스터 β-액틴 프로모터이다.
특정 구현예에서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 CD20, CD52, CD59, 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 CD20, CD52, CD59, 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 각각의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 CD20, CD52, CD59, 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 인간 CD52 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 인간 CD52 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 각각의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 인간 CD52 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 CD20, CD52, 및 CD59로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 CD20, CD52, 및 CD59로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 각각의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 CD20, CD52, 및 CD59로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 인간 CD52이다.
특정 구현예에서, 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 인간 CD52이다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 19(GX2NDTSQTSSPS)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52이고, X2는 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, X2는 A이다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 20(GQNX4TSQTSSPS)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52이고, X4는 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, X4는 A이다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 21(GQNDTSX7TSSPS)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52이고, X7은 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, X7은 A이다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 22(GQNDTSQX8SSPS)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52이고, X8은 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, X8은 A이다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 23(GQNDTSQX8X9SPS)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52이고, X8 및 X9 각각은 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 특정 구현예에서, X8 및 X9 각각은 A이다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 24(GQNDTSQX8SX10PS)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52이고, X8 및 X10 각각은 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 특정 구현예에서, X8 및 X10 각각은 A이다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 25(GQNDTSQX8X9X10PS)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52이고, X8, X9, 및 X10 각각은 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 특정 구현예에서, X8, X9, 및 X10 각각은 A이다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 26(GX2NDTSQX8X9SPS)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52이고, X2, X8, 및 X9 각각은 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 특정 구현예에서, X2, X8, 및 X9 각각은 A이다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 27(GX2NDTSQX8SX10PS)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52이고, X2, X8, 및 X10 각각은 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 특정 구현예에서, X2, X8, 및 X10 각각은 A이다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 28(GQNDTSX7X8X9SPS)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52이고, X7, X8, 및 X9 각각은 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 특정 구현예에서, X7, X8, 및 X9 각각은 A이다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 29(GQNDTSX7X8SX10PS)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52이고, X7, X8, 및 X10 각각은 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 특정 구현예에서, X7, X8, 및 X10 각각은 A이다.
특정 구현예에서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 19(GX2NDTSQTSSPS)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하고, X2는 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되고; 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 20(GQNX4TSQTSSPS) 및 서열번호 21(GQNDTSX7TSSPS)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하고, X4 및 X7 각각은 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
특정 구현예에서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 19(GX2NDTSQTSSPS)에 제시된 아미노산 서열로 구성된 변이체 인간 CD52로 구성되고, X2는 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되고; 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 20(GQNX4TSQTSSPS) 및 서열번호 21(GQNDTSX7TSSPS)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 구성된 변이체 인간 CD52로 구성되고, X4 및 X7 각각은 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
특정 구현예에서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 2(GANDTSQTSSPS)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하고; 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 4(GQNATSQTSSPS) 및 서열번호 7(GQNDTSATSSPS)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함한다.
특정 구현예에서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 2(GANDTSQTSSPS)에 제시된 아미노산 서열로 구성된 변이체 인간 CD52로 구성되고; 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 4(GQNATSQTSSPS) 및 서열번호 7(GQNDTSATSSPS)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 구성된 변이체 인간 CD52로 구성된다.
특정 구현예에서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 2(GANDTSQTSSPS)로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하고; 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 4(GQNATSQTSSPS)로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함한다.
특정 구현예에서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 2(GANDTSQTSSPS)로 제시된 아미노산 서열로 구성된 변이체 인간 CD52로 구성되고; 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 4(GQNATSQTSSPS)로 제시된 아미노산 서열로 구성된 변이체 인간 CD52로 구성된다.
특정 구현예에서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 2(GANDTSQTSSPS)로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하고; 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 7(GQNDTSATSSPS)로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함한다.
특정 구현예에서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 2(GANDTSQTSSPS)로 제시된 아미노산 서열로 구성된 변이체 인간 CD52로 구성되고; 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 7(GQNDTSATSSPS)로 제시된 아미노산 서열로 구성된 변이체 인간 CD52로 구성된다.
특정 구현예에서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 4(GQNATSQTSSPS)로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하고; 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 7(GQNDTSATSSPS)로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함한다.
특정 구현예에서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 20(GQNX4TSQTSSPS)으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하고; 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 23(GX2NDTSQX8X9SPS)으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하고; 적어도 제3 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 28(GQNDTSX7X8X9SPS)로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하고, X4, X7, X8, 및 X9 각각은 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
특정 구현예에서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 20(GQNX4TSQTSSPS)으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하고; 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 27(GX2NDTSQX8SX10PS)로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하고; 적어도 제3 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 29(GQNDTSX7X8SX10PS)로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하고, X4, X7, X8, 및 X10 각각은 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
특정 구현예에서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 4(GQNATSQTSSPS)로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하고; 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 15(GANDTSQAASPS)로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하고; 적어도 제3 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 17(GQNDTSAAASPS)로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함한다.
특정 구현예에서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 4(GQNATSQTSSPS)로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하고; 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 16(GANDTSQASAPS)으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하고; 적어도 제3 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 18(GQNDTSAASAPS)로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함한다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 고유한 표적 폴리펩티드는 치료용 폴리펩티드 또는 치료용 단백질을 포함한다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 고유한 표적 폴리펩티드는 다중쇄 단백질의 폴리펩티드이다.
특정 구현예에서, 각각의 고유한 표적 폴리펩티드는 다중쇄 단백질의 폴리펩티드이다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 고유한 표적 폴리펩티드는 항체의 폴리펩티드이다.
특정 구현예에서, 각각의 고유한 표적 폴리펩티드는 항체의 폴리펩티드이다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 고유한 표적 폴리펩티드는 교차 이중가변 도메인(CODV) Ig-유사 단백질의 폴리펩티드이다.
특정 구현예에서, 각각의 고유한 표적 폴리펩티드는 교차 이중가변 도메인(CODV) Ig-유사 단백질의 폴리펩티드이다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 고유한 표적 폴리펩티드는 CODV 트리아바디의 폴리펩티드이다.
특정 구현예에서, 각각의 고유한 표적 폴리펩티드는 CODV 트리아바디의 폴리펩티드이다.
특정 구현예에서, 재조합 포유류 숙주 세포는 CHO 세포이다.
본 발명의 추가 양태는 복수의 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조작된 포유류 숙주 세포로서, 각각의 재조합 폴리뉴클레오티드는 프로모터, 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 및 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 둘 다 동일한 mRNA 상에 전사되는, 조작된 포유류 숙주 세포이다.
특정 구현예에서, 복수의 고유한 표적 폴리펩티드는 2 내지 8개의 고유한 표적 폴리펩티드를 포함한다.
특정 구현예에서, 복수의 고유한 표적 폴리펩티드는 2 내지 4개의 고유한 표적 폴리펩티드를 포함한다.
특정 구현예에서, 복수의 고유한 표적 폴리펩티드는 2개의 고유한 표적 폴리펩티드를 포함한다.
특정 구현예에서, 복수의 고유한 표적 폴리펩티드는 3개의 고유한 표적 폴리펩티드를 포함한다.
특정 구현예에서, 복수의 고유한 표적 폴리펩티드는 4개의 고유한 표적 폴리펩티드를 포함한다.
특정 구현예에서, 각각의 재조합 폴리뉴클레오티드는 5'에서 3'으로, 프로모터, 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 및 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 각각의 재조합 폴리뉴클레오티드는 1 내지 4개의 프로모터, 1 내지 4개의 뉴클레오티드 서열(각각은 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화함), 및 1 내지 4개의 뉴클레오티드 서열(각각은 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화함)을 포함하고, 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 중 하나는 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 중 하나와 동일한 mRNA 상에 전사된다.
특정 구현예에서, 각각의 재조합 폴리뉴클레오티드는 2개의 프로모터, 및 2개의 뉴클레오티드 서열(각각은 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화함)을 포함하고, 1개 또는 2개의 뉴클레오티드 서열(각각은 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화함)을 추가로 포함하는 바이시스트론 폴리뉴클레오티드이다.
특정 구현예에서, 각각의 바이시스트론 폴리뉴클레오티드는 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 단일 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 각각의 바이시스트론 폴리뉴클레오티드는 2개의 뉴클레오티드 서열(각각은 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화함)을 포함하고, 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 각각은 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 중 하나와 동일한 mRNA 상에 전사된다.
특정 구현예에서, 각각의 재조합 폴리뉴클레오티드는 5'에서 3'으로, 1~4개의 프로모터 중 하나, 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 1~4개의 뉴클레오티드 서열 중 하나, 및 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 1~4개의 뉴클레오티드 서열 중 하나를 포함한다. 특정 구현예에서, 각각의 재조합 폴리뉴클레오티드는 하나의 프로모터, 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 하나의 뉴클레오티드 서열, 및 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 동일한 mRNA 상에 전사된다.
특정 구현예에서, 각각의 재조합 폴리뉴클레오티드는 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 3' 및 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 5'에 위치하는 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, 각각의 재조합 폴리뉴클레오티드는 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 번역 개시를 위한 대체(비-ATG) 시작 코돈, 및 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 번역 개시를 위한 ATG 시작 코돈을 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, 각각의 대체(비-ATG) 시작 코돈은 CTG, GTG, TTG, ATT, ATA, 및 ACG로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
특정 구현예에서, 각각의 대체(비-ATG) 시작 코돈은 GTG 및 TTG로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
특정 구현예에서, 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에는 ATG 트리플릿이 전혀 없다.
특정 구현예에서, 적어도 제1 재조합 폴리뉴클레오티드는 5'에서 3'으로, 제1 프로모터, 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 및 제1 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고; 적어도 제2 재조합 폴리뉴클레오티드는 5'에서 3'으로, 제2 프로모터, 제2 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 및 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 제1 재조합 폴리뉴클레오티드는 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 3' 및 제1 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 5'에 위치하는 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, 제1 재조합 폴리뉴클레오티드는 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 번역 개시를 위한 대체(비-ATG) 시작 코돈, 및 제1 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 번역 개시를 위한 ATG 시작 코돈을 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, 대체(비-ATG) 시작 코돈은 CTG, GTG, TTG, ATT, ATA, 및 ACG로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 대체(비-ATG) 시작 코돈은 GTG 및 TTG로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에는 ATG 트리플릿이 전혀 없다.
특정 구현예에서, 제2 재조합 폴리뉴클레오티드는 제2 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 3' 및 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 5'에 위치하는 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, 각각의 재조합 폴리뉴클레오티드는 5'에서 3'으로, 프로모터, 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 및 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 각각의 재조합 폴리뉴클레오티드는 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 3' 및 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 5'에 위치하는 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 프로모터는 β-액틴 프로모터이다.
특정 구현예에서, 각각의 프로모터는 β-액틴 프로모터이다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 프로모터는 햄스터 β-액틴 프로모터이다.
특정 구현예에서, 각각의 프로모터는 햄스터 β-액틴 프로모터이다.
특정 구현예에서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 CD20, CD52, CD59, 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 CD20, CD52, CD59, 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 각각의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 CD20, CD52, CD59, 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 인간 CD52 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 인간 CD52 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 각각의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 인간 CD52 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 CD20, CD52, 및 CD59로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 CD20, CD52, 및 CD59로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 각각의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 CD20, CD52, 및 CD59로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 인간 CD52이다.
특정 구현예에서, 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 인간 CD52이다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 19(GX2NDTSQTSSPS)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52이고, X2는 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, X2는 A이다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 20(GQNX4TSQTSSPS)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52이고, X4는 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, X4는 A이다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 21(GQNDTSX7TSSPS)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52이고, X7은 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, X7은 A이다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 22(GQNDTSQX8SSPS)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52이고, X8은 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, X8은 A이다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 23(GQNDTSQX8X9SPS)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52이고, X8 및 X9 각각은 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 특정 구현예에서, X8 및 X9 각각은 A이다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 24(GQNDTSQX8SX10PS)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52이고, X8 및 X10 각각은 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 특정 구현예에서, X8 및 X10 각각은 A이다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 25(GQNDTSQX8X9X10PS)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52이고, X8, X9, 및 X10 각각은 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 특정 구현예에서, X8, X9, 및 X10 각각은 A이다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 26(GX2NDTSQX8X9SPS)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52이고, X2, X8, 및 X9 각각은 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 특정 구현예에서, X2, X8, 및 X9 각각은 A이다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 27(GX2NDTSQX8SX10PS)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52이고, X2, X8, 및 X10 각각은 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 특정 구현예에서, X2, X8, 및 X10 각각은 A이다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 28(GQNDTSX7X8X9SPS)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52이고, X7, X8, 및 X9 각각은 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 특정 구현예에서, X7, X8, 및 X9 각각은 A이다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 29(GQNDTSX7X8SX10PS)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52이고, X7, X8, 및 X10 각각은 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 특정 구현예에서, X7, X8, 및 X10 각각은 A이다.
특정 구현예에서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 19(GX2NDTSQTSSPS)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하고, X2는 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되고; 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 20(GQNX4TSQTSSPS) 및 서열번호 21(GQNDTSX7TSSPS)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하고, X4 및 X7 각각은 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
특정 구현예에서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 19(GX2NDTSQTSSPS)에 제시된 아미노산 서열로 구성된 변이체 인간 CD52로 구성되고, X2는 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되고; 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 20(GQNX4TSQTSSPS) 및 서열번호 21(GQNDTSX7TSSPS)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 구성된 변이체 인간 CD52로 구성되고, X4 및 X7 각각은 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
특정 구현예에서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 2(GANDTSQTSSPS)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하고; 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 4(GQNATSQTSSPS) 및 서열번호 7(GQNDTSATSSPS)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함한다.
특정 구현예에서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 2(GANDTSQTSSPS)에 제시된 아미노산 서열로 구성된 변이체 인간 CD52로 구성되고; 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 4(GQNATSQTSSPS) 및 서열번호 7(GQNDTSATSSPS)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 구성된 변이체 인간 CD52로 구성된다.
특정 구현예에서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 2(GANDTSQTSSPS)로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하고; 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 4(GQNATSQTSSPS)로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함한다.
특정 구현예에서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 2(GANDTSQTSSPS)로 제시된 아미노산 서열로 구성된 변이체 인간 CD52로 구성되고; 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 4(GQNATSQTSSPS)로 제시된 아미노산 서열로 구성된 변이체 인간 CD52로 구성된다.
특정 구현예에서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 2(GANDTSQTSSPS)로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하고; 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 7(GQNDTSATSSPS)로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함한다.
특정 구현예에서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 2(GANDTSQTSSPS)로 제시된 아미노산 서열로 구성된 변이체 인간 CD52로 구성되고; 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 7(GQNDTSATSSPS)로 제시된 아미노산 서열로 구성된 변이체 인간 CD52로 구성된다.
특정 구현예에서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 4(GQNATSQTSSPS)로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하고; 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 7(GQNDTSATSSPS)로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함한다.
특정 구현예에서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 20(GQNX4TSQTSSPS)으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하고; 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 23(GX2NDTSQX8X9SPS)으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하고; 적어도 제3 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 28(GQNDTSX7X8X9SPS)로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하고, X4, X7, X8, 및 X9 각각은 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
특정 구현예에서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 20(GQNX4TSQTSSPS)으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하고; 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 27(GX2NDTSQX8SX10PS)로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하고; 적어도 제3 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 29(GQNDTSX7X8SX10PS)로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하고, X4, X7, X8, 및 X10 각각은 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
특정 구현예에서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 4(GQNATSQTSSPS)로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하고; 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 15(GANDTSQAASPS)로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하고; 적어도 제3 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 17(GQNDTSAAASPS)로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함한다.
특정 구현예에서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 4(GQNATSQTSSPS)로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하고; 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 16(GANDTSQASAPS)으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하고; 적어도 제3 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 18(GQNDTSAASAPS)로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함한다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 고유한 표적 폴리펩티드는 치료용 폴리펩티드 또는 치료용 단백질을 포함한다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 고유한 표적 폴리펩티드는 다중쇄 단백질의 폴리펩티드이다.
특정 구현예에서, 각각의 고유한 표적 폴리펩티드는 다중쇄 단백질의 폴리펩티드이다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 고유한 표적 폴리펩티드는 항체의 폴리펩티드이다.
특정 구현예에서, 각각의 고유한 표적 폴리펩티드는 항체의 폴리펩티드이다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 고유한 표적 폴리펩티드는 교차 이중가변 도메인(CODV) Ig-유사 단백질의 폴리펩티드이다.
특정 구현예에서, 각각의 고유한 표적 폴리펩티드는 교차 이중가변 도메인(CODV) Ig-유사 단백질의 폴리펩티드이다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 고유한 표적 폴리펩티드는 CODV 트리아바디의 폴리펩티드이다.
특정 구현예에서, 각각의 고유한 표적 폴리펩티드는 CODV 트리아바디의 폴리펩티드이다.
특정 구현예에서, 재조합 포유류 숙주 세포는 CHO 세포이다.
본 발명의 추가 양태는 서열번호 19(GX2NDTSQTSSPS)로 구성된(X2는 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 선택됨) 아미노산 서열을 포함하는 단리된 변이체 인간 CD52이다. 특정 구현예에서, X2는 A이다.
본 발명의 추가 양태는 서열번호 20(GQNX4TSQTSSPS)으로 구성된(X4는 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 선택됨) 아미노산 서열을 포함하는 단리된 변이체 인간 CD52이다. 특정 구현예에서, X4는 A이다.
본 발명의 또 다른 양태는 서열번호 22(GQNDTSQX8SSPS)로 구성된(X8은 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 선택됨) 아미노산 서열을 포함하는 단리된 변이체 인간 CD52이다. 특정 구현예에서, X8은 A이다.
도 1은 본 발명에 따른 재조합 폴리뉴클레오티드 및 상응하는 mRNA 전사체의 개략도이다. 이 도면에는, 단 하나의 대표적인 재조합 폴리뉴클레오티드만이 도시되어 있다. 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드(리포터)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 TTG 시작 코돈을 가지며, 고유한 표적 폴리펩티드(치료용 단백질)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 ATG 시작 코돈을 갖는다.
도 2a는 야생형 hCD52(WT) 및 hCD52의 10개의 단일 점 돌연변이체(각각은 WT의 표시된 아미노산을 알라닌(A)으로 치환함) 각각을 발현하는 CHO 세포에 대한 mAb 4B10 및 7F11의 결합을 나타내는 그래프이다. 형질감염되지 않은 CHO 세포(CHO 모체)에 대한 결합도 표시되어 있다.
도 2b는 야생형 hCD52(WT) 및 hCD52의 10개의 단일 점 돌연변이체(각각은 WT의 표시된 아미노산을 알라닌(A)으로 치환함) 각각을 발현하는 CHO 세포에 대한 mAb CF1D12, 5F7, 3G7, 4G7, 9D9, 및 11C11의 결합을 나타내는 그래프이다. 형질감염되지 않은 CHO 세포(CHO 모체)에 대한 결합도 표시되어 있다.
도 2c는 야생형 hCD52(WT) 및 hCD52의 10개의 단일 점 돌연변이체(각각은 WT의 표시된 아미노산을 알라닌(A)으로 치환함) 각각을 발현하는 CHO 세포에 대한 mAb Campath-1H, 2C3, 12G6, 및 23E6의 결합을 나타내는 그래프이다. 형질감염되지 않은 CHO 세포(CHO 모체)에 대한 결합도 표시되어 있다.
도 3은 천연(야생형) hCD52(서열번호 30) 및 최적의 Kozak 컨텍스트가 있는 비-AUG(대체) 시작 코돈, 모든 내부 ATG 코돈의 돌연변이, 제거된 스플라이스 부위, 및 hCD52의 4번 아미노산의 아스파트산을 알라닌으로 치환한 단일 점 돌연변이를 포함하는 조작된 돌연변이체 hCD52(Mut4; 서열번호 31)의 서열 배열을 나타낸다. Mut4는 Campath-1H(C-1H)에 의해 결합되지만 mAb 9D9에 의해서는 결합되지 않는다. 표시된 부분 아미노산 서열은 서열번호 4에 해당한다.
도 4는 천연(야생형) hCD52(서열번호 30) 및 최적의 Kozak 컨텍스트가 있는 비-AUG(대체) 시작 코돈, 모든 내부 ATG 코돈의 돌연변이, 제거된 스플라이스 부위, 및 hCD52의 8번 아미노산의 트레오닌을 알라닌으로 치환한 단일 점 돌연변이를 포함하는 조작된 돌연변이체 hCD52(Mut8; 서열번호 32)의 서열 배열을 나타낸다. Mut8은 mAb 9D9에 의해 결합되지만 Campath-1H(C-1H)에 의해서는 결합되지 않는다. 표시된 부분 아미노산 서열은 서열번호 8에 해당한다.
도 5는 천연(야생형) hCD52(서열번호 30) 및 최적의 Kozak 컨텍스트가 있는 비-AUG(대체) 시작 코돈, 모든 내부 ATG 코돈의 돌연변이, 제거된 스플라이스 부위, 및 hCD52의 8번 아미노산의 트레오닌을 알라닌으로 그리고 hCD52의 10번 아미노산의 세린을 알라닌으로 치환한 2개의 점 돌연변이를 포함하는 조작된 돌연변이체 hCD52(Mut8/10; 서열번호 33)의 서열 배열을 나타낸다. Mut8/10은 mAb 9D9에 의해 결합되지만 Campath-1H(C-1H)에 의해서는 결합되지 않는다. 표시된 부분 아미노산 서열은 서열번호 13에 해당한다.
도 6은 각각의 hCD52 돌연변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 ATG 시작 코돈을 갖는 경우, 표시된 hCD52 돌연변이체에 대한 Campath-1H 또는 9D9에 의한 결합을 나타내는 4개의 유세포 분석 히스토그램이다.
도 7은 각각의 hCD52 돌연변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 ATG 시작 코돈을 갖는 경우, 표시된 hCD52 돌연변이체에 대한 Campath-1H 또는 9D9에 의한 결합을 나타내는 4개의 유세포 분석 히스토그램이다.
도 8은 각각의 hCD52 돌연변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 표시된 시작 코돈(ATG, CTG, GTG, 또는 TTG)을 갖는 경우, 표시된 hCD52 돌연변이체에 대한 Campath-1H 또는 9D9에 의한 결합을 나타내는 4개의 유세포 분석 히스토그램이다.
도 9는 각각의 hCD52 돌연변이체가 표시된 시작 코돈(ATG, CTG, GTG, 또는 TTG)을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 경우, Campath-1H 또는 9D9에 의한 Mut4(좌측 그래프) 및 Mut8(우측 그래프)의 상대적 결합을 나타내는 막대 그래프의 쌍이다.
도 10은 리포터에 대한 시작 코돈(ATG/AUG, CTG/CUG, GTG, 또는 TTG)의 선택에 따른 리포터 발현 및 관심 유전자(GOI) 발현의 상대적 수준을 나타내는 유세포 분석 히스토그램이다. 표시된 부분 서열은 서열번호 35 내지 38에 해당한다.
도 11은 표시된 hCD52 돌연변이체(Mut4, Mut2/8/9, 및 Mut7/8/9) 및 표시된 항체(7F11, 9D9, 및 Campath-1H)를 사용하는 3-리포터 시스템에 대한 개략도를 나타내는 막대 그래프 모음이다.
도 12는 표시된 hCD52 돌연변이체(Mut4, Mut2/8/10, 및 Mut7/8/10) 및 표시된 항체(7F11, 9D9, 및 Campath-1H)를 사용하는 3-리포터 시스템에 대한 개략도를 나타내는 막대 그래프 모음이다.
도 13a는 CODV 트리아바디를 암호화하는 4개의 벡터를 나타내는 개략도이다. 이 시스템에는 2개의 리포터가 존재한다.
도 13b는 CODV 트리아바디를 암호화하는 2개의 바이시스트론 벡터를 나타내는 개략도이다. 이 시스템에는 2개의 리포터가 존재한다.
도 2a는 야생형 hCD52(WT) 및 hCD52의 10개의 단일 점 돌연변이체(각각은 WT의 표시된 아미노산을 알라닌(A)으로 치환함) 각각을 발현하는 CHO 세포에 대한 mAb 4B10 및 7F11의 결합을 나타내는 그래프이다. 형질감염되지 않은 CHO 세포(CHO 모체)에 대한 결합도 표시되어 있다.
도 2b는 야생형 hCD52(WT) 및 hCD52의 10개의 단일 점 돌연변이체(각각은 WT의 표시된 아미노산을 알라닌(A)으로 치환함) 각각을 발현하는 CHO 세포에 대한 mAb CF1D12, 5F7, 3G7, 4G7, 9D9, 및 11C11의 결합을 나타내는 그래프이다. 형질감염되지 않은 CHO 세포(CHO 모체)에 대한 결합도 표시되어 있다.
도 2c는 야생형 hCD52(WT) 및 hCD52의 10개의 단일 점 돌연변이체(각각은 WT의 표시된 아미노산을 알라닌(A)으로 치환함) 각각을 발현하는 CHO 세포에 대한 mAb Campath-1H, 2C3, 12G6, 및 23E6의 결합을 나타내는 그래프이다. 형질감염되지 않은 CHO 세포(CHO 모체)에 대한 결합도 표시되어 있다.
도 3은 천연(야생형) hCD52(서열번호 30) 및 최적의 Kozak 컨텍스트가 있는 비-AUG(대체) 시작 코돈, 모든 내부 ATG 코돈의 돌연변이, 제거된 스플라이스 부위, 및 hCD52의 4번 아미노산의 아스파트산을 알라닌으로 치환한 단일 점 돌연변이를 포함하는 조작된 돌연변이체 hCD52(Mut4; 서열번호 31)의 서열 배열을 나타낸다. Mut4는 Campath-1H(C-1H)에 의해 결합되지만 mAb 9D9에 의해서는 결합되지 않는다. 표시된 부분 아미노산 서열은 서열번호 4에 해당한다.
도 4는 천연(야생형) hCD52(서열번호 30) 및 최적의 Kozak 컨텍스트가 있는 비-AUG(대체) 시작 코돈, 모든 내부 ATG 코돈의 돌연변이, 제거된 스플라이스 부위, 및 hCD52의 8번 아미노산의 트레오닌을 알라닌으로 치환한 단일 점 돌연변이를 포함하는 조작된 돌연변이체 hCD52(Mut8; 서열번호 32)의 서열 배열을 나타낸다. Mut8은 mAb 9D9에 의해 결합되지만 Campath-1H(C-1H)에 의해서는 결합되지 않는다. 표시된 부분 아미노산 서열은 서열번호 8에 해당한다.
도 5는 천연(야생형) hCD52(서열번호 30) 및 최적의 Kozak 컨텍스트가 있는 비-AUG(대체) 시작 코돈, 모든 내부 ATG 코돈의 돌연변이, 제거된 스플라이스 부위, 및 hCD52의 8번 아미노산의 트레오닌을 알라닌으로 그리고 hCD52의 10번 아미노산의 세린을 알라닌으로 치환한 2개의 점 돌연변이를 포함하는 조작된 돌연변이체 hCD52(Mut8/10; 서열번호 33)의 서열 배열을 나타낸다. Mut8/10은 mAb 9D9에 의해 결합되지만 Campath-1H(C-1H)에 의해서는 결합되지 않는다. 표시된 부분 아미노산 서열은 서열번호 13에 해당한다.
도 6은 각각의 hCD52 돌연변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 ATG 시작 코돈을 갖는 경우, 표시된 hCD52 돌연변이체에 대한 Campath-1H 또는 9D9에 의한 결합을 나타내는 4개의 유세포 분석 히스토그램이다.
도 7은 각각의 hCD52 돌연변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 ATG 시작 코돈을 갖는 경우, 표시된 hCD52 돌연변이체에 대한 Campath-1H 또는 9D9에 의한 결합을 나타내는 4개의 유세포 분석 히스토그램이다.
도 8은 각각의 hCD52 돌연변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 표시된 시작 코돈(ATG, CTG, GTG, 또는 TTG)을 갖는 경우, 표시된 hCD52 돌연변이체에 대한 Campath-1H 또는 9D9에 의한 결합을 나타내는 4개의 유세포 분석 히스토그램이다.
도 9는 각각의 hCD52 돌연변이체가 표시된 시작 코돈(ATG, CTG, GTG, 또는 TTG)을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 경우, Campath-1H 또는 9D9에 의한 Mut4(좌측 그래프) 및 Mut8(우측 그래프)의 상대적 결합을 나타내는 막대 그래프의 쌍이다.
도 10은 리포터에 대한 시작 코돈(ATG/AUG, CTG/CUG, GTG, 또는 TTG)의 선택에 따른 리포터 발현 및 관심 유전자(GOI) 발현의 상대적 수준을 나타내는 유세포 분석 히스토그램이다. 표시된 부분 서열은 서열번호 35 내지 38에 해당한다.
도 11은 표시된 hCD52 돌연변이체(Mut4, Mut2/8/9, 및 Mut7/8/9) 및 표시된 항체(7F11, 9D9, 및 Campath-1H)를 사용하는 3-리포터 시스템에 대한 개략도를 나타내는 막대 그래프 모음이다.
도 12는 표시된 hCD52 돌연변이체(Mut4, Mut2/8/10, 및 Mut7/8/10) 및 표시된 항체(7F11, 9D9, 및 Campath-1H)를 사용하는 3-리포터 시스템에 대한 개략도를 나타내는 막대 그래프 모음이다.
도 13a는 CODV 트리아바디를 암호화하는 4개의 벡터를 나타내는 개략도이다. 이 시스템에는 2개의 리포터가 존재한다.
도 13b는 CODV 트리아바디를 암호화하는 2개의 바이시스트론 벡터를 나타내는 개략도이다. 이 시스템에는 2개의 리포터가 존재한다.
본 명세서 전반에 걸쳐, 다양한 간행물, 특허, 및 공개된 특허 명세서가 식별 인용에 의해 참조된다. 이러한 간행물, 특허, 및 공개된 특허 명세서의 개시 내용은 본 발명이 속하는 분야의 최신 기술을 보다 완전하게 설명하기 위해 본 명세서에 참조로 포함된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 특정 용어는 다음과 같이 정의된 의미를 갖는다.
I. 정의
본 발명의 실시는 달리 나타내지 않는 한, 해당 기술 분야의 기술 범위 내에 있는 통상적인 면역학, 분자 생물학, 미생물학, 세포 생물학, 및 재조합 DNA 기술을 사용할 것이다. 예를 들어, 문헌[Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition (1989); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel, et al. eds., (1987)); the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson. B.D. Hames and G. R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, and Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1987))] 참조.
명세서 및 청구범위에서 사용되는 단수 형태는 문맥상 명백하게 달리 명시하지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다. 예를 들어, 용어 "세포"는 세포의 혼합물을 비롯한 복수의 세포를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "포함하는"은 조성물 및 방법이 인용된 요소를 포함하나, 다른 요소를 배제하지는 않음을 의미하도록 의도된 것이다. 조성물 및 방법을 정의하기 위해 사용될 때 "~로 본질적으로 이루어진"은 조합에 대해 임의의 본질적 중요성을 갖는 다른 요소를 배제함을 의미한다. 따라서, 본원에 정의된 바와 같은 요소로 본질적으로 이루어진 조성물은 단리 및 정제 방법으로부터의 미량의 오염물, 및 인산염 완충 염수, 보존제 등과 같은 약학적으로 허용가능한 담체를 배제하지 않을 것이다. "~로 이루어진"은 본 발명의 조성물을 투여하기 위한 실질적인 방법 단계 및 다른 성분의 미량 요소를 넘는 것을 배제함을 의미한다. 이러한 각각의 연결어에 의해 한정된 구현예는 본 발명의 범위에 속한다.
본원에서 사용되는 용어 "폴리뉴클레오티드" 또는 "뉴클레오티드 서열"은 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체 형태를 의미하며, 이의 예는 유전자 또는 유전자 단편, 엑손, 인트론, 메신저 RNA(mRNA), 전달 RNA, 리보솜 RNA, 리보자임, 상보적 DNA(cDNA), 재조합 폴리뉴클레오티드, 분지형 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브, 및 프라이머를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 폴리뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드, 예컨대 메틸화된 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "폴리펩티드"는 임의의 길이의 아미노산 또는 아미노산 유사체의 중합체 형태를 의미하며, 이의 예는 전장 단일쇄 폴리펩티드, 전장 단일쇄 단백질, 전장 단일쇄 폴리펩티드의 단편, 전장 단일쇄 단백질의 단편; 전장 다중쇄 폴리펩티드, 전장 다중쇄 단백질, 전장 다중쇄 폴리펩티드의 단편, 전장 다중쇄 단백질의 단편; 및 다중쇄 폴리펩티드의 전장 단일쇄, 다중쇄 단백질의 전장 단일쇄, 전장 다중쇄 폴리펩티드의 단일쇄의 단편, 및 전장 다중쇄 단백질의 단일쇄의 단편을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "다중쇄 폴리펩티드" 또는 "다중쇄 단백질"은 2개 이상의 단일쇄 폴리펩티드로 구성된 임의의 폴리펩티드 또는 단백질을 의미한다. 2개 이상의 단일쇄 폴리펩티드는 공유 결합, 예를 들어 이황화 결합, 및/또는 비공유 결합, 예를 들어 이온 또는 수소 결합의 임의의 조합에 의해 회합될 수 있다. 예를 들어, 통상적인 IgG 항체는 힌지 영역에서 하나 이상의 이황화 결합에 의해 연결된 2개의 중쇄, 및 2개의 경쇄로 구성되며, 각각의 경쇄는 각각의 가변 경쇄(VL) 및 가변 중쇄(VH) 도메인 사이의 하나 이상의 이황화 결합에 의해 단일 중쇄에 연결된다. 다른 예로서, CODV 트리아바디는 2개의 상이한 중쇄(상반되는 노브와 홀이 있는 CODV 중쇄 및 Fab 중쇄) 및 2개의 상이한 경쇄(CODV 경쇄 및 Fab 경쇄)로 구성된다.
다량체 단백질이라고도 하는 다중쇄 단백질의 추가적인 예는 특정 효소, 이온 채널, 수용체, 세포 부착 분자, 전압 개폐 칼륨 채널, 및 치료용 단백질(예를 들어, 인슐린 및 α-갈락토시다제)을 비롯한(이에 한정되지 않음), 동종(homomeric) 및 이종(heteromeric) 다량체 단백질을 포함한다. 많은 수용성 및 막 단백질은 세포에서 동종다량체 복합체를 형성하며, 단백질 정보 은행(Protein Data Bank)에 있는 대부분의 단백질은 동종다량체이다. 원핵생물 단백질의 약 65%, 진핵생물 단백질의 약 55%는 이량체 이상의 복합체로 존재한다(세포골격, 리보솜 등과 같은 매우 높은 차수의 구조는 포함되지 않음). 복합체 중에서, 동종체의 빈도는 단세포 종에서 이종체보다 약 4배 더 높은 반면, 척추동물에서 두 유형의 빈도는 동등하다. 결과적으로, 이종체는 단세포 종에서 단백질의 약 10%를 구성하지만 척추동물에서는 거의 30%를 구성한다. Lynch M, Mol Biol Evol. 29(5): 1353-1366 (2012). 호모올리고머는 여러 경로의 다양성 및 특이성을 유발하며, 유전자 발현, 효소 활성, 이온 채널, 수용체, 및 세포 부착 과정을 매개하고 조절할 수 있다. 뉴런의 원형질막에 있는 전압 개폐 칼륨 채널은 40개의 알려진 알파 서브유닛 중 4개로 구성된 이종다량체 단백질이다.
본원에서 사용되는 용어 "IRES" 또는 "IRES의 생물학적 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드"는 진핵 세포에서 캡 부위의 이점 없이 IRES에 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드의 번역을 개시할 수 있는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 역전사체와 같은 임의의 분자를 포함하도록 의도된 것이다. IRES 또는 IRES의 생물학적 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드는 피코르나바이러스 IRES와 같이 자연에서 발견되는 서열과 동일할 수 있거나, 또는 적합한 숙주 세포에 도입되었을 때 동일한 기능을 수행하는 비자연발생적 또는 비천연 서열일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "대체 시작 코돈"은 ATG 시작 코돈에 비해 효율이 감소된 번역 개시의 시작 부위로서 기능하는 임의의 비-ATG 폴리뉴클레오티드(일반적으로 트리플릿)를 포함하도록 의도된 것이다. 자연발생적 대체 시작 코돈의 사용은 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어 문헌[Kozak (1991) J Cell Biol. 115(4): 887-903; Mehdi et al. (1990) Gene 91: 173-178; Kozak (1989) Mol Cell Biol. 9(11): 5073-5080]에 기재되어 있다. 일반적으로, 대체 시작 코돈은 ATG의 번역 효율에 비해 감소된 번역 효율을 갖는다. 예를 들어, 대체 시작 코돈 GTG는 ATG의 번역 효율(100%)에 비해 3~5%의 번역 효율을 가질 수 있다. 대체 시작 코돈의 번역 효율은 이의 서열 컨텍스트에 영향을 받을 수도 있다. 예를 들어, 최적의 Kozak 컨센서스 서열은 대체 시작 코돈에서의 번역 개시에 긍정적인 영향을 미치는 것으로 보고되어 있다. Mehdi et al. (1990) Gene 91 :173-178; Kozak (1989) Mol Cell Biol. 9(11): 5073-5080. 완전한 Kozak 컨센서스 서열은 GCCRCCATGG(서열번호 34)이며, 여기서 시작 코돈 ATG는 볼드체로 표시되어 있고, ATG 시작 코돈의 A는 +1 위치로 지정되고, -3 위치의 "R"은 퓨린(A 또는 G)이다. 가장 잘 보존된 두 위치는 퓨린, 바람직하게는 -3에서의 A 및 +4에서의 G이다(Kozak (1991) J Cell Biol. 115(4): 887-903). 미국 특허공개 2006/0172382 및 미국 특허공개 2006/0141577에는 선택가능한 마커의 감쇠된 발현에 대한 대체 시작 코돈의 사용이 기재되어 있다. 당업자는 본원에 DNA로서 기재된 서열이 RNA 분자로서의 상관적인 서열을 가질 것임(예를 들어, DNA 서열 ATG는 예를 들어 RNA 서열 AUG에 해당함)을 인식할 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "높은 발현 수준"은 분석된 전체 세포 중 적어도 50, 70, 80, 90, 95, 또는 99%의 발현 수준보다 높은 발현 수준을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "CD20"은 pre-B 세포 단계에서 시작하여 B 세포의 표면에서 발현되고 골수와 말초의 성숙한 B 세포에서도 발현되는 4개의 막관통 단백질을 의미한다. CD20은 3개의 표면 이용가능한 항원 영역을 제시한다. 인간 및 마우스 CD20에 대한 cDNA 및 아미노산 서열은 GenBank(예를 들어, 수탁번호 NM_152866, NM_021950, 및 NM_152867(인간); NM_007641(마우스); NP_068769, NP_690605, 및 NP_690606(인간); 및 NP_031667(마우스))로부터 입수할 수 있다. 전장 인간 CD20은 297개의 아미노산 길이이며, 전장 마우스 CD20은 291개의 아미노산 길이이다.
Campath-1H 항원으로도 알려진 CD52는 성숙한 림프구에서 발현되는 짧은 당단백질을 의미하며; 그 기능은 잘 알려져 있지 않지만, 세포 부착을 억제하는 것으로 여겨진다. 인간 및 마우스 CD52에 대한 cDNA 및 아미노산 서열은 GenBank(예를 들어, 수탁번호 BC000644(인간); NM_013706(마우스); AAH00644(인간); 및 EDL30035(마우스))로부터 입수할 수 있다. 전장 인간 CD52는 42개-아미노산 신호 서열을 포함하여 61개의 아미노산 길이이며, 전장 마우스 CD52는 23개-아미노산 신호 서열을 포함하여 74개의 아미노산 길이이다.
막 공격 복합체(MAC)-억제 단백질 및 프로텍틴으로도 알려진 CD59는 보체 성분 C9가 중합되어 막 공격 복합체를 형성하는 것을 억제하는 세포 표면 당단백질이다. 인간 및 마우스 CD59에 대한 cDNA 및 아미노산 서열은 GenBank(예를 들어, 수탁번호 NM_203331, NM_0006111, NM_001127223, NM_001127225, 및 NM_001127226(인간); NM_181858 및 NM_001368215(마우스); NP_000602, NP_001120695, NP_001120697, NP_001120698, 및 NP_001120699(인간); 및 NP_862906 및 NP_001355144(마우스))로부터 입수할 수 있다. 전장 인간 CD59는 25개-아미노산 신호 서열을 포함하여 128개의 아미노산 길이이며, 전장 마우스 CD59는 23개-아미노산 신호 서열을 포함하여 129개의 아미노산 길이이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "치료용 폴리펩티드" 또는 "치료용 단백질"은 숙주 세포 및 본원에 예시된 양태에서 생산될 수 있는 임의의 단백질 또는 폴리펩티드를 의미하며, 이는 치료제 또는 약물, 예를 들어 항체, 항체 단편, 항체-유사 분자(예를 들어, 교차 이중가변 도메인(CODV) Ig-유사 단백질), 또는 효소로서의 잠재력 때문에 선택된다.
II. 방법
본 발명의 일 양태는 복수의 표적 폴리펩티드를 높은 수준으로 발현시키는 방법으로서,
(a) 복수의 포유류 숙주 세포(각각은 복수의 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함함)를 배양하는 단계
(각각의 재조합 폴리뉴클레오티드는 프로모터, 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 및 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 둘 다 동일한 mRNA 상에 전사되고,
배양은 포유류 숙주 세포 표면 상의 각각의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드의 발현 및 각각의 고유한 표적 폴리펩티드의 발현을 가능하게 하는 조건하에 이루어짐);
(b) 단계 (a)의 배양된 포유류 숙주 세포를 복수의 검출가능한 제제(각각은 포유류 숙주 세포 표면 상에 발현된 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드 중 하나 이상에 고유하게 결합할 수 있음)와 접촉시키는 단계;
(c) 단계 (b)로부터의 접촉된 세포에 대해 적어도 한 회차의 형광 활성화 세포 분류를 수행함으로써, 복수의 검출가능한 제제 중 적어도 하나에 의해 고유하게 결합된 하나 이상의 포유류 숙주 세포를 선택하는 단계;
(d) 단계 (c)에서 선택된 포유류 숙주 세포의 하나 이상의 클론 집단을 준비하는 단계;
(e) 상기 클론 집단 각각에서 적어도 2개의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드의 발현 수준을 검출함으로써 단계 (d)로부터의 하나 이상의 클론 집단을 분석하는 단계;
(f) 적어도 2개의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드의 높은 발현 수준을 갖는 하나 이상의 클론 집단을 선택하는 단계; 및
(g) 높은 수준의 복수의 표적 폴리펩티드 발현을 가능하게 하는 조건하에 단계 (f)에서 선택된 하나 이상의 클론 집단을 배양하는 단계를 포함하는 방법이다.
복수의 포유류 숙주 세포는 포유류 숙주 세포 집단, 예를 들어 포유류 세포의 세포주의 세포 집단일 수 있다. 복수의 세포 또는 세포의 집단은 일반적으로 단계 (a)에서 100개 이상, 500개 이상, 1,000개 이상, 10,000개 이상, 50,000개 이상, 100,000개 이상, 500,000개 이상, 또는 106개 이상의 세포를 포함한다. 세포는 일반적으로 모두 한 가지 유형, 예를 들어 CHO 세포, HEK-293 세포, BHK-21 세포, HepG2 세포, BAE-1 세포, SH-SY5Y 세포, 골수종 세포, 하이브리도마 세포, HeLa 세포, Vero 세포, NIH3T3 세포, WEHI231 세포, YAC 세포, Jurkat 세포, 및 이들의 유도체, 예를 들어 CHO-K1 세포 및 CHO/DHFR- 세포이다.
포유류 숙주 세포의 표면 상의 각각의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드의 발현 및 각각의 고유한 표적 폴리펩티드의 발현을 가능하게 하는 조건하의 배양은 조직 배양에서 포유류 세포에 전형적인 조건, 예를 들어 우아 혈청(FCS) 또는 우태 혈청(FBS), L-글루타민, 및 페니실린/스트렙토마이신이 경우에 따라 보충된 DMEM, Ham F12, 또는 무혈청 배지와 같은 적합한 배지에서의 5% CO2가 보충된 가습된 공기 중의 37℃와 같은 조건을 포함할 수 있다. 배양은 임의의 적합한 형식, 예를 들어 멀티웰 플레이트 배양, 접시 배양, 벌크 배양, 또는 생물반응기 배양으로 일어날 수 있다. 배양은 세포 표면 마커 폴리펩티드의 발현을 위한 시간뿐만 아니라 세포 집단 확장을 위한 시간을 허용할 수 있다.
복수의 재조합 폴리뉴클레오티드는 2개 이상의 상이한 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 특정 구현예에서, 복수의 재조합 폴리뉴클레오티드는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개 이상의 상이한 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 특정 구현예에서, 복수의 재조합 폴리뉴클레오티드는 2개의 상이한 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 특정 구현예에서, 복수의 재조합 폴리뉴클레오티드는 3개의 상이한 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 특정 구현예에서, 복수의 재조합 폴리뉴클레오티드는 4개의 상이한 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 특정 구현예에서, 복수의 재조합 폴리뉴클레오티드는 5개의 상이한 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 특정 구현예에서, 복수의 재조합 폴리뉴클레오티드는 6개의 상이한 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 특정 구현예에서, 복수의 재조합 폴리뉴클레오티드는 7개의 상이한 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 특정 구현예에서, 복수의 재조합 폴리뉴클레오티드는 8개의 상이한 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
물론, 각각의 포유류 숙주 세포는 각각의 재조합 폴리뉴클레오티드의 단일 초과의 카피를 포함할 수 있다. 예를 들어, 각각의 포유류 숙주 세포는 각각의 재조합 폴리뉴클레오티드의 약 101 내지 약 106개의 카피를 포함할 수 있다.
추가로, 각각의 포유류 숙주 세포는 각각의 재조합 폴리뉴클레오티드와 대략 동일한 수 또는 대안적으로 상이한 수의 카피를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 각각의 포유류 숙주 세포는 적어도 2개의 상이한 재조합 폴리뉴클레오티드의 대략 동일한 수의 카피를 포함하는 것이 바람직하다. 특정 구현예에서, 각각의 포유류 숙주 세포는 각각의 재조합 폴리뉴클레오티드의 대략 동일한 수의 카피를 포함하는 것이 바람직하다. 다른 특정 구현예에서, 각각의 포유류 숙주 세포는 적어도 2개의 상이한 재조합 폴리뉴클레오티드의 상이한 수의 카피를 포함하는 것이 바람직하다. 다른 특정 구현예에서, 각각의 포유류 숙주 세포는 각각의 재조합 폴리뉴클레오티드의 상이한 수의 카피를 포함하는 것이 바람직하다. 각각의 상이한 재조합 폴리뉴클레오티드의 카피 수는 다양할 수 있으며, 상이한 재조합 폴리뉴클레오티드를 숙주 포유류 세포에 도입하는 데 사용되는 조건에 기초하여 선택될 수 있다.
각각의 재조합 폴리뉴클레오티드는 프로모터, 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 및 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 둘 다 동일한 mRNA 상에 전사된다.
각각의 재조합 폴리뉴클레오티드는 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하기 때문에, 그리고 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 둘 다 동일한 mRNA 상에 전사되기 때문에, 각각의 포유류 숙주 세포는 상이한 재조합 폴리뉴클레오티드만큼 많은 고유한, 즉 상이한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 발현할 수 있다. 예를 들어, 2개의 상이한 재조합 폴리뉴클레오티드로 형질감염된 포유류 숙주 세포는 2개의 고유한, 즉 상이한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 발현할 수 있다. 유사하게, 3개의 상이한 재조합 폴리뉴클레오티드로 형질감염된 포유류 숙주 세포는 3개의 고유한, 즉 상이한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 발현할 수 있고, 나머지도 이와 마찬가지이다. 고유한, 즉 상이한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 수에 상관없이, 각각의 이러한 세포 표면 마커 폴리펩티드의 발현은 상응하는 고유한, 즉 상이한 표적 폴리펩티드의 발현과 관련될 것이다.
유사하게, 각각의 재조합 폴리뉴클레오티드는 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하기 때문에, 그리고 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 둘 다 동일한 mRNA 상에 전사되기 때문에, 각각의 포유류 숙주 세포는 상이한 재조합 폴리뉴클레오티드만큼 많은 고유한, 즉 상이한 표적 폴리펩티드를 발현할 수 있다. 예를 들어, 2개의 상이한 재조합 폴리뉴클레오티드로 형질감염된 포유류 숙주 세포는 2개의 고유한, 즉 상이한 표적 폴리펩티드를 발현할 수 있다. 유사하게, 3개의 상이한 재조합 폴리뉴클레오티드로 형질감염된 포유류 숙주 세포는 3개의 고유한, 즉 상이한 표적 폴리펩티드를 발현할 수 있고, 나머지도 이와 마찬가지이다. 고유한, 즉 상이한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 수에 상관없이, 각각의 이러한 표적 폴리펩티드의 발현은 상응하는 고유한, 즉 상이한 세포 표면 마커 폴리펩티드의 발현과 관련될 것이다.
단계 (b)는 단계 (a)의 배양된 포유류 숙주 세포를 복수의 검출가능한 제제(각각은 포유류 숙주 세포 표면 상에 발현된 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드 중 하나 이상에 고유하게 결합할 수 있음)와 접촉시키는 단계를 수반한다. 특정 구현예에서, 적어도 하나의 고유한 검출가능한 제제는 하나의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드에만 결합할 수 있다. 특정 구현예에서, 각각의 고유한 검출가능한 제제는 하나의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드에만 결합할 수 있다. 특정 구현예에서, 적어도 하나의 고유한 검출가능한 제제는 하나 초과의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드에 결합할 수 있다. 예를 들어, 이러한 고유한 검출가능한 제제는 2개의 상이한, 즉 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드에 결합할 수 있을 수 있다.
단계 (c)는 단계 (b)로부터의 접촉된 세포에 대해 적어도 한 회차의 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 수행함으로써, 복수의 검출가능한 제제 중 적어도 하나에 의해 고유하게 결합된 하나 이상의 포유류 숙주 세포를 선택하는 단계를 수반한다. 특정 구현예에서, 단계 (c)는 단계 (b)로부터의 접촉된 세포에 대한 단회의 FACS를 적어도 제1 검출가능한 제제 및 제2 검출가능한 제제를 사용하여 수행함으로써, 적어도 제1 검출가능한 제제 및 제2 검출가능한 제제 둘 다에 의해 고유하게 결합된 하나 이상의 포유류 숙주 세포를 선택하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 단계 (c)는 단계 (b)로부터의 접촉된 세포에 대한 단회의 FACS를 3개 이상의 검출가능한 제제를 사용하여 수행함으로써, 3개 이상의 검출가능한 제제에 의해 고유하게 결합된 하나 이상의 포유류 숙주 세포를 선택하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 단계 (c)는 단계 (b)로부터의 접촉된 세포에 대한 단회의 FACS를 3개의 검출가능한 제제를 사용하여 수행함으로써, 3개의 검출가능한 제제에 의해 고유하게 결합된 하나 이상의 포유류 숙주 세포를 선택하는 단계를 포함한다.
특정 구현예에서, 단계 (c)는 단계 (b)로부터의 접촉된 세포에 대한 단회의 FACS를 4개의 검출가능한 제제를 사용하여 수행함으로써, 4개의 검출가능한 제제에 의해 고유하게 결합된 하나 이상의 포유류 숙주 세포를 선택하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 단계 (c)는 단계 (b)로부터의 접촉된 세포에 대한 단회의 FACS를 5개의 검출가능한 제제를 사용하여 수행함으로써, 5개의 검출가능한 제제에 의해 고유하게 결합된 하나 이상의 포유류 숙주 세포를 선택하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 단계 (c)는 단계 (b)로부터의 접촉된 세포에 대한 단회의 FACS를 6개의 검출가능한 제제를 사용하여 수행함으로써, 6개의 검출가능한 제제에 의해 고유하게 결합된 하나 이상의 포유류 숙주 세포를 선택하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 단계 (c)는 단계 (b)로부터의 접촉된 세포에 대한 단회의 FACS를 7개의 검출가능한 제제를 사용하여 수행함으로써, 7개의 검출가능한 제제에 의해 고유하게 결합된 하나 이상의 포유류 숙주 세포를 선택하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 단계 (c)는 단계 (b)로부터의 접촉된 세포에 대한 단회의 FACS를 8개의 검출가능한 제제를 사용하여 수행함으로써, 8개의 검출가능한 제제에 의해 고유하게 결합된 하나 이상의 포유류 숙주 세포를 선택하는 단계를 포함한다.
특정 구현예에서, 단계 (c)는
(c1) 적어도 제1 세포 표면 마커 폴리펩티드에 대해 1회차 형광 활성화 세포 분류를 수행함으로써 적어도 제1 검출가능한 제제에 의해 결합된 하나 이상의 포유류 숙주 세포를 선택하는 단계; 및
(c2) 단계 (c1)에서 선택된 세포에서 적어도 제2 세포 표면 마커 폴리펩티드에 대해 2회차 형광 활성화 세포 분류를 수행함으로써 적어도 제1 검출가능한 제제 및 제2 검출가능한 제제 둘 다에 의해 결합된 하나 이상의 포유류 숙주 세포를 선택하는 단계를 포함한다.
물론, 특정 구현예에서, 더 추가적인 회차의 FACS를 수행함으로써, 임의의 수의 특정 검출가능한 제제에 의해 결합된 하나 이상의 포유류 숙주 세포를 선택한다. 예를 들어, 특정 구현예에서 단계 (c)는
(c3) 단계 (c2)에서 선택된 세포에서 적어도 제3 세포 표면 마커 폴리펩티드에 대해 3회차 FACS를 수행함으로써 적어도 제1, 제2, 및 제3 검출가능한 제제에 의해 결합된 하나 이상의 포유류 숙주 세포를 선택하는 단계를 추가로 포함한다.
유사하게, 특정 구현예에서 단계 (c)는
(c4) 단계 (c3)에서 선택된 세포에서 적어도 제4 세포 표면 마커 폴리펩티드에 대해 4회차 FACS를 수행함으로써 적어도 제1, 제2, 제3, 및 제4 검출가능한 제제에 의해 결합된 하나 이상의 포유류 숙주 세포를 선택하는 단계를 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, 단계 (e)는 단계 (d) 이후 7~28일 후에 수행된다. 특정 구현예에서, 단계 (e)는 단계 (d) 이후 7~21일 후에 수행된다. 특정 구현예에서, 단계 (e)는 단계 (d) 이후 7~14일 후에 수행된다. 특정 구현예에서, 단계 (e)는 단계 (d) 이후 7~13일 후에 수행된다. 특정 구현예에서, 단계 (e)는 단계 (d) 이후 7~12일 후에 수행된다. 특정 구현예에서, 단계 (e)는 단계 (d) 이후 7~11일 후에 수행된다. 특정 구현예에서, 단계 (e)는 단계 (d) 이후 7~11일 후에 수행된다. 특정 구현예에서, 단계 (e)는 단계 (d) 이후 7~9일 후에 수행된다. 특정 구현예에서, 단계 (e)는 단계 (d) 이후 7~8일 후에 수행된다. 특정 구현예에서, 단계 (e)는 단계 (d) 이후 7~9일 후에 수행된다. 특정 구현예에서, 단계 (e)는 단계 (d) 이후 7일 후에 수행된다.
특정 구현예에서, 단계 (e)는 단계 (d) 이후 8~28일 후에 수행된다. 특정 구현예에서, 단계 (e)는 단계 (d) 이후 8~21일 후에 수행된다. 특정 구현예에서, 단계 (e)는 단계 (d) 이후 8~14일 후에 수행된다. 특정 구현예에서, 단계 (e)는 단계 (d) 이후 8~13일 후에 수행된다. 특정 구현예에서, 단계 (e)는 단계 (d) 이후 8~12일 후에 수행된다. 특정 구현예에서, 단계 (e)는 단계 (d) 이후 8~11일 후에 수행된다. 특정 구현예에서, 단계 (e)는 단계 (d) 이후 8~11일 후에 수행된다. 특정 구현예에서, 단계 (e)는 단계 (d) 이후 8~9일 후에 수행된다. 특정 구현예에서, 단계 (e)는 단계 (d) 이후 8일 후에 수행된다.
특정 구현예에서, 단계 (e)는 단계 (d) 이후 9~28일 후에 수행된다. 특정 구현예에서, 단계 (e)는 단계 (d) 이후 9~21일 후에 수행된다. 특정 구현예에서, 단계 (e)는 단계 (d) 이후 9~14일 후에 수행된다. 특정 구현예에서, 단계 (e)는 단계 (d) 이후 9~13일 후에 수행된다. 특정 구현예에서, 단계 (e)는 단계 (d) 이후 9~12일 후에 수행된다. 특정 구현예에서, 단계 (e)는 단계 (d) 이후 9~11일 후에 수행된다. 특정 구현예에서, 단계 (e)는 단계 (d) 이후 9~11일 후에 수행된다. 특정 구현예에서, 단계 (e)는 단계 (d) 이후 9일 후에 수행된다.
특정 구현예에서, 단계 (e)는 단계 (d) 이후 10~28일 후에 수행된다. 특정 구현예에서, 단계 (e)는 단계 (d) 이후 10~21일 후에 수행된다. 특정 구현예에서, 단계 (e)는 단계 (d) 이후 10~14일 후에 수행된다. 특정 구현예에서, 단계 (e)는 단계 (d) 이후 10~13일 후에 수행된다. 특정 구현예에서, 단계 (e)는 단계 (d) 이후 10~12일 후에 수행된다. 특정 구현예에서, 단계 (e)는 단계 (d) 이후 10~11일 후에 수행된다. 특정 구현예에서, 단계 (e)는 단계 (d) 이후 10일 후에 수행된다.
특정 구현예에서, 단계 (e)는 단계 (d) 이후 11~28일 후에 수행된다. 특정 구현예에서, 단계 (e)는 단계 (d) 이후 11~21일 후에 수행된다. 특정 구현예에서, 단계 (e)는 단계 (d) 이후 11~14일 후에 수행된다. 특정 구현예에서, 단계 (e)는 단계 (d) 이후 11~13일 후에 수행된다. 특정 구현예에서, 단계 (e)는 단계 (d) 이후 11~12일 후에 수행된다. 특정 구현예에서, 단계 (e)는 단계 (d) 이후 11일 후에 수행된다.
특정 구현예에서, 단계 (e)는 단계 (d) 이후 12~28일 후에 수행된다. 특정 구현예에서, 단계 (e)는 단계 (d) 이후 12~21일 후에 수행된다. 특정 구현예에서, 단계 (e)는 단계 (d) 이후 12~14일 후에 수행된다. 특정 구현예에서, 단계 (e)는 단계 (d) 이후 12~13일 후에 수행된다. 특정 구현예에서, 단계 (e)는 단계 (d) 이후 12일 후에 수행된다.
특정 구현예에서, 단계 (e)는 단계 (d) 이후 13~28일 후에 수행된다. 특정 구현예에서, 단계 (e)는 단계 (d) 이후 13~21일 후에 수행된다. 특정 구현예에서, 단계 (e)는 단계 (d) 이후 13~14일 후에 수행된다. 특정 구현예에서, 단계 (e)는 단계 (d) 이후 13일 후에 수행된다.
특정 구현예에서, 단계 (e)는 단계 (d) 이후 14~28일 후에 수행된다. 특정 구현예에서, 단계 (e)는 단계 (d) 이후 14~21일 후에 수행된다. 특정 구현예에서, 단계 (e)는 단계 (d) 이후 14일 후에 수행된다.
특정 구현예에서, 단계 (e)는 단계 (d) 이후 15~28일 후에 수행된다. 특정 구현예에서, 단계 (e)는 단계 (d) 이후 15~21일 후에 수행된다. 특정 구현예에서, 단계 (e)는 단계 (d) 이후 15일 후에 수행된다.
특정 구현예에서, 단계 (e)는 단계 (d) 이후 16~28일 후에 수행된다. 특정 구현예에서, 단계 (e)는 단계 (d) 이후 16~21일 후에 수행된다. 특정 구현예에서, 단계 (e)는 단계 (d) 이후 16일 후에 수행된다.
특정 구현예에서, 단계 (e)는 단계 (d) 이후 17~28일 후에 수행된다. 특정 구현예에서, 단계 (e)는 단계 (d) 이후 17~21일 후에 수행된다. 특정 구현예에서, 단계 (e)는 단계 (d) 이후 17일 후에 수행된다.
특정 구현예에서, 단계 (e)는 단계 (d) 이후 18~28일 후에 수행된다. 특정 구현예에서, 단계 (e)는 단계 (d) 이후 18~21일 후에 수행된다. 특정 구현예에서, 단계 (e)는 단계 (d) 이후 18일 후에 수행된다.
특정 구현예에서, 단계 (e)는 단계 (d) 이후 19~28일 후에 수행된다. 특정 구현예에서, 단계 (e)는 단계 (d) 이후 19~21일 후에 수행된다. 특정 구현예에서, 단계 (e)는 단계 (d) 이후 19일 후에 수행된다.
특정 구현예에서, 단계 (e)는 단계 (d) 이후 20~28일 후에 수행된다. 특정 구현예에서, 단계 (e)는 단계 (d) 이후 20~21일 후에 수행된다. 특정 구현예에서, 단계 (e)는 단계 (d) 이후 20일 후에 수행된다.
특정 구현예에서, 단계 (e)는 단계 (d) 이후 21~28일 후에 수행된다. 특정 구현예에서, 단계 (e)는 단계 (d) 이후 21일 후에 수행된다.
특정 구현예에서, 단계 (e)는 단계 (d) 이후 22~28일 후에 수행된다. 특정 구현예에서, 단계 (e)는 단계 (d) 이후 22일 후에 수행된다.
특정 구현예에서, 단계 (e)는 단계 (d) 이후 23~28일 후에 수행된다. 특정 구현예에서, 단계 (e)는 단계 (d) 이후 23일 후에 수행된다.
특정 구현예에서, 단계 (e)는 단계 (d) 이후 24~28일 후에 수행된다. 특정 구현예에서, 단계 (e)는 단계 (d) 이후 24일 후에 수행된다.
특정 구현예에서, 단계 (e)는 단계 (d) 이후 25~28일 후에 수행된다. 특정 구현예에서, 단계 (e)는 단계 (d) 이후 25일 후에 수행된다.
특정 구현예에서, 단계 (e)는 단계 (d) 이후 26~28일 후에 수행된다. 특정 구현예에서, 단계 (e)는 단계 (d) 이후 26일 후에 수행된다.
특정 구현예에서, 단계 (e)는 단계 (d) 이후 27~28일 후에 수행된다. 특정 구현예에서, 단계 (e)는 단계 (d) 이후 27일 후에 수행된다.
특정 구현예에서, 단계 (e)는 단계 (d) 이후 28일 후에 수행된다.
특정 구현예에서, 단계 (e)의 분석 단계는 유세포 분석을 포함한다. 특정 구현예에서, 단계 (e)에서 유세포 분석에 의한 분석은 세포 분류를 포함한다. 다른 특정 구현예에서, 단계 (e)에서 유세포 분석에 의한 분석은 세포 분류를 포함하지 않는다.
특정 구현예에서, 단계 (f)에서의 복수의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드 중 적어도 하나의 발현 수준은 단계 (e)에서 분석된 클론 집단 중 적어도 70%의 상응하는 발현 수준보다 높다. 예를 들어, 복수의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드 중 하나가 CD52인 경우, 단계 (f)에서의 CD52의 발현 수준은 단계 (e)에서 분석된 클론 집단 중 적어도 70%의 CD52 발현 수준보다 높을 수 있다. 특정 구현예에서, 단계 (f)에서의 복수의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드 중 적어도 하나는 하나의 고유한 세포 표면 마커이다. 다른 특정 구현예에서, 단계 (f)에서의 복수의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드 중 적어도 하나는 2개의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드이다. 다른 특정 구현예에서, 단계 (f)에서의 복수의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드 중 적어도 하나는 3개의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드, 4개의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드 등이다. 동일한 원칙이 임의의 수의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드에 대해 필요한 부분만 약간 수정하여 적용된다.
특정 구현예에서, 단계 (f)에서의 복수의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드 각각의 발현 수준은 단계 (e)에서 분석된 클론 집단 중 적어도 70%의 상응하는 발현 수준보다 높다.
특정 구현예에서, 단계 (f)에서의 복수의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드 중 적어도 제1 폴리펩티드의 발현 수준은 단계 (f)에서의 복수의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드 중 적어도 제2 폴리펩티드의 발현 수준보다 높다. 예를 들어, 복수의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드 중 하나가 제1 CD52 변이체이고, 복수의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드 중 다른 하나가 제2 CD52 변이체인 경우, 단계 (f)에서의 적어도 제1 CD52 변이체의 발현 수준은 단계 (f)에서의 적어도 제2 CD52 변이체의 발현 수준보다 높을 수 있다. 유사하게, 복수의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드 중 하나가 제1 CD52 변이체이고, 복수의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드 중 다른 하나가 제2 CD52 변이체이고, 복수의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드 중 또 다른 하나가 제3 CD52 변이체인 경우, 단계 (f)에서의 적어도 제1 CD52 변이체의 발현 수준은 단계 (f)에서의 적어도 제2 CD52 변이체 및 제3 CD52 변이체 둘 다의 발현 수준보다 높을 수 있다. 다른 예로서, 복수의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드 중 하나가 제1 CD52 변이체이고, 복수의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드 중 다른 하나가 제2 CD52 변이체이고, 복수의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드 중 또 다른 하나가 제3 CD52 변이체인 경우, 단계 (f)에서의 적어도 제1 CD52 변이체의 발현 수준 및 제2 CD52 변이체의 발현 수준은 단계 (f)에서의 제3 CD52 변이체의 발현 수준보다 높을 수 있다. 동일한 원칙이 임의의 수의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드에 대해 필요한 부분만 약간 수정하여 적용된다.
특정 구현예에서, 단계 (f)에서의 복수의 고유한 세포 표면 폴리펩티드 중 제1 폴리펩티드의 발현 수준은 단계 (f)에서의 복수의 고유한 세포 표면 폴리펩티드 중 제2 폴리펩티드의 발현 수준보다 높다.
특정 구현예에서, 상기 방법은
(h) 단계 (g)에서 발현된 적어도 제1 고유한 표적 폴리펩티드 및 제2 고유한 표적 폴리펩티드를 하나 이상의 선택된 클론 집단으로부터 또는 하나 이상의 선택된 클론 집단이 배양되는 세포 배양 배지로부터 단리하는 단계를 추가로 포함한다. 목적하는 발현된 표적 폴리펩티드를 단리 또는 정제하기 위한 임의의 적합한 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 단리는 친화성 크로마토그래피, 겔 여과/크기 배제, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 면역침전, 이온 교환 크로마토그래피, 또는 이의 임의의 조합을 수반할 수 있다. 분비된 표적 폴리펩티드의 경우, 단리 또는 정제는 세포 배지로부터 또는 이의 투석액 및/또는 농축액으로부터 직접 수행될 수 있다. 다른 표적 폴리펩티드의 경우, 단리 또는 정제는 세포 용해 단계 또는 막 파괴 단계를 포함할 수 있다. 이러한 일반적인 단리 및 정제 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다.
특정 구현예에서, 복수의 고유한 표적 폴리펩티드는 2 내지 8개의 고유한 표적 폴리펩티드를 포함한다.
특정 구현예에서, 복수의 고유한 표적 폴리펩티드는 2 내지 4개의 고유한 표적 폴리펩티드를 포함한다.
특정 구현예에서, 복수의 고유한 표적 폴리펩티드는 2개의 고유한 표적 폴리펩티드를 포함한다.
특정 구현예에서, 복수의 고유한 표적 폴리펩티드는 3개의 고유한 표적 폴리펩티드를 포함한다.
특정 구현예에서, 복수의 고유한 표적 폴리펩티드는 4개의 고유한 표적 폴리펩티드를 포함한다.
특정 구현예에서, 복수의 고유한 표적 폴리펩티드는 5개의 고유한 표적 폴리펩티드를 포함한다.
특정 구현예에서, 복수의 고유한 표적 폴리펩티드는 6개의 고유한 표적 폴리펩티드를 포함한다.
특정 구현예에서, 복수의 고유한 표적 폴리펩티드는 7개의 고유한 표적 폴리펩티드를 포함한다.
특정 구현예에서, 복수의 고유한 표적 폴리펩티드는 8개의 고유한 표적 폴리펩티드를 포함한다.
특정 구현예에서, 복수의 고유한 표적 폴리펩티드는 8개 이상의 고유한 표적 폴리펩티드를 포함한다.
특정 구현예에서, 각각의 재조합 폴리뉴클레오티드는 5'에서 3'으로, 프로모터, 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 및 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 각각의 재조합 폴리뉴클레오티드는 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 3' 및 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 5'에 위치하는 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, 각각의 재조합 폴리뉴클레오티드는 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 번역 개시를 위한 대체(비-ATG) 시작 코돈, 및 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 번역 개시를 위한 ATG 시작 코돈을 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, 각각의 대체(비-ATG) 시작 코돈은 CTG, GTG, TTG, ATT, ATA, 및 ACG로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 즉, 대체(비-ATG) 시작 코돈은 동일하거나 상이할 수 있으며; 일부 또는 전부가 동일할 수 있거나, 또는 일부 또는 전부가 상이할 수 있다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 대체 시작 코돈은 CTG이다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 대체 시작 코돈은 GTG이다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 대체 시작 코돈은 TTG이다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 대체 시작 코돈은 ATT이다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 대체 시작 코돈은 ATA이다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 대체 시작 코돈은 ACG이다.
특정 구현예에서, 각각의 대체(비-ATG) 시작 코돈은 GTG 및 TTG로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 특정 구현예에서, 적어도 하나의 대체 시작 코돈은 GTG이다. 특정 구현예에서, 적어도 하나의 대체 시작 코돈은 TTG이다. 특정 구현예에서, 각각의 대체(비-ATG) 시작 코돈은 GTG이다. 다른 특정 구현예에서, 각각의 대체(비-ATG) 시작 코돈은 TTG이다.
특정 구현예에서, 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에는 ATG 트리플릿이 전혀 없다.
특정 구현예에서, 적어도 제1 재조합 폴리뉴클레오티드는 5'에서 3'으로, 제1 프로모터, 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 및 제1 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고; 적어도 제2 재조합 폴리뉴클레오티드는 5'에서 3'으로, 제2 프로모터, 제2 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 및 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 앞서 지적한 바와 같이, 본 발명은 또한, 상응하는 요소를 갖는 적어도 제3 재조합 폴리뉴클레오티드, 상응하는 요소를 갖는 적어도 제4 재조합 폴리뉴클레오티드, 상응하는 요소를 갖는 적어도 제5 재조합 폴리뉴클레오티드, 상응하는 요소를 갖는 적어도 제6 재조합 폴리뉴클레오티드, 상응하는 요소를 갖는 적어도 제7 재조합 폴리뉴클레오티드, 및 상응하는 요소를 갖는 적어도 제8 재조합 폴리뉴클레오티드를 제한 없이 추가로 포함할 수 있는 구현예를 고려한다.
특정 구현예에서, 제1 재조합 폴리뉴클레오티드는 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 3' 및 제1 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 5'에 위치하는 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, 제1 재조합 폴리뉴클레오티드는 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 번역 개시를 위한 대체(비-ATG) 시작 코돈, 및 제1 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 번역 개시를 위한 ATG 시작 코돈을 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, 대체(비-ATG) 시작 코돈은 CTG, GTG, TTG, ATT, ATA, 및 ACG로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 대체(비-ATG) 시작 코돈은 GTG 및 TTG로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 대체(비-ATG) 시작 코돈은 CTG이다.
특정 구현예에서, 대체(비-ATG) 시작 코돈은 GTG이다.
특정 구현예에서, 대체(비-ATG) 시작 코돈은 TTG이다.
특정 구현예에서, 대체(비-ATG) 시작 코돈은 ATT이다.
특정 구현예에서, 대체(비-ATG) 시작 코돈은 ATA이다.
특정 구현예에서, 대체(비-ATG) 시작 코돈은 ACG이다.
특정 구현예에서, 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에는 ATG 트리플릿이 전혀 없다.
특정 구현예에서, 제2 재조합 폴리뉴클레오티드는 제2 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 3' 및 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 5'에 위치하는 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, 각각의 재조합 폴리뉴클레오티드는 5'에서 3'으로, 프로모터, 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 및 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 각각의 재조합 폴리뉴클레오티드는 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 3' 및 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 5'에 위치하는 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 추가로 포함한다.
각각의 프로모터는 임의의 다른 프로모터와 독립적으로 선택된다. 특정 구현예에서, 2개의 프로모터는 동일하지 않다. 특정 구현예에서, 적어도 2개의 프로모터는 동일하다. 특정 구현예에서, 모든 프로모터는 동일하다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 프로모터는 β-액틴 프로모터이다.
특정 구현예에서, 각각의 프로모터는 β-액틴 프로모터이다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 프로모터는 햄스터 β-액틴 프로모터이다.
특정 구현예에서, 각각의 프로모터는 햄스터 β-액틴 프로모터이다.
특정 구현예에서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 CD20, CD52, CD59, 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 달리 나타내지 않는 한, CD20, CD52, 및 CD59는 CD20, CD52, 및 CD59의 인간 형태 및 비인간 형태 둘 다를 포함한다. 특정 구현예에서, CD20은 인간 CD20(hCD20)이다. 특정 구현예에서, CD52는 인간 CD52(hCD52)이다. 특정 구현예에서, CD59는 인간 CD59(hCD59)이다. CD20, CD52, 및 CD59의 비인간 형태는 CD20, CD52, 및 CD59의 마우스, 래트, 및 비인간 영장류 형태를 제한 없이 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "변이체"는 적어도 하나의 아미노산 잔기가 야생형 분자와 다른 특정 분자의 돌연변이 버전을 의미한다. 예를 들어, "변이체"는 변이체가 숙주 포유류 세포의 표면에서 발현될 수 있다면, 야생형 폴리펩티드와 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개의 점 돌연변이를 포함할 수 있다. 2개 이상의 점 돌연변이를 갖는 변이체의 경우, 상기 돌연변이는 서로 인접하거나 인접하지 않을 수 있다. 일부 구현예에서, 적어도 2개의 점 돌연변이는 서로 인접해 있다. 다른 특정 구현예에서, 2개의 점 돌연변이는 서로 인접하지 않는다. 일부 구현예에서, 일부 점 돌연변이는 서로 인접하고, 다른 점 돌연변이는 서로 인접하지 않는다.
특정 구현예에서, 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 CD20 또는 이의 변이체이다.
특정 구현예에서, 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 CD20이다.
특정 구현예에서, 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 변이체 CD20이다.
특정 구현예에서, 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 CD52 또는 이의 변이체이다.
특정 구현예에서, 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 CD52이다.
특정 구현예에서, 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 변이체 CD52이다.
특정 구현예에서, 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 CD59 또는 이의 변이체이다.
특정 구현예에서, 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 CD59이다.
특정 구현예에서, 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 변이체 CD59이다.
특정 구현예에서, 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 CD20, CD52, CD59, 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 이러한 구현예에서, 제1 및 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서로 상이하다. 예를 들어, 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 야생형 CD52일 수 있고, 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 변이체 CD52일 수 있다. 다른 예로서, 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 제1 변이체 CD52일 수 있고, 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 제2 변이체 CD52일 수 있으며, 제1 및 제2 변이체 CD52 분자는 상이하다.
특정 구현예에서, 각각의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 CD20, CD52, CD59, 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 인간 CD52 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 인간 CD52 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 이러한 구현예에서, 제1 및 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서로 상이하다. 예를 들어, 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 야생형 인간 CD52일 수 있고, 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 변이체 인간 CD52일 수 있다. 다른 예로서, 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 제1 변이체 인간 CD52일 수 있고, 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 제2 변이체 인간 CD52일 수 있으며, 제1 및 제2 변이체 인간 CD52 분자는 상이하다.
특정 구현예에서, 각각의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 인간 CD52 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 CD20, CD52, 및 CD59로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 CD20, CD52, 및 CD59로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 각각의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 CD20, CD52, 및 CD59로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 인간 CD52이다.
특정 구현예에서, 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 인간 CD52이다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 19(GX2NDTSQTSSPS)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52이고, X2는 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, X2는 A이다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 20(GQNX4TSQTSSPS)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52이고, X4는 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, X4는 A이다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 21(GQNDTSX7TSSPS)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52이고, X7은 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, X7은 A이다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 22(GQNDTSQX8SSPS)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52이고, X8은 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, X8은 A이다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 23(GQNDTSQX8X9SPS)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52이고, X8 및 X9 각각은 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 특정 구현예에서, X8 및 X9 각각은 A이다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 24(GQNDTSQX8SX10PS)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52이고, X8 및 X10 각각은 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 특정 구현예에서, X8 및 X10 각각은 A이다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 25(GQNDTSQX8X9X10PS)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52이고, X8, X9, 및 X10 각각은 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 특정 구현예에서, X8, X9, 및 X10 각각은 A이다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 26(GX2NDTSQX8X9SPS)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52이고, X2, X8, 및 X9 각각은 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 특정 구현예에서, X2, X8, 및 X9 각각은 A이다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 27(GX2NDTSQX8SX10PS)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52이고, X2, X8, 및 X10 각각은 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 특정 구현예에서, X2, X8, 및 X10 각각은 A이다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 28(GQNDTSX7X8X9SPS)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52이고, X7, X8, 및 X9 각각은 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 특정 구현예에서, X7, X8, 및 X9 각각은 A이다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 29(GQNDTSX7X8SX10PS)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52이고, X7, X8, 및 X10 각각은 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 특정 구현예에서, X7, X8, 및 X10 각각은 A이다.
특정 구현예에서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 19(GX2NDTSQTSSPS)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하고, X2는 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되고; 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 20(GQNX4TSQTSSPS) 및 서열번호 21(GQNDTSX7TSSPS)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하고, X4 및 X7 각각은 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
특정 구현예에서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 19(GX2NDTSQTSSPS)에 제시된 아미노산 서열로 구성된 변이체 인간 CD52로 구성되고, X2는 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되고; 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 20(GQNX4TSQTSSPS) 및 서열번호 21(GQNDTSX7TSSPS)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 구성된 변이체 인간 CD52로 구성되고, X4 및 X7 각각은 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
특정 구현예에서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 2(GANDTSQTSSPS)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하고; 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 4(GQNATSQTSSPS) 및 서열번호 7(GQNDTSATSSPS)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함한다.
특정 구현예에서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 2(GANDTSQTSSPS)에 제시된 아미노산 서열로 구성된 변이체 인간 CD52로 구성되고; 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 4(GQNATSQTSSPS) 및 서열번호 7(GQNDTSATSSPS)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 구성된 변이체 인간 CD52로 구성된다.
특정 구현예에서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 2(GANDTSQTSSPS)로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하고; 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 4(GQNATSQTSSPS)로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함한다.
특정 구현예에서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 2(GANDTSQTSSPS)로 제시된 아미노산 서열로 구성된 변이체 인간 CD52로 구성되고; 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 4(GQNATSQTSSPS)로 제시된 아미노산 서열로 구성된 변이체 인간 CD52로 구성된다.
특정 구현예에서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 2(GANDTSQTSSPS)로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하고; 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 7(GQNDTSATSSPS)로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함한다.
특정 구현예에서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 2(GANDTSQTSSPS)로 제시된 아미노산 서열로 구성된 변이체 인간 CD52로 구성되고; 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 7(GQNDTSATSSPS)로 제시된 아미노산 서열로 구성된 변이체 인간 CD52로 구성된다.
특정 구현예에서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 4(GQNATSQTSSPS)로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하고; 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 7(GQNDTSATSSPS)로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함한다.
특정 구현예에서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 20(GQNX4TSQTSSPS)으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하고; 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 23(GX2NDTSQX8X9SPS)으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하고; 적어도 제3 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 28(GQNDTSX7X8X9SPS)로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하고, X4, X7, X8, 및 X9 각각은 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
특정 구현예에서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 20(GQNX4TSQTSSPS)으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하고; 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 27(GX2NDTSQX8SX10PS)로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하고; 적어도 제3 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 29(GQNDTSX7X8SX10PS)로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하고, X4, X7, X8, 및 X10 각각은 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
특정 구현예에서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 4(GQNATSQTSSPS)로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하고; 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 15(GANDTSQAASPS)로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하고; 적어도 제3 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 17(GQNDTSAAASPS)로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함한다.
특정 구현예에서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 4(GQNATSQTSSPS)로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하고; 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 16(GANDTSQASAPS)으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하고; 적어도 제3 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 18(GQNDTSAASAPS)로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함한다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 고유한 표적 폴리펩티드는 치료용 폴리펩티드 또는 치료용 단백질을 포함한다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 고유한 표적 폴리펩티드는 다중쇄 단백질의 폴리펩티드이다.
특정 구현예에서, 각각의 고유한 표적 폴리펩티드는 다중쇄 단백질의 폴리펩티드이다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 고유한 표적 폴리펩티드는 항체의 폴리펩티드이다.
특정 구현예에서, 각각의 고유한 표적 폴리펩티드는 항체의 폴리펩티드이다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 고유한 표적 폴리펩티드는 교차 이중가변 도메인(CODV) Ig-유사 단백질의 폴리펩티드이다. 특정 구현예에서, 적어도 하나의 고유한 표적 폴리펩티드는 교차 이중가변 도메인(CODV) Ig-유사 단백질 트리아바디의 폴리펩티드이다.
특정 구현예에서, 각각의 고유한 표적 폴리펩티드는 교차 이중가변 도메인(CODV) Ig-유사 단백질의 폴리펩티드이다. 특정 구현예에서, 각각의 고유한 표적 폴리펩티드는 교차 이중가변 도메인(CODV) Ig-유사 단백질 트리아바디의 폴리펩티드이다.
재조합 포유류 숙주 세포는 본원에 개시된 방법 및/또는 조성물에 따라 표적 폴리펩티드(들)를 발현할 수 있는 임의의 포유류 세포 또는 세포주일 수 있다. 특정 구현예에서, 재조합 포유류 숙주 세포는 CHO 세포, HEK-293 세포, BHK-21 세포, HepG2 세포, BAE-1 세포, SH-SY5Y 세포, 골수종 세포(예: Sp2/0-Ag14), 하이브리도마 세포, HeLa 세포, Vero 세포, NIH3T3 세포, WEHI231 세포, YAC 세포, Jurkat 세포, 및 이들의 유도체, 예를 들어 CHO-K1 세포 및 CHO/DHFR- 세포로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 재조합 포유류 숙주 세포는 CHO 세포이다.
III. 조성물
본 발명의 추가 양태는 복수의 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조작된 포유류 숙주 세포로서, 각각의 재조합 폴리뉴클레오티드는 프로모터, 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 및 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 둘 다 동일한 mRNA 상에 전사되는, 조작된 포유류 숙주 세포이다.
특정 구현예에서, 복수의 고유한 표적 폴리펩티드는 2 내지 8개의 고유한 표적 폴리펩티드를 포함한다.
특정 구현예에서, 복수의 고유한 표적 폴리펩티드는 2 내지 4개의 고유한 표적 폴리펩티드를 포함한다.
특정 구현예에서, 복수의 고유한 표적 폴리펩티드는 2개의 고유한 표적 폴리펩티드를 포함한다.
특정 구현예에서, 복수의 고유한 표적 폴리펩티드는 3개의 고유한 표적 폴리펩티드를 포함한다.
특정 구현예에서, 복수의 고유한 표적 폴리펩티드는 4개의 고유한 표적 폴리펩티드를 포함한다.
특정 구현예에서, 각각의 재조합 폴리뉴클레오티드는 5'에서 3'으로, 프로모터, 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 및 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 각각의 재조합 폴리뉴클레오티드는 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 3' 및 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 5'에 위치하는 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, 각각의 재조합 폴리뉴클레오티드는 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 번역 개시를 위한 대체(비-ATG) 시작 코돈, 및 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 번역 개시를 위한 ATG 시작 코돈을 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, 각각의 대체(비-ATG) 시작 코돈은 CTG, GTG, TTG, ATT, ATA, 및 ACG로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
특정 구현예에서, 각각의 대체(비-ATG) 시작 코돈은 GTG 및 TTG로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
특정 구현예에서, 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에는 ATG 트리플릿이 전혀 없다.
특정 구현예에서, 적어도 제1 재조합 폴리뉴클레오티드는 5'에서 3'으로, 제1 프로모터, 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 및 제1 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고; 적어도 제2 재조합 폴리뉴클레오티드는 5'에서 3'으로, 제2 프로모터, 제2 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 및 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 제1 재조합 폴리뉴클레오티드는 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 3' 및 제1 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 5'에 위치하는 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, 제1 재조합 폴리뉴클레오티드는 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 번역 개시를 위한 대체(비-ATG) 시작 코돈, 및 제1 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 번역 개시를 위한 ATG 시작 코돈을 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, 대체(비-ATG) 시작 코돈은 CTG, GTG, TTG, ATT, ATA, 및 ACG로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 대체(비-ATG) 시작 코돈은 GTG 및 TTG로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에는 ATG 트리플릿이 전혀 없다.
특정 구현예에서, 제2 재조합 폴리뉴클레오티드는 제2 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 3' 및 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 5'에 위치하는 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, 각각의 재조합 폴리뉴클레오티드는 5'에서 3'으로, 프로모터, 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 및 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 각각의 재조합 폴리뉴클레오티드는 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 3' 및 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 5'에 위치하는 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 프로모터는 β-액틴 프로모터이다.
특정 구현예에서, 각각의 프로모터는 β-액틴 프로모터이다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 프로모터는 햄스터 β-액틴 프로모터이다.
특정 구현예에서, 각각의 프로모터는 햄스터 β-액틴 프로모터이다.
특정 구현예에서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 CD20, CD52, CD59, 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 CD20, CD52, CD59, 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 각각의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 CD20, CD52, CD59, 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 인간 CD52 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 인간 CD52 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 각각의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 인간 CD52 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 CD20, CD52, 및 CD59로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 CD20, CD52, 및 CD59로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 각각의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 CD20, CD52, 및 CD59로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 인간 CD52이다.
특정 구현예에서, 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 인간 CD52이다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 19(GX2NDTSQTSSPS)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52이고, X2는 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, X2는 A이다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 20(GQNX4TSQTSSPS)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52이고, X4는 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, X4는 A이다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 21(GQNDTSX7TSSPS)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52이고, X7은 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, X7은 A이다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 22(GQNDTSQX8SSPS)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52이고, X8은 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, X8은 A이다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 23(GQNDTSQX8X9SPS)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52이고, X8 및 X9 각각은 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 특정 구현예에서, X8 및 X9 각각은 A이다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 24(GQNDTSQX8SX10PS)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52이고, X8 및 X10 각각은 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 특정 구현예에서, X8 및 X10 각각은 A이다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 25(GQNDTSQX8X9X10PS)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52이고, X8, X9, 및 X10 각각은 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 특정 구현예에서, X8, X9, 및 X10 각각은 A이다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 26(GX2NDTSQX8X9SPS)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52이고, X2, X8, 및 X9 각각은 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 특정 구현예에서, X2, X8, 및 X9 각각은 A이다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 27(GX2NDTSQX8SX10PS)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52이고, X2, X8, 및 X10 각각은 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 특정 구현예에서, X2, X8, 및 X10 각각은 A이다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 28(GQNDTSX7X8X9SPS)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52이고, X7, X8, 및 X9 각각은 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 특정 구현예에서, X7, X8, 및 X9 각각은 A이다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 29(GQNDTSX7X8SX10PS)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52이고, X7, X8, 및 X10 각각은 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 특정 구현예에서, X7, X8, 및 X10 각각은 A이다.
특정 구현예에서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 19(GX2NDTSQTSSPS)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하고, X2는 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되고; 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 20(GQNX4TSQTSSPS) 및 서열번호 21(GQNDTSX7TSSPS)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하고, X4 및 X7 각각은 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
특정 구현예에서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 19(GX2NDTSQTSSPS)에 제시된 아미노산 서열로 구성된 변이체 인간 CD52로 구성되고, X2는 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되고; 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 20(GQNX4TSQTSSPS) 및 서열번호 21(GQNDTSX7TSSPS)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 구성된 변이체 인간 CD52로 구성되고, X4 및 X7 각각은 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
특정 구현예에서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 2(GANDTSQTSSPS)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하고; 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 4(GQNATSQTSSPS) 및 서열번호 7(GQNDTSATSSPS)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함한다.
특정 구현예에서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 2(GANDTSQTSSPS)에 제시된 아미노산 서열로 구성된 변이체 인간 CD52로 구성되고; 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 4(GQNATSQTSSPS) 및 서열번호 7(GQNDTSATSSPS)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 구성된 변이체 인간 CD52로 구성된다.
특정 구현예에서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 2(GANDTSQTSSPS)로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하고; 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 4(GQNATSQTSSPS)로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함한다.
특정 구현예에서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 2(GANDTSQTSSPS)로 제시된 아미노산 서열로 구성된 변이체 인간 CD52로 구성되고; 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 4(GQNATSQTSSPS)로 제시된 아미노산 서열로 구성된 변이체 인간 CD52로 구성된다.
특정 구현예에서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 2(GANDTSQTSSPS)로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하고; 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 7(GQNDTSATSSPS)로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함한다.
특정 구현예에서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 2(GANDTSQTSSPS)로 제시된 아미노산 서열로 구성된 변이체 인간 CD52로 구성되고; 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 7(GQNDTSATSSPS)로 제시된 아미노산 서열로 구성된 변이체 인간 CD52로 구성된다.
특정 구현예에서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 4(GQNATSQTSSPS)로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하고; 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 7(GQNDTSATSSPS)로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함한다.
특정 구현예에서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 20(GQNX4TSQTSSPS)으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하고; 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 23(GX2NDTSQX8X9SPS)으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하고; 적어도 제3 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 28(GQNDTSX7X8X9SPS)로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하고, X4, X7, X8, 및 X9 각각은 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
특정 구현예에서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 20(GQNX4TSQTSSPS)으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하고; 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 27(GX2NDTSQX8SX10PS)로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하고; 적어도 제3 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 29(GQNDTSX7X8SX10PS)로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하고, X4, X7, X8, 및 X10 각각은 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
특정 구현예에서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 4(GQNATSQTSSPS)로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하고; 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 15(GANDTSQAASPS)로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하고; 적어도 제3 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 17(GQNDTSAAASPS)로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함한다.
특정 구현예에서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 4(GQNATSQTSSPS)로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하고; 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 16(GANDTSQASAPS)으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하고; 적어도 제3 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 18(GQNDTSAASAPS)로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함한다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 고유한 표적 폴리펩티드는 치료용 폴리펩티드 또는 치료용 단백질을 포함한다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 고유한 표적 폴리펩티드는 다중쇄 단백질의 폴리펩티드이다.
특정 구현예에서, 각각의 고유한 표적 폴리펩티드는 다중쇄 단백질의 폴리펩티드이다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 고유한 표적 폴리펩티드는 항체의 폴리펩티드이다.
특정 구현예에서, 각각의 고유한 표적 폴리펩티드는 항체의 폴리펩티드이다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 고유한 표적 폴리펩티드는 교차 이중가변 도메인(CODV) Ig-유사 단백질의 폴리펩티드이다.
특정 구현예에서, 각각의 고유한 표적 폴리펩티드는 교차 이중가변 도메인(CODV) Ig-유사 단백질의 폴리펩티드이다.
특정 구현예에서, 재조합 포유류 숙주 세포는 CHO 세포이다.
본 발명의 추가 양태는 서열번호 19(GX2NDTSQTSSPS)로 구성된(X2는 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 선택됨) 아미노산 서열을 포함하는 단리된 변이체 인간 CD52이다. 특정 구현예에서, X2는 A이다.
본 발명의 또 다른 양태는 서열번호 20(GQNX4TSQTSSPS)으로 구성된(X4는 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 선택됨) 아미노산 서열을 포함하는 단리된 변이체 인간 CD52이다. 특정 구현예에서, X4는 A이다.
본 발명의 또 다른 양태는 서열번호 21(GQNDTSQX8SSPS)로 구성된(X8은 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 선택됨) 아미노산 서열을 포함하는 단리된 변이체 인간 CD52이다. 특정 구현예에서, X8은 A이다.
실시예
실시예 1. 새로운 항-hCD52 단일클론 항체의 생성 및 특성화
마우스를 인간 CD52(hCD52)로 면역화한 다음, 통상적인 방법을 사용하여 결합 항체로부터 뮤린 단일클론 항-hCD52 항체를 발현하는 11개의 클론을 제조하였다. 이어서 이들 11개의 단일클론 항체를 다시 통상적인 방법을 사용하여, 마우스 가변 영역 및 인간 불변 영역을 갖는 키메라 단일클론 항체로 전환시켰다. hCD52 펩티드 모방체에 대한 11개 클론의 친화도 평가를 수행하였다. 11개 클론은 표 1에 제시되어 있다.
다음으로, hCD52 펩티드 모방체의 절단형 및 알라닌 스캐닝 시리즈에 대한 ELISA 기반 결합 프로파일 측면에서 클론을 특성화하였다. Campath-1H(C-1H)와 비교하였다. 결과는 표 2 및 3에 제시되어 있다. 표 2는 C-1H가 주로 hCD52의 C-말단 영역에 결합하는 반면, 9D9, 11C11, 3G7, 및 CF1D12는 주로 hCD52의 N-말단 영역에 결합함을 보여준다. 이러한 결과는 표 3에 나타낸 데이터와 대체로 일치한다. 즉, hCD52의 C-말단 영역에서의 알라닌 스캐닝은 C-1H에 의한 결합을 방해한 반면 hCD52의 N-말단 영역에서의 알라닌 스캐닝은 9D9, 11C11, 및 3G7에 의한 결합을 방해하였다.
이러한 클론(항체) 중 일부를 또한 FACS 기반 결합 프로파일 측면에서 특성화하였다. 간략하게, hCD52 및 표 3의 펩티드 모방체에 상응하는 hCD52의 개별 알라닌 스캐닝 변이체를 CHO 세포를 통해 개별적으로 발현시키고, 이를 이어서 본 실시예에 기재된 선택된 항체(4B10, 7F11, CF1D12, 5F7, 3G7, 4G7, 9D9, 11C11, Campath-1H, 2C3, 12G8, 및 23E6)를 사용하여 FACS를 통해 분석하였다. 시험 항원의 아미노산 서열은 다음과 같다:
Mut1
AQNDTSQTSSPS
서열번호 1
Mut2
GANDTSQTSSPS
서열번호 2
Mut3
GQADTSQTSSPS
서열번호 3
Mut4
GQNATSQTSSPS
서열번호 4
Mut5
GQNDASQTSSPS
서열번호 5
Mut6
GQNDTAQTSSPS
서열번호 6
Mut7
GQNDTSATSSPS
서열번호 7
Mut8
GQNDTSQASSPS
서열번호 8
Mut9
GQNDTSQTASPS
서열번호 9
Mut10
GQNDTSQTSAPS
서열번호 10
WT
GQNDTSQTSSPS
서열번호 11
결과는 도 2a 내지 2c에 도시되어 있고, Campath-1H 및 클론 9D9가 세포 표면 제시 hCD52 알라닌 돌연변이체 4(GQNATSQTSSPS; 서열번호 4)와 8(GQNDTSQASSPS; 서열번호 8)를 명확히 구별했음을 보여준다.
이러한 연구의 결과는 상응하는 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드의 발현을 평가함으로써 개별 세포에서 복수의 상이한 표적 폴리펩티드의 공동 발현을 모니터링하기 위한 시스템을 개발할 가능성에 대한 원리 증명을 제공하였다.
실시예 2. 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드로서 유용한 예시적인 hCD52 돌연변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 구성체
최적의 Kozak 컨텍스트가 있는 비-AUG(대체) 시작 코돈, 모든 내부 ATG 코돈의 돌연변이, 제거된 스플라이스 부위, 및 hCD52의 선택된 아미노산을 알라닌으로 치환한 단일 점 돌연변이를 포함하는 hCD52의 다양한 돌연변이체 버전을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제조하였다.
도 3은 천연(야생형) hCD52(서열번호 30) 및 최적의 Kozak 컨텍스트가 있는 비-AUG(대체) 시작 코돈, 모든 내부 ATG 코돈의 돌연변이, 제거된 스플라이스 부위, 및 hCD52의 4번 아미노산의 아스파트산을 알라닌으로 치환한 단일 점 돌연변이를 포함하는 조작된 돌연변이체 hCD52(Mut4; 서열번호 31)의 서열 배열을 나타낸다. Mut4는 Campath-1H(C-1H)에 의해 결합되지만 mAb 9D9에 의해서는 결합되지 않는다.
도 4는 천연(야생형) hCD52(서열번호 30) 및 최적의 Kozak 컨텍스트가 있는 비-AUG(대체) 시작 코돈, 모든 내부 ATG 코돈의 돌연변이, 제거된 스플라이스 부위, 및 hCD52의 8번 아미노산의 트레오닌을 알라닌으로 치환한 단일 점 돌연변이를 포함하는 조작된 돌연변이체 hCD52(Mut8; 서열번호 32)의 서열 배열을 나타낸다. Mut8은 mAb 9D9에 의해 결합되지만 Campath-1H(C-1H)에 의해서는 결합되지 않는다.
도 5는 천연(야생형) hCD52(서열번호 30) 및 최적의 Kozak 컨텍스트가 있는 비-AUG(대체) 시작 코돈, 모든 내부 ATG 코돈의 돌연변이, 제거된 스플라이스 부위, 및 hCD52의 8번 아미노산의 트레오닌을 알라닌으로 그리고 hCD52의 10번 아미노산의 세린을 알라닌으로 치환한 2개의 점 돌연변이를 포함하는 조작된 이중 돌연변이체 hCD52(Mut8/10; 서열번호 33)의 서열 배열을 나타낸다. Mut8과 유사하게, Mut8/10은 mAb 9D9에 의해 결합되지만 Campath-1H(C-1H)에 의해서는 결합되지 않는다.
실시예 3. 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드로서 유용한 예시적인 hCD52 돌연변이체를 암호화하는 추가적인 폴리뉴클레오티드 구성체
hCD52의 돌연변이체 Mut4, Mut8, Mut8/9, Mut8/10, 및 Mut8/9/10을 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 CHO 세포를 형질감염시켰다. 모든 돌연변이체는 ATG 시작 코돈을 가졌다. 형광단 표지된 Campath-1H 및 9D9 항체를 사용하여 FACS로 세포를 분석하였다. 결과는 도 6 및 도 7에 도시되어 있다.
도 6은 각각의 hCD52 돌연변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 ATG 시작 코돈을 갖는 경우, hCD52의 Mut4(서열번호 4) 또는 Mut8/10(서열번호 13)을 발현하는 세포에 대한 Campath-1H 또는 9D9에 의한 결합을 나타내는 4개의 유세포 분석 히스토그램이다. 도면은 Campath-1H 및 9D9를 사용하여 Mut4 돌연변이체 및 Mut8/10 돌연변이체를 쉽게 구별할 수 있었음을 나타낸다.
도 7은 각각의 hCD52 돌연변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 ATG 시작 코돈을 갖는 경우, hCD52의 Mut4(서열번호 4), Mut8(서열번호 8), Mut8/9(서열번호 12), Mut8/10(서열번호 13), 또는 Mut8/9/10(서열번호 14)을 발현하는 세포에 대한 Campath-1H 또는 9D9에 의한 결합을 나타내는 4개의 유세포 분석 히스토그램이다. 도면은 Campath-1H 및 9D9를 사용하여 Mut4 돌연변이체 및 4개의 모든 Mut8 함유 돌연변이체를 쉽게 구별할 수 있었음을 나타낸다.
실시예 4. 비-ATG 시작 코돈 사용의 효과
각각 ATG, CTG, GTG, 또는 TTG 시작 코돈을 갖는 hCD52 돌연변이체 Mut4 및 Mut8을 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 CHO 세포를 형질감염시켰다. 형광단 표지된 Campath-1H 및 9D9 항체를 사용하여 FACS로 세포를 분석하였다. 결과는 도 8 및 도 9에 도시되어 있다.
도 8은 시작 코돈에 따라 개별적으로 Mut4(서열번호 4) 또는 Mut8(서열번호 8)을 발현하는 세포에 대한 Campath-1H 또는 9D9에 의한 결합을 나타내는 4개의 유세포 분석 히스토그램이다. 도면은 Mut4 및 Mut8 각각에 대한 발현이 ATG > CTG > GTG > TTG > 모의의 패턴을 따랐음을 보여준다.
도 9는 Campath-1H 및 9D9를 사용하여 특히 ATG, CTG, 또는 GTG 시작 코돈을 갖는 Mut4 및 Mut8 돌연변이체를 쉽게 구별할 수 있었음을 보여주는, 도 8의 데이터에 대한 막대 그래프 표현이다.
실시예 5. 표적 폴리펩티드의 발현에 대한 세포 표면 마커 시작 코돈의 효과
대체 시작 리포터와 가용성 수용체-Fc 융합 단백질을 공동 발현하는 안정적으로 형질감염된 CHO 풀을 유세포 분석법을 사용하여 분석하였다. 개시 코돈으로서 UUG, GUG, CUG, 또는 AUG를 사용하여 각각의 리포터를 발현시켰다. 히스토그램 오버레이는 개시 코돈의 모든 AUG 3'이 돌연변이된 CD52 또는 CD59의 세포 표면 발현 수준을 보여준다. Cairns et al. (2011) Biotechnol. Bioeng. 108: 2611-22. 대표적인 결과는 도 10에 도시되어 있다. 도면은 리포터(세포 표면 마커) 발현과 관심 유전자(GOI; 표적 폴리펩티드) 발현 사이에 역의 관계가 있고 이는 리포터를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 시작 코돈에 따라 달랐음을 보여준다. 결과는 TTG가 GOI에 대한 리보솜의 더 큰 판독을 가능하게 하는 가장 낮은 검출가능한 CD52 발현 수준을 나타냈음을 보여주었다. 궁극적으로 중요한 것은 리포터가 아니라 표적 단백질의 발현이므로, 도면은 TTG와 같은 차선의 비-ATG 시작 코돈의 선택이 충분하고 바람직함을 보여준다.
실시예 6. 3개의 리포터를 가능하게 할 수 있는 hCD52 알라닌 돌연변이 조합
추가의 개념 증명으로서, 도 11은 특정 hCD52 알라닌 돌연변이체의 특정 조합이 3개의 고유한 리포터를 가능하게 할 수 있는 방법을 예시한다. 도 11에 나타낸 바와 같이, hCD52 돌연변이체 4(GQNATSQTSSPS; 서열번호 4)는 Campath-1H(C-1H)에 의해 식별되었지만 9D9 또는 7F11에 의해서는 식별되지 않았다. hCD52 돌연변이체 Mut2/8/9(GANDTSQAASPS; 서열번호 15)는 9D9에 대한 결합에 의해 식별되었지만 C1H 또는 7F11에 대한 결합에 의해서는 식별되지 않았다. hCD52 돌연변이체 Mut7/8/9(GQNDTSAAASPS; 서열번호 17)는 7F11에 대한 결합에 의해 식별되었지만 C1H 또는 9D9에 대한 결합에 의해서는 식별되지 않았다.
실시예 7. 3개의 리포터를 가능하게 할 수 있는 추가적인 hCD52 알라닌 돌연변이 조합
또 다른 개념 증명으로서, 도 12는 특정 hCD52 알라닌 돌연변이체의 특정 조합이 3개의 고유한 리포터를 가능하게 할 수 있는 방법을 예시한다. 도 12에 나타낸 바와 같이, hCD52 돌연변이체 4(GQNATSQTSSPS; 서열번호 4)는 Campath-1H(C-1H)에 의해 식별되었지만 9D9 또는 7F11에 의해서는 식별되지 않았다. hCD52 돌연변이체 Mut2/8/10(GANDTSQASAPS; 서열번호 16)은 9D9에 대한 결합에 의해 식별되었지만 C1H 또는 7F11에 대한 결합에 의해서는 식별되지 않았다. hCD52 돌연변이체 Mut7/8/9(GQNDTSAASAPS; 서열번호 18)는 7F11에 대한 결합에 의해 식별되었지만 C1H 또는 9D9에 대한 결합에 의해서는 식별되지 않았다.
실시예 8. CODV 트리아바디 발현에 사용하기 위한 이중리포터 시스템
CODV 트리아바디가 설명된 바 있지만, 그 생산은 매우 어렵다. 이러한 구성체는 4개의 상이한 폴리펩티드쇄, 즉 2개의 상이한 중쇄(상반되는 노브와 홀이 있는 CODV 중쇄 및 Fab 중쇄) 및 2개의 상이한 경쇄(CODV 경쇄 및 Fab 경쇄)를 갖는다. 이 4개의 개별 폴리펩티드쇄의 발현 균형을 맞추는 것은 어려우며, 과도한 유리 중쇄는 이를 발현하는 세포에 독성을 나타낼 수 있다.
일 구현예에서, 각각의 중쇄는 단일 mRNA 상에 암호화된 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드와 함께 자신의 별개 발현 벡터로부터 발현되고, 각각의 경쇄는 어떤 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드도 없이 자신의 별개 발현 벡터로부터 발현된다. 상응하는 중쇄와 경쇄(CODV 중쇄와 경쇄, 및 Fab 중쇄와 경쇄)는 자가 회합하여 목적하는 CODV 트리아바디를 형성한다. 도 13a 참조.
특히, 이 방법은 각각의 아암에 대한 클론을 독립적으로 단리 및 스크리닝하는 기능을 제공하며, 제품 품질(즉, 균질한 삼중특이적 발현)에 대한 바람직한 스크리닝을 제공할 수 있다.
다른 구현예에서, 상응하는 중쇄 및 경쇄가 단일 바이시스트론 벡터 상에 암호화되는 것을 제외하고, 유사한 접근 방식을 취할 수 있다. 도 13b 참조.
SEQUENCE LISTING
<110> Genzyme Corporation
<120> FLOW CYTOMETRY ATTENUATED REPORTER EXPRESSION (FLARE) MULTIPLE
REPORTER SYSTEM AND METHODS OF USE THEREOF
<130> 723333: SA9-271
<150> 63/116,094
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caaactggac tctcaggaca aaacgacacc agccaaacca gcagcccctc agcatccagc 120
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1 5 10
Claims (189)
- 복수의 표적 폴리펩티드를 높은 수준으로 발현시키는 방법으로서,
(a) 복수의 포유류 숙주 세포(각각은 복수의 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함함)를 배양하는 단계
(각각의 재조합 폴리뉴클레오티드는 프로모터, 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 및 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 둘 다 동일한 mRNA 상에 전사되고,
배양은 포유류 숙주 세포 표면 상의 각각의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드의 발현 및 각각의 고유한 표적 폴리펩티드의 발현을 가능하게 하는 조건하에 이루어짐);
(b) 단계 (a)의 배양된 포유류 숙주 세포를 복수의 검출가능한 제제(각각은 포유류 숙주 세포 표면 상에 발현된 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드 중 하나 이상에 고유하게 결합할 수 있음)와 접촉시키는 단계;
(c) 단계 (b)로부터의 접촉된 세포에 대해 적어도 한 회차의 형광 활성화 세포 분류를 수행함으로써, 복수의 검출가능한 제제 중 적어도 하나에 의해 고유하게 결합된 하나 이상의 포유류 숙주 세포를 선택하는 단계;
(d) 단계 (c)에서 선택된 포유류 숙주 세포의 하나 이상의 클론 집단을 준비하는 단계;
(e) 상기 클론 집단 각각에서 적어도 2개의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드의 발현 수준을 검출함으로써 단계 (d)로부터의 하나 이상의 클론 집단을 분석하는 단계;
(f) 적어도 2개의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드의 높은 발현 수준을 갖는 하나 이상의 클론 집단을 선택하는 단계; 및
(g) 높은 수준의 복수의 표적 폴리펩티드 발현을 가능하게 하는 조건하에 단계 (f)에서 선택된 하나 이상의 클론 집단을 배양하는 단계
를 포함하는 방법. - 제1항에 있어서, 단계 (c)는 단계 (b)로부터의 접촉된 세포에 대한 단회의 형광 활성화 세포 분류를 적어도 제1 검출가능한 제제 및 제2 검출가능한 제제를 사용하여 수행함으로써, 적어도 제1 검출가능한 제제 및 제2 검출가능한 제제 둘 다에 의해 고유하게 결합된 하나 이상의 포유류 숙주 세포를 선택하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제1항에 있어서, 단계 (c)는
(c1) 적어도 제1 세포 표면 마커 폴리펩티드에 대해 1회차 형광 활성화 세포 분류를 수행함으로써 적어도 제1 검출가능한 제제에 의해 결합된 하나 이상의 포유류 숙주 세포를 선택하는 단계; 및
(c2) 단계 (c1)에서 선택된 세포에서 적어도 제2 세포 표면 마커 폴리펩티드에 대해 2회차 형광 활성화 세포 분류를 수행함으로써 적어도 제1 검출가능한 제제 및 제2 검출가능한 제제 둘 다에 의해 결합된 하나 이상의 포유류 숙주 세포를 선택하는 단계
를 포함하는, 방법. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (e)는 단계 (d) 이후 7~28일 후에 수행되는, 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (e)의 분석 단계는 유세포 분석을 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (f)에서의 복수의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드 중 적어도 하나의 발현 수준은 단계 (e)에서 분석된 클론 집단 중 적어도 70%의 상응하는 발현 수준보다 높은, 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (f)에서의 복수의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드 각각의 발현 수준은 단계 (e)에서 분석된 클론 집단 중 적어도 70%의 상응하는 발현 수준보다 높은, 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (f)에서의 복수의 고유한 세포 표면 폴리펩티드 중 적어도 제1 폴리펩티드의 발현 수준은 단계 (f)에서의 복수의 고유한 세포 표면 폴리펩티드 중 적어도 제2 폴리펩티드의 발현 수준보다 높은, 방법.
- 제8항에 있어서, 단계 (f)에서의 복수의 고유한 세포 표면 폴리펩티드 중 제1 폴리펩티드의 발현 수준은 단계 (f)에서의 복수의 고유한 세포 표면 폴리펩티드 중 제2 폴리펩티드의 발현 수준보다 높은, 방법.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
(h) 단계 (g)에서 발현된 적어도 제1 고유한 표적 폴리펩티드 및 제2 고유한 표적 폴리펩티드를 하나 이상의 선택된 클론 집단으로부터 또는 하나 이상의 선택된 클론 집단이 배양되는 세포 배양 배지로부터 단리하는 단계를 추가로 포함하는 방법. - 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 고유한 표적 폴리펩티드는 2 내지 8개의 고유한 표적 폴리펩티드를 포함하는, 방법.
- 제11항에 있어서, 복수의 고유한 표적 폴리펩티드는 2 내지 4개의 고유한 표적 폴리펩티드를 포함하는, 방법.
- 제12항에 있어서, 복수의 고유한 표적 폴리펩티드는 2개의 고유한 표적 폴리펩티드를 포함하는, 방법.
- 제12항에 있어서, 복수의 고유한 표적 폴리펩티드는 3개의 고유한 표적 폴리펩티드를 포함하는, 방법.
- 제12항에 있어서, 복수의 고유한 표적 폴리펩티드는 4개의 고유한 표적 폴리펩티드를 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 재조합 폴리뉴클레오티드는 5'에서 3'으로, 프로모터, 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 및 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 재조합 폴리뉴클레오티드는 1 내지 4개의 프로모터, 1 내지 4개의 뉴클레오티드 서열(각각은 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화함), 및 1 내지 4개의 뉴클레오티드 서열(각각은 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화함)을 포함하고, 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 중 하나는 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 중 하나와 동일한 mRNA 상에 전사되는, 방법.
- 제17항에 있어서, 각각의 재조합 폴리뉴클레오티드는 2개의 프로모터, 및 2개의 뉴클레오티드 서열(각각은 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화함)을 포함하고, 1개 또는 2개의 뉴클레오티드 서열(각각은 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화함)을 추가로 포함하는 바이시스트론 폴리뉴클레오티드인, 방법.
- 제18항에 있어서, 각각의 바이시스트론 폴리뉴클레오티드는 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 단일 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
- 제18항에 있어서, 각각의 바이시스트론 폴리뉴클레오티드는 2개의 뉴클레오티드 서열(각각은 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화함)을 포함하고, 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 각각은 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 중 하나와 동일한 mRNA 상에 전사되는, 방법.
- 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 재조합 폴리뉴클레오티드는 5'에서 3'으로, 1~4개의 프로모터 중 하나, 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 1~4개의 뉴클레오티드 서열 중 하나, 및 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 1~4개의 뉴클레오티드 서열 중 하나를 포함하는, 방법.
- 제17항에 있어서, 각각의 재조합 폴리뉴클레오티드는 하나의 프로모터, 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 하나의 뉴클레오티드 서열, 및 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 동일한 mRNA 상에 전사되는, 방법.
- 제16항 또는 제21항에 있어서, 각각의 재조합 폴리뉴클레오티드는 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 3' 및 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 5'에 위치하는 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 추가로 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 재조합 폴리뉴클레오티드는 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 번역 개시를 위한 대체(비-ATG) 시작 코돈, 및 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 번역 개시를 위한 ATG 시작 코돈을 추가로 포함하는, 방법.
- 제24항에 있어서, 각각의 대체(비-ATG) 시작 코돈은 CTG, GTG, TTG, ATT, ATA, 및 ACG로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는, 방법.
- 제24항에 있어서, 각각의 대체(비-ATG) 시작 코돈은 GTG 및 TTG로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는, 방법.
- 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에는 ATG 트리플릿이 전혀 없는, 방법.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
적어도 제1 재조합 폴리뉴클레오티드는 5'에서 3'으로, 제1 프로모터, 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 및 제1 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고;
적어도 제2 재조합 폴리뉴클레오티드는 5'에서 3'으로, 제2 프로모터, 제2 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 및 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법. - 제28항에 있어서, 제1 재조합 폴리뉴클레오티드는 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 3' 및 제1 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 5'에 위치하는 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 추가로 포함하는, 방법.
- 제28항에 있어서, 제1 재조합 폴리뉴클레오티드는 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 번역 개시를 위한 대체(비-ATG) 시작 코돈, 및 제1 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 번역 개시를 위한 ATG 시작 코돈을 추가로 포함하는, 방법.
- 제30항에 있어서, 대체(비-ATG) 시작 코돈은 CTG, GTG, TTG, ATT, ATA, 및 ACG로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제31항에 있어서, 대체(비-ATG) 시작 코돈은 GTG 및 TTG로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제28항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에는 ATG 트리플릿이 전혀 없는, 방법.
- 제28항에 있어서, 제2 재조합 폴리뉴클레오티드는 제2 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 3' 및 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 5'에 위치하는 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 추가로 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 재조합 폴리뉴클레오티드는 5'에서 3'으로, 프로모터, 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 및 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
- 제35항에 있어서, 각각의 재조합 폴리뉴클레오티드는 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 3' 및 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 5'에 위치하는 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 추가로 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 프로모터는 β-액틴 프로모터인, 방법.
- 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 프로모터는 β-액틴 프로모터인, 방법.
- 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 프로모터는 햄스터 β-액틴 프로모터인, 방법.
- 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 프로모터는 햄스터 β-액틴 프로모터인, 방법.
- 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 CD20, CD52, CD59, 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 CD20, CD52, CD59, 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 CD20, CD52, CD59, 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 인간 CD52 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제1항 내지 제40항 및 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 인간 CD52 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제45항에 있어서, 각각의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 인간 CD52 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 CD20, CD52, 및 CD59로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제1항 내지 제40항 및 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 CD20, CD52, 및 CD59로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제48항에 있어서, 각각의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 CD20, CD52, 및 CD59로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 인간 CD52인, 방법.
- 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 인간 CD52인, 방법.
- 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 19(GX2NDTSQTSSPS)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52이고, X2는 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제52항에 있어서, X2는 A인, 방법.
- 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 20(GQNX4TSQTSSPS)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52이고, X4는 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제54항에 있어서, X4는 A인, 방법.
- 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 21(GQNDTSX7TSSPS)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52이고, X7은 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제56항에 있어서, X7은 A인, 방법.
- 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 22(GQNDTSQX8SSPS)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52이고, X8은 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제58항에 있어서, X8은 A인, 방법.
- 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 23(GQNDTSQX8X9SPS)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52이고, X8 및 X9 각각은 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는, 방법.
- 제60항에 있어서, X8 및 X9 각각은 A인, 방법.
- 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 24(GQNDTSQX8SX10PS)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52이고, X8 및 X10 각각은 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는, 방법.
- 제62항에 있어서, X8 및 X10 각각은 A인, 방법.
- 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 25(GQNDTSQX8X9X10PS)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52이고, X8, X9, 및 X10 각각은 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는, 방법.
- 제64항에 있어서, X8, X9, 및 X10 각각은 A인, 방법.
- 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 26(GX2NDTSQX8X9SPS)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52이고, X2, X8, 및 X9 각각은 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는, 방법.
- 제66항에 있어서, X2, X8, 및 X9 각각은 A인, 방법.
- 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 27(GX2NDTSQX8SX10PS)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52이고, X2, X8, 및 X10 각각은 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는, 방법.
- 제68항에 있어서, X2, X8, 및 X10 각각은 A인, 방법.
- 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 28(GQNDTSX7X8X9SPS)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52이고, X7, X8, 및 X9 각각은 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는, 방법.
- 제70항에 있어서, X7, X8, 및 X9 각각은 A인, 방법.
- 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 29(GQNDTSX7X8SX10PS)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52이고, X7, X8, 및 X10 각각은 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는, 방법.
- 제72항에 있어서, X7, X8, 및 X10 각각은 A인, 방법.
- 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 19(GX2NDTSQTSSPS)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하고, X2는 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되고; 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 20(GQNX4TSQTSSPS) 및 서열번호 21(GQNDTSX7TSSPS)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하고, X4 및 X7 각각은 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는, 방법.
- 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 19(GX2NDTSQTSSPS)에 제시된 아미노산 서열로 구성된 변이체 인간 CD52로 구성되고, X2는 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되고; 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 20(GQNX4TSQTSSPS) 및 서열번호 21(GQNDTSX7TSSPS)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 구성된 변이체 인간 CD52로 구성되고, X4 및 X7 각각은 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는, 방법.
- 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 2(GANDTSQTSSPS)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하고; 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 4(GQNATSQTSSPS) 및 서열번호 7(GQNDTSATSSPS)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 2(GANDTSQTSSPS)에 제시된 아미노산 서열로 구성된 변이체 인간 CD52로 구성되고; 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 4(GQNATSQTSSPS) 및 서열번호 7(GQNDTSATSSPS)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 구성된 변이체 인간 CD52로 구성되는, 방법.
- 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 2(GANDTSQTSSPS)로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하고; 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 4(GQNATSQTSSPS)로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 2(GANDTSQTSSPS)로 제시된 아미노산 서열로 구성된 변이체 인간 CD52로 구성되고; 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 4(GQNATSQTSSPS)로 제시된 아미노산 서열로 구성된 변이체 인간 CD52로 구성되는, 방법.
- 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 2(GANDTSQTSSPS)로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하고; 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 7(GQNDTSATSSPS)로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 2(GANDTSQTSSPS)로 제시된 아미노산 서열로 구성된 변이체 인간 CD52로 구성되고; 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 7(GQNDTSATSSPS)로 제시된 아미노산 서열로 구성된 변이체 인간 CD52로 구성되는, 방법.
- 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 4(GQNATSQTSSPS)로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하고; 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 7(GQNDTSATSSPS)로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 20(GQNX4TSQTSSPS)으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하고; 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 23(GX2NDTSQX8X9SPS)으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하고; 적어도 제3 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 28(GQNDTSX7X8X9SPS)로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하고, X4, X7, X8, 및 X9 각각은 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는, 방법.
- 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 20(GQNX4TSQTSSPS)으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하고; 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 27(GX2NDTSQX8SX10PS)로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하고; 적어도 제3 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 29(GQNDTSX7X8SX10PS)로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하고, X4, X7, X8, 및 X10 각각은 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는, 방법.
- 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 4(GQNATSQTSSPS)로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하고; 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 15(GANDTSQAASPS)로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하고; 적어도 제3 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 17(GQNDTSAAASPS)로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 4(GQNATSQTSSPS)로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하고; 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 16(GANDTSQASAPS)으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하고; 적어도 제3 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 18(GQNDTSAASAPS)로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 고유한 표적 폴리펩티드는 치료용 폴리펩티드 또는 치료용 단백질을 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 고유한 표적 폴리펩티드는 다중쇄 단백질의 폴리펩티드인, 방법.
- 제1항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 고유한 표적 폴리펩티드는 다중쇄 단백질의 폴리펩티드인, 방법.
- 제1항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 고유한 표적 폴리펩티드는 항체의 폴리펩티드인, 방법.
- 제1항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 고유한 표적 폴리펩티드는 항체의 폴리펩티드인, 방법.
- 제1항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 고유한 표적 폴리펩티드는 교차 이중가변 도메인(CODV) Ig-유사 단백질의 폴리펩티드인, 방법.
- 제92항에 있어서, 각각의 고유한 표적 폴리펩티드는 교차 이중가변 도메인(CODV) Ig-유사 단백질의 폴리펩티드인, 방법.
- 제92항에 있어서, 적어도 하나의 고유한 표적 폴리펩티드는 CODV 트리아바디의 폴리펩티드인, 방법.
- 제92항에 있어서, 각각의 고유한 표적 폴리펩티드는 CODV 트리아바디의 폴리펩티드인, 방법.
- 제1항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 포유류 숙주 세포는 CHO 세포인, 방법.
- 복수의 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조작된 포유류 숙주 세포로서, 각각의 재조합 폴리뉴클레오티드는 프로모터, 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 및 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 둘 다 동일한 mRNA 상에 전사되는, 조작된 포유류 숙주 세포.
- 제97항에 있어서, 복수의 고유한 표적 폴리펩티드는 2 내지 8개의 고유한 표적 폴리펩티드를 포함하는, 조작된 포유류 숙주 세포.
- 제98항에 있어서, 복수의 고유한 표적 폴리펩티드는 2 내지 4개의 고유한 표적 폴리펩티드를 포함하는, 조작된 포유류 숙주 세포.
- 제99항에 있어서, 복수의 고유한 표적 폴리펩티드는 2개의 고유한 표적 폴리펩티드를 포함하는, 조작된 포유류 숙주 세포.
- 제99항에 있어서, 복수의 고유한 표적 폴리펩티드는 3개의 고유한 표적 폴리펩티드를 포함하는, 조작된 포유류 숙주 세포.
- 제99항에 있어서, 복수의 고유한 표적 폴리펩티드는 4개의 고유한 표적 폴리펩티드를 포함하는, 조작된 포유류 숙주 세포.
- 제97항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 재조합 폴리뉴클레오티드는 5'에서 3'으로, 프로모터, 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 및 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 조작된 포유류 숙주 세포.
- 제97항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 재조합 폴리뉴클레오티드는 1 내지 4개의 프로모터, 1 내지 4개의 뉴클레오티드 서열(각각은 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화함), 및 1 내지 4개의 뉴클레오티드 서열(각각은 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화함)을 포함하고, 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 중 하나는 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 중 하나와 동일한 mRNA 상에 전사되는, 조작된 포유류 숙주 세포.
- 제104항에 있어서, 각각의 재조합 폴리뉴클레오티드는 2개의 프로모터, 및 2개의 뉴클레오티드 서열(각각은 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화함)을 포함하고, 1개 또는 2개의 뉴클레오티드 서열(각각은 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화함)을 추가로 포함하는 바이시스트론 폴리뉴클레오티드인, 조작된 포유류 숙주 세포.
- 제105항에 있어서, 각각의 바이시스트론 폴리뉴클레오티드는 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 단일 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 조작된 포유류 숙주 세포.
- 제105항에 있어서, 각각의 바이시스트론 폴리뉴클레오티드는 2개의 뉴클레오티드 서열(각각은 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화함)을 포함하고, 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 각각은 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 중 하나와 동일한 mRNA 상에 전사되는, 조작된 포유류 숙주 세포.
- 제104항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 재조합 폴리뉴클레오티드는 5'에서 3'으로, 1~4개의 프로모터 중 하나, 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 1~4개의 뉴클레오티드 서열 중 하나, 및 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 1~4개의 뉴클레오티드 서열 중 하나를 포함하는, 조작된 포유류 숙주 세포.
- 제104항에 있어서, 각각의 재조합 폴리뉴클레오티드는 하나의 프로모터, 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 하나의 뉴클레오티드 서열, 및 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 동일한 mRNA 상에 전사되는, 조작된 포유류 숙주 세포.
- 제103항 또는 제108항에 있어서, 각각의 재조합 폴리뉴클레오티드는 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 3' 및 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 5'에 위치하는 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 추가로 포함하는, 조작된 포유류 숙주 세포.
- 제97항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 재조합 폴리뉴클레오티드는 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 번역 개시를 위한 대체(비-ATG) 시작 코돈, 및 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 번역 개시를 위한 ATG 시작 코돈을 추가로 포함하는, 조작된 포유류 숙주 세포.
- 제111항에 있어서, 각각의 대체(비-ATG) 시작 코돈은 CTG, GTG, TTG, ATT, ATA, 및 ACG로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는, 조작된 포유류 숙주 세포.
- 제111항에 있어서, 각각의 대체(비-ATG) 시작 코돈은 GTG 및 TTG로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는, 조작된 포유류 숙주 세포.
- 제111항 내지 제112항 중 어느 한 항에 있어서, 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에는 ATG 트리플릿이 전혀 없는, 조작된 포유류 숙주 세포.
- 제97항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서,
적어도 제1 재조합 폴리뉴클레오티드는 5'에서 3'으로, 제1 프로모터, 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 및 제1 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고;
적어도 제2 재조합 폴리뉴클레오티드는 5'에서 3'으로, 제2 프로모터, 제2 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 및 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 조작된 포유류 숙주 세포. - 제115항에 있어서, 제1 재조합 폴리뉴클레오티드는 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 3' 및 제1 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 5'에 위치하는 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 추가로 포함하는, 조작된 포유류 숙주 세포.
- 제115항에 있어서, 제1 재조합 폴리뉴클레오티드는 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 번역 개시를 위한 대체(비-ATG) 시작 코돈, 및 제1 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 번역 개시를 위한 ATG 시작 코돈을 추가로 포함하는, 조작된 포유류 숙주 세포.
- 제117항에 있어서, 대체(비-ATG) 시작 코돈은 CTG, GTG, TTG, ATT, ATA, 및 ACG로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조작된 포유류 숙주 세포.
- 제118항에 있어서, 대체(비-ATG) 시작 코돈은 GTG 및 TTG로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조작된 포유류 숙주 세포.
- 제115항 내지 제119항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에는 ATG 트리플릿이 전혀 없는, 조작된 포유류 숙주 세포.
- 제115항에 있어서, 제2 재조합 폴리뉴클레오티드는 제2 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 3' 및 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 5'에 위치하는 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 추가로 포함하는, 조작된 포유류 숙주 세포.
- 제97항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 재조합 폴리뉴클레오티드는 5'에서 3'으로, 프로모터, 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 및 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 조작된 포유류 숙주 세포.
- 제122항에 있어서, 각각의 재조합 폴리뉴클레오티드는 고유한 표적 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 3' 및 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 5'에 위치하는 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 추가로 포함하는, 조작된 포유류 숙주 세포.
- 제97항 내지 제123항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 프로모터는 β-액틴 프로모터인, 조작된 포유류 숙주 세포.
- 제97항 내지 제123항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 프로모터는 β-액틴 프로모터인, 조작된 포유류 숙주 세포.
- 제97항 내지 제123항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 프로모터는 햄스터 β-액틴 프로모터인, 조작된 포유류 숙주 세포.
- 제97항 내지 제123항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 프로모터는 햄스터 β-액틴 프로모터인, 조작된 포유류 숙주 세포.
- 제97항 내지 제127항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 CD20, CD52, CD59, 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조작된 포유류 숙주 세포.
- 제97항 내지 제128항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 CD20, CD52, CD59, 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조작된 포유류 숙주 세포.
- 제97항 내지 제129항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 CD20, CD52, CD59, 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조작된 포유류 숙주 세포.
- 제97항 내지 제127항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 인간 CD52 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조작된 포유류 숙주 세포.
- 제97항 내지 제127항 및 131항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 인간 CD52 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조작된 포유류 숙주 세포.
- 제132항에 있어서, 각각의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 인간 CD52 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조작된 포유류 숙주 세포.
- 제97항 내지 제127항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 CD20, CD52, 및 CD59로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조작된 포유류 숙주 세포.
- 제97항 내지 제127항 및 124항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 CD20, CD52, 및 CD59로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조작된 포유류 숙주 세포.
- 제135항에 있어서, 각각의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 CD20, CD52, 및 CD59로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조작된 포유류 숙주 세포.
- 제97항 내지 제127항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 인간 CD52인, 조작된 포유류 숙주 세포.
- 제97항 내지 제127항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 인간 CD52인, 조작된 포유류 숙주 세포.
- 제97항 내지 제127항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 19(GX2NDTSQTSSPS)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52이고, X2는 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조작된 포유류 숙주 세포.
- 제139항에 있어서, X2는 A인, 조작된 포유류 숙주 세포.
- 제97항 내지 제127항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 20(GQNX4TSQTSSPS)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52이고, X4는 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조작된 포유류 숙주 세포.
- 제141항에 있어서, X4는 A인, 조작된 포유류 숙주 세포.
- 제97항 내지 제127항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 21(GQNDTSX7TSSPS)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52이고, X7은 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조작된 포유류 숙주 세포.
- 제143항에 있어서, X7은 A인, 조작된 포유류 숙주 세포.
- 제97항 내지 제127항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 22(GQNDTSQX8SSPS)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52이고, X8은 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조작된 포유류 숙주 세포.
- 제145항에 있어서, X8은 A인, 조작된 포유류 숙주 세포.
- 제77항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 23(GQNDTSQX8X9SPS)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52이고, X8 및 X9 각각은 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는, 조작된 포유류 숙주 세포.
- 제147항에 있어서, X8 및 X9 각각은 A인, 조작된 포유류 숙주 세포.
- 제97항 내지 제127항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 24(GQNDTSQX8SX10PS)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52이고, X8 및 X10 각각은 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는, 조작된 포유류 숙주 세포.
- 제149항에 있어서, X8 및 X10 각각은 A인, 조작된 포유류 숙주 세포.
- 제97항 내지 제127항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 25(GQNDTSQX8X9X10PS)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52이고, X8, X9, 및 X10 각각은 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는, 조작된 포유류 숙주 세포.
- 제151항에 있어서, X8, X9, 및 X10 각각은 A인, 조작된 포유류 숙주 세포.
- 제97항 내지 제127항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 26(GX2NDTSQX8X9SPS)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52이고, X2, X8, 및 X9 각각은 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는, 조작된 포유류 숙주 세포.
- 제153항에 있어서, X2, X8, 및 X9 각각은 A인, 조작된 포유류 숙주 세포.
- 제97항 내지 제127항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 27(GX2NDTSQX8SX10PS)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52이고, X2, X8, 및 X10 각각은 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는, 조작된 포유류 숙주 세포.
- 제155항에 있어서, X2, X8, 및 X10 각각은 A인, 조작된 포유류 숙주 세포.
- 제97항 내지 제127항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 28(GQNDTSX7X8X9SPS)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52이고, X7, X8, 및 X9 각각은 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는, 조작된 포유류 숙주 세포.
- 제157항에 있어서, X7, X8, 및 X9 각각은 A인, 조작된 포유류 숙주 세포.
- 제97항 내지 제127항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 29(GQNDTSX7X8SX10PS)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52이고, X7, X8, 및 X10 각각은 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는, 조작된 포유류 숙주 세포.
- 제159항에 있어서, X7, X8, 및 X10 각각은 A인, 조작된 포유류 숙주 세포.
- 제97항 내지 제127항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 19(GX2NDTSQTSSPS)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하고, X2는 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되고; 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 20(GQNX4TSQTSSPS) 및 서열번호 21(GQNDTSX7TSSPS)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하고, X4 및 X7 각각은 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는, 조작된 포유류 숙주 세포.
- 제97항 내지 제127항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 19(GX2NDTSQTSSPS)에 제시된 아미노산 서열로 구성된 변이체 인간 CD52로 구성되고, X2는 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되고; 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 20(GQNX4TSQTSSPS) 및 서열번호 21(GQNDTSX7TSSPS)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 구성된 변이체 인간 CD52로 구성되고, X4 및 X7 각각은 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는, 조작된 포유류 숙주 세포.
- 제97항 내지 제127항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 2(GANDTSQTSSPS)에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하고; 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 4(GQNATSQTSSPS) 및 서열번호 7(GQNDTSATSSPS)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하는, 조작된 포유류 숙주 세포.
- 제97항 내지 제127항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 2(GANDTSQTSSPS)에 제시된 아미노산 서열로 구성된 변이체 인간 CD52로 구성되고; 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 4(GQNATSQTSSPS) 및 서열번호 7(GQNDTSATSSPS)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 구성된 변이체 인간 CD52로 구성되는, 조작된 포유류 숙주 세포.
- 제97항 내지 제127항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 2(GANDTSQTSSPS)로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하고; 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 4(GQNATSQTSSPS)로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하는, 조작된 포유류 숙주 세포.
- 제97항 내지 제127항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 2(GANDTSQTSSPS)로 제시된 아미노산 서열로 구성된 변이체 인간 CD52로 구성되고; 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 4(GQNATSQTSSPS)로 제시된 아미노산 서열로 구성된 변이체 인간 CD52로 구성되는, 조작된 포유류 숙주 세포.
- 제97항 내지 제127항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 2(GANDTSQTSSPS)로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하고; 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 7(GQNDTSATSSPS)로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하는, 조작된 포유류 숙주 세포.
- 제97항 내지 제127항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 2(GANDTSQTSSPS)로 제시된 아미노산 서열로 구성된 변이체 인간 CD52로 구성되고; 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 7(GQNDTSATSSPS)로 제시된 아미노산 서열로 구성된 변이체 인간 CD52로 구성되는, 조작된 포유류 숙주 세포.
- 제97항 내지 제127항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 4(GQNATSQTSSPS)로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하고; 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 7(GQNDTSATSSPS)로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하는, 조작된 포유류 숙주 세포.
- 제97항 내지 제127항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 20(GQNX4TSQTSSPS)으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하고; 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 23(GX2NDTSQX8X9SPS)으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하고; 적어도 제3 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 28(GQNDTSX7X8X9SPS)로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하고, X4, X7, X8, 및 X9 각각은 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는, 조작된 포유류 숙주 세포.
- 제97항 내지 제127항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 20(GQNX4TSQTSSPS)으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하고; 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 27(GX2NDTSQX8SX10PS)로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하고; 적어도 제3 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 29(GQNDTSX7X8SX10PS)로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하고, X4, X7, X8, 및 X10 각각은 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는, 조작된 포유류 숙주 세포.
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- 제97항 내지 제127항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 제1 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 4(GQNATSQTSSPS)로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하고; 적어도 제2 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 16(GANDTSQASAPS)으로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하고; 적어도 제3 고유한 세포 표면 마커 폴리펩티드는 서열번호 18(GQNDTSAASAPS)로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 변이체 인간 CD52를 포함하는, 조작된 포유류 숙주 세포.
- 제97항 내지 제173항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 고유한 표적 폴리펩티드는 치료용 폴리펩티드 또는 치료용 단백질을 포함하는, 조작된 포유류 숙주 세포.
- 제97항 내지 제173항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 고유한 표적 폴리펩티드는 다중쇄 단백질의 폴리펩티드인, 조작된 포유류 숙주 세포.
- 제97항 내지 제173항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 고유한 표적 폴리펩티드는 다중쇄 단백질의 폴리펩티드인, 조작된 포유류 숙주 세포.
- 제97항 내지 제173항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 고유한 표적 폴리펩티드는 항체의 폴리펩티드인, 조작된 포유류 숙주 세포.
- 제97항 내지 제173항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 고유한 표적 폴리펩티드는 항체의 폴리펩티드인, 조작된 포유류 숙주 세포.
- 제97항 내지 제173항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 고유한 표적 폴리펩티드는 교차 이중가변 도메인(CODV) Ig-유사 단백질의 폴리펩티드인, 조작된 포유류 숙주 세포.
- 제179항에 있어서, 각각의 고유한 표적 폴리펩티드는 교차 이중가변 도메인(CODV) Ig-유사 단백질의 폴리펩티드인, 조작된 포유류 숙주 세포.
- 제97항 내지 제173항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 고유한 표적 폴리펩티드는 CODV 트리아바디의 폴리펩티드인, 조작된 포유류 숙주 세포.
- 제97항 내지 제173항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 고유한 표적 폴리펩티드는 CODV 트리아바디의 폴리펩티드인, 조작된 포유류 숙주 세포.
- 제97항 내지 제182항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 포유류 숙주 세포는 CHO 세포인, 조작된 포유류 숙주 세포.
- 서열번호 19(GX2NDTSQTSSPS)로 구성된(X2는 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 선택됨) 아미노산 서열을 포함하는 단리된 변이체 인간 CD52.
- 제184항에 있어서, X2는 A인, 단리된 변이체 인간 CD52.
- 서열번호 20(GQNX4TSQTSSPS)으로 구성된(X4는 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 선택됨) 아미노산 서열을 포함하는 단리된 변이체 인간 CD52.
- 제186항에 있어서, X4는 A인, 단리된 변이체 인간 CD52.
- 서열번호 22(GQNDTSQX8SSPS)로 구성된(X8은 A, G, I, L, 및 V로 이루어진 군으로부터 선택됨) 아미노산 서열을 포함하는 단리된 변이체 인간 CD52.
- 제188항에 있어서, X8은 A인, 단리된 변이체 인간 CD52.
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