CN116284246A - 信号肽、核酸片段、重组表达载体、宿主细胞及其应用 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及一种信号肽、核酸片段、重组表达载体、宿主细胞及其应用，该信号肽氨基酸序列如SEQ ID No.15所示。编码该信号肽核酸片段的3’端连接有重组蛋白的编码序列片段，用于介导体外重组蛋白在宿主细胞中的分泌表达。上述信号肽用于重组蛋白的分泌表达具有适用性广、分泌效率高且表达水平高。经验证，本申请的信号肽能够显著提升重组蛋白的表达水平，最高达到5倍以上，平均提升在3倍左右。
Description
技术领域
本申请涉及生物技术领域，特别是涉及一种信号肽、核酸片段、重组表达载体、宿主细胞及其应用。
背景技术
Bloble和Dobberstin(1975)提出了信号肽假设(signal hypothesis)，信号肽假说认为分泌蛋白N-端有一段信号肽，当新生肽长约50-70aa后，信号肽从核糖体的大亚基中露出，立即被RER膜上的受体识别并与之结合。在信号肽越膜进入RER内腔后被信号肽酶水解。正在合成的新生肽随着信号肽通过RER膜上的蛋白孔道穿过脂双层进入RER腔内。这一假设经过多年的继续研究又有了新的发展，但基本观点仍是正确的。Bloble因这项成就而荣获了1999年度诺贝尔生理学或医学奖。
信号肽假说认为，编码分泌蛋白的mRNA在翻译时首先合成的是N末端带有疏水氨基酸残基的信号肽，它被内质网膜上的受体识别并与之相结合。信号肽经由膜中蛋白质形成的孔道到达内质网内腔，随即被位于腔表面的信号肽酶水解，由于它的引导，新生的多肽就能够通过内质网膜进入腔内，最终被分泌到胞外。翻译结束后，核糖体亚基解聚、孔道消失，内质网膜又恢复原先的脂双层结构。
其中，信号肽(signal peptide)是在某种分泌蛋白质及细胞膜蛋白质新合成时，以前体物质多肽的形式合成，其N末端含有作为通过膜时之信号的氨基酸序列，这种氨基酸序列称信号肽或信号序列(signal sequence)。信号肽一般位于分泌蛋白的N端。包括三个区：一个带正电的N末端，有2-3个极性氨基酸，称为碱性氨基末端；一个中间疏水序列，其以中性氨基酸为主，它是信号肽的主要功能区；一个较长的带负电荷的C末端，含小分子氨基酸，是信号序列切割位点，也称加工区。在蛋白合成过程中前体物质多肽靠此序列与膜结合，接着形成膜结合型多核糖体，多肽链与其合成相平行地通过膜，并在通过膜时，由在存在膜上的肽酶将信号肽切断而除掉。
在现代的生物医药发展中，体外重组表达技术广泛发展，影响体外重组蛋白在宿主细胞中的表达的因素很多，例如信号肽、转录和翻译控制因子、mRNA的稳定性、载体的构建及宿主菌的选择等等。在同一表达载体下，同一种蛋白在不同信号肽的作用下，即使都能分泌表达，其分泌效率也会相差甚远。选择分泌效率高的信号肽，可以提高蛋白的分泌表达量。然而，利用蛋白或抗体本身的信号肽进行分泌表达存在分泌效率低、表达水平低等问题。
发明内容
基于此，有必要提供一种适用性广、分泌效率高且表达水平高的蛋白分泌信号肽。
本申请解决上述技术问题的技术方案如下：
一种信号肽，其氨基酸序列如SEQ ID No.15所示。
一种核酸片段，其编码如上述的信号肽。
在其中一个实施例中，所述核酸片段的核苷酸序列如SEQ ID No.33所示。
一种重组表达载体，包括上述的核酸片段。
在其中一个实施例中，所述核酸片段的3’端连接有重组蛋白的编码序列片段。
在其中一个实施例中，所述核酸片段的5’端连接有Kozak序列片段。
一种宿主细胞，其基因组中含有上述的重组表达载体。
本申请还提供一种上述的信号肽、上述的核酸片段、上述的重组表达载体或上述的宿主细胞在制备重组蛋白中的应用。
在其中一个实施例中，所述重组蛋白选自RBD蛋白、ERBB2受体、HE4蛋白、NT-proBNP蛋白、PSA蛋白、ST2受体、TPO蛋白、Bosd2蛋白和LysozymeC中的一种或多种。
一种重组蛋白的制备方法，使用上述的宿主细胞进行基因表达获得所述重组蛋白。
本申请提供一种人工合成信号肽，该信号肽适用性广、分泌效率高且表达水平高，从而大大提高重组蛋白的表达水平。经验证，本申请的信号肽能够显著提升重组蛋白的表达水平，最高达到5倍以上，平均提升在3倍左右。
附图说明
图1为实施例1中质粒pcDNA3.1图谱；
图2为实施例1中载体信号肽连接结构图；
图3为实施例1中不同分泌信号肽信噪比检测图；
图4为实施例1中信号肽和验证蛋白自身信号肽对验证蛋白表达量的影响；
图5为实施例1中信号肽对蛋白表达量提升倍数图。
具体实施方式
为了便于理解本申请，下面将对本申请进行更全面的描述。但是，本申请可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使本申请公开内容更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本申请。
术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。本申请要素或组分前的不定冠词“一种”和“一个”对要素或组分的数量要求(即出现次数)无限制性。因此“一个”或“一种”应被解读为包括一个或至少一个，并且单数形式的要素或组分也包括复数形式，除非所述数量明显只指单数形式。“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
术语解释：
“载体”是指可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。
“宿主细胞”是指可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如纤维原细胞、CHO细胞、COS细胞、NSO细胞、HeLa细胞、BHK细胞、HEK 293细胞或人细胞等的动物细胞。
本申请一实施方式提供了一种信号肽，其氨基酸序列如SEQ ID No.15所示。
具体地，如SEQ ID No.15所示的氨基酸序列为：MTRLTVLALLALLLASSRA。
此外，本申请一实施方式还提供了一种核酸片段，该核酸片段编码用于介导重组蛋白在宿主细胞中分泌表达的上述信号肽。
进一步的，上述核酸片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.33所示，具体地为ATGACCAGACTGACCGTGCTGGCTCTGCTGGCTCTGCTGCTGGCAAGCTCTAGAGCT。
在其中一些实施例中，上述的核酸片段可通过常规的化学合成等方法制备。
在其中一些实施例中，上述的核酸片段可添加于重组表达载体，用于介导重组蛋白的分泌表达。
另外，本申请一实施方式还提供了一种重组表达载体，该重组表达载体含有上述编码信号肽的核酸片段及编码目的蛋白质的核酸片段。
在其中一些实施例中，编码上述的信号肽的核酸片段的3’端连接有重组蛋白的编码序列片段。
进一步地，上述重组表达载体中，编码本申请的信号肽的核酸片段的5’端连接有Kozak序列片段。
在其中一个可选地具体示例中，表达融合蛋白所采用的载体为pcDNA3.1，合成并构建信号肽表达载体，用限制性内切酶BamHI和XhoI对载体进行双酶切，然后进行凝胶电泳，回收目的片段，将信号肽的目的序列克隆入BamHI和XhoI的酶切位点，将含有信号肽和目的蛋白的表达载体转化或转染宿主细胞并表达目的蛋白。进一步地，通过编码信号肽的核酸片段经翻译后产生的信号肽，可以使得宿主细胞产生的蛋白能够分泌到细胞外，便于收集目的蛋白。
可以理解，上述重组表达载体中的重组表达载体为真核表达载体。进一步地，上述重组表达载体中的重组表达载体为用于哺乳动物真核表达的表达载体。
此外，本申请一实施方式还提供了一种宿主细胞，该宿主细胞基因组中含有上述重组表达载体，能够产生信号肽，促进重组蛋白分泌表达。
在其中一个实施例中，宿主细胞为HEK293。当然，在其他实施例中，宿主细胞不限于HEK293，还可以是其他细胞，如纤维原细胞、CHO细胞、COS细胞、NS0细胞、HeLa细胞、BHK细胞或人细胞等的动物细胞。
在其中一个实施例中，在将含有上述编码信号肽的核酸片段和上述编码目的蛋白的核酸片段的重组表达载体转染入宿主细胞后，培养转染后的宿主细胞，制备目的蛋白。
在将转染后的宿主细胞培养一段时间后，收集宿主细胞或培养宿主细胞的培养液，制备含有目的蛋白的初级产物；然后将初级产物纯化，制备纯化后的目的蛋白。结果表明，本申请合成的信号肽与目的蛋白本身的信号肽相比，可使目的蛋白的表达量提高。此信号肽也可以用于提高其他目的蛋白的表达量。
目前体外重组表达技术广泛发展，影响体外重组蛋白在宿主细胞中表达的因素很多。其中，利用蛋白或抗体本身的信号肽进行分泌表达存在分泌效率低、表达水平低、成本升高等问题。文献报道的信号肽编码规律，即：(1)N端通常为带正电或者负电荷的氨基酸残基；(2)疏水核心通常由6-15个疏水残基组成，形成α螺旋；(3)C端-3和C端-1位置为小的不带电荷的氨基酸残基以被有效切割；(4)C端-2位置通常为芳香族且更常见的是疏水性氨基酸残基；(5)C端-4位置允许疏水性氨基酸残基如亮氨酸或异亮氨酸；(6)C端-5位置通常为脯氨酸。根据上述文献报道的信号肽编码规律可对野生型信号肽进行改造，然而并不是根据上述信号肽编码规律就容易得到表达水平高的信号肽，甚至反而可能导致表达水平的降低。本申请经过大量改造和大量筛选，最终才得到本申请的适用性广、分泌效率高、表达水平高的蛋白分泌信号肽，以用于重组蛋白的高效分泌表达。
本申请一实施方式还提供了一种上述信号肽、上述核酸片段、上述重组表达载体或上述宿主细胞在制备重组蛋白中的应用。
在其中一些实施例中，上述重组蛋白选自RBD蛋白、ERBB2受体、HE4蛋白、NT-proBNP蛋白、PSA蛋白、ST2受体、TPO蛋白、Bos d 2蛋白和Lysozyme C中的一种或多种。
另外，本申请还提供一种重组蛋白的制备方法，使用上述宿主细胞进行基因表达获得该重组蛋白。
在其中一些具体示例中，该重组蛋白的制备方法包括以下步骤：
将编码本申请的信号肽的核酸片段与编码目的蛋白的核酸片段连接后克隆入重组表达载体，而后将该重组表达载体转化或转染宿主细胞后表达目的蛋白。
上述信号肽对体外重组蛋白的表达具有适用性广、分泌效率高和表达水平高的优势。
具体实施例
以下结合具体实施例进行详细说明。以下实施例如未特殊说明，则不包括除不可避免的杂质外的其他组分。实施例中采用试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者生产厂家推荐的方法实现。以下所用的重组蛋白编码基因序列来自江苏赛索飞生物科技有限公司，重组蛋白来自三联生物工程股份有限公司。
实施例1
一、筛选高效介导重组蛋白分泌表达的信号肽
1.设计信号肽
本实施例首先选择文献中报道的一些能够介导蛋白高效表达的分泌信号肽，如表1中的Seq ID No.1、Seq ID No.4、Seq ID No.7、Seq ID No.10、Seq ID No.13、Seq IDNo.16，然后通过文献报道的信号肽编码规律，即：(1)N端通常为带正电或者负电荷的氨基酸残基；(2)疏水核心通常由6-15个疏水残基组成，形成α螺旋；(3)C端-3和C端-1位置为小的不带电荷的氨基酸残基以被有效切割；(4)C端-2位置通常为芳香族且更常见的是疏水性氨基酸残基；(5)C端-4位置允许疏水性氨基酸残基如亮氨酸或异亮氨酸；(6)C端-5位置通常为脯氨酸；对这些信号肽进行部分位点突变(序列如Seq ID No.2、Seq ID No.3、Seq IDNo.5、Seq ID No.6、Seq ID No.8、Seq ID No.9、Seq ID No.11、Seq ID No.12、Seq IDNo.14、Seq ID No.15、Seq ID No.17、Seq ID No.18)，然后构建至pcDNA3.1真核表达载体，其图谱见图1，然后按照图2所示的表达框位置将COVID-19(RBD)蛋白表达基因连接至信号肽下游，COVID-19(RBD)蛋白氨基酸序列如Seq ID No.37。
表1
2.构建不同信号肽表达载体
首先，构建包含Kozak序列和上述表1中信号肽表达载体(由江苏赛索飞生物科技有限公司完成)，其信号肽基因序列如表2所示Seq ID No.19～36，COVID-19(RBD)蛋白基因序列(序列如Seq ID No.71)融合了小鼠IgG1型抗体Fc端(序列如Seq ID No.72)，能够便于重组蛋白的检测和纯化，通过BamHI和XhoI限制性内切酶对载体进行切割，然后进行琼脂糖凝胶电泳切胶回收载体片段。将目的片段分别用BamHI和XhoI限制性内切酶切割，然后和酶切的载体进行连接，连接产物转化至TOP10感受态细胞之后，37℃培养15h，挑取单克隆菌落进行电泳PCR鉴定，阳性克隆送样品至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序鉴定，测序正确的质粒进行质粒大提，提取之后的质粒经过0.22μm滤膜过滤除菌，然后-20℃保存。
表2
3.不同信号肽介导重组蛋白的瞬转表达测试
准备OPM-CD05培养基(奥普迈)培养的悬浮HEK293细胞，转染前24小时将细胞密度接种至1×106个/mL，转染当天37℃预热培养体积1/15的OPM-CD05培养基，按照每1μg DNA/mL培养物加入转染质粒，然后加入2倍质量的PEI(1mg/mL)转染试剂(Polysciences)，颠倒混匀之后室温静置20min，然后将DNA和PEI混合物缓缓加入到培养的细胞中，中间培养第2和第4天补加1％的葡萄糖(2M)和谷氨酰胺溶液(200mM)，培养6～7天时收集细胞表达上清，进行表达量检测。为了减少实验的误差，每个信号肽的表达载体平行三组进行实验，收获料液上清后，然后检测表达量。
4.不同分泌信号肽表达水平检测分析
本实验采用江苏三联生物工程股份有限公司自主开发的SLXP-001B型仪器及其配套试剂进行蛋白定量分析，其基本原理是在硬基质的蛋白芯片上包被羊抗鼠抗体，然后孵育瞬转表达的细胞培养上清，最后加入HRP酶标的羊抗鼠(Jackson)抗体，经过发光后根据其光强信噪比判断表达水平的高低。基本步骤如下：将蛋白芯片转载于SLXP-001B型仪器上，然后芯片杯中加入细胞瞬转表达上清200μL，仪器自检之后开始检测。最后通过分析不同信号肽表达载体的检测信噪比，研究不同信号肽的真实表达水平。通过三组试验平均的信噪比分析可以得出，如图3所示，信号肽E2信噪比相对最高，因此选择E2信号肽进行更多重组蛋白的表达测试。
二、验证高表达蛋白信号肽表达水平
选取了上述信噪比最高的E2信号肽做进一步实际应用的研究，在同等条件下，分别使用本申请的信号肽和验证蛋白自身的信号肽进行对比验证，比较该信号肽在HEK293细胞中分泌表达的水平，具体操作如下：
1.高表达蛋白信号肽表达载体的构建
首先，本申请信号肽(其氨基酸序列如Seq ID No.15，基因序列如Seq ID No.33)、测试蛋白自身信号肽(其氨基酸序列如Seq ID No.39、Seq ID No.43、Seq ID No.47、SeqID No.51、Seq ID No.55、Seq ID No.59、Seq ID No.63、Seq ID No.67，基因序列如Seq IDNo.73、Seq ID No.77、Seq ID No.81、Seq ID No.85、Seq ID No.89、Seq ID No.93、Seq IDNo.97、Seq ID No.101)和测试蛋白(其氨基酸序列如Seq ID No.40、Seq ID No.44、Seq IDNo.48、Seq ID No.52、Seq ID No.56、Seq ID No.60、Seq ID No.64、Seq ID No.68，基因序列如Seq ID No.74、Seq ID No.78、Seq ID No.82、Seq ID No.86、Seq ID No.90、Seq IDNo.94、Seq ID No.98、Seq ID No.102，)的重组表达载体由江苏赛索飞生物科技有限公司合成，载体融合了小鼠IgG1型抗体Fc端(自身信号肽+测试蛋白氨基酸序列如Seq IDNo.41、Seq ID No.45、Seq ID No.49、Seq ID No.53、Seq ID No.57、Seq ID No.61、Seq IDNo.65、Seq ID No.69，本申请信号肽+测试蛋白氨基酸序列如Seq ID No.42、Seq IDNo.46、Seq ID No.50、Seq ID No.54、Seq ID No.58、Seq ID No.62、Seq IDNo.66、Seq IDNo.70，自身信号肽+测试蛋白基因序列如Seq ID No.75、Seq ID No.79、Seq ID No.83、SeqID No.87、Seq ID No.91、Seq ID No.95、Seq ID No.99、Seq ID No.103，本申请信号肽+测试蛋白基因序列如Seq ID No.76、Seq ID No.80、Seq ID No.84、Seq ID No.88、Seq IDNo.92、Seq IDNo.96、Seq ID No.100、Seq ID No.104)，能够便于重组蛋白的检测和纯化，载体上合成通过BamHI和XhoI限制性内切酶对载体进行切割，然后进行琼脂糖凝胶电泳切胶回收载体片段。将目的片段分别用BamHI和XhoI限制性内切酶切割，然后和酶切的载体进行连接，连接产物转化至TOP10感受态细胞之后，37℃培养15h，挑取单克隆菌落进行电泳PCR鉴定，阳性克隆送样品至生工生物(上海)股份有限公司进行测序鉴定，测序正确的质粒进行质粒大提，提取之后的质粒经过0.22μm滤膜过滤除菌，然后-20℃保存。
表3
2.蛋白表达测试
准备OPM-CD05培养基(奥普迈)培养的悬浮HEK293细胞，转染前24小时将细胞密度接种至1×106个/mL，转染当天37℃预热培养体积1/15的OPM-CD05培养基，按照每1μg DNA/ml培养物加入转染质粒，然后加入2倍质量的PEI(1mg/mL)转染试剂(Polysciences)，颠倒混匀之后室温静置20min，然后将DNA和PEI混合物缓缓加入的培养细胞中，中间培养第2和第4天补加1％的葡萄糖(2M)和谷氨酰胺溶液(200mM)，培养6-7天时收集细胞表达上清，进行表达量检测。为了减少实验的误差，每个信号肽的表达载体平行三组进行实验，收获料液上清后，经过纯化后计算重组蛋白的平均表达量。
3.目的蛋白分离纯化
首先将rProteinA亲和柱连接于AKTA pure150L设备上，用5CV的平衡缓冲液(PBS，pH 7.4)进行柱平衡，然后细胞培养上清经过离心上清后上样，上样结束后继续用平衡缓冲液平衡至UV基线平稳。用20mM的柠檬酸(pH 3.0)的柠檬酸洗脱层析柱上的蛋白，收集洗脱峰，用pH9.0的Tris-HCl调节洗脱液pH至7.2，然后用透析袋将蛋白的缓冲Buffer进行置换，置换至pH 7.4的PBS中，然后检测纯化后蛋白浓度和蛋白总量，计算产量，具体结果如表4。
表4
| 信号肽 | 蛋白平均表达量(mg/L) |
| ERBB2自身信号肽 | 18.5 |
| ERBB2人工合成信号肽 | 49.3 |
| HE4自身信号肽 | 23.3 |
| HE4人工合成信号肽 | 61.8 |
| NT-proBNP自身信号肽 | 13.7 |
| NT-proBNP人工合成信号肽 | 40.6 |
| PSA自身信号肽 | 29.3 |
| PSA人工合成信号肽 | 90.0 |
| ST2自身信号肽 | 10.2 |
| ST2人工合成信号肽 | 41.7 |
| TPO自身信号肽 | 4.6 |
| TPO人工合成信号肽 | 26.3 |
| Bos d 2自身信号肽 | 25.4 |
| Bos d 2人工合成信号肽 | 83.4 |
| Lysozyme自身信号肽 | 34.3 |
| Lysozyme人工合成信号肽 | 91.8 |
4.人工合成信号肽对蛋白表达水平的效果分析
同等条件下，分别使用该人工合成信号肽和验证蛋白本身的信号肽进行蛋白表达测试，结果表明，如图4和图5所示，本申请的人工合成信号肽能够显著提升重组蛋白的表达水平，最高达到5倍以上，平均提升在3倍左右。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对申请专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种信号肽，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No.15所示。
2.一种核酸片段，其特征在于，其编码如权利要求1所述的信号肽。
3.根据权利要求2所述的核酸片段，其特征在于，所述核酸片段的核苷酸序列如SEQ IDNo.33所示。
4.一种重组表达载体，其特征在于，包括权利要求2或3所述的核酸片段。
5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述核酸片段的3’端连接有重组蛋白的编码序列片段。
6.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述核酸片段的5’端连接有Kozak序列片段。
7.一种宿主细胞，其特征在于，其基因组中含有权利要求4～6任一项所述的重组表达载体。
8.权利要求1所述的信号肽、权利要求2～3任一项所述的核酸片段、权利要求4～6任一项所述的重组表达载体或权利要求7所述的宿主细胞在制备重组蛋白中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述重组蛋白选自RBD蛋白、ERBB2受体、HE4蛋白、NT-proBNP蛋白、PSA蛋白、ST2受体、TPO蛋白、Bos d 2蛋白和Lysozyme C中的一种或多种。
10.一种重组蛋白的制备方法，其特征在于，使用权利要求7所述的宿主细胞进行基因表达获得所述重组蛋白。
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