JP2019505808A - 生体分子の固定化方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、少なくとも1つのスルフヒドリル基を含有する生体分子の固定化方法であって、修飾金属表面を生体分子と接触させ、生じた表面に光開始剤の存在下でUV線を照射することを含み、前記金属表面は、金属表面に共有結合した末端チオール又はジチオール基、もう一方の末端に孤立二重結合又は三重結合を保持しているスペーサー基を含むクロスリンカー化合物で修飾されている。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、2015年2月22に提出された欧州特許出願EP16156777.1に対する優先権の利益を主張する。この出願の全内容は、参照によってその全体が組み込まれる。

発明の背景
1. 技術分野
本発明は、少なくとも1つのスルフヒドリル基を含有する生体分子の固定化方法に関する。この方法は、修飾金属表面を生体分子と接触させ、結生じた表面に光開始剤の存在下でUV線を照射することを含み、前記金属表面は、金属表面に共有結合した末端チオール又はジチオール基、もう一方の末端に孤立二重結合又は三重結合を保持しているスペーサー基を含むクロスリンカー化合物で修飾されている。

2. 先行技術
サンプル中に存在する分析物、例えば生物学的プロセスに影響を及ぼす生体分子その他の分子の検出及び定量化は分析試験に不可欠である。例えば、生物活性又は疾患のマーカーである生体分子の検出は医学的状態及び病理学の診断に重要である。しかしながら、生体分子等の分析物の検出の利用可能信号への変換は、一部は検出事象、例えば抗原に結合している抗体を知覚可能データに変換できる検出可能信号に変換することの複雑さのため困難である。酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)等のいくつかのアッセイは、サンプルに色の変化をもたらす光又は反応生成物を生み出す結合事象のモニタリングによって生体分子を検出する。これらのタイプのアッセイの1つの利点は、それらが非常に高感度なことである。しかしながら、ELISAアッセイ等のこれらのアッセイの欠点は、それらは典型的に検出可能信号の発生に長時間を必要とし、完了するには多工程が必要なことである。

最近、伝統的な免疫アッセイの感度を保持しながら、信号の発生に関与する複雑さと時間を排除する他の方法が開発されている。1つの戦略は、例えば分析物に対して高い親和性を有する高選択性抗体を使用することによって、免疫アッセイの感度を電気化学測定と連関させることである。検出事象を電気信号に結び付けることによって、サンプル中の分析物の存在及び濃度についての情報を即座に電気信号に変換することができる。過去数十年にわたっていくつかの検知概念及び関連装置が開発されてきた。最も一般的な伝統的技術には、サイクリック・ボルタンメトリー、クロノアンペロメトリー、クロノポテンシオメトリー、及びインピーダンス・スペクトロスコピーがある。
しかしながら、電気化学センサーの一般的性能は、感知要素を生体サンプルにナノスケールで接続する表面アーキテクチャーによって決まることが多い。電気化学バイオセンサーは、所望の生化学事象による応答の高い十分な感度及び特有の同定を可能にする表面アーキテクチャーの欠如に悩まされてきた。
従って、ELISAアッセイ等の伝統的アッセイの高い感度を有しながら、電気化学センサーの望しい態様、例えば容易に測定できる信号及び小型化の見込み等を維持する電気化学バイオセンサーが要望されている。

米国特許出願US 2012/0228155は、標的分析物を検出するための官能化電極の作製方法であって、下記：
導電性面、例えば金電極を、末端アミノ基を有する第1のチオール化合物と、末端OH、アルコキシ、メチル、糖、双性イオン、又は極性非イオン基を有する第2のチオール化合物との混合物と接触させ、第1及び第2のチオール化合物のスルフヒドリル基が導電性面と結合し、それによって導電性面の表面上に単分子層を作り出すこと；
導電性面の表面上の単分子層を、アミン反応性官能基、及びジアジリン又はマレイミド部分を含むヘテロ二官能性リンカーと接触させること；及び
導電性面の表面上の単分子層を、特異的に標的分析物に結合するリガンドと接触させ、それによって、標的分析物を検出するための官能化電極を作製すること
を含む方法に関する。
ヘテロ二官能性リンカーがスルホ-NHSジアジリン(スルホ-SDA)を含む場合、この方法はさらに導電性面の表面上の単分子層をUV照射に曝し、それによって、標的分析物を検出するための官能化電極を作製することを含む。

米国特許US 8,580,571は、親水性ポリマーがそれに結合している基板を含むバイオセンサーの製造方法に関する。この方法は下記工程：
基板上に自己組織化単分子膜を形成する工程（ここで、自己組織化は、アルカンチオールによって形成される）；この基板上に光ラジカル発生剤含有溶液をコーティングして、光ラジカル発生剤が基板上の自己組織化単分子膜に結合できるようにする工程、この基板上に親水性ポリマー含有溶液をコーティングする工程（ここで、親水性ポリマーは、カルボキシル基と二重結合を有する多糖である）及びこの基板を光に曝して光ラジカル発生剤から反応基を発生させ、前記反応基に親水性ポリマーの二重結合を介して親水性ポリマーを共有結合させる工程を含み、それによってバイオセンサーが、親水性ポリマーがそれに結合している基板を含むことになり、バイオセンサー内の基板に結合した親水性ポリマーに含まれるカルボキシル基が、対象とする生理活性物質をバイオセンサー上に固定化するために用いられる。

中国特許出願CN 104 597 230は、官能化ポリマーフィルムの製造方法であって、下記工程：
バイオチップの基板の表面上に末端官能化自己集合単分子層、例えば金表面に結合した末端官能化チオール又はジチオール化合物を形成する工程；光クロスリンカー、例えばフェニルジアジリンを自己集合単分子層の末端に化学結合によりグラフトする工程；形成された結果表面上にポリマー溶液をスピンコーティングする工程；及びスピンコーティングされたポリマー表面を有するバイオチップ上にUV照射を行なって、表面にグラフトされたポリマーにUV光下でポリマーフィルムを形成させる化学結合を形成する工程を含む方法を示唆する。

発明の概略
従って、本発明は、少なくとも1つのスルフヒドリル基を含有する生体分子の固定化方法であって、
(a)必要に応じて、生体分子内の既存-S-S-結合を切断するために還元剤で生体分子を処理する工程、又は
(b)必要に応じて、保護されたスルフヒドリル基を有するアシル化剤で生体分子を処理し、スルフヒドリル基を脱保護する工程；
(c)修飾金属表面を生体分子と接触させる工程；
(d)生じた表面に光開始剤の存在下でUV照射する工程
を含み、
ここで、前記金属表面は、
a.前記金属表面に共有結合した末端チオール又はジチオール基を含み、前記末端チオール又はジチオール基は
b.スペーサー基に接続しており、前記スペーサー基は、もう一方の末端に孤立C-C二重結合又はC-C三重結合を保持している
クロスリンカー化合物で修飾されている、前記方法に関する。

さらに、本発明は、下記式(I)の化合物に関する。
HS-(CH₂)_m-CH(ZH)-SPACER-(CH₂)_p-A (I)
式中、
mは、2〜6の整数であり、
Aは、-CH=CH₂及び-C≡CHから選択され、かつ
Zは、S又は単結合であり、
SPACERは、下記式
-(CH₂)_n-(C=O)_x-Y-(CH₂CH₂-O)_y-(CH₂)_r-(C=O)_v-X-
の基であり、
ここで、
X及びYは、それぞれ独立にNH又はOであり、
nは、0又は1〜10の整数であり、
x及びvは、それぞれ独立に0又は1であり、
yは、1〜20の整数であり、
r及びpは、それぞれ独立に1〜6の整数から選択される。

本発明の別の態様は、下記式(II)の中間体である。

式中、A、SPACER、m及びsは、式(I)について与えた意味を有する。
さらに、本発明は、修飾金属表面であって、この表面の金属原子の少なくとも1つに本発明の式(I)の化合物の少なくとも1つのチオール基が共有結合している、修飾金属表面に関する。
本発明の最終態様は、本発明に従って生体分子の固定化方法を行なうためのキットであって、下記
(i)本発明の修飾金属表面を有する基板、
(ii)適切な還元剤を含有する任意選択的な格納ユニット、又は
(iii)保護されたスルフヒドリル基を有する適切なアシル化剤及びスルフヒドリル基用の脱保護剤を含有する任意選択的な格納ユニット、
(iv)適切な光開始剤を含有する格納ユニット、及び
(v)この方法を行なうための条件を説明するパンフレット
を含む、キットである。

リポアミド-PEG(11)-マレイミドで修飾された表面と比較した異なる条件下での本発明の相補型金属酸化物半導体(CMOS)チップの蛍光写真を示す。 モノクロナールマウス抗体がその上に固定化された本発明のCMOSチップの蛍光写真を示す。 ポリクロナールウサギ抗ACTH抗体がその上に固定化された本発明のCMOSチップの蛍光写真を示す。 本発明の生体分子の固定化の略図を示す。

発明の詳細な説明
I. 用語リスト
特に指定のない限り、慣例的用法に従って技術用語を使用する。分子生物学の一般用語の定義は、Benjamin Lewin, Genes VII(Oxford University Press出版), 2000(ISBN 019879276X)；Kendrew et al.(eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology(B1ackwel1 Publishers出版), 1994(ISBN 0632021829)；及びRobert A. Meyers(ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference,(Wiley, John &Sons, Inc.出版), 1995(ISBN 0471186341)；並びに他の同様の参考文献で見つけられる。

本明細書で使用する場合、単数用語「a」、「an」、及び「the」は、文脈が明白にそうでないと示さない限り複数の参照対象を含む。同様に、単語「又は」は、文脈が明白にそうでないと示さない限り「及び」を含むよう意図される。また、本明細書で使用する場合、用語「含む(comprises)」は、「含む(includes)」を意味する。従って「A又はBを含む」は、A、B、又はA及びBを含むことを意味する。さらに、全てのヌクレオチドサイズ又はアミノ酸サイズ、並びに核酸若しくはポリペプチド又は他の化合物に与えられる全ての分子量又は分子質量値は近似であり、説明のために提供されることを理解すべきである。本発明に記載の方法及び材料と同様又は等価な方法及び材料を本開示の実施又は試験に使用できるが、適切な方法及び材料について後述する。矛盾する場合、用語の説明を含め、本明細書が支配することになる。さらに、材料、方法、及び例は、例示に過ぎず、限定する意図ではない。

本開示の種々の例の精査を容易にするため、特殊用語の下記説明を提供する。
生体分子：生物源に由来し得るか又は合成により生成され得る生物活性分子。
アレルゲン：I型過敏性反応を刺激できる非寄生性抗原。I型アレルギーは、複数のアレルゲン源(例えば、ダニ、花粉、動物、昆虫、カビ、及び食物)に起源をもち得るアレルゲンと呼ばれる、他の点では無害の抗原に対する免疫グロブリンE(IgE)抗体の産生である。特にアレルゲンとの反復接触後に、T細胞へのアレルゲンのIgE媒介提示がT細胞の活性化及び慢性アレルギー性炎症(例えば、慢性喘息、アトピー性皮膚炎)をもたらす。この事象は、アレルゲン特異的血清IgEレベル及び患者の増加をも誘発する。一般的アレルゲンとしては以下のものがある：木等の植物由来のもの、例えばベツラ・ベルコサ(Betula verrucosa)アレルゲンBet v I、Bet v 2、及びBet v 4；ジュニペルス・オキシセドルス(Juniperous oxycedrus)アレルゲンJun o 2；カスタネア・サチバ(Castanea sativa)アレルゲンCas s 2；及びヘベア・ブラシリエンシス(Hevea brasiliensis)アレルゲンHev b I、Hev b 3、Hev b 8、Hev b 9、Hev b 10及びHev b 11；草、例えばフレウム・プレテンス(Phleum pretense)アレルゲンPhl p I、Phl p 2、Phl p 4、Phl p Sa、Phlp 5、Phlp 6、Phlp 7、Phl p 11、及びPhl p 12；雑草、例えばパリエタリア・ジュダイカ(Parietaria judaica)アレルゲンPar j 2.01011；及びアルテミシア・ブルガリス(Artemisia vulgaris)アレルゲンArt v I及びArt v 3；ダニ、例えばデルマトファゴイデス・プテロニッシヌス(Dermatophagoides pteronyssinus)アレルゲンDer p I、Der p 2、Der p 5、Der p 7、Der p 8、及びDer p 10；チロファグ・プトレセンチア(Tyrophagu putrescentiae)アレルゲンTyr p 2；レピドグリフス・デストルツクトル(Lepidoglyphus destrtuctor)アレルゲンLep d 2.01及びLep d 13；及びエウログリフス・マイネイ(Euroglyphus maynei)アレルゲンEur m 2.0101；動物、例えばネコ、例えばフェリス・ドメスチクス(Felis domesticus)アレルゲンFel d I；ペナエウス・アズテクス(Penaeus aztecus)アレルゲンPen a I；シプリヌス・カルポ(Cyprinus carpo)アレルゲンCyp c I；及び並びにネコ、イヌ、ウシ、マウス、ラット、ブタ、ヒツジ、ニワトリ、ウサギ、ハムスター、ウマ、ハト、及びモルモットからのアルブミン；真菌、例えばペニシリウム・シトリヌム(Penicillium citrinum)アレルゲンPen c 3及びPen c 19；ペニシリウム・ノタツム(Penicillium notatum)アレルゲンPenn13；アスペルギルス・フミガツス(Aspergillus fumigatus)アレルゲンAsp f I、Asp f3、Asp f4、Asp f6、Asp f7及びAsp f8；アルテルナリア・アルテルナタ(Alternaria alternata)アレルゲンAlt a I及びAlt a 5；マラッセジア・フルフール(Malassezia furfur)アレルゲンMal f I、Mal f 5、Mal f 6、Mal f 7、Mal f 8、及びMal f 9；昆虫、例えばブラテラ・ゲルマニカ(Blatella germanica)アレルゲンBla g 2、Bla g 4、及びBla g 5；アピス・メリフェラ(Apis mellifera)アレルゲンApi m 2及びApi m I；ベスプラ・ブルガリス(Vespula vulgaris)アレルゲンVes v 5；ベスプラ・ゲルマニカ(Vespula germanica)アレルゲンVes g 5；及びポルステス・アンヌラリス(Polstes annularis)アレルゲンPol a 5；食物、例えばマルス・ドメスチカ(Malus domestica)アレルゲンMal d I及びMal d 2；アピウム・グラベオレンス(Apium graveolens)アレルゲンApi g I及びApi g 1.0201；ダウクス・カロタ(Daucus carota)アレルゲンDau c I；及びアラキス・ヒポガエア(Arachis hypogaea)アレルゲンAra h 2及びAra h 5等。いくつかの実施形態では、アレルゲン又はその部分が官能化表面又は電極の一部であり、従って開示官能化表面を用いて、アレルゲンに特異的に結合する、サンプル中の抗体の存在及び濃度を測定することができる。いくつかの実施形態では、アレルゲン又はその部分に特異的に結合する抗体が開示官能化表面又は電極の一部であり、従って開示官能化電極を用いてアレルゲンの存在及び濃度を測定することができる。

「抗体」は集合的に、他の分子への結合を実質的に排除して、対象となる分子(又は対象となる非常に類似した分子群)に特異的に結合する免疫グロブリン又は免疫グロブリン様分子(例として、限定するものではないが、IgA、IgD、IgE、IgG及びIgM、その組み合わせを含めて)、並びに任意の脊索動物、例えば脊椎動物、例えば、哺乳動物、例えばヒト、ヤギ、ウサギ及びマウス等における免疫反応中に産生される同様の分子及びその断片を指す。「抗体」は典型的に、抗原のエピトープを特異的に認識してそれに結合する少なくとも1つの軽鎖又は重鎖免疫グロブリン可変領域を有するポリペプチドリガンドを含む。例示抗体として、ポリクロナール及びモノクロナール抗体がある。
用語抗体は、他の分析物に結合できるパラトープ配列をも含む。

免疫グロブリンは、重鎖及び軽鎖から構成され、それぞれ可変重鎖(VH)領域及び可変軽鎖(VL)領域と呼ばれる可変領域を有する。まとめて、VH領域とVL領域は、免疫グロブリンによって認識される抗原との結合に関与している。例示的免疫グロブリン断片としては、限定するものではないが、タンパク質分解免疫グロブリン断片(例えば、技術上周知であるF(ab')2断片、Fab'断片、Fab'-SH断片及びFab断片)、組換え免疫グロブリン断片(例えばsFv断片、dsFv断片、二重特異性sFv断片、二重特異性dsFv断片、F(ab)'2断片)、単鎖Fvタンパク質(「scFv」)、及びジスルフィド安定化Fvタンパク質(「dsFv」)が挙げられる。抗体の他の例には、ジアボディ、及びトリアボディ(技術上周知である)、並びにラクダ科抗体がある。「抗体」には、遺伝子操作された分子、例えばキメラ抗体も含まれる。「抗体」には、遺伝子操作された抗体、例えばキメラ抗体(例えば、ヒト化マウス抗体)、及びヘテロ結合抗体(例えば、二重特異性抗体)も含まれる。また、Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, Ill.); Kuby, J., Immunology, 3rd Ed., W.H.Freeman & Co., New York, 1997を参照されたい。

各重鎖及び軽鎖は、定常領域と可変領域を含む(領域は「ドメイン」としても知られる)。組み合わさって、重鎖可変領域と軽鎖可変領域が抗原に特異的に結合する。軽鎖及び重鎖可変領域は、「相補性決定領域」又は「CDR」とも呼ばれる3つの超可変領域で中断された「フレームワーク」領域を含有する。フレームワーク領域及びCDRの範囲は定義されている(参照によって組み込まれるKabat et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Edition, U.S. Department of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.(NIH公開番号91-3242)参照)。Kabatデータベースは、現在オンラインで維持されている。種内では様々な軽鎖又は重鎖のフレームワーク領域の配列が比較的保存されている。構成軽鎖と重鎖の組み合わさったフレームワーク領域である、抗体のフレームワーク領域が働いて三次元空間にCDRを位置付けてアラインし、例えば抗原結合に適した配向でCDRを保持する。
CDRは、主に抗原のエピトープへの結合に関与する。各鎖のCDRは、典型的にN末端から順番に番号をつけてCDR1、CDR2及びCDR3と呼ばれ、特定のCDRは典型的にはそれが位置する鎖によっても特定される。従って、VH CDR3は、それが見いだされる抗体の重鎖の可変ドメイン内に位置し、一方でVL CDR1は、それが見いだされる抗体の軽鎖の可変ドメインのCDRIである。

「モノクロナール抗体」は、Bリンパ球の単一クローンによって又は単一抗体の軽鎖及び重鎖遺伝子がその中にトランスフェクト若しくは形質導入(transduce)された細胞によって産生された抗体である。モノクロナール抗体は、当業者に周知の方法、例えば骨髄腫細胞と免疫脾臓細胞の融合からハイブルドーマ抗体形成細胞を作製することによって生成される。これらの融合細胞及びそれらの子孫は「ハイブリドーマ」と呼ばれる。モノクロナール抗体には、ヒト化モノクロナール抗体が含まれる。[0048]「ヒト化」免疫グロブリンは、ヒトフレームワーク領域及び非ヒト(例えばマウス、ラット又は合成)免疫グロブリンからの1つ以上のCDRを含む免疫グロブリンである。CDRを形成する非ヒト免疫グロブリンは「ドナー」と呼ばれ、フレームワークを形成するヒト免疫グロブリンは「アクセプター」と呼ばれる。一実施形態では、全てのCDRが、ヒト化免疫グロブリン中のドナー免疫グロブリン由来である。定常領域は存在する必要ないが、存在する場合、それらはヒト免疫グロブリン定常領域と実質的に同一、例えば少なくとも約85〜90%、例えば約95%以上同一でなければならない。従って、ヒト化免疫グロブリンのおそらくCDR以外の全ての部分が天然のヒト免疫グロブリン配列の相当部分と実質的に同一である。「ヒト化抗体」は、ヒト化軽鎖免疫グロブリン及びヒト化重鎖免疫グロブリンを含む抗体である。ヒト化抗体は、CDRを形成するドナー抗体と同じ抗原に結合する。ヒト化免疫グロブリン又は抗体のアクセプターフレームワークは、ドナーフレームワークから得られるアミノ酸による限られた数の置換を有し得る。ヒト化又は他のモノクロナール抗体は、抗原結合性又は他の免疫グロブリン機能に実質的に影響を及ぼさない追加の保存的アミノ酸置換を有することがある。ヒト化免疫グロブリンは、遺伝子操作を利用して構築することができる(例えば米国特許第5,585,089号参照)。

いくつかの実施形態では、抗体は、例えばチオール若しくはジチオール化合物又はそれ自体が電極表面に結合している官能化チオール若しくはジチオール化合物に共有結合した開示官能化電極の一部である抗原のような、対象とする抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、対象とする抗原に特異的な抗体は、例えばチオール若しくはジチオール化合物又はそれ自体が電極表面に結合している官能化チオール若しくはジチオール化合物に共有結合した開示官能化電極の一部である。いくつかの実施形態では、抗体は、酵素を含む検出試薬の一部である。

抗原：特異的な体液性免疫又は細胞性免疫の産物によって特異的に結合され得る化合物、組成物、又は物質、例えば抗体分子又はT細胞受容体。抗原は、いずれのタイプの分子であってもよく、例えば、ハプテン、単純な中間代謝物、糖(例えば、オリゴ糖)、脂質、及びホルモン並びに巨大分子、例えば複合炭水化物(例えば、多糖)、リン脂質、核酸及びタンパク質が挙げられる。一般的分類の抗原としては、限定するものではないが、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、原虫その他の寄生虫抗原、腫瘍抗原、自己免疫疾患、アレルギー反応及び移植片拒絶反応に関与する抗原、毒素、並びに技術上周知の他の抗原が挙げられる。
いくつかの実施形態では、抗原は、例えばチオール若しくはジチオール化合物又はそれ自体が電極表面に結合している官能化チオール若しくはジチオール化合物に共有結合した開示官能化電極の一部である抗体のような対象とする抗体のためのリガンドである。いくつかの実施形態では、対象とする抗原は、例えばチオール若しくはジチオール化合物又はそれ自体が電極表面に結合している官能化チオール若しくはジチオール化合物に共有結合した開示官能化電極の一部である。

アプタマー：標的生体分子等の標的分子、例えば標的分析物等の分析物に特異的に結合する小さい核酸及びペプチド分子。いくつかの実施形態ではアプタマーは、官能化電極等の開示修飾表面の一部である。
細菌病原：疾患を引き起こす細菌(病原性細菌)。開示官能化電極に用いる抗原が由来しうる病原性細菌の例としては、限定するものではないが、とりわけ、アシネトバクター・バウマニイ(Acinetobacter baumanii)、アクチノバチルス種(Actinobacillus sp.)、アクチノミセテス(Actinomycetes)、アクチノミセス種(Actinomyces sp.)(例えばアクチノミセス・イスラエリイ(Actinomyces israelii)及びアクチノミセス・ナエスルンジイ(Actinomyces naeslundii))、アエロモナス種(Aeromonas sp.)(例えばアエロモナス・ヒドロフィラ(Aeromonas hydrophila)、アエロモナス・ベロニイ・ビオバル・ソブリア(Aeromonas veronii biovar sobria)(アエロモナス・ソブリア(Aeromonas sobria))、及びアエロモナス・カビア(Aeromonas caviae))、アナプラズマ・ファゴシトフィルム(Anaplasma phagocytophilum)、アルカリゲネス・キシロソキシダンス(Alcaligenes xylosoxidans)、アシネトバクター・バウマニイ(Acinetobacter baumanii)、アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンス(Actinobacillus actinomycetemcomitans)、バチルス種(Bacillus sp.)(例えばバチルス・アントラシス(Bacillus anthracis)、バチルス・セレウス(Bacillus cereus)、バチルス・スブチリス(Bacillus subtilis)、バチルス・チューリンゲンシス(Bacillus thuringiensis)、及びバチルス・ステアロサーモフィルス(Bacillus stearothermophilus))、バクテロイデス種(Bacteroides sp.)(例えばバクテロイデス・フラジリス(Bacteroides fragilis))、バルトネラ種(Bartonella sp.)(例えばバルトネラ・バシリホルミス(Bartonella bacilliformis)及びバルトネラ・ヘンセラ(Bartonella henselae))、ビフィドバクテリウム種(Bifidobacterium sp.)、ボルデテラ種(Bordetella sp.)(例えばボルデテラ・パータシス(Bordetella pertussis)、ボルデテラ・パラパータシス(Bordetella parapertussis)、及びボルデテラ・ブロンキセプチカ(Bordetella bronchiseptica))、ボレリア種(Borrelia sp.)(例えばボレリア・レクレンチス(Borrelia recurrentis)、及びボレリア・ブルグドルフェリ(Borrelia burgdorferi))、ブルセラ種(Brucella sp.)(例えばブルセラ・アボルタス(Brucella abortus)、ブルセラ・カニス(Brucella canis)、ブルセラ・メリンテンシス(Brucella melintensis)及びブルセラ・スイス(Brucella suis))、バークホルデリア種(Burkholderia sp.)(例えばバークホルデリア・シュードマレイ(Burkholderia pseudomallei)及びバークホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia))、カンピロバクター種(Campylobacter sp.)(例えばカンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)、カンピロバクター・コリ(Campylobacter coli)、カンピロバクター・ラリ(Campylobacter lari)及びカンピロバクター・フィタス(Campylobacter fetus))、キャプノサイトファーガ種(Capnocytophaga sp.)、カルジオバクテリウム・ホミニス(Cardiobacterium hominis)、クラミジア・トラコマチス(Chlamydia trachomatis)、クラミドフィラ・ニューモニエ(Chlamydophila pneumoniae)、クラミドフィラ・シタッシ(Chlamydophila psittaci)、シトロバクター種(Citrobacter sp.)、コクシエラ・ブルネッティ(Coxiella burnetii)、コリネバクテリウム種(Corynebacterium sp.)(例えば、コリネバクテリウム・ジフテリエ(Corynebacterium diphtheriae)、コリネバクテリウム・ジェイコイム(Corynebacterium jeikeum)及びコリネバクテリウム(Corynebacterium))、クロストリジウム種(Clostridium sp.)(例えばクロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)、クロストリジウム・ドシル(Clostridium docile)、クロストリジウム・ボツリヌム(Clostridium botulinum)及びクロストリジウム・テタニ(Clostridium tetani))、エイケネラ・コローデンス(Eikenella corrodens)、エンテロバクター種(Enterobacter sp.)(例えばエンテロバクター・エロゲネス(Enterobacter aerogenes)、エンテロバクター・アッグロメランス(Enterobacter agglomerans)、エンテロバクター・クロアカ(Enterobacter cloacae)及び大腸菌(エシェリキア・コリ(Escherichia coli)、日和見性大腸菌、例えば腸内毒素原性大腸菌(E. coli)、腸管侵入性大腸菌、腸管病原性大腸菌、腸管出血性大腸菌、腸管凝集性大腸菌及び尿路病原性大腸菌を含む)、エンテロコッカス種(Enterococcus sp.)(例えばエンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)及びエンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium))、エーリキア種(Ehrlichia sp.)(例えばエールリキア・カフェエンシア(Ehrlichia chafeensia)及びエールリキア・カニス(Ehrlichia canis))、エリシペロトリキス・ルシオパチア(Erysipelothrix rhusiopathiae)、ユーバクテリウム種(Eubacterium sp.)、フランシセラ・ツラレンシス(Francisella tularensis)、フソバクテリウム・ヌクレアタム(Fusobacterium nucleatum)、ガードネレラ・バギナリス(Gardnerella vaginalis)、ゲメラ・モルビロルム(Gemella morbillorum)、ヘモフィルス種(Haemophilus sp.)(例えばヘモフィルス・インジュルエンザ(Haemophilus injluenzae)、ヘモフィルス・ズクレイ(Haemophilus ducreyi)、ヘモフィルス・アエギプチウス(Haemophilus aegyptius)、ヘモフィルス・パラインジュルエンザ(Haemophilus parainjluenzae)、ヘモフィルス・ヘモリチクス(Haemophilus haemolyticus)及びヘモフィルス・パラヘモリチクス(Haemophilus parahaemolyticus))が挙げられる。
さらに、ヘリコバクター種(Helicobacter sp.)(例えばヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、ヘリコバクター・シネディ(Helicobacter cinaedi)及びヘリコバクター・フェンネリア(Helicobacter fennelliae))、エインゲラ・キンギイ(Eingella kingii)、エレブシエラ種(Elebsiella sp.)(例えばエレブシエラ・ニューモニエ(Elebsiella pneumoniae)、エレブシエラ・グラヌロマチス(Elebsiella granulomatis)及びエレブシエラ・オキシトカ(Elebsiella oxytoca))、ラクトバチルス種(Lactobacillus sp.)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、レプトスピラ・インターロガンス(Leptospira interrogans)、レジオネラ・ニューモフィラ(Legionella pneumophila)、レプトスピラ・インターロガンス(Leptospira interrogans)、ペプトストレプトコッカス種(Peptostreptococcus sp.)、モラクセラ・カタラーリス(Moraxella catarrhalis)、モルガネラ種(Morganella sp.)、モビルンカス種(Mobiluncus sp.)、ミクロコッカス種(Micrococcus sp.)、マイコバクテリウム種(Mycobacterium sp.)(例えばマイコバクテリウム・レプラ(Mycobacterium leprae)、マイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ(Mycobacterium intracellulare)、マイコバクテリウム・アビウム(Mycobacterium avium)、マイコバクテリウム・ボビス(Mycobacterium bovis)、及びマイコバクテリウム・マリヌム(Mycobacterium marinum))、マイコプラズマ種(Mycoplasm sp.)(例えばマイコプラズマ・ニューモニエ(Mycoplasma pneumoniae)、マイコプラズマ・ホミニス(Mycoplasma hominis)、及びマイコプラズマ・ゲニタリウム(Mycoplasma genitalium))、ノカルジア種(Nocardia sp.)(例えばノカルジア・アステロイデス(Nocardia asteroides)、ノカルジア・シリアシゲオルギカ(Nocardia cyriacigeorgica)及びノカルジア・ブラシリエンシス(Nocardia brasiliensis))、ナイセリア種(Neisseria sp.)(例えばナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)及びナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis))、パスツレラ・マルトシダ(Pasteurella multocida)、プレジオモナス・シゲロイデス(Plesiomonas shigelloides)、プレボテラ種(Prevotella sp.)、ポルフィロモナス種(Porphyromonas sp.)、プレボテラ・メラミ・ノゲニカ(Prevotella melami nogenica)、プロテウス種(Proteus sp.)(例えばプロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)及びプロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis))、プロビデンシア種(Providencia sp.)(例えばプロビデンシア・アルカリファシエンス(Providencia alcalifaciens)、プロビデンシア・レットゲリ(Providencia rettgeri)及びプロビデンシア・スツアルチイ(Providencia stuartii))、シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、プロピオニバクテリウム・アクネス(Propionibacterium acnes)、ロドコッカス・エクイ(Rhodococcus equi)、リケッチア種(Rickettsia sp.)(例えばリケッチア・リケッチイ(Rickettsia rickettsii)、リケッチア・アカリ(Rickettsia akari)及びリケッチア・プロワゼキイ(Rickettsia prowazekii)、オリエンティア・ツツガムシ(Orientia tsutsugamushi)(以前：リケッチア・ツツガムシ(Rickettsia tsutsugamushi))及びリケッチア・チフィ(Rickettsia typhi))、ロドコッカス種(Rhodococcus sp.)、セラチア・マルセセンス(Serratia marcescens)、ステノトロホモナス・マルトフィリア(Stenotrophomonas maltophilia)、サルモネラ種(Salmonella sp.)(例えばサルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、サルモネラ・チフィ(Salmonella typhi)、サルモネラ・パラチフィ(Salmonella paratyphi)、サルモネラ・エンテリティディス(Salmonella enteritidis)、サルモネラ・コレラスイス(Salmonella cholerasuis)及びサルモネラ・チフィリウム(Salmonella typhimurium))、セラチア種(Serratia sp.)(例えばセラチア・マレセンス(Serratia marescens)及びセラチア・リキファシエンス(Serratia liquifaciens))、シゲラ種(Shigella sp.)(例えば赤痢菌(シゲラ・ジセンテリア(Shigella dysenteriae))、シゲラ・フレックスネリ(Shigella flexneri)、シゲラ・ボイディ(Shigella boydii)及びシゲラ・ソネイ(Shigella sonnei))、スタフィロコッカス種(Staphylococcus sp.)(例えばスタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、スタフィロコッカス・エピデルミデス(Staphylococcus epidermidis)、スタフィロコッカス・ヘモリチクス(Staphylococcus hemolyticus)、スタフィロコッカス・サプロフィチカス(Staphylococcus saprophyticus))、ストレプトコッカス種(Streptococcus sp.)(例えば肺炎球菌(ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoniae))(例えばクロラムフェニコール耐性セロタイプ4肺炎球菌、スペクチノマイシン耐性セロタイプ6B肺炎球菌、ストレプトマイシン耐性セロタイプ9V肺炎球菌、エリスロマイシン耐性セロタイプ14肺炎球菌、オプトヒン耐性セロタイプ14肺炎球菌、リファンピシン耐性セロタイプ18C肺炎球菌、テトラサイクリン耐性セロタイプ19F肺炎球菌、ペニシリン耐性セロタイプ19F肺炎球菌、及びトリメトプリム耐性セロタイプ23F肺炎球菌、クロラムフェニコール耐性セロタイプ4肺炎球菌、スペクチノマイシン耐性セロタイプ6B肺炎球菌、ストレプトマイシン耐性セロタイプ9V肺炎球菌、オプトヒン耐性セロタイプ14肺炎球菌、リファンピシン耐性セロタイプ18C肺炎球菌、ペニシリン耐性セロタイプ19F肺炎球菌、又はトリメトプリム耐性セロタイプ23F肺炎球菌)、ストレプトコッカス・アガラクチアエ(Streptococcus agalactiae)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)、グループA連鎖球菌(ストレプトコッカス(streptococci))、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)、グループB連鎖球菌、ストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)、グループC連鎖球菌、ストレプトコッカス・アンギノサス(Streptococcus anginosus)、ストレプトコッカス・エキスミリス(Streptococcus equismilis)、グループD連鎖球菌、ストレプトコッカス・ボビス(Streptococcus bovis)、グループF連鎖球菌、及びストレプトコッカス・アンギノサス(Streptococcus anginosus)グループG連鎖球菌)、スピリルム・ミヌス(Spirillum minus)、ストレプトバチルス・モニリホルミ(Streptobacillus moniliformi)、トレポネーマ種(Treponema sp.)(例えばトレポネーマ・カラテウム(Treponema carateum)、トレポネーマ・ペテヌ(Treponema petenue)、トレポネーマ・パリズム(Treponema pallidum)及びトレポネーマ・エンデミクム(Treponema endemicum))、トロフェリマ・ウィッペリイ(Tropheryma whippelii)、ウレアプラズマ・ウレアリチカム(Ureaplasma urealyticum)、ベイロネラ種(Veillonella sp.)、ビブリオ種(Vibrio sp.)(例えばビブリオ・コレラエ(Vibrio cholerae)、ビブリオ・パラヘモリチクス(Vibrio parahemolyticus)、ビブリオ・バルニフィカス(Vibrio vulnificus)、ビブリオ・パラヘモリチカス(Vibrio parahaemolyticus)、ビブリオ・バルニフィカス(Vibrio vulnificus)、ビブリオ・アルギノリチカス(Vibrio alginolyticus)、ビブリオ・ミミカス(Vibrio mimicus)、ビブリオ・ホリサ(Vibrio hollisae)、ビブリオ・フィウビアリス(Vibrio fiuvialis)、ビブリオ・メトクニルロビイ(Vibrio metchnilrovii)、ビブリオ・ダムセラ(Vibrio damsela)及びビブリオ・フルニシイ(Vibrio furnisii))、エルシニア種(Yersinia sp.)(例えばエルシニア・エンテロコリチカ(Yersinia enterocolitica)、エルシニア・ペスチス(Yersinia pestis)、及びエルシニア・シュードツベルクロシス(Yersinia pseudotuberculosis))及びザントモナス・マルトフィリア(Xanthomonas maltophilia)のいずれか1つ以上(又はその組み合わせ)が挙げられる。

本開示方法及び組成物で使用するのに適した細菌抗原としては、細菌から単離、精製又は誘導可能なタンパク質、多糖、リポ多糖、及び外膜小胞がある。さらに、細菌抗原には、溶菌液及び不活化細菌製剤が含まれる。細菌抗原は、組換え発現により生成可能である。細菌抗原は好ましくは、その生活環の少なくとも1つの段階中に細菌の表面に露出されるエピトープを含む。細菌抗原としては、限定するものではないが、上述した細菌のみならず以下に特定する特有の抗原例の1つ以上由来の抗原が挙げられる。
淋菌(ネイセリア・ゴノルロエア(Neiserria gonorrhoeae))抗原にはPor(又はporn)タンパク質、例えばPorB(例えば、Zhu et al.(2004) Vaccine 22:660-669参照)、トランスフェリン結合タンパク質(transferring binding protein)、例えばTbpA及びTbpB(例えば、Price et al.(2004) Infect. Immun. 71(1):277-283参照)、混濁タンパク質(opacity protein)(例えばOpa)、還元修飾可能タンパク質(reduction-modifiable protein)(Rmp)、及び外膜小胞(OMV)製剤(例えば、全て参照によって組み込まれるPlante et al.(2000) J.Infect. Dis.182:848-855；WO 99/24578；WO 99/36544；WO 99/57280；及びWO 02/079243参照)が含まれる。
クラミジア・トラコマチス(Chlamydia trachomatis)抗原には、セロタイプA、B、Ba及びC(トラコーマの病原体、失明の原因)、セロタイプLi、L3(鼠径リンパ肉芽腫症と関連)、及びセロタイプD〜Kが含まれる。クラミジア・トラコーマ(Chlamydia trachomas)抗原には、WO 00/37494；WO 03/049762；WO 03/068811；及びWO 05/002619(全て参照によって組み込まれる)で同定された抗原も含まれ、PepA(CT045)、LcrE(CT089)、Art(CT381)、DnaK(CT396)、CT398、OmpH様(CT242)、L7/L12(CT316)、OmcA(CT444)、AtosS(CT467)、CT547、Eno(CT587)、HrtA(CT823)、MurG(CT761)、CT396及びCT761、並びにこれらの抗原の特定の組み合わせが挙げられる。
梅毒トレポネーマ(トレポネーマ・パリズム(Treponema pallidum)(梅毒)抗原としては、TmpA抗原がある。

本開示の組成物は、性行為感染症(STD)に由来する1種以上の抗原を含み得る。該抗原は、クラミジア、性器ヘルペス、肝炎(例えばHCV)、性器疣贅、淋病、梅毒及び／又は軟性下疳等のSTDの予防又は治療を提供することができる(参照によって組み込まれるWO 00/15255参照)。抗原は、1種以上のウイルス又は細菌STD由来であり得る。本発明に用いるウイルスSTD抗原は、例えば、HIV、単純ヘルペスウイルス(HSV-I及びHSV-2)、ヒトパピローマウイルス(HPV)、及び肝炎ウイルス(HCV)由来であり得る。本発明に用いる細菌STD抗原は、例えば、淋菌(Neiserria gonorrhoeae)、クラミジア・トラコマチス(Chlamydia trachomatis)、トレポネーマ・パリズム(Treponema pallidum)、ヘモフィルス・デュクレイ(Haemophilus ducreyi)、大腸菌(E. coli)、及びストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)由来であり得る。
いくつかの実施形態では、開示官能化表面又は電極は、上記生物の1種以上由来の1種以上の抗原を含む。いくつかの実施形態では、上記生物の1種以上由来の抗原に特異的に結合する抗体が開示官能化電極の一部であり、従っていくつかの例では、サンプル中の該抗原を検出するために用いて、例えば特定の細菌感染を診断することができる。

結合親和性：標的に対する特異的な結合因子の親和性、例えば抗原に対する抗体、標的分析物等の標的分析物に対する抗体の親和性。一実施形態では、親和性を、Frankel et al., Mo/. Immunol., 16:101-106, 1979によって記載されたスキャッチャード(Scatchard)法により計算する。別の実施形態では、結合親和性を特異的な結合作用物質受容体解離速度によって測定する。さらに別の実施形態では、高結合親和性を競合ラジオイムノアッセイによって測定する。いくつかの例では、高結合親和性(K_D)は少なくとも約1×10^-8Mである。他の実施形態では、高結合親和性は少なくとも約1.5×10^-8、少なくとも約2.0×10^-8、少なくとも約2.5×10^-8、少なくとも約3.0×10^-8、少なくとも約3.5×10^-8、少なくとも約4.0×10^-8、少なくとも約4.5×10^-8又は少なくとも約5.0×10^-8Mである。

生体分子：生体系由来のいずれもの分子であり、限定するものではないが、合成又は天然起源のタンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、アミノ酸、ヌクレオシド、ヌクレオチド、核酸、オリゴヌクレオチド、DNA、PNA、RNA、炭水化物、糖、脂質、脂肪酸、ハプテン、抗生物質、ビタミン、エンテロトキシン等が挙げられる。いくつかの例では、生体分子は、その存在及び又は濃度若しくは量を決定できる標的分析物である。いくつかの実施形態では、生体分子は、チオール若しくはジチオール化合物に共有結合しており、及び／又はクロスリンカー、例えば開示官能化金属表面、特に電極の一部であるチオール若しくはジチール化合物である。

ケモカイン：小さいサイズ(質量で約8〜10キロダルトン(kDa))及びそれらの3次元形状の形成の鍵である保存位置に4つのシステイン残基が存在すること等の共有構造特性に従って分類されるタンパク質。これらのタンパク質は、それらの標的細胞の表面で選択的に存在するケモカイン受容体と呼ばれるGタンパク質結合膜貫通受容体と相互作用することによって生物学的効果を発揮する。ケモカインはケモカイン受容体に結合するので、ケモカイン受容体リガンドである。
ケモカインの例としては、CCLケモカイン、例えばCCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCLS、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9、CCL10、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27及びCCL28；CXCLケモカイン、例えばCXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCLS、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16及びCXCL17；XCLケモカイン、例えばXCL1及びXCL2；並びにCX3CLケモカイン、例えばCX3CL1がある。いくつかの実施形態では、ケモカイン又はその部分が開示官能化電極の一部である。いくつかの実施形態では、ケモカイン又はその部分に特異的に結合する抗体が官能化電極の一部であり、従っていくつかの例では、サンプル中の該ケモカインを検出するために使用することができる。

抱合、連結、結合又は連鎖：第1の単位の第2の単位への化学的カップリング。これには、限定するものではないが、1つの分子の別の分子への共有結合、1つの分子の別の分子への非共有結合(例えば、静電的結合)、水素結合による1つの分子の別の分子への非共有結合、ファンデルワールス力による1つの分子の別の分子への非共有結合、及び該カップリングのありとあらゆる組み合わせが含まれる。いくつかの実施形態では、標的分析物用リガンドは、チオール若しくはジチオール化合物に共有結合しており、及び／又はクロスリンカーである。
接触：固体又は液体の両形態を含めた直接的物理的会合状態に置くこと。
コントロール：標準試料。いくつかの例では、コントロールは、標的分析物、例えば対象とする生体分子等の分析物の既知濃度又は量を示す既知の値であり得る。いくつかの例では、既知濃度又は量のコントロール、又は1組のコントロールを用いて官能化電極を較正することができる。
試験サンプルとコントロールとの差異は、増加又は逆に減少であり得る。差異は、質的差異又は量的差異、例えば統計的に有意な差異であり得る。いくつかの例では、差異は、コントロールに対して、少なくとも約10%、例えば少なくとも約20%, 少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約100%、少なくとも約150%、少なくとも約200%、少なくとも約250%、少なくとも約300%、少なくとも約350%、少なくとも約400%、少なくとも約500%、又は500%超の増加又は減少である。

複合体(複合型)：2種のタンパク質、又はその断片若しくは誘導体、1種のタンパク質(又は断片若しくは誘導体)及び非タンパク質化合物、分子又は任意の2種以上の化合物が、特異的様式で測定できるほど互いに会合すると複合体を形成すると言われる。いくつかの例では、複合体は、官能化電極と標的分析物との間で形成される複合体である。
共有結合：2個の原子間の原子間結合であって、これらの原子が1つ以上の電子対を共有することを特徴とする。用語「共有結合させる(covalently bound)」又は「共有結合させる(covalently linked)」は、2つの別々の分子を1つの隣接分子にすることを意味し、例えば標的分析物に特異的なリガンドとチオール又はジチオール化合物を(例えば直接又はリンカーを介して間接的に)共有結合させることができる。
クロスリンカー：生体分子内に存在する少なくとも1つの官能基、例えば光化学反応におけるスルフヒドリル基及び金属表面への共有結合を形成する別の官能基に反応性である少なくとも2つの非同一基を有するホモ又はヘテロ多官能性試薬。両官能基は、原則としてスペーサー基によって互いに隔てられている。いくつかの例では、タンパク質クロスリンカーはスルフヒドリル反応性であり、それはスルフヒドリル基、例えば生体分子内に存在するスルフヒドリル基、例えばシステイン残基上に存在するスルフヒドリル基、又は例えばアミン基を、保護されたスルフヒドリル基を有する薬剤と反応させた後に脱保護することによって導入されたスルフヒドリル基と共有結合を形成できることを意味する。

サイトカイン：ナノ乃至ピコモル濃度で体液性レギュレーターとして作用し、かつ正常又は病的のどちらの状態下でも個々の細胞及び組織の機能活性を調節する様々な可溶性タンパク質及びペプチドの一般名。これらのタンパク質はまた、細胞間の相互作用を直接媒介し、細胞外環境で起こるプロセスを制御する。サイトカインには、天然起源のペプチドと完全又は部分的生物活性を保持する変種の両方が含まれる。サイトカインはサイトカイン受容体に結合するので、サイトカイン受容体リガンドである。
サイトカインの例としては、インターロイキン、例えばIL-1a,IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10及びIL-12；インターフェロン、例えばIFN-a、IFN-(3及びIFN-y；腫瘍壊死因子、例えばTNF-a及びTNF-(3マクロファージ；炎症性タンパク質、例えばMIP-1a及びMIP-13；並びに形質転換成長因子、例えばTGF-(3が挙げられる。いくつかの例では、サイトカイン又はその部分が開示官能化電極の一部である。いくつかの実施形態では、サイトカイン又はその部分に特異的に結合する抗体が開示官能化電極の一部であり、従って開示官能化電極を用いてサンプル中のサイトカインの存在を判定することができる。

サイクリックボルタンメトリー：分析物溶液又は酵素基質ペアの酸化還元電位についての情報を得るため、例えば開示バイオセンサーに含める酵素基質ペアを選択するために使用できる電気化学技術。固定速度で2つの値間で電圧を掃引するが、電圧がV2に到達すると、走査を逆にして電圧を掃引してV1に戻す。参照電極と作用電極との間で電圧を測定し、一方で作用電極とカウンター電極との間で電流を測定する。得られた測定値を電流対電圧としてプロットする。これはボルタモグラムとしても知られる。分析物の電気化学還元電位に向かって電圧が上昇するにつれて、電流も増大する。V2に向けて電圧を上げながらこの還元電位を過ぎると、電流は下がり、酸化電位を超えたときから、ピークを形成した。電圧を逆にしてV1に向けた走査を完了するにつれて、反応は初期反応からの生成物を再び酸化し始める。これが順方向走査に比べて異極性の電流の増加をもたらすが、電圧走査がV1に向かって続くにつれて電流が再び下がって第2のピークを形成した。逆向き走査は、所与の走査速度での反応の可逆性についての情報をも提供する。所与の化合物に対するボルタモグラムの形状は、走査速度及び各吸着工程後の異なる電極表面によって左右されるのみならず、触媒濃度によって左右されることもある。

検出：作用因子(例えば信号又は標的分析物)が存在するか否かを決定すること。いくつかの例では、これはさらに定量化を含むことがある。いくつかの例では、電磁信号を用いて作用因子、例えば分析物の存在、量又は濃度を検出する。いくつかの例では、検出は間接的であり、例えば分析物が存在するときに検出可能信号の生成を触媒する酵素を使用する。他の例では、分析物が存在すると信号が低減し、その結果、分析物の濃度上昇が信号を減らす。
ジチオール基：原則としてC_1-5アルキレンジイル基で隔てられた2つのチオール又はスルフヒドリル基を表す、クロスリンカーの末端基。最も好ましくは、リポ酸誘導体の還元によって得ることができるジチオールである。

エピトープ：抗原決定基。これらは、抗原性である、すなわち、特異的免疫反応を誘発する分子上の特定の化学基又は隣接若しくは非隣接ペプチド配列である。抗体は、抗体及びマッチング(又は同族)エピトープの三次元構造に基づいて特定の抗原性エピトープに結合する。
電磁放射線：電場及び磁場の強度の同時周期変動によって伝播される一連の電磁波であり、ラジオ波、赤外、可視光、紫外(UV)光、X線及びガンマ線がある。特定例では、電磁は、電極、例えば本明細書で開示する官能化金属表面の電流変化として検出できる電子の形態である。

真菌病原体：疾患を引き起こす真菌。開示方法及び組成物に従って用いる真菌病原の例としては、限定するものではないが、紅色白癬菌(トリコフィトン・ルブルム(Trichophyton rubrum))、トリコフィトン・メンタグロフィテス(T. mentagrophytes)、エピデルモフィトン・フロッコースム(Epidermophyton floccosum)、ミクロスポルム・カニス(Microsporum canis)、ピチロスポルム・オルビクラーレ(Pityrosporum orbiculare)(マラッセジア・フルフール(Malassezia furfur))、カンジダ種(Candida sp.)(例えばカンジダ・アルビカンス(Candida albicans))、アスペルギルス種(Aspergillus sp.)(例えばアスペルギルス・フミガツス(Aspergillus fumigatus)、アスペルギルス・フラバス(Aspergillus flavus)及びアスペルギルス・クラバタス(Aspergillus clavatus))、クリプトコッカス種(Cryptococcus sp.)(例えばクリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、クリプトコッカス・ガッティ(Ciyptococcus gattii)、クリプトコッカス・ラウレンチイ(Ciyptococcus laurentii)及びクリプトコッカス・アルビズス(Ciyptococcus albidus))、ヒストプラズマ種(Histoplasma sp.)(例えばヒストプラズマ・カプスラーツム(Histoplasma capsulatum))、ニューモシスチス種(Pneumocystis sp.)(例えばニューモシスチス・ジロベシイ(Pneumocystis jirovecii))、及びスタキボトリス属(Stachybotrys)(例えばスタキボトリス・カルタルム(Stachybotrys chartarum))のいずれか1つ以上(又はその任意の組み合わせ)が挙げられる。いくつかの実施形態では、開示官能化基板又は電極は、上記1つ以上の生物の由来の1つ以上の抗原を含む。いくつかの実施形態では、上記1つ以上の生物由来の抗原に特異的に結合する抗体は、開示官能化電極の一部であり、従っていくつかの実施例では、例えば特定の真菌感染を診断するためのサンプル中の該抗原又は環境サンプル中の真菌の存在を検出するために該抗体を使用することができる。

成長因子：細胞増殖及び細胞分化を刺激できるタンパク質。成長因子の例としては、形質転換成長因子β(TGF-(3)、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、神経成長因子(NGF)、ニューロトロフィン、血小板由来成長因子(PDGF)、エリスロポエチン(EPO)、トロンボポエチン(TPO)、ミオスタチン(GDF-8)、増殖分化因子-9(GDF-9、塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF又はFGF2)、上皮成長因子(EGF)、肝細胞増殖因子(HGF)等が挙げられる。いくつかの実施形態では、成長因子又はその部分が開示官能化電極の一部である。いくつかの実施形態では、成長因子又はその部分に特異的に結合する抗体が開示官能化電極の一部であり、従っていくつかの例では、該抗体を用いてサンプル中の該成長因子を検出することができる。
異種：リンカー等の分子に関して、「異種」とは、通常は例えば単一分子として互いに関連しない分子を指す。従って、「異種」リンカーは、別の分子に付着したリンカーであり、このリンカーは通常は天然に、例えば野生型分子に付随して見られない。
ハイスループット技術：このプロセスを通じて、1つのサンプル又は複数サンプル中に存在する分析物を容易に同定することができる。特定例では、現代ロボット工学、データ加工及び制御ソフトウェア、液体取扱い装置、及び高感度検出器を併用するので、ハイスループット技術は、例えば本明細書で開示するアッセイ及び組成物を用いて、短時間で分析物の迅速な検出及び／又は定量化を可能にする。

ホルモン：ある細胞(又は細胞群)から別の細胞(又は細胞群)に信号を運ぶ小分子の分類。ホルモンの例としては、とりわけ、アミン-トリプトファン、例えばメラトニン(n-アセチル-5-メトキシトリプタミン)及びセロトニン；アミン-チロシン、例えばチロキシン(甲状腺ホルモン)、トリ-ヨードチロニン(甲状腺ホルモン)、エピネフリン(アドレナリン)、ノルエピネフリン(ノルアドレナリン)及びドーパミン；ペプチドホルモン、例えばアンチムレリアンホルモン(ムレリアン抑制因子)、アジポネクチン、副腎皮質刺激ホルモン(オルチコトロピン)、アンジオテンシノーゲン及びアンジオテンシン、抗利尿ホルモン(バソプレッシン、アルギニンバソプレッシン)、心房性ナトリウム利尿ペプチドアトリオペプチン)、カルシトニン、コレシストキニン、コルチコトロピン放出ホルモン、エリトロポエチン、ホリクル刺激ホルモン、ガストリン、グレリン、グルカゴン、ゴナドトロピン放出ホルモン、成長因子放出ホルモン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、ヒト胎盤性ラクトゲン、成長ホルモン、インヒビン、インスリン、インスリン様成長因子(ソマトメジン)、レプチン、黄体ホルモン、メラノサイイト刺激ホルモン、オキシトシン、副甲状腺ホルモン、プロラクチン、レラキシン、セクレチン、ソマトスタチン、トロンボポエチン、甲状腺刺激ホルモン及びチロトロピン放出ホルモン；ステロイド、例えばコルチゾール、アルドステロン、テストステロン、デヒドロエピアンドロステロン、アンドロステンジオン、ジヒドロテストステロン、エストラジオール、エストロン、エストリオール、プロゲステロン及びカルシトリオール(ビタミンd3)；並びにエイコサノイド、例えばプロスタグランジン、ロイコトリエン、プロスタサイクリン及びトロンボキサンが挙げられる。いくつかの実施形態では、ホルモン又はその部分が開示官能化電極の一部である。いくつかの実施形態では、ホルモン又はその部分に特異的に結合する抗体が開示官能化電極の一部である。従って、いくつかの例では、開示官能化電極を用いて該ホルモン並びにその前駆体及び類似体を検出することができる。

単離された：「単離された」生体成分(例えば生体分子)は、混合物中の他の成分から実質的に分離又は精製されている。
リガンド：対象とする分析物(例えば標的分析物)に特異的に結合するいずれもの分子、例えば抗体、タンパク質、ペプチド又は小分子(例えば標的分析物等の分析物に特異的に結合する、10キロダルトン(kDa)未満の分子質量を有する分子)。
リンカー及びクロスリンカー：2つの異なる分子を動作可能に連結するための分子ブリッジとして作用する化合物又は成分。この場合、リンカーのある部分が第1の分子に動作可能に連結され、リンカーの別の部分が第2の分子に動作可能に連結される。2つの異なる分子を段階的なやり方でリンカーに連結することができる。リンカーにはそれがその分子ブリッジとしての目的を果たすことができる限り特定のサイズ又は含量制限はない。当業者は、リンカーには、限定するものではないが、化学鎖、化合物、炭水化物鎖、ペプチド、ハプテン等が含まれることが分かる。リンカーには、限定するものではないが、ホモ二官能性リンカー及びヘテロ二官能性リンカーが含まれ得る。当業者に周知のヘテロ二官能性リンカーは、第1の分子に特異的に結び付くための第1の反応性官能基を有する一端及び第2の分子に特異的に結び付くための第2の反応性官能基を有する反対端を含有する。結び付くべき分子及び検出方法を行なう条件のような因子に応じて、リンカーは、フレキシビリティ、安定性及び特定の化学パラメーター及び／又温度パラメーターのような特性を最適化するために長さ及び組成が変動し得る。

核酸：リン酸ジエステル結合によって連結されたヌクレオチド単位(リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、その関連する天然起源の構造的変種及び非天然起源の合成類似体又はその組み合わせ)、その関連する天然起源の構造的変種及び非天然起源の合成類似体で構成されているポリマー。従って、この用語には、ヌクレオチド及びヌクレオチド間の連結が非天然起源の構成類似体、例えば、限定するものではないが、ホスホロチオエート、ホスホルアミダート、メチルホスホナート、キラル-メチルホスホナート、2-O-メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸(PNA)等を含む核酸ポリマーが含まれる。該ポリヌクレオチドは、例えば、自動DNAシンセサイザーを用いて合成可能である。用語「オリゴヌクレオチド」は典型的に短いポリヌクレオチドを指し、一般的に50ヌクレオチド未満である。ヌクレオチド配列がDNA配列(すなわち、A、T、G、C)で表されるとき、これには「U」が「T」に取って代わるRNA配列(すなわち、A、U、G、C)も含まれることが理解されよう。

本明細書では通常の表示法を用いてヌクレオチド配列を記載する：一本鎖ヌクレオチド配列の左末端は5'末端であり；二本鎖ヌクレオチド配列の右方向は5'方向と呼ばれる。新生RNA転写物への5'から3'の方向のヌクレオチドの付加は転写方向と呼ばれる。mRNAと同じ配列を有するDNA鎖は「コード鎖」と呼ばれ；当該DNAから転写されたmRNAと同じ配列を有し、かつRNA転写物の5'から5'末端に位置するDNA鎖上の配列は「上流配列」と呼ばれ；RNAと同じ配列を有し、かつコーディングRNA転写物の3'から3'末端にある配列は「下流配列」と呼ばれる。
「組換え核酸」は、天然には結合されていないヌクレオチド配列を有する核酸を指す。これには、適切な宿主細胞を形質転換するために使用できる増幅又は組織化核酸を含む核酸ベクターが含まれる。組換え核酸を含む宿主細胞は、「組換え宿主細胞」と呼ばれる。この組換え宿主細胞において遺伝子が発現されて、例えば「組換えポリペプチド」が産生される。組換え核酸は、ノンコーディング機能(例えばプロモーター、複製起点、リボソーム結合部位等)をも果たし得る。

核酸配列の配列比較のためには、典型的に、ある配列が参照配列として働き、これと試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを使用するときには、試験配列と参照配列をコンピューターに入力し、配列座標を指定し、必要に応じて配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。デフォルトプログラムパラメーターを使用する。比較のための配列アライメント方法は技術上周知である。比較のための配列の最適アライメントは、例えば、Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981の局所相同性アルゴリズムによって、又はNeedleman & Wunsch, J. Mol. Biol.48:443, 1970の相同性アライメントアルゴリズムによって、又はPearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988の類似性検索方法によって、又はこれらのアルゴリズムのコンピューター処理の実行(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.のGAP、BESTFIT、FASTA及びTFASTA)によって、又は手動アライメント及び目視検査(例えば、Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds 1995 supplement)参照)によって行なうことができる。

ヌクレオチド：核酸分子の基本単位。ヌクレオチドは、エステル結合によって1、2又は3個のリン酸基が糖部分に付着したペントース単糖に付着した窒素含有塩基を含む。
DNAの主ヌクレオチドは、デオキシアデノシン5'三リン酸(dATP又はA)、デオキシグアノシン5'三リン酸(dGTP又はG)、デオキシシチジン5'三リン酸(dCTP又はC)及びデオキシチミジン5'三リン酸(dTTP又はT)である。RNAの主ヌクレオチドは、アデノシン5'三リン酸(ATP又はA)、グアノシン5'三リン酸(GTP又はG)、シチジン5'三リン酸(CTP又はC)及びウリジン5'三リン酸(UTP又はU)である。
ヌクレオチドには、例えば米国特許US5,866,336に記載されているように、修飾された塩基、修飾された糖部分及び修飾されたリン酸骨格を含有する当該ヌクレオチドが含まれる。

その構造の任意の位置でヌクレオチドを修飾するために使用できる修飾された塩基部分の例としては、限定するものではないが、とりわけ下記：5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-クロロウラシル、5-ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、アセチル-シトシン、5-(カルボキシヒドロキシルメチル)ウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β-D-ガラクトシルクェオシン、イノシン、N-6-ソペンテニルアデニン、1-メチルグアニン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアニン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン、N6-アデニン、7-メチルグアニン、5-メチルアミノメチルウラシル、メトキシアミノメチル-2-チオウラシル、β-D-マンノシルクェオシン、5'-メトキシカルボキシメチルウラシル、5-メトキシウラシル、2-メタ-イルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸、プソイドウラシル、クェオシン、2-チオシトシン、5-メチル-2-チオウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-メチルウラシル、ウラシル-5-オキシ-酢酸メチルエステル、ウラシル-5-オキシ酢酸、5-メチル-2-チオウラシル、3-(3-アミノ-3-N-2-カルボキシプロピル)ウラシル及び2,6-ジアミノプリン 2'-デオキシグアノシンか挙げられる。
その構造の任意の位置でヌクレオチドを修飾するために使用し得る修飾された糖部分の例には、限定するものではないが、アラビノース、2-フルオロアラビノース、キシロース及びヘキソース又はリン酸骨格の修飾された成分、例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミドチオアート、ホスホルアミダート、ホスホルジアミダート、メチルホスホナート又はアルキルホスホトリエステル又はその類似体が含まれる。

神経ペプチド：特異的に神経ペプチド受容体に結合する、哺乳動物の脳内で神経細胞によって放出されるペプチド。神経ペプチドの例としては、とりわけ、メラニン細胞刺激ホルモン(a-MSH)、ガラニン様ペプチド、コカイン・アンフェタミン調節転写物(CART)、神経ペプチドY、アグーチ関連タンパク質(AGRP)、(3-エンドルフィン、ダイノルフィン、エンケファリン、ガラニン、グレリン、成長ホルモン放出ホルモン、ニューロテンシン、ニューロメジンU、ソマトスタチン、ガラニン、エンケファリン コレシストキニン、血管作動性腸ペプチド(VIP)及びサブスタンスPが挙げられる。いくつの実施形態では、神経ペプチド又はその部分が開示官能化電極の一部である。いくつかの実施形態では、神経ペプチド又はその部分に特異的に結合する抗体が官能化電極の一部であり、従っていくつかの例では、該抗体を用いてサンプル中の該ペプチドを検出することができる。
オリゴヌクレオチド：約100ヌクレオチド塩基長までの線形ポリヌクレオチド配列。

寄生虫：宿主(寄生虫のための)として作用するヒトその他の生物内で生息する生物。寄生虫は、それらの生活環の少なくとも一部についてそれらの宿主に依存している。寄生虫は、必要な食物を消費し、体の組織及び細胞をむしばみ、人々を病気にする毒性廃棄物を排泄するのでヒトに有害である。開示方法及び組成物に従って用いる寄生虫の例としては、限定するものではないが、マラリア(熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)、三日熱マラリア原虫(P vivax)、四日熱マラリア原虫(P malariae))、住血吸虫(Schistosomes)、トリパノソーマ(Trypanosomes)、リーシュマニア(Leishmania)、フィラリア性線虫、トリコモナス症(Trichomoniasis)、肉胞子虫症(Sarcosporidiasis)、条虫(無鉤条虫(T. saginata)、有鉤条虫(T. solium))、トキソプラズマ・ゴンディ(Toxoplasma gondii)、施毛虫症(Trichinelosis)(トリキネラ・スピラリス(Trichinella spiralis))又はコクシジウム症(Coccidiosis)(エイメジア種(Eimedia species))のいずれか1つ以上(又はその組み合わせ)が挙げられる。従っていくつかの実施形態では、開示官能化電極が上記1種以上の生物由来の1種以上の抗原を含む。いくつかの実施形態では、上記1種以上の生物由来の抗原に特異的に結合する抗体が開示官能化電極の一部である。従っていくつかの例では、開示官能化電極を用いてサンプル中の該寄生虫を検出して、例えば、特定の寄生虫感染を診断することができ、又は環境サンプル中の寄生虫の存在を検出することができる。

光開始剤：UV光で照射されると別々のラジカル基に切断される有機分子又は有機基。好ましくは1-ベンゾイル-1-メチル-エタノール部分を示すα-ヒドロキシ-、α-アルコキシ-又はα-アミノ-アリールケトン由来の該分子又は基が好ましく；最も好ましい光開始剤は、2-ヒドロキシ-4’-(2-ヒドロキシエトキシ)-2-メチルプロピオフェノン及び2,2-ジメトキシ-2-フェニルフェノンである。「光開始剤の存在下」とは、光開始剤が、光反応前に溶液の形態で添加されるか又は例えば米国特許US 8,580,571によって開示されているように金属表面に以前に付着していることを意味する。
ポリペプチド：モノマーであるアミノ酸残基がアミド結合を介して結合してるポリマー。アミノ酸がa-アミノ酸であるとき、L-光学異性体又はD-光学異性体のいずれも使用することができる。本明細書で使用する用語「ポリペプチド」又は「タンパク質」は、いずれのアミノ酸配列をも包含し、糖タンパク質等の修飾された配列を含める意図である。「ポリペプチド」は、天然起源のタンパク質のみならず、組換え又は合成により生成されるタンパク質をも包含する。「残基」又は「アミノ酸残基」には、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドに組み込まれるアミノ酸も含まれる。

精製された：用語「精製された」は、絶対的な純度を必要とせず；むしろ、それは相対的用語のつもりである。従って、例えば、精製されたペプチド、タンパク質、結合体、又は他の化合物は、混合物のタンパク質又は他の成分から全体的又は部分的に単離されているものである。一般的に、本開示の範囲内で用いる実質的に精製されたペプチド、タンパク質、結合体、又は他の活性化合物は、ペプチド、タンパク質、結合体又は他の活性化合物の医薬担体、賦形剤、緩衝液、吸収増強剤、安定剤、保存剤、アジュバント又は他の共成分との混合又は製剤前のプレパレーション中に存在する全ての巨大分子種の80%超を構成する。さらに典型的には、ペプチド、タンパク質、結合体又は他の活性化合物が精製されて、他の製剤成分との混合前の精製されたプレパレーション中に存在する全ての巨大分子種の90%超、多くの場合95%超となる。他の場合には、精製されたプレパレーションが本質的に均質であり、通常の技術では他の巨大分子種は検出できない。

定量化：分子の量(例えば相対量)又は分子の活性、例えば分析物、例えばサンプル中に存在する標的分析物の量を決定又は測定すること。
サンプル：分析すべき物質。一実施形態では、サンプルは生体サンプルである。別の実施形態では、サンプルは環境サンプル、例えば土壌、沈降水、又は空気である。環境サンプルは、産業発生源、例えば農場、廃棄物流、又は水源から得られる。生体サンプルは、生体物質(例えば核酸及びタンパク質)を含むサンプルである。いくつかの例では、生体サンプルは、生物又はその一部、例えば動物から得られる。特定実施形態では、生体サンプルは動物対象、例えばヒト対象から得られる。生体サンプルは、限定するものではないが、多細胞有機体(例えば、動物)を含めた任意の生存有機体から得られ、或いは任意の生存有機体によって排泄又は分泌されたいずれの固体又は流体サンプルであってもよい(健康な若しくは見掛けは健康そうなヒト対象又は診断若しくは調査すべき癌等の状態若しくは疾患を患うヒト患者からのサンプルを含む)。例えば、生体サンプルは、例えば、血液、血漿、血清、尿、胆汁、腹水、唾液、脳脊髄液、眼房水若しくは硝子体液、又はいずれもの体分泌物、漏出液、滲出液から得られる生物学的流体(例えば、膿瘍又はいずれかの他の感染若しくは炎症部位から得られる流体)、又は関節(例えば、正常関節又は関節リウマチ、変形性関節症、痛風若しくは化膿性関節炎等の疾患を患う関節)から得られる流体であってよい。生体サンプルは、いずれの器官又は組織から得られるサンプル(生検又は剖検試料、例えば腫瘍生検を含む)であってもよく、或いは細胞(初代細胞であれ、培養細胞であれ)或いはいずれかの細胞、組織又は器官によって条件付けされた媒体を含むこともある。いくつかの例では、生体サンプルが細胞溶解物、例えば対象の腫瘍から得た細胞溶解物である。

スペーサー基：2つの末端反応基を隔てる、クロスリンカー内の基。照射すると、反応基の一方は金属表面に結合し、他方は生体分子のスルフヒドリル基に結合する。スペーサー基は、好ましくはC_5-30アルキレン-ジ-1,ω-イル基であり、1つ以上の非隣接CH₂基がそれぞれ独立にO、S、NH、NR、NR-CO、CO-NR、O-CO及びCO-O（Rは、水素又はC_1-6アルキルを表す）から選択される基と置き換わっていてもよい。ポリエチレングリコール(PEG)基は、該スペーサー基の好ましい成分である。
特異的結合因子：実質的に規定標的のみに結合する因子。従って、抗原に特異的である抗体等の抗原結合因子は、実質的に特異的抗原又はその断片に結合する因である。いくつかの例では、特異的結合因子は、特異的抗原又はその抗原性断片、例えば標的分析物に特異的に結合するモノクロナール又はポリクロナール抗体である。他の例では、特異的結合因子は、抗原に特異性の抗体に特異的に結合する抗原である。いくつかの例では、特異的結合因子は、酵素、例えば酵素基質の反応を触媒して電気活性産物にする酵素に結合される。
対象：ヒト及び獣医学の両対象、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、ブタ、及びウシ、並びにさらに食糧生産分野の対象、例えばニワトリ又は魚類、例えばサケ、マグロ又はマスが含まれる。食糧生産分野の他の重要な対象は植物材料である。

基質：酵素により作用される分子。基質が酵素の活性部位と結合し、酵素・基質複合体が形成される。いくつかの例では、酵素基質が酵素によって電気活性産物に変換される。
チオール：硫黄-水素結合又はスルフヒドリル基(S-H)を含有する有機硫黄化合物。チオールは、アルコールの硫黄類似体である。S-H官能基は、チオール基又はスルフヒドリル基と呼ばれることがある。チオールは、一般化学式R-S-Hを有する。いくつかの例では、S-H基は、導電性表面等の表面と反応することによって該表面に結合することができる。

腫瘍抗原：腫瘍抗原は、腫瘍特異性T細胞免疫応答を刺激できる腫瘍細胞によって産生される抗原である。例示腫瘍抗原としては、限定するものではないが、RAGE-1、チロシナーゼ、MAGE-1、MAGE-2、NY-ESO-1、メラン-A/MART-1、糖タンパク質(gp)75、gp100、βカテニン、メラノーマ優先発現抗原(PRAME)、MUM-1、ウィルムス腫瘍(WT)-1、癌胎児抗原(CEA)、及びPR-1が挙げられる。当技術分野ではさらなる腫瘍抗原が知られており(例えばNovellino et al., Cancer Immunol.Immunother.54(3):187-207, 2005参照)、それについては後述する。腫瘍抗原は、「癌抗原」とも呼ばれる。腫瘍抗原は、技術上周知のいずれの腫瘍関連抗原であってもよく、例えば、癌胎児抗原(CEA)、(3-ヒト絨毛性ゴナドトロピン、αフェトプロテイン(AFP)、レクチン反応性AFP、サイログロブリン、RAGE-1、MN-CA IX、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、RU1、RU2(AS)、腸管カルボキシルエステラーゼ、mut hsp70-2、マクロファージコロニー刺激因子、プロスターゼ(prostase)、前立腺特異抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGE-la、p53、プロステイン(prostein)、PSMA、Her2/neu、サバイビン及びテロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原-1、MAGE、ELF2M、好中球エラスターゼ、エフリンB2、CD22、インスリン様成長因子(IGF)-I、IGF-II、IGF-I受容体及びメソテリンが挙げられる。
いくつかの実施形態では、腫瘍抗原又はその部分が開示官能化電極の一部である。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原又はその部分に特異的に結合する抗体が開示官能化電極の一部である。従って、いくつかの例では、開示官能化電極を用いてサンプル中の該抗原を検出し、例えば癌を診断することができる。

ウイルス：生細胞内で増殖する顕微鏡レベルの感染性生物。ウイルスは本質的に、タンパク質外被で囲まれた核酸コアから成り、生細胞内でのみ複製する能力を有する。「ウイルス複製」は、少なくとも1つのウイルス生活環の存在によってさらなるウイルスを産生することである。ウイルスは、宿主細胞の正常な機能を絶滅させて、該ウイルスによって決められた様式で細胞が振る舞うようにすることができる。例えば、ウイルス感染は、非感染細胞が通常はサイトカインを産生しないのに、サイトカインを産生する、又はサイトカインに応答する細胞を生じさせ得る。いくつかの例では、ウイルスは病原である。ウイルスの別の形態がプリオンである。

開示方法及び組成物に従って用いるウイルス病原の具体例としては、限定するものではないが、とりわけ、アレナウイルス(例えばグアナリトウイルス、ラッサウイルス、フニンウイルス、マチュポウイルス及びサビアウイルス)、アルテリウイルス、ロニウイルス(Ronivirus)、アストロウイルス、ブニヤウイルス(例えばクリミア・コンゴ出血熱ウイルス及びハンタウイルス)、バルナウイルス(Barnavirus)、ビルナウイルス、ボルナウイルス(例えばボルナ病ウイルス)、ブロモウイルス、カリシウイルス、クリソウイルス(Chrysovirus)、コロナウイルス(例えばコロナウイルス及びSARS)、シストウイルス、クロステロウイルス、コモウイルス、ジシストロウイルス(Dicistroviruses)、フラウイルス(Flavirus)(例えば黄熱病ウイルス、ウエストナイルウイルス、C型肝炎ウイルス、及びデング熱ウイルス)、フィロウイルス(例えばエボラウイルス及びマールブルグウイルス)、フレキシウイルス(Flexivirus)、ヘペウイルス(例えばE型肝炎ウイルス)、ヒトアデノウイルス(例えばヒトアデノウイルスA-F)、ヒトアストロウイルス、ヒトBKポリオーマウイルス、ヒトボカウイルス、ヒトコロナウイルス(例えばヒトコロナウイルスHKU1、NL63、及び0C43)、ヒトエンテロウイルス(例えばヒトエンテロウイルスA-D)、ヒトエリスロウイルスV9、ヒトフォーミーウイルス、ヒトヘルペスウイルス(例えばヒトヘルペスウイルス1(単純ヘルペスウイルス1型)、ヒトヘルペスウイルス2(単純ヘルペスウイルス2型)、ヒトヘルペスウイルス3(水痘帯状疱疹ウイルス)、ヒトヘルペスウイルス4型1(human herpesvirus 4 type 1)(エプスタイン・バーウイルス1型(Epstein-Barr virus type 1)、ヒトヘルペスウイルス4型2(human herpesvirus 4 type 2)(エプスタイン・バーウイルス2型)、ヒトヘルペスウイルス5株AD169、ヒトヘルペスウイルス5株メルリン(Merlin)株、ヒトヘルペスウイルス6A、ヒトヘルペスウイルス6B、ヒトヘルペスウイルス7、ヒトヘルペスウイルス8型M、ヒトヘルペスウイルス8型P及びヒトサイトメガロウイルス)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)(例えばHIV 1及びHIV 2)、ヒトメタニューモウイルス、ヒトパピローマウイルス、ヒトパラインフルエンザウイルス(例えばヒトパラインフルエンザウイルス1-3)、ヒトパレコウイルス(human parechovirus)、ヒトパルボウイルス(例えばヒトパルボウイルス4及びヒトパルボウイルスB19)、ヒト呼吸器多核体ウイルス、ヒトライノウイルス(例えばヒトライノウイルスA及びヒトライノウイルスB)、ヒトスプマレトロウイルス(human spumaretrovirus)、ヒトTリンパ好性ウイルス(例えばヒトTリンパ好性ウイルス1及びヒトTリンパ好性ウイルス2)、ヒトポリオーマウイルス、ハイポウイルス(Hypovirus)、レビウイルス、ルテオウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス(LCM)、マルナウイルス(Marnavirus)、ナルナウイルス(Narnavirus)、ニドウイルス目(Nidovirales)、ノダウイルス、オルソミクソウイルス(例えばインフルエンザウイルス)、パルチチウイルス(Partitivirus)、パラミクソウイルス(例えば麻疹ウイルス及び流行性耳下腺炎ウイルス)、ピコルナウイルス(例えばポリオウイルス、風邪ウイルス、及びA型肝炎ウイルス)、ポティウイルス、ポックスウイルス(例えば痘瘡および牛痘)、セキウイルス、レオウイルス(例えばロタウイルス)、ラブドウイルス(例えば、狂犬病ウイルス)、ラブドウイルス(例えば水疱性口内炎ウイルス)、テトラウイルス(Tetravirus)、トガウイルス(例えば風疹ウイルス及びロスリバーウイルス)、トムブスウイルス、トティウイルス、ティモウイルス、並びにノロウイルスのいずれか1つ以上(又はその組み合わせ)が挙げられる。

ウイルス抗原は、C型肝炎ウイルス(HCV)由来であり得る。HCV抗原は、非構造領域からのEl、E2、El/E2、NS345ポリタンパク質、NS345コアポリタンパク質、コア及び／又はペプチドの1つ以上から選択され得る(参照によって組み込まれるHoughton et al.(1991) Hepatology 14:381-388)。
ウイルス抗原は、ヒトヘルペスウイルス、例えば単純ヘルペスウイルス(HSV)、水痘帯状疱疹ウイルス(VZV)、エプスタイン・バーウイルス(EBV)、又はサイトメガロウイルス(CMV)由来であり得る。ヒトヘルペスウイルス抗原は、最初期タンパク質、初期タンパク質、及び後期タンパク質から選択され得る。HSV抗原は、HSV-I又はHSV-2株由来であってよい。HSV抗原は、糖タンパク質gB、gC、gD及びgH、又は免疫エスケープ(immune escape)タンパク質(gC、gE、又はgl)から選択され得る。VZV抗原は、コア、ヌクレオカプシド、テグメント、又はエンベロープタンパク質から選択され得る。弱毒生VZVワクチンは商業的に入手可能である。EBV抗原は、初期抗原(EA)タンパク質、ウイルスカプシド抗原(VCA)、及び膜抗原(MA)の糖タンパク質から選択され得る。CMV抗原は、カプシドタンパク質、エンベロープ糖タンパク質(例えばgB及びgH)、及びテグメントタンパク質から選択され得る。例示ヘルペス抗原としては、ヒトヘルペスウイルス1(単純ヘルペスウイルス1型)(NC 001806)、ヒトヘルペスウイルス2(単純ヘルペスウイルス2型)(NC 001798)、ヒトヘルペスウイルス3(水痘帯状疱疹ウイルス)(NC 001348)、ヒトヘルペスウイルス4型1(エプスタイン・バーウイルス1型)(NC 007605)、ヒトヘルペスウイルス4型2(エプスタイン・バーウイルス2型)(NC 009334)、ヒトヘルペスウイルス5株AD169(NC 001347)、ヒトヘルペスウイルス5株メルリン(Merlin)株(NC 006273)、ヒトヘルペスウイルス6A(NC 001664)、ヒトヘルペスウイルス6B(NC 000898)、ヒトヘルペスウイルス7(NC 001716)、ヒトヘルペスウイルス8型M(NC 003409)、及びヒトヘルペスウイルス8型P(NC 009333)由来のもの(GENBANK(商標)、カッコ内受入番号)が挙げられる。

ヒトパピローマウイルス(HPV)抗原は技術上周知であり、例えばHPV E6及びE7タンパク質、特にE6及びE7の両タンパク質に欠失があるE6/E7の融合タンパク質の変種を開示する国際特許公開第W096/19496号(参照によってその全体が組み込まれる)で見つけられる。HPV L1に基づく抗原は、全て参照によって組み込まれる国際特許公開第W094/00152号、第W094/20137号、第W093/02184号及び第W094/05792号に開示されている。該抗原には、モノマー、カプソメア又はウイルス様粒子としてのLl抗原が含まれ得る。該粒子は、さらにL2タンパク質を含み得る。他のHPV抗原は、初期タンパク質、例えばE7又は融合タンパク質、例えばL2-E7である。例示HPV抗原には、ヒトパピローマウイルス-1(NC 001356)、ヒトパピローマウイルス-18(NC 001357)、ヒトパピローマウイルス-2(NC 001352)、ヒトパピローマウイルス-54(NC 001676)、ヒトパピローマウイルス-61(NC 001694)、ヒトパピローマウイルス-cand90(NC 004104)、ヒトパピローマウイルスRTRX7(NC 004761)、ヒトパピローマウイルス10型(NC 001576)、ヒトパピローマウイルス101型(NC 008189)、ヒトパピローマウイルス103型(NC 008188)、ヒトパピローマウイルス107型(NC 009239)、ヒトパピローマウイルス16型(NC 001526)、ヒトパピローマウイルス24型(NC 001683)、ヒトパピローマウイルス26型(NC 001583)、ヒトパピローマウイルス32型(NC 001586)、ヒトパピローマウイルス34型(NC 001587)、ヒトパピローマウイルス4型(NC 001457)、ヒトパピローマウイルス41型(NC 001354)、ヒトパピローマウイルス48型(NC 001690)、ヒトパピローマウイルス49型(NC 001591)、ヒトパピローマウイルス5型(NC 001531)、ヒトパピローマウイルス50型(NC 001691)、ヒトパピローマウイルス53型(NC 001593)、ヒトパピローマウイルス60型(NC 001693)、ヒトパピローマウイルス63型(NC 001458)、ヒトパピローマウイルス6b型(NC 001355)、ヒトパピローマウイルス7型(NC 001595)、ヒトパピローマウイルス71型(NC 002644)、ヒトパピローマウイルス9型(NC 001596)、ヒトパピローマウイルス92型(NC 004500)、及びヒトパピローマウイルス96型(NC 005134)由来のもの(GENBANK(商標)、括弧内は受入番号)が挙げられる。

ウイルス抗原は、レトロウイルス、例えばオンコウイルス、レンチウイルス又はスプーマウイルス由来であってよい。オンコウイルス抗原は、HTLV-I、HTLV-2又はHTLV-5由来であり得る。レンチウイルス抗原は、HIV-1又はHIV-2由来であり得る。レトロウイルス抗原は、gag、pol、env、tax、tat、rex、rev、nef、vif、vpu、及びvprから選択され得る。HIVに対する抗原は技術上周知であり、例えばHIV抗原は、gag(p24gag及びp55gag)、env(gp160及びgp41)、pol、tat、nef、rev vpu、ミニタンパク質、(p55 gag及びgp140v)から選択される得る。HIV抗原は、下記株の1つ以上に由来してよい：HIVmb、HIV；HIVLAV、HIVLAI、HIVM N、HIV-1 CM235、HIV-1 US4。HIV抗原の例は、国際特許公開第WO 09/089,568号、第WO 09/080,719号、第WO 08/099,284号、及び第WO 00/15255号、並びに米国特許第7,531,181号及び第6,225,443号で見つけられる。これらは全て参照によって組み込まれる。例示HIV抗原としては、ヒト免疫不全ウイルス1(NC 001802)、ヒト免疫不全ウイルス2(NC 001722)由来のもの(GEN-BANK(商標)、括弧内受入番号)が挙げられる。

いくつかの実施形態では、開示官能化電極は、上記1つ以上のウイルス由来の1つ以上の抗原を含む。いくつかの実施形態では、上記1つ以上のウイルス由来の抗原に特異的に結合する抗体が官能化電極の一部である。従っていくつかの例では、開示官能化電極を用いてサンプル中の該ウイルスを検出し、例えばウイルス感染を診断するか又は環境サンプル中のウイルスの存在を検出することができる。
電気化学センサーの一般的性能は、感知要素をナノメートルスケールで生体サンプルに接続する表面アーキテクチャーによって決まることが多い。電気化学センサーは、所望の生化学事象による応答の十分高い感度及び独特の同定を可能にする表面アーキテクチャーの欠如に悩まされている。

種々の以前の試みは、安定性及び非特異的生体分子吸着への耐性等の自己組織化単分子膜の望ましい特性のため長鎖自己組織化単分子膜（self-assembled monolayer）(SAM)からバイオセンサーを作り出そうとしてきた。しかしながら、長鎖アルキルに基づく電気化学センサーは、電子伝達に対するそれらの低い透過性のため適用性が限定されることに悩まされてきた(例えばFragoso et al., Anal. Chem., 80:2556-2563, 2008参照)。長鎖SAMに存在する認知された限界を克服するめの試みにおいて、Fragosoらは、低絶縁であると考えられるジチオールに注意を向けた。しかしながら、低絶縁単分子層に変えることによって、長鎖SAMを用いる1つの利点が失われる。すなわち、非特異的電子伝達に対する選択性の損失が、センサーの雑音に対する信号を低下させ、ひいては感度を低下させる。
SAMの使用に対する別の欠点は、それらがイオン性絶縁体であり、電気化学センサーの根底にある導電性材料に電子を伝達及び導電性材料から電子を伝達するためにイオンは容易にはSAMを透過できないことである(例えばBoubour and Lennox, Langmuir 16:42224228, 2000参照)。非特異的電子伝達の制限という観点からはSAMの絶縁特性は望ましいが、対象とする分析物のための選択的イオン伝達の非存在下では、SAMは電気化学センサーの構成要素としての使用が制限される。

本明細書で開示するように、電気活性であり、電子伝導表面への単分子層経由の電子伝達を促進できる酵素反応生成物の選択と相まって非特異的電子伝達に向けたそれらの絶縁特性を保持するチオール又はジチオール化合物の慎重な選択によって、長鎖チオール含有SAMからセンサーを作り出すための以前の試みに存在する制限が克服された。従って、本明細書に開示するように、驚くべきことに、高い信号対雑音をもたらす等のSAMに基づく有益な絶縁特性を、高い選択性及び感度と共に保持する官能化電極を形成できることが分かった。
本明細書ではキットをも提供する。対象とする分析物を検出するためのキットは、1つ以上の開示バイオセンサーを含有する。いくつかの実施形態では、キットは、対象とする分析物の検出手段を開示する説明書を含有する。説明書は電子形態で書かれてもよく(例えばコンピューターディスケット又はコンパクトディスク)、ビジュアル的であってもよい(例えばビデオファイル)。キットは、電気活性反応生成物を有する検出試薬及び基質をも含有する。キットは、キットがそのためにデザインされる特定用途を容易にするための追加成分を含有することもある。従って、例えば、キットはさらに、特定の方法の実施に日常的に用いられる緩衝液及び他の試薬を含有し得る。該キット及び適切な内容物は技術上周知である。いくつかの例では、キットは、例えばキットに含まれるバイオセンサーを較正する手段としてコントロール、例えば既知量又は濃度の標的分析物を含有するコントロール溶液を含有する。キットは、自動アッセイ試験、及び自動データ収集用のコンポーネントを含有し得る。これらは迅速なポイントオブケア設定(point-of-care setting)に有用であろう。

本発明の方法の好ましい実施形態は、
(A)クロスリンカー化合物は、下記式(I)の化合物であり、
HS-(CH₂)_m-CH(ZH)-SPACER-(CH₂)_p-A (I)
（式中、
mは、2〜6の整数、特に2〜4の整数であり、
Aは、-CH=CH₂及び-C≡CH、特に-CH=CH₂から選択され、かつ
Zは、S又は単結合、特にSであり、
SPACERは、下記式
-(CH₂)_n-(C=O)_x-Y-(CH₂CH₂-O)_y-(CH₂)_r-(C=O)_v-X-
の基であり、
ここで、
X及びYは、それぞれ独立にNH又はOであり、
nは、0又は1〜10の整数、特に2〜6の整数、最も好ましくは4であり、
x及びvは、それぞれ独立に0又は1、特に1であり、
yは、1〜20の整数、特に4〜18の整数であり、
r及びpは、それぞれ独立に1〜6の整数、特に1から選択され；
ポリエチレングリコール基(PEG)-(CH₂CH₂-O)_y-は、規定数yのエチレンオキシド単位、特に4〜18単位、最も好ましくは8〜16単位を含有するか、又は0.5〜10kDa、特に2〜8kDa、最も好ましくは約5kDaの平均分子質量を有する不確定数のエチレンオキシド単位を含有する）；
(B)生体分子は抗体、酵素又は核酸、特にモノクロナール抗体であり；
(C)光開始剤は1-ベンゾイル-1-メチル-エタノール誘導体、特に水溶性の1-ベンゾイル-1-メチル-エタノール誘導体、最も好ましくは2-ヒドロキシ-4-(2-ヒドロキシエトキシ)-2-メチルプロピオフェノンであり；
(D)照射を300〜340nm、特に約320nmの波長λ_maxで行なう
方法である。

さらに、本発明は、式(I)の新規化合物、好ましくは式(I)の化合物が下記式(IA)：
HS-(CH₂)_m-CH(SH)-SPACER-CH₂-A (IA)
（式中、A及びSPACERは、式(I)について与えた意味を有し、かつ
mは、2〜4の整数、特に2であり、
式(IA)のSPACERは、好ましくは下記式
-(CH₂)_n-(C=O)-NH-(CH₂CH₂-O)_y-CH₂-(C=O)-NH-
の基であり、
ここで、
nは、0又は1〜10の整数、特に2〜6の整数、最も好ましくは4であり、
yは、1〜20の整数である）
の化合物である。

最も好ましくは、リポ酸(liponic acid)から、特にR-α-リポ酸から、-S-S-結合の還元によって得られる下記式(IB)：
HS-(CH₂)₂-CH(SH)-(CH₂)₄-(C=O)-NH-(CH₂CH₂-O)_y-CH₂-(C=O)-NH-CH₂-A (IB)
（式中、A及びyは、式(I)について与えた意味を有する）
の化合物である。
式(IA)及び(B)の好ましい化合物は、下記反応スキームIに従って合成可能である。
反応スキームI

工程1)及び工程2)において、エステル化反応又はアミド形成反応の条件下で対応酸をアルコール(Y又はX=O)又はアミン(Y又はX=NH)で処理する。該反応条件は当業者に周知である。例えばN-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)若しくは塩化チオニルによる処理によって酸を活性化し、及び／又は反応中に生じる水を脱水剤で不可逆的に捕捉する。
最も好ましくはN-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)、ナトリウムN-ヒドロキシスルホスクシンイミド、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBT)、1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール(HOAT)又はペンタフルオルフェノール及びジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)又は1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)の存在下で酸をアルコール又はアミドで処理する。
工程3)において、還元剤、特にDTT(ジチオスレイトール)、メルカプトエタノール、トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)及び／又はDTE(ジチオエリスリトール)で処理してジスルフィド結合を還元的に開裂する。
XがSであり、vが0である、式Iの好ましい化合物は、下記反応スキームIIに従って調製可能である。
反応スキームII

保護基PGは、アミノ又はヒドロキシル基の保護に適した基である。該保護基及び脱保護方法(工程2)は当業者に周知である。T. W. Green, P. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, Wiley-Interscience, New York, 1999と比較されたい。アミノ基に最も好ましい保護基は、例えば、9-フルオレニル-メチルカルバマート、(FMOCアミノ)、t-ブチルカルバマート(BOCアミノ)、ベンジルカルバマート、アセトアミド、トリフルオロアセトアミド、ベンジルアミン及びトリチルアミンである。ヒドロキシに最も好ましい保護基は、例えばメトキシメチルエーテル、テトラヒドロピラニルエーテル、t-ブチルエーテル、ベンジルエーテル、トリヒドロカルビルシリルエーテル、例えばt-ブチルジメチルシリルエーテル又はt-ブチルジフェニルシリルエーテルである。
工程3)の置換反応は、原則としてアルカリ金属水酸化物、好ましくは水酸化ナトリウム若しくは水酸化カリウム、又は三級アミン、好ましくはトリエチルアミン若しくは2,2,6,6-テトラメチルピペリジン等の塩基の存在下で行なう。
工程4は、反応スキーム1、工程3)についての記載に類似して実施可能である。
従って、式(II)の新規リポ酸誘導体は、式(I)、(IA)及び(IB)の化合物の調製用中間体として本発明の別の主題である。
下記式(IIA)の化合物

特に下記式(IIA1)の化合物

が最も好ましく、
式中、SPACER、A及びpは、式(I)について与えた意味を有する。

実施例
下記非限定例を参照して本開示を説明する。
略語
AcOH 酢酸
approx. 約
℃ 摂氏度
DCC ジシクロヘキシルカルボジイミド
DCM ジクロロメタン
DTT ジチオスレイトール
kDa キロダルトン
MeCN アセトニトリル
MeOH メタノール
mL ミリリットル
mM ミリモル濃度
NHS N-ヒドロキシスクシンイミド
PEG-アルケン メトキシポリ(エチレングリコール)アルケン
PEG-アルキン メトキシポリ(エチレングリコール)アルキン
rpm 毎分回転数
λ 波長
TCEP トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン
TEA トリエチルアミン
TFA トリフルオロ酢酸

SH-PEG-アルケン/-アルキンクロスリンカーの合成
診断用生体分子の、PEG-アルケン/-アルキンクロスリンカーによるマイクロチップへのカップリングのため800Da及び5000Daの平均分子量を有するPEG-アルケン分子及びPEG-アルキン分子を合成した。さらに、アルケン又はアルキンで官能化しない600DaのSH-mPEGを合成した。この分子は、チップ表面上の官能基の均一な統計学的分布を得るため、金属表面のコーティング中のPEG-アルケン/-アルキンクロスリンカーの希釈に使用することができる。

実験
RP-HPLC−RP-HPLC分析は、ELSD検出器及びフォトダイオードアレイ検出器を備えたWaterアライアンスシステムで行なった。XBridge(商標) BEH300 4.6×250mm 5μm RP18カラムを使用した。HPLC-H₂O(+0.1%TFA)及びHPLC-MeCN(+0.1%TFA)をグラジエントHPLCの溶出剤として使用した。
NMR−NMR分光法のため、30〜60mgの分析物を600μLのCDCl3に溶かしてNMRバイアルに移した。Varian Mercury-400BBを(1H、400MHz；13C、100.6MHz)で又はVarian Mercury-300BBを(1H、300MHz；13C、75.5MHz)で用いて分光法を行なった。化学シフトはppmで示し、溶媒信号に較正した。
MALDI-TOF-MS−Aximaコンフィデンスシステム(Shimadzu)でα-シアノ-4-ヒドロキシ-ケイ皮酸(CHCA)マトリックスを用いて線形モードでMALDI-TOF-MS分析を行なった。
撹拌−マグネチックスターラーバーを全ての反応混合物及び結晶化懸濁液に添加してそれらをMR3001 K(Heidolph)マグネチックスターラーで撹拌した。
エバポレーション及び乾燥−Vacuum Pump Unit PC510(Vacuubrand)及び温度40℃の水浴を備えたLaborota 4000-効率的(Heidolph)ロータリーエバポレーターを用いて減圧下で溶媒を除去して乾固させた。同手順を材料の乾燥に用いた。
クロマトグラフィー−クロマトグラフィーは、ガラスカラムに詰めた40〜63μmのシリカゲルを用いて異なる典型的有機溶媒の混合物で行なった。手動でフラクションを収集してTLCで分析した。純粋生成物含有フラクションを混ぜ合わせて減圧下で溶媒を除去した。
TLC−TLCシリカゲル60 F254アルミニウムシートで典型的有機溶媒の異なる混合物を用いてTLC分析を行なった。過マンガン酸カリウム水溶液を染色試薬として用いた。

実施例1.1.
R-α-リポ酸-PEG12-アリル(B)の合成

工程1：40mLのDCM中R-α-リポ酸(668mg,3.24mmol)の溶液にDCC(1.00g,4.86mmol)及びNHS(599mg,4.86mmol)を加え、得られた混合物を室温で1時間撹拌した。沈殿したジシクロヘキシル尿素を濾過で除去し、10mLのDCMで2回洗浄した。得られた清澄黄色反応混合物にNH₂-PEG12-COOH(2.00g,3.24mmol)及びTEA(900μL, 6.48mmol)を加えた。反応混合物を室温で2.5時間撹拌した。引き続き減圧下で溶媒を除去した。得られた残留物のクロマトグラフィー(35gのシリカゲル(40〜63μm) DCM/MeOH−98:2→90:10、+0.1%のAcOH)による精製後に76%の収率を示す1.99gの生成物(A)を得た。RP-HPLC分析によれば、生成物は約3.3%のリポ酸及び2.8%に達する特定できない不純物を含有した。全体的純度は約94%だった。

工程2：工程1で得た生成物(A)(1.20g,1.49mmol)の20mLのDCM中の溶液にDCC(461mg,2.23mmol)及びNHS(257mg,2.23mmol)を加え、得られた反応混合物を室温で1時間撹拌した。沈殿したジシクロヘキシル尿素を濾過で除去し、5mLのDCMで2回洗浄した。得られた清澄黄色反応混合物にアリルアミン(224μL,2.98mmol)及びTEA(415μL,2.99mmol)を加えた。反応混合物を室温で17時間撹拌し、引き続き20mLの水で洗浄した。有機相を減圧下で濃縮し、得られた固体をクロマトグラフィー(15gのシリカゲル(40〜63μm) DCM/MeOH−98:2→95:5)で精製した。63%の収率を示す796mgの生成物CES0594を得た。RP-HPLC分析(図2)によれば、生成物は＞99%の純度を有した。(B)の分子量及び同一性は、MALDI-MS及びNMRにより確認した。

実施例1.2.
R-α-リポ酸-PEG12-プロパルギル(C)の合成

実施例1.1.の工程1で得た生成物(A)(1.52g,1.89mmol)の40mLのDCM中の溶液に、DCC(592mg,2.87mmol)及びNHS(325mg,2.82mmol)を加え、得られた反応混合物を室温で1時間撹拌した。沈殿したジシクロヘキシル尿素を濾過で除去し、5mLのDCMで2回洗浄した。
得られた清澄黄色反応混合物に、プロパルギルアミン(245μL,3.82mmol)及びTEA(525μL,3.79mmol)を加えた。反応混合物を室温で1時間撹拌し、引き続き20mLの水で洗浄した。有機相を減圧下で濃縮し、得られた固体をクロマトグラフィー(21gのシリカゲル(40〜63μm) DCM/MeOH−98:2→95:5)で精製した。64%の収率を示す1.01gの生成物CES0596を得た。RP-HPLC分析によれば、生成物は検出可能不純物を含有しなかった。(C)の分子量及び同一性は、MALDI-MS及びNMRにより確認した。

実施例1.3.
R-α-リポ酸-mPEG8(D)の合成

40mLのDCM中R-α-リポ酸(538mg,2.61mmol)の溶液に、DCC(8.11mg,3.93mmol)及びNHS(450mg,3.91mmol)を加え、得られた反応混合物を室温で1時間撹拌した。沈殿したジシクロヘキシル尿素を濾過で除去し、5mLのDCMで2回洗浄した。得られた清澄黄色反応混合物にNH2-mPEG8(0.98g,2.56mmol)及びTEA(725μL,5.23mmol)を加えた。反応混合物を室温で1時間撹拌し、引き続き30mLの水で洗浄した。有機相を減圧下で濃縮し、得られた固体をクロマトグラフィー(34gのシリカゲル(40〜63μm) DCM/MeOH−98:2→97:3)で精製した。75%の収率を示す1.12gの生成物(D)を得た。RP-HPLC分析によれば、生成物は約99.8%の純度を有した。CES0598の分子量及び同一性は、MALDI-MS及びNMRにより確認した。

実施例1.4.
R-α-リポ酸-5kDa PEG-アリル(F)の合成

工程1：5mLのDCM中R-α-リポ酸(125mg,606μmol)の溶液にDCC(184mg,892μmol)及びNHS(108mg,938μmol)を加え、得られた反応混合物を室温で1時間撹拌した。沈殿したジシクロヘキシル尿素を濾過で除去し、2mLのDCMで2回洗浄した。得られた清澄黄色反応混合物にNH2-5kDa PEG-COOH(3.03g,606μmol)及びDCM(91mL)中のTEA(166μL,1198μL)を加えた。反応混合物を室温で17時間撹拌し、引き続き50mLの100mMクエン酸で洗浄した。有機相を減圧下で濃縮し、得られた固形物をクロマトグラフィー(36gのシリカゲル(40〜63μm) DCM/MeOH−98:2→90:10+0.1%AcOH)で精製した。88%の収率を示す2.75gの生成物(E)を得た。RP-HPLC分析によれば、生成物は約80%の純度と20%の不明不純物を有した。これらの不純物は、次工程の精製中に除去された。

工程2：40mLのDCM中(E)(1.30g,251μmol)の溶液にDCC(76mg,368μmol)及びNHS(42mg,365μmol)を加え、得られた反応混合物を室温で6時間撹拌した。黄色のわずかに濁った溶液にアリルアミン(50μL,666μmol)及びTEA(100μL,721μmol)を加えて混合物を室温で18時間撹拌した。沈殿したジシクロヘキシル尿素及び遊離N-ヒドロキシスクシンイミドを濾過で除去し、10mLのDCMで2回洗浄した。反応混合物を30mLの水で洗浄した。有機相を減圧下で濃縮し、得られた固体をクロマトグラフィー(31gのシリカゲル(40〜63μm) DCM/MeOH−95:5→80:20)で精製した。90%の収率を示す1.18gの生成物(F)を得た。RP-HPLC分析によれば、生成物は約97.5%の純度を有した。(F)の分子量及び同一性は、MALDI-MS及びNMRにより確認した。

実施例1.5.
R-α-リポ酸-5kDa PEG-プロパルギル(G)の合成

実施例1.4の工程1に従って得た生成物(E)(1.30g,251μmol)の40mLのDCM中の溶液にDCC(116mg,562μmol)及びNHS(59mg,513mmol)を加え、得られた反応混合物を室温で3.5時間撹拌した。黄色のわずかに濁った溶液にプロパルギルアミン(48μL,749μmol)及びTEA(104μL,750μmol)を加えて混合物を室温で20時間撹拌した。沈殿したジシクロヘキシル尿素及び遊離N-ヒドロキシスクシンイミドを濾過で除去し、10mLのDCMで2回洗浄した。反応混合物を30mLの水で洗浄した。有機相を減圧下で濃縮し、得られた固形物をクロマトグラフィー(32gのシリカゲル(40〜63μm) DCM/MeOH−95:5→80:20)で精製した。90%の収率を示す1.18gの生成物(G)を得た。RP-HPLC分析によれば、生成物は約95%の純度を有した。(G)の分子量及び同一性は、MALDI-MS及びNMRにより確認した。

実施例2.1. 光化学カップリング条件の調査
モデルシステムを用いてR-α-リポ酸-PEG12-アリル(B)と3-メルカプトプロピオン酸の光化学反応を確立した(スキーム7)：

最適化条件を用いて部分的還元抗体の光化学修飾を調べた。
光開始剤II(2,2-ジメトキシ-2-フェニルフェノン(phenyphenone))は水溶液中での不十分な溶解度を示したので(＜1mg/1mLの10%DMSO水溶液)、光開始剤I(2-ヒドロキシ-4’-(2-ヒドロキシエトキシ)-2-メチルプロピオフェノン)のみを用いて全ての実験を行なった。対照的に、光開始剤Iは、DMSOを添加せずに1mg/mLの濃度まで水に溶解した。
初期実験において、水中1mg/mlの生成物(B)のストック溶液を10モル%の光開始剤Iで処理した。反応混合物を5つの管に分けた(1つの管当たり200μl、A〜E)。これらの管に異なるモル過剰の3-メルカプトプロピオン酸(SH)を加えた(表1、エントリーA〜E参照)。

表１

下記条件を用いて反応を引き起こした。
・反応温度＝1℃
・光曝露時間＝30分
・λ_max：310nm
照射直後にサンプルをHPLCで分析した。要するに、これらの実験は、合成したクロスリンカーのアルキン基へのチオール試薬の光惹起カップリングの実現可能性を実証した。
さらなる実験を行なって、反応速度及び反応体積への依存性を決定した。300秒間で、約60%の転化率が得られ、線形回帰が反応プロセスをよく描写した。転化率は適用反応体積に依存しなかった。20μL又は200μLの反応体積は、同反応時間で同転化率をもたらした。対照的に、該反応型の典型的速度論(Macromol. Rapid Commun. 2010, 31, 1247-1266)は、対数相関を示す。この実現可能性研究は、完全転換よりはむしろ光誘発クリック反応の再現性に焦点を合わせた。この点で、5秒後に既に2%の再現性のある転化率が得られた。
さらに、これらの結果に基づいて、還元抗体による第1の実験をデザインした。質量差のためそれぞれの反応生成物をSDS-PAGEで検出できるので、反応進行のために5kDaのPEG結合体(アルケン(F)及びアルキン(G))のみを使用した。

3.1. 抗体の部分的還元
抗体の内部ジスルフィド結合の部分的還元によって、フリーのチオール基を抗体に導入することができる。従って抗体活性に影響を及ぼすことなく抗体の部分的還元をもたらす還元条件を調査すべきである。反応は、25〜50μLの体積で行なうべきである。還元剤としてDTT、TCEP及びシステアミンを試験すべきである。次に還元反応の成功を調べるため、部分的に還元した抗体を、フリーのスルフヒドリル基と反応する5kDa mPEG-マレイミドで修飾すべきである。

3.2. 実験
還元剤スクリーニング−結果セクションで示すように各種の還元剤過剰量を用いて0.5mg/mL(抗ACTH抗体)又は0.5、5、10及び15mg/mL(IgG1)のタンパク質濃度で還元剤スクリーニング実験を行なった。反応は、20mMのリン酸Na、pH7.2を反応緩衝液として用いて最終体積25μLで室温にて1又は2時間行なった。
抗体のPEG化−20mMのリン酸Na、pH7.2中、400:1のPEG:タンパク質モル比で室温にて3時間PEG化反応を行なった。反応混合物中のタンパク質濃度は、0.3mg/mL(抗ACTH抗体)から0.3、3、6及び9mg/mL(IgG1)までの範囲だった。
SDS-PAGE−還元条件又は非還元条件下、InvitrogenからのNuPAGEシステムの4〜12%のBis-Trisゲルを用いてSDS-PAGEを行なった。SimplyBlue(商標) SafeStainキット(Invitrogen)でゲルを染色した。
サイズ排除クロマトグラフィー−Agilent 1200でSuperdex 200 10/300を用いて、SECを行なった。SECは、溶出剤としてPBS(10mM Na₂HPO₄、2mM KH₂PO₄、137mM NaCl、2.7mM KCl、pH7.4)を用いて流速0.65mL/分で行なった。

3.2. 結果
初期実験では異なる濃度の還元剤を用いて抗ACTH抗体の部分的還元を調べた。このようにして、完全な非解離IgGを得ることができる還元剤の濃度を決定すべきである。
一般的なマウスIgG1抗体(Biogenes)を用いて、部分的還元に適した条件をさらに詳細に調べた。
特に、還元効率へのIgG1濃度の影響をDTTについて調査した。生じた全てのフリーのチオール基をSDS-PAGEのバンドシフトとして定量的に検出するために5kDa mPEG-マレイミドを過剰量(400倍)で反応混合物に添加した。
一般的に、還元剤の過剰量が増すにつれて、より高い比率の還元されたIgG1が検出された。さらに、タンパク質濃度が高いほど、より低いDTT過剰量がIgG1の還元の誘発に必要とされた。6又は10当量のDTTを用いると、SDS-PAGE分析によれば5kDa mPEG-マレイミドによる重鎖の0〜5倍の修飾が得られた。1.5又は3当量のDTTによる還元は、主に重鎖のモノPEG化をもたらしたが、比較的程度は低いものの、より高度の修飾も観察された。1%(1.5当量のDTT)対約20%(10当量のDTT)の比では、軽鎖のモノ修飾のみが観察された。
さらに、還元形態のIgG1が多いほど、PEG化度は高かった。還元剤とPEGの添加後のIgG1の会合状態に与えるジスルフィド還元の影響をさらにSECで分析した。
非還元IgG1は、20.1分で単一かつ定型的ピークとして溶出した。10倍過剰のDTTによる処理は、抗体の保持時間又はプロファイルに検出可能な影響を及ぼさなかった。これは生理的条件下での完全性を示唆している。この知見は、同条件下でIgG1の重鎖と軽鎖への解離が観察されたSDS-PAGEによる知見と対照的だった。

部分的に還元されたIgG1(10倍過剰のDTT)の5kDa mPEG-Malによる修飾により、ピークは14.5〜22分のより短い保持時間へ広がった。これは、5kDa mPEGで修飾された完全抗体に対して予測された。抗体の解離を指し示すことになるより大きい保持時間での信号は観察されなかった。より低いDTT過剰(1.5倍)では、SEC中に得られたピークは10倍DTT過剰に比べて広がりが少なかった。これはより低度のPEG化を示唆している。
抗ACTH抗体を用いて3つ全ての還元剤について各種モル過剰で還元時間の影響を調べた。1時間及び2時間のインキュベーション後に高モル過剰の5kDa mPEG-マレイミドを添加して還元を停止させた。
全ての調査条件下で完全な抗ACTH抗体がSDS-PAGEにより観察された。これは鎖間ジスルフィド結合の不完全な還元を示唆している。しかしながら、DTT又はTCEPの過剰量が増すと、より高い比率の重鎖及び軽鎖のみならずより高い度合のPEG化が検出された。この効果は、2時間の還元時間でわずかに強かった。システアミンを用いて、300〜900倍過剰の還元剤で抗ACTH抗体の顕著な解離がないことを達成することができた。これらの結果に基づいて、1時間の還元時間を用いることに決めた。さらに、TCEPはマレイミド活性化分子で修飾されないので、PEG化抗ACTH抗体の調製のために、還元剤としてTCEPを選択した。

実施例4.1. 部分的に還元された抗体への光反応によるPEG-アルケン/-アルキンのカップリング
PEG-リンカー(F)及び(G)のアルケン/アルキン官能基への抗体のカップリングのための光反応条件が開発されてきた。従って、光曝露時間、PEG過剰量、光開始剤I(「Photo I」)濃度、タンパク質濃度及び反応pH値のような様々な反応条件を調査すべきである。得られた結合体のSDS-PAGEによってカップリング効率を分析した。

4.2 実験
抗体の(部分的)還元−15mgのタンパク質濃度を有する抗体溶液に、抗体に比べて0.1〜10倍モル過剰に相当する0.01〜1mMの最終濃度でTCEPを加えた。20mMのリン酸Na、pH7.2中、室温で1時間還元反応を行なった。引き続いて、光クリックケミストリー(photo click chemistry)によって抗体をPEG-アルケン又はPEG-アルキンで修飾した。
光クリックケミストリーによるPEG-アルケン/-アルキンでの抗体の修飾−下記セクションに記載の各種条件下でcaproBox(商標)(Caprotech)を用いて光誘導によってPEG-アルケンロットCES0601又はPEG-アルキンロットCES0602で抗体の修飾を行なった。

4.3. 結果
PEG-アルケンの初期光化学カップリング実験のために市販の抗体IgG1(マウス)を用いた。抗体を1mM TCEP(10当量)で15mg/mLのタンパク質濃度にて1時間還元した。還元されたIgG1で下記条件を用いて、抗体修飾に及ぼすPEG過剰量の影響を試験した。
・IgG1濃度：1mg/mL
・反応緩衝液：20mMのリン酸Na、pH7.2
・IgG1と比べたPEG-アルケン(F)のモル過剰量：0.2〜10倍
・光開始剤I過剰量：0.1モル／1モルのPEG
・光曝露時間：30分
SDS-PAGE分析によってIgG1のPEG化をモニターした。

SDS-PAGEによって、還元されたがPEG化されないIgG1について55kDa及び25kDaに2つのバンドが検出され、それぞれ重鎖及び軽鎖に帰属する。光誘導によってPEG-アルケンに結合された全てのサンプルに対していくつかの高分子量バンドが観察された。これらのバンドは、PEG化抗体断片について予測される約10kDaの分子量差と一致しないので、ほぼ確実に凝集タンパク質又は誤って構築されたタンパク質に相当する。10当量のPEG過剰でのみ約65kDaでバンドが観察され、モノPEG化重鎖に帰属する。PEG及び光開始剤を含有したが、光に曝されなかったIgG1サンプルについては、重鎖及び軽鎖を除いてはさらなるバンドは検出されなかった。これは、光曝露によって凝集が起こったことを示唆している。

PEG化重鎖が得られたので、光クリックケミストリーによる抗体の修飾は実行可能であると想定されたが、凝集抗体の減少に向けて反応を最適化しなければならなかった。
タンパク質凝集を減らし、PEG化を増やすために、様々な光曝露時間及び光開始剤I濃度を調査した。従って、TCEPで還元されたIgG1を、下記条件を用いてPEG-アルケンで修飾した。
・IgG1濃度：1mg/mL
・反応緩衝液：20mMのリン酸Na、pH7.2
・IgG1と比べたPEG-アルケンのモル過剰量：10倍
・光開始剤I過剰量：1〜10モル／1モルのPEG
・光曝露時間：5秒〜10分

光開始剤I過剰量の増加は全ての光曝露時間で凝集のより高いフラクションをもたらしたが、モノPEG化重鎖の比率は影響を受けなかった。光曝露を5〜30秒へ短縮することによって凝集体フラクションを顕著に減らすことができたが、この時間範囲でも、モノPEG化重鎖のフラクションは曝露時間と共に減少した。
鎖間ジスルフィド形成によって起こり得る間違った構築を最小限にするため、初期抗体還元中のIgG1と比べたTCEPの過剰量を1又は5当量に減らすことに決めた。その後、抗体を1当量のPEG-アルケンで1当量の光開始剤Iを用いて異なる光曝露時間で修飾した。
TCEP過剰量の減少によって、1当量のTCEPを用いて10分の光曝露時間で凝集体比率を約9%近くに減らすことができた。しかしながら、最終チップコーティングプロセスには短い曝露が強く必要とされるので、1倍のTCEP過剰で13%のモノPEG化重鎖及び5倍のTCEP過剰で15%のモノPEG化重鎖をもたらした0.5分という標準時間を選択することに決めた。さらに約1%及び3%のモノPEG化軽鎖がそれぞれ1及び5当量のTCEPで検出された。1当量のTCEPで顕著に低い割合の凝集体が検出されたので、それを標準TCEP過剰として選択することに決めた。
下記条件を用いて標準光曝露時間についてPEG過剰量をさらに最適化した。
・IgG1濃度：1mg/mL
・反応緩衝液：20mMのリン酸Na、pH7.2
・IgG1と比べたPEG-アルケンのモル過剰量：0.5〜10倍
・光開始剤I過剰量：1モル／1モルのPEG
・光曝露時間：30秒
PEG過剰量の増加につれて、より高い割合のモノPEG化重鎖が観察された。

最高比率(7%)のモノPEG化重鎖は、10当量のPEGで得られたので、これを標準PEG過剰量として選択した。
下記反応パラメーターを用いて反応混合物中のタンパク質濃度を最適化した。
・IgG1濃度：0.2〜10mg/mL
・反応緩衝液：20mMのリン酸Na、pH7.2
・IgG1と比べたPEG-アルケンのモル過剰量：10倍
・光開始剤I過剰量：1モル／1モルのPEG
・光曝露時間：30秒
モノPEG化重鎖の割合は、タンパク質濃度が高いほど増加した。しかしながら、同様に高分子量不純物(凝集体及び多重PEG化抗体)の割合も増加した。
最高割合(16%)のモノPEG化重鎖は2mg/mLのタンパク質濃度で検出された。しかしながら、高タンパク質濃度を得るためには、前工程で抗体を濃縮しなければならない。チップのコーティングを強く必要とされるため、抗体、抗体濃度及びPEG：タンパク質比をさらに最適化しなければならないことになる。従って溶液中の反応については、抗体の前濃縮を最小限にするため、1mg/mLという標準タンパク質濃度を選択した。

下記反応パラメーターを用いて反応pH値を最適化した。
・IgG1濃度：1mg/mL
・反応緩衝液及びpH値：100mMの酢酸Na、pH5.0；20mMのリン酸Na、pH7.2；100mMのホウ酸Na、pH9.0
・IgG1と比べたPEG-アルケンのモル過剰量：10倍
・光開始剤I過剰量：1モル／1モルのPEG
・光曝露時間：30秒
反応pH5で、最高割合(2%)のモノPEG化軽鎖が検出されたが、低比率(6%)のモノPEG化重鎖が得られた。わずかに高い比率(7%)のモノPEG化軽鎖がpH7で得られた。pH9では、最高割合(9%)のモノPEG化が検出されたが、最高比率(22%)のHMWIも得られた。そこで少ない(18%)HMWIが検出された7という標準反応pH値を用いることに決めた。
下記標準反応パラメーターを選択した。
・タンパク質濃度：1mg/mL
・反応緩衝液：20mMのリン酸Na、pH7.2
・IgG1と比べたPEG-アルケン/-アルキンのモル過剰量：10倍
・光開始剤I過剰量：1モル／1モルのPEG
・光曝露時間：30秒

標準反応パラメーターをPEG-アルキン及び抗ACTH抗体の修飾に導入した。前の実験において様々な還元剤でIgG1及び抗ACTH抗体の還元が達成されたので、様々なTCEP濃度を調べた。
両結合体について(PEG-アルケン又はPEG-アルキンを用いて)モノPEG化タンパク質の最高割合(約7%)が最低TCEP過剰量(0.1当量)で得られたので、これを標準条件として選んだ。
非還元性SDS-PAGEによれば、抗ACTH抗体のシステイン残基におけるPEG化は、抗体の四次構造に影響を及ぼさなかった。結合体の還元性SDS-PAGEでは、66及び75kDaでバンドが検出され、それぞれモノPEG化重鎖及びジPEG化重鎖に割り当てられた。PEG化軽鎖はSDS-PAGEによって観察されなかった。

S-アセチルチオ酢酸N-スクシンイミジル(SATA)を用いたチオール基の導入およびその後のPEG-アルケンによる修飾
SEC分析によれば、抗体の四次構造は、部分的還元及びPEGのそれぞれのシステイン残基への結合によって影響されなかった。しかしながらジスルフィド結合の還元は、抗体安定性を弱め、その活性を妨害する恐れがある。従って、二官能性試薬SATAを用いるフリーのチオール基の導入を調査すべきである。この手法によって、SATAを、最初にそのNHS官能基によって、抗体中のリジン残基のフリーのアミノ基に付着させる。その後、結合されたSATAのスルフヒドリル基をヒドロキシルアミンによる処理で脱保護する。

得られたフリーのチオール基を、前に開発した条件下で光反応によってPEG-アルケン/-アルキンに結合すべきである。
5.1. 実験
抗体のフリーのアミノ基へのSATAの付着−IgG1及び抗ACTH抗体へのSATAの付着のためにSATA及びスルフヒドリル付加キット(Thermo Scientific)を使用した。製造者の説明書に基づいて反応を行なった。20mMのリン酸Na、pH7.2中1mg/mLの濃度の抗体をSATAにより1、3、5及び10当量のモル過剰で修飾した。室温で2時間反応を行なった。結合されたSATAのスルフヒドリル基を、室温で2時間5mg/mLの濃度のヒドロキシルアミンアミンで処理して脱保護した。CentriSpin 10カラムを用いて残余の遊離SATA及びヒドロキシルアミンを除去した。
フリーのSATAチオール基へのPEG-アルケン/-アルキンの結合−抗体に結合されたSATAのフリーのチオール基にcaproBox(商標)(Caprotech)を用いて光誘導によりPEG-アルケン/-アルキンを付着させた。この反応は、20mMのリン酸Na、pH7.2中で1mg/mLのタンパク質濃度及び10倍のPEG-アルケン/-アルキン過剰量にて行なった。1モルのPEG当たり1モルの光開始剤Iを添加し、30秒の光曝露時間を選択した。

5.2. 結果
初期実験では、異なるSATA過剰量を用いて、抗体IgG1のアミノ基に付着したSATA分子のフリーのチオール基へのPEG-アルケンの付着を調べた。得られたPEG化反応混合物をSDS-PAGEによって分析した。
非還元性SDS-PAGEでは、完全IgG1に相当する155kDaに主バンドが検出された。より低い分子量(約135及び110kDa)のさらなるバンドは、部分的に解離したIgG1に割り当てられた。これらのバンドの比率は、SATA過剰が多くなるにつれて増加した。このことは、SATAの付着が抗体の四次構造に影響を及ぼした可能性を示唆している。従って抗体と比べたSATAの過剰量を最小限にすべきである。還元性SDS-PAGEでは、全タンパク質の1〜2%に達する66kDaのバンドがモノPEG化重鎖に相当した。より高い分子量のさらなるバンドは、高分子量不純物(HMWI)に割り当てられた。これらは凝集体又は多重PEG化タンパク質に相当する可能性がある。さらなる調査のため、IgG1をそのために3又は10当量のSATAで修飾したコントロール反応を行なった。その後、PEG-アルケンを添加せずに標準条件下で光クリック反応を行なった。
還元性SDS-PAGEでは、PEG化反応で観察されたHMWIを示すバンドが検出された。光クリック反応中に混合物にPEGは添加されなかったので、これらのバンドは凝集タンパク質に割り当てられた。
その後の実験で、1及び3倍の過剰量で抗ACTH抗体に結合したSATAへのPEG-アルケンの付着を光クリックケミストリーにより調べた。
抗ACTH抗体を用いると、光クリック反応後にIgG1に比べて低比率の凝集体が観察された。抗ACTH抗体のモノPEG化重鎖に相当するバンドは還元性SDS-PAGE分析によって検出された。従って抗体のPEG化は実行可能と考えられるが、モノPEG-HCの比率は低かった(＜1%)。

光反応経由のアルケン/アルキン及び共有結合タンパク質(抗体)による金表面の表面修飾
6.1. 実験
下表に列挙する機器は例示である。他の製造者の匹敵する品質の機器を代わりに使用してよい。

6.2. 材料
下表に列挙する材料は例示である。他の製造者からの匹敵する品質の材料を代わりに使用してよい。

6.3. 溶液及び緩衝液の調製
○10mMのリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.2
・710mgのリン酸水素二ナトリウムを250mLのビーカーに量り入れ、250mLのddH₂Oでビーカーを満たす；780mgのリン酸二水素ナトリウムを別の250mLのビーカーに量り入れ、ddH₂Oでビーカーを満たす。
・250mLのリン酸水素二ナトリウムを500mLのビーカーに入れ、pH7.2に達するまでリン酸二水素で滴定する。
・0.2μmのポリエーテルスルホン膜フィルターを用いて溶液を濾過して500mLのガラス瓶に入れる。
・溶液を室温で6カ月まで貯蔵する。

○ddH₂O中25mg/mLのTCEPストック溶液
・25mgのTCEPを1.5mLのねじぶた管に量り入れる。
・1mLのddH₂Oを加える。
・TCEPが完全に溶解するまで管をボルテックスする。
・4℃で貯蔵する。
○20mMのリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.2中1mg/mLの光開始剤
・10mgの光開始剤を15mLのねじぶた管に量り入れる。
・10mLの10mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.2を加える。
・溶液を10分40℃で振盪させて光開始剤を溶かす。
・溶液を0.2μmのポリエーテルスルホンシリンジフィルターに通す。
・使用日に溶液を調製する。

○DMAC中10mMのPEG-アルケン/-アルキン溶液及び金表面修飾
・PEG-アルケン/-アルキンを-20℃で貯蔵し；約30分間室温で解凍する。
・適切な質量のPEG-アルケン/-アルキンを15mLのねじぶた管に量り入れる(5000DaのPEG-アルケン→1mLのDMACに500mg溶かして100mMのストック溶液を得る)。
・PEGが完全に溶解するまでPEG溶液をボルテックスする。
・100mMのストック溶液を等分して-20℃で貯蔵することができる。
・その結果、使用日に作業溶液を調製する：
・ストック溶液をDMACで10mMの作業溶液濃度に希釈する。
・溶液を反転させ、ボルテックスして均質化する。
・ドラフト内で、10μLの10mM PEG-アルケン/アルキン溶液を浄化(洗浄プロトコル)金CMOS表面にピペットで移し、ガラスペトリ皿内で60分間20℃で反応させる。
・250mLのビーカー内で10秒間金CMOS表面をddH₂Oで洗浄する。
・金CMOS表面を圧縮空気で乾燥させる。
・使用するまで20℃で乾式貯蔵する。

○ジスルフィド結合のTCEP還元
・20μLの抗体(0.2mg/mL、MW＝150kDa)をピペットで0.5mLのカップに入れる。
・TCEPストック溶液をリン酸ナトリウム緩衝液で2回1:100希釈及び1:2希釈して、抗体濃度に関して3×モル過剰の最終TCEP濃度を得る。
・20μLのTCEPを抗体に加える。
・還元混合物を室温及び30rpmの撹拌で60分インキュベートする。
○抗体のスポッティング(Spotting)及びカップリング
・ピペットで15μLのスポッティング緩衝液をGenetix Plateに入れる。
・2.24μLの光開始剤ストック溶液を加える。
・12.76μLの還元抗体溶液を加えてスポッティング濃度より2倍高濃度にする。
・スポッティング(標準スポッティング手順)
・UVランプをスポッティング装置内に置き、金表面の上10mmの距離でUV光(λ＝302nm)に少なくとも4分から10分まで曝す。
・ddH₂Oで洗浄し、圧縮空気で乾燥させる。
・表面を所望の遮断剤で遮断する(遮断プロトコル)。
・ddH₂Oで洗浄し、圧縮空気で乾燥させる。
・意図したアッセイにCMOSを使用する。

図4の上部は、スペーサーとしてのポリエチレングリコール(PEG)基及び末端アリル基を有する、ジチオール基を介して金属表面に共有結合しているクロスリンカー分子(4)で修飾されている金属表面(1)を模式的に示す。少なくとも1つのスルフヒドリル基を有する生体分子(2)、光開始剤及びUV光による照射を加えると、図4の下部に示すように、生体分子が表面上にクロスリンカーを介して固定化(3)される。

実施例7〜9
CMOSチップの表面修飾を評価するために作製した異なる固定化実験の結果を図1〜3の蛍光写真に示す。
CMOSチップは128個の電極を含み、各電極はスポッティングによってアドレス指定可能である(実施例6と比較せよ)。対応するスポッティングレイアウトをも示す。

リポアミド-PEG(11)-マレイミド修飾表面と比べたUV光及び光開始剤の影響。
下記実験では、センサー表面として128個の金電極から成るCMOSチップから蛍光写真を撮った。ポリクロナールウサギ抗ACTH抗体のスポッティングのために異なる希釈度及びスポッティング緩衝液を使用した。その後、ACTHを表面に付加し、ACTHについての完全アッセイを行なった。モノクロナールマウス抗ACTH抗体は、付加後に、結び付いたACTHに結合し、これは蛍光標識ウサギ抗マウス抗体で可視化することができる。
蛍光強度は、結び付いたポリクロナールウサギ抗ACTH抗体の量に正比例する。図1に、リポアミド-PEG(11)-マレイミド修飾表面と比較した光反応の異なる条件を示す。
A：304nmの波長で10分のUV照射によるリポアミド-PEG(11)-マレイミド修飾表面。蛍光の弱い存在が観察できるだけである。これは、抗体の固定化反応が低度に起こっただけであることを意味する。
B：7.5分の照射時間による本発明のR-α-リポ酸-PEG12-プロパルギル修飾表面。より高い蛍光強度のため、抗体の固定化が起こったに違いないことが明白である。
注目すべきは、サンプルKIA5〜KIA7には光開始剤を使用しなかったが、サンプルKIA1〜KIA4は、光開始剤を用いて生成されたことである。全ての抗体をTCEPで前処理し、TCEPの異なる過剰量(抗体の濃度に対して30×、3×モル過剰量)を利用した。
C：UV照射なしでのR-α-リポ酸-PEG12-プロパルギル修飾表面。UV照射なしでは表面で抗体のほんのわずかな固定化しか起こらないことが明白である。
D：スポッティングレイアウトKIAは、ポリクロナールウサギ抗ACTH抗体の異なる反応条件を表す。
SPO：スポッティング緩衝液のみを適用したスポッティングコントロールを表す。

光開始剤がある場合とない場合のモノクロナールマウス抗ACTH抗体の固定化
この実験では、モノクロナールマウス抗体の固定化についての光反応の適応性を実証した。抗体を蛍光標識抗マウス抗体で直接染色した。対応する結果を図2に示す。
図2は、R-α-リポ酸-PEG12-プロパルギル修飾表面に本発明に従って光反応及び4分の照射時間の助けを借りたモノクロナールマウス抗体の固定化を示す。
A：光開始剤の使用の有無による固定化効率の比較を示す。光開始剤の使用がモノクロナール抗体の強力かつ均一な固定化を果たすことは明白である。しかしながら、光開始剤がないと、固定化効率はあまりはっきりせず、ゾーンの形成が認められる。それにもかかわらず、光開始剤なしでも十分な照射時間で反応を行なえることを想定し得る
B：スポッティングレイアウトKIAは、染色し得ないポリクロナールウサギ抗ACTH抗体に相当する。
SPO：スポッティング緩衝液のみを適用したスポッティングコントロールを表す。
MIA：光開始剤の有無にかかわらずMIA1、MIA2が生成されたモノクロナールマウス抗体を表す。全ての抗体を前もってTCEPで処理した。

アリル及びプロパルギル官能性並びに規定及び非規定PEG鎖長の比較。
この実験では、アリル及びプロパルギル基の反応性を比較した。さらに、規定及び非規定PEG鎖長の反応性の差を調べた。非規定PEG鎖長は5kDaの分子質量を有するものである。実施例7で述べたように分析物としてACTHを用いてアッセイを行なった。利用したCMOSチップは、電極間の間隙がその上で蛍光増強を示すベンゾシクロブテン(BCB)層で前処理した。100μg/mLで始まる1:2希釈系列内で抗体を適用した。対応する結果を図3に示す。照射時間は4分だった。
図3は、異なる修飾表面上での本発明の光反応によるポリクロナールウサギ抗ACTH抗体の固定化を示す。
A：R-α-リポ酸-5kDa PEG-プロパルギル(実施例1.5)修飾表面。
B：R-α-リポ酸-PEG12-プロパルギル(実施例1.2)修飾表面。
C：R-α-リポ酸-5kDa PEG-アリル(実施例1.4)修飾表面。
D：R-α-リポ酸-PEG12-アリル(実施例1.1)修飾表面。
E：スポッティングレイアウトKIAは、KIAが最高濃度(スポッティング溶液として100μg/mL)を示す一方で、KIA4が最低濃度(スポッティング溶液として12,5μg/mL)を含有するポリクロナールウサギ抗ACTH抗体に対応する。Dが最高強度の蛍光を示すことは明白である。全ての他の修飾表面は、わずかに低い強度を示すが、ここでは、特異的固定化を認めることもできる。

Claims (14)

1. 少なくとも1つのスルフヒドリル基を含有する生体分子の固定化方法であって、下記工程：
   (a)必要に応じて、生体分子内の既存-S-S-結合を切断するために還元剤で前記生体分子を処理する工程、又は
   (b)必要に応じて、保護されたスルフヒドリル基を有するアシル化剤で生体分子を処理し、前記スルフヒドリル基を脱保護する工程；
   (c)修飾金属表面を前記生体分子と接触させる工程；
   (d)生じた表面に光開始剤の存在下でUV照射する工程
   を含み、
   前記金属表面は、
   a. 前記金属表面に共有結合した末端チオール又はジチオール基を含み、前記末端チオール又はジチオール基が
   b. スペーサー基に結び付いており、前記スペーサー基は、もう一方の末端に
   c. 孤立二重結合又は三重結合を保持している
   クロスリンカー化合物で修飾されている、
   前記方法。
2. リンカー化合物が、下記式(I)
   HS-(CH₂)_m-CH(ZH)-SPACER-(CH₂)_p-A (I)
   （式中、
   mは、2〜6の整数であり、
   Aは、-CH=CH₂及び-C≡CHから選択され、かつ
   Zは、S又は単結合であり、
   SPACERは、下記式
   -(CH₂)_n-(C=O)_x-Y-(CH₂CH₂-O)_y-(CH₂)_r-(C=O)_v-X-
   の基であり、
   ここで、
   X及びYは、それぞれ独立にNH又はOであり、
   nは、0又は1〜10の整数であり、
   x及びvは、それぞれ独立に0又は1であり、
   yは、1〜20の整数であり、
   r及びpは、それぞれ独立に1〜6の整数から選択される）
   の化合物である、
   請求項1に記載の方法。
3. ZがSであり、
   AがCH=CH₂であり、かつ
   mが2〜4の整数であり、
   X及びYがNHであり、
   nが0又は1〜10の整数であり、
   x及びvが1であり、
   yが1〜20の整数であり、
   r及びpが1である、
   請求項2に記載の方法。
4. 生体分子が、抗体、酵素又は核酸である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
5. 光開始剤が1-ベンゾイル-1-メチル-エタノール誘導体である、
   請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
6. 照射を300〜340nm、好ましくは約320nmの波長λ_maxで行なう、
   請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
7. 下記式(I)
   HS-(CH₂)_m-CH(ZH)-SPACER-(CH₂)_p-A (I)
   （式中、
   mは、2〜6の整数であり、
   Aは、-CH=CH₂及び-C≡CHから選択され、かつ
   Zは、S又は単結合であり、
   SPACERは、下記式
   -(CH₂)_n-(C=O)_x-Y-(CH₂CH₂-O)_y-(CH₂)_r-(C=O)_v-X-
   の基であり、
   ここで、
   X及びYは、それぞれ独立にNH又はOであり、
   nは、0又は1〜10の整数であり、
   x及びvは、それぞれ独立に0又は1であり、
   yは、1〜20の整数であり、
   r及びpは、それぞれ独立に1〜6の整数から選択される）
   のクロスリンカー化合物。
8. 下記式(IA)
   HS-(CH₂)_m-CH(SH)-SPACER-(CH₂)_p-A (IA)
   （式中、A、SPACER、m及びpは、請求項7の式(I)に与えた意味を有する）
   のクロスリンカー化合物。
9. 請求項8に記載の式(IA)のクロスリンカー化合物であって、
   mが2〜4であり、
   pが1であり、
   SPACERが下記式
   -(CH₂)_n-(C=O)-NH-(CH₂CH₂-O)_y-CH₂-(C=O)-NH-
   （式中、
   nは、0又は1〜10の整数であり、
   yは、1〜20の整数である）
   の基である、前記クロスリンカー化合物。
10. 下記式(II)
    （式中、A、SPACER、m及びpは、請求項7の式(I)に与えた意味を有する）
    の中間体。
11. 修飾金属表面であって、請求項7〜9のいずれか1項に記載の式(I)又は(IA)の化合物の少なくとも1つのチオール基が、前記表面の金属原子の少なくとも1つに共有結合している、前記修飾金属表面。
12. 金属が貴金属、好ましくは金である、請求項11に記載の修飾金属表面。
13. 請求項1〜6のいずれか1項に記載の生体分子の固定化方法を行なうためのキットであって、下記
    (vi)請求項11又は12に記載の修飾金属表面を有する基板、
    (vii)適切な還元剤を含有する任意選択的な格納ユニット、又は
    (iii)保護されたスルフヒドリル基を有する適切なアシル化剤及び前記スルフヒドリル基用の脱保護剤を含有する任意選択的な格納ユニット、
    (ix)適切な光開始剤を含有する格納ユニット、及び
    (v)この方法を行なうための条件を説明するパンフレット
    を含む、前記キット。
14. UV照射に適した装置をさらに含む、請求項13に記載の生体分子の固定化方法を行なうためのキット。