JP2019211368A - 分析用閾値決定装置及び分析用閾値決定方法 - Google Patents

分析用閾値決定装置及び分析用閾値決定方法 Download PDF

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Abstract

【課題】Ｓ／Ｎ比の高い計数が可能な分析用閾値決定装置及び分析用閾値決定方法を提供する。【解決手段】分析用閾値決定装置１００は、演算部４１が生成した一対の閾値と、パルス計数部３４が出力した計数値と、に基づいて、分析に用いる一対または複数対の閾値を決定する閾値決定部４６を備える。演算部４１は、パルス計数部３４がパルスを計数するごとに、一対の閾値のうちの少なくとも一方の閾値を変化させた新たな一対の閾値を、所定の値に至るまで繰り返し生成する。閾値決定部４６は、生成された各一対の閾値を階級とし、パルス計数部３４が出力した計数値を度数とした度数分布に基づいて、代表値である階級を選択する。閾値決定部４６は、代表値である階級から所定の範囲の階級に対応した一対または複数対の閾値を決定する。【選択図】図８Ａ

Description

本発明は、分析用閾値決定装置及び分析用閾値決定方法に関する。詳細には、本発明は、抗原、抗体等の生体物質を分析するための分析用閾値決定装置及び分析用閾値決定方法に関する。
疾病に関連付けられた特定の抗原又は抗体をバイオマーカーとして検出することで、疾病の発見及び治療の効果等を定量的に分析する免疫検定法（immunoassay）が知られている。酵素により標識された抗原又は抗体を検出するＥＬＩＳＡ法（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay）は免疫検定法の一つであり、コスト等のメリットから広く普及している。
しかしながら、ＥＬＩＳＡ法は、前処理、抗原抗体反応、Ｂ／Ｆ（bond/free）分離、酵素反応等を合計した時間が数時間から１日程度であり、分析に長時間を要する。そこで、光ディスクに固定された抗体と試料中の抗原を結合させ、抗原に抗体が設けられた粒子をさらに結合させ、光ヘッドで走査することにより、光ディスク上に捕捉された粒子を短時間に計数する技術が提案されている（例えば、特許文献１参照）。また、光ディスクのトラッキング構造が形成される面に生体試料及び粒子を付着させ、光ピックアップで信号の変化を検出する技術が提案されている（例えば、特許文献２参照）。
特開平５−５７４１号公報 特表２００２−５３０７８６号公報
パルスは、光ディスクに付着した粒子に起因して、光ディスクからの反射信号として生成されるため、このパルスを利用することにより粒子が計数される。
しかしながら、光ディスクに付着させる粒子は非常に小さく、ナノレベルオーダーであることもある。そのため、粒子の大きさを一定に保つことは一般的に困難であるため、パルスのパルス幅及びパルス振幅のばらつきが大きくなる。また、粒子が金属などを含む場合、光の反射特性に影響を及ぼしやすいため、パルス幅及びパルス振幅のばらつきがより顕著になりやすい。
そのため、多くのパルスを計数しようとしても粒子に起因するパルス以外の信号も計数してしまうおそれがあり、Ｓ／Ｎ比が低下してしまうというおそれがあった。
本発明は、このような従来技術の有する課題に鑑みてなされたものである。そして、本発明の目的は、Ｓ／Ｎ比の高い計数が可能な分析用閾値決定装置及び分析用閾値決定方法を提供することにある。
上記課題を解決するために、本発明の態様に係る分析用閾値決定装置は、分析用基板に照射光を照射し、照射光による分析用基板からの反射光を受光して受光レベル信号を生成する光ピックアップを備える。分析用基板には、検出対象物質と検出対象物質に結合する粒子とが表面に固定されている。分析用閾値決定装置は、受光レベル信号に含まれるパルスのパルス幅について一対の閾値、またはパルスのパルス振幅について一対の閾値を生成する演算部を備える。分析用閾値決定装置は、パルス幅がパルス幅についての一対の閾値の範囲内に存在するか否かを判定するか、またはパルス振幅がパルス振幅についての一対の閾値の範囲内に存在するか否かを判定するパルス判定部を備える。分析用閾値決定装置は、パルス判定部が生成された一対の閾値の範囲内に存在すると判定したパルスを計数し、計数したパルスの計数値を出力するパルス計数部を備える。分析用閾値決定装置は、演算部が生成した一対の閾値と、パルス計数部が出力した計数値と、に基づいて、分析に用いる一対または複数対の閾値を決定する閾値決定部を備える。演算部は、パルス計数部がパルスを計数するごとに、一対の閾値のうちの少なくとも一方の閾値を変化させた新たな一対の閾値を、所定の値に至るまで繰り返し生成する。閾値決定部は、生成された各一対の閾値を階級とし、パルス計数部が出力した計数値を度数とした度数分布に基づいて、代表値である階級を選択する。閾値決定部は、代表値である階級から所定の範囲の階級に対応した一対または複数対の閾値を決定する。
上記課題を解決するために、本発明の態様に係る分析用閾値決定方法は、検出対象物質と検出対象物質に結合する粒子とが表面に固定された分析用基板に照射光を照射する照射ステップを含む。分析用閾値決定方法は、照射光による分析用基板からの反射光を受光して受光レベル信号を生成する信号生成ステップを含む。分析用閾値決定方法は、受光レベル信号に含まれるパルスが、パルス幅について設定された一対の閾値、またはパルスがパルス振幅について設定された一対の閾値の範囲内に存在するか否かを判定する判定ステップを含む。分析用閾値決定方法は、判定ステップにおいて、設定された一対の閾値の範囲内に存在すると判定されたパルスを計数し、計数したパルスの計数値を出力する計数値出力ステップを含む。分析用閾値決定方法は、計数値出力ステップにおいてパルスを計数するごとに、一対の閾値のうちの少なくとも一方の閾値を変化させた新たな一対の閾値を、所定の値に至るまで繰り返し生成する閾値生成ステップを含む。分析用閾値決定方法は、生成された各一対の閾値を階級とし、計数値出力ステップで出力された計数値を度数とした度数分布に基づいて、代表値である階級を選択する代表値選択ステップを含む。分析用閾値決定方法は、代表値である階級から所定の範囲の階級に対応した一対または複数対の閾値を、分析に用いる一対または複数対の閾値として決定する閾値決定ステップを含む。
本発明によれば、Ｓ／Ｎ比の高い計数が可能な分析用閾値決定装置及び分析用閾値決定方法を提供することができる。
第１実施形態に係る分析用閾値決定装置を含む分析装置の構成を示すブロック図である。 反応領域を有する分析用基板の一例を示す上面図である。 反応領域のトラック領域に粒子が捕獲されている状態を拡大して示した上面図である。 検出対象物質が抗体と粒子とによってトラック領域の凹部にサンドイッチ捕獲されている状態を示す模式的な断面図である。 本実施形態に係るディスクドライブの一例を示す概略図である。 第１実施形態に係る分析用閾値決定方法の一例を示すフローチャートである。 本実施形態に係る計数テーブルの一例を示す図である。 得られたヒストグラムの一例を示す図である。 図８Ａにおける領域Ｇ１を抜き取ったグラフの概要を示す図である。 図８Ａにおける領域Ｇ２を抜き取ったグラフの概要を示す図である。 反応領域ごとに前測定を実施する様子を示す模式図である。 分割領域ごとに前測定を実施する様子を示す模式図である。 第２実施形態に係る分析用閾値決定方法の一例を示すフローチャートである。
以下、本実施形態に係る分析用閾値決定装置及び分析用閾値決定方法について説明する。なお、図面の寸法比率は説明の都合上誇張されており、実際の比率とは異なる場合がある。
［第１実施形態］
まず、第１実施形態に係る分析用閾値決定装置及び分析用閾値決定方法について詳細に説明する。
図１に示すように、本実施形態に係る分析用閾値決定装置１００は、パルス検出回路３０と、システム制御部４０と、を備える。この実施形態では、分析用閾値決定装置１００と、ディスクドライブ２０とを備えた分析装置２００を例として説明する。
ディスクドライブ２０では、分析用基板１０が再生される。分析用基板１０は、例えば、ブルーレイディスク（ＢＤ）、ＤＶＤ、コンパクトディスク（ＣＤ）等の光ディスクと同等の円板形状を有する。分析用基板１０は、例えば、一般的に光ディスクに用いられるポリカーボネート樹脂又はシクロオレフィンポリマー等の樹脂材料で形成されている。なお、分析用基板１０は、上記の光ディスクに限定されるものではなく、他の形態又は所定の規格に準拠した光ディスクを用いることもできる。
図２に示すように、分析用基板１０は、反応領域１１を有する。反応領域１１は、検出対象物質１３、粒子１４及び抗体１５などが固定された分析対象となる領域である（図４参照）。本実施形態では、分析用基板１０の中心部に位置決め孔１２が形成されており、分析用基板１０の中心Ｃａに対して同一円周Ｃｂ上に中心部がそれぞれ位置するように、８つの反応領域１１が等間隔に形成されている。ただし、反応領域１１の数又は形成位置はこれに限定されるものではない。
図３に示すように、分析用基板１０の表面には、凸部１０ａと凹部１０ｂとが半径方向に交互に配置されたトラック領域１０ｃが形成されている。凸部１０ａ及び凹部１０ｂは、分析用基板１０の内周部から外周部に向かってスパイラル状に形成されている。凸部１０ａは光ディスクのランドに相当する。凹部１０ｂは光ディスクのグルーブに相当する。凹部１０ｂの半径方向のピッチに相当するトラックピッチは例えば３２０ｎｍである。
図３及び図４に示すように、分析用基板１０の表面には、検出対象物質１３と検出対象物質１３に結合する粒子１４とが固定されている。分析用基板１０の表面には、検出対象物質１３と特異的に結合する抗体１５が固定されている。抗体１５は検出対象物質１３を認識して結合し、検出対象物質１３が分析用基板１０の表面に捕捉される。一方、粒子１４には検出対象物質１３を認識する抗体１６が複数設けられており、粒子１４は抗体１６を介して検出対象物質１３と結合し、サンドイッチ構造を形成している。
検出対象物質１３は、例えば疾病に関連付けられた特定のタンパク質などの抗原である。このような抗原を検出対象物質１３として用いることにより、疾病の発見などに役立てることができる。例えばエクソソームなどの検出対象物質１３は、モニタリング対象の疾患状態に応じ、体液内の濃度が変化するため、バイオマーカーとしての役割を果たすことができる。検出対象物質１３であるエクソソームの大きさは１００ｎｍ程度である。
粒子１４は、検出対象物質１３の標識となる。粒子１４としては、特に限定されないが、例えばポリマー粒子、金属粒子、シリカ粒子などの標識用ビーズなどが挙げられる。粒子１４は、内部にフェライト等の磁性材料を含む磁気ビーズなどであってもよい。粒子１４の大きさは２００ｎｍ程度である。
図５に示すように、ディスクドライブ２０は、ターンテーブル２１と、クランパ２２と、ターンテーブル駆動部２３と、ガイド軸２４と、光ピックアップ２５と、を備える分析用基板駆動装置である。ディスクドライブ２０は、周知の情報再生用ディスクドライブを用いることができる。
ターンテーブル２１上には、反応領域１１が形成された面が下向きになるように分析用基板１０が載置される。
クランパ２２は、ターンテーブル２１に対して離隔する方向及び接近する方向、すなわち、図５の上方向及び下方向に駆動される。分析用基板１０は、クランパ２２が下方向に駆動されると、クランパ２２とターンテーブル２１とによって、ターンテーブル２１上に保持される。具体的には、分析用基板１０の中心Ｃａがターンテーブル２１の回転軸Ｃ１上に位置するように保持される。
ターンテーブル駆動部２３は、ターンテーブル２１を分析用基板１０及びクランパ２２と共に、回転軸Ｃ１回りに回転駆動させる。ターンテーブル駆動部２３としてスピンドルモータを用いてもよい。ターンテーブル駆動部２３は、ドライブ制御部４４のターンテーブル駆動回路４４ａによって制御される。
ガイド軸２４は、分析用基板１０と平行に、かつ、分析用基板１０の半径方向に沿って配置されている。すなわち、ガイド軸２４は、ターンテーブル２１の回転軸Ｃ１に直交する方向に沿って配置されている。
光ピックアップ２５はガイド軸２４に支持されている。光ピックアップ２５は、ガイド軸２４に沿って、ターンテーブル２１の回転軸Ｃ１に直交する方向であり、分析用基板１０の半径方向に、かつ、分析用基板１０と並行に駆動される。光ピックアップ２５は、ドライブ制御部４４の光ピックアップ駆動回路４４ｂによって制御される。
光ピックアップ２５は対物レンズ２５ａを備えている。光ピックアップ２５は分析用基板１０に照射光２５ｂを照射する。照射光２５ｂは例えばレーザ光である。照射光２５ｂは対物レンズ２５ａによって分析用基板１０の表面に集光される。分析用基板１０を回転させた状態で光ピックアップ２５が分析用基板１０の半径方向に駆動されることにより、照射光２５ｂは凹部１０ｂに沿って走査される。
光ピックアップ２５は照射光２５ｂによる分析用基板１０からの反射光を受光して受光レベル信号ＪＳを生成する。図１に示すように、光ピックアップ２５は、受光レベル信号ＪＳをパルス検出回路３０のパルス情報抽出部３１へ出力する。
図１に示すように、パルス検出回路３０は、パルス情報抽出部３１と、パラメータ記憶部３２と、パルス判定部３３と、パルス計数部３４と、を備える。
パルス検出回路３０は、ディスクドライブ２０から出力された受光レベル信号ＪＳを取得し、粒子１４に起因するパルス信号の解析を行うことで検出対象物質１３の計数情報を取得する。パルス検出回路３０は、例えば専用回路基板などのハードウェアである。
パルス情報抽出部３１は、受光レベル信号ＪＳに含まれるパルスからパルス情報を抽出する。パルス情報には、例えば、パルス幅及びパルス振幅などが含まれる。パルス情報抽出部３１は、パラメータ記憶部３２に記憶されている抽出パラメータの設定値を読み出し、抽出パラメータの設定値に基づいて受光レベル信号ＪＳに含まれるパルス情報を抽出してもよい。例えば、パルス情報としてパルス幅を抽出する場合、パルス幅を抽出するための抽出電圧Ｖｔｈを抽出パラメータとし、抽出電圧Ｖｔｈにおけるパルス幅をパルス情報として抽出してもよい。また、パルス情報としてパルス振幅を抽出する場合、パルスのピーク値などをパルス情報として抽出してもよい。抽出されたパルス情報は、パルス判定部３３に出力される。
パラメータ記憶部３２は、抽出パラメータと判定パラメータとを含むパルス関連パラメータの設定値を記憶する。判定パラメータは受光レベル信号ＪＳに含まれるパルスが粒子１４に起因するパルスか否かを判定するために用いられる。本実施形態において、判定パラメータの設定値は閾値である。判定パラメータとしては、例えば、パルス振幅の上限側の閾値電圧である振幅上限電圧ＶＨ、パルス振幅の下限側の閾値電圧である振幅下限電圧ＶＬ、パルス幅の上限側の閾値時間であるパルス幅上限時間ＴＨ、パルス幅の下限側の閾値時間であるパルス幅下限時間ＴＬなどが挙げられる。
パルス判定部３３は、受光レベル信号ＪＳに含まれるパルスが、パルス幅の方向またはパルス振幅の方向に設定された上限値及び下限値からなる一対の閾値の範囲内に存在するか否かを判定する。具体的には、パルス判定部３３は、パルス幅がパルス幅についての一対の閾値の範囲内に存在するか否かを判定するか、またはパルス振幅がパルス振幅についての一対の閾値の範囲内に存在するか否かを判定する。パルス判定部３３はパラメータ記憶部３２から判定パラメータの設定値を読み出し、パルス情報抽出部３１で抽出されたパルス情報が設定値の範囲内であった場合に、パルス判定部３３は粒子１４に起因したパルスと判定する。なお、後述するように、演算部４１によって選択された複数対の閾値が導き出されると、パルス判定部３３は、受光レベル信号ＪＳに含まれるパルスが選択された複数対の閾値のうちのいずれかの一対の閾値の範囲内に存在するか否かを判定する。
判定に用いる一対の閾値は、パルス幅及びパルス振幅の少なくともいずれか一方における一対の閾値であってもよい。例えば、パルス判定部３３は、抽出電圧Ｖｔｈにおけるパルス幅がパルス幅下限時間ＴＬ〜パルス幅上限時間ＴＨの範囲内である場合に、粒子１４に起因したパルスと判定する。また、パルス判定部３３は、パルス振幅が振幅下限電圧ＶＬ〜振幅上限電圧ＶＨの範囲内である場合に、粒子１４に起因したパルスと判定する。パルス判定部３３は、受光レベル信号ＪＳに含まれるパルスが粒子１４に起因するパルスと判定した場合に、計数値がインクリメントされるようパルス計数部３４に検出信号を出力する。
パルス計数部３４は一対の閾値の範囲内に存在するパルスを計数して計数値を出力する。具体的には、パルス計数部３４は、検出信号をリアルタイムで取得し、粒子１４に起因するパルスを計数する。計数値はパルス計数部３４からシステム制御部４０の演算部４１に出力されるが、ユーザが計数値を確認できるように計数値を表示部４５に出力してもよい。なお、後述するように、演算部４１は一対の閾値のうちの少なくとも一方の閾値を設定された変化分を単位として繰り返し変化させて、新たな一対の閾値を生成する。そして、パルス判定部３３がその生成された一対の閾値の範囲内に存在すると判定したパルスを計数し、変化分ごとのパルスの計数値を出力する。
図１に示すように、システム制御部４０は、演算部４１と、パラメータ設定部４２と、測定制御部４３と、ドライブ制御部４４と、表示部４５と、閾値決定部４６と、を備える。
システム制御部４０は、ディスクドライブ２０及びパルス検出回路３０を制御し、計数値、判定パラメータに関する演算処理及び設定を実施する。システム制御部４０は、ソフトウェアプログラムがインストールされたコンピュータであってもよい。
演算部４１は、後述する図６のフローチャートに示されるような前測定及び本測定に関する処理を実行する。前測定では、照射光２５ｂの強度及び分析用基板１０の反射特性の状態などに応じて一対の閾値を生成するための測定が実施される。本測定では、前測定によって生成された一対の閾値で検出対象物質１３が実際に分析される。
演算部４１は、ドライブ制御部４４に対し、光ピックアップ２５の移動及び分析用基板１０の回転などの前測定に関する制御命令を出力する。
演算部４１は、一対の閾値のうちの少なくとも一方の閾値を設定された変化分を単位として繰り返し変化させて、新たな一対の閾値を生成する。具体的には、演算部４１は、受光レベル信号ＪＳに含まれるパルスのパルス幅について一対の閾値、またはパルスのパルス振幅について一対の閾値を生成する。そして、演算部４１は、パルス計数部３４がパルスを計数するごとに、一対の閾値のうちの少なくとも一方の閾値を変化させた新たな一対の閾値を、所定の値に至るまで繰り返し生成する。演算部４１は、例えば上限又は下限の閾値のみを設定された変化分を単位として繰り返し変化させて、新たな一対の閾値を生成してもよい。また、演算部４１は、上限及び下限の閾値を設定された変化分を単位として繰り返し変化させて、新たな一対の閾値を生成してもよい。上限及び下限の閾値を変化させる場合は、上限と下限の間隔を一定に保ったまま両方の閾値を変化させてもよい。さらに、上限及び下限の閾値を変化させる変化量は必ずしも一定でなくてもよく、例えば所定の範囲においてその範囲外よりも変化量を小さく、または大きく設定してもよい。上述したように、パルス計数部３４は、演算部４１が一対の閾値を生成するごとに、パルス判定部３３が一対の閾値の範囲内に存在すると判定したパルスを計数し、変化分ごとのパルスの計数値を出力する。
閾値決定部４６は、演算部４１が生成した一対の閾値と、パルス計数部３４が出力した計数値と、に基づいて、分析に用いる一対または複数対の閾値を決定する。閾値決定部４６は、演算部４１によって生成された各一対の閾値を階級とし、パルス計数部３４が出力した計数値を度数とした度数分布に基づいて、代表値である階級を選択する。ここでいうパルス計数部３４が出力した計数値とは、上記変化分ごとのパルスの計数値である。度数分布は、ヒストグラムであってもよい。
代表値は、平均値、中央値及び最頻値からなる群より選択される少なくとも１つの値であってもよい。最頻値は、例えば正規分布のフィッティングなどによって求めてもよい。閾値決定部４６は、例えば後述する度数分布に基づいて代表値を選択して演算値記憶部４７に記憶させてもよい。
閾値決定部４６は、代表値である階級から所定の範囲の階級に対応した複数対の閾値を、分析に用いる複数対の閾値として決定する。代表値が平均値である場合、閾値決定部４６は、度数分布の標準偏差（σ）を演算し、平均値である階級から所定の標準偏差の範囲の階級に含まれる複数対の閾値を、分析に用いる複数対の閾値として決定してもよい。標準偏差に基づいて新たな複数対の閾値を決定する場合、分布のばらつきに応じて近接する範囲を定めてもよい。平均値は、閾値決定部４６の平均値演算部で演算し、演算値記憶部４７に記憶してもよい。また、標準偏差は、閾値決定部４６の標準偏差演算部で演算し、演算値記憶部４７などの記憶部に記憶してもよい。
代表値は平均値であり、所定の範囲は±１σの範囲であることが好ましい。すなわち、閾値決定部４６は、平均値である階級から±１σの範囲の階級に含まれる複数対の閾値を選択された複数対の閾値とすることが、Ｓ／Ｎ比向上の観点から好ましい。また、度数分布をヒストグラムとした場合において、閾値決定部４６は、代表値を中心とするヒストグラムの面積がヒストグラムの全面積に対して所定の割合以下の面積となるように、分析に用いる複数対の閾値として決定してもよい。Ｓ／Ｎ比向上の観点から、所定の割合は、３０％以下であることが好ましく、１０％以下であることがより好ましい。また、分析に用いる閾値は複数対に限らず、一対の閾値であってもよい。
演算値記憶部４７は、閾値決定部４６で選択された代表値、標準偏差などの演算値を記憶する。
パラメータ設定部４２は、演算部４１からの出力を受けて、設定すべきパラメータの値をパラメータ記憶部３２に記憶させる。
測定制御部４３は、前測定及び本測定の実施を管理する。測定制御部４３は、ユーザによって前測定又は本測定の実施の選択が可能な入力部を備えていてもよい。また、測定制御部４３は、入力部で選択された情報に基づいて、ドライブ制御部４４に計数の開始、中断及び終了などを命令したり、演算部４１及び閾値決定部４６に演算処理を命令したりしてもよい。
ドライブ制御部４４は、測定制御部４３からの入力を受け、ディスクドライブ２０を制御する。ドライブ制御部４４は、例えば、ディスクドライブ２０において、分析用基板１０の測定開始位置及び測定終了位置のような測定位置などを制御することができる。ドライブ制御部４４は、例えば、ターンテーブル駆動回路４４ａ、光ピックアップ駆動回路４４ｂなどを備えていてもよい。
ターンテーブル駆動回路４４ａはターンテーブル駆動部２３を制御する。例えば、ターンテーブル駆動回路４４ａは、ターンテーブル２１が分析用基板１０及びクランパ２２と共に一定の線速度で回転するようにターンテーブル駆動部２３を制御する。
光ピックアップ駆動回路４４ｂは光ピックアップ２５の駆動を制御する。例えば光ピックアップ駆動回路４４ｂは、光ピックアップ２５をガイド軸２４に沿って移動させたり、光ピックアップ２５の対物レンズ２５ａを上下方向に移動させたりする。
ドライブ制御部４４は、前測定時において、演算部４１によって一対の閾値の少なくとも一方が変更されるごとに同じ位置を繰り返して測定するようディスクドライブ２０を制御する。例えば、ドライブ制御部４４は、光ピックアップ２５が測定開始位置及び測定終了位置などに移動するよう光ピックアップ２５を制御する。前測定の時間を短くするため、前測定の範囲は、本測定の範囲よりも狭いことが好ましい。具体的には、演算部４１で変化させて得られた新たな一対の閾値の範囲内に存在するパルスを計数する領域は、分析に用いる一対の閾値で計数する領域よりも狭いことが好ましい。
測定開始位置及び測定終了位置は予め設定されていてもよく、前測定時において所定の計数値が得られるように測定開始位置及び測定終了位置を決定してもよい。測定開始位置及び測定終了位置が予め設定されている場合、一対の閾値の少なくとも一方の閾値を変更しながら計数を繰り返すだけでよく、校正を簡略化することができるため好ましい。前測定時において所定の計数値が得られるように測定開始位置及び測定終了位置を決定する場合、所定量以上の計数値で前測定することができ、安定した前測定を行うことができるため好ましい。この場合、演算部４１を介してディスクドライブ２０の測定開始位置及び測定終了位置が制御される。ただし、本測定で測定される全測定対象領域を前測定の対象とすると時間がかかるため、本測定の測定領域の中央付近であって、全測定対象領域よりも狭い範囲とすることが好ましい。
表示部４５は、前測定又は本測定に関する情報をユーザに提示することができる。前測定に関する情報としては、ユーザが次の処理を選択できるような前測定の精度等の付加情報などが挙げられる。本測定に関する情報としては、本測定における計数値などが挙げられる。表示部４５としては、ユーザに前測定又は本測定に関する情報を提示することができれば特に限定されないが、例えばディスプレイ等が挙げられる。
次に、図６に示すフローチャートを用いて本実施形態に係る分析用閾値決定方法における各工程を説明する。なお、本実施形態では、横軸を走査時間（走査位置）、縦軸を電圧とするグラフにおいて、粒子１４が存在する場合は下に凸のパルスが発生する系について説明する。具体的には、本実施形態では、便宜上、振幅下限電圧ＶＬ，振幅上限電圧ＶＨ及び抽出電圧Ｖｔｈが電圧に比例する０〜＋１００の範囲の整数である場合について説明する。本実施形態では、反射光を何も検出しない場合の信号レベルを１００、分析用基板１０上に粒子１４及び異物などが存在しない場合の信号レベルを基準電圧Ｖｂａｓｅとし、粒子１４が存在する場合は基準電圧Ｖｂａｓｅより小さい値をとる系について説明する。なお、基準電圧Ｖｂａｓｅの値は、分析用基板１０の状態及び照射光２５ｂの強度などに依存する。
ただし、本実施形態はこのような態様に限定されない。例えば、受光レベル信号の信号強度（電圧値）をそのまま用いてもよく、振幅下限電圧ＶＬ，振幅上限電圧ＶＨ及び抽出電圧Ｖｔｈは小数であってもよい。また、基準電圧Ｖｂａｓｅを０としてもよく、パルスの極性を反転させて粒子１４が存在する場合に上に凸のパルスが発生する系であってもよい。
ステップＳ１では、前測定を実施するか否かが選択される。演算部４１は、前測定を実施する場合（ＹＥＳ）にはステップＳ２に処理を進め、前測定を実施しない場合（ＮＯ）にはステップＳ１０に処理を進める。分析条件が同じである場合は、前測定を毎回する必要はないため、本測定のみを実施するためにステップＳ１０に処理を進めてもよい。前測定を実施するか否かは、ユーザがグラフィカルユーザインタフェース（ＧＵＩ）などを介して選択してもよいし、使用期間又は使用回数などの情報に基づいて演算部４１が判定してもよい。
ステップＳ２では、演算部４１は、振幅下限電圧ＶＬの値を０に設定するようパラメータ設定部４２を制御する。また、演算部４１は、振幅上限電圧ＶＨの値を、予め設定された値である初期値ＶＨ０より十分大きな値であるＶｍａｘに設定するようパラメータ設定部４２を制御する。なお、振幅下限電圧ＶＬ及び振幅上限電圧ＶＨに代えてパルス幅上限時間ＴＨ及びパルス幅下限時間ＴＬを用いる場合は、演算部４１は、抽出電圧Ｖｔｈの値を、予め設定された値である初期値Ｖｔｈ０に設定するようパラメータ設定部４２を制御すればよい。そして、演算部４１は、ステップＳ３に処理を進める。
ステップＳ３では、演算部４１は、粒子１４を計数するようドライブ制御部４４を制御する。具体的には、演算部４１は、光ピックアップ２５を前測定用の測定開始位置から測定終了位置まで分析用基板１０の半径方向に移動させたり、分析用基板１０を一定の速度で回転させたりするようドライブ制御部４４を制御する。
粒子１４の計数は、パルス検出回路３０で実施される。光ピックアップ２５は、検出対象物質１３と検出対象物質１３に結合する粒子１４とが表面に固定された分析用基板１０に照射光２５ｂを照射する（照射ステップ）。そして、光ピックアップ２５は、照射光２５ｂによる分析用基板１０からの反射光を受光して受光レベル信号ＪＳを生成する（信号生成ステップ）。生成された受光レベル信号ＪＳに含まれるパルスのパルス情報はパルス情報抽出部３１によって取得される。パルス判定部３３は、受光レベル信号ＪＳに含まれるパルスが、パルス幅について設定された一対の閾値、またはパルスがパルス振幅について設定された一対の閾値の範囲内に存在するか否かを判定する（第１の判定ステップ）。パルス判定部３３は、受光レベル信号ＪＳに含まれるパルスが一対の閾値の範囲内に存在すると判定した場合に、計数値がインクリメントされるようパルス計数部３４に検出信号を出力する。パルス計数部３４は、一対の閾値の範囲内に存在するパルスを計数して計数値を演算部４１へ出力する。すなわち、パルス計数部３４は、第１の判定ステップにおいて、設定された一対の閾値の範囲内に存在すると判定されたパルスを計数し、計数したパルスの計数値を出力する（計数値出力ステップ）。そして、ステップＳ４へ処理を進める。
ステップＳ４では、演算部４１は、ステップＳ３の前測定により得られた粒子１４の計数値を、設定された振幅下限電圧ＶＬの値と関連付けて計数テーブルに記憶する。そして、ステップＳ５へ処理を進める。
ステップＳ５では、演算部４１は、パラメータ記憶部３２に記憶された振幅下限電圧ＶＬをインクリメントした値で再設定するようパラメータ設定部４２を制御する。例えば、演算部４１は、設定された振幅下限電圧ＶＬの値がＶＬｎの場合、ＶＬｎをインクリメントしてパラメータ記憶部３２の振幅下限電圧ＶＬをＶＬｎ＋１＝ＶＬｎ＋１（ｎは０以上Ｖｍａｘ未満の整数）とするようパラメータ設定部４２に通知する。なお、本実施形態では、演算部４１は、元々の振幅下限電圧ＶＬに１を加えているが、加える数値は１でなくてもよい。そして、演算部４１は、ステップＳ６へ処理を進める。
ステップＳ６では、演算部４１は、振幅下限電圧ＶＬの設定値がＶｍａｘ以上となったか否かを判定する。演算部４１は、振幅下限電圧ＶＬの設定値がＶｍａｘ未満の場合（ＮＯ）にはステップＳ３へ処理を進め、振幅下限電圧ＶＬの設定値がＶｍａｘ以上の場合（ＹＥＳ）にはステップＳ７へ処理を進める。
ステップＳ３〜ステップＳ６により、演算部４１は、計数値出力ステップにおいて、パルス計数部３４がパルスを計数するごとに、一対の閾値のうちの少なくとも一方の閾値を変化させた新たな一対の閾値を、所定の値に至るまで繰り返し生成している（閾値生成ステップ）。具体的には、演算部４１は、振幅下限電圧ＶＬに１ずつ繰り返し加えて異なる一連の値、すなわち新たな一対の閾値に変化させ、複数の値の振幅下限電圧ＶＬを得ている。ここで、振幅下限電圧ＶＬの設定値が０〜Ｖｍａｘまで計数された場合、例えば図７に示すような計数テーブルが完成する。
図７の計数テーブルには、複数の値の閾値が左欄に記憶され、変化させて得られた一対の閾値ごとに計数された計数値が右欄に記憶されている。具体的には、計数テーブルには、振幅下限電圧ＶＬの設定値Ｖｎにそれぞれ関連づけられた計数値Count(vn)が記憶されている。ＶＬ＝０からＶＬ＝Ｖｍａｘで設定された場合のそれぞれの計数値は、Count(0)からCount(vmax)として計数テーブルに記憶されている。なお、計数値Count(vn)は、振幅下限電圧ＶＬの設定値がｖｎである場合の計数値を示している（ここでは、ｎは０〜Ｖｍａｘの整数）。
ステップＳ７では、パルス計数部３４は、パルス判定部３３が複数対の閾値における各一対の閾値の範囲内に存在すると判定したパルスを計数し、変化分ごとのパルスの計数値を出力している。本実施形態では、変化分ごとのパルスの計数値は、以下の数式（１）に示すように、dCount(vn)で表される。
dCount(vn)＝Count(vn)−Count(vn+1) （１）
閾値決定部４６は、各一対の閾値を階級とし、パルス計数部３４が出力した計数値を度数とした度数分布を生成している。具体的には、振幅下限電圧ＶＬを階級及びdCount(vn)を度数とし、ＶＬ＝０からＶＬ＝Ｖｍａｘまでグラフ化することにより、図８Ａに示すようなヒストグラムが得られる。そして、閾値決定部４６は、ステップＳ８へ処理を進める。
ステップＳ８では、閾値決定部４６は、閾値生成ステップで生成された各一対の閾値を階級とし、計数値出力ステップで出力された計数値を度数とした度数分布に基づいて、代表値である階級を選択する（代表値選択ステップ）。閾値決定部４６は、選択した代表値を演算値記憶部４７に記憶する。
ステップＳ９では、閾値決定部４６は、演算値記憶部４７から代表値を読み出す。そして、閾値決定部４６は、代表値である階級から所定の範囲の階級に対応した一対または複数対の閾値を、分析に用いる一対または複数対の閾値として決定する（閾値決定ステップ）。図８Ｂでは、代表値が平均値であり、平均値から±１σの範囲に含まれる閾値とする場合について説明している。ここで、σは標準偏差である。図８Ｂに示すように、閾値決定部４６は、平均値Ｖａを中心として、±１σの範囲内となるように振幅下限電圧ＶＬと振幅上限電圧ＶＨを演算する。すなわち、振幅下限電圧ＶＬ及び振幅上限電圧ＶＨは、以下の数式（２）及び数式（３）のようにして算出される。
ＶＬ＝Ｖａ−σ （２）
ＶＨ＝Ｖａ＋σ （３）
図８Ｃでは、平均値から±３σの範囲に含まれる閾値とする場合について説明している。図８Ｃに示すように、平均値から±３σの範囲に含まれる閾値とする場合、粒子１４に起因するパルスの大部分を計数することができる。しかしながら、粒子１４としてナノメートルオーダーの粒子１４を用いた場合、粒子１４の大きさを均一にすることが困難である場合が多い。また、粒子１４に磁性を有する金属材料が含まれる場合、粒子１４の反射特性が変化するが、粒子１４の粒子径が小さいと、反射特性を均一にすることも困難である場合が多い。このような場合、図８Ｃに示すように、ノイズに起因するパルスも多く計数される傾向にある。
したがって、高いＳ／Ｎ比で計数するためには、図８Ｂに示すように、平均値から±１σの範囲に含まれる閾値とすることが好ましい。そして、演算部４１は、ステップＳ１０へ処理を進める。
ステップＳ１０では、演算部４１は、前測定で選択された複数対の閾値のうちのいずれかの一対の閾値で本測定による粒子１４を計数するようドライブ制御部４４を制御する。具体的には、演算部４１は、本測定用の測定開始位置から測定終了位置まで、光ピックアップ２５を分析用基板１０の半径方向に移動させたり、分析用基板１０を一定の速度で回転させたりするようドライブ制御部４４を制御する。
ドライブ制御部４４はディスクドライブ２０を制御し、本測定用に設定された測定開始位置から測定終了位置まで分析用基板１０を本測定し、パルス検出回路３０において粒子１４に起因するパルスを計数する。粒子１４の計数は、前測定で決定された複数対の閾値のうちのいずれかの一対の閾値で計数することを除き、ステップＳ３と同様に、パルス検出回路３０で実施される。このとき、パルス判定部３３は、受光レベル信号ＪＳに含まれるパルスが決定された複数対の閾値のうちのいずれかの一対の閾値の範囲内に存在するか否かを判定する（第２の判定ステップ）。そして、演算部４１は、ステップＳ１１へ処理を進める。
ステップＳ１１では、本測定での計数値が表示部４５に表示され、本測定が終了する。
上記実施形態では、一対の閾値のうちの一方の閾値を設定された変化分を単位として繰り返し変化させているが、一対の閾値のうちの両方の閾値を設定された変化分を単位として繰り返し変化させてもよい。例えば、ステップＳ２において、振幅下限電圧ＶＬを０，振幅上限電圧ＶＨを１とし、ステップＳ５でインクリメントしてＶＬをＶＬｎ＋１＝ＶＬｎ＋１，ＶＨをＶＬｎ＋１＋１＝ＶＬｎ＋２とすることで、dCount(vn)に相当する分布を直接求めてもよい。この場合、ステップＳ６における前測定終了の条件は、ＶＨの設定値がＶｍａｘになった時などにしてもよい。
本実施形態では、振幅下限電圧ＶＬ又は振幅上限電圧ＶＨを変化させながら計数し、振幅下限電圧ＶＬ及び振幅上限電圧ＶＨを補正する方法を説明した。しかしながら、パルス波形を正規分布として考えれば、パルス振幅とパルス幅は比例する。そのため、振幅下限電圧ＶＬをパルス幅下限時間ＴＬに、振幅上限電圧ＶＨをパルス幅上限時間ＴＨに置き換えて、同様の測定をしても、同等の効果が得られる。
以上の通り、本実施形態に係る分析用閾値決定装置１００は、分析用基板１０に照射光２５ｂを照射し、照射光２５ｂによる分析用基板１０からの反射光を受光して受光レベル信号ＪＳを生成する光ピックアップ２５を備える。分析用基板１０には、検出対象物質１３と検出対象物質１３に結合する粒子１４とが表面に固定されている。分析用閾値決定装置１００は、受光レベル信号ＪＳに含まれるパルスのパルス幅について一対の閾値、またはパルスのパルス振幅について一対の閾値を生成する演算部４１を備える。分析用閾値決定装置１００は、パルス幅がパルス幅についての一対の閾値の範囲内に存在するか否かを判定するか、またはパルス振幅がパルス振幅についての一対の閾値の範囲内に存在するか否かを判定するパルス判定部３３を備える。分析用閾値決定装置１００は、パルス判定部３３が生成された一対の閾値の範囲内に存在すると判定したパルスを計数し、計数したパルスの計数値を出力するパルス計数部３４を備える。分析用閾値決定装置１００は、演算部４１が生成した一対の閾値と、パルス計数部３４が出力した計数値と、に基づいて、分析に用いる一対または複数対の閾値を決定する閾値決定部４６を備える。演算部４１は、パルス計数部３４がパルスを計数するごとに、一対の閾値のうちの少なくとも一方の閾値を変化させた新たな一対の閾値を、所定の値に至るまで繰り返し生成する。閾値決定部４６は、生成された各一対の閾値を階級とし、パルス計数部３４が出力した計数値を度数とした度数分布に基づいて、代表値である階級を選択する。閾値決定部４６は、代表値である階級から所定の範囲の階級に対応した一対または複数対の閾値を決定する。
また、本実施形態に係る分析用閾値決定方法は、検出対象物質１３と検出対象物質１３に結合する粒子１４とが表面に固定された分析用基板１０に照射光２５ｂを照射する照射ステップを含む。分析用閾値決定方法は、照射光２５ｂによる分析用基板１０からの反射光を受光して受光レベル信号ＪＳを生成する信号生成ステップを含む。分析用閾値決定方法は、受光レベル信号ＪＳに含まれるパルスが、パルス幅について設定された一対の閾値、またはパルスがパルス振幅について設定された一対の閾値の範囲内に存在するか否かを判定する判定ステップを含む。分析用閾値決定方法は、判定ステップにおいて、設定された一対の閾値の範囲内に存在すると判定されたパルスを計数し、計数したパルスの計数値を出力する計数値出力ステップを含む。分析用閾値決定方法は、計数値出力ステップにおいてパルスを計数するごとに、一対の閾値のうちの少なくとも一方の閾値を変化させた新たな一対の閾値を、所定の値に至るまで繰り返し生成する閾値生成ステップを含む。分析用閾値決定方法は、生成された各一対の閾値を階級とし、計数値出力ステップで出力された計数値を度数とした度数分布に基づいて、代表値である階級を選択する代表値選択ステップを含む。分析用閾値決定方法は、代表値である階級から所定の範囲の階級に対応した一対または複数対の閾値を、分析に用いる一対または複数対の閾値として決定する閾値決定ステップを含む。
アッセイノイズ、分析用基板１０の傷、異物の存在など、外乱が発生した場合には、検出対象物質１３に対してノイズが占める割合が大きくなる傾向にある。しかしながら、本実施形態に係る分析用閾値決定装置１００及び分析用閾値決定方法によれば、ヒストグラムの代表値に近接する範囲を新たな一対の閾値とすることで、代表値に近いパルス振幅及びパルス幅などを有するパルスのみを計数することができる。そのため、閾値の上限及び下限を広くとった場合と比較して、ノイズに起因するパルスの検出割合が低くなるため、Ｓ／Ｎ比を向上させることができる。
［第２実施形態］
次に、第２実施形態に係る分析用閾値決定装置１００及び分析用閾値決定方法について詳細に説明する。なお、上記実施形態と同一の構成には同一符号を付し、重複する説明は省略する。本実施形態では、分析対象となる領域ごとに前測定が実施され、代表値が選択されている。
アッセイノイズ、分析用基板１０の傷及び異物の存在などの外乱が発生した場合には、ヒストグラムの形状が測定領域ごとに異なってしまうことがある。しかしながら、測定領域ごとに代表値を選択し、本測定することで、測定領域ごとにＳ／Ｎ比のより高い計数結果を導き出すことができる。
本実施形態では、分析用基板１０は、検出対象物質１３と粒子１４とが表面に固定された複数の分析対象領域を有する。分析対象領域は、図２及び図９に示すような、分析用基板１０に形成された複数の反応領域１１であってもよい。反応領域１１は、例えばウェルなどを用いて形成されていてもよい。図９の実施形態では、反応領域１１ごとに前測定が実施され、代表値が選択されている。すなわち、閾値決定部４６は、反応領域１１ごとに閾値を決定している。本実施形態によれば、反応領域１１ごとに新たな一対の閾値を決定するため、反応領域１１ごとに高いＳ／Ｎ比で計数することができる。
分析対象領域は、図１０に示すような、反応領域１１を分割して形成された複数の分割領域１１ａであってもよい。図１０の実施形態では、分割領域１１ａごとに前測定が実施され、代表値が決定されている。すなわち、閾値決定部４６は、分割領域１１ａごとに閾値を決定している。同じ反応領域１１内であっても、反応領域１１の平面方向において粒子１４の多い場所及び少ない場所が存在し、パルス振幅代表値の最適値が変動することも予想される。しかしながら、本実施形態によれば、分割領域１１ａごとに閾値を決定するため、分割領域１１ａごとに高いＳ／Ｎ比で計数することができる。なお、分割領域１１ａごとに代表値を決定する場合、測定する分割領域１１ａを特定する方法は特に限定されない。
次に、図１１のフローチャートを用いて本実施形態に係る分析用閾値決定装置１００及び分析用閾値決定方法について説明する。
ステップＳ１〜ステップＳ８では、第１実施形態と同様に、閾値決定部４６はパルス振幅代表値を選択し、演算値記憶部４７に記憶させる。そして、ステップＳ１２へ処理を進める。
ステップＳ１２では、反応領域１１などの分析対象領域が全て前測定されているか否かが判定される。例えば、分析対象領域がＮ個の場合、Ｎ個全て前測定されているか判定される。この時、Ｎ個全てではなく、着目したい分析領域のみが全て前測定されているか判定してもよい。分析対象領域が全て前測定されていない場合（ＮＯ）には、ステップＳ２に処理が戻される。一方、分析対象領域が全て前測定されている場合（ＹＥＳ）には、ステップＳ９に処理が進められる。
ステップＳ９〜ステップＳ１０では、第１実施形態と同様に、代表値に近接する範囲が設定され、本測定により特定の領域が計数される。そして、演算部４１はステップＳ１３へ処理を進める。
ステップＳ１３では、演算部４１は、分析対象領域の数がＮ個未満である場合（ＮＯ）には次の分析領域に測定対象を移動させてステップＳ１１へ処理を進める。一方、演算部４１は、測定した分析対象領域の数がＮ個に達した場合（ＹＥＳ）には測定制御部４３に測定を終了させるよう制御する。
以上、実施例に沿って本実施形態の内容を説明したが、本実施形態はこれらの記載に限定されるものではなく、種々の変形及び改良が可能であることは、当業者には自明である。
１０ 分析用基板、
１３ 検出対象物質、
１４ 粒子、
２５ 光ピックアップ、
２５ｂ 照射光、
３３ パルス判定部、
３４ パルス計数部、
４１ 演算部、
４６ 閾値決定部、
１００ 分析用閾値決定装置、
ＪＳ 受光レベル信号、

Claims (5)

  1. 検出対象物質と前記検出対象物質に結合する粒子とが表面に固定された分析用基板に照射光を照射し、前記照射光による前記分析用基板からの反射光を受光して受光レベル信号を生成する光ピックアップと、
    前記受光レベル信号に含まれるパルスのパルス幅について一対の閾値、または前記パルスのパルス振幅について一対の閾値を生成する演算部と、
    前記パルス幅が前記パルス幅についての一対の閾値の範囲内に存在するか否かを判定するか、または前記パルス振幅が前記パルス振幅についての一対の閾値の範囲内に存在するか否かを判定するパルス判定部と、
    前記パルス判定部が前記生成された一対の閾値の範囲内に存在すると判定したパルスを計数し、前記計数したパルスの計数値を出力するパルス計数部と、
    前記演算部が生成した一対の閾値と、前記パルス計数部が出力した計数値と、に基づいて、分析に用いる一対または複数対の閾値を決定する閾値決定部と、
    を備え、
    前記演算部は、前記パルス計数部がパルスを計数するごとに、前記一対の閾値のうちの少なくとも一方の閾値を変化させた新たな一対の閾値を、所定の値に至るまで繰り返し生成し、
    前記閾値決定部は、前記生成された各一対の閾値を階級とし、前記パルス計数部が出力した前記計数値を度数とした度数分布に基づいて、代表値である階級を選択し、
    前記代表値である階級から所定の範囲の階級に対応した一対または複数対の閾値を決定する、分析用閾値決定装置。
  2. 前記代表値は、平均値、中央値及び最頻値からなる群より選択される少なくとも１つの値である請求項１に記載の分析用閾値決定装置。
  3. 前記代表値は平均値であり、前記所定の範囲は±１σの範囲である請求項１又は２に記載の分析用閾値決定装置。
  4. 前記分析用基板は、前記検出対象物質と前記粒子とが表面に固定された複数の分析対象領域を有し、
    前記閾値決定部は、前記分析対象領域ごとに前記代表値を選択する請求項１〜３のいずれか１項に記載の分析用閾値決定装置。
  5. 検出対象物質と前記検出対象物質に結合する粒子とが表面に固定された分析用基板に照射光を照射する照射ステップと、
    前記照射光による前記分析用基板からの反射光を受光して受光レベル信号を生成する信号生成ステップと、
    前記受光レベル信号に含まれるパルスが、パルス幅について設定された一対の閾値、または前記パルスがパルス振幅について設定された一対の閾値の範囲内に存在するか否かを判定する判定ステップと、
    前記判定ステップにおいて、前記設定された一対の閾値の範囲内に存在すると判定されたパルスを計数し、前記計数したパルスの計数値を出力する計数値出力ステップと、
    前記計数値出力ステップにおいてパルスを計数するごとに、前記一対の閾値のうちの少なくとも一方の閾値を変化させた新たな一対の閾値を、所定の値に至るまで繰り返し生成する閾値生成ステップと、
    生成された各一対の閾値を階級とし、前記計数値出力ステップで出力された前記計数値を度数とした度数分布に基づいて、代表値である階級を選択する代表値選択ステップと、
    前記代表値である階級から所定の範囲の階級に対応した一対または複数対の閾値を、分析に用いる一対または複数対の閾値として決定する閾値決定ステップと、
    を含む分析用閾値決定方法。
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