WO2019235209A1 - 分析用閾値決定装置及び分析用閾値決定方法 - Google Patents

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pair
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analysis
threshold
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齋藤　敦
茂彦 岩間
山本　雅弘
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株式会社Ｊｖｃケンウッド
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    • G01N2015/1486—Counting the particles

Definitions

  • the present disclosure relates to an analysis threshold determination device and an analysis threshold determination method. Specifically, the present disclosure relates to an analytical threshold value determination apparatus and an analytical threshold value determination method for analyzing biological materials such as antigens and antibodies.
  • An immunoassay is known in which a specific antigen or antibody associated with a disease is detected as a biomarker to quantitatively analyze the effect of disease detection and treatment.
  • An ELISA method Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay
  • An enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay for detecting an antigen or antibody labeled with an enzyme is one of immunoassays, and is widely used because of merit such as cost.
  • the total time for pretreatment, antigen-antibody reaction, B / F (bond / free) separation, enzyme reaction, etc. is about several hours to one day, and it takes a long time for analysis. Therefore, the antibody fixed on the optical disk is bound to the antigen in the sample, and the particles with the antibody are further bound to the antigen, and the particles captured on the optical disk are counted in a short time by scanning with an optical head.
  • the technique which performs is proposed (for example, refer patent document 1).
  • a technique has been proposed in which a biological sample and particles are attached to the surface on which the tracking structure of an optical disk is formed, and a change in signal is detected with an optical pickup (see, for example, Patent Document 2).
  • the pulse Since the pulse is generated as a reflection signal from the optical disk due to the particles adhering to the optical disk, the particles are counted by using this pulse.
  • the particles adhering to the optical disk are very small and may be on the nano level. Therefore, since it is generally difficult to keep the particle size constant, variations in the pulse width and pulse amplitude of the pulse become large. In addition, when the particles contain metal or the like, variations in pulse width and pulse amplitude tend to become more prominent because they tend to affect the light reflection characteristics.
  • An object of the present disclosure is to provide an analysis threshold determination device and an analysis threshold determination method capable of counting with a high S / N ratio.
  • an analysis threshold value determination device irradiates an analysis substrate with irradiation light, and receives reflected light from the analysis substrate by the irradiation light to generate a light reception level signal
  • An optical pickup is provided.
  • a detection target substance and particles that bind to the detection target substance are fixed to the surface of the analysis substrate.
  • the analysis threshold value determination device includes a calculation unit that generates a pair of threshold values for the pulse width of a pulse included in the received light level signal or a pair of threshold values for the pulse amplitude of the pulse.
  • the analysis threshold determination apparatus determines whether the pulse width is within a pair of threshold values for the pulse width, or whether the pulse amplitude is within a pair of threshold values for the pulse amplitude.
  • the threshold determination device for analysis includes a pulse counting unit that counts pulses determined to be within the range of the pair of thresholds generated by the pulse determination unit and outputs a count value of the counted pulses.
  • the analysis threshold value determination device includes a threshold value determination unit that determines a pair or a plurality of threshold values used for analysis based on the pair of threshold values generated by the calculation unit and the count value output by the pulse counting unit.
  • the calculation unit Each time the pulse counting unit counts pulses, the calculation unit repeatedly generates a new pair of threshold values obtained by changing at least one of the pair of threshold values until a predetermined value is reached.
  • the threshold value determination unit selects a class as a representative value based on a frequency distribution in which each pair of generated threshold values is a class and the count value output by the pulse counting unit is a frequency.
  • the threshold value determination unit determines a pair or a plurality of threshold values corresponding to a predetermined range of classes from the class that is the representative value.
  • an analysis threshold value determining method includes an irradiation step of irradiating irradiation light to an analysis substrate on which a detection target substance and particles that bind to the detection target substance are fixed.
  • the analysis threshold value determination method includes a signal generation step of receiving reflected light from the analysis substrate by irradiation light and generating a light reception level signal.
  • the analysis threshold value determining method determines whether or not the pulse included in the received light level signal is within a pair of threshold values set for the pulse width or a pair of threshold values set for the pulse amplitude. A determination step is included.
  • the analysis threshold value determining method includes a count value output step of counting the pulses determined to be within the range of the set pair of threshold values in the determination step and outputting the count value of the counted pulses.
  • the threshold determination method for analysis is a threshold that repeatedly generates a new pair of threshold values, each of which is a change in at least one of the pair of threshold values, every time a pulse is counted in the count value output step until a predetermined value is reached. Includes a generation step.
  • a threshold value determination method for analysis is a representative value selection step of selecting a class as a representative value based on a frequency distribution in which each pair of generated threshold values is a class and the count value output in the count value output step is a frequency. including.
  • the analysis threshold value determining method includes a threshold value determining step of determining a pair or a plurality of pairs of threshold values corresponding to a class within a predetermined range from the class as a representative value as a pair or a plurality of pairs of threshold values used for the analysis.
  • FIG. 1 is a block diagram illustrating a configuration of an analysis apparatus including an analysis threshold value determination apparatus according to the first embodiment.
  • FIG. 2 is a top view showing an example of an analysis substrate having a reaction region.
  • FIG. 3 is an enlarged top view showing a state where particles are captured in the track region of the reaction region.
  • FIG. 4 is a schematic cross-sectional view showing a state in which the detection target substance is sandwiched and captured in the concave portion of the track region by the antibody and the particles.
  • FIG. 5 is a schematic diagram showing an example of a disk drive according to the present embodiment.
  • FIG. 6 is a flowchart illustrating an example of the analysis threshold determination method according to the first embodiment.
  • FIG. 7 is a diagram illustrating an example of a counting table according to the present embodiment.
  • FIG. 8A is a diagram illustrating an example of the obtained histogram.
  • FIG. 8B is a diagram showing an outline of a graph obtained by extracting the region G1 in FIG. 8A.
  • FIG. 8C is a diagram showing an outline of a graph obtained by extracting the region G2 in FIG. 8A.
  • FIG. 9 is a schematic diagram showing a state in which pre-measurement is performed for each reaction region.
  • FIG. 10 is a schematic diagram illustrating a state in which pre-measurement is performed for each divided region.
  • FIG. 11 is a flowchart illustrating an example of the analysis threshold determination method according to the second embodiment.
  • the analysis threshold value determination device 100 includes a pulse detection circuit 30 and a system control unit 40.
  • an analysis apparatus 200 including an analysis threshold value determination apparatus 100 and a disk drive 20 will be described as an example.
  • the analysis substrate 10 is reproduced.
  • the analysis substrate 10 has a disk shape equivalent to an optical disc such as a Blu-ray disc (BD), DVD, or compact disc (CD).
  • the analysis substrate 10 is made of, for example, a resin material such as polycarbonate resin or cycloolefin polymer generally used for optical disks.
  • the analysis substrate 10 is not limited to the optical disc described above, and an optical disc conforming to another form or a predetermined standard may be used.
  • the analysis substrate 10 has a reaction region 11.
  • the reaction region 11 is a region to be analyzed in which the detection target substance 13, the particles 14, the antibody 15 and the like are fixed (see FIG. 4).
  • the positioning hole 12 is formed in the central portion of the analysis substrate 10, and eight reactions are performed so that the central portions are located on the same circumference Cb with respect to the center Ca of the analysis substrate 10. Regions 11 are formed at equal intervals. However, the number or formation position of the reaction regions 11 is not limited to this.
  • a track region 10c in which convex portions 10a and concave portions 10b are alternately arranged in the radial direction is formed on the surface of the analysis substrate 10.
  • the convex portion 10 a and the concave portion 10 b are formed in a spiral shape from the inner peripheral portion of the analysis substrate 10 toward the outer peripheral portion.
  • the convex portion 10a corresponds to a land of the optical disc.
  • the recess 10b corresponds to a groove of the optical disc.
  • the track pitch corresponding to the pitch in the radial direction of the recess 10b is, for example, 320 nm.
  • the detection target substance 13 and the particles 14 that bind to the detection target substance 13 are fixed to the surface of the analysis substrate 10.
  • An antibody 15 that specifically binds to the detection target substance 13 is fixed to the surface of the analysis substrate 10.
  • the antibody 15 recognizes and binds to the detection target substance 13, and the detection target substance 13 is captured on the surface of the analysis substrate 10.
  • a plurality of antibodies 16 for recognizing the detection target substance 13 are provided on the particles 14, and the particles 14 are bonded to the detection target substance 13 via the antibodies 16 to form a sandwich structure.
  • the detection target substance 13 is an antigen such as a specific protein associated with a disease, for example. By using such an antigen as the detection target substance 13, it can be used for finding a disease or the like.
  • the detection target substance 13 such as exosome can serve as a biomarker because the concentration in the body fluid changes according to the disease state to be monitored.
  • the size of the exosome that is the detection target substance 13 is about 100 nm.
  • the particle 14 serves as a label for the detection target substance 13.
  • the particles 14 are not particularly limited, and examples thereof include labeling beads such as polymer particles, metal particles, and silica particles.
  • the particles 14 may be magnetic beads containing a magnetic material such as ferrite inside.
  • the size of the particles 14 is about 200 nm.
  • the disk drive 20 is an analysis substrate drive device including a turntable 21, a clamper 22, a turntable drive unit 23, a guide shaft 24, and an optical pickup 25.
  • the disk drive 20 a known information reproducing disk drive can be used.
  • the analysis substrate 10 is placed on the turntable 21 so that the surface on which the reaction region 11 is formed faces downward.
  • the clamper 22 is driven in a direction away from and approaching the turntable 21, that is, in an upward direction and a downward direction in FIG.
  • the analysis substrate 10 is held on the turntable 21 by the clamper 22 and the turntable 21 when the clamper 22 is driven downward.
  • the center Ca of the analysis substrate 10 is held so as to be positioned on the rotation axis C ⁇ b> 1 of the turntable 21.
  • the turntable drive unit 23 rotates the turntable 21 around the rotation axis C1 together with the analysis substrate 10 and the clamper 22.
  • a spindle motor may be used as the turntable driving unit 23.
  • the turntable drive unit 23 is controlled by a turntable drive circuit 44 a of the drive control unit 44.
  • the guide shaft 24 is arranged in parallel to the analysis substrate 10 and along the radial direction of the analysis substrate 10. That is, the guide shaft 24 is disposed along a direction orthogonal to the rotation axis C ⁇ b> 1 of the turntable 21.
  • the optical pickup 25 is supported on the guide shaft 24.
  • the optical pickup 25 is driven in a direction perpendicular to the rotation axis C1 of the turntable 21 along the guide shaft 24, in the radial direction of the analysis substrate 10, and in parallel with the analysis substrate 10.
  • the optical pickup 25 is controlled by the optical pickup driving circuit 44 b of the drive control unit 44.
  • the optical pickup 25 includes an objective lens 25a.
  • the optical pickup 25 irradiates the analysis substrate 10 with irradiation light 25b.
  • the irradiation light 25b is, for example, laser light.
  • the irradiation light 25b is condensed on the surface of the analysis substrate 10 by the objective lens 25a.
  • the optical pickup 25 is driven in the radial direction of the analysis substrate 10 while the analysis substrate 10 is rotated, the irradiation light 25b is scanned along the recess 10b.
  • the optical pickup 25 receives the reflected light from the analysis substrate 10 by the irradiation light 25b and generates a light reception level signal JS. As shown in FIG. 1, the optical pickup 25 outputs a light reception level signal JS to the pulse information extraction unit 31 of the pulse detection circuit 30.
  • the pulse detection circuit 30 includes a pulse information extraction unit 31, a parameter storage unit 32, a pulse determination unit 33, and a pulse counting unit 34.
  • the pulse detection circuit 30 acquires the received light level signal JS output from the disk drive 20, and acquires the counting information of the detection target substance 13 by analyzing the pulse signal caused by the particles 14.
  • the pulse detection circuit 30 is hardware such as a dedicated circuit board.
  • the pulse information extraction unit 31 extracts pulse information from the pulses included in the light reception level signal JS.
  • the pulse information includes, for example, a pulse width and a pulse amplitude.
  • the pulse information extraction unit 31 may read the setting value of the extraction parameter stored in the parameter storage unit 32 and extract the pulse information included in the light reception level signal JS based on the setting value of the extraction parameter. For example, when extracting the pulse width as the pulse information, the extraction voltage V th for extracting the pulse width may be used as the extraction parameter, and the pulse width at the extraction voltage V th may be extracted as the pulse information. When extracting the pulse amplitude as the pulse information, the peak value of the pulse or the like may be extracted as the pulse information.
  • the extracted pulse information is output to the pulse determination unit 33.
  • the parameter storage unit 32 stores setting values of pulse related parameters including extraction parameters and determination parameters.
  • the determination parameter is used to determine whether or not the pulse included in the light reception level signal JS is a pulse caused by the particles 14.
  • the setting value of the determination parameter is a threshold value.
  • the determination parameters include, for example, an amplitude upper limit voltage V H that is a threshold voltage on the upper limit side of the pulse amplitude, an amplitude lower limit voltage V L that is a threshold voltage on the lower limit side of the pulse amplitude, and a pulse that is a threshold time on the upper limit side of the pulse width.
  • width upper limit time T H such as a pulse width limit time T L can be mentioned a threshold time for the lower limit of the pulse width.
  • the pulse determination unit 33 determines whether or not the pulse included in the received light level signal JS exists within a pair of threshold values including an upper limit value and a lower limit value set in the pulse width direction or the pulse amplitude direction. To do. Specifically, the pulse determination unit 33 determines whether or not the pulse width exists within a pair of threshold values for the pulse width, or the pulse amplitude falls within a pair of threshold values for the pulse amplitude. Determine if it exists. The pulse determination unit 33 reads the set value of the determination parameter from the parameter storage unit 32. When the pulse information extracted by the pulse information extraction unit 31 is within the set value range, the pulse determination unit 33 is caused by the particles 14.
  • the pulse determination unit 33 selects any one of a plurality of pairs of threshold values from which a pulse included in the light reception level signal JS is selected. It is determined whether it exists in the range of a pair of threshold values.
  • the pair of threshold values used for the determination may be a pair of threshold values in at least one of the pulse width and the pulse amplitude.
  • the pulse determination unit 33 when the pulse width in the extraction voltage V th is in the range of the pulse width limit time T L ⁇ pulse width upper limit time T H, determines a pulse caused by the particles 14. Further, the pulse determination unit 33 determines that the pulse is caused by the particle 14 when the pulse amplitude is within the range of the amplitude lower limit voltage V L to the amplitude upper limit voltage V H.
  • the pulse determination unit 33 determines that the pulse included in the light reception level signal JS is a pulse caused by the particles 14, the pulse determination unit 33 outputs a detection signal to the pulse counting unit 34 so that the count value is incremented.
  • the pulse counting unit 34 counts pulses existing within a pair of threshold values and outputs a count value. Specifically, the pulse counting unit 34 acquires the detection signal in real time, and counts pulses caused by the particles 14. Although the count value is output from the pulse counting unit 34 to the calculation unit 41 of the system control unit 40, the count value may be output to the display unit 45 so that the user can check the count value. As will be described later, the calculation unit 41 repeatedly changes at least one of the pair of threshold values with a set change as a unit to generate a new pair of threshold values. And the pulse determination part 33 counts the pulse which it determined with existing in the range of the produced
  • the system control unit 40 includes a calculation unit 41, a parameter setting unit 42, a measurement control unit 43, a drive control unit 44, a display unit 45, and a threshold value determination unit 46.
  • the system control unit 40 controls the disk drive 20 and the pulse detection circuit 30, and performs arithmetic processing and setting related to the count value and the determination parameter.
  • the system control unit 40 may be a computer in which a software program is installed.
  • the calculation unit 41 performs processing related to pre-measurement and main measurement as shown in a flowchart of FIG.
  • a measurement for generating a pair of threshold values is performed according to the intensity of the irradiation light 25b and the state of the reflection characteristic of the analysis substrate 10.
  • the detection target substance 13 is actually analyzed using a pair of threshold values generated by the previous measurement.
  • the calculation unit 41 outputs a control command related to pre-measurement such as movement of the optical pickup 25 and rotation of the analysis substrate 10 to the drive control unit 44.
  • the calculating unit 41 repeatedly changes at least one of the pair of threshold values with a set change as a unit to generate a new pair of threshold values. Specifically, the calculation unit 41 generates a pair of threshold values for the pulse width of the pulse included in the light reception level signal JS or a pair of threshold values for the pulse amplitude of the pulse. Then, every time the pulse counting unit 34 counts pulses, the calculation unit 41 repeatedly generates a new pair of threshold values in which at least one of the pair of threshold values is changed until a predetermined value is reached. The calculation unit 41 may generate a new pair of thresholds by repeatedly changing, for example, only the upper or lower threshold value as a unit of change.
  • the calculation unit 41 may generate a new pair of threshold values by repeatedly changing the upper and lower threshold values in units of set changes.
  • both thresholds may be changed while keeping the upper and lower intervals constant.
  • the amount of change for changing the upper and lower thresholds is not necessarily constant. For example, the amount of change in a predetermined range may be set smaller or larger than outside the range.
  • the pulse counting unit 34 counts the pulses that the pulse determination unit 33 determines to be within the range of the pair of threshold values, and the pulses for each change amount. The count value is output.
  • the threshold determination unit 46 determines a pair or a plurality of pairs of thresholds used for the analysis based on the pair of thresholds generated by the calculation unit 41 and the count value output by the pulse counting unit 34.
  • the threshold value determination unit 46 selects a class that is a representative value based on a frequency distribution in which each pair of threshold values generated by the calculation unit 41 is a class and the count value output by the pulse counting unit 34 is a frequency.
  • the count value output by the pulse counter 34 here is the count value of the pulse for each change.
  • the frequency distribution may be a histogram.
  • the representative value may be at least one value selected from the group consisting of an average value, a median value, and a mode value.
  • the mode value may be obtained, for example, by fitting a normal distribution.
  • the threshold value determination unit 46 may select a representative value based on a frequency distribution, which will be described later, and store the selected value in the calculated value storage unit 47.
  • the threshold value determination unit 46 determines a plurality of pairs of threshold values corresponding to a predetermined range of classes from the class that is the representative value, as a plurality of pairs of threshold values used in the analysis.
  • the threshold value determination unit 46 calculates a standard deviation ( ⁇ ) of the frequency distribution, and calculates a plurality of pairs of threshold values included in a class within a predetermined standard deviation range from the class that is the average value. You may determine as a several pairs threshold value used for an analysis. When new pairs of threshold values are determined based on the standard deviation, adjacent ranges may be determined according to the distribution variation.
  • the average value may be calculated by the average value calculation unit of the threshold value determination unit 46 and stored in the calculation value storage unit 47.
  • the standard deviation may be calculated by the standard deviation calculation unit of the threshold value determination unit 46 and stored in a storage unit such as the calculation value storage unit 47.
  • the representative value is an average value
  • the predetermined range is preferably a range of ⁇ 1 ⁇ . That is, it is preferable from the viewpoint of improving the S / N ratio that the threshold value determination unit 46 sets a plurality of pairs of threshold values included in a class within a range of ⁇ 1 ⁇ from a class that is an average value as a selected pair of threshold values.
  • the threshold value determination unit 46 sets a plurality of pairs used in the analysis so that the area of the histogram centered on the representative value is equal to or less than a predetermined ratio with respect to the total area of the histogram. It may be determined as a threshold value. From the viewpoint of improving the S / N ratio, the predetermined ratio is preferably 30% or less, and more preferably 10% or less.
  • the threshold values used for the analysis are not limited to a plurality of pairs, and may be a pair of threshold values.
  • the calculated value storage unit 47 stores calculated values such as representative values and standard deviations selected by the threshold value determining unit 46.
  • the parameter setting unit 42 receives the output from the calculation unit 41 and causes the parameter storage unit 32 to store the parameter value to be set.
  • the measurement control unit 43 manages the execution of the previous measurement and the main measurement.
  • the measurement control unit 43 may include an input unit that allows the user to select whether to perform the previous measurement or the main measurement.
  • the measurement control unit 43 instructs the drive control unit 44 to start, stop, and end counting based on the information selected by the input unit, and commands the arithmetic processing unit 41 and the threshold value determination unit 46 to perform arithmetic processing. You may do it.
  • the drive control unit 44 receives the input from the measurement control unit 43 and controls the disk drive 20.
  • the drive control unit 44 can control measurement positions such as a measurement start position and a measurement end position of the analysis substrate 10.
  • the drive control unit 44 may include, for example, a turntable drive circuit 44a, an optical pickup drive circuit 44b, and the like.
  • the turntable drive circuit 44a controls the turntable drive unit 23.
  • the turntable driving circuit 44 a controls the turntable driving unit 23 so that the turntable 21 rotates at a constant linear velocity together with the analysis substrate 10 and the clamper 22.
  • the optical pickup driving circuit 44b controls the driving of the optical pickup 25.
  • the optical pickup driving circuit 44b moves the optical pickup 25 along the guide shaft 24 or moves the objective lens 25a of the optical pickup 25 in the vertical direction.
  • the drive control unit 44 controls the disk drive 20 so that the same position is repeatedly measured every time at least one of the pair of threshold values is changed by the calculation unit 41 during the previous measurement.
  • the drive control unit 44 controls the optical pickup 25 so that the optical pickup 25 moves to a measurement start position, a measurement end position, and the like.
  • the pre-measurement range is preferably narrower than the main measurement range. Specifically, it is preferable that the area for counting pulses existing in the range of the new pair of threshold values obtained by changing the calculation unit 41 is narrower than the area for counting with the pair of threshold values used for analysis.
  • the measurement start position and the measurement end position may be set in advance, and the measurement start position and the measurement end position may be determined so that a predetermined count value is obtained at the time of the previous measurement.
  • the measurement start position and the measurement end position are set in advance, it is only necessary to repeat counting while changing at least one of the pair of threshold values, which is preferable because calibration can be simplified.
  • the pre-measurement can be performed with a count value of a predetermined amount or more, and stable pre-measurement can be performed.
  • the measurement start position and measurement end position of the disk drive 20 are controlled via the calculation unit 41. However, since it takes time if the entire measurement target area measured in the main measurement is the target of the previous measurement, it is preferable that the area is near the center of the main measurement measurement area and narrower than the entire measurement target area.
  • the display unit 45 can present information related to the previous measurement or the main measurement to the user.
  • the information related to the previous measurement includes additional information such as the accuracy of the previous measurement that allows the user to select the next process.
  • Examples of the information related to the main measurement include a count value in the main measurement.
  • each step in the threshold value determination method for analysis according to the present embodiment will be described using the flowchart shown in FIG.
  • a system in which a downward convex pulse is generated when particles 14 are present in a graph in which the horizontal axis represents the scanning time (scanning position) and the vertical axis represents the voltage will be described.
  • the amplitude lower limit voltage V L , the amplitude upper limit voltage V H and the extraction voltage V th are integers in the range of 0 to +100 proportional to the voltage will be described.
  • the signal level when no reflected light is detected is 100
  • the signal level when the particle 14 and foreign matter are not present on the analysis substrate 10 is the reference voltage V base
  • the particle 14 is present. Is a system that takes a value smaller than the reference voltage Vbase . Note that the value of the reference voltage V base depends on the state of the analysis substrate 10 and the intensity of the irradiation light 25b.
  • the signal intensity (voltage value) of the light reception level signal may be used as it is, and the amplitude lower limit voltage V L , the amplitude upper limit voltage V H and the extraction voltage V th may be decimal numbers.
  • the reference voltage V base may be set to 0, and a system in which an upward convex pulse is generated when the particle 14 is present by inverting the polarity of the pulse may be used.
  • step S1 whether or not to perform the previous measurement is selected.
  • the calculation unit 41 proceeds to step S2, and when the pre-measurement is not performed (NO), the calculation unit 41 proceeds to step S10.
  • the analysis conditions are the same, it is not necessary to perform the previous measurement every time, so the process may be advanced to step S10 in order to perform only the main measurement.
  • Whether to perform the pre-measurement may be selected by the user via a graphical user interface (GUI) or the like, or the calculation unit 41 may determine based on information such as a use period or the number of uses.
  • GUI graphical user interface
  • step S2 the calculation unit 41 controls the parameter setting unit 42 to set the value of the amplitude lower limit voltage V L to 0.
  • the calculation unit 41 controls the parameter setting unit 42 to set the value of the amplitude upper limit voltage V H to V max that is sufficiently larger than the initial value V H0 that is a preset value.
  • the calculation unit 41 sets the value of the extraction voltage V th in advance.
  • the parameter setting unit 42 may be controlled so as to set the initial value V th0 that is the calculated value.
  • the calculating part 41 advances a process to step S3.
  • step S3 the calculation unit 41 controls the drive control unit 44 to count the particles 14. Specifically, the calculation unit 41 moves the optical pickup 25 in the radial direction of the analysis substrate 10 from the measurement start position for the previous measurement to the measurement end position, or rotates the analysis substrate 10 at a constant speed. The drive control unit 44 is controlled to do so.
  • the counting of the particles 14 is performed by the pulse detection circuit 30.
  • the optical pickup 25 irradiates the analysis substrate 10 on which the detection target substance 13 and the particles 14 bound to the detection target substance 13 are fixed on the surface with the irradiation light 25b (irradiation step). And the optical pick-up 25 receives the reflected light from the board
  • the pulse information extraction unit 31 acquires the pulse information of the pulses included in the generated light reception level signal JS.
  • the pulse determination unit 33 determines whether or not the pulse included in the light reception level signal JS is within a pair of threshold values set for the pulse width or a pair of threshold values set for the pulse amplitude. (First determination step). When the pulse determination unit 33 determines that the pulse included in the light reception level signal JS is within the pair of threshold values, the pulse determination unit 33 outputs a detection signal to the pulse counting unit 34 so that the count value is incremented.
  • the pulse counting unit 34 counts pulses existing within a pair of threshold values and outputs the count value to the calculation unit 41. In other words, the pulse counting unit 34 counts the pulses determined to be within the range of the set pair of threshold values in the first determination step, and outputs the counted value of the counted pulses (count value output step). . Then, the process proceeds to step S4.
  • step S4 the calculation unit 41 stores the count value of the particles 14 obtained by the previous measurement in step S3 in the count table in association with the set value of the amplitude lower limit voltage VL . Then, the process proceeds to step S5.
  • step S5 the calculation unit 41 controls the parameter setting unit 42 so as to reset the amplitude lower limit voltage VL stored in the parameter storage unit 32 with an incremented value.
  • the calculating part 41 has added 1 to the original amplitude lower limit voltage VL , the numerical value to add may not be 1.
  • FIG. And the calculating part 41 advances a process to step S6.
  • step S6 the arithmetic unit 41 determines whether the setting value of the amplitude lower limit voltage V L is equal to or higher than V max.
  • the calculation unit 41 proceeds to step S3 when the set value of the amplitude lower limit voltage V L is less than V max (NO), and proceeds to step S3 when the set value of the amplitude lower limit voltage V L is greater than or equal to V max (YES).
  • the process proceeds to step S7.
  • the calculation unit 41 sets a new pair of threshold values obtained by changing at least one of the pair of threshold values each time the pulse counting unit 34 counts pulses in the count value output step. These are repeatedly generated until reaching a predetermined value (threshold generation step). Specifically, the calculation unit 41 repeatedly adds one to the amplitude lower limit voltage V L one by one to change to a different series of values, that is, a new pair of threshold values, and obtains a plurality of values of the amplitude lower limit voltage V L.
  • a counting table as shown in FIG. 7 is completed.
  • threshold values of a plurality of values are stored in the left column, and count values counted for each pair of threshold values obtained by changing are stored in the right column.
  • the count table stores count values Count (v n ) respectively associated with the set value V n of the amplitude lower limit voltage V L.
  • the count value Count (v n ) indicates a count value when the set value of the amplitude lower limit voltage V L is v n (here, n is an integer from 0 to V max ).
  • step S7 the pulse counting unit 34 counts the pulses that the pulse determining unit 33 determines to be within the range of each pair of threshold values in the plurality of pairs of threshold values, and outputs a pulse count value for each change.
  • the pulse count value for each change is represented by dCount (v n ) as shown in the following formula (1).
  • step S8 the threshold value determination unit 46 uses the pair of threshold values generated in the threshold value generation step as a class, and the class that is a representative value based on the frequency distribution in which the count value output in the count value output step is a frequency. (Representative value selection step). The threshold value determination unit 46 stores the selected representative value in the calculated value storage unit 47.
  • step S ⁇ b> 9 the threshold determination unit 46 reads the representative value from the calculation value storage unit 47. Then, the threshold determination unit 46 determines a pair or a plurality of pairs of thresholds corresponding to a class within a predetermined range from the class that is the representative value as a pair or a plurality of pairs of thresholds used in the analysis (threshold determination step).
  • FIG. 8B illustrates a case where the representative value is an average value and the threshold value is included in a range of ⁇ 1 ⁇ from the average value.
  • ⁇ is a standard deviation. As shown in FIG.
  • the threshold value determination unit 46 calculates the amplitude lower limit voltage V L and the amplitude upper limit voltage V H so as to be within a range of ⁇ 1 ⁇ around the average value Va. That is, the amplitude lower limit voltage V L and the amplitude upper limit voltage V H are calculated as in the following formulas (2) and (3).
  • V L Va ⁇ (2)
  • V H Va + ⁇ (3)
  • FIG. 8C illustrates a case where the threshold value is within a range of ⁇ 3 ⁇ from the average value.
  • the threshold value when the threshold value is within a range of ⁇ 3 ⁇ from the average value, most of the pulses caused by the particles 14 can be counted.
  • the nanometer-order particle 14 when used as the particle 14, it is often difficult to make the size of the particle 14 uniform.
  • the particles 14 include a magnetic metal material, the reflection characteristics of the particles 14 change.
  • the particle diameter of the particles 14 is small, it is often difficult to make the reflection characteristics uniform. In such a case, as shown in FIG. 8C, a large number of pulses due to noise tend to be counted.
  • the calculating part 41 advances a process to step S10.
  • step S10 the calculation unit 41 controls the drive control unit 44 to count the particles 14 by the main measurement with any one of the plurality of threshold values selected in the previous measurement. Specifically, the calculation unit 41 moves the optical pickup 25 in the radial direction of the analysis substrate 10 from the measurement start position for the main measurement to the measurement end position, or rotates the analysis substrate 10 at a constant speed. The drive control unit 44 is controlled.
  • the drive control unit 44 controls the disk drive 20 to perform the main measurement of the analysis substrate 10 from the measurement start position set for the main measurement to the measurement end position, and counts pulses caused by the particles 14 in the pulse detection circuit 30. .
  • the counting of the particles 14 is performed by the pulse detection circuit 30 in the same manner as in step S3 except that the counting is performed with any one of the plurality of thresholds determined in the previous measurement.
  • the pulse determination unit 33 determines whether or not the pulse included in the light reception level signal JS exists within the range of any one of the plurality of thresholds determined (second second). Judgment step). And the calculating part 41 advances a process to step S11.
  • step S11 the count value in the main measurement is displayed on the display unit 45, and the main measurement is completed.
  • one threshold value of a pair of threshold values is repeatedly changed with a set change amount as a unit.
  • both of the pair of threshold values are repeatedly changed with a change amount set as a unit. You may let them.
  • a distribution corresponding to dCount (v n ) may be directly obtained.
  • the condition before the measurement termination in step S6 may be, for example, when the set value of the V H becomes V max.
  • the method of correcting the amplitude lower limit voltage V L and the amplitude upper limit voltage V H by counting while changing the amplitude lower limit voltage V L or the amplitude upper limit voltage V H has been described.
  • the pulse waveform is considered as a normal distribution, the pulse amplitude and the pulse width are proportional. Therefore, the amplitude lower limit voltage V L pulse width limit time T L, by replacing the amplitude upper limit voltage V H to the pulse width upper limit time T H, even when the same measurement, the same effect can be obtained.
  • the analysis threshold value determining apparatus 100 irradiates the analysis substrate 10 with the irradiation light 25b, receives the reflected light from the analysis substrate 10 by the irradiation light 25b, and outputs the received light level signal JS.
  • An optical pickup 25 is provided on the analysis substrate 10, a detection target substance 13 and particles 14 bonded to the detection target substance 13 are fixed to the surface.
  • the analysis threshold value determining apparatus 100 includes a calculation unit 41 that generates a pair of threshold values for the pulse width of a pulse included in the received light level signal JS or a pair of threshold values for the pulse amplitude of the pulse.
  • the analysis threshold value determining apparatus 100 determines whether or not the pulse width exists within a pair of threshold values for the pulse width, or whether the pulse amplitude exists within a pair of threshold values for the pulse amplitude.
  • a pulse determination unit 33 is provided for determining whether or not.
  • the analysis threshold value determining apparatus 100 includes a pulse counting unit 34 that counts pulses determined to be within the range of the pair of threshold values generated by the pulse determining unit 33 and outputs a count value of the counted pulses.
  • the threshold determination device 100 for analysis determines a threshold value determination unit 46 that determines a pair or threshold values used for analysis based on the pair of threshold values generated by the calculation unit 41 and the count value output by the pulse counting unit 34. Is provided.
  • the calculation unit 41 Each time the pulse counting unit 34 counts pulses, the calculation unit 41 repeatedly generates a new pair of threshold values in which at least one of the pair of threshold values is changed until a predetermined value is reached.
  • the threshold value determination unit 46 selects a class as a representative value based on a frequency distribution in which each pair of generated threshold values is a class and the count value output by the pulse counting unit 34 is a frequency.
  • the threshold value determination unit 46 determines a pair or a plurality of threshold values corresponding to a predetermined range of classes from the class that is the representative value.
  • the analysis threshold value determining method includes an irradiation step of irradiating the irradiation substrate 25 with the irradiation light 25b on the analysis substrate 10 on which the detection target substance 13 and the particles 14 bound to the detection target substance 13 are fixed.
  • the analysis threshold value determining method includes a signal generation step of receiving the reflected light from the analysis substrate 10 by the irradiation light 25b and generating the received light level signal JS.
  • the threshold determination method for analysis determines whether the pulse included in the light reception level signal JS is within a range of a pair of thresholds set for the pulse width or a pair of thresholds set for the pulse amplitude. Including a determination step.
  • the analysis threshold value determining method includes a count value output step of counting the pulses determined to be within the range of the set pair of threshold values in the determination step and outputting the count value of the counted pulses.
  • the threshold determination method for analysis is a threshold that repeatedly generates a new pair of threshold values, each of which is a change in at least one of the pair of threshold values, every time a pulse is counted in the count value output step until a predetermined value is reached. Includes a generation step.
  • a threshold value determination method for analysis is a representative value selection step of selecting a class as a representative value based on a frequency distribution in which each pair of generated threshold values is a class and the count value output in the count value output step is a frequency. including.
  • the analysis threshold value determining method includes a threshold value determining step of determining a pair or a plurality of pairs of threshold values corresponding to a class within a predetermined range from the class as a representative value as a pair or a plurality of pairs of threshold values used for the analysis.
  • the ratio of noise to the detection target substance 13 tends to increase.
  • the range close to the representative value of the histogram is set as a new pair of threshold values, so that the pulse amplitude and pulse close to the representative value are obtained. Only pulses having a width or the like can be counted. Therefore, compared with the case where the upper limit and the lower limit of the threshold value are set wider, the detection ratio of pulses caused by noise becomes lower, so that the S / N ratio can be improved.
  • the shape of the histogram may be different for each measurement region.
  • by selecting a representative value for each measurement region and performing the main measurement it is possible to derive a count result having a higher S / N ratio for each measurement region.
  • the analysis substrate 10 has a plurality of analysis target regions in which the detection target substance 13 and the particles 14 are fixed to the surface.
  • the analysis target region may be a plurality of reaction regions 11 formed on the analysis substrate 10 as shown in FIGS.
  • the reaction region 11 may be formed using, for example, a well.
  • a pre-measurement is performed for each reaction region 11 and a representative value is selected. That is, the threshold determination unit 46 determines a threshold for each reaction region 11. According to this embodiment, since a new pair of threshold values is determined for each reaction region 11, counting can be performed with a high S / N ratio for each reaction region 11.
  • the analysis target region may be a plurality of divided regions 11a formed by dividing the reaction region 11 as shown in FIG.
  • the pre-measurement is performed for each divided region 11a, and the representative value is determined. That is, the threshold determination unit 46 determines a threshold for each divided region 11a. Even within the same reaction region 11, there are places where there are many and few particles 14 in the planar direction of the reaction region 11, and it is also expected that the optimum value of the pulse amplitude representative value varies. However, according to the present embodiment, since the threshold value is determined for each divided region 11a, counting can be performed with a high S / N ratio for each divided region 11a. In addition, when determining a representative value for every division area 11a, the method of specifying the division area 11a to measure is not specifically limited.
  • step S1 to step S8 as in the first embodiment, the threshold value determination unit 46 selects a pulse amplitude representative value and stores it in the calculated value storage unit 47. Then, the process proceeds to step S12.
  • step S12 it is determined whether or not all analysis target regions such as the reaction region 11 have been pre-measured. For example, when there are N analysis target regions, it is determined whether all N regions have been measured before. At this time, it may be determined whether only the analysis region to be focused on has been pre-measured instead of all N. If all the analysis target areas have not been previously measured (NO), the process returns to step S2. On the other hand, when all the analysis target areas have been pre-measured (YES), the process proceeds to step S9.
  • step S9 to step S10 as in the first embodiment, a range close to the representative value is set, and a specific area is counted by this measurement. And the calculating part 41 advances a process to step S13.
  • step S13 when the number of analysis target areas is less than N (NO), the calculation unit 41 moves the measurement target to the next analysis area and returns the process to step S10. On the other hand, when the number of analyzed areas to be analyzed reaches N (YES), the calculation unit 41 advances the processing to step S11 and displays the count value in the main measurement on the display unit 45.
  • the measurement control unit 43 is controlled to end the measurement.
  • an analysis threshold determination device and an analysis threshold determination method capable of counting with a high S / N ratio it is possible to provide an analysis threshold determination device and an analysis threshold determination method capable of counting with a high S / N ratio.

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Abstract

分析用閾値決定装置（１００）は、演算部（４１）が生成した一対の閾値と、パルス計数部（３４）が出力した計数値と、に基づいて、分析に用いる一対または複数対の閾値を決定する閾値決定部（４６）を備える。演算部（４１）は、パルス計数部（３４）がパルスを計数するごとに、一対の閾値のうちの少なくとも一方の閾値を変化させた新たな一対の閾値を、所定の値に至るまで繰り返し生成する。閾値決定部（４６）は、生成された各一対の閾値を階級とし、パルス計数部（３４）が出力した計数値を度数とした度数分布に基づいて、代表値である階級を選択する。閾値決定部（４６）は、代表値である階級から所定の範囲の階級に対応した一対または複数対の閾値を決定する。

Description

分析用閾値決定装置及び分析用閾値決定方法
　本開示は、分析用閾値決定装置及び分析用閾値決定方法に関する。詳細には、本開示は、抗原、抗体等の生体物質を分析するための分析用閾値決定装置及び分析用閾値決定方法に関する。
　疾病に関連付けられた特定の抗原又は抗体をバイオマーカーとして検出することで、疾病の発見及び治療の効果等を定量的に分析する免疫検定法（immunoassay）が知られている。酵素により標識された抗原又は抗体を検出するＥＬＩＳＡ法（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay）は免疫検定法の一つであり、コスト等のメリットから広く普及している。
　しかしながら、ＥＬＩＳＡ法は、前処理、抗原抗体反応、Ｂ／Ｆ（bond/free）分離、酵素反応等を合計した時間が数時間から１日程度であり、分析に長時間を要する。そこで、光ディスクに固定された抗体と試料中の抗原を結合させ、抗原に抗体が設けられた粒子をさらに結合させ、光ヘッドで走査することにより、光ディスク上に捕捉された粒子を短時間に計数する技術が提案されている（例えば、特許文献１参照）。また、光ディスクのトラッキング構造が形成される面に生体試料及び粒子を付着させ、光ピックアップで信号の変化を検出する技術が提案されている（例えば、特許文献２参照）。
特開平５－５７４１号公報 特表２００２－５３０７８６号公報
　パルスは、光ディスクに付着した粒子に起因して、光ディスクからの反射信号として生成されるため、このパルスを利用することにより粒子が計数される。
　しかしながら、光ディスクに付着させる粒子は非常に小さく、ナノレベルオーダーであることもある。そのため、粒子の大きさを一定に保つことは一般的に困難であるため、パルスのパルス幅及びパルス振幅のばらつきが大きくなる。また、粒子が金属などを含む場合、光の反射特性に影響を及ぼしやすいため、パルス幅及びパルス振幅のばらつきがより顕著になりやすい。
　そのため、多くのパルスを計数しようとしても粒子に起因するパルス以外の信号も計数してしまうおそれがあり、Ｓ／Ｎ比が低下してしまうというおそれがあった。
　本開示は、このような従来技術の有する課題に鑑みてなされたものである。そして、本開示の目的は、Ｓ／Ｎ比の高い計数が可能な分析用閾値決定装置及び分析用閾値決定方法を提供することにある。
　上記課題を解決するために、本開示の態様に係る分析用閾値決定装置は、分析用基板に照射光を照射し、照射光による分析用基板からの反射光を受光して受光レベル信号を生成する光ピックアップを備える。分析用基板には、検出対象物質と検出対象物質に結合する粒子とが表面に固定されている。分析用閾値決定装置は、受光レベル信号に含まれるパルスのパルス幅について一対の閾値、またはパルスのパルス振幅について一対の閾値を生成する演算部を備える。分析用閾値決定装置は、パルス幅がパルス幅についての一対の閾値の範囲内に存在するか否かを判定するか、またはパルス振幅がパルス振幅についての一対の閾値の範囲内に存在するか否かを判定するパルス判定部を備える。分析用閾値決定装置は、パルス判定部が生成された一対の閾値の範囲内に存在すると判定したパルスを計数し、計数したパルスの計数値を出力するパルス計数部を備える。分析用閾値決定装置は、演算部が生成した一対の閾値と、パルス計数部が出力した計数値と、に基づいて、分析に用いる一対または複数対の閾値を決定する閾値決定部を備える。演算部は、パルス計数部がパルスを計数するごとに、一対の閾値のうちの少なくとも一方の閾値を変化させた新たな一対の閾値を、所定の値に至るまで繰り返し生成する。閾値決定部は、生成された各一対の閾値を階級とし、パルス計数部が出力した計数値を度数とした度数分布に基づいて、代表値である階級を選択する。閾値決定部は、代表値である階級から所定の範囲の階級に対応した一対または複数対の閾値を決定する。
　上記課題を解決するために、本開示の態様に係る分析用閾値決定方法は、検出対象物質と検出対象物質に結合する粒子とが表面に固定された分析用基板に照射光を照射する照射ステップを含む。分析用閾値決定方法は、照射光による分析用基板からの反射光を受光して受光レベル信号を生成する信号生成ステップを含む。分析用閾値決定方法は、受光レベル信号に含まれるパルスが、パルス幅について設定された一対の閾値、またはパルスがパルス振幅について設定された一対の閾値の範囲内に存在するか否かを判定する判定ステップを含む。分析用閾値決定方法は、判定ステップにおいて、設定された一対の閾値の範囲内に存在すると判定されたパルスを計数し、計数したパルスの計数値を出力する計数値出力ステップを含む。分析用閾値決定方法は、計数値出力ステップにおいてパルスを計数するごとに、一対の閾値のうちの少なくとも一方の閾値を変化させた新たな一対の閾値を、所定の値に至るまで繰り返し生成する閾値生成ステップを含む。分析用閾値決定方法は、生成された各一対の閾値を階級とし、計数値出力ステップで出力された計数値を度数とした度数分布に基づいて、代表値である階級を選択する代表値選択ステップを含む。分析用閾値決定方法は、代表値である階級から所定の範囲の階級に対応した一対または複数対の閾値を、分析に用いる一対または複数対の閾値として決定する閾値決定ステップを含む。
図１は、第１実施形態に係る分析用閾値決定装置を含む分析装置の構成を示すブロック図である。 図２は、反応領域を有する分析用基板の一例を示す上面図である。 図３は、反応領域のトラック領域に粒子が捕獲されている状態を拡大して示した上面図である。 図４は、検出対象物質が抗体と粒子とによってトラック領域の凹部にサンドイッチ捕獲されている状態を示す模式的な断面図である。 図５は、本実施形態に係るディスクドライブの一例を示す概略図である。 図６は、第１実施形態に係る分析用閾値決定方法の一例を示すフローチャートである。 図７は、本実施形態に係る計数テーブルの一例を示す図である。 図８Ａは、得られたヒストグラムの一例を示す図である。 図８Ｂは、図８Ａにおける領域Ｇ１を抜き取ったグラフの概要を示す図である。 図８Ｃは、図８Ａにおける領域Ｇ２を抜き取ったグラフの概要を示す図である。 図９は、反応領域ごとに前測定を実施する様子を示す模式図である。 図１０は、分割領域ごとに前測定を実施する様子を示す模式図である。 図１１は、第２実施形態に係る分析用閾値決定方法の一例を示すフローチャートである。
　以下、本実施形態に係る分析用閾値決定装置及び分析用閾値決定方法について説明する。なお、図面の寸法比率は説明の都合上誇張されており、実際の比率とは異なる場合がある。
　［第１実施形態］
　まず、第１実施形態に係る分析用閾値決定装置及び分析用閾値決定方法について詳細に説明する。
　図１に示すように、本実施形態に係る分析用閾値決定装置１００は、パルス検出回路３０と、システム制御部４０と、を備える。この実施形態では、分析用閾値決定装置１００と、ディスクドライブ２０とを備えた分析装置２００を例として説明する。
　ディスクドライブ２０では、分析用基板１０が再生される。分析用基板１０は、例えば、ブルーレイディスク（ＢＤ）、ＤＶＤ、コンパクトディスク（ＣＤ）等の光ディスクと同等の円板形状を有する。分析用基板１０は、例えば、一般的に光ディスクに用いられるポリカーボネート樹脂又はシクロオレフィンポリマー等の樹脂材料で形成されている。なお、分析用基板１０は、上記の光ディスクに限定されるものではなく、他の形態又は所定の規格に準拠した光ディスクを用いることもできる。
　図２に示すように、分析用基板１０は、反応領域１１を有する。反応領域１１は、検出対象物質１３、粒子１４及び抗体１５などが固定された分析対象となる領域である（図４参照）。本実施形態では、分析用基板１０の中心部に位置決め孔１２が形成されており、分析用基板１０の中心Ｃａに対して同一円周Ｃｂ上に中心部がそれぞれ位置するように、８つの反応領域１１が等間隔に形成されている。ただし、反応領域１１の数又は形成位置はこれに限定されるものではない。
　図３に示すように、分析用基板１０の表面には、凸部１０ａと凹部１０ｂとが半径方向に交互に配置されたトラック領域１０ｃが形成されている。凸部１０ａ及び凹部１０ｂは、分析用基板１０の内周部から外周部に向かってスパイラル状に形成されている。凸部１０ａは光ディスクのランドに相当する。凹部１０ｂは光ディスクのグルーブに相当する。凹部１０ｂの半径方向のピッチに相当するトラックピッチは例えば３２０ｎｍである。
　図３及び図４に示すように、分析用基板１０の表面には、検出対象物質１３と検出対象物質１３に結合する粒子１４とが固定されている。分析用基板１０の表面には、検出対象物質１３と特異的に結合する抗体１５が固定されている。抗体１５は検出対象物質１３を認識して結合し、検出対象物質１３が分析用基板１０の表面に捕捉される。一方、粒子１４には検出対象物質１３を認識する抗体１６が複数設けられており、粒子１４は抗体１６を介して検出対象物質１３と結合し、サンドイッチ構造を形成している。
　検出対象物質１３は、例えば疾病に関連付けられた特定のタンパク質などの抗原である。このような抗原を検出対象物質１３として用いることにより、疾病の発見などに役立てることができる。例えばエクソソームなどの検出対象物質１３は、モニタリング対象の疾患状態に応じ、体液内の濃度が変化するため、バイオマーカーとしての役割を果たすことができる。検出対象物質１３であるエクソソームの大きさは１００ｎｍ程度である。
　粒子１４は、検出対象物質１３の標識となる。粒子１４としては、特に限定されないが、例えばポリマー粒子、金属粒子、シリカ粒子などの標識用ビーズなどが挙げられる。粒子１４は、内部にフェライト等の磁性材料を含む磁気ビーズなどであってもよい。粒子１４の大きさは２００ｎｍ程度である。
　図５に示すように、ディスクドライブ２０は、ターンテーブル２１と、クランパ２２と、ターンテーブル駆動部２３と、ガイド軸２４と、光ピックアップ２５と、を備える分析用基板駆動装置である。ディスクドライブ２０は、周知の情報再生用ディスクドライブを用いることができる。
　ターンテーブル２１上には、反応領域１１が形成された面が下向きになるように分析用基板１０が載置される。
　クランパ２２は、ターンテーブル２１に対して離隔する方向及び接近する方向、すなわち、図５の上方向及び下方向に駆動される。分析用基板１０は、クランパ２２が下方向に駆動されると、クランパ２２とターンテーブル２１とによって、ターンテーブル２１上に保持される。具体的には、分析用基板１０の中心Ｃａがターンテーブル２１の回転軸Ｃ１上に位置するように保持される。
　ターンテーブル駆動部２３は、ターンテーブル２１を分析用基板１０及びクランパ２２と共に、回転軸Ｃ１回りに回転駆動させる。ターンテーブル駆動部２３としてスピンドルモータを用いてもよい。ターンテーブル駆動部２３は、ドライブ制御部４４のターンテーブル駆動回路４４ａによって制御される。
　ガイド軸２４は、分析用基板１０と平行に、かつ、分析用基板１０の半径方向に沿って配置されている。すなわち、ガイド軸２４は、ターンテーブル２１の回転軸Ｃ１に直交する方向に沿って配置されている。
　光ピックアップ２５はガイド軸２４に支持されている。光ピックアップ２５は、ガイド軸２４に沿って、ターンテーブル２１の回転軸Ｃ１に直交する方向であり、分析用基板１０の半径方向に、かつ、分析用基板１０と並行に駆動される。光ピックアップ２５は、ドライブ制御部４４の光ピックアップ駆動回路４４ｂによって制御される。
　光ピックアップ２５は対物レンズ２５ａを備えている。光ピックアップ２５は分析用基板１０に照射光２５ｂを照射する。照射光２５ｂは例えばレーザ光である。照射光２５ｂは対物レンズ２５ａによって分析用基板１０の表面に集光される。分析用基板１０を回転させた状態で光ピックアップ２５が分析用基板１０の半径方向に駆動されることにより、照射光２５ｂは凹部１０ｂに沿って走査される。
　光ピックアップ２５は照射光２５ｂによる分析用基板１０からの反射光を受光して受光レベル信号ＪＳを生成する。図１に示すように、光ピックアップ２５は、受光レベル信号ＪＳをパルス検出回路３０のパルス情報抽出部３１へ出力する。
　図１に示すように、パルス検出回路３０は、パルス情報抽出部３１と、パラメータ記憶部３２と、パルス判定部３３と、パルス計数部３４と、を備える。
　パルス検出回路３０は、ディスクドライブ２０から出力された受光レベル信号ＪＳを取得し、粒子１４に起因するパルス信号の解析を行うことで検出対象物質１３の計数情報を取得する。パルス検出回路３０は、例えば専用回路基板などのハードウェアである。
　パルス情報抽出部３１は、受光レベル信号ＪＳに含まれるパルスからパルス情報を抽出する。パルス情報には、例えば、パルス幅及びパルス振幅などが含まれる。パルス情報抽出部３１は、パラメータ記憶部３２に記憶されている抽出パラメータの設定値を読み出し、抽出パラメータの設定値に基づいて受光レベル信号ＪＳに含まれるパルス情報を抽出してもよい。例えば、パルス情報としてパルス幅を抽出する場合、パルス幅を抽出するための抽出電圧Ｖｔｈを抽出パラメータとし、抽出電圧Ｖｔｈにおけるパルス幅をパルス情報として抽出してもよい。また、パルス情報としてパルス振幅を抽出する場合、パルスのピーク値などをパルス情報として抽出してもよい。抽出されたパルス情報は、パルス判定部３３に出力される。
　パラメータ記憶部３２は、抽出パラメータと判定パラメータとを含むパルス関連パラメータの設定値を記憶する。判定パラメータは受光レベル信号ＪＳに含まれるパルスが粒子１４に起因するパルスか否かを判定するために用いられる。本実施形態において、判定パラメータの設定値は閾値である。判定パラメータとしては、例えば、パルス振幅の上限側の閾値電圧である振幅上限電圧ＶＨ、パルス振幅の下限側の閾値電圧である振幅下限電圧ＶＬ、パルス幅の上限側の閾値時間であるパルス幅上限時間ＴＨ、パルス幅の下限側の閾値時間であるパルス幅下限時間ＴＬなどが挙げられる。
　パルス判定部３３は、受光レベル信号ＪＳに含まれるパルスが、パルス幅の方向またはパルス振幅の方向に設定された上限値及び下限値からなる一対の閾値の範囲内に存在するか否かを判定する。具体的には、パルス判定部３３は、パルス幅がパルス幅についての一対の閾値の範囲内に存在するか否かを判定するか、またはパルス振幅がパルス振幅についての一対の閾値の範囲内に存在するか否かを判定する。パルス判定部３３はパラメータ記憶部３２から判定パラメータの設定値を読み出し、パルス情報抽出部３１で抽出されたパルス情報が設定値の範囲内であった場合に、パルス判定部３３は粒子１４に起因したパルスと判定する。なお、後述するように、演算部４１によって選択された複数対の閾値が導き出されると、パルス判定部３３は、受光レベル信号ＪＳに含まれるパルスが選択された複数対の閾値のうちのいずれかの一対の閾値の範囲内に存在するか否かを判定する。
　判定に用いる一対の閾値は、パルス幅及びパルス振幅の少なくともいずれか一方における一対の閾値であってもよい。例えば、パルス判定部３３は、抽出電圧Ｖｔｈにおけるパルス幅がパルス幅下限時間ＴＬ～パルス幅上限時間ＴＨの範囲内である場合に、粒子１４に起因したパルスと判定する。また、パルス判定部３３は、パルス振幅が振幅下限電圧ＶＬ～振幅上限電圧ＶＨの範囲内である場合に、粒子１４に起因したパルスと判定する。パルス判定部３３は、受光レベル信号ＪＳに含まれるパルスが粒子１４に起因するパルスと判定した場合に、計数値がインクリメントされるようパルス計数部３４に検出信号を出力する。
　パルス計数部３４は一対の閾値の範囲内に存在するパルスを計数して計数値を出力する。具体的には、パルス計数部３４は、検出信号をリアルタイムで取得し、粒子１４に起因するパルスを計数する。計数値はパルス計数部３４からシステム制御部４０の演算部４１に出力されるが、ユーザが計数値を確認できるように計数値を表示部４５に出力してもよい。なお、後述するように、演算部４１は一対の閾値のうちの少なくとも一方の閾値を設定された変化分を単位として繰り返し変化させて、新たな一対の閾値を生成する。そして、パルス判定部３３がその生成された一対の閾値の範囲内に存在すると判定したパルスを計数し、変化分ごとのパルスの計数値を出力する。
　図１に示すように、システム制御部４０は、演算部４１と、パラメータ設定部４２と、測定制御部４３と、ドライブ制御部４４と、表示部４５と、閾値決定部４６と、を備える。
　システム制御部４０は、ディスクドライブ２０及びパルス検出回路３０を制御し、計数値、判定パラメータに関する演算処理及び設定を実施する。システム制御部４０は、ソフトウェアプログラムがインストールされたコンピュータであってもよい。
　演算部４１は、後述する図６のフローチャートに示されるような前測定及び本測定に関する処理を実行する。前測定では、照射光２５ｂの強度及び分析用基板１０の反射特性の状態などに応じて一対の閾値を生成するための測定が実施される。本測定では、前測定によって生成された一対の閾値で検出対象物質１３が実際に分析される。
　演算部４１は、ドライブ制御部４４に対し、光ピックアップ２５の移動及び分析用基板１０の回転などの前測定に関する制御命令を出力する。
　演算部４１は、一対の閾値のうちの少なくとも一方の閾値を設定された変化分を単位として繰り返し変化させて、新たな一対の閾値を生成する。具体的には、演算部４１は、受光レベル信号ＪＳに含まれるパルスのパルス幅について一対の閾値、またはパルスのパルス振幅について一対の閾値を生成する。そして、演算部４１は、パルス計数部３４がパルスを計数するごとに、一対の閾値のうちの少なくとも一方の閾値を変化させた新たな一対の閾値を、所定の値に至るまで繰り返し生成する。演算部４１は、例えば上限又は下限の閾値のみを設定された変化分を単位として繰り返し変化させて、新たな一対の閾値を生成してもよい。また、演算部４１は、上限及び下限の閾値を設定された変化分を単位として繰り返し変化させて、新たな一対の閾値を生成してもよい。上限及び下限の閾値を変化させる場合は、上限と下限の間隔を一定に保ったまま両方の閾値を変化させてもよい。さらに、上限及び下限の閾値を変化させる変化量は必ずしも一定でなくてもよく、例えば所定の範囲においてその範囲外よりも変化量を小さく、または大きく設定してもよい。上述したように、パルス計数部３４は、演算部４１が一対の閾値を生成するごとに、パルス判定部３３が一対の閾値の範囲内に存在すると判定したパルスを計数し、変化分ごとのパルスの計数値を出力する。
　閾値決定部４６は、演算部４１が生成した一対の閾値と、パルス計数部３４が出力した計数値と、に基づいて、分析に用いる一対または複数対の閾値を決定する。閾値決定部４６は、演算部４１によって生成された各一対の閾値を階級とし、パルス計数部３４が出力した計数値を度数とした度数分布に基づいて、代表値である階級を選択する。ここでいうパルス計数部３４が出力した計数値とは、上記変化分ごとのパルスの計数値である。度数分布は、ヒストグラムであってもよい。
　代表値は、平均値、中央値及び最頻値からなる群より選択される少なくとも１つの値であってもよい。最頻値は、例えば正規分布のフィッティングなどによって求めてもよい。閾値決定部４６は、例えば後述する度数分布に基づいて代表値を選択して演算値記憶部４７に記憶させてもよい。
　閾値決定部４６は、代表値である階級から所定の範囲の階級に対応した複数対の閾値を、分析に用いる複数対の閾値として決定する。代表値が平均値である場合、閾値決定部４６は、度数分布の標準偏差（σ）を演算し、平均値である階級から所定の標準偏差の範囲の階級に含まれる複数対の閾値を、分析に用いる複数対の閾値として決定してもよい。標準偏差に基づいて新たな複数対の閾値を決定する場合、分布のばらつきに応じて近接する範囲を定めてもよい。平均値は、閾値決定部４６の平均値演算部で演算し、演算値記憶部４７に記憶してもよい。また、標準偏差は、閾値決定部４６の標準偏差演算部で演算し、演算値記憶部４７などの記憶部に記憶してもよい。
　代表値は平均値であり、所定の範囲は±１σの範囲であることが好ましい。すなわち、閾値決定部４６は、平均値である階級から±１σの範囲の階級に含まれる複数対の閾値を選択された複数対の閾値とすることが、Ｓ／Ｎ比向上の観点から好ましい。また、度数分布をヒストグラムとした場合において、閾値決定部４６は、代表値を中心とするヒストグラムの面積がヒストグラムの全面積に対して所定の割合以下の面積となるように、分析に用いる複数対の閾値として決定してもよい。Ｓ／Ｎ比向上の観点から、所定の割合は、３０％以下であることが好ましく、１０％以下であることがより好ましい。また、分析に用いる閾値は複数対に限らず、一対の閾値であってもよい。
　演算値記憶部４７は、閾値決定部４６で選択された代表値、標準偏差などの演算値を記憶する。
　パラメータ設定部４２は、演算部４１からの出力を受けて、設定すべきパラメータの値をパラメータ記憶部３２に記憶させる。
　測定制御部４３は、前測定及び本測定の実施を管理する。測定制御部４３は、ユーザによって前測定又は本測定の実施の選択が可能な入力部を備えていてもよい。また、測定制御部４３は、入力部で選択された情報に基づいて、ドライブ制御部４４に計数の開始、中断及び終了などを命令したり、演算部４１及び閾値決定部４６に演算処理を命令したりしてもよい。
　ドライブ制御部４４は、測定制御部４３からの入力を受け、ディスクドライブ２０を制御する。ドライブ制御部４４は、例えば、ディスクドライブ２０において、分析用基板１０の測定開始位置及び測定終了位置のような測定位置などを制御することができる。ドライブ制御部４４は、例えば、ターンテーブル駆動回路４４ａ、光ピックアップ駆動回路４４ｂなどを備えていてもよい。
　ターンテーブル駆動回路４４ａはターンテーブル駆動部２３を制御する。例えば、ターンテーブル駆動回路４４ａは、ターンテーブル２１が分析用基板１０及びクランパ２２と共に一定の線速度で回転するようにターンテーブル駆動部２３を制御する。
　光ピックアップ駆動回路４４ｂは光ピックアップ２５の駆動を制御する。例えば光ピックアップ駆動回路４４ｂは、光ピックアップ２５をガイド軸２４に沿って移動させたり、光ピックアップ２５の対物レンズ２５ａを上下方向に移動させたりする。
　ドライブ制御部４４は、前測定時において、演算部４１によって一対の閾値の少なくとも一方が変更されるごとに同じ位置を繰り返して測定するようディスクドライブ２０を制御する。例えば、ドライブ制御部４４は、光ピックアップ２５が測定開始位置及び測定終了位置などに移動するよう光ピックアップ２５を制御する。前測定の時間を短くするため、前測定の範囲は、本測定の範囲よりも狭いことが好ましい。具体的には、演算部４１で変化させて得られた新たな一対の閾値の範囲内に存在するパルスを計数する領域は、分析に用いる一対の閾値で計数する領域よりも狭いことが好ましい。
　測定開始位置及び測定終了位置は予め設定されていてもよく、前測定時において所定の計数値が得られるように測定開始位置及び測定終了位置を決定してもよい。測定開始位置及び測定終了位置が予め設定されている場合、一対の閾値の少なくとも一方の閾値を変更しながら計数を繰り返すだけでよく、校正を簡略化することができるため好ましい。前測定時において所定の計数値が得られるように測定開始位置及び測定終了位置を決定する場合、所定量以上の計数値で前測定することができ、安定した前測定を行うことができるため好ましい。この場合、演算部４１を介してディスクドライブ２０の測定開始位置及び測定終了位置が制御される。ただし、本測定で測定される全測定対象領域を前測定の対象とすると時間がかかるため、本測定の測定領域の中央付近であって、全測定対象領域よりも狭い範囲とすることが好ましい。
　表示部４５は、前測定又は本測定に関する情報をユーザに提示することができる。前測定に関する情報としては、ユーザが次の処理を選択できるような前測定の精度等の付加情報などが挙げられる。本測定に関する情報としては、本測定における計数値などが挙げられる。表示部４５としては、ユーザに前測定又は本測定に関する情報を提示することができれば特に限定されないが、例えばディスプレイ等が挙げられる。
　次に、図６に示すフローチャートを用いて本実施形態に係る分析用閾値決定方法における各工程を説明する。なお、本実施形態では、横軸を走査時間（走査位置）、縦軸を電圧とするグラフにおいて、粒子１４が存在する場合は下に凸のパルスが発生する系について説明する。具体的には、本実施形態では、便宜上、振幅下限電圧ＶＬ，振幅上限電圧ＶＨ及び抽出電圧Ｖｔｈが電圧に比例する０～＋１００の範囲の整数である場合について説明する。本実施形態では、反射光を何も検出しない場合の信号レベルを１００、分析用基板１０上に粒子１４及び異物などが存在しない場合の信号レベルを基準電圧Ｖｂａｓｅとし、粒子１４が存在する場合は基準電圧Ｖｂａｓｅより小さい値をとる系について説明する。なお、基準電圧Ｖｂａｓｅの値は、分析用基板１０の状態及び照射光２５ｂの強度などに依存する。
　ただし、本実施形態はこのような態様に限定されない。例えば、受光レベル信号の信号強度（電圧値）をそのまま用いてもよく、振幅下限電圧ＶＬ，振幅上限電圧ＶＨ及び抽出電圧Ｖｔｈは小数であってもよい。また、基準電圧Ｖｂａｓｅを０としてもよく、パルスの極性を反転させて粒子１４が存在する場合に上に凸のパルスが発生する系であってもよい。
　ステップＳ１では、前測定を実施するか否かが選択される。演算部４１は、前測定を実施する場合（ＹＥＳ）にはステップＳ２に処理を進め、前測定を実施しない場合（ＮＯ）にはステップＳ１０に処理を進める。分析条件が同じである場合は、前測定を毎回する必要はないため、本測定のみを実施するためにステップＳ１０に処理を進めてもよい。前測定を実施するか否かは、ユーザがグラフィカルユーザインタフェース（ＧＵＩ）などを介して選択してもよいし、使用期間又は使用回数などの情報に基づいて演算部４１が判定してもよい。
　ステップＳ２では、演算部４１は、振幅下限電圧ＶＬの値を０に設定するようパラメータ設定部４２を制御する。また、演算部４１は、振幅上限電圧ＶＨの値を、予め設定された値である初期値ＶＨ０より十分大きな値であるＶｍａｘに設定するようパラメータ設定部４２を制御する。なお、振幅下限電圧ＶＬ及び振幅上限電圧ＶＨに代えてパルス幅上限時間ＴＨ及びパルス幅下限時間ＴＬを用いる場合は、演算部４１は、抽出電圧Ｖｔｈの値を、予め設定された値である初期値Ｖｔｈ０に設定するようパラメータ設定部４２を制御すればよい。そして、演算部４１は、ステップＳ３に処理を進める。
　ステップＳ３では、演算部４１は、粒子１４を計数するようドライブ制御部４４を制御する。具体的には、演算部４１は、光ピックアップ２５を前測定用の測定開始位置から測定終了位置まで分析用基板１０の半径方向に移動させたり、分析用基板１０を一定の速度で回転させたりするようドライブ制御部４４を制御する。
　粒子１４の計数は、パルス検出回路３０で実施される。光ピックアップ２５は、検出対象物質１３と検出対象物質１３に結合する粒子１４とが表面に固定された分析用基板１０に照射光２５ｂを照射する（照射ステップ）。そして、光ピックアップ２５は、照射光２５ｂによる分析用基板１０からの反射光を受光して受光レベル信号ＪＳを生成する（信号生成ステップ）。生成された受光レベル信号ＪＳに含まれるパルスのパルス情報はパルス情報抽出部３１によって取得される。パルス判定部３３は、受光レベル信号ＪＳに含まれるパルスが、パルス幅について設定された一対の閾値、またはパルスがパルス振幅について設定された一対の閾値の範囲内に存在するか否かを判定する（第１の判定ステップ）。パルス判定部３３は、受光レベル信号ＪＳに含まれるパルスが一対の閾値の範囲内に存在すると判定した場合に、計数値がインクリメントされるようパルス計数部３４に検出信号を出力する。パルス計数部３４は、一対の閾値の範囲内に存在するパルスを計数して計数値を演算部４１へ出力する。すなわち、パルス計数部３４は、第１の判定ステップにおいて、設定された一対の閾値の範囲内に存在すると判定されたパルスを計数し、計数したパルスの計数値を出力する（計数値出力ステップ）。そして、ステップＳ４へ処理を進める。
　ステップＳ４では、演算部４１は、ステップＳ３の前測定により得られた粒子１４の計数値を、設定された振幅下限電圧ＶＬの値と関連付けて計数テーブルに記憶する。そして、ステップＳ５へ処理を進める。
　ステップＳ５では、演算部４１は、パラメータ記憶部３２に記憶された振幅下限電圧ＶＬをインクリメントした値で再設定するようパラメータ設定部４２を制御する。例えば、演算部４１は、設定された振幅下限電圧ＶＬの値がＶＬｎの場合、ＶＬｎをインクリメントしてパラメータ記憶部３２の振幅下限電圧ＶＬをＶＬｎ＋１＝ＶＬｎ＋１（ｎは０以上Ｖｍａｘ未満の整数）とするようパラメータ設定部４２に通知する。なお、本実施形態では、演算部４１は、元々の振幅下限電圧ＶＬに１を加えているが、加える数値は１でなくてもよい。そして、演算部４１は、ステップＳ６へ処理を進める。
　ステップＳ６では、演算部４１は、振幅下限電圧ＶＬの設定値がＶｍａｘ以上となったか否かを判定する。演算部４１は、振幅下限電圧ＶＬの設定値がＶｍａｘ未満の場合（ＮＯ）にはステップＳ３へ処理を進め、振幅下限電圧ＶＬの設定値がＶｍａｘ以上の場合（ＹＥＳ）にはステップＳ７へ処理を進める。
　ステップＳ３～ステップＳ６により、演算部４１は、計数値出力ステップにおいて、パルス計数部３４がパルスを計数するごとに、一対の閾値のうちの少なくとも一方の閾値を変化させた新たな一対の閾値を、所定の値に至るまで繰り返し生成している（閾値生成ステップ）。具体的には、演算部４１は、振幅下限電圧ＶＬに１ずつ繰り返し加えて異なる一連の値、すなわち新たな一対の閾値に変化させ、複数の値の振幅下限電圧ＶＬを得ている。ここで、振幅下限電圧ＶＬの設定値が０～Ｖｍａｘまで計数された場合、例えば図７に示すような計数テーブルが完成する。
　図７の計数テーブルには、複数の値の閾値が左欄に記憶され、変化させて得られた一対の閾値ごとに計数された計数値が右欄に記憶されている。具体的には、計数テーブルには、振幅下限電圧ＶＬの設定値Ｖｎにそれぞれ関連づけられた計数値Count(vn)が記憶されている。ＶＬ＝０からＶＬ＝Ｖｍａｘで設定された場合のそれぞれの計数値は、Count(0)からCount(vmax)として計数テーブルに記憶されている。なお、計数値Count(vn)は、振幅下限電圧ＶＬの設定値がｖｎである場合の計数値を示している（ここでは、ｎは０～Ｖｍａｘの整数）。
　ステップＳ７では、パルス計数部３４は、パルス判定部３３が複数対の閾値における各一対の閾値の範囲内に存在すると判定したパルスを計数し、変化分ごとのパルスの計数値を出力している。本実施形態では、変化分ごとのパルスの計数値は、以下の数式（１）に示すように、dCount(vn)で表される。
　dCount(vn)＝Count(vn)－Count(vn+1)　　　（１）
　閾値決定部４６は、各一対の閾値を階級とし、パルス計数部３４が出力した計数値を度数とした度数分布を生成している。具体的には、振幅下限電圧ＶＬを階級及びdCount(vn)を度数とし、ＶＬ＝０からＶＬ＝Ｖｍａｘまでグラフ化することにより、図８Ａに示すようなヒストグラムが得られる。そして、閾値決定部４６は、ステップＳ８へ処理を進める。
　ステップＳ８では、閾値決定部４６は、閾値生成ステップで生成された各一対の閾値を階級とし、計数値出力ステップで出力された計数値を度数とした度数分布に基づいて、代表値である階級を選択する（代表値選択ステップ）。閾値決定部４６は、選択した代表値を演算値記憶部４７に記憶する。
　ステップＳ９では、閾値決定部４６は、演算値記憶部４７から代表値を読み出す。そして、閾値決定部４６は、代表値である階級から所定の範囲の階級に対応した一対または複数対の閾値を、分析に用いる一対または複数対の閾値として決定する（閾値決定ステップ）。図８Ｂでは、代表値が平均値であり、平均値から±１σの範囲に含まれる閾値とする場合について説明している。ここで、σは標準偏差である。図８Ｂに示すように、閾値決定部４６は、平均値Ｖａを中心として、±１σの範囲内となるように振幅下限電圧ＶＬと振幅上限電圧ＶＨを演算する。すなわち、振幅下限電圧ＶＬ及び振幅上限電圧ＶＨは、以下の数式（２）及び数式（３）のようにして算出される。
　ＶＬ＝Ｖａ－σ　　　（２）
　ＶＨ＝Ｖａ＋σ　　　（３）
　図８Ｃでは、平均値から±３σの範囲に含まれる閾値とする場合について説明している。図８Ｃに示すように、平均値から±３σの範囲に含まれる閾値とする場合、粒子１４に起因するパルスの大部分を計数することができる。しかしながら、粒子１４としてナノメートルオーダーの粒子１４を用いた場合、粒子１４の大きさを均一にすることが困難である場合が多い。また、粒子１４に磁性を有する金属材料が含まれる場合、粒子１４の反射特性が変化するが、粒子１４の粒子径が小さいと、反射特性を均一にすることも困難である場合が多い。このような場合、図８Ｃに示すように、ノイズに起因するパルスも多く計数される傾向にある。
　したがって、高いＳ／Ｎ比で計数するためには、図８Ｂに示すように、平均値から±１σの範囲に含まれる閾値とすることが好ましい。そして、演算部４１は、ステップＳ１０へ処理を進める。
　ステップＳ１０では、演算部４１は、前測定で選択された複数対の閾値のうちのいずれかの一対の閾値で本測定による粒子１４を計数するようドライブ制御部４４を制御する。具体的には、演算部４１は、本測定用の測定開始位置から測定終了位置まで、光ピックアップ２５を分析用基板１０の半径方向に移動させたり、分析用基板１０を一定の速度で回転させたりするようドライブ制御部４４を制御する。
　ドライブ制御部４４はディスクドライブ２０を制御し、本測定用に設定された測定開始位置から測定終了位置まで分析用基板１０を本測定し、パルス検出回路３０において粒子１４に起因するパルスを計数する。粒子１４の計数は、前測定で決定された複数対の閾値のうちのいずれかの一対の閾値で計数することを除き、ステップＳ３と同様に、パルス検出回路３０で実施される。このとき、パルス判定部３３は、受光レベル信号ＪＳに含まれるパルスが決定された複数対の閾値のうちのいずれかの一対の閾値の範囲内に存在するか否かを判定する（第２の判定ステップ）。そして、演算部４１は、ステップＳ１１へ処理を進める。
　ステップＳ１１では、本測定での計数値が表示部４５に表示され、本測定が終了する。
　上記実施形態では、一対の閾値のうちの一方の閾値を設定された変化分を単位として繰り返し変化させているが、一対の閾値のうちの両方の閾値を設定された変化分を単位として繰り返し変化させてもよい。例えば、ステップＳ２において、振幅下限電圧ＶＬを０，振幅上限電圧ＶＨを１とし、ステップＳ５でインクリメントしてＶＬをＶＬｎ＋１＝ＶＬｎ＋１，ＶＨをＶＬｎ＋１＋１＝ＶＬｎ＋２とすることで、dCount(vn)に相当する分布を直接求めてもよい。この場合、ステップＳ６における前測定終了の条件は、ＶＨの設定値がＶｍａｘになった時などにしてもよい。
　本実施形態では、振幅下限電圧ＶＬ又は振幅上限電圧ＶＨを変化させながら計数し、振幅下限電圧ＶＬ及び振幅上限電圧ＶＨを補正する方法を説明した。しかしながら、パルス波形を正規分布として考えれば、パルス振幅とパルス幅は比例する。そのため、振幅下限電圧ＶＬをパルス幅下限時間ＴＬに、振幅上限電圧ＶＨをパルス幅上限時間ＴＨに置き換えて、同様の測定をしても、同等の効果が得られる。
　以上の通り、本実施形態に係る分析用閾値決定装置１００は、分析用基板１０に照射光２５ｂを照射し、照射光２５ｂによる分析用基板１０からの反射光を受光して受光レベル信号ＪＳを生成する光ピックアップ２５を備える。分析用基板１０には、検出対象物質１３と検出対象物質１３に結合する粒子１４とが表面に固定されている。分析用閾値決定装置１００は、受光レベル信号ＪＳに含まれるパルスのパルス幅について一対の閾値、またはパルスのパルス振幅について一対の閾値を生成する演算部４１を備える。分析用閾値決定装置１００は、パルス幅がパルス幅についての一対の閾値の範囲内に存在するか否かを判定するか、またはパルス振幅がパルス振幅についての一対の閾値の範囲内に存在するか否かを判定するパルス判定部３３を備える。分析用閾値決定装置１００は、パルス判定部３３が生成された一対の閾値の範囲内に存在すると判定したパルスを計数し、計数したパルスの計数値を出力するパルス計数部３４を備える。分析用閾値決定装置１００は、演算部４１が生成した一対の閾値と、パルス計数部３４が出力した計数値と、に基づいて、分析に用いる一対または複数対の閾値を決定する閾値決定部４６を備える。演算部４１は、パルス計数部３４がパルスを計数するごとに、一対の閾値のうちの少なくとも一方の閾値を変化させた新たな一対の閾値を、所定の値に至るまで繰り返し生成する。閾値決定部４６は、生成された各一対の閾値を階級とし、パルス計数部３４が出力した計数値を度数とした度数分布に基づいて、代表値である階級を選択する。閾値決定部４６は、代表値である階級から所定の範囲の階級に対応した一対または複数対の閾値を決定する。
　また、本実施形態に係る分析用閾値決定方法は、検出対象物質１３と検出対象物質１３に結合する粒子１４とが表面に固定された分析用基板１０に照射光２５ｂを照射する照射ステップを含む。分析用閾値決定方法は、照射光２５ｂによる分析用基板１０からの反射光を受光して受光レベル信号ＪＳを生成する信号生成ステップを含む。分析用閾値決定方法は、受光レベル信号ＪＳに含まれるパルスが、パルス幅について設定された一対の閾値、またはパルスがパルス振幅について設定された一対の閾値の範囲内に存在するか否かを判定する判定ステップを含む。分析用閾値決定方法は、判定ステップにおいて、設定された一対の閾値の範囲内に存在すると判定されたパルスを計数し、計数したパルスの計数値を出力する計数値出力ステップを含む。分析用閾値決定方法は、計数値出力ステップにおいてパルスを計数するごとに、一対の閾値のうちの少なくとも一方の閾値を変化させた新たな一対の閾値を、所定の値に至るまで繰り返し生成する閾値生成ステップを含む。分析用閾値決定方法は、生成された各一対の閾値を階級とし、計数値出力ステップで出力された計数値を度数とした度数分布に基づいて、代表値である階級を選択する代表値選択ステップを含む。分析用閾値決定方法は、代表値である階級から所定の範囲の階級に対応した一対または複数対の閾値を、分析に用いる一対または複数対の閾値として決定する閾値決定ステップを含む。
　アッセイノイズ、分析用基板１０の傷、異物の存在など、外乱が発生した場合には、検出対象物質１３に対してノイズが占める割合が大きくなる傾向にある。しかしながら、本実施形態に係る分析用閾値決定装置１００及び分析用閾値決定方法によれば、ヒストグラムの代表値に近接する範囲を新たな一対の閾値とすることで、代表値に近いパルス振幅及びパルス幅などを有するパルスのみを計数することができる。そのため、閾値の上限及び下限を広くとった場合と比較して、ノイズに起因するパルスの検出割合が低くなるため、Ｓ／Ｎ比を向上させることができる。
　［第２実施形態］
　次に、第２実施形態に係る分析用閾値決定装置１００及び分析用閾値決定方法について詳細に説明する。なお、上記実施形態と同一の構成には同一符号を付し、重複する説明は省略する。本実施形態では、分析対象となる領域ごとに前測定が実施され、代表値が選択されている。
　アッセイノイズ、分析用基板１０の傷及び異物の存在などの外乱が発生した場合には、ヒストグラムの形状が測定領域ごとに異なってしまうことがある。しかしながら、測定領域ごとに代表値を選択し、本測定することで、測定領域ごとにＳ／Ｎ比のより高い計数結果を導き出すことができる。
　本実施形態では、分析用基板１０は、検出対象物質１３と粒子１４とが表面に固定された複数の分析対象領域を有する。分析対象領域は、図２及び図９に示すような、分析用基板１０に形成された複数の反応領域１１であってもよい。反応領域１１は、例えばウェルなどを用いて形成されていてもよい。図９の実施形態では、反応領域１１ごとに前測定が実施され、代表値が選択されている。すなわち、閾値決定部４６は、反応領域１１ごとに閾値を決定している。本実施形態によれば、反応領域１１ごとに新たな一対の閾値を決定するため、反応領域１１ごとに高いＳ／Ｎ比で計数することができる。
　分析対象領域は、図１０に示すような、反応領域１１を分割して形成された複数の分割領域１１ａであってもよい。図１０の実施形態では、分割領域１１ａごとに前測定が実施され、代表値が決定されている。すなわち、閾値決定部４６は、分割領域１１ａごとに閾値を決定している。同じ反応領域１１内であっても、反応領域１１の平面方向において粒子１４の多い場所及び少ない場所が存在し、パルス振幅代表値の最適値が変動することも予想される。しかしながら、本実施形態によれば、分割領域１１ａごとに閾値を決定するため、分割領域１１ａごとに高いＳ／Ｎ比で計数することができる。なお、分割領域１１ａごとに代表値を決定する場合、測定する分割領域１１ａを特定する方法は特に限定されない。
　次に、図１１のフローチャートを用いて本実施形態に係る分析用閾値決定装置１００及び分析用閾値決定方法について説明する。
　ステップＳ１～ステップＳ８では、第１実施形態と同様に、閾値決定部４６はパルス振幅代表値を選択し、演算値記憶部４７に記憶させる。そして、ステップＳ１２へ処理を進める。
　ステップＳ１２では、反応領域１１などの分析対象領域が全て前測定されているか否かが判定される。例えば、分析対象領域がＮ個の場合、Ｎ個全て前測定されているか判定される。この時、Ｎ個全てではなく、着目したい分析領域のみが全て前測定されているか判定してもよい。分析対象領域が全て前測定されていない場合（ＮＯ）には、ステップＳ２に処理が戻される。一方、分析対象領域が全て前測定されている場合（ＹＥＳ）には、ステップＳ９に処理が進められる。
　ステップＳ９～ステップＳ１０では、第１実施形態と同様に、代表値に近接する範囲が設定され、本測定により特定の領域が計数される。そして、演算部４１はステップＳ１３へ処理を進める。
　ステップＳ１３では、演算部４１は、分析対象領域の数がＮ個未満である場合（ＮＯ）には次の分析領域に測定対象を移動させてステップＳ１０へ処理を戻す。一方、演算部４１は、測定した分析対象領域の数がＮ個に達した場合（ＹＥＳ）には、ステップS１１へ処理を進めて本測定での計数値を表示部４５に表示させた後、測定制御部４３に測定を終了させるよう制御する。
　特願２０１８－１０８５１６号（出願日：２０１８年６月６日）の全内容は、ここに援用される。
　以上、実施例に沿って本実施形態の内容を説明したが、本実施形態はこれらの記載に限定されるものではなく、種々の変形及び改良が可能であることは、当業者には自明である。
　本開示によれば、Ｓ／Ｎ比の高い計数が可能な分析用閾値決定装置及び分析用閾値決定方法を提供することができる。
　１０　分析用基板、
　１３　検出対象物質、
　１４　粒子、
　２５　光ピックアップ、
　２５ｂ　照射光、
　３３　パルス判定部、
　３４　パルス計数部、
　４１　演算部、
　４６　閾値決定部、
　１００　分析用閾値決定装置、
　ＪＳ　受光レベル信号、

Claims (5)

  1. 　検出対象物質と前記検出対象物質に結合する粒子とが表面に固定された分析用基板に照射光を照射し、前記照射光による前記分析用基板からの反射光を受光して受光レベル信号を生成する光ピックアップと、
    　前記受光レベル信号に含まれるパルスのパルス幅について一対の閾値、または前記パルスのパルス振幅について一対の閾値を生成する演算部と、
    　前記パルス幅が前記パルス幅についての一対の閾値の範囲内に存在するか否かを判定するか、または前記パルス振幅が前記パルス振幅についての一対の閾値の範囲内に存在するか否かを判定するパルス判定部と、
    　前記パルス判定部が前記生成された一対の閾値の範囲内に存在すると判定したパルスを計数し、前記計数したパルスの計数値を出力するパルス計数部と、
    　前記演算部が生成した一対の閾値と、前記パルス計数部が出力した計数値と、に基づいて、分析に用いる一対または複数対の閾値を決定する閾値決定部と、
    　を備え、
    　前記演算部は、前記パルス計数部がパルスを計数するごとに、前記一対の閾値のうちの少なくとも一方の閾値を変化させた新たな一対の閾値を、所定の値に至るまで繰り返し生成し、
    　前記閾値決定部は、前記生成された各一対の閾値を階級とし、前記パルス計数部が出力した前記計数値を度数とした度数分布に基づいて、代表値である階級を選択し、
    　前記代表値である階級から所定の範囲の階級に対応した一対または複数対の閾値を決定する、分析用閾値決定装置。
  2. 　前記代表値は、平均値、中央値及び最頻値からなる群より選択される少なくとも１つの値である請求項１に記載の分析用閾値決定装置。
  3. 　前記代表値は平均値であり、前記所定の範囲は±１σの範囲である請求項１又は２に記載の分析用閾値決定装置。
  4. 　前記分析用基板は、前記検出対象物質と前記粒子とが表面に固定された複数の分析対象領域を有し、
    　前記閾値決定部は、前記分析対象領域ごとに前記代表値を選択する請求項１～３のいずれか１項に記載の分析用閾値決定装置。
  5. 　検出対象物質と前記検出対象物質に結合する粒子とが表面に固定された分析用基板に照射光を照射する照射ステップと、
    　前記照射光による前記分析用基板からの反射光を受光して受光レベル信号を生成する信号生成ステップと、
    　前記受光レベル信号に含まれるパルスが、パルス幅について設定された一対の閾値、または前記パルスがパルス振幅について設定された一対の閾値の範囲内に存在するか否かを判定する判定ステップと、
    　前記判定ステップにおいて、前記設定された一対の閾値の範囲内に存在すると判定されたパルスを計数し、前記計数したパルスの計数値を出力する計数値出力ステップと、
    　前記計数値出力ステップにおいてパルスを計数するごとに、前記一対の閾値のうちの少なくとも一方の閾値を変化させた新たな一対の閾値を、所定の値に至るまで繰り返し生成する閾値生成ステップと、
    　生成された各一対の閾値を階級とし、前記計数値出力ステップで出力された前記計数値を度数とした度数分布に基づいて、代表値である階級を選択する代表値選択ステップと、
    　前記代表値である階級から所定の範囲の階級に対応した一対または複数対の閾値を、分析に用いる一対または複数対の閾値として決定する閾値決定ステップと、
    　を含む分析用閾値決定方法。
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