JP2019193931A - 溶液混合容器、及び流体デバイス - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2013年9月25日に、日本に出願された特願2013−199071号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
更に、高価な試薬を使用する場合や少量多検体を検査する場合において、有用性が高い方法として注目されている。
一般的に、流路へと溶液を注入する際、空気等の混入のないように流路内を完全に溶液で満たそうとすれば、空気の排出完了と同時に注入を停止しない限り、流路内の体積よりも多くの溶液を注入する必要がある。これは非特許文献1に記載の回転混合器の構成においても同様であり、上記ループ状流路内で混合される複数の溶液は、ループ状流路内の体積よりも多くの溶液が注入されなければならない。したがって、混合に用いる溶液の体積は、注入流路内で定量されてはいても、ループ状流路内で実際に混合される際には、必ずしも正確ではないという恐れがあった。
(1)本発明の一実施態様における溶液混合器は、
溶液が循環する主流路と、
前記主流路に接続する少なくとも1つの溶液導入流路と、
前記主流路に接続する少なくとも1つの溶液排出流路と、を含み、
前記溶液排出流路は少なくとも1つの溶液排出流路バルブを有し、
前記主流路は少なくとも1つの主流路バルブを有する。
(2)本発明の一実施態様における流体デバイスは、先に記載の溶液混合器を備えることを特徴とする。
(3)本発明の一実施態様における溶液の混合方法は、溶液混合器を用いて、2種類の溶液を混合する方法であって、
前記溶液混合器は、
溶液が循環する主流路と、前記主流路に接続する溶液導入流路と、前記主流路に接続する溶液排出流路と、を含み、前記溶液排出流路は溶液排出流路バルブを有し、前記主流路は少なくとも1つの主流路バルブを有し、少なくとも1つの前記主流路バルブは、前記溶液排出流路の近傍に配置されており、
前記溶液排出流路の近傍に配置された少なくとも1つの前記主流路バルブ及び前記溶液排出流路バルブを開放した状態で、第一の溶液を前記溶液導入流路から前記主流路に送液する工程aと、
前記溶液排出流路の近傍に配置された少なくとも1つの前記主流路バルブを閉める工程bと、
第二の溶液を前記溶液導入流路から前記主流路に送液する工程cと、
前記溶液排出流路バルブを閉じる工程dと、
前記溶液排出流路の近傍に配置された少なくとも1つの前記主流路バルブを開け、前記第一の溶液と前記第二の溶液とを循環させて混合する工程eと、を含む方法である。
(4)本発明の一実施態様における溶液の混合方法は、溶液混合器を用いて、2種類の溶液を混合する方法であって、
前記溶液混合器は、
溶液が循環する主流路と、前記主流路に接続する溶液導入流路と、前記主流路に接続する溶液排出流路と、を含み、前記溶液排出流路は溶液排出流路バルブを有し、前記主流路は2つの主流路バルブを有し、前記溶液導入流路及び前記溶液排出流路は、前記2つの主流路バルブを閉じることによって区画される前記主流路の部分領域以外の領域で前記主流路に接続しており、
前記2つの主流路バルブ及び前記溶液排出流路バルブを開放した状態で、第一の溶液を前記溶液導入流路から前記主流路に送液する工程aと、
前記2つの主流路バルブを閉じる工程bと、
第二の溶液を前記溶液導入流路から前記主流路に送液する工程cと、
前記溶液排出流路バルブを閉じる工程dと、
前記2つの主流路バルブを開け、前記第一の溶液と前記第二の溶液とを循環させて混合する工程eと、
を含む方法である。
(5)本発明の一実施態様における溶液の混合方法は、溶液混合容器を用いて、複数の溶液を混合する方法であって、
前記溶液混合容器は、
第一の流路と、
第二の流路と、
前記第一の流路及び前記第二の流路を連通させる第一の結合流路及び第二の結合流路と、
前記第一の流路及び前記第二の流路のそれぞれに接続する第一の溶液導入流路及び第二の溶液導入流路と、
前記第一の流路及び前記第二の流路のそれぞれに接続する第一の溶液排出流路及び第二の溶液排出流路と、
前記第一の溶液排出流路及び前記第二の溶液排出流路にそれぞれ配置された第一の溶液排出流路バルブ及び第二の溶液排出流路バルブと、
前記第一の結合流路及び前記第二の結合流路にそれぞれ配置された第一の主流路バルブ及び第二の主流路バルブと、
を有し、
前記第一の主流路バルブ及び前記第二の主流路バルブを閉じ、前記第一の溶液排出流路バルブ及び前記第二の溶液排出流路バルブを開放した状態で、前記第一の溶液導入流路から前記第一の流路に第一の溶液を導入し、前記第二の溶液導入流路から前記第二の流路に第二の溶液を導入する工程aと、
前記第一の溶液排出流路バルブ及び前記第二の溶液排出流路バルブを閉じ、前記第一の主流路バルブ及び前記第二の主流路バルブを開放して、前記第一の溶液及び前記第二の溶液を循環させて混合する工程bと、
を含む方法である。
(6)本発明の一実施態様における溶液の混合方法は、混合容器を用いて、複数の溶液を混合する方法であって、
前記混合容器は、溶液が循環する主流路を含み、
前記主流路は、第一の流路と、第二の流路と、第三の流路と、前記第一の流路と前記第二の流路とを連通させる第一の結合流路及び第二の結合流路と、前記第二の流路及び前記第三の流路を連通させる第三の結合流路及び第四の結合流路と、を含み、
前記第一の流路、前記第二の流路及び前記第三の流路に接続する少なくとも1つの溶液導入流路と、
前記第一の流路、前記第二の流路及び前記第三の流路に接続する少なくとも1つの溶液排出流路と、を備え、
前記溶液排出流路は少なくとも1つの溶液排出流路バルブを有し、
前記第一の結合流路、前記第二の結合流路、第三の結合流路及び第四の結合流路は、それぞれ少なくとも1つの流路バルブを有し、
前記主流路バルブ及び前記溶液排出流路バルブは、前記主流路バルブ及び前記溶液排出流路バルブを閉じることによって区画される前記第一の流路、前記第二の流路及び前記第三の流路それぞれの部分領域が所定の体積を有するよう配置され、
前記第一の流路及び前記第二の流路が、相互に、且つ、他の流路から隔離されるように前記主流路バルブ及び前記溶液排出流路バルブを閉じ、前記第一の流路に第一の溶液を導入し、前記第二の流路に第二の溶液を導入する工程aと、
前記第一の流路と前記第二の流路とが連通するように主流路バルブを開放し、前記第一の溶液及び前記第二の溶液を循環させて混合する工程bと、
前記第三の流路が、他の流路から隔離されるように前記主流路バルブ及び前記溶液排出流路バルブを閉じ、前記第三の流路に第三の溶液を導入する工程cと、
前記第一の流路及び前記第二の流路と前記第三の流路とが連通するように主流路バルブを開放し、第一の溶液及び第二の溶液の混合溶液と第三の溶液とを循環させて混合する工程dと、
を含む方法である。
[第1実施形態]
本実施形態の溶液混合器は、
溶液が循環する主流路と、
前記主流路に接続する溶液導入流路と、
前記主流路に接続する溶液排出流路と、を備え、
前記溶液排出流路中には前記溶液排出流路を開閉するための溶液排出流路バルブを有し、
前記主流路中には前記主流路を定量区画するための第一の主流路バルブを有し、
前記第一の主流路バルブは溶液排出流路の近傍に配置され、
前記主流路を定量区画するための第二の主流路バルブを備え、
前記第二の主流路バルブは溶液導入流路の近傍に配置されたものである。
図1は、本実施形態の溶液混合器20の基本構成を示す模式図である。本実施形態の溶液混合器は、溶液が循環する主流路21と、前記主流路に接続する溶液導入流路42と、前記主流路に接続する溶液排出流路32と、を備え、前記溶液排出流路32中には前記溶液排出流路32を開閉するための溶液排出流路バルブ33を有し、前記主流路21中には前記主流路21を定量区画するための第一の主流路バルブ23bを有し、前記第一の主流路バルブ23bは溶液排出流路32の近傍に配置され、さらに、前記主流路21を定量区画するための第二の主流路バルブ23aを備え、前記第二の主流路バルブ23aは溶液導入流路42の近傍に配置されたものである。溶液導入流路42および溶液排出流路32の数は特に制限されないが、図1に示される溶液混合器20は、それぞれ溶液導入流路42および溶液排出流路32を1つずつ備えている。
本実施形態の溶液混合器20は、予め流路内の体積が定められた主流路21を有しているので、主流路バルブ23により区画された主流路21内に充填された溶液の体積が正確に把握された状態で溶液を混合することができる。当該流路内に溶液が送液され、溶液の体積が定量された後、主流路バルブ23を開くことで、区画された流路同士が連通され、溶液の混合が可能となる。
このように、主流路21は、定量のみならず混合にも用いることが可能であるので、混合器への溶液の注入と定量を同時に行うことが可能であり、操作の効率化が実現される。
本実施形態の溶液混合器は、
先の第一実施形態の溶液混合器の構成に、前記溶液導入流路を開閉するための溶液導入流路バルブをさらに有し、前記溶液導入流路として、第一の溶液を導入する第一の導入流路と、第二の溶液を導入する第二の導入流路と、を備えるものである。図2は、本実施形態の溶液混合器30の基本構成を示す模式図である。溶液混合器30は、前記溶液導入流路42を開閉するための溶液導入流路バルブ43をさらに有し、前記溶液導入流路として、第一の溶液を導入する第一の導入流路42aと、第二の溶液を導入する第二の導入流路42bと、を備えている。溶液導入流路バルブ43を設けたことにより、溶液導入流路バルブ43及び溶液排出バルブ33によって、主流路21が完全に区画化され得る。したがって、溶液導入流路バルブ43及び溶液排出流路バルブ33を閉じ、主流路バルブ23を開けた場合、溶液導入流路バルブ43及び溶液排出流路バルブ33によって閉鎖された主流路21内では、より効率的に溶液混合が実現される。
また、溶液混合器30が前記溶液導入流路として、第一の溶液を導入する第一の導入流路43aと、第二の溶液を導入する第二の導入流路43bとを備えることで、主流路バルブ23により区画された主流路21内へと異なる溶液を個別に導入できる。したがって、図2に示されるように、第二の主流路バルブ23aは、第一の導入流路42aと、第二の溶液を導入する第二の導入流路42bとの間に配置されることが好ましい。
本実施形態の溶液混合器30’の構成を図3に示す。本実施形態の溶液混合器30’は、先の第2実施形態の溶液混合器30の構成に、前記溶液排出流路32として、第一の溶液を排出する第一の排出流路32aと、第二の溶液を排出する第二の排出流路32bと、を備えるものである。また、図3に示すように、第一の主流路バルブ23bは、第一の溶液を排出する第一の排出流路32aと、第二の溶液を排出する第二の排出流路32bとの間に配置されることが好ましい。このような構成を有する本実施形態の溶液混合器30’は、溶液排出流路バルブ33a又は33bの開閉を操作することで、主流路バルブ23によって区画された主流路21内へと導入された第一の溶液とおよび第二の溶液のそれぞれに対して個別に、主流路内の空気等の排出前記溶液の充填等を制御することができる。
本実施形態の溶液混合器は、
前記主流路を定量区画するための第三の主流路バルブを備え、前記第三の主流路バルブは溶液排出流路の近傍にあって、前記第一の主流路バルブと前記第三の主流路バルブとの間に前記溶液排出流路は接続する。本実施形態の溶液混合器を模式的に示した図を図4に示す。本実施形態の溶液混合器40は、主流路21を定量区画するための第三の主流路バルブ23b’を備え、第三の主流路バルブ23b’は溶液排出流路32の近傍であって、第一の主流路バルブ23bと第三の主流路バルブ23b’との間に溶液排出流路32が接続する。このような構成を有する混合器40は、主流路バルブ23によって区画された主流路21内の溶液に対して個別に、主流路内の空気等の排出前記溶液の充填等を制御することができる。例えば、主流路21内に溶液が充填されている状態にあるとき、第一の主流路バルブ23b及び第二の主流路バルブ23aを閉じ、第三の主流路バルブ23b’及び溶液排出バルブ33を開くことで、主流路21内に充填された溶液のうち、主流路バルブ23aと、23b’によって区画された流路内の溶液を、溶液排出流路32を通じて排出できる。
本実施形態の溶液混合器は、
前記主流路が、第一の流路と、第二の流路と、前記第一の流路と前記第二の流路を連通させる結合流路と、を備え、前記結合流路は前記第一の主流路バルブを有するものである。
本実施形態の溶液混合器の基本構成を示す模式図を図5に示す。溶液混合器50は、主流路21が、第一の流路21aと、第二の流路21bと、第一の流路21aと第二の流路21bとを連通させる結合流路22と、を備え、結合流路22は第一の主流路バルブ23bを有するものである。また、本実施形態の溶液混合器50は、図5に示されるように、第二の主流路バルブ23aおよび第三の主流路バルブ23b’を備えていることが好ましい。
第一の流路21aと、第二の流路21bとして表される複数の流路が、結合流路22によって連通されることで、後述の≪溶液の混合方法≫の第2実施形態において詳述するように、複数種の溶液を順次混合することが容易となる。
本実施形態の溶液混合器は、先に記載の第5実施形態の溶液混合器50に、更に、ポンプを備えるものである。また、前記ポンプは、バルブの開閉により溶液の送液が可能なポンプバルブであることが好ましい。図6は、本実施形態の溶液混合器を模式的に表した図である。溶液混合器60は、ポンプバルブ24を備え、ポンプは3つのポンプバルブ24からなる。ポンプバルブ24の数は、4つ以上でもよい。主流路21中にポンプが配置されることで、より効率的な回転混合が実現される。なお、主流路バルブ23をポンプバルブとして使用してもよい。
本実施形態の溶液混合器は、前記第一の溶液と前記第二の溶液との混合液の検出部を備えたものである。図7は、本実施形態の溶液混合器を模式的に表した図である。溶液混合器70は、先に記載の第5実施形態の溶液混合器50に、更に検出部4cを備えている。
溶液混合器70の主流路21内において溶液を回転混合させることで、検出部4cは当該溶液に含まれる分子との接触の機会が促進される。
図22に示すように、検出部4cは、標的miRNA133を第一の部分131と第二の部分132に分割した場合に、第一の部分131とハイブリダイズし得る配列を含む捕捉プローブ134が固定されてなる基板を備えていることが好ましい。
検出プローブ135は、二本鎖を形成する二つのステム部135c,135dと、該二つのステム部135c,135d間の領域であり、標識物質135aにより標識されているループ部135eと、標的miRNA133を第一の部分131と第二の部分132に分割した場合に、第二の部分132とハイブリダイズし得る配列135bとを有し、且つ5’突出末端又は3’突出末端を有する。
本実施形態においては、miRNA133の5’側の部分を第一の部分131とし、miRNA133の3’側の部分を第二の部分132とする。
miRNA133を高精度に定量する観点から、捕捉プローブ134は、miRNA133の第二の部分132とハイブリダイズしないように、miRNA133の第二の部分132に相補的な配列を含まないことが好ましい。
基板136に固定された捕捉プローブ134が、miRNA133とハイブリダイゼーションするためには、分子的な自由度が必要であることから、捕捉プローブ134は、基板136と結合する3’末端にスペーサー134aを有していることが好ましい。スペーサー134aの長さとしては、特に限定されないが、3〜50塩基が好ましく、5〜25塩基がより好ましい。ただし、スペーサーに用いられる塩基は、同程度の長さと柔らかさを持ったPEG等のリンカーで代替可能である。係る場合には、スペーサー134aに用いられる塩基数は0塩基でもよい。
捕捉プローブ134の長さは、プローブとして機能するために必要な長さであれば特に限定されないが、第一の部分131及びスペーサー134aの塩基数を勘案し、3〜50塩基が好ましく、5〜40塩基がより好ましい。
miRNA133を高精度に定量する観点から、検出プローブ135は、miRNA133の第一の部分131とハイブリダイズしないように、miRNA133の第一の部分131に相補的な配列を含まないことが好ましい。
本実施形態において、検出プローブ135は、5’末端側から、二本鎖を形成する二つのステム部135c,135dと、該2つのステム部135c,135d間の領域であるループ部135eと、第二の部分132とハイブリダイズし得る配列135bとからなる。即ち、検出プローブ135は、3’突出末端を有している。検出プローブは、突出末端を有しており、検出プローブが有する突出末端が、5’突出末端であるか3’突出末端であるかは、捕捉プローブと基板とが捕捉プローブの5’末端を介して結合しているか3’末端を介して結合しているかによる。
検出プローブ135におけるループ部の長さは、ステム部の長さとの兼ね合いによって決まり、検出プローブ135が安定してステムループ構造を形成できる長さであれば特に限定されないが、3〜200塩基が好ましく、5〜100塩基がより好ましい。
検出プローブ135の長さは、ステムループ構造を形成でき、プローブとして機能するために必要な長さであれば特に限定されないが、第二の部分132の塩基数及びステムループ構造形成に必要な塩基数を勘案し、14〜200塩基が好ましく、24〜150塩基がより好ましい。
捕捉プローブ134及び検出プローブ135の少なくともいずれか一方が、LNA又はBNAを含むことが好ましく、捕捉プローブ134及び検出プローブ135の両方が、LNA又はBNAを含むことがより好ましい。
蛍光色素としては、FAM(カルボキシフルオレセイン)、JOE(6−カルボキシ−4’,5’−ジクロロ2’,7’−ジメトキシフルオレセイン)、FITC(フルオレセインイソチオシアネート)、TET(テトラクロロフルオレセイン)、HEX(5'−ヘキサクロロ−フルオレセイン−CEホスホロアミダイト)、Cy3、Cy5、Alexa568、Alexa647等が挙げられる。
全RNA中、miRNAはごく微量しか存在しないため、分画せずにmiRNAを高効率に標識することは困難である。一方、本実施形態においては、予め標識した検出プローブを用いるため、高感度に、miRNAを検出することができる。
本実施形態の溶液混合器は、前記主流路が撹拌構造を含む。撹拌構造として曲率を有する構造が挙げられる。曲率を有する構造においては流路内の流路壁面と溶液の相互作用(摩擦)により、壁面周辺の流速は遅く、流路中央の流速は速くなる。その結果、液体の流速に分布ができるため、溶液の混合が促進される。当該流路の内径は一例には0.01〜3mmであり、例えば0.5〜1mmである。
また前記曲率を有する構造は、折り返し構造に含まれていてもよい。図8は、本実施形態の溶液混合器80を模式的に表した図である。溶液混合器80は、主流路が折り返し構造31を含む。ここで、「折り返し構造」とは、基準となる流路の長軸方向に対して略直角に、流路がほぼ180度折り返す構造をいう。
折り返し数は、流路の伸びる方向が変更された回数で数えられ、図8に示される折り返し構造31における折り返し数は8である。折り返し構造においては、上記流速の差が繰り返し生じるので、溶液の混合がさらに促進される。
[第1実施形態]
本実施形態の流体デバイスは、先に記載の溶液混合器を備えるものである。
本実施形態の流体デバイスは、サンプル中のエキソソームが内包する生体分子を検出するデバイスであることが好ましい。エキソソームは、直径30〜100nmの小型脂質小胞であり、エンドソームと細胞膜との融合体として、腫瘍細胞、樹状細胞、T細胞、B細胞等、種々の細胞から、血液、尿、唾液等の体液中に分泌される。
がん細胞等の異常細胞は、細胞膜の内部に特有のタンパク質や核酸、マイクロRNAなどを発現している。そして、体液中に分泌されるエキソソームも、分泌元の細胞由来のマイクロRNAなどを発現している。そのため、体液中のエキソソームの膜内部に存在する生体分子を分析することで、バイオプシー検査をしなくとも、生体内の異常を調べることができる技術の確立が期待されている。なお、バイオプシー検査とは、病変部位の組織を採取し顕微鏡で病変部位を観察することによって、病気の診断等を調べる臨床検査をいう。
図9に示すように、本実施形態の流体デバイス1は、疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物で修飾された層を有するエキソソーム精製部2と、生体分子精製部3と、溶液混合器4と、検出部4cと、エキソソーム精製部2と生体分子精製部3を繋ぐ第一の流路5と、生体分子精製部3と溶液混合器4を繋ぐ第二の流路6と、を備えている。
後述するように、エキソソーム精製部2からの廃液が第三の流路10を通って第一の廃液槽7に送られる。生体分子精製部3からの廃液が第四の流路11を通って第二の廃液槽8に送られる。溶液混合器4からの廃液が第五の流路12を通って第三の廃液槽9に送られる。
尚、本明細書において、「エキソソーム固定部2d上にエキソソームを固定する」とは、エキソソーム固定部にエキソソームを吸着させることも意味する。
飽和又は不飽和の炭化水素基としては、炭素原子数6〜24の直鎖若しくは分岐鎖のアルキル基又はアルケニル基が好ましく、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、ヘプタデシル基、ステアリル基(オクタデシル基)、ノナデシル基、イコシル基、ヘンイコシル基、ドコシル基、トリコシル基、テトラコシル基、ミリストレイル基、パルミトレイル基、オレイル基、リノイル基、リノレイル基、リシノレイル基、イソステアリル基等が挙げられる。
中でも、ミリストレイル基、パルミトレイル基、オレイル基、リノイル基、リノレイル基が好ましく、オレイル基がより好ましい。
係る親水性鎖は、基板との結合のために化学修飾されていることが好ましく、活性エステル基を有することがより好ましく、N−ヒドロキシスクシンイミド基を有することが特に好ましい。
脂質−PEG誘導体は、BAM(Biocompatible anchor for membrane)と呼ばれる。BAMとしては、例えば下記式(1)で表される化合物が挙げられる。
エキソソーム固定部2dの層として用いられる基板としては、ガラス基板、シリコン基板、ポリマー基板、金属基板等が挙げられる。基板は、疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物の親水性鎖と結合する物質を介して結合していてもよく、係る物質としては、アミノ基、カルボキシル基、チオール基、水酸基、アルデヒド基を有する物質が挙げられ、3−アミノプロピルトリエトキシシランが好ましい。
分析に用いられるサンプル量としては、1mL程度が好ましい。
また、係るサンプルには、培養細胞が分泌したエキソソームを含有する細胞培養液も含まれる。
サンプルは、超遠心分離、限外ろ過、連続フロー電気泳動、サイズフィルターを用いたろ過、ゲルろ過クロマトグラフィー等により調製されたものであってもよいが、本実施形態においては、エキソソーム固定部2dにおける疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物とエキソソームとの親和性が非常に高いため、調製を加えていないサンプルそのものであってもよい。
一例として、エキソソーム捕捉時の吸引圧力は、1〜30kPaであり、捕捉に要する時間は15秒程度である。エキソソーム固定部2dを通過した廃液は、バルブ10aを介して第三の流路10を通り第一の廃液槽7へ送られる。
一例として、図11に示すように、流路2h上のバルブ2eを開き、洗浄液導入用インレット2aに洗浄液を注入し、エキソソーム固定部2dに導入する。
本実施形態においては疎水性鎖と親水性鎖を有する化合物で修飾された層とエキソソームとの結合が強力であるため、流速を速く調整でき、短時間での洗浄が可能である。一例として、PBS洗浄液500μLを吸引圧力1〜30kPaで15秒程度送液することにより洗浄される。エキソソーム固定部2dを通過した廃液は、バルブ10aを介して第三の流路10を通り第一の廃液槽7へ送られる。
破砕液がエキソソーム固定部2dを通ることにより、エキソソーム固定部2d上に捕捉されたエキソソームが破砕され、エキソソームに内包される生体分子が放出される。
一例として、エキソソーム破砕時の吸引圧力は、1〜30kPaであり、破砕に要する時間は30秒程度である。エキソソーム固定部2dを通過した廃液は、バルブ10aを介して第三の流路10を通り第一の廃液槽7へ送られる。エキソソームから放出された生体分子は、バルブ5aを介して第一の流路5を通り生体分子精製部3へ送られる。
生体分子固定部3cは、生体分子を固定可能なものであれば特に限定されないが、一例として核酸を固定するシリカメンブレンが挙げられる。
エキソソームは、分泌元の細胞に由来するタンパク質や核酸を保持している。核酸としては、miRNAが挙げられる。近年、短鎖の非コードRNAであるmiRNAが、生体内の遺伝子発現の制御をしていることが報告され、miRNAの異常発現とがんを初めとした様々な疾患との関係が明らかになりつつある。
本実施形態において、生体分子固定部3cが固定する生体分子はmiRNAであることが好ましい。生体分子固定部3cとしては、上述したように、流路上に埋め込まれたシリカメンブレンが挙げられる。
生体分子固定部3cをエキソソーム破砕液が通過することにより、生体分子固定部3c上に生体分子が捕捉される。
一例として、エキソソーム破砕液送液時の吸引圧力は、50〜70kPaであり、送液に要する時間は1分程度である。生体分子固定部3cを通過した廃液は、バルブ11aを介して第四の流路11を通り第二の廃液槽8へ送られる。
図11に示すように、流路3e上のバルブ3dを開き、生体分子洗浄液導入用インレット3aに洗浄液を注入し、吸引により洗浄液を生体分子固定部3cへ導入する。洗浄液としては、例えば70%〜80%程度のエタノールが挙げられる。
一例として、洗浄時の洗浄液使用量は1mL程度であり、吸引圧力は、50〜70kPaであり、洗浄液の送液に要する時間は1分程度である。生体分子固定部3cを通過した廃液は、バルブ11aを介して第四の流路11を通り第二の廃液槽8へ送られる。エキソソームから放出された生体分子は、バルブ5aを介して第一の流路5を通り生体分子精製部3へ送られる。
図11に示すように、生体分子洗浄液導入用インレット3aから空気を吸引し、生体分子固定部3cを通過させることにより乾燥させる。
一例として、生体分子固定部3c乾燥時の吸引圧力は、50〜70kPaであり、乾燥に要する時間は2分程度である。
図11に示すように、流路3gのバルブ3fを開け、生体分子回収液導入用インレット3bに生体分子回収液を注入し、生体分子回収液を生体分子固定部3cに導入する。
一例として、生体分子回収液は、RNase−free waterであり、該回収液の使用量は30μLであり、吸引圧力50〜70kPaで回収液を吸引し、回収液が生体分子固定部3cに到達した時点で吸引を停止させ、3分程度保持する。
生体分子は第二の流路6を通り、溶液混合器4へ送られる。一例として、溶液混合器4への生体分子の吸引圧力は、6kPa以下であり、30秒程度かけて送液する。
なお、流路6は、一例として、バルブ4eと4gの間につなぐ。また、溶液排出流路としての流路12は、先に記載の≪溶液混合器≫の第5〜7実施形態で示すように、主流路バルブ23bと主流路バルブ23b’との間につなぐようにしてもよい。
一例として、検出プローブ溶解液の組成は、100〜200nM検出プローブ、100〜200mM Tris−HCl(pH7.5)、200〜400mM NaCl、10〜30mM MgCl2、0.5〜2mg/mL BSA、10〜30mM DTT、5〜20units/μL T4DNA Ligaseであり、係る検出プローブ溶解液を吸引圧力6kPa以下、30秒程度かけて送液する。
一例として、洗浄液は0.2×SSCバッファーであり、使用量は500μLであり、該洗浄液を吸引圧力6kPa以下、1分かけて送液して洗浄を行う。洗浄液は溶液混合器内で循環させることが好ましい。洗浄液を循環させることにより短時間で効率よく基盤の洗浄が行われる。基板を通過した廃液は、バルブ12aを介して第五の流路12を通り、第三の廃液槽9へ送られる。
標識物質の強度の測定は、一例として、図示略の顕微鏡、光源、パソコンなどの制御部により行われる。
[第1実施形態]
本実施改訂の溶液の混合方法は、先に記載の溶液混合器を用いた溶液の混合方法であって、溶液導入流路から第一の溶液を送液する工程と、
主流路を定量区画して第一の溶液を定量切り出しするように、主流路バルブを閉める工程と、
溶液導入流路から第二の溶液を送液する工程と、
溶液排出バルブを閉じる工程と、
第一の溶液と第二の溶液を回転混合して第三の溶液を得る工程と、
前記第三の溶液を検出する工程と、
前記第三の溶液を検出する工程の後に、主流路に洗浄液を送液し、主流路を洗浄する工程と、
を有する。
本実施形態の溶液の混合方法は、先に記載の溶液混合器を用いた溶液の混合方法であって、
前記主流路が有する複数の流路(主流路)のうち隣接する二つの流路(主流路)を選択する工程Aと、
前記二つの流路(主流路)及び該二つの流路(主流路)に隣接する結合流路が定量区画されるように、前記流路(主流路)に隣接するバルブを閉める工程Bと、
前記二つの流路(主流路)のうち、第一の流路(主流路)に第一の溶液を送液する工程Cと、
前記二つの流路(主流路)のうち、第二の流路(主流路)に第二の溶液を送液する工程Dと、
前記二つの流路(主流路)同士を連通させる結合流路を開閉するための主流路バルブを開け、第一の溶液及び第二の溶液を回転混合して第三の溶液を得る工程Eと、
を有し、更に前記工程Eの後、前記二つの流路(主流路)に隣接する第三の流路(主流路)を選択する工程Fと、
前記第三の流路(主流路)及び該第三の流路(主流路)に隣接する結合流路が定量区画されるように、前記第三の流路(主流路)に隣接するバルブを閉める工程Gと、
前記第三の流路(主流路)に第四の溶液を送液する工程Hと、
これら三つの流路(主流路)同士を連通させる結合流路を開閉するための主流路バルブを開け、第三の溶液及び第四の溶液を回転混合して第五の溶液を得る工程Iと、
を有する。
溶液混合器50’を用いた溶液の混合方法について、以下に説明する。工程A〜Bは図13A〜13Bを、工程C〜Eは図14A〜14Bを、工程F〜工程Gは図15A〜15Bを、工程H〜工程Iは図16A〜16Bをそれぞれ参照されたい。
(工程A):まず、主流路21のうち隣接する二つの流路(主流路)21a、21bを選択する。
(工程B):前記二つの流路(主流路)21a、21b及び該二つの流路(主流路)に隣接する結合流路22が定量区画されるように、前記流路(主流路)に隣接する主流路バルブ23a、23b、23c、23dおよび溶液排出流路バルブ33a、33bを閉める。
(工程C/D):前記第一の流路(主流路)21aに第一の溶液91を、前記第二の流路(主流路)21bに第二の溶液92をそれぞれ送液する。
(工程E):前記流路(主流路)21aと流路(主流路)21b同士を連通させる結合流路を開閉するための主流路バルブ23a、23bを開け、第一の溶液91及び第二の溶液92を回転混合して第三の溶液93を得る。
(工程F):二つの流路(主流路)21a、21bに隣接する第三の流路(主流路)21cを選択する。
(工程G):流路(主流路)21c及び流路(主流路)21cに隣接する結合流路が定量区画されるように、流路(主流路)21cに隣接する主流路バルブ23e、23f及び溶液排出流路バルブ33cを閉める。
(工程H):流路(主流路)21cに第四の溶液94を送液する。
(工程I):これら三つの流路(主流路)21a、21b、21c同士を連通させる結合流路を開閉するための主流路バルブ23a、23b、23c、23dを開け、第三の溶液及び第四の溶液を回転混合して第五の溶液95を得る。
ガラス表面に3−アミノプロピルトリエトキシシラン(以下、APTESともいう。)を修飾し、APTES末端にエキソソームを固定化する前記式(1)で表されるPEG脂質誘導体、非特異吸着を抑制するメトキシPEGを修飾した。次に、ポリメタクリルスチレンを切削加工することで、精製デバイスを作製した。乳がん細胞株MCF−7の培養上清を超遠心し回収したエキソソーム懸濁液およびヒト血清中のエキソソームをデバイス内で固定した後、AFMで固定粒子密度を計測した。
デバイス内で固定化されたエキソソームのAFM像と固定密度を図17に示す。まず、AFM像より30−200nmの直径を持つ粒子が固定化されていることを確認した。
次に、固定層からの距離に対し、固定密度が指数関数的に減少することを確認した。また、ヒト血清から直接固定化した場合の固定量が、精製済みエキソソームを固定した場合の74%であることから、メトキシPEGが非特異吸着の抑制に寄与していると考えられる。
流路内に小型化したシリカメンブレンを固定したデバイスを作製し、miRNAの精製を行った。miRNAをエキソソーム破砕液に懸濁し、吸引操作によりシリカメンブレンを通過させた。続いてシリカメンブレンの洗浄、乾燥を行った後、miRNA溶出液を導入しmiRNAを回収した。miRNA回収量は定量リアルタイムPCRにより求めた。
また、一般的なスピンカラム法との比較として、QIAGEN社miRNeasy Mini Kitを用いた。
miRNAの回収結果を図18に示す。本ユニットではシリカメンブレンのサイズを小型化することによって、所要時間の短縮と使用試薬の低減が達成された。また、サイズの小型化に伴い、少量の溶出液でmiRNAを回収することできるようになり、miRNA溶液の濃縮が可能となった。
標的miRNAとして、miR−141、miR−143、miR−1275、miR−107、miR−181a−2*、miR−484、miR−21、let−7a,let−7b,let−7d,let−7f、miR−39の配列を有するRNAを合成した。また、それぞれの標的miRNAに相補的な配列を有する検出プローブ合計12種の核酸プローブを設計・合成した。一方、それぞれの標的miRNAに相補的な配列を有する捕捉プローブをガラス基板上で合成し、スポット状に配置した。
用いた標的miRNA、捕捉プローブ、及び検出プローブの配列を以下に示す。
(1)標的miRNA1:miR−141
[配列:5’−UAACACUGUCUGGUAAAGAUGG−3’] (配列番号1:22mer)
標的miRNA2:miR−143
[配列:5’−UGAGAUGAAGCACUGUAGCUC−3’] (配列番号2:21mer)
標的miRNA3:miR−1275
[配列:5’− GUGGGGGAGAGGCUGUC−3’] (配列番号3:17mer)
標的miRNA4:miR−107
[配列:5’− AGCAGCAUUGUACAGGGCUAUCA−3’] (配列番号4:23mer)
標的miRNA5:miR−181a−2*
[配列:5’− ACCACUGACCGUUGACUGUACC−3’] (配列番号5:22mer)
標的miRNA6:miR−484
[配列:5’− UCAGGCUCAGUCCCCUCCCGAU−3’] (配列番号6:22mer)
標的miRNA7:miR−21
[配列:5’− UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA−3’] (配列番号7:22mer)
標的miRNA8:let−7a
[配列:5’− UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU−3’] (配列番号8:22mer)
標的miRNA9:let−7b
[配列:5’− UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUU−3’] (配列番号9:22mer)
標的miRNA10:let−7d
[配列:5’− AGAGGUAGUAGGUUGCAUAGUU−3’] (配列番号10:22mer)
標的miRNA11:let−7f
[配列:5’− UGAGGUAGUAGAUUGUAUAGUU−3’] (配列番号11:22mer)
標的miRNA12:miR−39
[配列:5’− UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG−3’] (配列番号12:22mer)
[配列:5’−p−X1−fS−3’]
X1は以下の配列を表し、pはリン酸を表し、Sはチオール基を表し、fは6−FAM(6−フルオロセイン)を表す。
X1:ACCAGACAGTGTTAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAA(配列番号13:60mer)
捕捉プローブ2(Capture probe2)
X1:GTGCTTCATCTCAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAAC(配列番号14:60mer)
捕捉プローブ3(Capture probe3)
X1:CTCCCCCACACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACA(配列番号15:60mer)
捕捉プローブ4(Capture probe4)
X1:CTGTACAATGCTGCTACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACA(配列番号16:60mer)
捕捉プローブ5(Capture probe5)
X1:CAACGGTCAGTGGTACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAA(配列番号17:60mer)
捕捉プローブ6(Capture probe6)
X1:GGGACTGAGCCTGAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAA(配列番号18:60mer)
捕捉プローブ7(Capture probe7)
X1:AGTCTGATAAGCTAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAA(配列番号19:60mer)
捕捉プローブ8(Capture probe8)
X1:AACCTACTACCTCAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAA(配列番号20:60mer)
捕捉プローブ9(Capture probe9)
X1:ACCTACTACCTCAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAAC(配列番号21:60mer)
捕捉プローブ10(Capture probe10)
X1:AACCTACTACCTCTACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAA(配列番号22:60mer)
捕捉プローブ11(Capture probe11)
X1:ATCTACTACCTCAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAAC(配列番号23:60mer)
捕捉プローブ12(Capture probe12)
X1:TTTACACCCGGTGAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAA(配列番号24:60mer)
[配列:5’−p−X2−Al−X3−3’]
X2、X3は以下の配列を表し、pはリン酸を表し、AlはAlexa647−AminoC6−dAを表す。
X2:CTCAACTGGTGTCGTGG(配列番号25:17mer)
X3:GTCGGCAATTCAGTTGAGCCATCTTT(配列番号26:26mer)
検出プローブ2(Detect probe2)
X2:CTCAACTGGTGTCGTGG(配列番号25:17mer)
X3:GTCGGCAATTCAGTTGAGGAGCTACA(配列番号27:26mer)
検出プローブ3(Detect probe3)
X2:CTCAACTGGTGTCGTGG(配列番号25:17mer)
X3:GTCGGCAATTCAGTTGAGGACAGCCT(配列番号28:26mer)
検出プローブ4(Detect probe4)
X2:CTCAACTGGTGTCGTGG(配列番号25:17mer)
X3:GTCGGCAATTCAGTTGAGTGATAGCC(配列番号29:26mer)
検出プローブ5(Detect probe5)
X2:CTCAACTGGTGTCGTGG(配列番号25:17mer)
X3:GTCGGCAATTCAGTTGAGGGTACAGT(配列番号30:26mer)
検出プローブ6(Detect probe6)
X2:CTCAACTGGTGTCGTGG(配列番号25:17mer)
X3:GTCGGCAATTCAGTTGAGATCGGGAG(配列番号31:26mer)
検出プローブ7(Detect probe7)
X2:CTCAACTGGTGTCGTGG(配列番号25:17mer)
X3:GTCGGCAATTCAGTTGAGTCAACATC(配列番号32:26mer)
検出プローブ8(Detect probe8)
X2:CTCAACTGGTGTCGTGG(配列番号25:17mer)
X3:GTCGGCAATTCAGTTGAGAACTATAC(配列番号33:26mer)
検出プローブ9(Detect probe9)
X2:CTCAACTGGTGTCGTGG(配列番号25:17mer)
X3:GTCGGCAATTCAGTTGAGAACCACACA(配列番号34:27mer)
検出プローブ10(Detect probe10)
X2:CTCAACTGGTGTCGTGG(配列番号25:17mer)
X3:GTCGGCAATTCAGTTGAGAACTATGC(配列番号35:26mer)
検出プローブ11(Detect probe11)
X2:CTCAACTGGTGTCGTGG(配列番号25:17mer)
X3:)GTCGGCAATTCAGTTGAGAACTATACA(配列番号36:27mer)
検出プローブ12(Detect probe12)
X2:CTCAACTGGTGTCGTGG(配列番号25:17mer)
X3:GTCGGCAATTCAGTTGAGCAAGCTGA(配列番号37:26mer)
表1中、Takara 10×bufferの組成は、500mM Tris−HCl(pH7.5)、100mM MgCl2、50mM DTTである。
結果を図19に示す。図19(a)は、miRNA検出結果を示す基板の画像である。
図19(b)は、図19(a)に対応しており、網掛けで示したスポットが、標的miRNAに対応するスポットで、蛍光が観察されるべきスポットである。各アルファベットは下記のmiRNAに対応している。
A:141、B:143、C:1275、D:107、E:181a-2*、F:484、S:let-7a、T:let-7b、U:let-7d。
導入したmiRNAに対応するプローブを固定した各スポットにおいて、Alexa647標識された検出プローブの蛍光像が観察された。なお、「C」のmiR-1275は、検出限界濃度を確認するため他のmiRNAの1000分の1の濃度で入れたため、蛍光が暗くなっている。また、プローブの配列ごとに明るさが異なるのは、プローブの親和性が異なるためである。
このことから、該溶液混合器を用いてmiRNAを配列依存的に検出できることが確認された。
溶液混合器の主流路21上のバルブ23a、23bを閉じた状態で、バルブ43aを開け、第一の溶液91を溶液混合器へと送液した(図20(2))。バルブ33を閉じた状態で、バルブ43bを開け、第二の溶液92を溶液混合器へと送液した(図20(3))。次いで、バルブ43a、43b、33が閉じた状態で、23a、23bを開き、ポンプバルブ(23a)からなるポンプを始動させ、第一の溶液91と第二の溶液92とを回転混合させ、第三の溶液93を得た(図20(4),図20(5))。第一の溶液91と第二の溶液92とは、十分に混合されていた。
図21Bに示す流体デバイスを作製した。図21Aの表に示すような各工程におけるバルブの開閉制御により、流体の流れを制御できることが確認された。
Claims (11)
- 溶液混合容器を用いて、複数の溶液を混合する方法であって、
前記溶液混合容器は、
溶液が循環する主流路と、
前記主流路に接続する少なくとも1つの溶液導入流路と、
前記主流路に接続する少なくとも1つの溶液排出流路と、を含み、
前記主流路は、少なくとも2つの主流路バルブを有し、
前記主流路バルブは、いずれか2つの該主流路バルブを閉じることによって区画される前記主流路の部分領域のそれぞれが所定の体積を有するよう配置されており、
前記主流路の部分領域の全てに、前記少なくとも1つの溶液導入流路と前記少なくとも1つの溶液排出流路が接続し、
前記溶液排出流路のそれぞれが溶液排出流路バルブを有し、
前記主流路の部分領域のそれぞれに、前記溶液導入流路から溶液を導入する工程と、
前記主流路バルブをすべて開放して、前記溶液を回転混合する工程と、を含む方法。 - 少なくとも1つの前記主流路バルブが前記溶液導入流路及び/又は前記溶液排出流路の近傍に配置されている請求項1に記載の方法。
- 前記主流路は、
第一の流路と、
第二の流路と、
前記第一の流路と前記第二の流路とを連通させる第一の結合流路及び第二の結合流路と、を含み、
前記主流路バルブは、前記第一の結合流路及び/又は前記第二の結合流路に配置されている請求項1又は2に記載の方法。 - 更に、前記主流路に溶液を循環させるポンプを含む請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ポンプは、少なくとも3つのポンプバルブを含む請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記主流路は、溶液中の物質の検出部を含む請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記溶液中の物質は生体分子であり、
前記検出部は、前記生体分子に親和性を有する物質が固定された基板を含む請求項6に記載の方法。 - 溶液混合器を用いて、2種類の溶液を混合する方法であって、
前記溶液混合器は、
溶液が循環する主流路と、前記主流路に接続する溶液導入流路と、前記主流路に接続する溶液排出流路と、を含み、前記溶液排出流路は溶液排出流路バルブを有し、前記主流路は2つの主流路バルブを有し、前記溶液導入流路及び前記溶液排出流路は、前記2つの主流路バルブを閉じることによって区画される前記主流路の部分領域以外の領域で前記主流路に接続しており、
前記2つの主流路バルブは、それらを閉じることによって区画される前記主流路の部分領域のそれぞれが所定の体積を有するよう配置されており、
前記2つの主流路バルブ及び前記溶液排出流路バルブを開放した状態で、第一の溶液を前記溶液導入流路から前記主流路に送液する工程aと、
前記2つの主流路バルブを閉じる工程bと、
第二の溶液を前記溶液導入流路から前記主流路に送液する工程cと、
前記溶液排出流路バルブを閉じる工程dと、
前記2つの主流路バルブを開け、前記第一の溶液と前記第二の溶液とを循環させて混合する工程eと、
を含む方法。 - 溶液混合容器を用いて、複数の溶液を混合する方法であって、
前記溶液混合容器は、
第一の流路と、
第二の流路と、
前記第一の流路及び前記第二の流路を連通させる第一の結合流路及び第二の結合流路と、
前記第一の流路及び前記第二の流路のそれぞれに接続する第一の溶液導入流路及び第二の溶液導入流路と、
前記第一の流路及び前記第二の流路のそれぞれに接続する第一の溶液排出流路及び第二の溶液排出流路と、
前記第一の溶液排出流路及び前記第二の溶液排出流路にそれぞれ配置された第一の溶液排出流路バルブ及び第二の溶液排出流路バルブと、
前記第一の結合流路及び前記第二の結合流路にそれぞれ配置された第一の主流路バルブ及び第二の主流路バルブであって、それらを閉じることによって区画される前記主流路の部分領域のそれぞれが所定の体積を有するよう配置されている第一の主流路バルブ及び第二の主流路バルブとを有し、
前記第一の主流路バルブ及び前記第二の主流路バルブを閉じ、前記第一の溶液排出流路バルブ及び前記第二の溶液排出流路バルブを開放した状態で、前記第一の溶液導入流路から前記第一の流路に第一の溶液を導入し、前記第二の溶液導入流路から前記第二の流路に第二の溶液を導入する工程aと、
前記第一の溶液排出流路バルブ及び前記第二の溶液排出流路バルブを閉じ、前記第一の主流路バルブ及び前記第二の主流路バルブを開放して、前記第一の溶液及び前記第二の溶液を循環させて混合する工程bと、
を含む方法。 - 前記溶液混合容器は、更に、
第三の流路と、
前記第二の流路及び前記第三の流路を連通させる第三の結合流路及び第四の結合流路と、
前記第三の流路に接続する第三の溶液導入流路と、
前記第三の流路に接続する第三の溶液排出流路と、
前記第三の溶液排出流路に配置された第三の溶液排出流路バルブと、
前記第三の結合流路及び前記第四の結合流路にそれぞれ配置された第三の主流路バルブ及び第四の主流路バルブと、
を有し、
前記工程bの前又は後に、前記第三の溶液排出流路バルブを開放した状態で、前記第三の溶液導入流路から前記第三の流路に第三の溶液を導入する工程cと、
前記工程b及び前記工程cの後に、前記第三の溶液排出流路バルブを閉じ、前記第三の主流路バルブ及び前記第四の主流路バルブを開放して、前記第一の溶液及び前記第二の溶液の混合溶液と、第三の溶液とを循環させて混合する工程dと、を含む請求項9に記載の方法。 - 混合容器を用いて、複数の溶液を混合する方法であって、
前記混合容器は、溶液が循環する主流路を含み、
前記主流路は、第一の流路と、第二の流路と、第三の流路と、前記第一の流路と前記第二の流路とを連通させる第一の結合流路及び第二の結合流路と、前記第二の流路及び前記第三の流路を連通させる第三の結合流路及び第四の結合流路と、を含み、
前記第一の流路、前記第二の流路及び前記第三の流路に接続する少なくとも1つの溶液導入流路と、
前記第一の流路、前記第二の流路及び前記第三の流路に接続する少なくとも1つの溶液排出流路と、を備え、
前記溶液排出流路は少なくとも1つの溶液排出流路バルブを有し、
前記第一の結合流路、前記第二の結合流路、第三の結合流路及び第四の結合流路は、それぞれ少なくとも1つの主流路バルブを有し、
前記主流路バルブ及び前記溶液排出流路バルブは、前記主流路バルブ及び前記溶液排出流路バルブを閉じることによって区画される前記第一の流路、前記第二の流路及び前記第三の流路それぞれの部分領域が所定の体積を有するよう配置され、
前記第一の流路及び前記第二の流路が、相互に、且つ、他の流路から隔離されるように前記主流路バルブ及び前記溶液排出流路バルブを閉じ、前記第一の流路に第一の溶液を導入し、前記第二の流路に第二の溶液を導入する工程aと、
前記第一の流路と前記第二の流路とが連通するように主流路バルブを開放し、前記第一の溶液及び前記第二の溶液を循環させて混合する工程bと、
前記第三の流路が、他の流路から隔離されるように前記主流路バルブ及び前記溶液排出流路バルブを閉じ、前記第三の流路に第三の溶液を導入する工程cと、
前記第一の流路及び前記第二の流路と前記第三の流路とが連通するように主流路バルブを開放し、第一の溶液及び第二の溶液の混合溶液と第三の溶液とを循環させて混合する工程dと、
を含む方法。
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