JP2019024451A - 組換え酵母及びこれを用いたエタノールの製造方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】アセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子を導入したキシロース代謝能を有する組換え酵母であって、ミトコンドリア外膜における細胞質NADHの再酸化に関与するNADH脱水素酵素をコードする遺伝子を抑制する。
【選択図】図1
Description
なお、GPD1・GPD2遺伝子によるグルセリン生産経路は、下記式に示すように、代謝で発生する余剰の補酵素NADHをNAD+に酸化する経路である。
よってGPD1・GPD2遺伝子を破壊することでこの反応経路を破壊し、mhpFを導入することで余剰の補酵素NADHを供給し、下記の反応が進む。
アセチルコエンザイムA+NADH+H+→アセトアルデヒド+NAD++コエンザイムA
また、アセチルコエンザイムAは酢酸からアセチル-CoA合成酵素により合成され、アセトアルデヒドはエタノールに変換されることから、最終的には下記反応式になり、余剰の補酵素NADHが酸化されると同時に、酢酸も代謝される。
酢酸+2NADH+2H++ATP→エタノール+NAD++AMP+Pi
(1)アセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子を導入したキシロース代謝能を有する組換え酵母であって、ミトコンドリア外膜における細胞質NADHの再酸化に関与するNADH脱水素酵素をコードする遺伝子を抑制したことを特徴とする組換え酵母。
(2)上記NADH脱水素酵素をコードする遺伝子は、以下の(a)又は(b)のタンパク質をコードする遺伝子であることを特徴とする(1)記載の組換え酵母。
(a)配列番号2又は4に示すアミノ酸配列を有するタンパク質
(b)配列番号2又は4に示すアミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、NADHをNAD+とする反応を触媒する酵素活性を有するタンパク質
(3)キシロースイソメラーゼ遺伝子が導入されたものであることを特徴とする(1)記載の組換え酵母。
(4)上記キシロースイソメラーゼ遺伝子は、以下の(a)又は(b)のタンパク質をコードする遺伝子であることを特徴とする(3)記載の組換え酵母。
(a)配列番号6に示すアミノ酸配列を有するタンパク質
(b)配列番号6に示すアミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、キシロースをキシルロースにする酵素活性を有するタンパク質
(5)更にキシルロキナーゼ遺伝子が導入されたものであることを特徴とする(1)記載の組換え酵母。
(6)ペントースリン酸経路における非酸化過程の経路を構成する酵素群から選ばれる酵素をコードする遺伝子が導入されたものであることを特徴とする(1)記載の組換え酵母。
(7)上記ペントースリン酸経路における非酸化過程の経路を構成する酵素群は、リボース-5-リン酸イソメラーゼ、リブロース-5-リン酸-3-エピメラーゼ、トランスケトラーゼ及びトランスアルドラーゼであることを特徴とする(6)記載の組換え酵母。
(8)上記組換え酵母は、アセトアルデヒドをエタノールに変換する活性を有するアルコール脱水素酵素遺伝子を高発現することを特徴とする(1)記載の組換え酵母。
(9)上記組換え酵母は、エタノールをアセトアルデヒドに変換する活性を有するアルコール脱水素酵素遺伝子の発現量が低下したものであることを特徴とする(1)記載の組換え酵母。
(10)上記(1)〜(9)いずれかに記載の組換え酵母を、キシロースを含有する培地にて培養してエタノール発酵を行う工程を有するエタノールの製造方法。
(11)上記培地はセルロースを含有しており、上記エタノール発酵では、少なくとも上記セルロースの糖化が同時に進行することを特徴とする(10)記載のエタノールの製造方法。
本発明に係るエタノールの製造方法は、キシロース代謝能を有し、アセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子を導入した組換え酵母であって、ミトコンドリア外膜における細胞質NADHの再酸化に関与するNADH脱水素酵素をコードする遺伝子を抑制した組換え酵母である。本発明に係る組換え酵母は、培地に含まれる酢酸を代謝することができる。したがって、本発明に係る組換え酵母を利用したエタノールの製造方法によれば、エタノール発酵に伴って培地中の酢酸濃度が低減するといった特徴がある。
本発明に係るエタノールの製造方法に使用される組換え酵母は、アセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子を導入し、且つ、ミトコンドリア外膜における細胞質NADHの再酸化に関与するNADH脱水素酵素をコードする遺伝子(以下、NADH脱水素酵素遺伝子と称する)を抑制した、キシロース代謝能を有する組換え酵母である。ここで、キシロース代謝能を有するとは、本来的にはキシロース代謝能を有しない酵母に対してキシロース代謝関連酵素遺伝子を導入することでキシロース代謝能を獲得すること、或いは、本来的にキシロース代謝関連酵素遺伝子を備えておりキシロース代謝能を有していることの両方を意味する。より具体的に、キシロース代謝能を有する酵母としては、本来的にはキシロース代謝能を有しない酵母に対して、キシロースイソメラーゼ遺伝子が導入されることによりキシロース代謝能が付与された酵母、その他のキシロース代謝関連遺伝子が導入されることによりキシロース代謝能が付与された酵母を挙げることができる。
本発明に係る組換え酵母は、例えば、キシロース代謝能を有しない酵母に対して、上述したアセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子及び上述したキシロース代謝関連酵素遺伝子を導入するとともに、当該酵母ゲノムにおけるNADH脱水素酵素遺伝子の発現量が低下するように改変することで作製することができる。或いは、本発明に係る組換え酵母は、例えば、キシロース代謝能を有する酵母に対して、上述したアセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子を導入するとともに、当該酵母ゲノムにおけるNADH脱水素酵素遺伝子を破壊することで作製することができる。なお、本発明に係る組換え酵母を作製するに際して、上述した他の遺伝子を導入しても良いし、エタノールをアルデヒドに変換する活性を有するアルコール脱水素酵素遺伝子(ADH2遺伝子)の発現量を低下するよう改変しても良い。
以上で説明した組換え酵母を使用してエタノールを製造する際には、少なくともキシロースを含有する培地にてエタノール発酵培養を行う。すなわち、エタノール発酵を行う培地とは、炭素源として少なくともキシロースを含有することとなる。なお、培地には、予めグルコース等の他の炭素源が含まれていても良い。
本実施例では、キシロースイソメラーゼ遺伝子及び大腸菌のアセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子等を導入し、NADH脱水素酵素遺伝子を破壊した組換え酵母を作製し、この組換え酵母の酢酸代謝能を評価した。
(1)XI・XKS1・TKL1・TAL1・RKI1・RPE1遺伝子導入及びGRE3遺伝子破壊用プラスミド
GRE3遺伝子座にGRE3遺伝子を破壊しながら、ヤマトシロアリ(Reticulitermes speratus)腸内原生生物由来のキシロースイソメラーゼ遺伝子の377番目のアミノ酸をアスパラギンからスレオニンに置換され、キシロースの資化速度が向上した変異遺伝子(XI_N337C; WO2014/156194参照)、酵母由来のキシルロキナーゼ(XKS1)遺伝子、ペントースリン酸回路のトランスケトラーゼ1(TKL1)遺伝子、トランスアルドラーゼ1(TAL1)遺伝子、リブロースリン酸エピメラーゼ1(RPE1)遺伝子、リボースリン酸ケトイソメラーゼ(RKI1)遺伝子を酵母に導入するために必要な配列を含むプラスミド、pUC-5U_GRE3- P_HOR7- TKL1- TAL1-FBA1_P-P_ADH1-RPE1- RKI1-TEF1_P-P_TDH1-XI_N337C-T_DIT1- P_TDH3-XKS1-T_HIS3-LoxP-G418-LoxP-3U_GRE3を作製した。
ADH2遺伝子座にADH2遺伝子を破壊しながら、E. coli由来のアセトアルデヒド脱水素遺伝子(mhpF)及び酵母由来のアルコールデヒドロゲナーゼ1(ADH1)遺伝子を酵母に導入するために必要な配列を含むプラスミド、pUC-5U_ADH2-P_TDH3-ADH1-T_ADH1-DIT1_T-mhpF-HOR7_P-URA3-3U_ADH2を作製した。
ADH2遺伝子座にADH2遺伝子を破壊しながら、E. coli由来のアセトアルデヒド脱水素遺伝子(adhE)及び酵母由来のアルコールデヒドロゲナーゼ1(ADH1)遺伝子を酵母に導入するために必要な配列を含むプラスミド、pUC-5U_ADH2-P_TDH3-ADH1-T_ADH1-DIT1_T-adhE-HOR7_P-URA3-3U_ADH2を作製した。
NDE1遺伝子を破壊するために必要な配列を含むプラスミド、PUC19-5U_NDE1-RPL41B_T-eutE-TDH3_P-LoxP66-P_CYC1-HPH-T_URA3-CYC1_T-Crei-GAL1_P-LoxP71-3U_NDE1を作製した。このプラスミドには、酵母ゲノム上への相同組換えおよびNDE1遺伝子を破壊するための領域として、NDE1遺伝子の上流約800bpのDNA配列(5U_NDE1)、NDE1遺伝子の下流約1050bpのDNA配列(3U_NDE1)、並びにTDH3プロモーターとRPL41Bターミネーターが付加されたeutE遺伝子(NCBIアクセスNo.946943、全長を酵母のコドン使用頻度に合わせてコドンを変換した配列を全合成したもの)、マーカーとしてハイグロマイシン耐性遺伝子を含む遺伝子配列(HPH marker)が含まれるように構築した。
機能していないURA3遺伝子座のURA3遺伝子を相同組換えにより野生型に戻すための野生型URA3遺伝子断片をOC2株より増幅した。本DNA断片は下記表5のプライマーを用いたPCRにより増幅することが可能である。
Cre遺伝子をマルチコピーで発現するためのプラスミドpYES-Creを作製した。このプラスミドはpYES6/CT(ライフテクノロジー)に、ガラクトースで誘導されるプロモーターであるGAL1プロモーターと融合したCre遺伝子(NCBIアクセスNo.NP_415757.1、全長を酵母のコドン使用頻度に合わせてコドンを変換した配列を全合成したもの)を導入して構築した。
2倍体酵母のSaccharomyces cerevisiae OC2株(NBRC2260)を5-フルオロオロチン酸添加培地で選抜し(Boeke, J.D., et al. 1987 Methods Enzymol.;154:164-75.)、ウラシル要求性となった株(OC2U)を宿主とした。酵母の形質転換はFrozen-EZ Yeast Transformation II(ZYMO RESEARCH)を用い、添付のプロトコルに従って行った。
本実施例で作製した株の遺伝子型を表7にまとめた。
以上のように作製した株からそれぞれ発酵能力が高い株を選び、フラスコ発酵試験を以下のように実施した。まず、グルコース濃度20g/LのYPD液体培地(イーストエキストラクト 10g/L、ペプトン 20g/L、グルコース 20g/L)を20ml分注した100ml容バッフル付きフラスコに供試株を植菌し、30℃ 120rpmで24時間培養を行った。集菌後、エタノール生産用の培地(グルコース46g/L、キシロース40g/L、イーストエキストラクト10g/L、ペプトン20g/L及び酢酸3.0g/L)を8ml分注した10ml容フラスコに植菌し(菌濃度0.3g乾燥菌体/L)、振盪培養(80rpm、振幅35mm、30℃)、温度を31度又は34度にて発酵試験を行った。なお、フラスコにつける栓は、内径1.5mmニードルを通したゴム製で、ニードルの先に逆止弁を取り付けることでフラスコが嫌気的に保たれるようにした。
カラム:AminexHPX-87H
移動相:0.01N H2SO4
流量:0.6ml/min
温度:30℃
検出器:示差屈折率検出器 RID-10A
発酵試験の結果を表8及び図1に示した。
Claims (11)
- アセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子を導入したキシロース代謝能を有する組換え酵母であって、ミトコンドリア外膜における細胞質NADHの再酸化に関与するNADH脱水素酵素をコードする遺伝子を抑制したことを特徴とする組換え酵母。
- 上記NADH脱水素酵素をコードする遺伝子は、以下の(a)又は(b)のタンパク質をコードする遺伝子であることを特徴とする請求項1記載の組換え酵母。
(a)配列番号2又は4に示すアミノ酸配列を有するタンパク質
(b)配列番号2又は4に示すアミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、NADHをNAD+とする反応を触媒する酵素活性を有するタンパク質 - キシロースイソメラーゼ遺伝子が導入されたものであることを特徴とする請求項1記載の組換え酵母。
- 上記キシロースイソメラーゼ遺伝子は、以下の(a)又は(b)のタンパク質をコードする遺伝子であることを特徴とする請求項3記載の組換え酵母。
(a)配列番号6に示すアミノ酸配列を有するタンパク質
(b)配列番号6に示すアミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、キシロースをキシルロースにする酵素活性を有するタンパク質 - 更にキシルロキナーゼ遺伝子が導入されたものであることを特徴とする請求項1記載の組換え酵母。
- ペントースリン酸経路における非酸化過程の経路を構成する酵素群から選ばれる酵素をコードする遺伝子が導入されたものであることを特徴とする請求項1記載の組換え酵母。
- 上記ペントースリン酸経路における非酸化過程の経路を構成する酵素群は、リボース-5-リン酸イソメラーゼ、リブロース-5-リン酸-3-エピメラーゼ、トランスケトラーゼ及びトランスアルドラーゼであることを特徴とする請求項6記載の組換え酵母。
- 上記組換え酵母は、アセトアルデヒドをエタノールに変換する活性を有するアルコール脱水素酵素遺伝子を高発現することを特徴とする請求項1記載の組換え酵母。
- 上記組換え酵母は、エタノールをアセトアルデヒドに変換する活性を有するアルコール脱水素酵素遺伝子の発現量が低下したものであることを特徴とする請求項1記載の組換え酵母。
- 請求項1〜9いずれか一項記載の組換え酵母を、キシロースを含有する培地にて培養してエタノール発酵を行う工程を有するエタノールの製造方法。
- 上記培地はセルロースを含有しており、上記エタノール発酵では、少なくとも上記セルロースの糖化が同時に進行することを特徴とする請求項10記載のエタノールの製造方法。
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