JP2018530336A - 多重ゲノム編集 - Google Patents

Abstract

細胞内の遺伝子の一部又は全部のコピーを変化させる方法であって、１又は複数の標的核酸配列の各々の全体又は一部に相補的な部分を含む１又は複数のリボ核酸（ＲＮＡ）配列及びＣａｓタンパク質をコードする核酸配列を細胞に導入すること、並びにＣａｓタンパク質が発現され、且つＣａｓタンパク質が細胞内の１又は複数の標的核酸配列に結合して変化させる条件下で細胞を維持することを含む方法が提供される。

Description

関連出願データ
本出願は、２０１５年１０月８日に出願された米国仮特許出願第６２／２３９，２３９号に対する優先権を主張するものであり、あらゆる目的のために、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

配列特異的ヌクレアーゼによるゲノム編集は公知である。ゲノムにおけるヌクレアーゼを介した二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）切断は、非特異的な挿入及び欠失（インデル）の導入を頻繁に生じる非相同末端結合（Non-Homologous End Joining）（ＮＨＥＪ）、又は相同鎖を修復鋳型として組み込む相同組換え修復（homology directed repair）（ＨＤＲ）の２つの主要な機構によって修復され得る。その全体が参照により本明細書に組み込まれる、参考文献４を参照されたい。配列特異的ヌクレアーゼが、所望の突然変異を含む相同ドナーＤＮＡコンストラクトと共に送達された場合、遺伝子ターゲティング効率は、ドナーコンストラクト単独に比べて１０００倍上昇する。

１細胞胚に部位特異的ヌクレアーゼのＤＮＡ又はｍＲＮＡを直接注入し、様々な種の特定の遺伝子座でＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）を生じさせることにより、ゲノム改変工程を加速するための代替的な方法が開発されている。これらの部位特異的ヌクレアーゼによって誘導されたＤＳＢは、その後、誤りがちな（error-prone）非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって修復され、切断部位に欠失又は挿入を保有する突然変異マウス及びラットがもたらされ得る。ＤＳＢに隣接する末端に相同性を有するドナープラスミドを同時注入した場合、高忠実度の相同組換えにより、標的組込みを有する動物を産生することができる。これらの方法は、それぞれの標的遺伝子についてのジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＮＦ）又は転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）の複雑な設計を必要とし、ターゲティングの効率が実質的に異なり得るため、これまで多重遺伝子ターゲティングは報告されていない。

したがって、移植用臓器の潜在的な供給源のために、ブタなどの動物を産生する遺伝的に改変された細胞を作製するための改善された方法が必要とされている。

本明細書には、細胞内の複数の核酸配列の高効率な同時ターゲティングを達成するための、クラスタ化された規則的な間隔の短い回文構造の繰り返し（ＣＲＩＳＰＲ）及びＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）システムの使用が記載される。

本開示の態様は、ヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡ結合タンパク質などの、細胞によって発現されるヌクレアーゼ活性を有する酵素をＤＮＡ（デオキシリボ核酸）上の標的位置へと導く１又は複数のガイドＲＮＡ（リボ核酸）を使用して、前記位置で酵素がＤＮＡを切断し、相同組換えなどによって外来性ドナー核酸がＤＮＡに挿入される、細胞（例えば、幹細胞、体細胞、生殖系列細胞、接合子）における、ＤＮＡの多重改変などのゲノムＤＮＡの改変に関する。本開示の態様は、細胞内にＤＮＡの複数の改変を有する細胞を作製するための、細胞におけるＤＮＡ改変をサイクリング又は反復する工程を含む。改変には、外来性ドナー核酸の挿入が含まれ得る。改変には、内因性核酸の欠失が含まれ得る。

複数の核酸配列を、共形質転換などによって、酵素及び複数のＲＮＡをコードする核酸を発現する細胞に導入する単一工程によって変化させる（modulate）（例えば、不活性化する）ことができ、この工程でＲＮＡが発現され、複数のＲＮＡの各々がＤＮＡの特定部位に酵素をガイドし、酵素がＤＮＡを切断する。この態様によれば、細胞内のＤＮＡの多くの変化又は改変が単一サイクルで作製される。

ある態様によれば、酵素を発現する細胞は、酵素をコードし且つ細胞によって発現され得る核酸を細胞に導入することなどにより、酵素を発現するように遺伝的に改変されている。このように、本開示の態様は、酵素を発現する細胞にＲＮＡを導入する工程、細胞に外来性ドナー核酸を導入する工程、ＲＮＡを発現させる工程、ＲＮＡ、酵素、及びＤＮＡの共局在複合体を形成する工程、並びに酵素によってＤＮＡを酵素的に切断する工程をサイクリングさせることを含む。ドナー核酸のＤＮＡへの挿入も本明細書で提供される。上記工程をサイクリング又は反復することにより、複数の遺伝子座における細胞の多重遺伝子改変、すなわち複数の遺伝子改変を有する細胞がもたらされる。

特定の態様によれば、本開示の範囲内のＤＮＡ結合タンパク質又は酵素には、ガイドＲＮＡと複合体を形成するタンパク質が含まれ、ガイドＲＮＡは複合体を二本鎖ＤＮＡ配列にガイドし、ここで複合体はＤＮＡ配列に結合する。ある態様によれば、酵素は、ＤＮＡに結合し且つＲＮＡによってガイドされる、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＲＮＡガイドＤＮＡ結合タンパク質などの、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合タンパク質であり得る。ある態様によれば、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合タンパク質はＣａｓ９タンパク質である。

本開示のこの態様は、ＲＮＡ及びＤＮＡ結合タンパク質の二本鎖ＤＮＡへの共局在又は二本鎖ＤＮＡとの共局在と称され得る。このようにして、ＤＮＡ結合タンパク質−ガイドＲＮＡ複合体を用いて二本鎖ＤＮＡの複数の部位を切断し、遺伝子の１又は複数（例えば、全部）のコピーの破壊などの複数の遺伝子改変を有する細胞が作製され得る。

特定の態様によれば、標的ＤＮＡに相補的なＲＮＡとの共局在複合体を形成し且つ標的ＤＮＡを部位特異的に切断する酵素を発現する細胞内の標的ＤＮＡに複数の変異を加える方法が提供され、この方法は、（ａ）標的ＤＮＡに相補的な１又は複数のＲＮＡをコードし且つ酵素を標的ＤＮＡにガイドする第一外来核酸を細胞に導入する工程であって、前記１又は複数のＲＮＡ及び酵素は標的ＤＮＡの共局在複合体のメンバーであり、１又は複数のＲＮＡと酵素が標的ＤＮＡに共局在し、酵素が標的ＤＮＡを切断して細胞内で変異ＤＮＡを生成する工程、並びに工程（ａ）を複数回反復して細胞内のＤＮＡに複数の変異を生じさせることを含む。

いくつかの態様では、細胞内の１又は複数の標的核酸配列の発現を不活性化する方法は、１又は複数の標的核酸配列の各々の全体又は一部に相補的な部分を含む１又は複数のリボ核酸（ＲＮＡ）配列及びＣａｓタンパク質をコードする核酸配列を細胞に導入すること；並びに細胞内でＣａｓタンパク質が発現され、且つＣａｓタンパク質が１又は複数の標的核酸配列に結合して不活性化する条件下で細胞を維持することを含む。

他の態様では、細胞内の１又は複数の標的核酸配列を変化させる方法は、細胞内の標的核酸配列の全体又は一部に相補的なＲＮＡをコードする核酸配列を細胞に導入すること；ＲＮＡと相互作用し且つ標的核酸配列を部位特異的に切断する酵素をコードする核酸配列を細胞に導入すること；及び複合体を形成する相補的標的核酸配列にＲＮＡが結合する条件下で細胞を維持することを含み、酵素が複合体上の結合部位に結合して、１又は複数の標的核酸配列を変化させる。

本明細書で述べる方法では、導入工程は、１又は複数のＲＮＡ配列及びＣａｓタンパク質をコードする核酸配列を細胞にトランスフェクトすることを含み得る。

いくつかの実施形態では、１又は複数のＲＮＡ配列、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列、又はそれらの組合せが、細胞のゲノムに導入される。

いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質の発現が誘導される。

本明細書で述べる方法では、細胞は胚由来である。細胞は、幹細胞、接合子、又は生殖系列細胞であり得る。細胞が幹細胞である実施形態では、幹細胞は、胚性幹細胞又は多能性幹細胞である。他の実施形態では、細胞は体細胞である。細胞が体細胞である実施形態では、体細胞は、真核細胞又は原核細胞である。真核細胞は、ブタ、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ウマ、ウシ、非ヒト霊長動物、ヒト由来などの動物細胞であり得る。

１又は複数の標的核酸配列は、ブタ内在性レトロウイルス（ＰＥＲＶ）遺伝子を含み得る。例えば、ＰＥＲＶ遺伝子はｐｏｌ遺伝子を含み得る。

本明細書で述べる方法は、ｐｏｌ遺伝子の１又は複数のコピーを不活性化すること、変化させること、又は生じさせることができる。いくつかの実施形態では、細胞内のｐｏｌ遺伝子のすべてのコピーが不活性化される。

いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質はＣａｓ９である。

いくつかの実施形態では、１又は複数のＲＮＡ配列は、約１０から約１０００ヌクレオチドであり得る。例えば、１又は複数のＲＮＡ配列は、約１５から約２００ヌクレオチドであり得る。

いくつかの態様では、遺伝子操作された細胞は、１又は複数の内在性ウイルス遺伝子、及び１又は複数の内在性ウイルス遺伝子の１又は複数の標的核酸配列の全体又は一部に相補的な部分を含む１又は複数の外来性核酸配列を含み、ここで、細胞の１又は複数の内在性ウイルス遺伝子の各々が変化される。

別の態様では、遺伝子操作された細胞は、複数の内在性ウイルス遺伝子、及び複数の内在性ウイルス遺伝子の１又は複数の標的核酸配列の全体又は一部に相補的な部分を含む１又は複数の外来性核酸配列を含むことができ、ここで、細胞の複数の内在性ウイルス遺伝子の各々が変化される。

本明細書で述べる遺伝子操作された細胞は、ブタ内在性レトロウイルス（ＰＥＲＶ）遺伝子を含み得る。例えば、ＰＥＲＶ遺伝子はｐｏｌ遺伝子を含み得る。

いくつかの態様では、ｐｏｌ遺伝子の変化により、ｐｏｌ遺伝子の１又は複数のコピーが不活性化される。例えば、細胞内のｐｏｌ遺伝子の全部又は実質的に全部のコピーが不活性化される。

ある態様によれば、ＲＮＡは約１０から約１０００ヌクレオチドである。ある態様によれば、ＲＮＡは約２０から約１００ヌクレオチドである。

ある態様によれば、１又は複数のＲＮＡはガイドＲＮＡである。ある態様によれば、１又は複数のＲＮＡはｔｒａｃｒＲＮＡ−ｃｒＲＮＡ融合体である。

ある態様によれば、ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、又は外因性ＤＮＡである。

ＰＫ１５細胞中の６２コピーのＰＥＲＶ中のｐｏｌ遺伝子を特異的に標的とするようにＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ ｇＲＮＡを設計したことを示す図である。ブタゲノム中に存在する内在性レトロウイルスを表す系統樹。ＰＥＲＶは青色で強調される。 ＰＫ１５細胞中の６２コピーのＰＥＲＶ中のｐｏｌ遺伝子を特異的に標的とするようにＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ ｇＲＮＡを設計したことを示す図である。デジタル液滴ＰＣＲ（digital droplet PCR）によるＰＫ１５細胞中のＰＥＲＶのコピー数の測定。ｐｏｌエレメントのコピー数は、ＡＣＴＢ、ＧＡＰＤＨ、及びＥＢ２の３つの独立した参照遺伝子を用いて６２と推定された。Ｎ＝３、平均±ＳＥＭ。 ＰＫ１５細胞中の６２コピーのＰＥＲＶ中のｐｏｌ遺伝子を特異的に標的とするようにＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ ｇＲＮＡを、設計したことを示す図である。２つのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ ｇＲＮＡを、ＰＥＲＶ ｐｏｌ遺伝子の触媒領域を標的とするように設計した。２つのｇＲＮＡターゲティング配列をＰＥＲＶ遺伝子構造の模式図の下に示している。これらのＰＡＭ配列は赤色で強調される。（配列番号：２７〜２８） Ｃａｓ９処理後にＰＲＥＶ ｐｏｌ遺伝子のすべてのコピーが不活性化されたクローンＰＫ１５細胞を示す図である。Ｃａｓ９誘導の１７日後に、単一細胞由来のＰＫ１５のクローン間でｐｏｌターゲティング効率の二峰性分布が観察された。４５／５０クローンは１６％未満のターゲティング効率を示し、５／５０クローンは９３％を超えるターゲティング効率を示した。 Ｃａｓ９処理後にＰＲＥＶ ｐｏｌ遺伝子のすべてのコピーが不活性化されたクローンＰＫ１５細胞を示す図である。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９処理後のＰＥＲＶ ｐｏｌ遺伝子座におけるＰＫ１５ハプロタイプ。ＰＥＲＶ ｐｏｌ配列におけるインデル事象が赤色で示されている。紫色の陰影は内在性ＰＥＲＶを示す。 ＰＫ１５細胞と５日間及び７日間共培養した後のＨＥＫ−２９３−ＧＦＰ細胞（それぞれ２９３Ｇ５Ｄ及び３９３Ｇ７Ｄ）のゲノムにおけるＰＥＲＶ ｐｏｌ ＤＮＡ、ＰＥＲＶ ｇａｇ ＤＮＡ、及びＰＥＲＶ ｅｎｖ ＤＮＡの検出を示す図である。ブタＧＧＴＡ１プライマーセットを用いて、精製したヒト細胞におけるブタ細胞混入を検出した。 特定のプライマーセットを用いた、野生型ＰＫ１５細胞と共培養した集団に由来する１０００個の２９３Ｇ細胞におけるＰＥＲＶエレメント数のｑＰＣＲ定量を示す図である。（Ｎ＝３、平均±ＳＥＭ） 高レベルのＰＥＲＶ ｐｏｌ改変を有するＰＫ１５クローン１５、２０、２９、及び３８、並びに最小限に改変されたクローン４０及び４１におけるＰＥＲＶエレメント数のｑＰＣＲ定量を示す図である。（Ｎ＝ ３、平均±ＳＥＭ） 高度に改変されたＰＫ１５クローン２０及び最小限に改変されたクローン４０と共にあらかじめ培養した集団から単離した様々な数のＨＥＫ２９３−ＧＦＰ細胞（０．１個、１個、１０個、及び１００）由来のゲノムＤＮＡ上のＰＥＲＶ ｐｏｌに関するＰＣＲの結果を示す図である。ＰＣＲ反応の完全なパネルについては図Ｓ１８−２１を参照のこと。 図４（図Ｓ１）は、ＰＥＲＶ ｐｏｌコンセンサス配列及びｇＲＮＡ設計を示す図である。 図５（図Ｓ２）は、ＰＥＲＶを標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９コンストラクトの模式図である。 図６（図Ｓ３）は、Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ活性の測定を示す図である。 図７（図Ｓ４）は、ＰＥＲＶターゲティングのためのＣａｓ９発現を誘導するＤＯＸ濃度の最適化を示す図である。 図８（図Ｓ５）は、Ｐｉｇｇｙｂａｃ−Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ ＰＥＲＶターゲティング効率の時系列測定を示す図である。 図９（図Ｓ６）は、Ｌｅｎｔｉ−Ｃａｓ９／２ｇＲＮＡ ＰＥＲＶターゲティング効率の時系列測定を示す図である。 図１０（図Ｓ７）は、ＰＥＲＶターゲティング効率及びインデルパターン化のサンガー配列決定による検証を示す図である。（配列番号：２９） 図１１（図Ｓ８）は、反復された遺伝子編集実験を示す。 図１２Ａ（図Ｓ９）は、単一細胞のＰＥＲＶ ｐｏｌターゲティング効率を示す図である。 図１２Ｂ（図Ｓ９）は、単一細胞のＰＥＲＶ ｐｏｌターゲティング効率を示す図である。 図１３（図Ｓ１０）は、ＰＥＲＶハプロタイプの系統樹を示す図である。 図１４（図Ｓ１１）はｐｏｌ遺伝子破壊の分布を示す図である。 図１５Ａ（図Ｓ１２）は、高改変ＰＫ１５クローン及び低改変ＰＫ１５クローンの核型分析を示す図である。 図１５Ｂ（図Ｓ１２）は、高改変ＰＫ１５クローン及び低改変ＰＫ１５クローンの核型分析を示す図である。 図１６（図Ｓ１３）は、ＰＫ１５クローンの核型分析の概要を示す図である。 図１７（図Ｓ１４）は核型の命名法を示す図である。 図１８（図Ｓ１５）は、ＰＥＲＶ逆転写酵素活性の検出を示す図である。 図１９（図Ｓ１６）は、ヒト細胞へのＰＥＲＶの感染を検出するための実験計画を示す図である。 図２０Ａ（図Ｓ１７）は、ＦＡＣＳによる精製ＨＥＫ２９３−ＧＦＰ細胞の品質管理を示す図である。 図２０Ｂ（図Ｓ１７）は、ＦＡＣＳによる精製ＨＥＫ２９３−ＧＦＰ細胞の品質管理を示す図である。 図２０Ｃ（図Ｓ１７）は、ＦＡＣＳによる精製ＨＥＫ２９３−ＧＦＰ細胞の品質管理を示す図である。 図２１Ａ（図Ｓ１８）は、ブタＧＧＴＡ１プライマーを用いたＨＥＫ２９３細胞におけるブタ細胞混入の検出を示す図である。 図２１Ｂ（図Ｓ１８）は、ブタＧＧＴＡ１プライマーを用いたＨＥＫ２９３細胞におけるブタ細胞混入の検出を示す図である。 図２１Ｃ（図Ｓ１８）は、ブタＧＧＴＡ１プライマーを用いたＨＥＫ２９３細胞におけるブタ細胞混入の検出を示す図である。 図２１Ｄ（図Ｓ１８）は、ブタＧＧＴＡ１プライマーを用いたＨＥＫ２９３細胞におけるブタ細胞混入の検出を示す図である。 図２２Ａ（図Ｓ１９）は、ＰＥＲＶ ｐｏｌプライマーを用いたＨＥＫ２９３細胞におけるＰＥＲＶ ＤＮＡエレメントの検出を示す図である。 図２２Ｂ（図Ｓ１９）は、ＰＥＲＶ ｐｏｌプライマーを用いたＨＥＫ２９３細胞におけるＰＥＲＶ ＤＮＡエレメントの検出を示す図である。 図２２Ｃ（図Ｓ１９）は、ＰＥＲＶ ｐｏｌプライマーを用いたＨＥＫ２９３細胞におけるＰＥＲＶ ＤＮＡエレメントの検出を示す図である。 図２２Ｄ（図Ｓ１９）は、ＰＥＲＶ ｐｏｌプライマーを用いたＨＥＫ２９３細胞におけるＰＥＲＶ ＤＮＡエレメントの検出を示す図である。 図２３Ａ（図Ｓ２０）は、ＰＥＲＶ ｅｎｖプライマーを用いたＨＥＫ２９３細胞におけるＰＥＲＶ ＤＮＡエレメントの検出を示す図である。 図２３Ｂ（図Ｓ２０）は、ＰＥＲＶ ｅｎｖプライマーを用いたＨＥＫ２９３細胞におけるＰＥＲＶ ＤＮＡエレメントの検出を示す図である。 図２３Ｃ（図Ｓ２０）は、ＰＥＲＶ ｅｎｖプライマーを用いたＨＥＫ２９３細胞におけるＰＥＲＶ ＤＮＡエレメントの検出を示す図である。 図２３Ｄ（図Ｓ２０）は、ＰＥＲＶ ｅｎｖプライマーを用いたＨＥＫ２９３細胞におけるＰＥＲＶ ＤＮＡエレメントの検出を示す図である。 図２４Ａ（図Ｓ２１）は、ＰＥＲＶ ｇａｇプライマーを用いたＨＥＫ２９３細胞におけるＰＥＲＶ ＤＮＡエレメントの検出を示す図である。 図２４Ｂ（図Ｓ２１）は、ＰＥＲＶ ｇａｇプライマーを用いたＨＥＫ２９３細胞におけるＰＥＲＶ ＤＮＡエレメントの検出を示す図である。 図２４Ｃ（図Ｓ２１）は、ＰＥＲＶ ｇａｇプライマーを用いたＨＥＫ２９３細胞におけるＰＥＲＶ ＤＮＡエレメントの検出を示す図である。 図２４Ｄ（図Ｓ２１）は、ＰＥＲＶ ｇａｇプライマーを用いたＨＥＫ２９３細胞におけるＰＥＲＶ ＤＮＡエレメントの検出を示す図である。 図２５Ａ（図Ｓ２２）は、高改変クローン及び低改変クローンにおけるＣａｓ９／２ｇＲＮＡの発現レベルを示す図である。 図２５Ｂ（図Ｓ２２）は、高改変クローン及び低改変クローンにおけるＣａｓ９／２ｇＲＮＡの発現レベルを示す図である。 図２６（図Ｓ２３）は、高改変ＰＫ１５クローン及び低改変ＰＫ１５クローンの主成分分析を示す図である。 図２７Ａ（図Ｓ２４）は、遺伝子セット濃縮解析を示す図である。 図２７Ｂ（図Ｓ２４）は、遺伝子セット濃縮解析を示す図である。 図２８（図Ｓ２５）は、インデル組成分析及び高改変クローン間の比較を示す図である。 図２９Ａ（図Ｓ２６）は、活性ＰＥＲＶエレメントのＣａｓ９除去を引き起こすＤＮＡ修復過程のマルコフモデル解析を示す図である。 図２９Ｂ（図Ｓ２６）は、活性ＰＥＲＶエレメントのＣａｓ９除去を引き起こすＤＮＡ修復過程のマルコフモデル解析を示す図である。 図２９Ｃ（図Ｓ２６）は、活性ＰＥＲＶエレメントのＣａｓ９除去を引き起こすＤＮＡ修復過程のマルコフモデル解析を示す図である。 図２９Ｄ（図Ｓ２６）は、活性ＰＥＲＶエレメントのＣａｓ９除去を引き起こすＤＮＡ修復過程のマルコフモデル解析を示す図である。 図３０（図Ｓ２７）は、全ゲノム配列解析（Whole Genome Sequencing）（ＷＧＳ）を用いたオフターゲット解析を示す図である。

本発明の態様は、核酸工学のためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の使用を対象とする。本明細書には、複数の変異遺伝子を保有する動物（例えば、ブタ）の作製のための効率的な技術の開発が記載される。具体的には、本明細書ではＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムと称する、クラスタ化された規則的な間隔の短い回文構造の繰り返し（ＣＲＩＳＰＲ）及びＣＲＩＳＰＲ関連遺伝子（Ｃａｓ遺伝子）は、例えば多重ゲノム編集のための、効率的な遺伝子ターゲティング技術として適合している。本明細書では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓを介した遺伝子編集により、ブタ腎上皮細胞株（例えば、ＰＫ１５）中のブタ内在性レトロウイルス（ＰＥＲＶ）ｐｏｌ遺伝子の６２コピーの同時不活性化が高効率で可能になることが明らかにされる。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡとＰＥＲＶを標的とするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）との細胞への同時注入又はトランスフェクションにより、最大１００％の効率で両方の遺伝子に両アリルの変異を有するヒト細胞へのＰＥＲＶ感染が１０００分の１以下に低下した。本明細書では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにより、ＰＥＲＶのすべてのコピーが不活性化された細胞の一段階作製が可能になることが示される。特定の実施形態では、本明細書に記載される方法により、２０％〜１００％の効率で、例えば、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上、例えば、最大９６％、最大９７％、最大９８％、最大９９％、またはそれ以上の効率で、１、２、３、４、５、またはそれ以上の遺伝子が不活性化された細胞及び動物、例えば、ブタが作製される。

実施例１．ブタ内在性レトロウイルス（ＰＥＲＶ）のゲノムワイド不活性化
移植のための臓器の不足は、臓器不全の治療に対する大きな障壁である。ブタの臓器は有望と考えられているが、ブタ内在性レトロウイルス（ＰＥＲＶ）のヒトへの感染についての懸念によってその使用が阻止されている。本明細書では、ブタ腎上皮細胞株（ＰＫ１５）中のすべてのＰＥＲＶの根絶を実施した。最初に、ＰＫ１５ ＰＥＲＶのコピー数は６２と決定された。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９を使用してＰＥＲＶｐｏｌ遺伝子の６２コピーのすべてを破壊し、本発明者らの遺伝子操作細胞を用いて、ヒト細胞へのＰＥＲＶ感染が１０００分の１以下に低下することが実証された。この試験により、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９の多重性が６２と高いと考えられることが示され、ブタからヒトへの異種移植への臨床適用のためにＰＥＲＶが不活性化され得る可能性が実証される。

ブタゲノムは、数コピーから数十コピーのＰＥＲＶエレメントを含む。
他の人畜共通感染症病原体とは異なり、ＰＥＲＶはバイオセキュアな飼育（biosecure breeding）によって排除することはできない。ヒトへのＰＥＲＶ感染の危険性を低減するための従来の戦略には、低分子干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、ワクチン、並びにジンクフィンガーヌクレアーゼ及びＴＡＬエフェクターヌクレアーゼを用いたＰＥＲＶ除去が含まれるが、これらの成功は限られている。本明細書では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ ＲＮＡガイドヌクレアーゼ系の成功的使用は、ＰＥＲＶ ｐｏｌ遺伝子のすべてのコピーを不活性化し、ヒト細胞のＰＥＲＶ感染性を１０００分の１に低下させるのに用いることができる。

ＰＥＲＶを特異的に標的とするＣａｓ９ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を設計するために、ブタにおける公的に入手可能なＰＥＲＶ及び他の内在性レトロウイルスの配列（「方法」）を解析した。ＰＥＲＶエレメントの明確なクレード（図１Ａ）を同定し、液滴デジタルＰＣＲを用いてＰＫ１５細胞中に６２コピーのＰＥＲＶが存在することを決定した（図１Ｂ）。ＰＥＲＶ上のｐｏｌ遺伝子の高度に保存された触媒中心を標的とする２つのＣａｓ９ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を設計した（図１Ｃ、図Ｓ１）。ｐｏｌ遺伝子産物は、逆転写酵素（ＲＴ）として機能し、したがってウイルスの複製及び感染に必須である。これらのｇＲＮＡは、すべてのＰＥＲＶを標的とするが、他の内在性レトロウイルス又はブタゲノム中の他の配列は標的としないと判断された（「方法」）。

最初の実験では、Ｃａｓ９及びｇＲＮＡを一過性にトランスフェクトした場合、ＰＥＲＶ編集が非効率的であることが示された（図Ｓ２）。そこで、ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンシステムを用いてドキシサイクリン誘導性Ｃａｓ９及び２つのｇＲＮＡをＰＫ１５細胞のゲノムに送達した（図Ｓ２〜３）。Ｃａｓ９の持続的な誘導により、ＰＥＲＶのターゲティング頻度の上昇がもたらされ（図Ｓ５）、１７日目に３７％（ゲノム当たり約２３個のＰＥＲＶコピー）の最大ターゲティング頻度が観察された（図Ｓ５）。おそらくＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９による非特異的ＤＮＡ損傷の毒性のため、高濃度のドキシサイクリン又は長期インキュベーションのいずれによってもターゲティング効率は上昇しなかった（図Ｓ４、５）。レンチウイルスコンストラクトを用いてＣａｓ９を送達した場合、同様の傾向が観察された（図Ｓ６）。最大のＰＥＲＶターゲティング効率を示した細胞株の遺伝子型を決定した。２つのｇＲＮＡ標的部位を中心とする４５５の異なる挿入及び欠失（インデル）事象が認められた（図２Ｂ）。インデルサイズは１ｂｐ〜１４８ｂｐの範囲であり、インデルの８０％は小さな欠失（９ｂｐ未満）であった。最初のディープシーケンシングの結果をサンガー配列決定で検証した（図Ｓ７）。

ＰＥＲＶターゲティング効率が高いＰＫ１５細胞由来の単一細胞を、フローサイトメトリを用いて選別し、得られたクローンのｐｏｌ遺伝子座をディープシーケンシングによって遺伝子型決定した。高レベルのＰＥＲＶ破壊（９７％〜１００％）を示すクローンの約１０％及び低レベルの編集（１０％未満）を示す残りのクローンに関して再現可能な二峰性（図２Ａ、Ｓ８−９）分布を認めた。これらのクローンのゲノムにおいて個々のインデル事象を調べた（図２Ｂ、図Ｓ１０〜１１）。高度に編集されたクローン（クローン２０、１００％；クローン１５、１００％；クローン２９、１００％；クローン３８、９７．３７％）に関して、各クローンにおいて１６〜２０の特有のインデルパターンのみが認められた（図２Ｂ、Ｓ１１）。さらに、各クローン内では、クローン全体よりもはるかに高い度合いのインデルの反復が存在し（図Ｓ２５）、すでに変異したＰＥＲＶコピーを鋳型として用いてＣａｓ９により切断された野生型ＰＥＲＶを修復する、遺伝子変換の機構が示唆された（図２Ｂ、図Ｓ２５）。ＰＥＲＶ除去の間のＤＮＡ修復の数学的モデリング（図Ｓ２６）及び発現データの解析（図Ｓ２２〜２４）により、この仮説が支持され、高度に編集されたクローンがＣａｓ９及びｇＲＮＡが高発現された細胞に由来することが示唆された。

次に、多重ゲノム編集の結果として予期せぬゲノム再編成が起こったかどうかを調べた。個々の改変クローンの核型分析（図Ｓ１２〜Ｓ１４）により、観察可能なゲノム再編成が存在しないことが示された。意図するｇＲＮＡ標的の各々に最大で２ｂｐのミスマッチを有する１１個の独立したゲノム遺伝子座を調べ、非特異的変異は認められなかった（図Ｓ２７）。これにより、本発明者らのＣａｓ９に基づく多重ゲノム工学戦略が壊滅的なゲノム不安定性を引き起こさなかったことが示唆される。

最後に、ブタゲノム中のＰＥＲＶ ｐｏｌの全コピーの破壊は、ブタからヒト細胞へのＰＥＲＶのインビトロでの感染を排除することができるかどうかを調べた。高改変ＰＫ１５クローンの細胞培養上清中のＲＴ活性の検出は認められず（図Ｓ１５）、改変された細胞が最小限の量のＰＥＲＶ粒子しか産生しなかったことが示唆された。ＷＴ ＰＫ１５細胞及び高改変ＰＫ１５細胞とＨＥＫ２９３細胞との共培養物を、ヒト細胞へのＰＥＲＶ ＤＮＡの感染に関して直接試験した。ＰＫ１５ ＷＴ及びＨＥＫ２９３細胞を５日間及び７日間共培養した後（図Ｓ１６〜１７）、ＨＥＫ２９３細胞中のＰＥＲＶ ｐｏｌ配列、ＰＥＲＶ ｇａｇ配列、及びＰＥＲＶ ｅｎｖ配列を検出した（図３Ａ）。ＰＥＲＶ感染の推定頻度は、１０００個のヒト細胞あたり約１０００ ＰＥＲＶであった（図３Ｂ）。しかしながら、９７％超のＰＥＲＶ ｐｏｌターゲティングを有するＰＫ１５クローンでは、バックグラウンドレベルと同様の、ＰＥＲＶ感染の最大１０００分の１までの低下が示された（図３Ｃ）。これらの結果は、ＰＫ１５クローンとの接触履歴を有するＨＥＫ２９３細胞の連続希釈物のＰＣＲ増幅により検証された（図３Ｄ、図Ｓ１８〜２１）。最小限に改変されたクローン４０と共培養した集団から単離された単一ＨＥＫ２９３細胞ではＰＥＲＶが一貫して検出されたが、高改変クローン２０と共培養した集団からの１００個のヒト細胞ではＰＥＲＶを明確に検出することはできなかった。したがって、遺伝子操作したＰＫ１５細胞のＰＥＲＶ感染性は最大１０００分の１まで低下していた。

要約すると、ＰＫ１５細胞中の６２コピーのＰＥＲＶ ｐｏｌのターゲティングに成功し、ヒト細胞へのＰＥＲＶのインビトロ感染が大幅に減少されることが実証された。ヒトへのインビボＰＥＲＶ感染は実証されていないが、ＰＥＲＶは依然として危険と考えられており、本発明者らの戦略はこれを完全に排除し得る。ブタの胚性幹細胞は存在しないので、このシステムを初代ブタ細胞で反復し、体細胞核移植を用いて動物にクローニングする必要がある。さらに、顕著なゲノム再編成を伴わずに、単一ブタ細胞中の６２遺伝子座の同時Ｃａｓ９ターゲティングが達成された。本発明者らの知る限り、同時に編集されることがこれまでに報告されているゲノム部位の最大数は６であった。したがって、本発明者らの方法により、生物学的重要性のある他の反復領域を編集する可能性が開かれる。

実施例２．方法
ＰＥＲＶコピー数の定量
Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ（商標）ＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ（商標））を使用して、製造業者の指示（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）に従ってＰＥＲＶのコピー数を定量した。簡単に述べると、培養細胞由来のゲノムＤＮＡ（ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ社）を精製し、５０ｎｇのゲノムＤＮＡをＭｓｅＩ（１０Ｕ）で３７℃にて１時間消化し、１０μｌの２×ｄｄＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ、１μｌの１８μＭ標的プライマー及び５μＭ標的プローブ（ＶＩＣ）、１μｌの１８μＭ参照プライマー及び５μＭ参照プローブ（ＦＡＭ）、５ｎｇの消化されたＤＮＡ、並びに２０μＬの総容量にするための水を用いてｄｄＰＣＲ反応物を調製した。プライマーの配列及びプローブ情報は、「拡張データ」表１に示されている。

方法

ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ ｇＲＮＡの設計
ＭＵＳＣＬＥを用いて、ブタゲノムに存在する２４５個の内在性レトロウイルスの多重配列アライメントを実施した。配列の系統樹を構築し、ＰＥＲＶを含むクレードを同定した（図１ａ参照）。ＲライブラリＤＥＣＩＰＨＥＲを使用して、すべてのＰＥＲＶを標的とするが他の内在性レトロウイルス配列は標的としない特異的ｇＲＮＡを設計した。

細胞培養
ＰＫ１５を、１０％ウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）高グルコース中で維持した。すべての細胞を加湿インキュベータ内で３７℃及び５％ＣＯ_２で維持した。

ＰｉｇｇｙＢａｃ−Ｃａｓ９／２ｇＲＮＡの構築及び細胞株の樹立
ＰｉｇｇｙＢａｃ−Ｃａｓ９／２ｇＲＮＡコンストラクトは、以前にＷａｎｇ ｅｔ ａｌ（２）に報告されているプラスミドに由来する。簡単に述べると、Ｕ６−ｇＲＮＡ１−Ｕ６−ｇＲＮＡ２をコードするＤＮＡフラグメントを合成し（Ｇｅｎｅｗｉｚ社）、これをＰｉｇｇＢａｃ−Ｃａｓ９コンストラクトに組み込んだ。ＰｉｇｇｙＢａｃ−Ｃａｓ９／２ｇＲＮＡが組み込まれたＰＫ１５細胞株を樹立するために、５×１０^５個のＰＫ１５細胞に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて４μｇのＰｉｇｇｙＢａｃ−Ｃａｓ９／２ｇＲＮＡプラスミド及び１μｇのＳｕｐｅｒ ＰｉｇｇｙＢａｃ Ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅプラスミド（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）をトランスフェクトした。コンストラクトが組み込まれた細胞を濃縮するために、トランスフェクションされた細胞に２μｇ／ｍＬのピューロマイシンを添加した。陰性対照に基づき、ピューロマイシンを野生型ＰＫ１５細胞に適用して、３日間で選択が完了したと判定した。以後、ＰＫ１５−ＰｉｇｇｙＢａｃ細胞株を２μｇ／ｍＬのピューロマイシンで維持した。２μｇ／ｍｌのドキシサイクリンを適用してＣａｓ９発現を誘導した。

レンチウイルス−Ｃａｓ９／２ｇＲＮＡの構築及び細胞株の樹立
Ｌｅｎｔｉ−Ｃａｓ９／２ｇＲＮＡコンストラクトは、以前に報告されたプラスミド（３）に由来した。Ｕ６−ｇＲＮＡ１−Ｕ６−ｇＲＮＡ２をコードするＤＮＡフラグメントを合成し（Ｇｅｎｅｗｉｚ社）、これをＬｅｎｔｉ−Ｃａｓ９−Ｖ２に組み込んだ。Ｌｅｎｔｉ−Ｃａｓ９／２ｇＲＮＡを有するレンチウイルスを作製するために、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を用いて、約５×１０^６個の２９３ＦＴ ＨＥＫ細胞に３μｇのＬｅｎｔｉ−Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ及び１２μｇのＶｉｒａＰｏｗｅｒ Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）をトランスフェクトした。レンチウイルス粒子をトランスフェクションの７２時間後に回収し、Ｌｅｎｔｉ−Ｘ ＧｏＳｔｉｘ（Ｔａｋａｒａ Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社）を用いてウイルス力価を測定した。約１０^５個のレンチウイルス粒子を約１×１０^６個のＰＫ１５細胞に形質導入し、形質導入の５日後に、形質導入細胞を濃縮するためにピューロマイシンによる選択を行った。その後ＰＫ１５−Ｌｅｎｔｉ細胞株を２μｇ／ｍＬのピューロマイシンで維持した。

コロニー形成した単一ＰＫ１５細胞の遺伝子型決定
ＰＫ１５培養物を、ＴｒｙｐＬＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて解離させ、生細胞識別色素ＴｏＰｒｏ−３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含むＰＫ１５培地に１〜２×１０^５細胞／ｍｌの濃度で再懸濁した。ＰＫ１５生細胞を、無菌条件下で１００ｍｍノズルを有するＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩ ＳＯＲＰ ＵＶ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて単細胞選別した。ウェルあたり一細胞のみが確実に選別されるように、ＳＳＣ−Ｈ対ＳＳＣ−Ｗ及びＦＳＣ−Ｈ対ＦＳＣ−Ｗダブレット識別ゲート及びストリンジェントな「０／３２／１６単一細胞」選別マスクを使用した。各ウェルが１００μｌのＰＫ１５培地を含む９６ウェルプレートに細胞を選別した。選別後、プレートを７０ｇで３分間遠心分離した。選別の７日後にコロニー形成が見られ、ＦＡＣＳの２週間後に遺伝子型決定実験を実施した。

クローン増殖を伴わない単一のＰＫ１５細胞を遺伝子型決定するために、以前に報告された単一細胞遺伝子型決定プロトコル（４）に従って、選別された単一細胞からＰＥＲＶ遺伝子座を直接増幅した。簡単に述べると、選別の前に、すべてのプラスチック及び非生物学的緩衝液をＵＶ照射で３０分間処理した。各ウェルが０．５μｌの１０×ＫＡＰＡ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｅｘｔｒａｃｔ緩衝液（ＫＡＰＡ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）、０．１μｌの１Ｕ／μｌのＫＡＰＡ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｅｘｔｒａｃｔ酵素、及び４．６μｌの水を含む９６ウェルＰＣＲプレートに単一細胞を選別した。溶解反応物を７５℃で１５分間インキュベートし、９５℃で５分間、反応物を不活性化した。次いで、すべての反応物を、１２．５μｌの２×ＫＡＰＡ ２Ｇ ｆａｓｔ（ＫＡＰＡ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）、１００ｎＭのＰＥＲＶ ｉｌｌｕｍｉｎａプライマー（「方法」表２）、及び７．５μｌの水を含む、２５μｌのＰＣＲ反応物に添加した。反応物を９５℃で３分間インキュベートし、続いて９５℃、１０秒；６５℃、２０秒；及び７２℃、２０秒の２５サイクルに供した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列アダプタを付加するために、１２．５ｍｌの２ ＫＡＰＡ ＨＩＦＩ Ｈｏｔｓｔａｒｔ Ｒｅａｄｙｍｉｘ（ＫＡＰＡ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列アダプタを有する１００ｎＭプライマー、及び７μｌの水を含む２０μｌのＰＣＲミックスに、５μｌの反応産物を添加した。反応物を９５℃で５分間インキュベートし、続いて９８℃、２０秒；６５℃、２０秒；及び７２℃、２０秒の１５〜２５サイクルに供した。ＰＣＲ産物をＥＸ ２％ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）上で検査し、続いてゲルから３００〜４００ｂｐの産物を回収した。次いで、これらの産物をほぼ同じ量で混合し、精製して（ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）、ＭｉＳｅｑ Ｐｅｒｓｏｎａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）で配列決定した。ディープシーケンシングデータを解析し、ＣＲＩＳＰＲ−ＧＡ（５）を用いてＰＥＲＶ編集効率を決定した。

ターゲティング効率の推定
カスタムパイプラインを構築し、ＰＥＲＶ不活性化の効率を推定した。簡単に述べると、ｐｏｌ遺伝子を増幅し、ＰＥ２５０又はＰＥ３００を使用してＩｌｌｕｍｉｎａ Ｎｅｘｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇによって配列決定した。最初に、２つの重複するリードを、ＰＥＡＲ（６）を使用して組み合わせ、ＢＬＡＴを使用して参照領域にマッピングした。マッピング後、リードを、ハプロタイプとインデルタイプの特定の組合せを含むセットに分類した（「拡張データ」図７参照）。マッピングされたリードの総数の０．５％未満の表示を有するリードセットは破棄した。最後に、Ｇｉｉｅｌｌ ｅｔ ａｌ（５）に記載されているようにマッピング出力を解析し、種々の挿入及び削除をコールした。

ＲＮＡ−ｓｅｑ解析
ｓｕｓＳｃｒ３ブタゲノム及びＥｎｓｅｍｂｌ転写産物は、ＵＣＳＣ Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｒｏｗｅｒ Ｄａｔａｂａｓｅから入手した。ＲＮＡ−Ｓｅｑリードを、ＳＴＡＲソフトウェア（７）を用いて参照ゲノムにマッピングし、ＢＥＤＴｏｏｌｓ（８）を用いて転写産物のＲＰＫＭを定量した。発現差異解析を、ＤＥＳｅｑ２パッケージ（９）を用いてＲで実施し、ソフトウェアのウェブサイトから入手した遺伝子セットの定義を用いてＧＳＥＡソフトウェア（１０）により遺伝子セット濃縮解析を行った。

逆転写酵素（ＲＴ）アッセイ
ＰＫ１５細胞及び改変ＰＫ１５クローン（４種の高改変クローン及び１種の低改変クローン）のＲＴ活性を試験するために、５×１０^５個の細胞をＴ７５ｃｍ^２フラスコに播種し、播種の４日後に上清を回収した。０．４５μＭのＭｉｌｌｅｘ−ＨＶ Ｓｙｒｉｎｇｅ Ｆｉｌｔｅｒ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社）を用いて培地をろ過し、ろ過した上清を、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒ Ｕｎｉｔ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社）を用いて４０００ｇで３０分間濃縮した。濃縮した上清を５０，０００ｒｐｍで６０分間、超遠心分離した。上清を慎重に除去し、ウイルスペレットを回収して、２０μｌの１０％ＮＰ４０で３７℃にて６０分間溶解した。

Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いてＲＴ反応を実施した。反応物の総容量は２０μｌであり、１ ＲＴ緩衝液、０．５ｍＭ ｄＮＴＰ、０．５μＭインフルエンザ逆方向プライマー（５′ ＣＴＧＣＡＴＧＡＣＣＡＧＧＧＴＴＴＡＴＧ ３′）（配列番号：１４）、１００単位のＲｎａｓｅＯＵＴ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、１００単位のＳｕｐｅｒＲｎａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、５μｌの試料溶解産物、及び５′末端と３′末端の両方でリボヌクレアーゼ耐性であった４０ｎｇのＩＤＴ合成インフルエンザＲＮＡ鋳型を含んでいた。ＲＮＡ鋳型配列は、５′ ｒＡ＊ｒＡ＊ｒＣ＊ｒＡ＊ｒＵ＊ｒＧｒＧｒＡｒＡｒＣｒＣｒＵｒＵｒＵｒＧｒＧｒＣｒＣｒＣｒＵｒＧｒＵｒＵｒＣｒＡｒＵｒＵｒＵｒＵｒＡｒＧｒＡｒＡｒ ＡｒＵｒＣｒＡｒＡｒＧｒＵｒＣｒＡｒＡｒＧｒＡｒＵｒＡｒＣｒＧｒＣｒＡｒＧｒＡｒＡｒＧｒＡｒＧｒＵｒＡｒＧｒＡｒＣｒＡｒＵｒＡｒＡｒＡｒＣｒＣｒＣｒＵｒＧｒＧｒＵｒＣｒＡｒＵｒＧｒＣｒＡｒＧｒＡｒＣｒＣｒＵ＊ｒＣ＊ｒＡ＊ｒＧ＊ｒＵ＊ｒＧ ３′（＊ホスホジエステル結合）（配列番号：１５）であった。ＲＴ反応の完了後、インフルエンザ順方向プライマー（５′ ＡＣＣＴＴＴＧＧＣＣＣＴＧＴＴＣＡＴＴＴ ３′）（配列番号：１６）及びインフルエンザ逆方向プライマー（上記に示す配列）を用いてＰＣＲによってＲＴ産物を調べた。像副産物の予想サイズは７２ｂｐであった。

感染性アッセイ
ＨＥＫ２９３−ＧＦＰ細胞株の樹立
Ｌｅｎｔｉ−ＧＦＰコンストラクトは、プラスミドｐＬＶＸ−ＩＲＥＳ−ＺｓＧｒｅｅｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、カタログ番号６３２１８７；ＰＴ４０６４−５）に由来した。Ｌｅｎｔｉ−ＧＦＰを有するレンチウイルスを作製するために、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、約５×１０^６個の２９３ＦＴ ＨＥＫ細胞に３μｇのｐＶＸ−ＺｓＧｒｅｅｎプラスミド及び１２μｇのＶｉｒａＰｏｗｅｒ Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）をトランスフェクトした。レンチウイルス粒子をトランスフェクションの７２時間後に回収し、Ｌｅｎｔｉ−Ｘ ＧｏＳｔｉｘ（Ｔａｋａｒａ Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社）を用いてウイルス力価を測定した。約１０^５個のレンチウイルス粒子を約１×１０^６個のＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトし、形質導入の５日後に、形質導入細胞を濃縮するためにピューロマイシンによる選択を実施した。その後、２９３−ＧＦＰ−Ｌｅｎｔｉ細胞株を０．５μｇ／ｍＬのピューロマイシンで維持した。

ＨＥＫ２９３−ＧＦＰに対するＰＫ１５ ＷＴの感染性試験
Ｌｅｎｔｉ−ＧＦＰ−２９３ＦＴ ＨＥＫ細胞の１×１０^５個の細胞及び１×１０^５個のＰＫ１５ ＷＴ細胞を６ウェルプレートで共培養した。並行して、２×１０^５個のＰＫ１５ ＷＴ細胞を対照として別のウェルで単独で培養した。５μｇ／ｍｌの抗生物質を７日間添加することによってピューロマイシン選択実験を行った。対照ウェルに生存細胞がなく、実験ウェルに約１００％のＧＦＰ陽性細胞が存在した時点を、ｌｅｎｔｉ−ＧＦＰ−２９３ＦＴヒト細胞を精製するためのピューロマイシン選択が完了した時点であると決定した。２９３ＦＴ ＨＥＫ／ＰＫ１５ ＷＴ共培養物からの細胞を種々の時間間隔で収集した。２９３−ＧＦＰ ＷＴ、ＰＫ１５ ＷＴの培養細胞及び共培養細胞から、（ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ社）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。Ｑｕｂｉｔ ２．０ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてゲノムＤＮＡ濃度を測定し、各試料から３ｎｇをＰＣＲのためのＤＮＡ鋳型として使用した。全体で、１μＬのゲノムＤＮＡを、１２．５μＬの２×ＫＡＰＡ Ｈｉｆｉ Ｈｏｔｓｔａｒｔ Ｒｅａｄｙｍｉｘ（ＫＡＰＡ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）及び１００μＭの「方法」表３に列挙したプライマーを含む２５μＬのＰＣＲミックスに添加した。反応物を９５℃で５分間インキュベートし、続いて９８℃、２０秒；６５℃、２０秒；及び７２℃、２０秒の３５サイクルに供した。ＰＣＲ産物をＥＸ ２％ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）上で可視化し、３００〜４００塩基対のバンドを観察した。

ＨＥＫ２９３−ＧＦＰ細胞中の感染したＰＥＲＶコピー数の定量
ＨＥＫ２９３−ＧＦＰ細胞中のＰＥＲＶコピー数を定量するためにｑＰＣＲを実施した。種々の量のＰＫ１５ ＷＴ細胞のゲノムＤＮＡをｑＰＣＲ反応の鋳型として使用した。
反応は、ＫＡＰＡ ＳＹＢＲ ＦＡＳＴ ｑＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ（ＫＡＰＡ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて三連で実施した。ＰＥＲＶ ｐｏｌプライマー、ＰＥＲＶ ｅｎｖプライマー、ＰＥＲＶ ｇａｇプライマー、ヒトＡＣＴＢプライマー、及びブタＧＧＴＡ１プライマー（「方法」表３）を最終濃度１μＭになるように添加した。反応物を９５℃で３分間（酵素活性化）インキュベートし、続いて９５℃、５秒（変性）；６０℃、６０秒（アニーリング／伸長）の５０サイクルに供した。ゲノムＤＮＡ量の対数は定量サイクル（Ｃｑ）と直線的に相関する。ｐｏｌプライマー、ｇａｇプライマー、ｅｎｖプライマーを用いてＰＥＲＶの存在を調べた。ブタＧＧＴＡ１プライマーは、感染後のヒト細胞中の潜在的なブタゲノム混入物質を制御するのに役立った。すべての実験を三連で実施した。

ＨＥＫ２９３−ＧＦＰに対する改変ＰＫ１５クローンの感染性アッセイ
ＨＥＫ２９３−ＧＦＰ細胞の１×１０^５個の細胞と、高改変クローン（１５、２０、２９、３８）及び低改変クローン（４０、４１）の１×１０^５個の細胞を６ウェルプレートで７日間共培養した。ＰＥＲＶエレメントを調べる目的でＨＥＫ２９３−ＧＦＰ細胞を単離するため、ＧＦＰ陽性細胞を二重選別してヒト細胞集団を精製した。

ＨＥＫ２９３−ＧＦＰ細胞に対する種々のクローンのＰＥＲＶ感染性を定量するために、選別後に系列希釈したＨＥＫ２９３−ＧＦＰ細胞についてｑＰＣＲアッセイ及びＰＣＲアッセイの両方を実施した。ｑＰＣＲアッセイのために、ゲノムＤＮＡ（ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ社）を、二重選別したＨＥＫ２９３−ＧＦＰ細胞から抽出した。Ｑｕｂｉｔ ２．０蛍光光度計（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてゲノムＤＮＡ濃度を測定した。全体で、３ｎｇのゲノムＤＮＡを、ＰＥＲＶ ｐｏｌプライマー、ＰＥＲＶ ｅｎｖプライマー、ＰＥＲＶ ｇａｇプライマー、及びブタＧＧＴＡプライマー（「拡張データ」表２）をそれぞれ用いて、２０μＬのＫＡＰＡ ＳＹＢＲ ＦＡＳＴ ｑＰＣＲ反応物（ＫＡＰＡ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に添加した。ｑＰＣＲ手順は、上記のように実施した。系列希釈アッセイのために、精製したＨＥＫ２９３−ＧＦＰ細胞を、直接ゲノムＤＮＡ抽出及びＰＣＲ反応のために９６ウェルＰＣＲプレートに選別した（１ウェルあたり１細胞、１ウェルあたり１０細胞、１ウェルあたり１００細胞、１ウェルあたり１０００細胞）。簡単に述べると、細胞を、２μＬの１０Ｘ ＫＡＰＡ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｅｘｔｒａｃｔ緩衝液、０．４μＬの１Ｕ／μＬ ＫＡＰＡ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｅｘｔｒａｃｔ酵素、及び１７．６μＬのＰＣＲグレードの水（ＫＡＰＡ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を含む２０μＬの溶解反応物中に選別した。次いで、反応物を５５℃で１０分間（溶解）、続いて９５℃で５分間（酵素不活性化）インキュベートした。次に、ＰＣＲマスターミックスを調製した。全体で、２μＬのゲノムＤＮＡ溶解産物を、１μＭ ＰＥＲＶ ｐｏｌプライマー、ＰＥＲＶ ｅｎｖプライマー、ＰＥＲＶ ｇａｇプライマー、又はブタＧＧＴＡプライマー（「拡張データ」表２）をそれぞれ用いて、４つの異なる２５μＬのＫＡＰＡ Ｈｉｆｉ Ｈｏｔｓｔａｒｔ ＰＣＲ反応物（ＫＡＰＡ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）に添加した。反応物を９５℃で３分間（初期変性）インキュベートし、続いて９５℃、１５秒（変性）；６０℃、１５秒（アニーリング）、７２℃、１ｋｂあたり１５秒、次いで７５℃、１ｋｂあたり１分（最終伸長）の３５サイクルに供した。（ＫＡＰＡ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）。ＰＣＲ産物を、９６ウェルＥ−Ｇｅｌ（登録商標）アガロースゲル、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｓａｆｅ ＤＮＡゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）上で可視化した。

ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９オフターゲット解析
ＰＫ１５（未処理細胞株）及びクローン２０（高度に編集されたクローン）について全ゲノム配列決定（ＷＧＳ）データを得た。Ｃａｓ９／２ｇＲＮＡの潜在的なオフターゲット効果を調べるために、参照配列（Ｓｕｓ Ｓｃｒｏｆａ １０．２）を、２つのｇＲＮＡによって標的とされる２０ｂｐ配列と１ｂｐ又は２ｂｐだけ異なる部位に関して検索した。１１箇所のそのような部位を同定し、それらの隣接領域の２００ｂｐと共に抽出した（図Ｓ１）。ＢＬＡＴを使用して、抽出した参照配列にＷＧＳリードをマッピングし、オフターゲット効果の結果としてクローン２０に出現した潜在的なインデルパターンを検索した。遺伝子座あたり平均７〜８倍の範囲を得た。参照配列とのマッチが５０ｂｐ未満であるリードは除外した。インデルの存在を示し得る複数のアライメントブロックを有する参照配列にマッピングされたリードの場合、アライメントブロックが参照配列と２０ｂｐ未満のマッチを含むリードは除外した。マッピングされた残りのリードを検査した後、クローン２０におけるオフターゲットインデルパターンの存在は検出されなかった。ここでオフターゲットに対する包括的検索の別の課題は、Ｓｕｓ Ｓｃｒｏｆａゲノムが依然として完全でないか、又は完全にアセンブルされておらず、全ゲノム解析を行う能力が限られていることである。

累積的ＰＥＲＶ不活性化の間のＤＮＡ修復過程相互作用の数学的モデル
この試験では、Ｃａｓ９によって生じたｄｓＤＮＡ切断に応答したＤＮＡ修復過程により生成された突然変異によって、ＰＥＲＶエレメントを不活性化した。ｄｓＤＮＡ切断は非相同末端結合（ＮＨＥＪ）又は相同修復（ＨＲ）のいずれかによって修復され得ること、並びにＨＲは適切な相同アームを有する鋳型が存在すると切断部位にＤＮＡ鋳型配列の正確なコピーを作製することができるが、ＮＨＥＪは突然変異（特にインデル）を作製することができ、しばしば「誤りがち（error prone）」と見なされていることは、一般に理解されている。しかし、ＮＨＥＪもｄｓＤＮＡ切断を高精度に修復できるという証拠があり（１１、１２）、ＮＨＥＪによる変異を生じた修復に対する完全な修復の相対的な割合は、正確には測定されていない。特に、Ｃａｓ９などの効率的なターゲティングヌクレアーゼが長期間発現される場合、ＮＨＥＪ又はＨＲのいずれかによる切断部位の完全な修復により、再度切断され得る標的部位が再生成される。妥当な仮説は、完全な修復及び再切断の過程が、標的部位を認識するヌクレアーゼの能力を破壊する突然変異が生じるまで繰り返し起こるということである。これらの修復様式がＰＥＲＶ除去の過程で一体となって機能し得る方法を探るために、それらの相互作用をマルコフ過程としてモデル化した。具体的には、以下のように仮定した。

・１細胞内にＮ個の同一コピーのヌクレアーゼ標的が存在する。
・野生型標的だけが認識されて切断され、一度に１つの標的だけが切断されて修復される。
・ＤＮＡ修復は以下のいずれかである．
−ＮＨＥＪによる標的部位の完全な修復（確率ｎ）
−標的認識を消失させる突然変異の生成をもたらすＮＨＥＪ（確率ｍ）
−細胞内の他のＮ−１個の標的配列のいずれか１つを用いたＨＲによる修復（確率ｈ）

したがって、ｎ＋ｍ＋ｈ＝１である。

マルコフモデルにより、以下の確率分布が計算される。

ここでp_i ^(c)は、切断ｃにｉ個の標的を消失させる突然変異が存在する確率であり、ここでｃ＝０、１、２．．．である。初期条件をＰ^（０）＝（１、０、・・・、０）、すなわちすべての標的が野生型として始まると仮定する。Ｎ＋１個ごとの遷移行列Ｍは以下のように示される。

０≦ｉ＜Ｎについては、

ｉ＝Ｎについては、

他のすべての０≦ｉ，ｊ≦Ｎについては、

最後に、ｃ＝０、１、２、・・・については、

Ｍに対する式は上記の命題ｉｉを仮定しており、細胞内の突然変異した部位の数は、野生型の部位での切断がＮＨＥＪ又は野生型鋳型の別のコピーを用いたＨＲによって完全に修復される場合（Ｍ（i,i）の式）は常に不変であるが、切断が、突然変異誘発性ＮＨＥＪ又は先に変異した部位を用いたＨＲによって修復された場合（Ｍ（i,i + 1）の式）は１つ増加することを数学的に述べている。

このモデルにより、実際の生物学に、以下の２つの注目すべき単純化が組み込まれている。（ｉ）標的認識はバイナリである、すなわちヌクレアーゼは標的を認識するか又は認識しないかのいずれかであると仮定する。これは、依然として標的認識を支持する小さな変異が野生型切断速度を実質的に変化させず、そのため効果的に野生型部位と一緒に扱うことができると仮定するのに等しい。（ｉｉ）変異鋳型を用いるＨＲ修復に対して野生型鋳型を用いるＨＲ修復は同等に効率的であると仮定する。これらの単純化に対処するためにモデルに変更を加えることはできるが、ここでは考慮しない。形式的に、上記の仮定ｉｉを前提とすると、この時点では切断すべき野生型部位は残っていないので、ｃのある値について条件ｐ_N ^（ｃ）＝１の場合、マルコフ処理は実際には停止するはずであるが、代わりに数学的に起こるのは、切断は継続するがモデルは固定された状態のままであるということであり、これも意味を為さない。最後に、このモデルは、時間の関数としてではなく、独立変数ｃ（切断の数）の関数としての変異数分布を効果的に表す。ＤＮＡ修復又はＰＥＲＶ部位除去の時間割合に関して予測は為されていないが、時間はｃと共に単調に増加すると仮定することができる。

マルコフモデルを介してＰＥＲＶ除去を解析するために、Ｎは常に６２に設定した。しかし、完全なＮＨＥＪ修復に対する変異誘発性ＮＨＥＪ修復の相対効率は（上記のように）未知であり、変異誘発性ＮＨＥＪに対するＨＲ修復の相対的割合は細胞の状態及び種類によって大きく異なり得るので、ｎ、ｍ、及びｈのすべての可能なパラメータ値（全体で２５００のパラメータの組合せ）の完全な２次元空間をカバーする離散グリッドについての変異数分布を計算した。このモデルを、ＭａｔＬａｂ（Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ，Ｗａｌｔｈａｍ）スクリプトとして及びライブラリマルコフ連鎖を用いたＲスクリプトとして（それぞれ「補足ファイル」のｍｏｄｅｌＭａｒｋｏｖ．ｍ、ｍｏｄｅｌＭａｒｋｏｖ．Ｒとして利用可能）実行した。

特定のパラメータ値についてマルコフモデルによって変異数分布を計算することに加えて、ＭａｔＬａｂスクリプトは、一連のＫカット全体にわたってＮＨＥＪ修復過程及びＨＲ修復過程のランダムなシミュレーションを実施し、図２７Ｂ〜Ｃに示されている、総変異数に対する個別ＮＨＥＪ事象の二変量分布を推定することを可能にした。Ｒスクリプトを使用して、上記のｎ、ｍ、及びｈの組合せのグリッドにわたってシステムの最も可能性の高い状態を推定した。Ｋは計算によって異なった。図Ｓ２７に示すように、モデルの不変の結果は、平均がｃと共にＮ個の突然変異の固定へと進む変異数の単峰性分布であり、図Ｓ２７Ｂ．Ｃでは、Ｋを、固定を実証するのに十分な高さの値に設定した。ｎグリッド、ｍグリッド、及びｈグリッドにわたるシステムの最も可能性の高い状態の計算のために、Ｋを５０、１００、２００、又は５００に設定し、各パラメータの組合せについて１００回のシミュレーションを行った。

データの寄託
ＰＥＲＶｓ要素の遺伝子型解析データを含むＩｌｌｕｍｉｎａ Ｍｉｓｅｑのデータは、欧州バイオインフォマティクス研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）（ＥＢＩ）によって管理運営される欧州ヌクレオチドアーカイブ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｒｃｈｉｖｅ）（ＥＮＡ）に提出参照番号ＰＲＪＥＢ １１２２２でアップロードされている。

付属書Ａは、本教示の様々な態様に関するさらなる情報を提供し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

ＤＮＡ配列表は、ブタゲノム配列及び公的配列データベースから抽出した複数の内在性レトロウイルスエレメントのゲノム配列をさらに含む。（配列番号：３０〜２８０）

本明細書で引用したすべての特許、公開出願及び参考文献の教示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

本発明を、その例示的な実施形態を参照して具体的に示し、説明したが、添付の特許請求の範囲に包含される本発明の範囲から逸脱することなく形態及び詳細の様々な変更を行い得ることは当業者に理解される。

Claims (43)

1. 細胞内の１又は複数の標的核酸配列の発現を不活性化する方法であって、
   前記１又は複数の標的核酸配列の各々の全体又は一部に相補的な部分を含む１又は複数のリボ核酸（ＲＮＡ）配列及びＣａｓタンパク質をコードする核酸配列を細胞に導入すること；並びに
   前記細胞内で前記Ｃａｓタンパク質が発現され、且つ前記Ｃａｓタンパク質が前記１又は複数の標的核酸配列に結合して不活性化する条件下で前記細胞を維持すること
   を含む方法。
2. 前記導入工程が、前記１又は複数のＲＮＡ配列及び前記Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列を前記細胞にトランスフェクトすることを含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記１又は複数のＲＮＡ配列、前記Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列、又はそれらの組合せが前記細胞のゲノムに導入される、請求項１に記載の方法。
4. 前記Ｃａｓタンパク質の発現が誘導される、請求項１に記載の方法。
5. 前記細胞が胚由来である、請求項１に記載の方法。
6. 前記細胞が、幹細胞、接合子、又は生殖系列細胞である、請求項１に記載の方法。
7. 前記幹細胞が、胚性幹細胞又は多能性幹細胞である、請求項６に記載の方法。
8. 前記細胞が体細胞である、請求項１に記載の方法。
9. 前記体細胞が真核細胞である、請求項８に記載の方法。
10. 前記真核細胞が動物細胞である、請求項９に記載の方法。
11. 前記動物細胞がブタ細胞である、請求項１０に記載の方法。
12. 前記１又は複数の標的核酸配列がブタ内在性レトロウイルス（ＰＥＲＶ）遺伝子を含む、請求項１に記載の方法。
13. 前記ＰＥＲＶ遺伝子がｐｏｌ遺伝子を含む、請求項１２に記載の方法。
14. 前記ｐｏｌ遺伝子の１又は複数のコピーが不活性化される、請求項１３に記載の方法。
15. 前記細胞内のｐｏｌ遺伝子のすべてのコピーが不活性化される、請求項１４に記載の方法。
16. 前記Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９である、請求項１に記載の方法。
17. 前記１又は複数のＲＮＡ配列が約１０から約１０００ヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
18. 前記１又は複数のＲＮＡ配列が約１５から約２００ヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
19. 細胞内の１又は複数の標的核酸配列を変化させる方法であって、
    前記細胞内の標的核酸配列の全体又は一部に相補的なＲＮＡをコードする核酸配列を前記細胞に導入すること；
    前記ＲＮＡと相互作用し且つ前記標的核酸配列を部位特異的に切断する酵素をコードする核酸配列を前記細胞に導入すること；及び
    複合体を形成する相補的標的核酸配列に前記ＲＮＡが結合する条件下で前記細胞を維持することを含み、
    前記酵素が前記複合体上の結合部位に結合して、前記１又は複数の標的核酸配列を変化させる方法。
20. 導入工程のそれぞれが、前記細胞に前記核酸配列をトランスフェクトすることを含む、請求項１９に記載の方法。
21. 前記ＲＮＡをコードする核酸配列、前記Ｃａｓタンパク質をコードする核酸配列、又はそれらの組合せが前記細胞のゲノムに導入される、請求項１９に記載の方法。
22. 前記酵素をコードする核酸配列を誘導によって発現させる、請求項１９に記載の方法。
23. 前記細胞が胚由来である、請求項１９に記載の方法。
24. 前記細胞が、幹細胞、接合子、又は生殖系列細胞である、請求項１９に記載の方法。
25. 前記幹細胞が胚性幹細胞又は多能性幹細胞である、請求項２４に記載の方法。
26. 前記細胞が体細胞である、請求項１９に記載の方法。
27. 前記体細胞が真核細胞である、請求項２６に記載の方法。
28. 前記真核細胞が動物細胞である、請求項２７に記載の方法。
29. 前記動物細胞がブタ細胞である、請求項２８に記載の方法。
30. 前記１又は複数の標的核酸配列がブタ内在性レトロウイルス（ＰＥＲＶ）遺伝子を含む、請求項１９に記載の方法。
31. 前記ＰＥＲＶ遺伝子がｐｏｌ遺伝子を含む、請求項３０に記載の方法。
32. 前記ｐｏｌ遺伝子の１又は複数のコピーが不活性化される、請求項１９に記載の方法。
33. 前記細胞内のｐｏｌ遺伝子のすべてのコピーが不活性化される、請求項３２に記載の方法。
34. 前記酵素がＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質である、請求項１９に記載の方法。
35. 前記Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９である、請求項３４に記載の方法。
36. 前記ＲＮＡをコードする核酸配列が約１０から約１０００ヌクレオチドである、請求項１９に記載の方法。
37. 前記ＲＮＡをコードする核酸配列が約１５から約２００ヌクレオチドである、請求項１９に記載の方法。
38. 遺伝子操作された細胞であって、
    １又は複数の内在性レトロウイルス遺伝子；及び
    前記１又は複数の内在性ウイルス遺伝子の１又は複数の標的核酸配列の全体又は一部に相補的な部分を含む１又は複数の外来性核酸配列
    を含み、
    前記細胞の１又は複数の内在性ウイルス遺伝子の各々が変化されている、細胞。
39. 遺伝子操作された細胞であって、
    複数の内在性ウイルス遺伝子；及び
    前記複数の内在性ウイルス遺伝子の１又は複数の標的核酸配列の全体又は一部に相補的な部分を含む１又は複数の外来性核酸配列
    を含み、
    前記細胞の複数の内在性ウイルス遺伝子の各々が変化されている、細胞。
40. 前記レトロウイルス遺伝子がブタ内在性レトロウイルス（ＰＥＲＶ）遺伝子を含む、請求項３９に記載の遺伝子操作された細胞。
41. 前記ＰＥＲＶ遺伝子がｐｏｌ遺伝子を含む、請求項４０に記載の遺伝子操作された細胞。
42. 前記ｐｏｌ遺伝子の変化により前記ｐｏｌ遺伝子の１又は複数のコピーが不活性化されている、請求項４１に記載の遺伝子操作された細胞。
43. 前記細胞内のｐｏｌ遺伝子のすべてのコピーが不活性化されている、請求項４２に記載の遺伝子操作された細胞。