CN107254551B

CN107254551B - 鉴定和选育PERV-pol基因缺陷型五指山小型猪新品系的方法

Info

Publication number: CN107254551B
Application number: CN201710418223.3A
Authority: CN
Inventors: 马玉媛; 章金刚; 范瑞; 赵雄; 贾俊婷; 王延琳; 皇甫超济; 冯书堂
Original assignee: Beijing Grand Life Science And Technology Co ltd; Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS
Current assignee: Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Priority date: 2017-06-06
Filing date: 2017-06-06
Publication date: 2020-04-07
Anticipated expiration: 2037-06-06
Also published as: CN107254551A

Abstract

本发明公开了一种鉴定和选育PERV‑pol基因缺陷型五指山小型猪近交系新品系的方法。本发明保护物质甲在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的功能为如下(a)或(b)：(a)鉴定猪内源性反转录病毒pol基因缺陷型五指山小型猪近交系；(b)选育猪内源性反转录病毒pol基因缺陷型五指山小型猪近交系品系；所述物质甲为用于检测五指山小型猪近交系的全基因组中的猪内源性反转录病毒pol基因是否发生了提前终止的物质。采用本发明方法能够准确鉴定待测猪是否为猪内源性反转录病毒pol基因缺陷型五指山小型猪近交系，可用于选育猪内源性反转录病毒pol基因缺陷型五指山小型猪近交系新品系。

Description

鉴定和选育PERV-pol基因缺陷型五指山小型猪新品系的方法

技术领域

本发明属于动物育种领域，具体涉及一种鉴定和选育PERV-pol基因缺陷型五指山小型猪近交系新品系的方法。

背景技术

五指山小型猪近交系是中国拥有完全自主的知识产权的新型实验动物。“近交系(InbredStrainAnimals)”是指经连续20代(或以上)的全同胞兄妹交配(或者亲代与子代交配)培育、近交系数大于99％的品系，该品系所有个体都可以追溯到起源于具有一对共同祖先的第20或以上代数的动物。五指山小型猪近交系体型小、性成熟早、产仔率较高、遗传稳定、无PERV-C型拷贝、PERV-A型及PERV-B型拷贝少、无应激反应基因、免疫代谢等基因与人类有较高同源性，异体皮肤移植鉴定试验未发生免疫排斥反应，全基因组序列测定60％基因纯合，证明该近交系猪培育成功，为研究医用疾病模型、新药鉴定、医用生物敷料产品研发与生产、以及异种器官移植等医用产业链发展及应用，创建、提供全新的科研平台与产业平台。

猪内源性反转录病毒(porcine endogenous retrovirus，PERV)是一种以前病毒DNA 形式整合入猪基因组中的反转录病毒，是由PERV-gag、pol、env三基因组成，它可随细胞基因组的复制而复制。部分猪源细胞可释放PERV病毒颗粒，并能感染多种体外培养的人源细胞。由于猪器官大小和解剖生理与人体器官相似，被认为是异种器官移植的最佳供体。但猪基因组内的PERV存在跨物种间感染风险，避免可能的PERV感染，是异种器官移植的重大安全性考虑。根据PERV env基因编码的不同，可以将PERV 分为三个亚型：PERV-A、PERV-B、PERV-C，其差异主要在于SU表面糖基化的VRA、 VRB和PRO区，这种差异可能导致不同类型的PERV有着不同的宿主感染范围。 PERV-A和PERV-B可感染多种人源细胞以及非人灵长类细胞，PERV-C仅感染特定猪来源的细胞。避免PERV在异种移植中的潜在感染风险，最根本的方法是选育PERV 病毒pol基因缺陷型小型猪近交系种群。

发明内容

本发明的目的是提供一种鉴定和选育PERV-pol基因缺陷型五指山小型猪近交系新品系的方法。

本发明首先保护物质甲在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的功能为如下(a)或(b)：(a)鉴定猪内源性反转录病毒pol基因缺陷型五指山小型猪近交系；(b)选育猪内源性反转录病毒pol基因缺陷型五指山小型猪近交系品系；所述物质甲为用于检测五指山小型猪近交系的全基因组中的猪内源性反转录病毒pol基因是否发生了提前终止的物质。

本发明还保护所述的物质甲和记载有判断标准甲的载体在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的功能为如下(a)或(b)：(a)鉴定猪内源性反转录病毒pol基因缺陷型五指山小型猪近交系；(b)选育猪内源性反转录病毒pol基因缺陷型五指山小型猪近交系品系；所述判断标准甲为：如果某一五指山小型猪近交系个体的全基因组中的猪内源性反转录病毒pol基因均发生了提前终止，该五指山小型猪近交系个体为猪内源性反转录病毒pol基因缺陷型五指山小型猪近交系个体。

本发明还保护一种试剂盒，包括所述的物质甲；所述试剂盒的功能为如下(a)或(b)：(a)鉴定猪内源性反转录病毒pol基因缺陷型五指山小型猪近交系；(b)选育猪内源性反转录病毒pol基因缺陷型五指山小型猪近交系品系。

以上任一所述物质甲具体可为通过全基因组测序检测五指山小型猪近交系的全基因组中的猪内源性反转录病毒pol基因是否发生了提前终止的设备或配套设备。

所述设备具体可为测序仪。

所述配套设备具体可包括测序仪、序列分析软件和序列比对软件。

所述序列分析软件具体可为DNAstar。

所述配套设备可包括记载有参考序列的载体。所述参考序列具体可为Wuzhishaninbred pig(Genbank：AJKK01000000.1)和Sus scrofa(Genbank：AEMK00000000.2)。

本发明还保护一种鉴定猪内源性反转录病毒pol基因缺陷型五指山小型猪近交系的方法，包括如下步骤：检测待测五指山小型猪近交系的全基因组中的猪内源性反转录病毒pol基因；如果某一五指山小型猪近交系个体的全基因组中的猪内源性反转录病毒pol基因均发生了提前终止，该五指山小型猪近交系个体为猪内源性反转录病毒 pol基因缺陷型五指山小型猪近交系个体。

本发明还保护一种选育猪内源性反转录病毒pol基因缺陷型五指山小型猪近交系品系的方法，包括如下步骤：

(1)检测待测五指山小型猪近交系的全基因组中的猪内源性反转录病毒pol基因；如果某一五指山小型猪近交系个体的全基因组中的猪内源性反转录病毒pol基因均发生了提前终止，该五指山小型猪近交系个体为猪内源性反转录病毒pol基因缺陷型五指山小型猪近交系个体；

(2)步骤(1)得到的猪内源性反转录病毒pol基因缺陷型五指山小型猪近交系个体之间交配，获得后代，即为猪内源性反转录病毒pol基因缺陷型五指山小型猪近交系品系。

本发明还保护以上任一所述的物质甲、HEK293细胞、记载有方法甲的载体和记载有方法乙的载体在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的功能为如下(a)或(b)：(a) 鉴定猪内源性反转录病毒pol基因缺陷型五指山小型猪近交系；(b)选育猪内源性反转录病毒pol基因缺陷型五指山小型猪近交系品系；

所述方法甲为“鉴定待测猪是否为无PERV传染性的五指山小型猪近交系”的方法，包括如下步骤：

①将来源于待测猪的PBMC与HEK293细胞共培养4-7天，去除所述PBMC，鉴定所述HEK293细胞中是否携带或表达猪内源性反转录病毒的结构基因，根据鉴定结果确定所述待测猪是否为无PERV传染性的五指山小型猪近交系：若所述HEK293细胞中不携带且不表达猪内源性反转录病毒的结构基因，则所述待测猪为候选的无 PERV传染性的五指山小型猪近交系；若所述HEK293细胞中携带或表达猪内源性反转录病毒的结构基因，则所述待测猪不为无PERV传染性的五指山小型猪近交系；

②将来源于经过所述步骤①获得的候选的无PERV传染性的五指山小型猪近交系的PBMC与HEK293细胞共培养4-7天，去除所述PBMC，继续培养所述HEK293细胞30-60天，期间在细胞汇合时即行传代，每次传代时一方面收集所述HEK293细胞鉴定是否携带或表达猪内源性反转录病毒的结构基因，另一方面收集细胞培养上清鉴定反转录酶活性，根据鉴定结果确定所述“经过所述步骤①获得的候选的无PERV传染性的五指山小型猪近交系”是否确实为无PERV传染性的五指山小型猪近交系：若每次的鉴定结果均显示所述HEK293细胞中不携带且不表达猪内源性反转录病毒的结构基因，并且所述细胞培养上清无反转录酶活性，则所述“经过所述步骤①获得的候选的无 PERV传染性的五指山小型猪近交系”确实为无PERV传染性的五指山小型猪近交系；反之则所述“经过所述步骤①获得的候选的无PERV传染性的五指山小型猪近交系”不为无PERV传染性的五指山小型猪近交系；

所述方法甲中，所述待测猪为五指山小型猪近交系；

所述方法乙为“鉴定待测猪是否为猪内源性反转录病毒pol基因缺陷型五指山小型猪近交系”的方法，包括如下步骤：检测待测猪的全基因组中的猪内源性反转录病毒 pol基因；如果某一待测猪的全基因组中的猪内源性反转录病毒pol基因均发生了提前终止，该待测猪为猪内源性反转录病毒pol基因缺陷型五指山小型猪近交系个体；

所述方法乙中，所述待测猪为所述方法甲得到的无PERV传染性的五指山小型猪近交系。

本发明还保护一种试剂盒，包括以上任一所述的物质甲、HEK293细胞、记载有所述方法甲的载体和记载有所述方法乙的载体；所述试剂盒的功能为如下(a)或(b)： (a)鉴定猪内源性反转录病毒pol基因缺陷型五指山小型猪近交系；(b)选育猪内源性反转录病毒pol基因缺陷型五指山小型猪近交系品系。

本发明还保护一种鉴定猪内源性反转录病毒pol基因缺陷型五指山小型猪近交系的方法，包括如下步骤：

③检测步骤②得到的无PERV传染性的五指山小型猪近交系的全基因组中的猪内源性反转录病毒pol基因；如果某一无PERV传染性的五指山小型猪近交系个体的全基因组中的猪内源性反转录病毒pol基因均发生了提前终止，该五指山小型猪近交系个体为猪内源性反转录病毒pol基因缺陷型五指山小型猪近交系个体。

③检测步骤②得到的无PERV传染性的五指山小型猪近交系的全基因组中的猪内源性反转录病毒pol基因；如果某一无PERV传染性的五指山小型猪近交系个体的全基因组中的猪内源性反转录病毒pol基因均发生了提前终止，该五指山小型猪近交系个体为猪内源性反转录病毒pol基因缺陷型五指山小型猪近交系个体；

④步骤③得到的猪内源性反转录病毒pol基因缺陷型五指山小型猪近交系个体之间交配，获得后代，即为猪内源性反转录病毒pol基因缺陷型五指山小型猪近交系品系。

以上任一所述的猪内源性反转录病毒pol基因编码“pol基因编码蛋白”(包括蛋白酶、逆转录酶和整合酶)；

所述“pol基因编码蛋白”为如下(c)或(d)：

(c)由序列表中序列9所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(d)将序列9的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的来源于猪内源性反转录病毒的蛋白质。

以上任一所述猪内源性反转录病毒pol基因为如下(e1)、(e2)或(e3)：

(e1)编码框如序列表的序列10所示的DNA分子；

(e2)在严格条件下与(e1)限定的DNA序列杂交且编码所述pol基因编码蛋白的DNA分子；

(e3)与(e1)或(e2)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码所述pol 基因编码蛋白的DNA分子。

上述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。

以上任一所述方法中，采用PCR和/或RT-PCR的方法鉴定所述HEK293细胞中是否携带有猪内源性反转录病毒的结构基因。

所述猪内源性反转录病毒的结构基因为gag基因、pol基因和env基因。只要这三个基因的检测结果有阳性的就说明所述HEK293细胞携带或表达猪内源性反转录病毒的结构基因。

用于扩增所述gag基因的引物对由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA 分子组成。用于扩增所述pol基因的引物对由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA分子组成。用于扩增所述env基因的引物对由序列表中序列5和序列6所示的两条单链DNA分子组成。

所述方法中，使用细胞培养液对PBMC与HEK293细胞的共培养体系冲洗至少4 遍以去除所述PBMC。

所述方法中，可以运用PCR扩增猪种属特异性基因验证所述PBMC的去除情况。其中，PCR扩增时采用的引物对为特异于猪源细胞α-1,3-半乳糖转移酶基因中种属特异性内含子序列的引物对，由序列表中序列7和序列8所示的两条单链DNA分子组成。

所述方法中，PBMC与HEK293细胞共培养初始时，所述PBMC的量可为所述 HEK293细胞的两倍。

所述方法中，PBMC与HEK293细胞共培养初始时，需向培养体系中加入工作浓度为2.5μg/ml的PHA，两天后以相同量补充一次PHA。

所述方法中，所述PBMC为离体PBMC，可分离自所述待测猪的股动脉血。

所述方法中，应用Cavidi公司的HS-Mn RT活性检测试剂盒检测所述细胞培养上清的反转录酶活性。

本发明中的所述方法为非疾病诊断治疗的方法。

实验证明，采用本发明方法能够准确鉴定待测猪是否为猪内源性反转录病毒pol基因缺陷型五指山小型猪近交系，可用于选育猪内源性反转录病毒pol基因缺陷型五指山小型猪近交系新品系。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

五指山小型猪近交系：北京盖兰德生物科技有限公司。

HEK293细胞：ATCC，CRL-1573^TM。

实施例1、无PERV传染性的五指山小型猪近交系的筛选及PERV-pol基因缺陷型五指山小型猪近交系新品系的鉴定与选育

一、无PERV传染性的五指山小型猪近交系的初步筛选

从新鲜无菌采集的五指山小型猪近交系的股动脉血中分离外周血单个核细胞(PBMC)。PBMC与HEK293细胞共培养4天，然后从共培养细胞中去除PBMC并使用PCR鉴定PBMC已完全去除，之后采用PCR、RT-PCR对共培养后的HEK293 细胞进行PERV-gag基因、PERV-pol基因、PERV-env基因检测，结果均为阴性者为初筛获得的无PERV传染性的五指山小型猪近交系。

1、细胞共培养及PCR验证猪PBMC的去除情况

在细胞共培养前一天，用6孔板进行HEK293细胞铺板，每孔细胞量为3×10⁵个， 37℃、5％CO₂、饱和湿度中培养24h，待细胞长成50％单层时即可用于共培养。从新鲜无菌采集的五指山小型猪近交系的股动脉血中分离外周血单个核细胞与HEK293细胞共培养，每孔加入的PBMC细胞量约为HEK293细胞量的2倍，同时加入PHA(工作浓度为2.5μg/ml)，两天后以相同量补充一次PHA。

共培养4天后，使用细胞培养液冲洗至少4遍以去除PBMC，并运用PCR方法扩增猪种属特异性基因验证猪PBMC的去除情况。根据猪源细胞的α-1,3-半乳糖转移酶基因中种属特异性内含子序列合成一对引物(表1)。

表1检测猪种属特异性基因的引物序列

使用Promega公司的基因组DNA纯化试剂盒提取细胞基因组DNA，以共培养后的HEK293细胞基因组为模板，用E3和E4组成的引物对进行PCR扩增，并以未经共培养的HEK293细胞基因组DNA为阴性对照。PCR反应在50μL体系中进行，取1μL 细胞基因组DNA作模板，依次加入10×PCR buffer 5μL，10mmol/L dNTP混合物4μL，上游引物50pmol，下游引物50pmol，Taq DNA聚合酶3U，加无菌去离子水至50μL，于PCR仪上进行反应。检测猪α-1,3-半乳糖转移酶基因的扩增程序为：94℃预变性4min； 94℃30s、56℃30s、72℃45s，35个循环；72℃延伸5min。反应结束后，PCR产物进行2％琼脂糖凝胶电泳分析。

预期片段位于500bp～750bp之间，结果表明共培养后细胞基因组DNA和阴性对照均没有扩增出预期大小片段。因此基本上可确认猪PBMC已被完全去除。

2、PCR及RT-PCR检测PERV结构基因

共培养后的HEK293细胞经PCR鉴定确认无猪PBMC存在后，取上述制备的细胞基因组DNA和同期使用Trizol制备的细胞总RNA，分别通过PCR和RT-PCR检测 PERV结构基因(PERV-gag基因、PERV-pol基因、PERV-env基因)的存在和表达情况。

反转录反应在20μL体系中进行，以9μL细胞总RNA为模板，1μLOligo(dt)₁₅为引物，70℃水浴5min后迅速转移到冰上，加入AMV 5×buffer 4μL，10mmol/L dNTP 混合物4μL，Rnasin 20U，AMV反转录酶12U，室温放置10min后，于42℃水浴1h，在AMV反转录酶的作用下反转录合成cDNA第一链。

分别以细胞基因组DNA和反转录产物cDNA为模板进行PCR反应，检测 PERV-gag基因、PERV-pol基因、PERV-env基因的保守区(表2)。

表2检测PREV的引物序列

F代表上游引物,R代表下游引物。gagF和gagR用于检测PERV-gag基因。polF 和polR用于检测PERV-pol基因。envF和envR用于检测PERV-env基因。

PCR反应在25μL体系中进行，取1μL细胞基因组DNA或2μL反转录产物作模板，依次加入Premix Ex Taq 12.5μL，上游引物50pmol，下游引物50pmol，加无菌去离子水至25μL，于PCR仪上进行反应。

检测PERV-gag基因保守区的扩增程序为：94℃预变性5min；94℃30s、55℃50s、 72℃45s，35个循环；72℃延伸5min。检测PERV-pol基因保守区的扩增程序为：94℃预变性5min；94℃30s、57℃50s、72℃45s，35个循环；72℃延伸5min。检测PERV-env 基因保守区的扩增程序为：94℃预变性5min；94℃30s、58℃50s、72℃45s，35个循环；72℃延伸5min。反应结束后，PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳分析。

PCR、RT-PCR检测PERV-gag基因、PERV-pol基因、PERV-env基因的结果均为阴性者为初筛获得的候选的无PERV传染性的五指山小型猪近交系。

二、无PERV传染性的五指山小型猪近交系的确证

初筛共获得11头候选的无PERV传染性的五指山小型猪近交系以及1头有PERV 传染性的五指山小型猪近交系，将这12头猪进行编号，之后通过确证实验来最终确定初筛所得的候选无PERV传染性的五指山小型猪近交系是否确实为无PERV传染性的五指山小型猪近交系。

确证实验时，重新采血并分离PBMC，将PBMC与HEK293细胞共培养。共培养 4天后，完全从共培养细胞中去除PBMC并使用PCR鉴定PBMC已完全去除。继续培养HEK293细胞30-60天，期间在细胞汇合时即行传代，每次传代时收集细胞进行 PCR、RT-PCR检测PERV-gag基因、PERV-pol基因、PERV-env基因，并收集细胞培养上清用于反转录酶活性检测。若PCR、RT-PCR检测均为阴性结果，再通过反转录酶活性检测对其进行进一步确证，检测结果均为阴性时，可判定该样品确实为无PERV 传染性的五指山小型猪近交系。

1、细胞共培养及PCR验证猪PBMC的去除情况

对初筛获得的11头候选的无PERV传染性的五指山小型猪近交系和1头有PERV 传染性的五指山小型猪近交系(阳性对照)重新采血并分离PBMC，将PBMC与 HEK293细胞共培养。共培养4天后，使用细胞培养液冲洗4遍以除尽PBMC，运用PCR 方法扩增猪种属特异性基因以验证猪PBMC的去除情况(方法同步骤一的1)。结果表明共培养后细胞基因组DNA和阴性对照均没有扩增出预期大小片段。因此基本上可确认猪PBMC已被完全去除。

2、PCR及RT-PCR检测PERV结构基因

继续培养HEK293细胞30-60天，期间在细胞汇合时即行传代，每次传代时收集细胞基因组DNA和总RNA，分别进行PCR、RT-PCR检测PERV-gag基因、PERV-pol 基因、PERV-env基因(方法同步骤一的2)。结果显示，在确证实验中除8号样品在 PCR、RT-PCR检测中出现了PERV-pol基因阳性结果外，其余待确证样品均为阴性结果。

3、反转录酶活性检测

每次细胞传代前收集细胞上清，将上清离心、过滤后除去细胞碎片等，然后应用Cavidi公司的HS-Mn RT活性检测试剂盒(产品目录号为#52030)进行反转录酶活性检测。参照试剂盒说明书步骤，首先绘制标准曲线，获得直线回归方程y＝(2E-3)x+ 0.204，R²＝0.996，其中x为反转录酶活性，单位μU/ml，y为OD405值。然后进行样品检测，结果显示，阳性对照样品自共培养后21天开始出现阳性结果，待测样品中有 5个样品在各时间点的OD值均未超过空白对照孔平均值的2倍，为无效值，说明这 5个样品无反转录酶活性，即无PERV感染性。

根据以上确证实验的检测结果，可知：初筛获得的11头候选五指山小型猪中有5头经确证为无PERV传染性的五指山小型猪近交系。5头经确证为无PERV传染性的五指山小型猪近交系中，3头母猪(体号为351、457、505，因此依次命名为WZSP351、 WZSP457、WZSP505)和2头公猪(体号为452、1，因此依次命名为WZSP452、WZSP1)。

三、无PERV传染性的五指山小型猪近交系的基因序列鉴定

随机从步骤二获得的5头经确证为无PERV传染性的五指山小型猪近交系中选取一个个体(WZSP452)。

1、提取WZSP452的基因组DNA，采用Illumina测序技术进行全基因组重测序。

2、分别从WZSP452的全基因组重测序结果、Wuzhishan inbred pig(Genbank：AJKK01000000.1)、Sus scrofa(Genbank：AEMK00000000.2)中提取所有PERV-pol 基因序列片段，使用DNAstar软件分析,结果见表3。

表3猪基因组中PERV-pol基因序列片段拷贝数分析

结果显示，从WZSP452中共提取出95个拷贝的PERV-pol基因序列片段，所有序列均未完全表达，均提前终止。

3、用PERV完整全长核酸序列(GenBank:EF133960.1；linearVRL 29-JUN-2010) 在步骤1得到的全基因组测序结果中进行blast来确定PERV的位置(使用Blast参数 identity>80％,coverage>80％,e-value cutoff of 1e-10)，得出5条scaffold。其中仅scaffold5028包含全部三个结构基因即gag基因、pol基因和env基因。使用 DNAstar软件对WZSP452全基因组中的scaffold5028序列进行分析，结果见表4和表 5。结果显示，WZSP452全基因组中，scaffold5028的gag基因、pol基因和env基因均提前终止，不能正常表达。结果显示，WZSP452全基因组中，pol基因均提前终止，不能正常表达。

表4 scaffold5028及其中gag/pol/env基因在全基因组中的具体位置

	起始位置	终止位置	长度(bp)
				scaffold5028	23882	33002	9121
scaffold5028-gag	25046	26868	1823
				scaffold5028-pol	26768	30127	3360
scaffold5028-env	30003	31981	1979

表5 scaffold5028中gag/pol/env基因中终止密码子位置

对三头母猪(WZSP351、WZSP457、WZSP505)分别按照上述方法进行鉴定，WZSP351全基因组中的猪内源性反转录病毒pol基因均发生了提前终止，WZSP457全基因组中的猪内源性反转录病毒pol基因均发生了提前终止，WZSP505全基因组中的猪内源性反转录病毒pol基因均发生了提前终止。

以上结果表明，WZSP452、WZSP351、WZSP457、WZSP505均为PERV-pol基因缺陷型五指山小型猪近交系新品系。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京盖兰德生物科技有限公司

<120> 一种鉴定和选育PERV-pol基因缺陷型五指山小型猪近交系新品系的方法

<130> GNCYX170956

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cccgatcagg agccctatat ccttacgtg 29

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cgcagcggta atgtcatctc gt 22

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gccctgtcaa ggaggta 17

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

agtgtgctat cttatagaaa gg 22

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gctacctctt cttgttggct atgc 24

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

caccacctgt actaaccagg tacc 24

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tccgagctgg tttaacaatg g 21

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tcttcttcgt ggtaactgtg agtc 24

<210> 9

<211> 1144

<212> PRT

<213> 猪内源性反转录病毒（porcine endogenous retrovirus，PERV）

<400> 9

Met Asp Ala Thr Gly Gln Arg Gln Tyr Pro Trp Thr Thr Arg Arg Thr

1 5 10 15

Val Asp Leu Gly Val Gly Arg Val Thr His Ser Phe Leu Val Ile Pro

20 25 30

Glu Cys Pro Val Pro Leu Leu Gly Arg Asp Leu Leu Thr Lys Met Gly

35 40 45

Ala Gln Ile Ser Phe Glu Gln Gly Arg Pro Glu Val Ser Ala Asn Asn

50 55 60

Lys Pro Ile Thr Val Leu Thr Pro Gln Leu Asp Asp Glu Tyr Arg Leu

65 70 75 80

Tyr Ser Pro Gln Val Lys Pro Asp Gln Asp Ile Gln Ser Trp Leu Glu

85 90 95

Gln Phe Pro Gln Ala Trp Ala Glu Thr Ala Gly Met Gly Leu Ala Lys

100 105 110

Gln Val Pro Pro Gln Val Ile Gln Leu Lys Ala Ser Ala Thr Pro Val

115 120 125

Ser Val Arg Gln Tyr Pro Leu Ser Arg Glu Ala Arg Glu Gly Ile Trp

130 135 140

Pro His Val Gln Arg Leu Ile Gln Gln Gly Ile Leu Val Pro Val Gln

145 150 155 160

Ser Pro Trp Asn Thr Pro Leu Leu Pro Val Arg Lys Pro Gly Thr Asn

165 170 175

Asp Tyr Arg Pro Val Gln Asp Leu Arg Glu Val Asn Lys Arg Val Gln

180 185 190

Asp Ile His Pro Thr Val Pro Asn Pro Tyr Asn Leu Leu Ser Ala Leu

195 200 205

Pro Pro Glu Arg Asn Trp Tyr Thr Val Leu Asp Leu Lys Asp Ala Phe

210 215 220

Phe Cys Leu Arg Leu His Pro Thr Ser Gln Pro Leu Phe Ala Phe Glu

225 230 235 240

Trp Arg Asp Pro Gly Thr Gly Arg Thr Gly Gln Leu Thr Trp Thr Arg

245 250 255

Leu Pro Gln Gly Phe Lys Asn Ser Pro Thr Ile Phe Asp Glu Ala Leu

260 265 270

His Arg Asp Leu Ala Asn Phe Arg Ile Gln His Pro Gln Val Thr Leu

275 280 285

Leu Gln Tyr Val Asp Asp Leu Leu Leu Ala Gly Ala Thr Lys Gln Asp

290 295 300

Cys Ser Glu Gly Thr Lys Ala Leu Leu Leu Glu Leu Ser Asp Leu Gly

305 310 315 320

Tyr Arg Ala Ser Ala Lys Lys Ala Gln Ile Cys Arg Arg Glu Val Thr

325 330 335

Tyr Leu Gly Tyr Ser Leu Arg Asp Gly Gln Arg Trp Leu Thr Glu Ala

340 345 350

Arg Lys Lys Thr Val Val Gln Ile Pro Ala Pro Thr Thr Ala Lys Gln

355 360 365

Val Arg Glu Phe Leu Gly Thr Ala Gly Phe Cys Arg Leu Trp Ile Pro

370 375 380

Gly Phe Ala Thr Leu Ala Ala Pro Leu Tyr Pro Leu Thr Lys Glu Lys

385 390 395 400

Gly Glu Phe Ser Trp Ala Pro Glu His Gln Lys Ala Phe Asp Ala Ile

405 410 415

Lys Lys Ala Leu Leu Ser Ala Pro Ala Leu Ala Leu Pro Asp Val Thr

420 425 430

Lys Pro Phe Thr Leu Tyr Val Asp Glu Arg Lys Gly Val Ala Arg Gly

435 440 445

Val Leu Thr Gln Thr Leu Gly Pro Trp Arg Arg Pro Val Ala Tyr Leu

450 455 460

Ser Lys Lys Leu Asp Pro Ile Ala Ser Gly Trp Pro Val Cys Leu Lys

465 470 475 480

Ala Ile Ala Ala Val Ala Ile Leu Val Lys Asp Ala Asp Lys Leu Thr

485 490 495

Leu Gly Gln Asn Ile Thr Ile Ile Ala Pro His Ala Leu Glu Asn Ile

500 505 510

Val Arg Gln Pro Pro Asp Arg Trp Met Thr Asn Ala Arg Met Thr Gln

515 520 525

Tyr Gln Ser Leu Leu Leu Thr Glu Arg Ile Thr Phe Ala Pro Pro Ala

530 535 540

Ala Leu Asn Pro Ala Thr Leu Leu Pro Glu Glu Thr Asp Glu Pro Val

545 550 555 560

Thr His Asp Cys His Gln Leu Leu Ile Glu Glu Thr Gly Val Arg Lys

565 570 575

Asp Leu Ile Asp Ile Pro Leu Thr Gly Glu Val Leu Thr Trp Phe Thr

580 585 590

Asp Gly Ser Ser Tyr Val Val Glu Gly Lys Arg Met Ala Gly Ala Ala

595 600 605

Val Val Asp Gly Thr Arg Thr Ile Trp Ala Ser Ser Leu Pro Glu Gly

610 615 620

Thr Ser Ala Gln Lys Ala Glu Leu Met Ala Leu Thr Gln Ala Leu Arg

625 630 635 640

Leu Ala Asp Gly Lys Ser Ile Asn Ile Tyr Thr Asp Ser Arg Tyr Ala

645 650 655

Phe Ala Thr Ala His Val His Gly Ala Ile Tyr Lys Gln Arg Gly Leu

660 665 670

Leu Thr Ser Ala Gly Arg Glu Ile Lys Asn Lys Glu Glu Ile Leu Ser

675 680 685

Leu Leu Glu Ala Leu His Leu Pro Lys Arg Leu Ala Ile Ile His Cys

690 695 700

Pro Gly His Gln Lys Ala Lys Asp Pro Ile Ser Arg Gly Asn Gln Met

705 710 715 720

Ala Asp Arg Val Ala Lys Gln Ala Ala Gln Gly Val Asn Leu Leu Pro

725 730 735

Ile Ile Glu Thr Pro Lys Ala Pro Glu Pro Gly Arg Gln Tyr Thr Leu

740 745 750

Glu Asp Trp Gln Glu Ile Lys Lys Ile Asp Gln Phe Ser Glu Thr Pro

755 760 765

Glu Arg Thr Cys Tyr Thr Ser Asp Gly Lys Glu Ile Leu Pro His Lys

770 775 780

Glu Gly Leu Glu Tyr Val Gln Gln Ile His Arg Leu Thr His Leu Gly

785 790 795 800

Thr Lys His Leu Gln Gln Leu Val Arg Thr Ser Pro Tyr His Val Leu

805 810 815

Arg Leu Pro Gly Val Ala Asp Ser Val Val Lys His Cys Val Pro Cys

820 825 830

Gln Leu Val Asn Ala Asn Pro Ser Arg Ile Pro Pro Gly Lys Arg Leu

835 840 845

Arg Gly Ser His Pro Gly Ala His Trp Glu Val Asp Phe Thr Glu Val

850 855 860

Lys Pro Ala Lys Tyr Gly Asn Lys Tyr Leu Leu Val Phe Val Asp Thr

865 870 875 880

Phe Ser Gly Trp Val Glu Ala Tyr Pro Thr Lys Lys Glu Thr Ser Thr

885 890 895

Val Val Ala Lys Lys Ile Leu Glu Glu Ile Phe Pro Arg Phe Gly Ile

900 905 910

Pro Lys Val Ile Gly Ser Asp Asn Gly Pro Ala Phe Val Ala Gln Val

915 920 925

Ser Gln Gly Leu Ala Lys Ile Leu Gly Ile Asp Trp Lys Leu His Cys

930 935 940

Ala Tyr Arg Pro Gln Ser Ser Gly Gln Val Glu Arg Met Asn Arg Thr

945 950 955 960

Ile Lys Glu Thr Leu Thr Lys Leu Thr Thr Glu Thr Gly Ile Asn Asp

965 970 975

Trp Ile Ala Leu Leu Pro Phe Val Pro Phe Arg Val Arg Asn Thr Pro

980 985 990

Gly Gln Phe Gly Leu Thr Pro Tyr Glu Leu Leu Tyr Gly Gly Pro Pro

995 1000 1005

Pro Leu Ala Glu Ile Ala Leu Ala His Ser Ala Asp Val Leu Leu

1010 1015 1020

Ser Gln Pro Leu Phe Ser Arg Leu Lys Ala Leu Glu Trp Val Arg

1025 1030 1035

Gln Arg Ala Trp Lys Gln Leu Arg Glu Ala Tyr Ser Gly Gly Asp

1040 1045 1050

Leu Gln Val Pro His Arg Phe Gln Val Gly Asp Ser Val Tyr Val

1055 1060 1065

Arg Arg His Arg Ala Gly Asn Leu Glu Thr Arg Trp Lys Gly Pro

1070 1075 1080

Tyr Leu Val Leu Leu Thr Thr Pro Thr Thr Val Lys Val Glu Gly

1085 1090 1095

Ile Pro Thr Trp Ile His Ala Ser His Val Lys Pro Val Pro Pro

1100 1105 1110

Pro Asp Ser Gly Trp Lys Ala Glu Lys Thr Glu Asn Pro Leu Lys

1115 1120 1125

Leu Arg Leu His Arg Val Val Pro Tyr Ser Val Asn Asn Ser Ser

1130 1135 1140

Ser

<210> 10

<211> 3435

<212> DNA

<213> 猪内源性反转录病毒（porcine endogenous retrovirus，PERV）

<400> 10

atggatgcca cagggcaacg gcagtatcca tggactaccc gaagaaccgt tgacttggga 60

gtgggacggg taacccactc gtttctggtc atccctgagt gcccagtacc ccttctgggt 120

agagacttac tgaccaagat gggagctcaa atttcttttg aacaaggaag accagaagtg 180

tctgcgaata acaaacccat cactgtgttg accccccaat tagatgatga atatagacta 240

tattctcccc aagtaaagcc tgatcaagat atacagtcct ggttggagca gtttccccaa 300

gcctgggcag aaaccgcagg gatgggtttg gcaaagcaag ttcccccaca ggttattcag 360

ctgaaggcca gtgctacacc agtatcagtc agacagtacc ccttgagtag agaggctcga 420

gaaggaattt ggccgcatgt tcaaagatta atccaacagg gcatcctagt tcctgtccaa 480

tccccttgga atactcccct gctaccggtt aggaagcctg ggaccaatga ttatcgacca 540

gtacaggact tgagagaggt caataaaagg gtgcaggaca tacacccaac ggtcccgaac 600

ccttataacc tcttgagcgc cctcccgcct gaacggaact ggtacacagt attggactta 660

aaagatgcct tcttctgcct gagattacac cccactagcc aaccactttt tgccttcgaa 720

tggagagatc caggtacggg aagaactggg cagctcacct ggacccgact gccccaaggg 780

ttcaagaact ccccgaccat ctttgatgaa gccctacaca gagacctggc caacttcagg 840

atccaacacc cccaggtgac cctcctccag tacgtggatg acctgcttct ggcgggagcc 900

accaaacagg actgctcaga aggtacgaag gcactactgc tggaattgtc tgacctaggc 960

tacagagcct ccgctaagaa ggcccagatt tgcaggagag aggtaacata cttggggtac1020

agtttgcggg acgggcagcg atggctgacg gaggcacgga agaaaactgt agtccagata1080

ccggccccaa ccacagccaa acaagtgaga gagtttttgg ggacagccgg attttgcaga1140

ctgtggatcc cggggtttgc gaccttagca gccccactct acccgctaac caaagaaaaa1200

ggggaattct cctgggctcc tgagcaccag aaggcatttg atgctatcaa aaaggccctg1260

ctgagcgcac ctgctctggc cctccctgat gtaactaaac cttttaccct ttatgtggat1320

gagcgtaagg gagtagcccg gggagtttta acccaaaccc taggaccatg gagaagacct1380

gttgcctacc tgtcaaagaa gctcgatcct atagccagtg gttggcccgt atgcctgaag1440

gctatcgcag ctgtggccat actggtcaag gacgctgaca aattgacttt gggacagaat1500

ataactataa tagcccccca tgcattggaa aacatcgtcc ggcagccccc agaccgatgg1560

atgaccaacg ctcgcatgac ccagtatcaa agcctgcttc tcacagagag gatcacgttt1620

gctccaccag ccgctctcaa ccctgccact cttctgcctg aagagactga tgaaccagtg1680

actcatgatt gccatcaact attgatcgag gagactgggg tccgcaagga ccttatagac1740

ataccgctga ctggagaagt gctgacctgg ttcactgatg ggagcagcta tgtagtggaa1800

ggtaagagga tggctggggc ggcagtggtg gacggaaccc gcacgatctg ggccagcagc1860

ctgccagaag gaacttcagc gcaaaaggct gagctcatgg ccctcacgca agctttgcgg1920

ctggccgacg ggaaatccat aaacatttat acggacagca ggtatgcctt tgcgactgca1980

cacgtacacg gggccatcta taagcaaagg gggttgctta cctcagcagg gagggaaata2040

aagaacaaag aggaaattct aagcctatta gaagccttac atttgccaaa aaggctagct2100

attatacact gtcctggaca tcagaaagcc aaagatccca tatccagagg gaaccagatg2160

gctgaccggg ttgccaagca ggcagcccag ggtgttaacc ttctgcctat aatagaaaca2220

cccaaagccc cagaacccgg acgacagtac accctagaag actggcaaga gataaaaaag2280

atagaccagt tctctgaaac tccggagagg acctgctata cctcagatgg gaaggaaatc2340

ctgccccaca aagaagggtt agaatatgtc caacagatac atcgtctaac ccacctagga2400

actaaacacc tgcagcagtt ggtcagaaca tccccttatc atgttctgag gctaccagga2460

gtggctgact cggtggtcaa acattgtgtg ccctgccagc tggttaatgc taatccttcc2520

agaatacctc caggaaagag actaagggga agccacccag gcgctcactg ggaagtggac2580

ttcactgagg taaagccggc taaatacgga aacaaatatc tattggtttt tgtagacacc2640

ttttcaggat gggtagaggc ttatcctact aagaaagaga cttcaaccgt ggtggctaag2700

aaaatactgg aggaaatttt tccaagattt ggaataccta aggtaatagg gtcagacaat2760

ggtccagctt tcgttgccca ggtaagtcag ggactggcca agatattggg gattgattgg2820

aaactgcatt gtgcatacag accccaaagc tcaggacagg tagagaggat gaatagaacc2880

attaaagaga cccttaccaa attgaccaca gagactggca ttaatgattg gatagctctc2940

ctgccctttg tgccttttag ggttaggaac acccctggac agtttgggct gaccccctat3000

gaattgctct acgggggacc ccccccgttg gcagaaattg cccttgcaca tagtgctgat3060

gtgctgcttt cccagccttt gttctctagg ctcaaggcgc tcgagtgggt gaggcagcga3120

gcgtggaagc agctccggga ggcctactca ggaggagact tgcaagttcc acatcgcttc3180

caagttgggg attcagtcta tgttagacgc caccgtgcag gaaacctcga gactcggtgg3240

aagggccctt atctcgtact tttgaccaca ccaacgactg tgaaagtcga aggaatcccc3300

acctggatcc atgcatccca cgttaagccg gtgccacctc ccgattcggg gtggaaagcc3360

gaaaagactg aaaatcccct taagcttcgc ctccatcgcg tggttcctta ctctgtcaat3420

aactcctcaa gttaa 3435

Claims

1.物质甲在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的功能为如下(a)或(b)：

(a)鉴定猪内源性反转录病毒pol基因缺陷型五指山小型猪近交系；

(b)选育猪内源性反转录病毒pol基因缺陷型五指山小型猪近交系品系；

所述物质甲为用于检测五指山小型猪近交系的全基因组中的猪内源性反转录病毒pol基因是否发生了提前终止的物质；所述提前终止指的是终止密码子位于读码框第235-237位核苷酸；

所述猪内源性反转录病毒pol基因为编码框如序列表的序列10所示的DNA分子。

2.权利要求1中所述的物质甲和记载有判断标准甲的载体在制备试剂盒中的应用；

所述试剂盒的功能为如下(a)或(b)：

所述判断标准甲为：如果某一五指山小型猪近交系个体的全基因组中的猪内源性反转录病毒pol基因均发生了提前终止，该五指山小型猪近交系个体为猪内源性反转录病毒pol基因缺陷型五指山小型猪近交系个体；所述提前终止指的是终止密码子位于读码框第235-237位核苷酸；

3.一种试剂盒，包括物质甲；所述物质甲为用于检测五指山小型猪近交系的全基因组中的猪内源性反转录病毒pol基因是否发生了提前终止的物质；所述提前终止指的是终止密码子位于读码框第235-237位核苷酸；

所述试剂盒的功能为如下(a)或(b)：

4.一种鉴定猪内源性反转录病毒pol基因缺陷型五指山小型猪近交系的方法，包括如下步骤：检测待测五指山小型猪近交系的全基因组中的猪内源性反转录病毒pol基因；如果某一五指山小型猪近交系个体的全基因组中的猪内源性反转录病毒pol基因均发生了提前终止，该五指山小型猪近交系个体为猪内源性反转录病毒pol基因缺陷型五指山小型猪近交系个体；

所述提前终止指的是终止密码子位于读码框第235-237位核苷酸；

5.一种选育猪内源性反转录病毒pol基因缺陷型五指山小型猪近交系品系的方法，包括如下步骤：

(2)步骤(1)得到的猪内源性反转录病毒pol基因缺陷型五指山小型猪近交系个体之间交配，获得后代，即为猪内源性反转录病毒pol基因缺陷型五指山小型猪近交系品系；

6.权利要求1中所述的物质甲、HEK293细胞、记载有方法甲的载体和记载有方法乙的载体在制备试剂盒中的应用；

所述试剂盒的功能为如下(a)或(b)：

①将来源于待测猪的PBMC与HEK293细胞共培养4-7天，去除所述PBMC，鉴定所述HEK293细胞中是否携带或表达猪内源性反转录病毒的结构基因，根据鉴定结果确定所述待测猪是否为无PERV传染性的五指山小型猪近交系：若所述HEK293细胞中不携带且不表达猪内源性反转录病毒的结构基因，则所述待测猪为候选的无PERV传染性的五指山小型猪近交系；若所述HEK293细胞中携带或表达猪内源性反转录病毒的结构基因，则所述待测猪不为无PERV传染性的五指山小型猪近交系；

②将来源于经过所述步骤①获得的候选的无PERV传染性的五指山小型猪近交系的PBMC与HEK293细胞共培养4-7天，去除所述PBMC，继续培养所述HEK293细胞30-60天，期间在细胞汇合时即行传代，每次传代时一方面收集所述HEK293细胞鉴定是否携带或表达猪内源性反转录病毒的结构基因，另一方面收集细胞培养上清鉴定反转录酶活性，根据鉴定结果确定所述“经过所述步骤①获得的候选的无PERV传染性的五指山小型猪近交系”是否确实为无PERV传染性的五指山小型猪近交系：若每次的鉴定结果均显示所述HEK293细胞中不携带且不表达猪内源性反转录病毒的结构基因，并且所述细胞培养上清无反转录酶活性，则所述“经过所述步骤①获得的候选的无PERV传染性的五指山小型猪近交系”确实为无PERV传染性的五指山小型猪近交系；反之则所述“经过所述步骤①获得的候选的无PERV传染性的五指山小型猪近交系”不为无PERV传染性的五指山小型猪近交系；

所述方法甲中，所述待测猪为五指山小型猪近交系；

所述方法乙为“鉴定待测猪是否为猪内源性反转录病毒pol基因缺陷型五指山小型猪近交系”的方法，包括如下步骤：检测待测猪的全基因组中的猪内源性反转录病毒pol基因；如果某一待测猪的全基因组中的猪内源性反转录病毒pol基因均发生了提前终止，该待测猪为猪内源性反转录病毒pol基因缺陷型五指山小型猪近交系个体；

所述方法乙中，所述待测猪为所述方法甲得到的无PERV传染性的五指山小型猪近交系；

7.一种试剂盒，包括物质甲、HEK293细胞、记载有权利要求6中所述方法甲的载体和记载有权利要求6中所述方法乙的载体；

所述物质甲为用于检测五指山小型猪近交系的全基因组中的猪内源性反转录病毒pol基因是否发生了提前终止的物质；所述提前终止指的是终止密码子位于读码框第235-237位核苷酸；所述猪内源性反转录病毒pol基因为编码框如序列表的序列10所示的DNA分子；

所述试剂盒的功能为如下(a)或(b)：

(b)选育猪内源性反转录病毒pol基因缺陷型五指山小型猪近交系品系。

8.一种鉴定猪内源性反转录病毒pol基因缺陷型五指山小型猪近交系的方法，包括如下步骤：

9.一种选育猪内源性反转录病毒pol基因缺陷型五指山小型猪近交系品系的方法，包括如下步骤：

④步骤③得到的猪内源性反转录病毒pol基因缺陷型五指山小型猪近交系个体之间交配，获得后代，即为猪内源性反转录病毒pol基因缺陷型五指山小型猪近交系品系；