JP2018529632A - 多リガンド−薬物複合体及びその使用 - Google Patents

多リガンド−薬物複合体及びその使用 Download PDF

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Abstract

複合体化合物またはそれらの医薬的に許容される塩は、１種のペイロード、及び２種以上の細胞相互作用分子を含む。これらの細胞相互作用分子は、細胞表面受容体に特異的に結合することができるリガンドである。病気を治療する方法は、ペイロードを対象に送達することを含む。
【選択図】図４

Description

関連する出願の参照
本願は、２０１５年８月１１日に「エンドサイトーシスを誘導することができる「リガンド−薬物複合体」という名称で提出された中国特許出願第２０１５１０４８９５５６．６号、及び２０１５年８月１１日に「エンドサイトーシスを誘導することができる多リガンド−薬物複合体」という名称で提出された中国特許出願第２０１５１０４８９５６０．２号の優先権を主張するものであり、それぞれ、その全内容を参照により本明細書に組み込む。
本願は、一般に、複合体化合物、医薬品組成物、及びその使用法に関する。より具体的には、本願は、多リガンド−薬物複合体（ｍＬＤＣ）、特にエンドサイトーシスを誘導することができるｍＬＤＣ、その医薬品組成物、ペイロード（payload＝低分子薬剤のこと）を必要とする対象に送達するのにｍＬＤＣを用いる方法、及び病気の治療にｍＬＤＣを用いる方法に関する。
通常、病気の細胞と正常細胞の病理学的及び生理学的特性は大きく異なり、その違いの一つは、病気の細胞の表面には、特異的すなわち過剰発現した材料（例えば、抗原、化学信号、受容体など）が存在することである。このような材料は正常細胞には存在しないか発現していても少ない。この原理に基づき、抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）及びポリペプチド−薬物複合体（ＰＤＣ）が病気の治療のために開発された。現在、ＡＤＣ及びＰＤＣ薬物は市場に出ているものや臨床実験中のものもあるが、これら薬物の設計原理のため、臨床ではＡＤＣ及びＰＤＣには多くの限定がある。
近年、ＡＤＣは、２０１１年のアドセトリス（Seattle Genetics社）及び２０１３年のカドサイラ（Genentech社）の認可により大きな足がかりを掴み、臨床試験では３０種を超える薬物について活発に研究開発が行われている分野である。にもかかわらず、ＡＤＣ開発は、好適な標的の欠如、製造上の障害、複雑な性質による低い薬物安定性、及びＡＤＣの分子量の大きさに渡る多くの困難に直面している。現在、ＡＤＣは主に癌の治療に用いられている。例えば、癌細胞表面の抗原に対する標的抗体の親和性は、１０-9〜１０-12（Ｋｄ、モル／リットル）である。従って、ＡＤＣは標的細胞に高い特異性を有する一方で、標的細胞と同じ標的受容体を有する正常細胞に対しても高い特異性を有する。また、生体内でＡＤＣが代謝するのに長い時間（１週間から３週間）かかることがある。その間、ＡＤＣは正常細胞を殺し続け、これによりＡＤＣの毒性副作用が著しく大きくなる可能性がある。従って、ＡＤＣのより理想的な適応症は腫瘍細胞と正常細胞で細胞表面の抗原の量が大きく異なる病気である。しかしながら、当該分野で周知の病気でこのような厳密な要件を満たす物はほとんど存在しない。
薬物複合体化合物の別の群はリガンド−薬物複合体（ＬＤＣ）（ここで、リガンドはペプチドまたは小分子の何れかである）である。しかしながら、ＬＤＣの応用には、生物学的利用能、安定性、有効性などに渡る毒性に対する様々な問題がある。例えば、多くのリガンドはその大きな分子量、親油性、あるいは他の属性により細胞内に入ることができず、その治療用途が限定される。また、その治療効果は、リガンドが従来の化学療法（例えば、ドキソルビシン、パクリタキセルなど）と組み合わせる場合は一般に低く、有効性の高い薬物分子（例えば、ＭＭＡＥ、ＤＭ１など）と組み合わせる場合はその毒性が高く、腫瘍治療のための治療有効量に達する前に動物が中毒死してしまう。
本願は、複合体化合物またはこれらの医薬的に許容される塩、これら複合体化合物の医薬品組成物、及びこれら複合体化合物を使用する方法に関する。本願は、より具体的には、多リガンド−薬物複合体（ｍＬＤＣ）、特にエンドサイトーシスを誘導することができるｍＬＤＣ、これらの医薬品組成物、必要とする対象にペイロードを送達するのにこれらｍＬＤＣを用いる方法、及び病気の治療にこれらｍＬＤＣを用いる方法に関する。上記の病気は、癌、免疫疾患、心臓血管疾患、代謝疾患、及び神経疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
本願の一側面は、１種のペイロード及び２種以上の細胞相互作用分子を含む複合体化合物またはその医薬的に許容される塩を開示する。上記ペイロードは、前記細胞相互作用分子のうちの少なくとも１種と結合されている。
態様によっては、前記ペイロードは、前記細胞相互作用分子のうちの少なくとも１種に直接結合されている。態様によっては、前記ペイロードは、前記細胞相互作用分子のうちの少なくとも１種に間接的に結合されている。態様によっては、前記ペイロードは、リンカーを介して前記細胞相互作用分子のうちの少なくとも１種に結合されている。態様によっては、前記細胞相互作用分子のうちの少なくとも１種は、細胞表面受容体に結合することができるリガンドである。態様によっては、前記細胞相互作用分子のうちの少なくとも２種は、細胞表面受容体に結合することができるリガンドである。
態様によっては、前記複合体化合物またはその医薬的に許容される塩は、第一の細胞表面受容体に特異的に結合することができる第一のリガンド、及び第二の細胞表面受容体に特異的に結合することができる第二のリガンドを含む。態様によっては、前記複合体化合物またはその医薬的に許容される塩は、第一の細胞表面受容体に特異的に結合することができる第一のリガンド、及び第二の細胞表面受容体に特異的に結合することができる第二のリガンドを含み、前記第一の細胞表面受容体及び前記第二の細胞表面受容体は互いに異なる。
態様によっては、前記ペイロードは、第一のリガンドに結合し、前記第一のリガンドは前記第二のリガンドに結合されている。態様によっては、前記第一のリガンドは、前記第二のリガンドに直接結合されている。態様によっては、前記第一のリガンドは、前記第二のリガンドに間接的に結合されている。態様によっては、前記第一のリガンドは、スペーサーを介して前記第二のリガンドに結合されている。
態様によっては、前記ペイロードは、リンカーなしで第一のリガンド及び第二のリガンドのそれぞれと直接結合されている。態様によっては、前記ペイロードは、第一のリンカーを介して第一のリガンドに結合され、第二のリンカーを介して第二のリガンドに結合されている。態様によっては、前記第一のリンカー及び前記第二のリンカーは同じである。他の態様によっては、前記第一のリンカー及び前記第二のリンカーは異なる。態様によっては、前記ペイロードは、リンカーなしで第一のリガンドに直接結合され、リンカーを介して第二のリガンドに結合されている。
態様によっては、前記複合体化合物またはその医薬的に許容される塩は、第三の細胞表面受容体に特異的に結合することができる第三のリガンドをさらに含む。態様によっては、前記第一の細胞表面受容体、前記第二の細胞表面受容体、及び前記第三の細胞表面受容体は互いに異なる。態様によっては、前記第一の細胞表面受容体、前記第二の細胞表面受容体、及び前記第三の細胞表面受容体のうち、少なくとも２種は互いに異なる。態様によっては、前記第一のリガンド、前記第二のリガンド、及び前記第三のリガンドは同じである。
態様によっては、本明細書で提供される第一、第二、及び第三の細胞表面受容体は、独立して、トランスフェリン受容体（ＴＦＲ）、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）、葉酸塩受容体（ＦＲ）、尿酸キナーゼ受容体、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、インテグリン受容体ＬＦＡ−１、ソマトスタチンＳＳＴ−１４受容体、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）受容体、ＴＲＰＶ６受容体、及びプロテアーゼ表面抗原受容体からなる群より選択される。
態様によっては、前記第一のリガンド、前記第二のリガンド、及び前記第三のリガンドは、独立して、ペプチド、葉酸塩、及びこれらの類縁体からなる群より選択される。
態様によっては、前記リガンドは、以下のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドを含む：Cys-Lys-Glu-Phe-Leu-His-Pro-Ser-Lys-Val-Asp-Leu-Pro-Arg（配列番号１５、名称Ｐ１０）、Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-Cys（配列番号１６、名称Ｐ１１）、Ala-Gly-[Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys]（配列番号１７、名称Ｐ１２）、Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-Cys（配列番号１８、名称Ｐ１３）、Arg-Gly-Asp（名称RGD）、及び配列番号１５〜１８のアミノ酸配列の何れかと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列を有する相同体ペプチド。前記相同体ペプチドは、それぞれ、配列番号１５〜１８のペプチドと機能的等価物である。
態様によっては、本明細書で記載する細胞相互作用分子の少なくとも１種は、エンドサイトーシスを仲介することができるエンドサイトーシス分子である。態様によっては、前記エンドサイトーシス分子は、また、細胞表面受容体に特異的に結合することもできる。
態様によっては、前記エンドサイトーシス分子は、葉酸塩及びそれらの類縁体、エンドサイトーシスを仲介することができるペプチド、及び細胞貫通ペプチドからなる群より選択される。
態様によっては、本明細書で提供されるリンカーは、ペプチドリンカー、ジスルフィドリンカー、またはｐＨ依存リンカーである。
態様によっては、前記ペプチドリンカーは、プロテアーゼによる切断または還元により特定の生理学的環境下で切断可能である。態様によっては、前記ペプチドリンカーは、バリン−シトルリン、フェニルアラニン−リシン、及びバリン−リシンからなる群より選択される。
態様によっては、前記ジスルフィドリンカーは、ＤＭＤＳ、ＭＤＳ、ＤＳＤＭ、及びＮＤＭＤＳからなる群より選択される。
態様によっては、前記ｐＨ依存リンカーは、シス−アコニット酸無水物である。
態様によっては、前記複合体化合物またはその医薬的に許容される塩は、少なくとも１種のペイロードを含む。態様によっては、前記複合体化合物またはその医薬的に許容される塩は、１種、２種、３種、または４種以上のペイロードを含む。
態様によっては、前記ペイロードは、小分子化合物、ヌクレオチド、ペプチド、タンパク質、及びナノ粒子からなる群より選択される。態様によっては、前記ペイロードは、小分子化合物である。態様によっては、前記ペイロードは、治療薬である。
態様によっては、前記複合体化合物は、ペイロード、２種または３種以上のリガンド、及び任意でリンカーまたはスペーサーを含む、多リガンド複合体化合物である。態様によっては、前記複合体化合物は、ペイロード、２種のリガンド、及び任意でリンカーまたはスペーサーを含む、二リガンド複合体化合物である。態様によっては、前記複合体化合物は、ペイロード、３種のリガンド、及び任意でリンカーまたはスペーサーを含む、三リガンド複合体化合物である。態様によっては、前記複合体化合物は、本明細書の図１に示される以下の化合物からなる群より選択される：ＬＤＣ１０Ｂ、ＬＤＣ１０ＢＲ、ＬＤＣ１０ＢＸ、ＬＤＣ１１Ｂ、ＬＤＣ１２Ｂ、ＬＤＣ１３Ｂ、ＬＤＣ１０１３、ＬＤＣ１０Ｈ、ＬＤＣ１１Ｈ、及びＬＤＣ１２Ｈ。
本願の他の側面は、本明細書で提供される複合体化合物またはその医薬的に許容される塩、及び医薬的に許容される担体を含む医薬品組成物を開示する。態様によっては、前記医薬品組成物は、静脈内投与、皮下投与、経口投与、筋肉内投与、非経口投与、または心室内投与される。
本願の他の側面は、治療有効量の本明細書で提供される複合体化合物またはその医薬的に許容される塩、あるいは本明細書で提供される医薬品組成物対象に投与することを含む、必要とする対象にペイロードを送達するための方法を開示する。
本願の他の側面は、治療有効量の本明細書で提供される複合体化合物またはその医薬的に許容される塩、あるいは本明細書で提供される医薬品組成物を対象に投与することを含む、対象の病気を治療するための方法を開示する。態様によっては、前記病気は癌、免疫疾患、心臓血管疾患、代謝疾患、及び神経疾患からなる群より選択される。
態様によっては、前記癌は、乳癌、肺癌、前立腺癌、腎臓癌、卵巣癌、胃癌、子宮癌、子宮内膜上皮性悪性腫瘍、肝臓癌、甲状腺癌、脾臓癌、大腸癌、結腸直腸癌、食道癌、皮膚癌、リンパ腫、白血病、及び多発性骨髄腫からなる群より選択される。
態様によっては、前記免疫疾患は自己免疫疾患である。態様によっては、前記自己免疫疾患は、結合組織疾患、全身性硬化、リウマチ性関節炎、及び全身性紅斑性狼瘡からなる群より選択される。
態様によっては、前記心臓血管疾患は、狭心症、心筋梗塞、脳卒中、心臓発作、高血圧性心疾患、リウマチ性心疾患、心筋症、心臓不整脈、及び先天性心疾患からなる群より選択される。
態様によっては、前記代謝疾患は、糖尿病、痛風、肥満、低血糖症、高血糖症、及び脂質異常からなる群より選択される。
態様によっては、前記神経疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、頭部外傷、多発性硬化症、めまい、昏睡、及びてんかんからなる群より選択される。
態様によっては、本明細書で提供される方法は、本明細書で提供される複合体化合物またはその医薬的に許容される塩、あるいは本明細書で提供される医薬品組成物と組み合わせて１種以上の治療薬を投与することをさらに含む。態様によっては、前記治療薬は、抗癌治療標的を標的する、癌に対する免疫応答を誘導または促進する、あるいは化学療法薬である。
図１は、ＬＤＣ１０Ｂ、ＬＤＣ１０ＢＲ、ＬＤＣ１０ＢＸ、ＬＤＣ１１Ｂ、ＬＤＣ１２Ｂ、ＬＤＣ１３Ｂ、ＬＤＣ１０１３、ＬＤＣ１０Ｈ、ＬＤＣ１１Ｈ、及びＬＤＣ１２Ｈの構造を示す。 図２はＬＤＣ１０Ｂのエンドサイトーシス試験の結果を示す。パネルＡ及びＢは、葉酸塩−ＦＩＴＣがＫＢ細胞（葉酸塩受容体陽性細胞）に入るが、Ａ３７５細胞（葉酸塩受容体陰性細胞）には入らないことを示す。パネルＣ及びＤは、１０Ａ−ＦＩＴＣがＫＢ細胞にもＡ３７５細胞にも入ることができないことを示す。パネルＥ及びＦは、二リガンド複合体１０Ｂ−ＦＩＴＣがＫＢ細胞には入るが、Ａ３７５細胞には入らないことを示す。 図３は、葉酸塩−ＦＩＴＣ、１０Ａ−ＦＩＴＣ、及び１０Ｂ−ＦＩＴＣの構造を示す。 図４は、腫瘍部位に集中する蛍光標識ＬＤＣ１０Ｂ−Ｃｙ５を示す、生きたマウスの画像である。
様々な側面及び態様が本明細書で開示されるが、当業者であれば自明の通り、本願の主題の精神及び範囲を逸脱することなく、これら側面及び態様に対して様々な等価の変形及び修正を行うことができる。本明細書で開示される様々な側面及び態様は、例示目的のみであり、添付の請求項に示される真の範囲を限定すると解釈されるべきではない。本明細書で引用したすべての文献、特許、または特許出願は、その全内容を参照により組み込む。特に定義しなければ、本明細書で用いられる技術用語及び科学用語は、本願が属する分野の当業者に一般に理解されるのと同じ意味を持つ。
本明細書及び添付の請求項で用いられる単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそうでないことを示していなければ、複数形を含む。本明細書では、用語「ａ」（または「ａｎ」）、「１つ以上」、及び「少なくとも１つ」は互いに言い換え可能である。また、用語「含む」、「備える」、及び「有する」も互いに言い換え可能である。
本願の一側面は、１種のペイロード及び２種以上の細胞相互作用分子を含み、前記ペイロードは前記細胞相互作用分子のうちの少なくとも１種に結合されている、複合体化合物またはその医薬的に許容される塩を開示する。
本明細書で用いられる用語「ペイロード」は標的細胞または組織に送達される分子または材料を指す。ペイロードは特に限定されず、対象の病気の診断、治療、または予防に用いることを意図される任意の医薬品化合物であってもよい。
態様によっては、前記ペイロードは、小分子化合物、ヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アプタマーなど）、ペプチド、タンパク質（例えば、酵素）、またはナノ粒子である。態様によっては、前記ペイロードは、小分子化合物である。態様によっては、前記小分子化合物は、メイタンシン及びその任意の誘導体、タキシノール及びその任意の誘導体、オーリスタチン及びその任意の誘導体、エポチロン及びその任意の誘導体、ブレオマイシン及びその任意の誘導体、ダクチノマイシン及びその任意の誘導体、プリカマイシン及びその任意の誘導体、及びマイトマイシンＣからなる群より選択される。態様によっては、前記ペイロードは、オーリスタチンまたはその任意の誘導体である。態様によっては、前記医薬品化合物は、癌を緩和または治療するのに用いられる化学療法薬である。
態様によっては、本明細書で開示される前記複合体化合物またはその医薬的に許容される塩は、１種のペイロードを含む。態様によっては、本明細書で開示される前記複合体化合物またはその医薬的に許容される塩は、少なくとも１種のペイロードを含む。例えば、前記複合体化合物またはその医薬的に許容される塩は、１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、１１種、１２種、１３種、１４種、１５種、１６種、１７種、１８種、１９種、または２０種以上のペイロードを含む。複数のペイロードを含む複合体分子では、これらペイロードはそれぞれ、同じであってもよく、互いに異なっていてもよい。態様によっては、前記ペイロードのうちの少なくとも２種は互いに異なる。
本明細書で用いられる用語「細胞相互作用分子」は、標的細胞またはその標的細胞の細胞表面受容体と相互作用して、細胞相互作用分子を含む複合体分子の標的細胞への特異的結合、標的細胞による複合体分子のエンドサイトーシス、及び／またはそうでなければ複合体分子の標的細胞による特異的な会合及び保持を生じさせることを誘導するあるいは容易にすることができる任意の分子または部位を指す。
細胞相互作用分子は小さな化学分子あるいは大きな生体分子であってもよい。態様によっては、細胞相互作用分子は、抗体、リガンド、またはエンドサイトーシス分子である。態様によっては、前記細胞相互作用分子のうちの少なくとも１種は、細胞表面受容体に結合することができるリガンドである。態様によっては、前記細胞相互作用分子のうちの少なくとも１種はエンドサイトーシスを仲介することができるエンドサイトーシス分子である。
本明細書で開示されるリガンドは、選択された標的（例えば、細胞表面受容体、細胞、組織、器官など）に対する特異的結合親和性を有する可能性がある様々な化学的あるいは生物学的実体を含む。態様によっては、リガンドは標的細胞の表面に発現したタンパク質すなわちマーカーに特異的に結合してもよい。態様によっては、本願のリガンドは１０-6〜１０-9（Ｋｄ値）の親和性を有する細胞表面受容体に結合する。態様によっては、リガンドは少なくとも１０-7、少なくとも１０-8、少なくとも１０-9Ｍ（Ｋｄ値）の親和性を有する細胞表面受容体に結合する。態様によっては、本願のリガンドは標的細胞表面受容体に対する親和性が他の標的でない細胞表面タンパク質すなわちマーカーに対する親和性の少なくとも２倍、３倍、４倍以上である細胞表面受容体に結合する。
態様によっては、本願の２種以上の細胞相互作用分子は、異なる細胞表面受容体に特異的に結合することができる２種以上のリガンドである。態様によっては、本願の複合体化合物またはその医薬的に許容される塩は２種のリガンドを含み、第一のリガンドは第一の細胞表面受容体に特異的に結合することができ、第二のリガンドは第二の細胞表面受容体に特異的に結合することができる。態様によっては、前記複合体分子は２種のリガンドを含み、第一のリガンドは葉酸塩受容体に特異的に結合することができ、第二のリガンドは黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）受容体に特異的に結合することができる。態様によっては、前記複合体分子は３種のリガンドを含み、第一のリガンドは葉酸塩受容体に特異的に結合することができ、第二のリガンドはＬＨＲＨ受容体に特異的に結合することができ、第三のリガンドはＳＳＴ−１４受容体に特異的に結合することができる。
態様によっては、本明細書で開示される複合体化合物またはその医薬的に許容される塩は、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、１１種、１２種、１３種、１４種、１５種、１６種、１７種、１８種、１９種、または２０種以上の細胞相互作用分子を含む。一複合体分子では、各細胞相互作用分子は同じであってもよく、あるいは互いに異なっていてもよい。態様によっては、前記細胞相互作用分子のうちの少なくとも２種は互いに異なる。態様によっては、前記細胞相互作用分子のそれぞれが互いに異なる。
態様によっては、本明細書で提供される複合体分子は、複数の細胞相互作用分子に結合した単一のペイロードのみを含む。態様によっては、本明細書で提供される一複合体分子は、複数の細胞相互作用分子に結合した複数のペイロードを含む。
本明細書で用いられる用語「結合する（conjugated）」は、２つの化学基の共有結合による結合を指し、それら２つの化学基は直接、共有結合しているか、あるいはリンカーを介して間接的に結合しているかの何れかである。
態様によっては、前記複合体化合物またはその医薬的に許容される塩は、１種のペイロード及び２種以上の細胞相互作用分子を含み、前記ペイロードは、前記細胞相互作用分子のうちの少なくとも１種と直接、共有結合する。態様によっては、前記ペイロードは、前記細胞相互作用分子のそれぞれと直接、共有結合している。
態様によっては、前記複合体化合物またはその医薬的に許容される塩は、１種のペイロード及び２種以上の細胞相互作用分子を含み、前記ペイロードは、リンカーを介して前記細胞相互作用分子のうちの少なくとも１種と共有結合している。態様によっては、前記ペイロードは、前記細胞相互作用分子のそれぞれとリンカーを介して共有結合している。
本明細書で用いられる用語「リンカー」は、ペイロードを細胞相互作用分子に共有結合させる分子または部位を指す。リンカーは、ペイロードと細胞相互作用分子のうちの少なくとも１種と結合する官能基を含む。態様によっては、官能基は、２つの反応性部位、すなわち、ペイロードに結合する部位と細胞相互作用分子に結合する部位を含んでいてもよい。態様によっては、これら官能基は互いに異なっている。態様によっては、官能基は、チオール反応部位及びアミン反応部位を含む基を含む。態様によっては、これらの官能基は互いに同じである。態様によっては、これら官能基はマレイミド基である。
態様によっては、本願のリンカーは、少なくとも１種（例えば、１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、または１０種以上）のペイロードと少なくとも２種（例えば、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、または１０種以上）の細胞相互作用分子に結合することができる多価リンカーである。多価リンカーに結合するペイロードは、同じであってもよく、あるいは異なっていてもよい。多価リンカーに結合する細胞相互作用分子は同じであってもよく、あるいは異なっていてもよい。
一側面では、リンカーは、標的細胞または組織へのペイロードの有効量を高め、毒性を回避するため、血液循環時のペイロードの意図しない放出を回避するのに十分な程度安定でなければならない。他の側面では、リンカーは、効率的に標的細胞を殺す、あるいは標的細胞の機能を阻止するため、標的細胞付近あるいは標的細胞内でペイロードを放出することができなければならない。態様によっては、リンカーは少なくとも１種の切断可能な官能基を含む。好ましいのは、切断可能な官能基は、標的細胞外では十分に安定であるが、標的細胞内に入ると切断されてペイロードを放出する。態様によっては、この切断可能な官能基は、対象の血液または血清中に比べて標的細胞内で少なくとも１０倍、２０倍、３０倍、５０倍、または１００倍以上効率的に切断される。
切断可能なリンカーは、加水分解、酵素反応、または還元反応、あるいはｐＨの変化により切断されてもよい。態様によっては、リンカーは、特定の生理学的環境下、例えば、適切なｐＨ環境下で切断可能である。態様によっては、リンカーは、ｐＨが約６．５以下の酸性環境で、あるいは一般酸として作用することができる酵素などの薬剤により切断可能である。態様によっては、リンカーは、切断剤、例えば、ｐＨ、酸化還元電位、または分解性分子の存在の影響を受けやすい。
態様によっては、リンカーは切断不能である。本明細書で用いられる切断不能リンカーは、細胞内代謝時にそのまま残っているリンカーを言う。
態様によっては、リンカーは、ペプチド結合で結合したアミノ酸の線状または分岐状の分子鎖からなるペプチドリンカーである。態様によっては、ペプチドリンカーは、標的細胞の周囲あるいは標的細胞中に多く、すなわち特異的に発現しているプロテアーゼ（例えば、リソソームまたはエンドソーム中のカテプシンＢ）により切断可能である。本明細書で用いられるペプチドリンカーは、様々な長さを有していてもよい。典型的には、本願のペプチドリンカーの長さは１〜５０アミノ酸である。態様によっては、ペプチドリンカーの長さは、アミノ酸が２〜４５個、２〜４０個、２〜３５個、２〜３０個、２〜２５個、２〜２０個、２〜１５個、２〜１０個、２〜９個、２〜８個、２〜７個、２〜６個、２〜５個、２〜４個、または２〜３個である。本明細書で記載するペプチドリンカーのアミノ酸の数は、範囲の両端を含む上記数値範囲内の任意の整数値と同じであってもよい。態様によっては、ペプチドリンカーの長さは、アミノ酸２個、３個、４個、または５個であることが好ましい。態様によっては、ペプチドリンカーは、バリン−シトルリン（Ｖａｌ−Ｃｉｔ）、フェニルアラニン−リシン、またはバリン−リシンである。
態様によっては、リンカーは、ジスルフィド結合を含むジスルフィドリンカーである。ジスルフィド結合は細胞内還元環境下で切断されてもよく、循環系では安定したままである。本願のジスルフィドリンカーは、ＤＳＤＭ、ＤＭＤＳ、ＭＤＳ、またはＮＤＭＤＳであってもよい。これらジスルフィドリンカーの構造を以下の表１に示す。
態様によっては、リンカーはｐＨ依存リンカーである。本明細書で記載するｐＨ依存リンカーは、特定のｐＨ環境で切断可能であってもよい。態様によっては、ｐＨ依存リンカーは、アルカリ性条件で安定であってもよく、酸性条件、例えば、ｐＨ値が６．５以下では切断可能である。態様によっては、ｐＨ依存リンカーはシス−アコニット酸無水物である。
態様によっては、本願のリンカーは、上記のリンカーの何れか１種またはそれらの任意の組み合わせを含む。態様によっては、本願のリンカーは、リンカーの部分としてスペーサーを含んでいてもよい。
態様によっては、前記ペイロードは、第一の細胞相互作用分子に直接または間接的に結合され、第一の細胞相互作用分子は、第二の細胞相互作用分子に直接または間接的に結合されている。態様によっては、前記ペイロードは、第一の細胞相互作用分子及び第二の細胞相互作用分子のそれぞれに直接、結合されている。態様によっては、前記ペイロードは、第一の細胞相互作用分子及び第二の細胞相互作用分子のそれぞれに間接的に結合されている。態様によっては、前記ペイロードは、第一の細胞相互作用分子に間接的に（例えばリンカーを介して）結合され、第一の細胞相互作用分子は第二の細胞相互作用分子に直接または間接的に結合されている。態様によっては、前記ペイロードは、第一の細胞相互作用分子に第一のリンカーを介して結合され、第二の細胞相互作用分子に第二のリンカーを介して結合されている。態様によっては、前記リンカーは、少なくとも１種（例えば、１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、または１０種以上）のペイロード、及び少なくとも２種（例えば、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、または１０種以上）のリガンドと結合する多価リンカーである。多価リンカーを、複数のペイロード及び複数の細胞相互作用分子を含む複合体分子を調製するのに用いてもよい。
態様によっては、２種の細胞相互作用分子は、スペーサーを介して互いに結合してもよい。態様によっては、１種以上のスペーサーを用いて２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、または１０種以上の細胞相互作用分子を結合させる。態様によっては、スペーサーは、標的細胞によって特異的に発現されている、あるいは標的細胞によって発現されるように誘導されるプロテアーゼにより切断可能である。このようなプロテアーゼとしては、例えば、以下の表２に示すプロテアーゼが挙げられる。態様によっては、スペーサーは、以下の表２に示すアミノ酸配列から選択される何れか１種のアミノ酸配列を含む。
本明細書で用いられる用語「切断可能」または「切断する」は、本明細書で提供される複合体化合物に対する代謝性過程または反応過程を指し、ペイロードと細胞相互作用分子のリンカー、または細胞相互作用分子間のスペーサーが分解されて、遊離ペイロードまたは細胞相互作用分子を放出する。リンカー及びスペーサーは、プロテアーゼにより切断される、あるいは特定の生理学的環境（例えば、ｐＨ環境）下で切断されるかの何れかである。
態様によっては、本明細書で記載する複合体化合物またはその医薬的に許容される塩は、３種のリガンドと結合されているペイロードを含み、第一のリガンドは、第一の細胞受容体に特異的に結合することができ、第二のリガンドは第二の細胞受容体に特異的に結合することができ、第三のリガンドは第三の細胞表面受容体に特異的に結合することができる。
態様によっては、第三のリガンドは、第一のリガンドに直接または間接的に（例えば、スペーサーを介して）結合されている。態様によっては、第三のリガンドは、ペイロードに直接または間接的に（例えば、リンカーを介して）結合されている。態様によっては、第一のリガンドは、第二のリガンドに直接または間接的に（例えば、スペーサーを介して）結合され、第二のリガンドは第三のリガンドに直接または間接的に（例えば、スペーサーを介して）結合されている。
態様によっては、第一の細胞表面受容体、第二の細胞表面受容体、及び第三の細胞表面受容体は、構造または機能が互いに異なる。態様によっては、前記第一の細胞表面受容体、前記第二の細胞表面受容体、及び前記第三の細胞表面受容体のうち、少なくとも２種は構造または機能が互いに異なる。態様によっては、前記第一のリガンド、前記第二のリガンド、及び前記第三のリガンドは同じである。
態様によっては、複合体分子は、以下に示される式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、またはＸの構造を有する（ここで、ｎ、ｍ、ｐ、ｑ、ｒ、及びｓは独立して０または１であり、リンカー及びスペーサーが独立して存在するか否かを表す）。
好ましい態様では、細胞表面受容体の発現は、正常細胞よりも標的細胞（例えば、癌細胞）で有意に多い。本明細書で用いられる用語「有意に」は、統計的に有意な差、当業者が認識することができる有意な差を指す。
態様によっては、細胞表面受容体の発現量は、正常細胞に比べて標的細胞（例えば、癌細胞）で２〜１，０００，０００倍多く、例えば、正常細胞に比べて標的細胞（例えば、癌細胞）では２〜１０倍、２〜１００倍、２〜１，０００倍、２〜１０，０００倍、２〜１００，０００倍、２〜１，０００，０００倍多い（範囲の両端を含む上記の数値範囲内の任意の値と同じであってもよい）。態様によっては、細胞表面受容体の発現量は、正常細胞に比べて標的細胞（例えば、癌細胞）では少なくとも１０倍、１００倍、１，０００倍、１０，０００倍、または１００，０００倍多い。態様によっては、正常細胞上の細胞表面受容体の量は、標的細胞（例えば、癌細胞）上の細胞表面受容体の量に比べて少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％少ない。態様によっては、本明細書で記載する細胞表面受容体は、正常細胞では検出されない。
態様によっては、第一、第二、及び第三の細胞表面受容体は、独立して、トランスフェリン受容体（ＴＦＲ）、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）、葉酸塩受容体（ＦＲ）、尿酸キナーゼ受容体、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、インテグリン受容体ＬＦＡ−１、ＳＳＴ−１４受容体、ＬＨＲＨ受容体、ＴＲＰＶ６受容体、及びプロテアーゼ表面抗原受容体からなる群より選択される。
態様によっては、第一のリガンド、第二のリガンド、及び第三のリガンドは同じである。態様によっては、第一のリガンド、第二のリガンド、及び第三のリガンドのうち、少なくとも２種は互いに異なる。態様によっては、第一のリガンド、第二のリガンド、及び第三のリガンドは、同じ細胞表面受容体に特異的に結合することができる。態様によっては、第一のリガンド、第二のリガンド、及び第三のリガンドは、異なる細胞表面受容体に特異的に結合することができる。態様によっては、第一のリガンド、第二のリガンド、及び第三のリガンドのそれぞれは、２種以上の異なる細胞表面受容体に結合することができる。
態様によっては、第一のリガンド、第二のリガンド、及び第三のリガンドは独立して、葉酸塩及びそれらの類縁体、及びペプチドからなる群より選択される。態様によっては、第一のリガンド、第二のリガンド、及び第三のリガンドは独立して、葉酸塩及びそれらの類縁体であり、前記リガンドの少なくとも２種は互いに異なる。態様によっては、葉酸塩の類縁体は、５−メチルテトラヒドロ葉酸塩、５−ホルミルテトラヒドロ葉酸塩、スルファニルアミド、メトトレキサート、及び５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸塩からなる群より選択される。
態様によっては、第一のリガンド、第二のリガンド、及び第三のリガンドは独立してペプチドである。態様によっては、前記ペプチドは、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、ＲＧＤ、及び配列番号１５〜１８のアミノ酸配列の何れかと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列を有する相同体ペプチドからなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、前記相同体ペプチドは、配列番号１５〜１８のペプチドと機能的均等物である。
本明細書で用いられる用語「〜とのパーセント（％）相同性」は、アミノ酸配列の場合は最大数の同一アミノ酸を達成するために候補と基準配列を並べ、任意でギャップを導入した後の２つのアミノ酸配列の同一性の百分率を指し、ヌクレオチド配列の場合は最大数の同一ヌクレオチドを達成するために候補と基準配列を並べ、任意でギャップを導入した後の２つのヌクレオチド配列間の同一性の百分率を指す。
相同性の百分率は、当該分野でよく知られた様々な方法で決定してもよい。例えば、配列は、以下の公開ツールで比較してもよい：ＢＬＡＳＴｐソフトウェア(National Center for Biotechnology Information (NCBI)のウエブサイトhttp://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgiから入手可能。また、次を参照のこと。Altschul S.F.et al., J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990); Stephen F. et al, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402 (1997)), ClustalW2 (available from the website of European Bioinformatics Institute: http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/, また次を参照のこと：Higgins D.G. et al., Methods in Enzymology, 266:383-402 (1996); Larkin M.A. et al., Bioinformatics (Oxford, England), 23(21): 2947-8 (2007))、及びTcoffee (Sweden Bioinformatics Instituteのウエブサイトから入手可能。また、次を参照のこと：Poirot O.et al., Nucleic Acids Res., 31(13): 3503-6 (2003); Notredame C. et al., J. Mol. Boil., 302(1): 205-17 (2000))。ソフトウェアを用いてこれらの配列のアライメントを行う場合、そのソフトウェアで利用可能な設定値のパラメータを用いてもよく、あるいはそれらパラメータをアライメントの目的に合うように変更してもよい。これらのすべては、当業者の知識の範囲内である。
本明細書に用いられる用語「機能的均等物」は、誘導体ペプチドが由来する元のペプチド配列の生物学的活性と実質的に同じである生物学的活性を保持する誘導体ペプチドを指す。機能的均等物は天然の誘導体であってもよく、あるいは合成で調製される。機能的均等物としては、例えば、ペプチドの生物学的活性が保存されているという条件で１種以上のアミノ酸の置換、欠失、または付加を有するアミノ酸配列が挙げられる。置換するアミノ酸は、置換されたアミノ酸の物理化学特性に類似した物理化学特性を有することが望ましい。望ましい類似した物理化学特性としては、電荷、嵩高さ、疎水性、親水性などの類似性が挙げられる。
態様によっては、前記機能的均等物は、アミノ酸残基の保存的置換を含む。アミノ酸残基の保存的置換は、類似特性を有するアミノ酸同士の置換を指し、例えば、極性アミノ酸同士の置換（例えば、グルタミンとアスパラギンの置換）、疎水性アミノ酸同士の置換（例えば、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、及びバリン間の置換）、同じ電荷を有するアミノ酸同士の置換（例えば、アルギニン、リシン、及びヒスチジン間の置換あるいはグルタミン酸とアスパラギン酸の置換）が挙げられる。
態様によっては、前記複合体化合物またはその医薬的に許容される塩の細胞相互作用分子のうちの少なくとも１種は、エンドサイトーシスを仲介することができるエンドサイトーシス分子である。
本明細書で用いられる用語「エンドサイトーシス分子」は、標的細胞と相互作用した後に、本明細書で開示される複合体化合物またはその医薬的に許容される塩の標的細胞へのエンドサイトーシス、内部移行、すなわち取り込みを仲介することができる分子を指す。
態様によっては、エンドサイトーシス分子は、葉酸塩及びそれらの類縁体、エンドサイトーシスを仲介することができるペプチド、及び細胞貫通ペプチドからなる群より選択される。
態様によっては、エンドサイトーシス分子は、細胞表面受容体にも特異的に結合することができる。態様によっては、本明細書で提供されるエンドサイトーシス分子は、葉酸塩及びそれらの類縁体である。態様によっては、葉酸塩の類縁体は、５−メチルテトラヒドロ葉酸塩、５−ホルミルテトラヒドロ葉酸塩、スルファニルアミド、メトトレキサート、及び５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸塩からなる群より選択される。
葉酸塩は、その小分子重量、免疫原性がないこと、及び高い安定性から、他の基と化学結合を形成するのに有用である。細胞の葉酸塩取り込みを仲介するために、葉酸塩は高い親和性を有する細胞表面で発現している葉酸塩受容体と会合してもよい。葉酸塩受容体は、大部分の正常細胞では非常に少ない量で発現するが、低葉酸塩条件で急速に細胞を分裂させるという葉酸塩の高い要求を満たすために多数の癌細胞では大量に発現している（Kelemen LE, Int J Cancer, 2006; 119: 243-50; Kane MA, et al., J Clin Invest. 1988; 81: 1398-406; Matsue H, et al., Proc Natl Acad Sci USA. 1992; 89: 6006-9; Zhao R, et al., Annu Rev Nutr. 2011; 31: 177-201を参照のこと）。葉酸塩は、細胞表面上の葉酸塩受容体に特異的に結合することができ、また、前記複合体化合物またはその医薬的に許容される塩の標的細胞へのエンドサイトーシスを仲介することができるエンドサイトーシス分子でもある。
態様によっては、エンドサイトーシス分子は、エンドサイトーシスを仲介することができるペプチドである。態様によっては、エンドサイトーシス分子は、さらに、細胞表面受容体に特異的に結合することができる。態様によっては、エンドサイトーシスを仲介することができるペプチドは、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、ＲＧＤ、及び配列番号１６〜１８の何れかのアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列を有する相同体ペプチドからなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、前記相同体ペプチドはそれぞれ、配列番号１６〜１８のペプチドの機能的均等物である。
態様によっては、エンドサイトーシス分子は細胞貫通ペプチドである。細胞貫通ペプチド（ＣＰＰ）は、タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）としても知られている、受容体から独立したやり方で細胞内部に入ることができる短いペプチド（一般に、４０個未満のアミノ酸）である。細胞貫通ペプチドがペイロードに結合されていると、ペイロードが膜を通る輸送を仲介することができ、タンパク質形質導入の活性を有する。態様によっては、本明細書で記載する細胞貫通ペプチドは、腫瘍吸収性ペプチド、ミトコンドリア貫通ペプチド、活性化可能な細胞貫通ペプチド、及び抗菌性ペプチドからなる群より選択される。態様によっては、細胞貫通ペプチドは、配列番号１９（RRRRRRRRR、名称Ｒ９）及び配列番号２０（GRKKRRQRRRPPQ、Ｔａｔペプチド、すなわち転写タンパク質のＨＩＶ転写活性化因子の細胞貫通ペプチドである）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
態様によっては、本明細書で記載するエンドサイトーシスを仲介することができるペプチドは、配列番号１６〜２０の配列及びＲＧＤに比べて１つのアミノ酸部位にのみアミノ酸の保存的置換を有する。態様によっては、本明細書で記載するエンドサイトーシスを仲介することができるペプチドは、配列番号１６〜２０の配列と比べて、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個のアミノ酸部位にアミノ酸の保存的置換を有する。
本明細書で記載するエンドサイトーシスを仲介することができるペプチドは、その生物学的活性に影響を及ぼさないという前提条件で、人工のアミノ酸を含んでいてもよく、それらの例としては、β−フルオロ−アラニン、１−メチル−ヒスチジン、γ−メチレン−グルタミン酸、α−メチル−ロイシン、４，５−デヒドロ−リシン、ヒドロキシプロリン、３−フルオロ−フェニルアラニン、３−アミノ−チロシン、４−メチル−トリプトファンなどが挙げられる。
態様によっては、本明細書で提供される複合体化合物またはその医薬的に許容される塩は、本明細書で提供されるペイロードを少なくとも１種（例えば、１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、または１０種以上）、本明細書で提供されるリガンドを少なくとも１種（例えば、１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、または１０種以上）、本明細書で提供されるエンドサイトーシス分子を少なくとも１種（例えば、１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、または１０種以上）及び任意で本明細書で提供される１種のリンカーまたはスペーサーを含む。態様によっては、複合体化合物またはその医薬的に許容される塩は、本明細書で提供される１種のペイロード、本明細書で提供される１種のリガンド、本明細書で提供される１種のエンドサイトーシス分子、及び任意で本明細書で提供される１種のリンカーまたはスペーサーを含む。
態様によっては、前記複合体化合物は、以下で示す式ＸＩ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩ、ＸＩＩＩＩ、またはＸＶの構造を有し、ここで、ｎ、ｍ、ｐ、ｑ、及びｓは独立して０または１であり、リンカー、多価リンカー、及びスペーサーが独立して存在するか否かを示す。
態様によっては、本願の複合体化合物は、化合物ＬＤＣ１０Ｂ、ＬＤＣ１０ＢＲ、ＬＤＣ１０ＢＸ、ＬＤＣ１１Ｂ、ＬＤＣ１２Ｂ、ＬＤＣ１３Ｂ、ＬＤＣ１０１３、ＬＤＣ１０Ｈ、ＬＤＣ１１Ｈ、ＬＤＣ１２Ｈ、及びＬＤＣ１３Ｈからなる群より選択される。ＬＤＣ１０Ｂ、ＬＤＣ１０ＢＲ、ＬＤＣ１０ＢＸ、ＬＤＣ１１Ｂ、ＬＤＣ１２Ｂ、ＬＤＣ１３Ｂ、ＬＤＣ１０１３、ＬＤＣ１０Ｈ、ＬＤＣ１１Ｈ、及びＬＤＣ１２Ｈの成分を以下の表３に示す。
MC-Val-Cit-PABの構造は以下の通りである。
ＬＤＣ１０Ｂ、ＬＤＣ１０ＢＲ、ＬＤＣ１０ＢＸ、ＬＤＣ１１Ｂ、ＬＤＣ１２Ｂ、ＬＤＣ１３Ｂ、ＬＤＣ１０１３、ＬＤＣ１０Ｈ、ＬＤＣ１１Ｈ、及びＬＤＣ１２Ｈの特定の構造を図１に示す。
態様によっては、本明細書で提供される複合体化合物またはその医薬的に許容される塩は、１種のペイロード及び２種の細胞相互作用分子を含み、前記２種の細胞相互作用分子のうちの１つは細胞表面受容体に特異的に結合することができるリガンドであり、もう一方はエンドサイトーシス分子（例えば、ＬＤＣ１０Ｈ、ＬＤＣ１０Ｂ、ＬＤＣ１０１３）である。態様によっては、エンドサイトーシス分子は、細胞表面受容体にも結合することができ、例えば、ＬＤＣ１０ＢまたはＬＤＣ１０１３である。態様によっては、エンドサイトーシス分子は、細胞貫通分子であり、例えば、ＬＤＣ１０Ｈなどである。
態様によっては、本明細書で提供される複合体化合物またはその医薬的に許容可能塩は、１種のペイロード、及びいずれもエンドサイトーシス分子（例えば、ＬＤＣ１１Ｂ、ＬＤＣ１２Ｂ、ＬＤＣ１３Ｂ）である２種の細胞相互作用分子を含む。態様によっては、本明細書で提供される複合体化合物またはその医薬的に許容可能塩は、第一のエンドサイトーシス分子及び第二のエンドサイトーシス分子を含み、第一のエンドサイトーシス分子は第二のエンドサイトーシス分子と同じである。態様によっては、本明細書で提供される複合体化合物またはその医薬的に許容可能塩は、第一のエンドサイトーシス分子及び第二のエンドサイトーシス分子を含み、第一のエンドサイトーシス分子は第二のエンドサイトーシス分子（例えば、ＬＤＣ１１Ｂ、ＬＤＣ１２Ｂ、ＬＤＣ１３Ｂ）と異なる。態様によっては、本明細書で提供される複合体化合物またはその医薬的に許容可能塩は、１種のペイロード、及びいずれも細胞表面受容体に特異的に結合することができるエンドサイトーシス分子（例えば、ＬＤＣ１１Ｂ、ＬＤＣ１２Ｂ、ＬＤＣ１３Ｂ）である２種の細胞相互作用分子を含む。態様によっては、第一のエンドサイトーシス分子は細胞表面受容体にも特異的に結合することができ、第二のエンドサイトーシス分子は細胞貫通分子（例えば、ＬＤＣ１１Ｈ、ＬＤＣ１２Ｈ、ＬＤＣ１３Ｈ）である。
態様によっては、本明細書で提供される複合体化合物またはその医薬的に許容可能塩は、１種のペイロード、及びいずれも細胞表面受容体に特異的に結合することができるリガンドである２種の細胞相互作用分子を含む。態様によっては、本明細書で提供される複合体化合物またはその医薬的に許容可能塩は、第一の細胞表面受容体に結合することができる第一の細胞相互作用分子、及び第二の細胞表面受容体に結合することができる第二の細胞相互作用分子を含み、第一の細胞相互作用分子は第二の細胞相互作用分子と同じである。態様によっては、本明細書で提供される複合体化合物またはその医薬的に許容可能塩は、第一の細胞表面受容体に結合することができる第一の細胞相互作用分子と第二の細胞表面受容体に結合することができる第二の細胞相互作用分子を含み、第一の細胞相互作用分子は、第二の細胞相互作用分子（例えば、ＬＤＣ１０Ｂ、ＬＤＣ１１Ｂ、ＬＤＣ１２Ｂ、ＬＤＣ１３Ｂ、ＬＤＣ１０１３）と異なる。
本願のｍＬＤＣを、標的組織環境の標的細胞に任意のペイロードを特異的に送達するのに用いてもよい。一般に、ｍＬＤＣ中に複数のリガンドがあることの利点は以下の３つである。まず、複数のリガンドは複数のモードでしばしば相乗的に作用して、その結果、副作用を低減しつつ治療効果を向上させることができる。次に、複数のリガンドの結合は、標的受容体または標的細胞に対するｍＬＤＣの親和性及び結合活性（avidity）を高めて、結合の特異性を高め、標的毒性を回避する。最後に、適切に設計されると、複数のリガンドの組み合わせは、しばしば薬物複合体に求められる多機能要件を満たすことができる。
本願のｍＬＤＣは、以下に挙げる予期しなかった技術的効果を達成するが、これらに限定されない。（１）細胞表面受容体に結合することができるリガンドとエンドサイトーシス分子の組み合わせにより、複合体化合物は標的細胞内に特異的に侵入することができる。（２）ｍＬＤＣは、非常に有効な化学療法薬（例えば、ＭＭＡＥ）を患者に送達するように薬物化合物の親和性及び標的特異性を高めて、そのような薬剤の治療可能域を広げ、副作用を回避する。（３）リンカーは、標的細胞の外（例えば、血液循環システム、細胞間物質など）へのペイロードの放出を防止することができ、これにより血液循環時の複合体化合物の安定性を確実にして薬物の毒性を低減する。標的細胞へ入った後、リンカーは切断されてペイロードを放出し、薬物の効果を発揮する。それと同時に、多剤耐性（ＭＤＲ）を回避することが可能である。（４）様々な薬物を本願の複合体化合物の形態で送達することができるので、関連する薬物の用途範囲を広げることができる。従って、本願のｍＬＤＣは、目的の範囲及びＬＤＣ薬物の治療可能範囲を広げるだけでなく、薬物によってはその毒性及び副作用を低減する。
例えば、複合体に２つのリガンドを用いてもよく、一方のリガンドは癌細胞表面受容体に特異的に結合し、もう一方のリガンドは癌に特異的なプロテアーゼにより充実性腫瘍内でのみ脱マスキングされ、エンドサイトーシスを誘導して複合体が薬物ペイロードを癌細胞のみに特異的に送達することを可能にし、受容体の何れかまたは両方を発現する正常細胞に対する毒性を回避する。
例えば、２つのリガンド、すなわち、Ｐ１０ペプチド及び葉酸塩を含むＬＤＣ１０Ｂは、２つまたは３つのモードで機能することができる。Ｐ１０ペプチドそのものは、相Ｉ臨床試験で有効な癌薬物であり、おそらくＴＲＰＶ６拮抗薬として作用していることが示された。葉酸塩は、癌細胞を殺すためにエンドサイトーシスにより効率的に細胞毒素ペイロードを送達するのを助けることが示された。二リガンド−薬物複合体として、ＬＤＣ１０Ｂは、ＴＲＰＶ６受容体及び葉酸塩受容体の両方を発現している癌細胞を殺すため、次の３つの方法で相乗的に機能することができる。まず、Ｐ１０ペプチド部位は、それ自体がＴＲＰＶ６拮抗薬として機能する。次に、Ｐ１０ペプチドは、あまり効率的ではないが、内部移行により結合した細胞毒素を送達することができる。また、葉酸塩は、葉酸塩受容体に結合してエンドサイトーシスにより効率的に細胞毒素を送達することができる。最後に、２つのリガンド、Ｐ１０ペプチド及び葉酸塩は、それぞれの受容体に相乗的に結合して、両方の受容体を発現している標的細胞の内部に細胞毒素ペイロードを送達することができる。
本明細書で用いられる「ポリペプチド」、「タンパク質」、及び「ペプチド」は互いに言い換え可能であり、アミノ酸の重合体を指す。本明細書で記載するポリペプチド、タンパク質、またはペプチドは、天然に発生するアミノ酸、人工のアミノ酸、またはアミノ酸の類縁体及び模倣物を含んでいてもよい。ポリペプチド、タンパク質、またはペプチドは、当該分野でよく知られた任意の方法により得ることができる。例えば、天然の材料からの単離及び精製、組み換え発現、化学合成などが挙げられるが、それらに限定されない。
本願の他の側面は、本明細書で提供される複合体化合物またはそれらの医薬的に許容される塩、及び医薬的に許容される担体を含む医薬品組成物を開示する。
本明細書で用いられる用語「医薬的に許容される」は、妥当な医学的判断の範囲内で過度の毒性、刺激、アレルギー反応などがなく、ヒト及び他の動物の細胞と接触させて用いるのに好適であり、合理的な便益危険比と釣り合いが取れていることを意味する。
本明細書で用いられる用語「医薬的に許容される塩」は、本願の複合体化合物の比較的非毒性である無機酸及び有機酸付加塩及び塩基付加塩を指す。代表的な酸付加塩としては、臭化水素酸塩、塩酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、ラウリン酸塩、ホウ酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、トシル酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ナフチル酸塩、メシル酸塩、グルコヘプトン酸塩、ラクチオビオン酸塩（lactiobionate）、スルファミン酸塩、マロン酸塩、サリチル酸塩、プロピオン酸塩、メチレン−ビス−ｂ−ヒドロキシナフトエ酸塩、ゲンチシン酸塩、イセチオン酸塩、ジ−ｐ−トルオイル酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、シクロヘキシルスルファミン酸塩、及びキナテスラウリルスルホン酸塩などが挙げられる。塩基付加塩としては、医薬的に許容される金属及びアミン塩が挙げられる。好適な金属塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、バリウム塩、亜鉛塩、マグネシウム塩、及びアルミニウム塩などが挙げられる。態様によっては、ナトリウム塩及びカリウム塩が好ましい。好適な無機塩基付加塩は、金属塩基から調製され、例えば、水素化ナトリウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化アルミニウム、水酸化リチウム、水酸化マグネシウム、及び水酸化亜鉛などが挙げられる。好適なアミン塩基付加塩は、安定した塩を形成するのに十分な塩基性を有するアミンから調製され、好ましくは、その低い毒性と医学的な使用での許容性から医薬化学で頻繁に用いられる以下のアミンが挙げられる：アンモニア、エチレンジアミン、Ｎ−メチル−グルカミン、リシン、アルギニン、オルニチン、コリン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、ジエタノールアミン、プロカイン、Ｎ−ベンジルフェネチルアミン、ジエチルアミン、ピペラジン、トリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン、水酸化四メチルアンモニウム、三エチルアミン、二ベンジルアミン、エフェナミン、デヒドロアビエチルアミン、Ｎ−エチルピペリジン、ベンジルアミン、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、エチルアミン、塩基性アミノ酸（例えば、リシン及びアルギニン）、及び二シクロヘキシルアミンなど。
本明細書に用いられる用語「医薬的に許容される担体」は、本明細書で提供される複合体化合物の構造及び特性と干渉しない、本明細書で提供される複合体化合物を対象に送達するための医薬的に許容される溶媒、懸濁剤、または任意の他の薬理的に不活性な媒体を指す。このような担体の特定のものにより、複合体化合物を例えば、対象が経口摂取するための錠剤、丸薬、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液、及びトローチとして処方することが可能になる。このような担体の特定のものにより、複合体化合物を注射、点滴、または局所投与として処方することが可能になる。
本明細書で提供される医薬品組成物で用いられる医薬的に許容される担体は、これらに限定されないが、例えば、医薬的に許容される液体、ゲル、固体担体、水性媒体（例えば、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、等張ブドウ糖注射液、殺菌水注射液、またはブドウ糖及び乳酸化リンゲル注射液）、非水性媒体（例えば、野菜由来の固定油、綿実油、トウモロコシ油、ごま油、またはピーナッツ油）、抗菌剤、等張剤（例えば、塩化ナトリウムまたはブドウ糖）、緩衝剤（例えば、リン酸塩またはクエン酸塩緩衝剤）、酸化防止剤（例えば、重硫酸ナトリウム）、麻酔薬（例えば、塩酸プロカイン）、懸濁／分散剤（例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ヒドロオキシプロピルメチルセルロース、またはポリビニルピロリドン）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）またはＥＧＴＡ（エチレングリコール四酢酸））、乳化剤（例えば、ポリソルバート８０（ＴＷＥＥＮ−８０））、希釈剤、アジュバント、賦形剤、非毒性補助物質、当該分野で周知の他の成分、またはこれらの様々な組み合わせが挙げられる。好適な成分としては、例えば、賦形剤、結着剤、緩衝剤、保存料、潤滑剤、風味剤、増粘剤、着色剤、または乳化剤を含んでいてもよい。
態様によっては、前記医薬品組成物は注射液製剤である。注射液製剤としては、例えば、水溶液または分散液、懸濁液、あるいは乳化液が挙げられる。すべての場合で、これら注射液製剤は殺菌されていなければならず、容易に注射することができるように当然、流体である。製造及び保存条件で安定でなければならず、また微生物（例えば、バクテリア及び真菌類）の汚染作用から保護されなければならない。これら担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセリン、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、これら及び／または植物油の好適な混合物を含む溶媒または分散媒であってもよい。これらの注射液製剤は適切な流動性を維持していなければならない。例えば、塗膜（例えば、レシチンなど）、界面活性剤などを用いて適切な流動性を維持してもよい。微生物の作用は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなど）により防止してもよい。
態様によっては、前記医薬品組成物は経口投与製剤である。経口投与製剤は、例えば、カプセル、カシェー剤、丸薬、錠剤、トローチ剤（風味付けした基材、通常、スクロース及びアラビアゴムまたはトラガカントを用いる）、粉末、顆粒、水性または非水性液体の溶液または懸濁液、水中油型または油中水型液体乳化液、エリキシル剤、シロップ、トローチ（挿入基材、例えば、ゼラチン及びグリセリン、またはスクロース及びアラビアゴムを用いる）及び／または口内洗浄液などが挙げられるが、これらに限定されない。
経口投与用の固体の投与形態（例えば、カプセル、錠剤、丸薬、糖衣錠、粉末、顆粒など）では、複合体化合物は１種以上の医薬的に許容される担体と混合される（例えば、クエン酸ナトリウムまたはリン酸水素カルシウム、及び／または以下の何れか：（１）賦形剤または増量剤（例えば、澱粉、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、及び／またはケイ酸）；（２）結着剤（例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース及び／またはアラビアゴム）；（３）保湿剤（例えば、グリセリン）；（４）崩壊剤（例えば、寒天−寒天、炭酸カルシウム、じゃがいも澱粉またはタピオカ澱粉、アルギン酸、特定のケイ酸塩、及び炭酸ナトリウム）；（５）溶解遅延剤（例えば、パラフィン）；（６）吸収促進剤（例えば、四級アンモニウム化合物）；（７）湿潤剤（例えば、アセチルアルコール及びモノステアリン酸グリセリン）；（８）吸収剤（例えば、カオリン及びベントナイト粘土）；（９）潤滑剤（例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、及びこれらの混合物）；及び（１０）着色剤。
経口投与用の液体の投与形態では、複合体化合物は医薬的に許容される乳化液、マイクロ乳化液、溶液、懸濁液、シロップ、及びエリキシル剤の何れかと混合される。この液体の投与形態は、複合体化合物に加えて、当該分野で一般に用いられる不活性希釈剤（例えば、水または他の溶媒、可溶化剤及び乳化剤（例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、カルボン酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、油（特に、綿種油、アメリカホドイモ油（groundnut）、トウモロコシ油、オリーブ油、ヒマシ油、及びごま油）、グリセリン、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、ソルビタンの脂肪酸エステル、及びこれらの混合物）を含んでいてもよい。不活性希釈剤の他に、経口投与組成物は、アジュバント（例えば、湿潤剤）、乳化剤、懸濁剤、甘味料、風味料、着色剤、香料、及び防腐剤をも含んでいてもよい。
態様によっては、上記医薬品組成物は、経口スプレー製剤または経鼻スプレー製剤である。スプレー製剤としては、水性エアロゾル、非水性懸濁液、リピドソーム製剤、または固体顆粒製剤などが挙げられるが、これらに限定されない。水性エアロゾルは、薬剤、従来の医薬的に許容される担体、及び安定化剤の混合水溶液または懸濁液により調製される。担体及び安定化剤は、特定の化合物の要件により変化するが、一般に、非イオン性界面活性剤（Tweens、すなわちポリエチレングリコール）、オレイン酸、レシチン、アミノ酸（例えば、グリシン）、緩衝溶液、塩、糖または糖アルコールが挙げられる。エアロゾルは、一般に、等張溶液により調製され、スプレーにより送達してもよい。
態様によっては、前記医薬品組成物を、１種以上の他の薬物と混合して用いてもよい。態様によっては、前記医薬品組成物は、少なくとも１種の他の薬物を含む。態様によっては、これらの他の薬物は抗腫瘍薬物、心臓血管薬物、抗炎症性薬物、抗ウイルス薬物、消化器系薬物、神経系薬物、呼吸器系薬物、免疫系薬物、皮膚薬物、代謝性薬物などである。
態様によっては、前記医薬品組成物は、適切な経路で必要とする対象に投与されてもよい。適切な経路としては、これらに限定されないが、経口投与，注射（例えば、静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射、皮内注射、心臓内注射、髄腔内注射、胸膜内注射、腹腔内注射など）、粘膜投与（例えば、経鼻投与、口内投与など）、舌下投与、直腸投与、経皮吸収投与、眼球内投与、及び肺投与が挙げられる。態様によっては、薬物組成物は静脈内投与、皮下投与、経口投与、筋肉内投与、または心室内投与してもよい。
ペイロードのあるものの特性（例えば、高い毒性、高い親水性など）により、ペイロードを必要とする対象により特異的かつより効率的に送達することが望ましい。例えば、癌治療では、正常細胞に対しては毒性がなく、癌細胞に特異的に化学療法薬を送達することが望ましい。従って、本願の他の側面は、ペイロードを必要とする対象に送達する方法を開示する。この方法は、前記対象に本明細書で提供される複合体化合物またはそれらの医薬的に許容される塩、あるいは本明細書で提供される医薬品組成物の治療有効量を投与することを含む。本明細書で記載するペイロードは、病気の防止、阻害、改善、または治療において研究者、獣医、医者、またはその他の臨床医によって調べられている組織、系、動物、個体、またはヒトで生物学的または薬物反応を引き出す任意の医薬品であってもよい。
本明細書で用いられる用語「対象」は、ヒト及び非ヒト動物を指す。非ヒト動物は、すべての脊椎動物、例えば、哺乳類及び非哺乳類を含む。対象はまた、ウシ、ブタ、ヒツジ、家禽、及びウマなどの家畜動物、あるいはイヌ及びネコなどのペット動物であってもよい。対象は、オスまたはメスであってもよく、高齢であってもよく、成人、青年、子供、あるいは幼児であってもよい。ヒトの対象は、白色人種、アフリカ系人種、アジア系人種、セム語系人種、その他の人種、あるいはこれら人種の混血であってもよい。
本明細書で用いられる用語「治療有効量」は、対象の病気または障害の１つ以上の症状をある程度まで緩和する、病気または障害と関連づけられた、あるいは原因となる１つ以上の生理学的または生化学的パラメータを部分的あるいは完全に正常に戻す、及び／または病気または障害の発症の尤度を低下させるような上記複合体化合物またはそれらの医薬的に許容される塩、あるいは医薬品組成物の量を指す。そのような量は、本明細書で提供される決定及び説明のための記載を前提として、一般に、当業者の権限内で多数の因子によって変動する。これらの因子としては、特定の対象、対象の年齢、重量、身長、一般的な体調、病歴、使用される特定の化合物、その化合物が処方される担体及びその化合物に選択された投与経路、及び治療される状態の性質及び重症度などが挙げられるが、これらに限定されない。
態様によっては、複合体化合物またはそれらの医薬的に許容される塩、あるいは医薬品組成物の量は、対象の病気または障害を阻害する、あるいは病気または障害の発症を予防的に阻害または防止するのに十分である。治療有効量は対象毎に異なってもよいが、一般に０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ、例えば、０．０１〜９０ｍｇ／ｋｇ、０．０１〜８０ｍｇ／ｋｇ、０．０１〜７０ｍｇ／ｋｇ、０．０１〜６０ｍｇ／ｋｇ、０．０１〜５０ｍｇ／ｋｇ、０．０１〜４０ｍｇ／ｋｇ、０．０１〜３０ｍｇ／ｋｇ、０．０１〜２０ｍｇ／ｋｇ、０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇ、０．０１〜５ｍｇ／ｋｇ、０．０１〜４ｍｇ／ｋｇ、０．０１〜３ｍｇ／ｋｇ、０．０１〜２ｍｇ／ｋｇ、０．０１〜１ｍｇ／ｋｇ、０．０１〜０．１ｍｇ／ｋｇの範囲である。本明細書で記載する治療有効量は、（上記範囲の両端を含む）上記の数値範囲内の任意の値と同じであってもよい。
本願の他の側面は、ペイロードを必要とする対象に送達するための方法を開示する。この方法は、前記対象に本明細書で提供される複合体化合物またはその医薬的に許容される塩、あるいは本明細書で提供される医薬品組成物の治療有効量を投与することを含む。
本願の他の側面は、対象の病気を治療するための方法を開示する。この方法は、前記対象に本明細書で提供される複合体化合物またらこれらの医薬的に許容される塩、あるいは本明細書で提供される医薬品組成物の治療有効量を投与することを含む。
態様によっては、前記病気は癌であり、乳癌、肺癌、前立腺癌、腎臓癌、卵巣癌、胃癌、子宮癌、子宮内膜上皮性悪性腫瘍、肝臓癌、甲状腺癌、脾臓癌、大腸癌、結腸直腸癌、食道癌、皮膚癌、リンパ腫、白血病、及び多発性骨髄腫が挙げられるが、これらに限定されない。
態様によっては、前記病気は免疫疾患、例えば、自己免疫疾患であり、結合組織疾患、全身性硬化、リウマチ性関節炎、及び全身性紅斑性狼瘡が挙げられるが、これらに限定されない。
態様によっては、前記病気は心臓血管疾患であり、狭心症、心筋梗塞、脳卒中、高血圧性心疾患、狭心症、心筋梗塞、脳卒中、心臓発作、高血圧性心疾患、リウマチ性心疾患、心筋症、心臓不整脈、及び先天性心疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
態様によっては、前記病気は代謝疾患であり、糖尿病、痛風、肥満、低血糖症、高血糖症、及び脂質異常が挙げられるが、これらに限定されない。
態様によっては、前記病気は神経疾患であり、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、頭部外傷、多発性硬化症、めまい、昏睡、及びてんかんが挙げられるが、これらに限定されない。
態様によっては、本明細書で提供される方法は、複合体化合物またはその医薬的に許容される塩、あるいは医薬品組成物と１種以上の治療薬を組み合わせて投与することをさらに含む。態様によっては、前記治療薬は、抗癌治療標的を標的とする、癌に対する免疫応答を誘発または促進する、あるいは化学療法薬である。
具体例により本願をさらに詳細に記載する。以下の例は、例示目的でのみ提供されており、いかなる方法でも本発明を限定することを意図しない。当業者には自明であるが、各種の重要ではないパラメータは変化または修正しても本質的に同じ結果が得られる。
以下の実施例は本願をさらに例示することを意図している。本願の利点及び特徴は、以下の記載で明らかになる。しかしながら、これらの記載は単なる例示であって、本願の範囲の限定と解釈されるべきではない。
実施例Ｉ：複合体分子の調製
ステップＩ：葉酸塩−ＮＨＳの合成
葉酸塩（４４．１ｇ、１００ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（２Ｌ）に溶解して、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（２４．８ｇ、１２０ｍｍｏｌ）及びＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）（２３ｇ、２００ｍｍｏｌ）と混合した。この混合物を暗所で１８時間、常温で撹拌した。溶解しなかった物質を濾別して、真空乾燥し、コロイド状の固体を得た。コロイド状の固体を氷冷エーテルで３回洗浄し、乾燥して黄色の粉末（５３．８ｇ）を得た。この粉末は、さらに精製せずに次の反応に用いることができる。
ステップＩＩ：Ｐ１０保護ペプチド樹脂の合成
Wang Resin（Sigma-Aldrich社から購入、１００ｇ、置換度：１．１ｍｍｏｌ／ｇ）を秤取り、固相反応塔に加えた。次いで、ＤＭＦを加えて、３０分間、窒素ガスでバブリングしながら湿潤した。別の三角フラスコにFmoc-Arg(pbf)-OH（１４２．７ｇ、２２０ｍｍｏｌ）、HOBt（３５．６ｇ、２６４ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（２．７ｇ、２２ｍｍｏｌ）を秤取り、ＤＭＦに溶解して、氷水槽で０℃まで冷却した。次いで、ＤＩＣ（４０．８ｍｌ、２６４ｍｍｏｌ）を加えて、５分間反応させた。この溶液を反応塔に加えて３時間反応させ、真空で乾燥させ、ＤＭＦで３回洗浄した。
無水酢酸（１０４ｍｌ）及びピリジン（８８．５ｍｌ）をＤＭＦ（５００ｍｌ）に溶解して、この混合物を上記の洗浄した樹脂に加えた。これら材料を密封して、室温で５時間静置した。ＤＭＦで３回洗浄し、メタノールで収縮した。樹脂を乾燥してFmoc-Arg（pbf)-Wang Resinを得た。置換度を求めたところ、０．５３ｍｍｏｌ／ｇであった。
３７．７ｇ（２０ｍｍｏｌ）のFmoc-Arg(pbf)-Wang Resin（置換度：０．５３ｍｍｏｌ／ｇ）を秤取り、反応塔に加えた。ＤＭＦで３回洗浄して、ＤＭＦで３０分間湿潤した。Ｆｍｏｃ保護基をＤＢＬＫで外して、ＤＭＦで６回洗浄した。Fmoc-Pro-OH（２０．２ｇ、６０ｍｍｏｌ）及び HOBt（９．７ｇ、７２ｍｍｏｌ）を秤取り、ＤＭＦに溶解して、氷水槽で０℃まで冷却した。次いで、ＤＩＣ（１１．１ｍｌ、７２ｍｍｏｌ）を加えて、５分間反応させた。この溶液を反応塔に加えて、２時間反応させ、ＤＢＬＫを加えてＦｍｏｃ保護基を外した。
ペプチド配列のＣ−末端からＮ−末端まで各アミノ酸を付加するために上記の手順を繰り返した。Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、及びFmoc-Cys(Trt)-OHをペプチド配列に従って１つずつ結合させ、ＤＢＬＫを加えてＦｍｏｃ保護基を外した。この溶液をＤＭＦで６回洗浄して、メタノールで２回収縮し、乾燥してＰ１０保護ペプチド樹脂（８５．８ｇ）を得た。
ステップＩＩＩ：中間体である葉酸塩−Ｐ１０（葉酸塩-Cys-Lys-Glu-Phe-Leu-His-Pro-Ser-Lys-Val-Asp-Leu-Pro-Arg-OH）の合成
葉酸塩−ＮＨＳ（３２．３ｇ、６０ｍｍｏｌ）を秤取り、ＤＭＳＯに溶解させた。ステップＩＩで得られたＰ１０保護ペプチド樹脂（８５．８ｇ）を加えて、５分間反応させた。ＤＩＥＡ（２１ｍｌ、１２０ｍｍｏｌ）を滴下して、反応を室温で４時間継続した。反応生成物をＤＭＦで３回洗浄して、メタノールで収縮し、真空乾燥して完全に保護されたペプチド樹脂（３２０．３ｇ）を得た。
上で得られた保護ペプチド樹脂（８０ｇ）を１０００ｍｌの一口フラスコに入れた。切断溶液（６４０ｍｌ、ＴＦＡ：チオアニソール：ＥＤＴ：アニソール＝９０：５：３：２（体積比））を調製して、フラスコに加え、室温で２．５時間反応させた。樹脂を濾過して、ＴＦＡ（１００ｍｌ）で洗浄した。濾液を合わせて無水エーテル（４５００ｍｌ）に加えて黄色の固体を分離した。これらの固体を遠心分離して、無水エーテルで洗浄し、真空乾燥して黄色の固体（４０．６ｇ）を得た。粗ペプチドの収率は９７．１％、ＨＰＬＣ純度は７６．３％であった。得られた黄色の固体をＨＰＬＣで精製して、冷凍乾燥して葉酸塩−Ｐ１０（２８．２５ｇ、純度：９８．６％）を得た。
ステップＩＶ：中間体Ｒ９−Ｐ１０（Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Cys-Lys-Glu-Phe-Leu-His-Pro-Ser-Lys-Val-Asp-Leu-Pro-Arg-OH）の合成
ステップＩＩで得られたＰ１０保護ペプチド樹脂の一部を秤取り、Ｒ９のペプチド配列に従って結合させ、中間体Ｒ９−Ｐ１０を得た。
ステップＶ：中間体Mc-Val-Cit-PAB-MMAEの合成
MMAE（７．１８ｇ、１０ｍｍｏｌ）を秤取り、２５０ｍｌの３つ口フラスコに入れ、無水ＤＭＦに溶解させた。Ｎ2保護下、室温で透明になるまで撹拌した。Mc-Val-Cit-PAB-PNP（７．３７ｇ）及びHOAt（７２ｍg、２ｍｍｏｌ）を溶液に加えて、５分間反応させた。次いで、ＤＩＥＡ（３．５ｍｌ、２０ｍｍｏｌ）を滴下して、反応を室温で３０分間継続した。温度を４０〜５０℃まで上げて、２０時間反応させた。その間、ＨＰＬＣを用いて反応を監視した。真空乾燥してＤＭＦを除去し、さらにＨＰＬＣ精製を行って生成物Mc-Val-Cit-PAB-MMAE（１０．７ｇ、純度：９９．３％）を得た。
ステップＶＩ：複合体ＬＤＣ１０Ｂ及びＬＤＣ１０Ｈの合成
ステップＶで得られたMc-Val-Cit-PAB-MMAE（６．５９ｇ、５ｍｍｏｌ）を秤取り、５０００ｍｌの一口フラスコに入れた。３３００ｍｌのリン酸緩衝液を加えて、ＰＨ＝７．２下で透明になるまで撹拌した。中間体である葉酸塩−Ｐ１０またはＲ９−Ｐ１０（１０．５ｇ、５．０２ｍｍｏｌ）を加えて、室温で２時間反応させた。この間、ＨＰＬＣを用いて反応を監視した。反応が終了した後、溶液を濾過して、ＨＰＬＣ及び冷凍乾燥を行ってＬＤＣ１０Ｂ（１４．５３ｇ、純度：９９．２％、収率：８５．０２％）及びＬＤＣ１０Ｈ（１２．３７ｇ、純度：９８．７％、収率：８１．３４％）を得た。
同様の手順で複合体ＬＤＣ１０ＢＲ、ＬＤＣ１０ＢＸ、ＬＤＣ１１Ｂ、ＬＤＣ１２Ｂ、ＬＤＣ１３Ｂ、ＬＤＣ１０１３、ＬＤＣ１１Ｈ、及びＬＤＣ１２Ｈを得ることができる。
ステップＶＩＩ：葉酸塩−ＦＩＴＣ（ＦＩＴＣ−ＡＣＰ−Ｌｙｓ（葉酸塩）−ＯＨ）の合成
Wang Resin（１ｇ、置換度：１．１ｍｍｏｌ／ｇ）を秤取り、固相反応塔に加えた。次いで、ＤＭＦを加えて、３０分間窒素ガスでバブリングしながら湿潤した。別の三角フラスコに２モル当量のＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｄｄｅ）−ＯＨ、２．４モル当量のＨＯＢｔ、及び０．２モル当量のＤＭＡＰをＤＭＦに溶解させ、氷水槽で０℃まで冷却した。次いで、２．４モル当量のＤＩＣを加えて、５分間反応させた。溶液を反応塔に加えて、３時間反応させた。真空乾燥して、ＤＭＦで３回洗浄した。
それぞれ１０モル当量の無水酢酸及びピリジンをＤＭＦ（１０ｍｌ）に溶解して、上記の洗浄した樹脂に加えた。これらの材料を密封して、室温で５時間静置した。樹脂をＤＭＦで３回洗浄して、メタノールで収縮し、乾燥してFmoc-LYS(Dde)-Wang Resinを得た。置換度を求めたところ、０．５１ｍｍｏｌ／ｇであった。
１．３ｇのFmoc-LYS(Dde)-Wang Resin（置換度：０．５１ｍｍｏｌ／ｇ）を秤取り、反応塔に加えた。ＤＭＦで３回洗浄して、ＤＭＦで３０分間湿潤した。ＤＢＬＫでＦｍｏｃ保護基を外して、ＤＭＦで６回洗浄した。２モル当量のFmoc-6-ACP-OH及び２．４モル当量のHOBtを秤取り、ＤＭＦに溶解して、氷水槽で０℃まで冷却した。次いで、２．４モル当量のＤＩＣを加えて、５分間反応させた。この溶液を反応塔に加えて、２時間反応させ、ＤＢＬＫを加えてＦｍｏｃ保護基を外した。
ＦＩＴＣのＤＭＦ溶液（１．５モル当量）をこの樹脂に加えて、３モル当量のＤＩＥＡを滴下した。反応を２時間継続して、樹脂をＤＭＦで３回洗浄した。
２％のヒドラジン水和物のＤＭＦ溶液を上記樹脂に加えて、１５分間反応させた。これを二回繰り返して、ＤＭＦで６回洗浄した。
葉酸塩−ＮＨＳ（２モル当量）を秤取り、ＤＭＳＯに溶解して、樹脂に加えた。５分間反応させて、ＤＩＥＡ（２１ｍｌ、１２０ｍｍｏｌ）を滴下し、反応を室温で４時間継続した。反応生成物をＤＭＳＯ及びＤＭＦでそれぞれ３回洗浄して、メタノールで収縮し、真空乾燥して完全に保護されたペプチド樹脂を得た。
樹脂から脱保護及び切断した後、ＨＰＬＣで粗葉酸塩−ＦＩＴＣを精製して、純度が９５％の黄色の固体の形態の生成物を得た。図３に葉酸塩−ＦＩＴＣの構造を示す。
ステップＶＩＩＩ：１０Ａ−ＦＩＴＣの合成
ステップＩＩで得られたＰ１０保護ペプチド樹脂０．１ｍｍｏｌ（０．４３ｇ）を秤取り、固相反応塔に加えた。次いで、ＤＭＦを加えて、３０分間窒素ガスでバブリングしながら湿潤した。２モル当量のFmoc-e-ACP-OH、次いで２モル当量のＤＢＬＫを加えてＦｍｏｃ保護基を外した。この溶液をＤＭＦで６回洗浄した。
ＦＩＴＣのＤＭＦ溶液（１．５モル当量）を樹脂に加えて、３モル当量のＤＩＥＡを滴下した。反応を２時間継続して、樹脂をＤＭＦで３回洗浄した。
樹脂から脱保護及び切断した後、ＨＰＬＣで粗１０Ａ−ＦＩＴＣを精製して、黄色の固体の形態の生成物（純度：９５％）を得た。図３に１０Ａ−ＦＩＴＣの構造を示す。
ステップＩＸ：１０Ｂ−ＦＩＴＣの合成
ステップＩＩで得られたＰ１０保護ペプチド樹脂０．１ｍｍｏｌ（０．４３ｇ）を秤取り、固相反応塔に加えた。次いで、ＤＭＦを加えて、３０分間窒素ガスでバブリングしながら湿潤した。２モル当量のFmoc-Lys(Dde)-OH、Fmoc-e-ACP-OH、次いで２モル当量のＤＢＬＫを加えてＦｍｏｃ保護基を外した。溶液をＤＭＦ６回洗浄した。
ＦＩＴＣのＤＭＦ溶液１．５モル当量を樹脂に加えて、３モル当量のＤＩＥＡを滴下した。反応を２時間継続して、樹脂をＤＭＦで３回洗浄した。
２％ヒドラジン水和物のＤＭＦ溶液を上記の樹脂に加えて、１５分間反応させた。これを２回繰り返して、ＤＭＦで６回洗浄した。
葉酸塩−ＮＨＳ（２モル当量）を秤取り、ＤＭＳＯに溶解させ、樹脂に加えて５分間反応させた。ＤＩＥＡ（２１ｍｌ、１２０ｍｍｏｌ）を滴下して、反応を室温で４時間継続した。反応生成物をＤＭＳＯ及びＤＭＦでそれぞれ３回洗浄して、メタノールで収縮させ、真空乾燥して、完全に保護されたペプチド樹脂を得た。
樹脂から脱保護及び切断した後、ＨＰＬＣで粗１０Ｂ−ＦＩＴＣを精製して黄色の固体の形態の生成物（純度：９５％）を得た。図３に１０Ｂ−ＦＩＴＣの構造を示す。
ステップＸ：ＬＤＣ１０Ｂ−ＣＹ５の合成
ステップＩＩで得られたＰ１０保護ペプチド樹脂０．１ｍｍｏｌ（０．４３ｇ）を秤取り、固相反応塔に加えた。次いで、ＤＭＦを加えて、３０分間窒素ガスでバブリングしながら湿潤した。２モル当量のFmoc-Lys(Dde)-OH、次いで２モル当量のＤＢＬＫを加えてＦｍｏｃ保護基を外した。溶液をＤＭＦで６回洗浄した。
１００ｍｇの蛍光色素Ｃｙ５、１．５モル当量のＨＡＴＵ、及びＨＯＢＴのＤＭＦ溶液（１．５モル当量）を樹脂に加えて、３モル当量のＤＩＥＡを滴下した。反応を２時間継続して、樹脂をＤＭＦで３回洗浄した。
２％ヒドラジン水和物のＤＭＦ溶液を上記の樹脂に加えて、１５分間反応させた。これを２回繰り返して、ＤＭＦで６回洗浄した。
葉酸塩−ＮＨＳ（２モル当量）を秤取り、ＤＭＳＯに溶解して、樹脂に加えた。５分間反応させて、ＤＩＥＡ（２１ｍｌ、１２０ｍｍｏｌ）を滴下し、反応を室温で４時間継続した。反応生成物をＤＭＳＯ及びＤＭＦでそれぞれ３回洗浄して、メタノールで収縮し、真空乾燥して完全に保護されたペプチド樹脂を得た。
樹脂から脱保護及び切断した後、ＨＰＬＣで粗ＬＤＣ１０Ｂ−ＣＹ５を精製して、黄色の固体の形態の生成物（純度：９５％）を得た。ＬＤＣ１０Ｂ−ＣＹ５は、蛍光プローブＣＹ５標識したＬＤＣ１０Ｂであり、二つのリガンド部位がリシンスペーサーを介してＣＹ５色素と結合している。
実施例ＩＩ：複合体の有効性アッセイ
以下の複合体が含まれる：ＬＤＣ１０Ｂ、ＬＤＣ１０ＢＸ、ＬＤＣ１０ＢＲ、ＬＤＣ１１Ｂ、ＬＤＣ１２Ｂ、ＬＤＣ１３Ｂ、ＬＤＣ１０１３、ＬＤＣ１０Ｈ、ＬＤＣ１１Ｈ、ＬＤＣ１３Ｈ、ＬＤＣ１、ＬＤＣ１０Ａ、ＬＤＣ１１Ａ、及びＬＤＣ１３Ａ。実験によってはＬＤＣ１、ＬＤＣ１０Ａ、ＬＤＣ１１Ａ、及びＬＤＣ１３Ａを対照として用いた。これらの構造は以下の通りである。
ＬＤＣ１：葉酸塩-(PEG)3-MC-Val-Cit-PAB-MMAE
ＬＤＣ１０Ａ：P10-MC-Val-Cit-PAB-MMAE
ＬＤＣ１１Ａ：P11-MC-Val-Cit-PAB-MMAE
ＬＤＣ１３Ａ：P13-MC-Val-Cit-PAB-MMAE
１．複合体ＬＤＣ１０Ｂのエンドサイトーシス試験
以下の複合体が含まれる：葉酸塩−ＦＩＴＣ（ＦＩＴＣ−ＡＣＰ−Ｌｙｓ（葉酸塩）−ＯＨ）、１０Ｂ−ＦＩＴＣ、及び１０Ａ−ＦＩＴＣ。
培地：ＲＰＭＩ１６４０培地、葉酸を含まない
実験方法：
１）ヒト鼻咽頭癌細胞株ＫＢ、メラノーマ細胞株Ａ３７５、ヒト肺癌細胞Ｈ４６０、卵巣癌細胞ＳＫＯＶ３、乳癌細胞株ＨＣＣ１９５４を、１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地で３７℃、５％ＣＯ2でインキュベートし、細胞を２〜３日ごとに継代培養した。
２）ヒト鼻咽頭癌細胞株ＫＢ、メラノーマ細胞株Ａ３７５、ヒト肺癌細胞Ｈ４６０、卵巣癌細胞ＳＫＯＶ３、乳癌細胞株ＨＣＣ１９５４を１ウェルにつき１×１０3細胞（９６ウェルプレート）で蒔いて、３７℃、５％ＣＯ2で８〜１２時間インキュベートした。
３）１μＭのＦＩＴＣ複合体または対照をプレートの細胞に加えて、３７℃で１０〜１５分間インキュベートした。次いで、ウェルの培地を吸引して取り除き、細胞をＰＢＳで３回洗浄した。
４）次いで、細胞を共焦点顕微鏡（ブランド）で撮像して、エンドサイトーシスを視覚化した。
結果及び分析：
葉酸塩リガンドを付加すると、二リガンドＬＤＣ１０Ｂに葉酸塩受容体仲介エンドサイトーシスをもたらす可能性があることを示すため、ＫＢ（葉酸塩受容体陽性細胞）及びＡ３７５（葉酸塩受容体陰性細胞）を１０Ａ−ＦＩＴＣ、葉酸塩−ＦＩＴＣ、及び１０Ｂ−ＦＩＴＣで調べた。図２に示すように、葉酸塩受容体仲介エンドサイトーシスにより葉酸塩−ＦＩＴＣはＫＢ（葉酸塩受容体陽性細胞）に入るが、Ａ３７５（葉酸塩受容体陰性細胞）には入らない（パネルＡ及びＢ）。一方、１０Ａ−ＦＩＴＣは、エンドサイトーシスがないために、いずれの細胞にも入ることができない（パネルＣ及びＤ）。しかしながら、葉酸塩リガンドを付加して１０Ａ−ＦＩＴＣを二リガンド複合体、すなわち１０Ｂ−ＦＩＴＣに転化すると、この複合体は葉酸塩受容体仲介エンドサイトーシスによりＫＢ（パネルＥ）に入る能力が与えられるが、Ａ３７５（パネルＦ）には入れない。さらに、５０ｍＭ（複合体の５０倍過剰）の遊離葉酸塩を含むインキュベート前のＫＢ細胞は、葉酸塩−ＦＩＴＣ及び１０Ｂ−ＦＩＴＣの両方のエンドサイトーシスを完全に阻止して（データは不図示）、実際にエンドサイトーシスが葉酸塩受容体によって仲介されたことを確認した。
２．複合体ＬＤＣ１０Ｂの細胞毒性試験
検査試料：ＬＤＣ１０Ｂ
対照試料：ＭＭＡＥ、ＬＤＣ１、ＬＤＣ１０Ａ
培地：ＲＰＭＩ１６４０培地、葉酸を含まない
実験方法：
１）ヒト鼻咽頭癌細胞株ＫＢ、メラノーマ細胞株Ａ３７５、ヒト肺癌細胞Ｈ１２９９、慢性骨髄白血病細胞株Ｋ５６２、ヒト肺癌細胞Ｈ４６０、卵巣癌細胞ＳＫＯＶ３、乳癌細胞株ＨＣＣ１９５４、ヒト胃癌細胞Ｎ８７、及びヒト乳癌細胞ＳＫ−ＢＲ−３を、１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地で３７℃、５％ＣＯ2でインキュベートし、細胞を２〜３日ごとに継代培養した。
２）ヒト鼻咽頭癌細胞株ＫＢ、メラノーマ細胞株Ａ３７５、ヒト肺癌細胞Ｈ１２９９、慢性骨髄白血病細胞株Ｋ５６２、ヒト肺癌細胞Ｈ４６０、卵巣癌細胞ＳＫＯＶ３、乳癌細胞株ＨＣＣ１９５４、ヒト胃癌細胞Ｎ８７、及びヒト乳癌細胞ＳＫ−ＢＲ−３を１ウェルあたり１×１０3細胞（９６ウェルプレート）で蒔いて、３７℃、５％ＣＯ2で８〜１２時間インキュベートした。
３）ＬＤＣ複合体または対照の貯蔵溶液をＰＢＳ溶液で調製した。１００μＬ／ウェルのＬＤＣ複合体または対照の連続希釈液をプレート内の試験細胞に加えて、３７℃、５％ＣＯ2で１５〜３０分間インキュベートした。次いで、ウェルの培地を吸引して取り除き、試験細胞を、複合体を含まない新しい培地（１５０μＬ／ウェル）で３７℃、５％ＣＯ2で２〜３日間インキュベートした。
４）CellTiter 96（登録商標）Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay（Promega社）を各ウェルに加えて、死んだ細胞の量を測定し、各プレートをインキュベーター内で３７℃、５％ＣＯ2で１時間インキュベートした。
５）各プレートをマイクロプレートリーダーにて４９０ｎｍで読み取り、ＬＤＣ複合体で処理した試験細胞と処理しなかった試験細胞の細胞生存数を比較した。５０％細胞死（ＩＣ50値）に必要なＬＤＣ薬物濃度を決定した。
結果及び分析：
ＬＤＣ１０Ｂは、以下の癌細胞を非常に効率的に殺すことができる：ヒト鼻咽頭癌細胞株ＫＢ、ヒト肺癌細胞Ｈ４６０、ヒト肺癌細胞Ｈ１２９９、慢性骨髄白血病細胞株Ｋ５６２、卵巣癌細胞ＳＫＯＶ３、乳癌細胞株ＨＣＣ１９５４、ヒト胃癌細胞Ｎ８７、ヒト乳癌細胞ＳＫ−ＢＲ−３。また、ＬＤＣ１０ＢのＩＣ50値はＬＤＣ１及びＬＤＣ１０Ａ対照よりも低かった（強かった）（表４を参照のこと）。これらの細胞株は、葉酸塩受容体及び／またはＴＲＰＶ６受容体の発現があることが知られている。しかしながら、ＬＤＣ１０Ｂの細胞毒性は、葉酸塩受容体の発現がないメラノーマ細胞株Ａ３７５に対して有意に低い（ＩＣ50の読み取りが高い）。
ＬＤＣ１０Ｂは、葉酸塩受容体とＴＲＰＶ６受容体の両方に結合することができる二リガンド−薬物複合体である。受容体陽性細胞株の場合、表５から分かるように、ＬＤＣ１０Ｂの細胞毒性は、単一リガンド−薬物複合体ＬＤＣ１またはＬＤＣ１０Ａに比べて２〜１５倍強かった（ＩＣ50値は２〜１５倍低かった）。葉酸塩受容体がないメラノーマ細胞株Ａ３７５では、ＬＤＣ１０Ｂは、ＬＤＣ１及びＬＤＣ１０Ａと同様に、毒性が約１５倍少なく、優れた特異性を示す。従って、二リガンド−薬物複合体ＬＤＣ１０Ｂは、相乗効果を示し、薬物の有効性に寄与している。
３．複合体ＬＤＣ１１Ｂの細胞毒性試験
検査試料：ＬＤＣ１１Ｂ
対照試料：ＭＭＡＥ、ＬＤＣ１、ＬＤＣ１１Ａ
培地：ＲＰＭＩ１６４０培地、葉酸を含まない
実験方法：
１）ヒト肺癌細胞Ｈ４６０、卵巣癌細胞ＳＫＯＶ３、ヒト腎臓胚細胞２９３Ａを、１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地で３７℃、５％ＣＯ2でインキュベートし、細胞を２〜３日ごとに継代培養した。
２）ヒト肺癌細胞Ｈ４６０、卵巣癌細胞ＳＫＯＶ３、ヒト腎臓胚細胞２９３Ａを１ウェルあたり１×１０3細胞（９６ウェルプレート）で蒔いて、３７℃、５％ＣＯ2で８〜１２時間インキュベートした。
３）ＬＤＣ複合体または対照の貯蔵溶液をＰＢＳ溶液で調製した。１００μＬ／ウェルのＬＤＣ複合体または対照の連続希釈液をプレート内の細胞に加えて、３７℃、５％ＣＯ2で１５〜３０分間インキュベートした。次いで、ウェルの培地を吸引して取り除き、複合体を含まない新しい培地（１５０μＬ／ウェル）で細胞を３７℃、５％ＣＯ2で２〜３日間インキュベートした。
４）CellTiter 96（登録商標）Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay（Promega社）を各ウェルに加えて、死んだ細胞の量を測定し、プレートをインキュベーター内で３７℃、５％ＣＯ2で１時間インキュベートした。
５）プレートをマイクロプレートリーダーにて４９０ｎｍで読み取り、ＬＤＣ複合体で処理した細胞および処理しなかった細胞の生存数を比較した。５０％細胞死（ＩＣ50値）に必要なＬＤＣ薬物濃度を決定した。
結果及び分析：
ＬＤＣ１１Ｂは以下の癌細胞を殺す、あるいはそれらの成長を阻害することができる：ヒト肺癌細胞Ｈ４６０、卵巣癌細胞ＳＫＯＶ３、ヒト腎臓胚細胞２９３Ａ。これらの細胞株は、葉酸塩受容体及び／またはＬＨＲＨ受容体の発現量が多いことが知られている。ＬＤＣ１１ＢのＩＣ50値は、ＬＤＣ１及びＬＤＣ１１Ａ対照よりも低かった（表５を参照のこと）。
ＬＤＣ１１Ｂは、葉酸塩受容体とＬＨＲＨ受容体の両方に結合することができる二リガンド−薬物複合体である。表５から分かるように、ＬＤＣ１１Ｂの細胞毒性は、単一リガンド複合体ＬＤＣ１またはＬＤＣ１１Ａよりもほぼ１０倍強かった（ＩＣ50値がほぼ１０倍低かった）。従って、二リガンド−薬物複合体ＬＤＣ１１Ｂは、相乗効果を示し、薬物の有効性に寄与している。
４．複合体ＬＤＣ１２Ｂの細胞毒性試験
検査試料：ＬＤＣ１２Ｂ
対照試料：ＭＭＡＥ
培地：ＲＰＭＩ１６４０培地、葉酸を含まない
実験方法：
１）ヒト子宮内膜癌細胞ＨＥＣ−１Ａ、ヒト胃癌細胞株ＧＴＬ−１６、ヒト大腸上皮性悪性腫瘍ＨＣＴ−１１６、ヒト神経芽細胞腫細胞株ＳＨ−ＳＹ５Ｙを、１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地で３７℃、５％ＣＯ2でインキュベートし、細胞を２〜３日ごとに継代培養した。
２）ヒト子宮内膜癌細胞ＨＥＣ−１Ａ、ヒト胃癌細胞株ＧＴＬ−１６、ヒト大腸上皮性悪性腫瘍ＨＣＴ−１１６、ヒト神経芽細胞腫細胞株ＳＨ−ＳＹ５Ｙを１ウェルあたり１×１０3細胞（９６ウェルプレート）で蒔いて、３７℃、５％ＣＯ2で８〜１２時間インキュベートした。
３）ＬＤＣ複合体または対照の貯蔵溶液をＰＢＳ溶液で調製した。１００μＬ／ウェルのＬＤＣ複合体または対照の連続希釈液をプレート内の細胞に加えて、３７℃、５％ＣＯ2で１５〜３０分間インキュベートした。次いで、ウェルの培地を吸引して取り除き、複合体を含まない新しい培地（１５０μＬ／ウェル）で細胞を３７℃、５％ＣＯ2で２〜３日間インキュベートした。
４）CellTiter 96（登録商標）Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay（Promega社）を各ウェルに加えて、死んだ細胞の量を測定し、プレートをインキュベーター内で３７℃、５％ＣＯ2で１時間インキュベートした。
５）プレートをマイクロプレートリーダーにて４９０ｎｍで読み取り、ＬＤＣ複合体で処理した細胞および処理しなかった細胞の生存数を比較した。５０％細胞死（ＩＣ50値）に必要なＬＤＣ薬物濃度を決定した。
結果及び分析：
ＬＤＣ１２Ｂは以下の癌細胞を殺す、あるいはそれらの成長を阻害することができる：ヒト子宮内膜癌細胞ＨＥＣ−１Ａ、ヒト胃癌細胞株ＧＴＬ−１６、ヒト大腸上皮性悪性腫瘍ＨＣＴ−１１６、ヒト神経芽細胞腫細胞株ＳＨ−ＳＹ５Ｙ。表６にＩＣ50値を示す。
５．複合体ＬＤＣ１３Ｂの細胞毒性試験
検査試料：ＬＤＣ１３Ｂ
対照試料：ＭＭＡＥ、ＬＤＣ１、ＬＤＣ１３Ａ
培地：ＲＰＭＩ１６４０培地、葉酸を含まない
実験方法：
１）ヒト鼻咽頭癌細胞株ＫＢ、ヒト大腸上皮性悪性腫瘍ＨＣＴ−１１６、ヒト前立腺癌細胞ＰＣ−３、ヒト胃癌細胞株ＧＴＬ−１６、ヒト子宮内膜癌細胞ＨＥＣ−１Ａ、及びヒト胃癌細胞Ｎ８７を、１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地で３７℃、５％ＣＯ2でインキュベートし、細胞を２〜３日ごとに継代培養した。
２）ヒト鼻咽頭癌細胞株ＫＢ、ヒト大腸上皮性悪性腫瘍ＨＣＴ−１１６、ヒト前立腺癌細胞ＰＣ−３、ヒト胃癌細胞株ＧＴＬ−１６、ヒト子宮内膜癌細胞ＨＥＣ−１Ａ、及びヒト胃癌細胞Ｎ８７を１ウェルあたり１×１０3細胞（９６ウェルプレート）で蒔いて、３７℃、５％ＣＯ2で８〜１２時間インキュベートした。
３）ＬＤＣ複合体または対照の貯蔵溶液をＰＢＳ溶液で調製した。１００μＬ／ウェルのＬＤＣ複合体または対照の連続希釈液をプレート内の細胞に加えて、３７℃、５％ＣＯ2で１５〜３０分間インキュベートした。次いで、ウェルの培地を吸引して取り除き、複合体を含まない新しい培地（１５０μＬ／ウェル）で細胞を３７℃、５％ＣＯ2で２〜３日間インキュベートした。
４）CellTiter 96（登録商標）Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay（Promega社）を各ウェルに加えて、死んだ細胞の量を測定し、プレートをインキュベーター内で３７℃、５％ＣＯ2で１時間インキュベートした。
５）プレートをマイクロプレートリーダーにて４９０ｎｍで読み取り、ＬＤＣ複合体で処理した細胞および処理しなかった細胞の生存数を比較した。５０％細胞死（ＩＣ50値）に必要なＬＤＣ薬物濃度を決定した。
結果及び分析：
ＬＤＣ１３Ｂは、以下の癌細胞を殺す、あるいはそれらの成長を阻害することができる：ヒト鼻咽頭癌細胞株ＫＢ、ヒト大腸癌細胞ＨＣＴ−１１６、ヒト胃癌細胞株ＧＴＬ−１６、ヒト子宮内膜癌細胞ＨＥＣ−１Ａ、ヒト前立腺癌細胞ＰＣ−３、ヒト胃癌Ｎ８７。特に、ＬＤＣ１３Ｂは、葉酸塩受容体及びＬＨＲＨ受容体の両方を有する細胞株であるＫＢに対して非常に効き目がある。さらに、二リガンドＬＤＣ１３Ｂは、単一リガンド−薬物複合体、すなわちＬＤＣ１及びＬＤＣ１３Ａの何れかよりも２〜１０倍効き目があり、二リガンド−薬物複合体の有効性についての利点が確認された。表７にＩＣ50値を示す。
６．複合体ＬＤＣ１０Ｈの細胞毒性試験
検査試料：ＬＤＣ１０Ｈ
対照試料：ＭＭＡＥ、ＬＤＣ１、ＬＤＣ１０Ａ
培地：ＲＰＭＩ１６４０培地、葉酸を含まない
実験方法：
１）ヒト肺癌細胞Ｈ１２９９、卵巣癌細胞ＳＫＯＶ３、乳癌細胞株ＨＣＣ１９５４、及びヒト肺癌細胞Ｈ４６０を、１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地で３７℃、５％ＣＯ2でインキュベートし、細胞を２〜３日ごとに継代培養した。
２）ヒト肺癌細胞Ｈ１２９９、卵巣癌細胞ＳＫＯＶ３、乳癌細胞株ＨＣＣ１９５４、及びヒト肺癌細胞Ｈ４６０を１ウェルあたり１×１０3細胞（９６ウェルプレート）で蒔いて、３７℃、５％ＣＯ2で８〜１２時間インキュベートした。
３）ＬＤＣ複合体または対照の貯蔵溶液をＰＢＳ溶液で調製した。１００μＬ／ウェルのＬＤＣ複合体または対照の連続希釈液をプレート内の細胞に加えて、３７℃、５％ＣＯ2で１５〜３０分間インキュベートした。次いで、ウェルの培地を吸引して取り除き、複合体を含まない新しい培地（１５０μＬ／ウェル）で細胞を３７℃、５％ＣＯ2で２〜３日間インキュベートした。
４）CellTiter 96（登録商標）Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay（Promega社）を各ウェルに加えて、死んだ細胞の量を測定し、プレートをインキュベーター内で３７℃、５％ＣＯ2で１時間インキュベートした。
５）プレートをマイクロプレートリーダーにて４９０ｎｍで読み取り、ＬＤＣ複合体で処理した細胞および処理しなかった細胞の生存数を比較した。５０％細胞死（ＩＣ50値）に必要なＬＤＣ薬物濃度を決定した。
結果及び分析：
ＬＤＣ１０Ｈは、以下の癌細胞を殺す、あるいはそれらの成長を阻害することができる：ヒト肺癌細胞Ｈ１２９９、卵巣癌細胞ＳＫＯＶ３、乳癌細胞株ＨＣＣ１９５４、及びヒト肺癌細胞Ｈ４６０。この二リガンドＬＤＣ１０Ｈは、一リガンド−薬物複合体ＬＤＣ１０Ａよりも１０倍以上効き目がある。この結果は、膜貫通ペプチド配列（Ｈ）がエンドサイトーシスによる薬物の細胞内への送達に役立つことができることを示している。さらに、ＬＤＣ１０Ｈはまた、単一リガンド複合体ＬＤＣ１よりも効き目があり、有効性について二リガンド−薬物複合体の利点が確認された。ＬＤＣ１０ＨのＩＣ50値は、ＬＤＣ１及びＬＤＣ１０Ａ対照よりも低かった（表８を参照のこと）。
７．複合体ＬＤＣ１０１３の細胞毒性試験
対照試料：ＭＭＡＥ、ＬＤＣ１、ＬＤＣ１０Ａ
培地：ＲＰＭＩ１６４０培地、葉酸を含まない
実験方法：
１）ヒト鼻咽頭癌細胞株ＫＢ、メラノーマ細胞株Ａ３７５、及びヒト肺癌細胞Ｈ４６０を、１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地で３７℃、５％ＣＯ2でインキュベートし、細胞を２〜３日ごとに継代培養した。
２）ヒト鼻咽頭癌細胞株ＫＢ、メラノーマ細胞株Ａ３７５、及びヒト肺癌細胞Ｈ４６０を１ウェルあたり１×１０3細胞（９６ウェルプレート）で蒔いて、３７℃、５％ＣＯ2で８〜１２時間インキュベートした。
３）ＬＤＣ複合体または対照の貯蔵溶液をＰＢＳ溶液で調製した。１００μＬ／ウェルのＬＤＣ複合体または対照の連続希釈液をプレート内の細胞に加えて、３７℃、５％ＣＯ2で１５〜３０分間インキュベートした。次いで、ウェルの培地を吸引して取り除き、複合体を含まない新しい培地（１５０μＬ／ウェル）で細胞を３７℃、５％ＣＯ2で２〜３日間インキュベートした。
４）CellTiter 96（登録商標）Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay（Promega社）を各ウェルに加えて、死んだ細胞の量を測定し、プレートをインキュベーター内で３７℃、５％ＣＯ2で１時間インキュベートした。
５）プレートをマイクロプレートリーダーにて４９０ｎｍで読み取り、ＬＤＣ複合体で処理した細胞および処理しなかった細胞の生存数を比較した。５０％細胞死（ＩＣ50値）に必要なＬＤＣ薬物濃度を決定した。
結果及び分析：
ＬＤＣ１０１３は、ヒト鼻咽頭癌細胞株ＫＢ、ヒト肺癌細胞Ｈ４６０の細胞株を殺すのに有効であり、またメラノーマ細胞株Ａ３７５の成長を阻害するのに有効である。ＬＤＣ１０１３のＩＣ50値は、ＬＤＣ１及びＬＤＣ１０Ａ対照よりも低かった（強かった）（表９を参照のこと）。しかしながら、ＬＤＣ１０１３の細胞毒性は、対照細胞株メラノーマ細胞株Ａ３７５に対しては有意に低い（ＩＣ50の読み取りが高い）。
ＬＤＣ１０１３は、ＬＨＲＨ受容体及びＴＲＰＶ６受容体の両方に結合することができる二リガンド−薬物複合体である。受容体陽性細胞株の場合、表９から分かるように、ＬＤＣ１０１３の細胞毒性は、単一リガンド−薬物複合体ＬＤＣ１またはＬＤＣ１０Ａに比べて２〜１５倍強かった（ＩＣ50値は２〜１５倍低かった）Ａ３７５の場合、ＬＤＣ１０１３はＨ４６０及びＫＢのそれぞれと比べて毒性が約１０〜１００倍低く、優れた特異性を示した。従って、二リガンド−薬物複合体ＬＤＣ１０１３は相乗効果を示し、薬物の有効性に寄与している。
８．複合体ＬＤＣ１０ＢＲの細胞毒性試験
対照試料：ＭＭＡＥ及びＬＤＣ１０Ｂ
培地：ＲＰＭＩ１６４０培地、葉酸を含まない
実験方法：
１）ヒト鼻咽頭癌細胞株ＫＢ、メラノーマ細胞株Ａ３７５、及びヒト肺癌細胞Ｈ４６０を、１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地で３７℃、５％ＣＯ2でインキュベートし、細胞を２〜３日ごとに継代培養した。
２）ヒト鼻咽頭癌細胞株ＫＢ、メラノーマ細胞株Ａ３７５、及びヒト肺癌細胞Ｈ４６０を１ウェルあたり１×１０3細胞（９６ウェルプレート）で蒔いて、３７℃、５％ＣＯ2で８〜１２時間インキュベートした。
３）ＬＤＣ複合体または対照の貯蔵溶液をＰＢＳ溶液で調製した。１００μＬ／ウェルのＬＤＣ複合体または対照の連続希釈液をプレート内の細胞に加えて、３７℃、５％ＣＯ2で１５〜３０分間インキュベートした。次いで、ウェルの培地を吸引して取り除き、複合体を含まない新しい培地（１５０μＬ／ウェル）で細胞を３７℃、５％ＣＯ2で２〜３日間インキュベートした。
４）CellTiter 96（登録商標）Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay（Promega社）を各ウェルに加えて、死んだ細胞の量を測定し、プレートをインキュベーター内で３７℃、５％ＣＯ2で１時間インキュベートした。
５）プレートをマイクロプレートリーダーにて４９０ｎｍで読み取り、ＬＤＣ複合体で処理した細胞および処理しなかった細胞の生存数を比較した。５０％細胞死（ＩＣ50値）に必要なＬＤＣ薬物濃度を決定した。
結果及び分析：
ＬＤＣ１０ＢＲは、ヒト鼻咽頭癌細胞株ＫＢ、ヒト肺癌細胞Ｈ４６０の細胞株を殺すのに有効であり、メラノーマ細胞株Ａ３７５の成長を阻害するのに有効である。ＬＤＣ１０ＢＲのＩＣ50値は、二リガンド複合体ＬＤＣ１０Ｂと同等であった（表１０を参照のこと）。
ＬＤＣ１０ＢＲは、ＲＧＤ（インテグリンα）受容体、葉酸塩受容体、及びＴＲＰＶ６受容体に結合することができる三リガンド−薬物複合体である。受容体陽性細胞株の場合、表１０から分かるように、ＬＤＣ１０ＢＲの細胞毒性は二リガンド複合体ＬＤＣ１０Ｂと同等であった。従って、三リガンド−薬物複合体ＬＤＣ１０ＢＲは、少なくとも二リガンドＬＤＣ１０Ｂと同じくらい有効である。さらに、三リガンドＬＤＣは、上記の３種の受容体すべてを発現させている癌細胞に対して優れた細胞毒性及び選択性を有する可能性があり、３種のリガンドが相乗効果を示し、薬物の有効性に寄与している。
実施例ＩＩＩ：動物モデルでの複合体の有効性研究
目的：癌治療のためのマウスモデルにおける複合体の抗腫瘍有効性を調べること
１．複合体ＬＤＣ１０Ｂ及びＬＤＣ１０Ｈの異種移植腫瘍に対する阻害アッセイ
治療に用いられた複合体：ＬＤＣ１０Ｂ、ＬＤＣ１０Ｈ
動物：６〜８週齢のメスのヌードマウス
実験方法：
１）ヒト大細胞肺癌細胞Ｈ４６０、ヒト肺癌細胞Ａ５４９、卵巣癌細胞ＳＫＯＶ３、及び乳癌細胞株ＨＣＣ１９５４を、１０％ウシ胎児血清を含むＩＭＤＭ培地で３７℃、５％ＣＯ2でインキュベートして、細胞を２〜３日ごとに継代培養した。
２）腫瘍の発生：７×１０6個の腫瘍細胞をヌードマウスの背中に皮下注射した。腫瘍寸法が１００〜２００ｍｍ3程度になった後、マウスを治療のためにグループ分けした。
３）治療：３マウス／群をＬＤＣ１０Ｂ、ＬＤＣ１０Ｈ、対照のＭＭＡＥ及びＰＢＳで治療した。５ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇの投与量で、５日ごとに３回注射した。
４）動物の物理的性能、体重、及び腫瘍寸法を監視した。実験中に動物の死亡数を記録した。
結果及び分析：
ＬＤＣ１０Ｂ及びＬＤＣ１０Ｈは、ヒト大細胞肺癌細胞Ｈ４６０、卵巣癌細胞ＳＫＯＶ３、及び乳癌細胞株ＨＣＣ１９５４の腫瘍の成長を阻害することができ、大部分の腫瘍は、５ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇの投与量で３回の注射を行った後に消失した。表１１及び表１２に詳細な結果を示す。
２．複合体ＬＤＣ１１Ａ、ＬＤＣ１１Ｂの異種移植腫瘍に対する阻害アッセイ
治療に用いられた複合体：ＬＤＣ１１Ａ及びＬＤＣ１１Ｂ
動物：６〜８週齢のメスのヌードマウス
実験方法：
１）ヒト大細胞肺癌細胞Ｈ４６０、卵巣癌細胞ＳＫＯＶ３、乳癌細胞株ＨＣＣ１９５４、及びヒト乳癌細胞ＳＫ−ＢＲ−３を、１０％ウシ胎児血清を含むＩＭＤＭ培地で３７℃、５％ＣＯ2でインキュベートし、細胞を２〜３日ごとに継代培養した。
２）腫瘍の発生：７×１０6個の腫瘍細胞をヌードマウスの背中に皮下注射した。腫瘍寸法が１００〜２００ｍｍ3程度になった後、マウスを治療のためにグループ分けした。
３）治療：３マウス／群をＬＤＣ１１Ａ、ＬＤＣ１１Ｂ、対照のＭＭＡＥ及びＰＢＳで治療した。５ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇの投与量で、５日ごとに３回注射した。
４）動物の物理的性能、体重、及び腫瘍寸法を監視した。実験中に動物の死亡数を記録した。
結果及び分析：
ＬＤＣ１１Ｂは、ヒト大細胞肺癌細胞Ｈ４６０、卵巣癌細胞ＳＫＯＶ３、及び乳癌細胞株ＨＣＣ１９５４の腫瘍の成長を阻害することができ、１０ｍｇ／ｋｇの投与量で続けて３回注射した後にほとんどの腫瘍は消失した。ＬＤＣ１１Ａに関しては、その強い毒性のために１回目の注射の後で動物は死亡した。表１３及び表１４に詳細な結果を示す。
３．複合体ＬＤＣ１３Ｂの異種移植腫瘍に対する阻害アッセイ
治療に用いられた複合体：ＬＤＣ１３Ｂ
動物：６〜８週齢のメスのヌードマウス
実験方法：
１）ヒト大細胞肺癌細胞Ｈ４６０を、１０％ウシ胎児血清を含むＩＭＤＭ培地で３７℃、５％ＣＯ2でインキュベートし、細胞を２〜３日ごとに継代培養した。
２）腫瘍の発生：７×１０6個の腫瘍細胞をヌードマウスの背中に皮下注射した。腫瘍寸法が２００ｍｍ3程度になった後、マウスを治療のためにグループ分けした。
３）治療：３マウス／群をＬＤＣ１３Ｂ、対照のＭＭＡＥ及びＰＢＳで治療した。２．５ｍｇ／ｋｇ及び５ｍｇ／ｋｇの投与量で３日ごとに４回注射した。
４）動物の物理的性能、体重、及び腫瘍寸法を監視した。実験中に動物の死亡数を記録した。
結果及び分析：
ＬＤＣ１３Ｂは、ヒト大細胞肺癌細胞Ｈ４６０の腫瘍の成長を阻害することができる。ほどんどの腫瘍は２．５ｍｇ／ｋｇで急速に縮小し、５ｍｇ／ｋｇの投与量で４回の注射を行った後では完全に消滅した。表１５に詳細な結果を示す。
４．複合体ＬＤＣ１０１３の異種移植腫瘍に対する阻害アッセイ
治療に用いられた複合体：ＬＤＣ１０１３
動物：６〜８週齢のメスのヌードマウス
実験方法：
１）ヒト乳癌細胞ＨＣＣ１９５４を、１０％ウシ胎児血清を含むＩＭＤＭ培地で３７℃、５％ＣＯ2でインキュベートし、細胞を２〜３日ごとに継代培養した。
２）腫瘍の発生：７×１０6個の腫瘍細胞をヌードマウスの背中に皮下注射した。腫瘍寸法が１８０〜３２０ｍｍ3程度になった後、マウスを治療のためにグループ分けした。
３）治療：３マウス／群をＬＤＣ１０１３、対照のＭＭＡＥ及びＰＢＳで治療した。２．５ｍｇ／ｋｇ及び５ｍｇ／ｋｇの投与量で３日ごとに４回注射した。
４）動物の物理的性能、体重、及び腫瘍寸法を監視した。実験中に動物の死亡数を記録した。
結果及び分析：
ＬＤＣ１０１３は、２．５ｍｇ／ｋｇの投与量を７回、５ｍｇ／ｋｇの投与量を７回、それぞれ３日ごとに注射した後、ＨＣＣ１９５４異種移植腫瘍を完全に取り除くことができる。表１６に詳細な結果を示す。
５．複合体ＬＤＣ１０ＢＸの異種移植腫瘍に対する阻害アッセイ
治療に用いられた複合体：ＬＤＣ１０ＢＸ
動物：６〜８週齢のメスのヌードマウス
実験方法：
１）ヒト肺癌細胞Ｈ４６０を、１０％ウシ胎児血清を含むＩＭＤＭ培地で３７℃、５％ＣＯ2でインキュベートし、細胞を２〜３日ごとに継代培養した。
２）腫瘍の発生：７×１０6個の腫瘍細胞をヌードマウスの背中に皮下注射した。腫瘍寸法が１８０〜３２０ｍｍ3程度になったら、マウスを治療のためにグループ分けした。
３）治療：３マウス／群をＬＤＣ１０ＢＸと対照ＬＤＣ１３Ａで治療した。１０ｍｇ／ｋｇの投与量を３日ごとに３回注射した。
４）動物の物理的性能、体重、及び腫瘍寸法を監視した。実験中に動物の死亡数を記録した。
結果及び分析：
ＬＤＣ１０ＢＸは、１０ｍｇ／ｋｇの投与量を３回、３日ごとに注射した後でＨ４６０異種移植腫瘍を取り除いた。
６．異種移植腫瘍モデルでの複合体濃度の検出
試料：ＬＤＣ１０Ｂ、ＬＤＣ１０Ｈ
動物：６〜８週齢のメスのヌードマウス
実験方法：
１）ヒト卵巣癌細胞ＳＫＯＶ３及び乳癌細胞株ＨＣＣ１９５４を、１０％ウシ胎児血清を含むＩＭＤＭ培地で３７℃、５％ＣＯ2でインキュベートし、細胞を２〜３日ごとに継代培養した。
２）腫瘍の発生：７×１０6個の腫瘍細胞をヌードマウスの背中に皮下注射した。腫瘍寸法が１００〜２００ｍｍ3程度になった後、マウスを治療のためにグループ分けした。
３）治療：３マウス／群、１０ｍｇ／ｋｇ、腹膜注射
４）血液採取：治療前に血液を採取した時間を０とし、血液を治療の２０分後、２時間後、４時間後、及び２４時間後に採取した。血液を遠心分離して、血清を採取し、冷凍保存した。
５）検出：血清中のＭＭＡＥ、ＬＤＣ１０Ｂ、ＬＤＣ１０Ｈと、ＬＤＣ１０Ｂ及びＬＤＣ１０ＨのＭＭＡＥ代謝物質の合計量をマウス抗MMAE ELISAキットにより検出した。
結果及び分析：
治療の２４時間後の血清中で微量のＬＤＣ１０Ｂが検出されたが、ＬＤＣ１０Ｈ及びそのＭＭＡＥ代謝物質は検出されなかった。このことは、遊離薬物は生体内で速く排泄／代謝されたことを示す。表１７に詳細な結果を示す。
上記を考慮し、生体外及び生体内での研究から以下のことが判明した。
（ａ）多リガンド−薬物複合体（ｍＬＤＣ）は、標的細胞に結合する、かつ／またはエンドサイトーシスにより標的細胞内に入って、細胞毒性ペイロードの効果により細胞を殺す。２０種を超える異なる癌細胞株を試験して、その結果、この結論が確認された。
（ｂ）生きている動物の生体内撮像から、蛍光標識ＬＤＣ１０Ｂ−Ｃｙ５は、その場の腫瘤に集中し、２４時間以上継続することが示された（図４を参照のこと）。
（ｃ）ｍＬＤＣは、マウスモデルの異種移植腫瘍を完全に取り除くことができる。大部分のリード化合物は、体重の低下や他の明らかな毒性を引き起こさず、投与量及び受容体発現に依存した形で異種移植腫瘍を制御または除去する優れた有効性を示した。腫瘍が完全に除去されると、マウスはその後の生涯に渡って（６ヶ月超）腫瘍が見られなかった。

Claims (55)

  1. １種のペイロード及び２種以上の細胞相互作用分子を含み、前記ペイロードは前記細胞相互作用分子のうちの少なくとも１種に結合されている複合体化合物またはその医薬的に許容される塩。
  2. 前記ペイロードは前記細胞相互作用分子のうちの少なくとも１種にリンカーを介して結合されている、請求項１に記載の複合体化合物またはその医薬的に許容される塩。
  3. 前記細胞相互作用分子のうちの少なくとも１種は細胞表面受容体に特異的に結合することができる、請求項１または２に記載の複合体化合物またはその医薬的に許容される塩。
  4. 前記細胞相互作用分子のうちの少なくとも２種は、細胞表面受容体に特異的に結合することができるリガンドである、請求項１〜３の何れか一項に記載の複合体化合物またはその医薬的に許容される塩。
  5. 前記細胞相互作用分子のうちの少なくとも１種は、エンドサイトーシスを仲介することができるエンドサイトーシス分子である、請求項１〜４の何れか一項に記載の複合体化合物またはその医薬的に許容される塩。
  6. 第一の細胞表面受容体に特異的に結合することができる第一のリガンド、及び第二の細胞表面受容体に特異的に結合することができる第二のリガンドを含む、請求項１〜５の何れか一項に記載の複合体化合物またはその医薬的に許容される塩。
  7. 前記ペイロードは前記第一のリガンドに結合され、前記第一のリガンドは前記第二のリガンドに結合されている、請求項６に記載の複合体化合物またはその医薬的に許容される塩。
  8. 前記第一のリガンドは前記第二のリガンドにスペーサーを介して結合されている、請求項７に記載の複合体化合物またはその医薬的に許容される塩。
  9. 前記スペーサーは、配列番号１〜１４のアミノ酸配列、Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ、Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ、Ｐｒｏ−Ａｒｇ、及びＰｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙからなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の複合体化合物またはその医薬的に許容される塩。
  10. 前記ペイロードは前記第一のリガンド及び前記第二のリガンドのそれぞれと直接結合されている、請求項６に記載の複合体化合物またはその医薬的に許容される塩。
  11. 前記ペイロードは前記第一のリガンドに第一のリンカーを介して結合され、前記第二のリガンドに第二のリンカーを介して結合されている、請求項６に記載の複合体化合物またはその医薬的に許容される塩。
  12. 第三の細胞表面受容体に特異的に結合することができる第三のリガンドをさらに含む、請求項６〜１１の何れか一項に記載の複合体化合物またはその医薬的に許容される塩。
  13. 前記第一の細胞表面受容体、前記第二の細胞表面受容体、及び前記第三の細胞表面受容体は互いに異なる、請求項１２に記載の複合体化合物またはその医薬的に許容される塩。
  14. 前記第一のリガンド、前記第二のリガンド、及び前記第三のリガンドは同じである、請求項６〜１３の何れか一項に記載の複合体化合物またはその医薬的に許容される塩。
  15. １種、２種、３種、または４種以上のペイロードを含む、請求項１〜１４の何れか一項に記載の複合体化合物またはその医薬的に許容される塩。
  16. 前記ペイロードは、小分子化合物、ヌクレオチド、ペプチド、タンパク質、及びナノ粒子からなる群より選択される、請求項１〜１５の何れか一項に記載に記載の複合体化合物またはその医薬的に許容される塩。
  17. 前記ペイロードは小分子化合物である、請求項１６に記載の複合体化合物またはその医薬的に許容される塩。
  18. 前記小分子化合物は、メイタンシン及びその任意の誘導体、タキシノール及びその任意の誘導体、オーリスタチン及びその任意の誘導体、エポチロン及びその任意の誘導体、ブレオマイシン及びその任意の誘導体、ダクチノマイシン及びその任意の誘導体、プリカマイシン及びその任意の誘導体、及びマイトマイシンＣからなる群より選択される、請求項１７に記載の複合体化合物またはその医薬的に許容される塩。
  19. 前記小分子化合物はオーリスタチンまたはその任意の誘導体である、請求項１８に記載の複合体化合物またはその医薬的に許容される塩。
  20. 前記エンドサイトーシス分子は、葉酸塩及びそれらの類縁体、エンドサイトーシスを仲介することができるペプチド、及び細胞貫通ペプチドからなる群より選択される、請求項５〜１９の何れか一項に記載の複合体化合物またはその医薬的に許容される塩。
  21. 前記エンドサイトーシス分子は、葉酸塩及びそれらの類縁体、及びエンドサイトーシスを仲介することができるペプチドからなる群より選択される、請求項５〜１９の何れか一項に記載の複合体化合物またはその医薬的に許容される塩。
  22. 前記葉酸塩の類縁体は５−メチルテトラヒドロ葉酸塩、５−ホルミルテトラヒドロ葉酸塩、スルファニルアミド、メトトレキサート、及び５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸塩からなる群より選択される、請求項２０または２１に記載の複合体化合物またはその医薬的に許容される塩。
  23. 前記細胞貫通ペプチドは腫瘍吸収性ペプチド、ミトコンドリア貫通ペプチド、活性化可能な細胞貫通ペプチド、及び抗菌性ペプチドからなる群より選択される、請求項２０に記載の複合体化合物またはその医薬的に許容される塩。
  24. 前記細胞貫通ペプチドは、配列番号１９または配列番号２０のアミノ酸配列を含む、請求項２０に記載の複合体化合物またはその医薬的に許容される塩。
  25. 前記エンドサイトーシスを仲介することができるペプチドは、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ、及び配列番号１６〜１８のアミノ酸配列の何れかと少なくとも７０％の相同性を有するアミノ酸配列を有する相同体ペプチドからなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、前記相同体ペプチドは配列番号１６〜１８の何れか１種のペプチドと機能的均等物である、請求項２１に記載の複合体化合物またはその医薬的に許容される塩。
  26. 前記第一のリガンド、前記第二のリガンド、及び前記第三のリガンドは独立して、ペプチド、葉酸塩及びそれらの類縁体からなる群より選択される、請求項１２に記載の複合体化合物またはその医薬的に許容される塩。
  27. 前記ペプチドは、配列番号１５、及び配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも７０％の相同性を有するアミノ酸配列を有する相同体ペプチドからなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、前記相同体ペプチドは配列番号１５のペプチドの機能的均等物である、請求項２６に記載の複合体化合物またはその医薬的に許容される塩。
  28. 前記ペプチドは、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ、及び配列番号１６〜１８のアミノ酸配列の何れかと少なくとも７０％の相同性を有するアミノ酸配列を有する相同体ペプチドからなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、前記相同体ペプチドは配列番号１６〜１８のペプチドの何れか１種の機能的均等物である、請求項２６に記載の複合体化合物またはその医薬的に許容される塩。
  29. 前記葉酸塩の類縁体は、５−メチルテトラヒドロ葉酸塩、５−ホルミルテトラヒドロ葉酸塩、スルファニルアミド、メトトレキサート、及び５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸塩からなる群より選択される、請求項２６に記載の複合体化合物またはその医薬的に許容される塩。
  30. 前記リンカーは、ペプチドリンカー、ジスルフィドリンカー、またはｐＨ依存リンカーである、請求項２〜２９の何れか一項に記載の複合体化合物またはその医薬的に許容される塩。
  31. 前記ペプチドリンカーは、プロテアーゼによる切断または還元により特定の生理学的環境下で切断可能である、請求項３０に記載の複合体化合物またはその医薬的に許容される塩。
  32. 前記ペプチドリンカーは、バリン−シトルリン、フェニルアラニン−リシン、及びバリン−リシンからなる群より選択される、請求項３０または３１に記載の複合体化合物またはその医薬的に許容される塩。
  33. 前記ジスルフィドリンカーは、ＤＭＤＳ、ＭＤＳ、ＤＳＤＭ、及びＮＤＭＤＳからなる群より選択される、請求項３２に記載の複合体化合物またはその医薬的に許容される塩。
  34. 前記ｐＨ依存リンカーはシス−アコニット酸無水物である、請求項３０に記載の複合体化合物またはその医薬的に許容される塩。
  35. 前記第一の細胞表面受容体、前記第二の細胞表面受容体、及び前記第三の細胞表面受容体は独立して、トランスフェリン受容体（ＴＦＲ）、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）、葉酸塩受容体（ＦＲ）、尿酸キナーゼ受容体、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、ＳＳＴ−１４受容体、ＬＨＲＨ受容体、ＴＲＰＶ６受容体、及びプロテアーゼ表面抗原受容体からなる群より選択される、請求項１２〜３４の何れか一項に記載の複合体化合物またはその医薬的に許容される塩。
  36. 前記複合体化合物は以下の化合物：ＬＤＣ１０Ｂ、ＬＤＣ１０ＢＲ、ＬＤＣ１０ＢＸ、ＬＤＣ１１Ｂ、ＬＤＣ１２Ｂ、ＬＤＣ１３Ｂ、ＬＤＣ１０１３、ＬＤＣ１０Ｈ、ＬＤＣ１１Ｈ、ＬＤＣ１２Ｈ、及びＬＤＣ１３Ｈからなる群より選択される、請求項１〜３５の何れか一項に記載の複合体化合物またはその医薬的に許容される塩。
  37. ペイロード、第一のエンドサイトーシス分子、及び第二のエンドサイトーシス分子を含み、前記第一のエンドサイトーシス分子は前記第二のエンドサイトーシス分子と同じである、請求項１に記載の複合体化合物またはその医薬的に許容される塩。
  38. ペイロード、第一のエンドサイトーシス分子、及び第二のエンドサイトーシス分子を含み、前記第一のエンドサイトーシス分子は前記第二のエンドサイトーシス分子と異なる、請求項１に記載の複合体化合物またはその医薬的に許容される塩。
  39. 前記第一のエンドサイトーシス分子は細胞貫通分子である、請求項３８に記載の複合体化合物またはその医薬的に許容される塩。
  40. ペイロード、第一の細胞表面受容体に結合することができる第一の細胞相互作用分子、及び第二の細胞表面受容体に結合することができる第二の細胞相互作用分子を含み、前記第一の細胞相互作用分子は前記第二の細胞相互作用分子と同じである、請求項１に記載の複合体化合物またはその医薬的に許容される塩。
  41. ペイロード、細胞表面受容体に特異的に結合するリガンド、及びエンドサイトーシス分子を含む、請求項１に記載の複合体化合物またはその医薬的に許容される塩。
  42. 第三の細胞相互作用分子をさらに含み、前記第三の細胞相互作用分子はエンドサイトーシス分子である、請求項３７〜４１の何れか一項に記載の複合体化合物またはその医薬的に許容される塩。
  43. 請求項１〜４２の何れか一項に記載の複合体化合物またはその医薬的に許容される塩、及び医薬的に許容される担体を含む医薬品組成物。
  44. 静脈内投与、皮下投与、経口投与、筋肉内投与、または心室内投与される、請求項４３に記載の医薬品組成物。
  45. 請求項１〜４２の何れか一項に記載の複合体化合物またはその医薬的に許容される塩、あるいは請求項４３または４４に記載の医薬品組成物の治療有効量を必要とする対象に投与することを含む、対象にペイロードを送達するための方法。
  46. 請求項１〜４２の何れか一項に記載の複合体化合物またはその医薬的に許容される塩、あるいは請求項４３または４４に記載の医薬品組成物の治療有効量を対象に投与することを含む、対象の病気を治療するための方法。
  47. 前記病気は、癌、免疫疾患、心臓血管疾患、代謝疾患、及び神経疾患からなる群より選択される、請求項４６に記載の方法。
  48. 前記癌は、乳癌、肺癌、前立腺癌、腎臓癌、白血病、卵巣癌、胃癌、子宮癌、子宮内膜上皮性悪性腫瘍、肝臓癌、大腸癌、甲状腺癌、脾臓癌、結腸直腸癌、食道癌、皮膚癌、リンパ腫、多発性骨髄腫からなる群より選択される、請求項４７に記載の方法。
  49. 前記免疫疾患は自己免疫疾患である、請求項４７に記載の方法。
  50. 前記自己免疫疾患は、結合組織疾患、全身性硬化、リウマチ性関節炎、及び全身性紅斑性狼瘡からなる群より選択される、請求項４９に記載の方法。
  51. 前記心臓血管疾患は、狭心症、心筋梗塞、脳卒中、心臓発作、高血圧性心疾患、リウマチ性心疾患、心筋症、心臓不整脈、及び先天性心疾患からなる群より選択される、請求項４７に記載の方法。
  52. 前記代謝疾患は、糖尿病、痛風、肥満、低血糖症、高血糖症、及び脂質異常からなる群より選択される、請求項４７に記載の方法。
  53. 前記神経疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、頭部外傷、多発性硬化症、めまい、昏睡、及びてんかんからなる群より選択される、請求項４７に記載の方法。
  54. 前記方法は、前記複合体化合物またはその医薬的に許容される塩、あるいは前記医薬品組成物を１種以上の治療薬と組み合わせて投与することをさらに含む、請求項４６〜５３の何れか一項に記載の方法。
  55. 前記治療薬は、抗癌治療標的を標的とする、癌に対する免疫応答を誘発または促進する、あるいは化学療法薬である、請求項５４に記載の方法。
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