JP2015519339A

JP2015519339A - 癌の処置のためのタンパク質の部位特異的標識及び標的送達

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Publication number: JP2015519339A
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Inventors: クランツ，アレクサンダー
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Priority date: 2012-05-11
Filing date: 2013-05-13
Publication date: 2015-07-09
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Abstract

本発明は、（1）抗癌剤ファーマコフォア、（2）癌細胞表面上のバイオマーカーに対するリガンド、及び/又は（3）別のタンパク質分子、との結合のために化学修飾されたタンパク質からのタンパク質コンジュゲートの形成に関する。本発明は、腫瘍並びに腫瘍血管系標的化及び癌処置のための新規な組成物、方法及び組合せを提供及び明示する。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、2012年5月11日に出願された米国特許仮出願第61/688,308号、2012年8月1日に出願された米国特許仮出願第61/741,984号、2013年1月7日に出願された米国特許仮出願第61/848,601号、及び2013年1月17日に出願された米国特許仮出願第61/849,034号の利益を主張し、これらのそれぞれは、その全体を参照により本明細書に組み入れられる。

発明の分野
本発明は、（1）抗癌剤ファーマコフォア、（2）癌細胞表面上のバイオマーカーに対するリガンド、及び/又は（3）別のタンパク質分子、との結合のために化学修飾されたタンパク質からのタンパク質コンジュゲートの形成に関する。本発明は、腫瘍並びに腫瘍血管系標的化及び癌処置のための新規な組成物、方法及び組合せを提供及び明示する。本発明は、抗癌剤ファーマコフォア若しくは癌細胞表面上のバイオマーカーに対するリガンドを結合するのに利用することができ、又はそれらの作用の持続期間の延長及びT細胞が媒介する抗腫瘍免疫のため、そのままでも治療薬として使用することができる、組換えによって生成された融合タンパク質もまた明示する。本発明は、腫瘍細胞に対する標的療法のための、新規な架橋タンパク質の使用にも関する。本発明は特に、様々な化学療法剤へのアネキシンタンパク質の部位特異的架橋に関し、又は抗癌剤若しくは細胞表面バイオマーカーに対するリガンドに結合し得るマルチマーアネキシンタンパク質の形成に関する。

アポトーシス研究への関心が高まり、アネキシンVのホスファチジルセリン結合特性が発見されると、細胞死検出技術及びアネキシンが媒介する細胞標的化の開発が活発になった。

癌は、最も一般的な死亡原因のうちの1つであり、世界中で毎年700万近い命を奪っている。治療用抗体又は低分子を用いる新たな癌標的療法により、処置はより腫瘍特異的になり、毒性が減じた。この結果、抗癌剤を要する標的療法が精力的に追い求められており、その理由については以下に述べる。

大半の低分子薬物は、静脈内に与えられた場合、大容積で分布している。このような処置の結果、しばしば、治療指数が正常組織中での高レベルの毒性のため狭域になる。抵抗性を克服するため又は効力を増大させるために化学療法剤の用量を増やすと、大抵の場合、毒性の副作用が生じ、一般には、従来の抗腫瘍剤の有効性を限定してしまう。

アネキシンタンパク質等の高分子キャリアと化学療法剤とが結合していれば、遊離薬物の分布容積が著しく低減され得るので、遊離薬物の濃度を腫瘍又は腫瘍内皮の中に向かっていくにつれて濃くすることができ、結果として、非特異的毒性の量及び種類を減少し、薬物要素の投薬当量当たりで腫瘍に効果的に送達され得る薬物の量を増大することができる。

第1の態様において、本発明は、式（I）の構造：

〔式中、
Pは、モノマータンパク質又はマルチマータンパク質を表し、Pは、細胞標的化タンパク質、細胞結合タンパク質、細胞トラフィッキングタンパク質（cell-trafficking protein）及び輸送タンパク質又はこれらの任意の組合せから独立に選択される1個、2個、3個又は4個のタンパク質を含み、
各Lは独立に、有機リンカー基を表し、
各Tは独立に、治療薬、タンパク質、又はバイオマーカーに対するリガンドを表し、
nは、0から10までの整数であり、
存在する各L-T部分は、Pのアミノ酸残基に部位特異的に結合している。〕
を有する治療用タンパク質を含む医薬組成物であって、
式（I）の化合物は、医薬組成物中に存在する生物活性タンパク質の少なくとも約75％に相当する、医薬組成物を特徴とする。

いくつかの実施形態において、nは、1から10までの整数である。

別の実施形態において、nは0である。

特定の実施形態において、Pは、モノマータンパク質を表す。

さらに別の実施形態において、Pは、マルチマータンパク質（例えば、ダイマー、トリマー又はテトラマー）を表す。

特定の実施形態において、Pは、癌細胞を標的とする細胞結合タンパク質であるタンパク質を含む。

別の実施形態において、Pは、アネキシンタンパク質、シナプトタグミンタンパク質、ラクトアドヘリン、α-フェトプロテイン、レプチン、トランスフェリンタンパク質若しくはヒト血清アルブミン、又は前記タンパク質のいずれかに対して少なくとも90％の配列同一性を有するタンパク質である、タンパク質を含む。

さらなる実施形態において、Pは、アネキシンタンパク質、シナプトタグミンタンパク質、ラクトアドヘリン、α-フェトプロテイン、レプチン、トランスフェリンタンパク質又はヒト血清アルブミンである、タンパク質を含む。

別の実施形態において、Pは、アネキシンタンパク質、求電子性カルボニルを含む修飾アミノ酸残基を含むアネキシンタンパク質、又はアネキシンタンパク質に対して少なくとも90％の配列同一性を有するタンパク質を含み、場合により前記タンパク質は、溶媒接触可能チオール（例えば、そのチオールを求電子性試薬又は本明細書に記載の別の試薬によって処理したとき、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％又は少なくとも95％のチオールが官能化されるチオール）を含む。

いくつかの実施形態において、Pは、アネキシンV、アネキシンV-128、アネキシンVに対して少なくとも90％の配列同一性を有するタンパク質、アネキシンV-128に対して少なくとも90％の配列同一性を有するタンパク質、又はこれらのタンパク質の任意の組合せを含む。

さらに別の実施形態において、Pは、アネキシンVを含む、又はPは、アネキシンVに対して少なくとも95％の配列同一性を有し且つアネキシンV-128ではないタンパク質を含む。

特定の実施形態において、Pは、アネキシンV-128を含む、又はPは、アネキシンV-128に対して少なくとも95％の配列同一性を有し且つアネキシンVではないタンパク質を含む。

別の実施形態において、Pは、RGD配列を含むように修飾されたアネキシンタンパク質を含む。

特定の実施形態において、Pは、アルデヒド又はケトンを含むように修飾されたアネキシンタンパク質を含む。

さらなる実施形態において、Pは、アルデヒド又はケトンを含むように修飾されたアネキシンタンパク質を含む。

いくつかの実施形態において、Pは、N末端残基にカルボニル基を含むように修飾されたアネキシンタンパク質を含む。

さらに別の実施形態において、Pは、N末端残基にアルデヒド基を含むように修飾されたアネキシンタンパク質を含む。

さらなる実施形態において、カルボニル基には、芳香族アミンによる還元的アミノ化を受けさせることができる。

さらに別の実施形態において、L-T部分は、カルボニル官能基を有する修飾アミノ酸を芳香族アミンによって還元的アミノ化することにより、Pの構成タンパク質に共有結合させたものである。

特定の実施形態において、存在する各タンパク質は、アネキシンVである。

別の実施形態において、存在する各タンパク質は、アネキシンV-128である。

特定の実施形態において、式中、Pはダイマーである。

さらに別の実施形態において、アネキシンサブユニットは、あるタンパク質のC末端を別のタンパク質のN末端に結合させるペプチドリンカーによって結合されている。

特定の実施形態において、Pは、アネキシンV-128であるタンパク質又はアネキシンV-128に対して少なくとも95％の配列同一性を有し且つアネキシンVではないタンパク質であって、N末端の位置にグリシンを有する該タンパク質を含み、前記タンパク質は、C末端において他のタンパク質と結合している。

さらなる実施形態において、他のタンパク質はアネキシンV-128である、又は前記他のタンパク質は、アネキシンV-128に対して少なくとも95％の配列同一性を有し且つアネキシンVではない。

特定の実施形態において、nは0である。

さらに別の実施形態において、nは1、2、3又は4である。

特定の実施形態において、各Lは独立に、
- C1〜C20アルキレン、
- ポリエチレングリコール、
- 2個から25個の間のアミノ酸残基を有するペプチド、
- 2個から25個の間の残基を有するペプトイド、
- α,ω-二官能性化合物から形成されたリンカーであって、該二官能性化合物の各末端官能基が、アミノオキシ、ヒドラジン、セミカルバジド、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、マレイミド、チオール、アルキン、アジド、アルデヒド及びアルコキシルアミンから独立に選択されるリンカー、
- ビス-無水物部分、ビス-イミデート部分若しくはビス-カルボニルイミダゾール部分から形成されたリンカー、又は
- アルキン部分とアジドとの付加環化反応から形成されたリンカー
からなる群より選択されるリンカー基である。

さらなる実施形態において、Lは独立に、
-ビス-アミノオキシアルカンNH₂O(CH₂)_nONH₂（式中、nは1から20の間の整数である）、
- 2個から15個の間の残基を有するペプトイド又はペプチドであって、場合により、D型立体配置になった少なくとも1つのアミノ酸、チオール側鎖を含む残基、求核性窒素を含む側鎖を含む残基、ヒドラジン基若しくはアミノオキシ基を含む側鎖を有する残基、カルボン酸若しくはカルボン酸エステルを含む側鎖を有する残基、又はこれらの任意の組合せを含むペプトイド又はペプチド、
-ビス-ヒドラジノ-アルカンNH₂NH(CH₂)_nONHNH₂（式中、nは1から20の間の整数である）、
-ビス-セミカルバジド-アルカンNH₂NRCO(CH₂)_nOCNRNH₂（式中、nは1から20の間の整数である）、
- 一方の末端官能基がアジドであり、他方の末端基がアミノオキシ又はヒドラジンである、α,ω-二官能性化合物から形成されたリンカー、
- 最大で1000個のモノマー部分を含む1,ω-置換ポリエチレングリコールポリマー、及び
- トリアゾールを含むリンカー
からなる群より選択されるリンカー基である。

別の実施形態において、治療用タンパク質は、キレート、タンパク質、ビタミン、酵素、ペプチド、ペプトイド、抗体、薬物、プロドラッグ、バイオマーカーに対するリガンド、及びエフェロサイトーシス（efferocytosis）の刺激物質から独立に選択される、1個以上のT基を含む。

さらなる実施形態において、各T基は、キレート、タンパク質、ビタミン、酵素、ペプチド、ペプトイド、抗体、薬物、プロドラッグ、バイオマーカーに対するリガンド、ポリマー、及びエフェロサイトーシスの刺激物質から独立に選択される。

さらに別の実施形態において、T基はキレートである。

特定の実施形態において、Tは、磁性材料を含む（例えば、磁性材料は常磁性又は超常磁性である）。

別の実施形態において、T基は、ビタミン、酵素、ペプチド、ペプトイド、抗体、薬物、プロドラッグ、及びバイオマーカーに対するリガンド、及びエフェロサイトーシスの刺激物質である。

さらに別の実施形態において、T基は、バイオマーカーに対するリガンド（例えば、フォレート、EGFR、ALK、MET、MUC-1又はKRAS）である。

さらなる実施形態において、T基は、アントラサイクリン、タキソール、オーリスタチン、カンプトテシン、ブレオマイシン（bleomycim）、カルボプラチナム（carboplatinum）、シタラビン、5-フルオロウラシル（5-fluoruracil）、タモキシフェン、カリケアマイシン（calicheimycin）、メイタンシン、ツブリシン、エトポシド、フォレート及びRGD結合部分からなる群より選択される。

特定の実施形態において、前記アントラサイクリンは、ドキソルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチンである、又は前記タキソールはパクリタキセルである。

さらに別の実施形態において、治療用タンパク質は、L₁-T₁によって表され、且つPの構成タンパク質のいずれかのN末端残基に部位特異的に結合している-L-T部分を含み、医薬組成物中に存在する式（I）の化合物の少なくとも約75％が、前記L₁-T₁部分に共有結合した前記N末端残基を有する。

なおさらなる実施形態において、N末端残基は、下記の部分構造によって表される：

〔式中、
両方のR_XはHである、又は両方のR_Xは、一緒になって炭素-窒素二重結合を形成しており、
R₁は、水素、場合により置換されていてもよいC1〜C20アルキル及びα-アミノ酸残基からなる群より選択され、
R₂は、場合により置換されていてもよいC1〜C20アルキル、C2〜C20アルケニル及びC2〜C20アルキニル、 (CH₂)_q(OCH₂CH₂)_r（式中q=0〜3、r=1〜1000）、又は(CH₂)_1-3CO-ペプチジル（式中のペプチジルが1〜40個のα-アミノ酸からできた鎖である）からなる群より独立に選択され、
X₁及びX₂のそれぞれは、共有結合、O、NR、NRCO及びNRCONRからなる群より独立に選択され、式中、Rは、水素からなる群より選択されるか、又は、C1〜C10アルキル、C2〜C10アルケニル、C2〜C10アルキニル、C6〜C10アリール、C3〜C9シクロアルキル及び3員から9員のヘテロシクロアルキルから選択される場合により置換されていてもよい基であり、
L^Xは、存在しない、又はカルボニルを介してT₁及びアミノ部分のそれぞれに共有結合したリンカーである。〕。

特定の実施形態において、T₁は、アントラサイクリン、タキソール、アウリスタチン、カンプトテシン、ブレオマイシン、カルボプラチナム、シタラビン、5-フルオロウラシル、タモキシフェン、カリケアマイシン、メイタンシン、ツブリシン及びエトポシドからなる群より選択される。

さらに別の実施形態において、医薬組成物中に存在する式（I）の化合物の少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％又は少なくとも約95％は、前記L₁-T₁部分に共有結合した前記N末端残基を有する。

さらなる実施形態において、両方のR_XはHである。

さらに別の実施形態において、治療用タンパク質は、L₂-T₂によって表され、且つPの構成タンパク質の、いずれかの表面利用可能チオール又は表面利用可能チオールから形成された官能基、に部位特異的に結合している-L-T部分を含み、
医薬組成物中に存在する式（I）の化合物の少なくとも約75％が、前記L₂-T₂部分に共有結合した前記表面利用可能チオールを有する。

特定の実施形態において、L₂-T₂は、表面活性チオールから形成されたS-プロパルギル官能基を介して、前記タンパク質に共有結合している。

さらに別の実施形態において、L₂-T₂は、表面活性チオールに共有結合したペンダントアジド部分（pendant azido moiety）を介して、前記タンパク質に共有結合している。

さらなる実施形態において、T₂は、フォレート又はRGD結合部分のいずれかである。

さらに別の実施形態において、医薬組成物中に存在する式（I）の化合物の少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％又は少なくとも約95％は、前記L₂-T₂部分に共有結合した前記表面利用可能チオールを有する。

特定の実施形態において、治療用タンパク質は、
（i） L₃-によって表され、Pの構成タンパク質のいずれかのN末端残基に部位特異的に結合している-L-T部分であって、医薬組成物中に存在する式（I）の化合物の少なくとも約75％が、前記L₃-T₃部分に共有結合した前記N末端残基を有する、-L-T部分、又は
（ii） L₃-T₃によって表され、Pの構成タンパク質のいずれかの表面利用可能チオールに部位特異的に結合している-L-T部分であって、医薬組成物中に存在する式（I）の化合物の少なくとも約75％が、前記L₃-T₃部分に共有結合した前記表面利用可能チオールを有する、-L-T部分
をさらに含む。

特定の実施形態において、医薬組成物中に存在する式（I）の化合物の少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％又は少なくとも約95％は、前記L₃-T₃部分に共有結合した前記N末端残基を有する。

別の実施形態において、医薬組成物中に存在する式（I）の化合物の少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％又は少なくとも約95％は、前記L₃-T₃部分に共有結合した前記表面利用可能チオールを有する。

さらに別の態様において、式（I）の化合物は、下記の構造を有する：

〔式中、
TとL^Xとの結合は、単結合又は二重結合であり、
両方のR_XはHである、又は両方のR_Xは、一緒になって炭素-窒素二重結合を形成しており、
Pは、アネキシンタンパク質、シナプトタグミンI、トランスフェリン、ラクトアドヘリン、α-フェトプロテイン及びレプチン及びヒト血清アルブミンからなる群より選択され、
R₁は、水素、場合により置換されていてもよいC1〜C20アルキル及びα-アミノ酸残基からなる群より選択され、
R₂は、場合により置換されていてもよいC1〜C20アルキル、C2〜C20アルケニル及びC2〜C20アルキニル、(CH₂)_q(OCH₂CH₂)_r（式中q=0〜3、r=1〜1000）、又は(CH₂)_1-3CO-ペプチジル（式中のペプチジルが1〜40個のα-アミノ酸からできた鎖である）からなる群より独立に選択され、
X₁及びX₂のそれぞれは、共有結合、O、NR、NRCO及びNRCONRからなる群より独立に選択され、式中、Rは、水素からなる群より選択されるか、又は、C1〜C10アルキル、C2〜C10アルケニル、C2〜C10アルキニル、C6〜C10アリール、C3〜C9シクロアルキル及び3員から9員のヘテロシクロアルキルから選択される場合により置換されていてもよい基であり、
L^Xは、存在しない、カルボニルを介してT及びアミノ部分のそれぞれに共有結合したリンカーである、又は二重結合を介してTに結合したリンカーであり、
Tは、抗癌剤である生物活性作用物質であり、L^Xが存在しない場合、Tは、カルボニルを介してアミノ基に共有結合している。〕。

別の態様において、本発明は、式IIの化合物：

〔式中、
両方のR_XはHである、又は両方のR_Xは、一緒になって炭素-窒素二重結合を形成しており、
Pは、アネキシンタンパク質、シナプトタグミンI、ラクトアドヘリン、α-フェトプロテイン及びレプチン及びヒト血清アルブミンからなる群より選択され、
R₁は、水素、場合により置換されていてもよいC1〜C20アルキル及びα-アミノ酸残基からなる群より選択され、
R₂は、場合により置換されていてもよいC1〜C20アルキル、C2〜C20アルケニル及びC2〜C20アルキニル、(CH₂)_q(OCH₂CH₂)_r（式中q=0〜3、r=1〜1000）、又は(CH₂)_1-3CO-ペプチジル（ペプチジルが1〜40個のα-アミノ酸からできた鎖である）からなる群より独立に選択され、
X₁及びX₂のそれぞれは、共有結合、O、NR、NRCO及びNRCONRからなる群より独立に選択され、式中、Rは、水素からなる群より選択されるか、又はC1〜C10アルキル、C2〜C10アルケニル、C2〜C10アルキニル、C6〜C10アリール、C3〜C9シクロアルキル及び3員から9員のヘテロシクロアルキルから選択される場合により置換されていてもよい基であり、
Lは、存在しない、又はカルボニルを介してT及びアミノ部分のそれぞれに共有結合したリンカーである。〕
を特徴とする。

いくつかの実施形態において、両方のR_XはHである。

さらに別の実施形態において、化合物は、前記化合物を治療薬Tと接触させ、治療用タンパク質を形成することにより、カルボニル基を有する。

別の態様において、本発明は、薬物、バイオマーカーに対するリガンド、及びその他の生物活性要素を架橋して治療用タンパク質を形成する方法であって、
（i）以下：

〔式中、R₃はHである。〕
に示されるカルボニル基を含む前記治療薬（III）を、
化合物（IV）の架橋剤（crosslinker）：

〔式中、
X₁及びX₂のそれぞれは独立にO、NH又はCONHであり、
R₁はH、CH₃又はアミノ酸側鎖であり、
R₂は場合により置換されていてもよいフェニルである、又は(CH₂)_m(OCH₂CH₂)_pであり、式中、mは1から8の間の整数であり、pは0から1000の間の整数であり、Pはタンパク質である。〕
と接触させて、下記の式の構造：

を有する化合物を形成すること、並びに
（ii）式（V）の化合物を、カルボニル官能基を含む式（VI）のタンパク質：

と接触させて、式（VII）の架橋タンパク質：

を生成すること、
による、上記方法を特徴とする。

いくつかの実施形態において、式（VII）のタンパク質が、場合により還元剤によって処理されて、対応するジアミン（VII-A）：

〔式中、窒素と炭素を有するR₃との結合は、二重結合又は単結合である。〕
を形成する。

さらに別の実施形態において、タンパク質は、アネキシンモノマーである、又はアネキシンマルチマーであり、前記モノマー又はマルチマーは、カルボニル部分を含む。

特定の実施形態において、治療薬は、アントラサイクリン、タキソール、アウリスタチン、カンプトテシン、ブレオマイシン、カルボプラチナム、シタラビン、5-フルオロウラシル、タモキシフェン、カリケアマイシン、メイタンシン、ツブリシン及びエトポシドからなる群より選択される。

特定の実施形態において、前記アントラサイクリンは、ドキソルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチンであり、又は前記タキソールは、パクリタキセルである。

いくつかの実施形態において、構造VIIの化合物は、タンパク質システイン官能基において生物活性要素によってさらに修飾されている。

さらに別の実施形態において、生物活性要素は、フォレート又はRGD結合部分のいずれかである。

特定の実施形態において、構造（VI）は、構造（VIII）：

〔式中、Xは、H又は生物活性作用物質である。〕
のN末端修飾タンパク質である。

別の態様において、本発明は、最初に、遊離チオールを含み且つケトン官能基又はアルデヒド官能基もまた含むように修飾されたタンパク質の遊離チオールをチオール反応性基質と縮合させ、次いでさらなるステップにおいて、（必要ならば反応性カルボニルを含むように修飾された）カルボニルを含む薬物を縮合させて炭素-窒素二重結合を形成することによって、前記タンパク質を（癌細胞を標的とする生物活性要素と）縮合させることにより、2個の生物活性要素に結合した治療用タンパク質を調製する方法を特徴とする。

別の態様において、本発明は、最初にカルボニルを含む薬物を式IIIの分子と縮合させ、次いでタンパク質生成物をチオール反応性作用物質と接触させることにより、癌細胞を標的とする2個の生物活性要素に結合した治療用タンパク質を調製する方法を特徴とする。

さらに別の態様において、本発明は、構造XII：

〔式中、R₁はH、CH₃又はアミノ酸側鎖である。〕
のプロパルギル化されたシステイン含有タンパク質を、アジド基質（XIII）：

〔式中、X₁=O、NH、CONH、NHCONH、R₂は(CH₂)_m(OCH₂CH₂)_pであり、式中、mは1から8の間の整数であり、pは0から1000の間の整数であり、Tは治療薬であり、R₃はH又はCH₃である。〕
と接触させて、式（XIV）の化合物：

を得ることにより、要素をタンパク質に架橋する方法を特徴とする。

いくつかの実施形態において、式（VII）のタンパク質を、場合により還元剤によって処理して、対応するジアミン（XIV-A）：

を形成する。

別の態様において、本発明は、式（XIV）の化合物：

を、式（XV）の化合物：

〔式中、X₁はO、NH、CONH又はNHCONHであり、R₂は場合により置換されていてもよいフェニルである、又は(CH₂)_m(OCH₂CH₂)_pであり、式中、mは1から8の間の整数であり、pは0から1000の間の整数であり、Tは治療薬である。〕
と合わせて、式（XVI）の化合物：

さらに別の態様において、本発明は、式Iの分子の遊離システインをプロパルギル化し、次いでプロパルギル化されたタンパク質を用いたアジド基質の1,3-付加環化によって生体要素（biological entity）を導入して、式（XVI）の構造を得ることにより、タンパク質を2個の要素を架橋する方法を特徴とする。

本発明は、本明細書に記載の方法のいずれかによって得られる治療用タンパク質も特徴とする。

別の態様において、本発明は、式（X）の構造を有する治療用タンパク質を特徴とする。

さらに別の態様において、本発明は、式（XVI）の構造を有する治療用タンパク質を特徴とする。

別の態様において、本発明は、本明細書に記載の実施形態のいずれかに記載されたような、単離された治療用タンパク質を特徴とする。

本明細書に記載のいずれかの方法又は治療用タンパク質のいくつかの実施形態において、タンパク質Pは、アネキシン、又はアネキシンVに対して少なくとも95％の配列同一性を有し且つアネキシンV-128ではないタンパク質を含む。

さらなる実施形態において、Pは、モノマー、ダイマー、トリマー又はテトラマーである。

特定の実施形態において、Pは、ダイアネキシン（diannexin）、アネキシンVに対して少なくとも95％の配列同一性を有し且つアネキシンV-128ではないタンパク質のダイマー、アネキシンV-128のダイマー、又はアネキシンV-128に対して少なくとも95％の配列同一性を有し且つアネキシンVではないタンパク質のダイマーである。

さらに別の実施形態において、タンパク質Pは、ホモダイマー又はヘテロダイマーアネキシンであり、2個のシステインが標識されている。

さらなる実施形態において、タンパク質Pは、ホモダイマー又はヘテロダイマーアネキシンであり、その少なくとも1つのアネキシン成分が突然変異体である。

いくつかの実施形態において、タンパク質Pは、ホモダイマー又はヘテロダイマーアネキシンであり、その少なくとも1つのアネキシン成分が突然変異体であり、2個のシステインが標識されている。

本明細書に記載のいずれかの方法又は治療用タンパク質のいくつかの実施形態において、各T基は独立に、ビタミン、酵素、ペプチド、ペプトイド、抗体、薬物、プロドラッグ、及びバイオマーカーに対するリガンド、及びエフェロサイトーシスの刺激物質から選択される。

特定の実施形態において、T基は、バイオマーカーに対するリガンドである。

別の実施形態において、リガンドは、フォレート、EGFR、ALK、MET、MUC-1及びKRASからなる群より選択される。

さらに別の実施形態において、Tは、アントラサイクリン、タキソール、アウリスタチン、カンプトテシン、ブレオマイシン、カルボプラチナム、シタラビン、5-フルオロウラシル、タモキシフェン、カリケアマイシン、メイタンシン、ツブリシン、エトポシド、フォレート及びRGD結合部分からなる群より選択される。

さらなる実施形態において、アントラサイクリンは、ドキソルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチンであり、又は前記タキソールは、パクリタキセルである。

別の態様において、本発明は、本明細書に記載の治療用タンパク質のいずれかを含む医薬組成物であって、前記治療用タンパク質が、医薬組成物中に存在する生物活性タンパク質の少なくとも約80％を占める、医薬組成物を特徴とする。

さらに別の態様において、本発明は、本明細書に記載の有効量の治療用タンパク質又はその医薬組成物のいずれかを、それを必要としている患者に投与することを含む、患者の癌を処置する方法を特徴とする。

特定の実施形態において、医薬組成物は、抗腫瘍免疫を促進する又はT細胞が媒介する抗腫瘍免疫を促進する治療用タンパク質を含む。

さらに別の実施形態において、コンジュゲート型治療薬Tの有効量は、非コンジュゲート型治療薬Tの投与に必要とされる量より少ない。

特定の実施形態において、コンジュゲート型治療薬Tの有効量は、非コンジュゲート型治療薬Tの投与によって必要とされる量の約95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％又は25％より少ない。

さらなる別の態様において、本発明は、式（X）の化合物：

の合成方法であって、表面利用可能チオールを有するタンパク質P（例えば、アネキシンV又はアネキシンV-128等のアネキシン）を、式（IX）のプロパルギルアルコール：

〔式中、XはBr、Cl、R、アルキルスルホネート又はアリールスルホネートである。〕
と接触させることによる、方法を特徴とする。

いくつかの実施形態において、タンパク質は、アネキシンV-128である。

さらに別の態様において、本発明は、式（XII）を有する化合物：

の合成方法であって、式（XI）の下記の構造：

〔式中、Pはタンパク質を表し、R₁はH、CH₃又はアミノ酸側鎖である。〕
を有するタンパク質を、式（IX）のプロパルギルアルコール：

〔式中、XがBr、Cl、R、アルキルスルホネート又はアリールスルホネートである。〕
と接触させることによる、方法を特徴とする。

さらに別の態様において、本発明は、式（XVII）の化合物：

〔式中、X₁は、存在しない、又はO、NH、CONH、NHCONHであり、R₂は、(CH₂)_m(OCH₂CH₂)_pであり、式中、mは、1から8の間の整数であり、pは、0から1000の間の整数である。〕
を特徴とする。

さらなる態様において、本発明は、式（XVIII）の化合物：

〔式中、R₁は、H、C1〜C20アルキル、C6〜C10アリール、C2〜C20アルケニル又はOHであり、R₂は、(CH₂)_m(OCH₂CH₂)_pであり、式中、mは、1から8の間の整数であり、pは、0から1000の間の整数である。〕
を特徴とする。

別の態様において、本発明は、式（XIX）の化合物：

〔式中、
X₁は、O、NH又はCONHであり、
X₂は、存在しない、又はO、NH若しくはCONHであり、
R₁は、H、CH₃又はアミノ酸側鎖であり、
R₂は、(CH₂)_m(OCH₂CH₂)_pであり、式中、mは、1から8の間の整数であり、pは、0から1000の間の整数である。〕
を特徴とする。

別の態様において、本発明は、式（XXI）の構造：

を有するタンパク質ダイマーを調製する方法であって、アルキン部分とアジド部分との付加環化反応を起こす条件下で、式（X）の2つの化合物：

を、式（XX）の化合物：

〔式中、R₂は(CH₂)_m(OCH₂CH₂)_pであり、式中、mは1から8の間の整数であり、pは0から1000の間の整数である。〕
と接触させることによる、方法を特徴とする。

別の態様において、本発明は、ホスファチジルセリン及びRGDペプチド又はフォレート受容体の両方を発現している癌細胞に薬物を送達する方法を特徴とする。

別の態様において、本発明は、シアノ水素化ホウ素ナトリウムの存在下又は非存在下で、式（II）の化合物を、ポリエチレングリコールカルバジド（XXII）：

と接触させることにより、式（II）のアネキシンケトアミドを部位特異的にPEG化する方法を特徴とする。

さらに別の態様において、本発明は、溶媒接触可能システインを含むアネキシンタンパク質を部位特異的に修飾する方法であって、最初にこのタンパク質を請求項14に記載のプロパルギル基質IXと接触させ、次いでXをPEG化されたアジドと縮合させて、XXIVを得ること等による、方法を特徴とする。

さらに別の態様において、本発明は、式（XXV）の化合物：

〔式中、
X₁は、O、NH又はCONHであり、
R₂は、(CH₂)_m(OCH₂CH₂)_pであり、式中、mは、1から8の間の整数であり、pは、0から1000の間の整数であり、
X₃は、N₃、SH又はプロパルギルである。〕
を特徴とする。

別の態様において、本発明は、式（XXVIII）の化合物：

〔式中、Yはハロゲンである。〕
を、遊離システインを含むアネキシンタンパク質によって処理して、

〔式中、AN-Sは、アネキシンタンパク質を表す。〕
を得ることを含む、アネキシンタンパク質をPEG化する方法を特徴とする。

別の態様において、本発明は、式（XXIX）の化合物：

別の態様において、本発明は、タンパク質を、式（XXXII）のビス-マレイミド：

〔式中、R₂は(CH₂)_m(OCH₂CH₂)_pであり、式中、mは1から8の間の整数であり、pは0から1000の間の整数である。〕
によって処理して、式（XXXIII）の化合物：

〔式中、AN^V-128は、アネキシンV-128を表す。〕
を得ることにより、アネキシンV-128のダイマーを形成する方法を特徴とする。

さらに別の態様において、本発明は、式（XXXIII）の分子を特徴とする。

別の態様において、本発明は、下記の式の化合物：

を、式P-SHを有する化合物（式中、Pは、アネキシンVタンパク質又はアネキシンV-128タンパク質である化合物）と合わせて、中間体化合物（XXXIV）：

を得、次いで、中間体化合物（XXXIV）は、式（XXXV）によって表される化合物：

〔式中、Pは、アネキシンVタンパク質又はアネキシンV-128タンパク質であり、Lは、アジド部分をタンパク質に共有結合させているリンカーである。〕
によって処理して、式（XXXVI）の化合物：

又はその位置異性体を得ることができる、アネキシンVのダイマー又はアネキシンV-128のダイマーを生成する方法を特徴とする。

別の態様において、本発明は、下記の式の化合物：

を、式P-SHを有する化合物〔式中、Pは、アネキシンVタンパク質又はアネキシンV-128タンパク質である。〕と合わせて、中間体化合物（XXXVIII）：

を得、次いで、中間体化合物（XXXVIII）は、式（XXXV）によって表される化合物：

〔式中、Pは、アネキシンVタンパク質又はアネキシンV-128タンパク質であり、Lは、アジド部分をタンパク質に共有結合させているリンカーである。〕
によって処理して、式（XXXIX）の化合物：

又はその位置異性体を得ることができる、アネキシンVのダイマー又はアネキシンV-128のダイマーを形成する方法を特徴とする。

本発明の治療用ペプチド及びその医薬組成物は、当技術分野で公知の任意の方法によって対象に投与することができ、限定されるわけではないが、経口経路、局所経路、経皮経路、非経口経路、皮下経路、鼻腔内経路、筋肉内経路及び静脈内経路が挙げられ、局所適用と全身適用の両方を含む。さらに、本発明の治療用ペプチド及びその医薬組成物は、当技術分野で周知の製剤技法を用いて、遅延放出又は制御放出（徐放）を実現するように設計することができる。

本発明は、医薬として許容される担体と組み合わさった本明細書で上述した治療的有効量のコンジュゲートを含む、医薬組成物も含む。本明細書で使用されるとき、「医薬として許容される担体」は、ヒト又は動物に本発明の治療用ペプチドを送達するための医薬として許容される溶媒、懸濁化剤又は媒体である。担体は、液体でも固体でもよく、計画して念頭に置いた投与方式よって選択される。本発明に従って利用され得る医薬として許容される担体の例としては、限定されるわけではないが、PEG、リポソーム、エタノール、DMSO、水性緩衝液、油及びこれらの組合せが挙げられる。

本明細書で使用されるとき、「アルキル」という用語は、完全に飽和した分枝状又は非分枝状炭化水素部分を指す。好ましくは、アルキルは、1個から20個の炭素原子を含み、より好ましくは1個から16個の炭素原子を含み、1個から10個の炭素原子を含み、1個から7個の炭素原子を含み、又は1個から4個の炭素原子を含む。アルキルの代表例としては、限定されるわけではないが、メチル、エチル、n-プロピル、iso-プロピル、n-ブチル、sec-ブチル、イソ-ブチル、tert-ブチル、n-ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、n-ヘキシル、3-メチルヘキシル、2,2-ジメチルペンチル、2,3-ジメチルペンチル、n-ヘプチル、n-オクチル、n-ノニル及びn-デシル等が挙げられる。さらに、「CX-CY-アルキル」という表現（式中、xは1〜5であり、yは2〜10である）は、特定の範囲の炭素の特定のアルキル基（直鎖又は分枝鎖）を示している。例えば、C1-C6アルキルという表現は、限定されるわけではないが、メチル、エチル、プロピル、ブチル、イソプロピル、tert-ブチル、イソブチル、n-ペンチル及びn-ヘキシルを含む。

「アルケニル」という用語は、少なくとも1つのオレフィン結合及び示された数の炭素原子を含む、直鎖状、環状又は分枝状炭化水素残基を単独で又は組み合わせて指す。好ましいアルケニル基は、炭素原子を最大で8個有し、好ましくは最大で6個有し、特に好ましくは最大で4個有する。アルケニル基の例は、エテニル、1-プロペニル、2-プロペニル、イソプロペニル、1-ブテニル、2-ブテニル、3-ブテニル、イソブテニル、1-シクロヘキセニル、1-シクロペンテニルである。

「アルキニル」という用語は、上述したアルキルに長さが類似しているが少なくとも1つの三重結合を含む、不飽和脂肪族基類縁体を含む。例えば、「アルキニル」という用語は、直鎖状アルキニル基（例えば、エチニル基、プロピニル基、ブチニル基、ペンチニル基、ヘキシニル基、ヘプチニル基、オクチニル基、ノニニル基、デシニル基等）、分枝鎖状アルキニル基及びシクロアルキル置換又はシクロアルケニル置換アルキニル基を含む。アルキニルという用語は、炭化水素主鎖の1個以上の炭素に置き換えて酸素原子、窒素原子、硫黄原子又はリン原子を含むアルキニル基をさらに含む。特定の実施形態において、直鎖状又は分枝鎖状アルキニル基は、その主鎖の中に6個以下の炭素原子を有する（例えば、直鎖の場合はC₂-C₆、分枝鎖の場合はC₃-C₆）。C₂-C₆という用語は、2個から6個の炭素原子を含むアルキニル基を含む。

本明細書で使用されるとき、「抗癌剤」という用語は、癌細胞機能を阻害することができる分子を指す。この作用物質は、増殖を阻害することができ、又は細胞に対して細胞傷害性であり得る。種々の抗癌剤を使用することができ、タンパク質合成を阻害する抗癌剤及び細胞の成長又は生存に必須の特定の遺伝子の発現を阻害する抗癌剤が含まれる。抗癌剤には、細胞死をもたらす抗癌剤、並びに細胞の成長、増殖及び/又は分化を阻害する抗癌剤が含まれる。好ましくは、抗癌剤は、特定の種類の癌細胞に対しては選択的に傷害性であるが、その他の正常細胞に対しては影響せず、又は有効性がより低いものである。

「アリール」という用語は、水素及び炭素のみからなり且つ6個から19個の炭素原子又は6個から10個の炭素原子を含む、単環式又は多環式、例えば三環式、二環式の芳香族炭化水素環系であって、部分飽和し得る環系を含む。アリール基としてとしては、限定されるわけではないが、フェニル基、トリル基、キシリル基、アントリル基、ナフチル基及びフェナントリル基等の基が挙げられる。アリール基は、多環（polycycle）（例えば、テトラリン）を形成するように芳香族ではない脂環式又は複素環式の環と縮合又は架橋することもできる。

「二官能性ポリマー」又は「二官能性リンカー」は、その他の部分（限定されるわけではないが、アミノ酸側基が挙げられる）と特異的に反応して共有結合又は非共有結合を形成することができる、2つの別個の官能基を含む分子を指す。特定の生物活性成分の基と反応性の1個の官能基及び第2の生体成分の基と反応性の別の基を有する二官能性リンカーは、第1の生物活性成分、二官能性リンカー及び第2の生物活性成分を含むコンジュゲートを形成するのに使用することができる。様々な化合物をペプチドに結合するための数多くの手順及びリンカー分子が公知である。例えば、参照により本明細書に組み込む欧州特許出願第188,256号、米国特許第4,671,958号、米国特許第4,659,839号、米国特許第4,414,148号、米国特許第4,699,784号、米国特許第4,680,338号及び米国特許第4,569,789号を参照されたい。「多官能性ポリマー」又は「多官能性リンカー」は、その他の部分（限定されるわけではないが、アミノ酸側基が挙げられる）と特異的に反応して共有結合又は非共有結合を形成することができる、2つ以上の別個の官能基を含む分子を指す。

本明細書で使用されるとき、「コンジュゲート」は、化学カップリング法によって生成された又は融合タンパク質を生成するキメラDNA分子の組換え発現によって生成された、直接結合している又はリンカーを介して結合している少なくとも1つの受容体結合リガンド及び少なくとも1つの抗癌剤を含む分子を指す。この定義には、モノマーを受容体又はホスファチジルセリン結合リガンドだと考えることができる、アネキシンタンパク質のマルチマーが含まれる。このようなダイマー又はマルチマーは、抗癌剤、又はバイオマーカーに対するリガンドもまた含み得る。

「生体適合性」という用語は、生体活性を有さず、例えばヒトに対して非毒性且つ非炎症性の化合物を指す。

「付加環化」という用語は、2つ以上の不飽和分子（又は同じ分子の部分）が合わさって環状付加物が形成され、結合多重度が純減するペリ環状化学反応を指す。

本明細書で使用されるとき、本発明の治療用ペプチドのリガンド及び抗癌剤成分並びにその医薬組成物に関する「共有結合した（covalently coupled）」、「結合した（linked）」、「結合された（bound）」及び「結合している（joined）」等の用語は、指定された成分が相互に直接共有結合していること、又は架橋、スペーサー若しくはリンカー等の介在する部分若しくは成分を介して相互に間接的に共有結合していることを意味する。限定のためではないが例えば、リガンドと抗癌剤は、Mickischら(1993年)に記載されたように、チオエーテル結合を介して一緒になって化学結合し得る。

「有効量」という用語は、本発明に従って使用されたとき、過度の有害な副作用（毒性、刺激（炎症）及びアレルギー反応等）を伴うことなく妥当な利益/リスク比に釣り合った検出可能な治療効果を示すのに十分な量の生物活性分子又はそのコンジュゲート若しくは誘導体を指す。治療効果は、限定のためではないが例えば、望ましくない組織又は悪性細胞の成長の阻害を挙げることができる。対象における有効量は、対象の種類、対象のサイズ及び健康、処置しようとする病態の性質及び重症度、投与方法、処置の持続期間、（もしあれば）併用療法の性質及び用いられる特定の製剤等に依存する。したがって、正確な有効量を前もって指定することはできない。しかしながら、所与の状況における有効量は、本明細書で提供された情報に基づいて慣用の実験を用いて当業者によって決定することができる。

「融合タンパク質」という用語は、単一の天然ポリペプチド中に通常存在しない少なくとも2つのポリペプチドドメインを有し、且つポリペプチドドメインがポリペプチド鎖によって結合されている、単一の分子要素を含む。したがって、天然に存在するタンパク質は、本明細書で使用されるとき、「融合タンパク質」ではない。

本明細書で使用されるときの「ヘテロアリール」という用語は、5個から14個の間の環員を有し且つ窒素、酸素及び硫黄からなる群より独立に選択される1個、2個、3個又は4個のヘテロ原子を含む、一、二又は三員の芳香族環（つまり、環系の中に4n+2個のπ電子を含む）を表す。例示的なヘテロアリールとしては、限定されるわけではないが、ピロリル、ピロリニル、ピロリジニル、ピラゾリル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピリジル、ピペリジニル、ホモピペリジニル、ピラジニル、ピペラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、オキサゾリル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリル、イソオキサゾリジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、チアゾリル、チアゾリジニル（例えば、1,3,4-チアジアゾール）、イソチアゾリル、イソチアゾリジニル、インドリル、キノリニル、イソキノリニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、フリル、チエニル、チアゾリジニル、イソチアゾリル、イソインダゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、オキサジアゾリル、プリニル、チアジアゾリル、テトラヒドロフラニル、ジヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、ジヒドロチエニル、ジヒドロインドリル、テトラヒドロキノリル、テトラヒドロイソキノリル、ピラニル、ジヒドロピラニル、ジチアゾリル、ベンゾフラニル及びベンゾチエニル等が挙げられる。

本明細書で使用されるときの「均一な」という用語は、「実質的に純粋な」という用語に関して規定しており、下記を参照されたい。

「結合」又は「リンカー」という用語は、通常化学反応の結果として形成され、一般的に共有結合である基又は結合を指すのに本明細書で使用されている。加水分解に安定な結合は、結合が水中で実質的に安定であり、且つ、限定されるわけではないが生理条件下を含む有用なpH値において水と長時間、おそらくは無限にさえ反応しないことを意味する。加水分解に不安定な結合又は加水分解により分解可能な結合は、結合が水中又は例えば血液などの水溶液中で分解可能であることを意味する。酵素的に不安定な結合又は酵素的に分解可能な結合は、結合が1つ以上の酵素によって分解され得ることを意味する。当技術分野で理解されているように、PEG及び関連ポリマーは、分解可能な結合を、ポリマー主鎖の中又はポリマー主鎖とポリマー分子の末端官能基の1つ以上との間のリンカー基の中に含み得る。例えば、PEGカルボン酸又は活性化PEGカルボン酸と生物活性作用物質のアルコール基との反応によって形成されたエステル結合は一般に、生理条件下で加水分解して作用物質を放出する。加水分解により分解可能なその他の結合としては、限定されるわけではないが、炭酸結合、アミンとアルデヒドとの反応から生じたイミン結合、アルコールとリン酸基との反応によって形成されたリン酸エステル結合、ヒドラジドとアルデヒドとの反応生成物であるヒドラゾン結合、アルデヒドとアルコールとの反応生成物であるアセタール結合、ギ酸塩とアルコールとの反応生成物であるオルトエステル結合、限定されるわけではないがPEG等のポリマーの末端のアミン基が挙げられるアミン基とペプチドのカルボキシル基によって形成されたペプチド結合、並びに、限定されるわけではないがポリマーの末端のホスホルアミダイト基が挙げられるホスホルアミダイト基とオリゴヌクレオチドの5'ヒドロキシル基によって形成されたオリゴヌクレオチド結合が挙げられる。

「リポソーム」は、様々な種類の脂質、リン脂質及び/又は界面活性剤から構成される小胞である。リポソームの成分は、一般的に、生体膜の脂質配列と同様の二層構造に配列されている。

本明細書で使用されるとき、「マルチマー」という用語は、2つ以上のモノマータンパク質又は修飾タンパク質から構成されるタンパク質分子と規定する。

「ペプチド」という用語は、ペプチド結合によって結合されたアミノ酸鎖を含む。「ペプチド」という用語は、線形鎖に配列されたアミノ酸でできていて球状形態に折りたたまれた化合物である、「タンパク質」又は「ポリペプチド」も指し得る。種々のポリペプチド又はタンパク質が、本明細書で提供された方法及び組成物の範囲内で使用され得る。特定の実施形態において、タンパク質は、抗体又は抗原結合部位を含む抗体のフラグメントを含み得る。本明細書で使用されるとき、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドは一般に、限定されるわけではないが、約200個超のアミノ酸から、遺伝子から翻訳された全長配列までのアミノ酸からできたタンパク質、約100個超のアミノ酸からできたポリペプチド及び/又は約3個から約100個のアミノ酸からできたペプチドを指す。便宜上、「タンパク質」、「ポリペプチド」及び「ペプチド」という用語は、本明細書で互換的に使用される。したがって、「タンパク質又はペプチド」という用語は、天然に存在するタンパク質中に見出される共通のアミノ酸のうちの少なくとも1つ、又は少なくとも1つの修飾されたアミノ酸若しくは特異なアミノ酸を含む、アミノ酸配列を包含する。タンパク質又はペプチドは、標準的な分子生物学的技法を用いたタンパク質、ポリペプチド若しくはペプチドの発現、天然源からのタンパク質若しくはペプチドの単離、又はタンパク質又はペプチドの化学合成を含む、当業者に公知の任意の技法によって製造することができる。合成して製造されたポリペプチドは、DNAによって天然にコードされないアミノ酸（例えば、天然に存在しないアミノ酸又は非天然アミノ酸）の置換を含み得る。天然に存在しないアミノ酸の例は、D-アミノ酸、システインの硫黄原子に結合したアセチルアミノメチル基を有するアミノ酸、PEG化アミノ酸、式NH₂(CH₂)_nCOOH（式中でnが2〜6である）のωアミノ酸、中性で非極性のアミノ酸、例えばサルコシン、t-ブチルアラニン、t-ブチルグリシン、N-メチルイソロイシン及びノルロイシンが挙げられる。タンパク質、ポリペプチド及びペプチドの配列は、当業者に公知の電子化されたデータベースにおいて見出すことができる。このようなデータベースの1つが、National Center for Biotechnology InformationのGenBankデータベース及びGenPeptデータベースである。代替的には、タンパク質、ポリペプチド及びペプチドの様々な商業用調製物が当業者に公知である。

「ペプトイド」という用語は、N-置換基が例えば天然アミノ酸又は非天然アミノ酸の側鎖であり得る、ポリ-N-置換グリシンを指す。例示的なペプトイドは、例えば、2〜25個の残基を有し得る。

本明細書で使用されるときの「医薬組成物」という用語は、医薬として許容される賦形剤を用いて製剤化された本明細書に記載の化合物を含む組成物を表す。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、政府の規制機関の認可により、哺乳動物の疾患の処置用の治療レジメンの一部として製造又は販売される。医薬組成物は、例えば、単位投与剤形（例えば、錠剤、カプセル剤、カプレット、ゲルキャップ（gelcap）又はシロップ剤）での経口投与用に製剤することもできるし、（例えば、クリーム剤、ゲル剤、ローション剤又は軟膏剤としての）局所投与用に製剤することもできるし、（例えば、微粒子状塞栓子（particulate embolus）を含まず且つ静脈内での使用に適した溶媒系に溶かした無菌溶液として）静脈内投与用に製剤することもできるし、あるいは、本明細書に記載のその他の任意の製剤中に配合することもできる。

本明細書で使用されるときの「医薬として許容される賦形剤」は、本明細書に記載の化合物以外で、患者において非毒性且つ非炎症性であるという特性を有する任意の成分（例えば、活性化合物を懸濁させる又は溶解することができる媒体）を指す。賦形剤は、例えば、接着防止剤、抗酸化剤、結合剤、被覆剤、圧縮助剤（compression aid）、崩壊剤、染料（着色料）、軟化薬、乳化剤、充填剤（希釈剤）、フィルム形成剤（film former）若しくはコーティング、矯味剤、香料、滑剤（流動促進剤）、滑沢剤、保存料、印刷用インク、収着媒、懸濁化剤若しくは分散剤、甘味料又は水和水を挙げることができる。例示的な賦形剤としては、限定されるわけではないが、ブチル化ヒドロキシトルエン（BHT）、炭酸カルシウム、（二塩基性）リン酸カルシウム、ステアリン酸カルシウム、クロスカルメロース、架橋ポリビニルピロリドン、クエン酸、クロスポビドン、システイン、エチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、マルチトール、マンニトール、メチオニン、メチルセルロース、メチルパラベン、微結晶性セルロース、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポビドン、α-デンプン（pregelatinized starch）、プロピルパラベン、レチニルパルミテート、シェラック、二酸化ケイ素、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、クエン酸ナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、ソルビトール、デンプン（コーンスターチ）、ステアリン酸、ステアリン酸、スクロース、タルク、二酸化チタン、ビタミンA、ビタミンE、ビタミンC及びキシリトールが挙げられる。

「ポリエチレングリコール」又は「PEG」は、カップリング剤の有無又はカップリング用部分又は活性化用部分による（例えばチオール、トリフレート、トレシレート（tresylate）、アジルジン（azirdine）、オキシランによる、又は好ましくはマレイミド部分による）誘導体化の有無に関わらず、その他の任意のポリアルキレングリコール化合物又はその誘導体も意味する。マレイミドモノメトキシPEG等の化合物が、本発明の活性化PEG化合物の例示である。ポリプロピレングリコール等のその他のポリアルキレングリコール化合物も本発明に使用することができる。その他の適当なポリマーコンジュゲートとしては、限定されるわけではないが、非ポリペプチド系ポリマーも挙げられるし、例えばデキストラン、コロミン酸又はその他の炭水化物を主体としたポリマー、ビオチン誘導体及びデンドリマーといった種類の帯電したポリマー又は中性のポリマーも挙げられる。PEGという用語は、ポリアルキレンオキシドの種類のその他のポリマーを含むことも図っている。PEGは、コンジュゲートの任意のN末端アミノ酸に結合することができ、且つ/又は、例えばリシン、ヒスチジン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸及びシステイン等のN末端アミノ酸若しくはその他のこのような結合可能で当業者に公知のアミノ酸の下流のアミノ酸残基に結合することができる。システインPEG化コンジュゲートは、例えば、ポリエチレングリコールをコンジュゲートのシステイン残基に付いたチオ基に結合させることによって生じる。コンジュゲートに結合したPEG部分は、分子量の範囲が例えば約200MWから40,000MWまでであり得る。

本明細書で使用されるときの「予防する」という用語は、本明細書に記載の疾患、障害又は病態の1つ以上の症状又は病態を予防する、予防的処置又は処置を指す。予防処置は、例えば、疾患、障害又は病態の発症に先行する事象の前（「曝露前予防法」）又は後（「曝露後予防法」）に開始することができる。本明細書に記載の化合物、又は医薬として許容されるその塩若しくは溶媒和物又はそれらの医薬組成物の投与を含む予防処置は、急性用、短期間用又は慢性用であり得る。投与する用量は、予防処置の途中で変更され得る。

本明細書で使用されるときの「受容体」という用語は、癌細胞又は腫瘍血管系の中の細胞の表面に一意に発現又は過剰発現しており、且つ、コンジュゲート等の血中の標的化用作用物質（circulating targeting agent）との相互作用が可能になるように癌細胞又は腫瘍血管系の中の細胞の表面に曝露されている、あらゆるペプチド、タンパク質、グリコタンパク質、ポリ炭水化物（polycarbohydrate）又は脂質を含むと理解される。

本明細書で使用されるときの「処置する」、「処置すること」及び「処置」という用語は、腫瘍成長の阻害と腫瘍細胞死の誘導の両方を含むと理解される。

「対象」という用語は、疾患、障害又は病態を患い得る又は罹患し得る生物、例えば原核生物及び真核生物を含むことを意図している。対象の例は、哺乳動物が挙げられ、例えば、ヒト、イヌ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、マウス、ウサギ、ラット及びヒト以外のトランスジェニック動物が挙げられる。特定の実施形態において、対象はヒトであり、例えば、癌、関節炎、アテローム血栓症（atherothrombosis）、粥腫の破裂（plaque rupture）又はクローン病を患っている、患うリスクがある、又は潜在的に患い得るヒトである。別の実施形態において、対象は細胞である。

本明細書で使用されるとき、「実質的に純粋な」は、対象種が優勢に存在する種である（すなわち、モル基準で、対象種が組成物中のその他のあらゆる個々の種より豊富である）ことを意味し、好ましくは、実質的に精製された分画は、存在するすべての高分子種の少なくとも約50％（モル基準）を対象種が占める組成物である。一般に、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在するすべての高分子種の約80％超を占め、より好ましくは約85％超、90％超、95％超及び99％超を占める。最も好ましくは、対象種は、組成物が単一の高分子種から本質的になる本質的な均一性に至るまで（汚染物質種が慣用の検出方法によって組成物中に検出され得なくなるまで）精製される。

本明細書で使用されるとき、「治療用タンパク質」という用語は、タンパク質コンジュゲートであってもよいし、潜在的な生体活性を有する有機化学的要素へのさらなる付加結合を含む若しくは含まない、組換えによって調製された融合タンパク質であってもよいし、又は潜在的な生体活性を有する有機化学的要素へのさらなる付加結合を含む若しくは含まない、化学的に生成したマルチマー（例えば、架橋タンパク質）であり得る。

本明細書で使用されるとき、当技術分野で十分に理解されているように、「処置」は、臨床結果等の有益な結果又は所望の結果を得るための手法である。有益な結果又は所望の結果としては、限定されるわけではないが、1つ以上の症状又は病態の軽減又は回復、疾患、障害又は病態の程度の縮減、疾患、障害又は病態の状態を安定化すること（すなわち、悪化させないこと）、疾患、障害又は病態の拡散を防止すること、疾患、障害又は病態の進行を遅延させる又は緩やかにすること、疾患、障害又は病態の回復又は好転、及び、検出可能か検出不可能かに関わらない寛解（部分的か完全かにも関わらない）を挙げることができる。疾患、障害又は病態を「好転させること」は、処置がないときの程度若しくは経時的変化に比較して、疾患、障害又は病態の程度及び/若しくは望ましくない臨床症状が和らげられ、且つ/又は、進行の経時的変化が緩やかになり若しくは長くなることを意味する。

ある基が置換されている場合、その基は、例えば、1個、2個、3個、4個、5個又は6個の置換基によって置換されていてよい。場合による（任意選択の）置換基としては、限定されるわけではないが、C_1〜6アルキル基、C_2〜6アルケニル基、C_2〜6アルキニル基、アリール基、ヘテロアリール基、ハロゲン基（-F、-Cl、-Br又は-I）、アジド（-N₃）、ニトロ基（-NO₂）、シアノ基（-CN）、アシルオキシ基（-OC(=O)R'）、アシル基（-C(=O)R'）、アルコキシ基（-OR'）、アミド基（-NR'C(=O)R"又は-C(=O)NRR'）、アミノ基（-NRR'）、カルボン酸基（-CO₂H）、カルボン酸エステル基（-CO₂R'）、カルバモイル基（-OC(=O)NR'R"又は-NRC(=O)OR'）、ヒドロキシ基（-OH）、イソシアノ基（-NC）、スルホン酸基（-S(=O)₂OR）、スルホンアミド（-S(=O)₂NRR'又は-NRS(=O)₂R'）又はスルホニル（-S(=O)₂R）が挙げられ、式中、それぞれのR又はR'は、H、C_1〜6アルキル、C_2〜6アルケニル、C_2〜6アルキニル、アリール又はヘテロアリールから独立に選択される。いくつかの実施形態において、置換基自体は、例えば、本明細書で規定された1個、2個、3個、4個、5個又は6個の置換基によってさらに置換されていてもよい。例えば、C_1〜6アルキル基、フェニル基又はヘテロアリール基は、本明細書に記載されたような1個、2個、3個、4個、5個又は6個の置換基によってさらに置換されていてもよい。

本発明は、本化合物のすべての異性体形態（例えば、エナンチオマー形態、ジアステレオマー形態及び幾何異性体形態（又は配座異性体形態））、例えば、シン異性体及びアンチ異性体、各不斉中心に対するR型及びS型立体配置、Z型及びE型二重結合異性体並びにZ型及びE型配座異性体を含む。したがって、本化合物の単一の立体化学的異性体並びにエナンチオマー混合物、ジアステレオマー混合物及び幾何異性体混合物（又は配座異性体混合物）は、本発明の範囲内である。逆の記載がない限り、本発明の化合物のすべての互変異性体形態が本発明の範囲内である。

本発明は、同じ原子番号を有するが通常自然に見出される原子質量又は質量数と異なる原子質量又は質量数を有する原子によって1個以上の原子が置き換えられている、医薬として許容される同位体標識されたすべての本発明の化合物を含む。本発明の化合物中への組み入れに適した同位体の例は、²H及び³H等の水素の同位体、¹¹C、¹³C及び¹⁴C等の炭素の同位体、³⁶Cl等の塩素の同位体、¹⁸F等のフッ素の同位体、¹²³I及び¹²⁵I等のヨウ素の同位体、¹³N及び¹⁵N等の窒素の同位体、¹⁵O、¹⁷O及び¹⁸O等の酸素の同位体、³²P等のリンの同位体並びに³⁵S等の硫黄の同位体が挙げられる。

適当な塩基に由来した塩は、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩及びアンモニウム塩が挙げられる。代表的なアルカリ金属塩又はアルカリ土類金属塩は、ナトリウム塩、リチウム塩、カリウム塩、カルシウム塩及びマグネシウム塩等が挙げられる。塩の一種には、医薬として許容される塩が挙げられる。本明細書で使用されるときの「医薬として許容される塩」という用語は、健全な医学的判断の範囲内で過度の毒性、刺激（炎症）及びアレルギー反応等を伴うことなくヒト及び動物の組織と接触させて使用するのに適しており、且つ妥当な利益/リスク比に釣り合っている塩を表す。医薬として許容される塩は、当技術分野で周知である。例えば、医薬として許容される塩は、Bergeら、J. Pharmaceutical Sciences 66:1〜19、1977年及びPharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use、（P.H. Stahl及びC.G. Wermuth編）、Wiley-VCH、2008年に記載されている。こうした塩は、本明細書に記載の化合物の最終的な単離及び精製の間にインシチュで調製することもできるし、又は遊離塩基基を適切な有機酸と反応させることによって別々に調製することもできる。代表的な酸付加塩としては、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、ショウノウ酸塩、カンファースルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、二グルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプトン酸塩、ヘキサン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、2-ヒドロキシ-エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、2-ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、3-フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩及び吉草酸塩等が挙げられる。代表的なアルカリ金属塩又はアルカリ土類金属塩としては、ナトリウム塩、リチウム塩、カリウム塩、カルシウム塩及びマグネシウム塩等も挙げられるし、加えて、限定されるわけではないがアンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン及びエチルアミン等を含む非毒性アンモニウム、第四級アンモニウム及びアミンカチオンも挙げられる。

本明細書で使用されるときの「医薬として許容される溶媒和物」という用語は、適切な溶媒の分子が結晶格子中に組み込まれている、本明細書に記載の化合物を意味する。適切な溶媒は、投与する投薬量において生理学的に耐容される。例えば、溶媒和物は、有機溶媒、水又はこれらの混合物を含む溶液からの結晶化、再結晶又は沈殿によって調製することができる。適切な溶媒の例は、エタノール、水（例えば、一水和物、二水和物及び三水和物）、N-メチルピロリジノン（NMP）、ジメチルスルホキシド（DMSO）、N,N'-ジメチルホルムアミド（DMF）、N,N'-ジメチルアセトアミド（DMAC）、1,3-ジメチル-2-イミダゾリジノン（DMEU）、1,3-ジメチル-3,4,5,6-テトラヒドロ-2-(1H)-ピリミジノン（DMPU）、アセトニトリル（ACN）、プロピレングリコール、酢酸エチル、ベンジルアルコール、2-ピロリドン及びベンジルベンゾエート等である。水が溶媒である場合、上記分子は、「水和物」と呼ばれる。

本発明は、特異的な癌細胞の種類に標的化し得る複数の要素を担持する均一な融合タンパク質コンジュゲートを含めたタンパク質コンジュゲート及び融合タンパク質を含む、治療用ペプチド及びその医薬組成物の設計及び調製に関する。治療用ペプチド及びその医薬組成物を用いる標的療法のこうした目的は、（1）癌細胞表面バイオマーカーに対する高いアフィニティーを有する標的成分、（2）各要素の、融合タンパク質の特異的な部位への結合のための部位特異的方法、及び（3）治療要素の放出のための開裂部位、を用いて達成することができる。

本明細書に記載の方法及び治療用タンパク質は、生物活性作用物質（例えば、癌治療薬）を標的化薬物送達（例えば、癌細胞への標的化送達）するのに有用であり得るタンパク質に結合するために部位特異的架橋反応を用いる。したがって、本明細書に記載の治療用タンパク質の一組は、細胞表面バイオマーカーのリガンド、低分子薬物要素、イメージング剤又は光学的作用物質（optical agent）等の化合物に架橋した、モノマー形態又はマルチマー形態の様々なタンパク質（例えば、アネキシンタンパク質又はその類縁体）からなり得る架橋化合物である。いくつかの実施形態において、治療用タンパク質は、68,000Daという糸球体ろ過の腎閾値を克服するように簡潔に設計することもできるし、又はホスファチジルセリン以外にも細胞表面のバイオマーカーを標的とすることもできるし、又は癌細胞の破壊のための作用物質を担持することもできる。

本発明は、架橋生成物を製造する方法及びマイクロアレイにおいて架橋生成物自体を使用する又は架橋生成物を成分として使用する方法、ファインケミカル及びキットの製造、放射性標識、分子イメージング及び光学イメージングの用途、並びに癌の診断及び処置にさらに関する。本開示の焦点は癌細胞に集中しているが、本発明及び本方法は、特定のウイルス病等、ホスファチジルセリンが細胞の外側表面に出現している病態を含む、その他の治療方法に使用することができる。

本明細書に記載のように、アネキシンのタンパク質ファミリーのメンバーは、特に興味深いものである。例えば、アネキシンVは、診断に関する研究の対象となり、顕著な毒性を伴うこともなく臨床での使用に用いられてきた。アポトーシス細胞の細胞表面バイオマーカーであるホスファチジルセリン（PS）に対しては、アネキシンVの高いアフィニティーが十分に確立されている。このタンパク質は、治療用タンパク質、例えばイメージング剤（imaging agent）の開発に使用することができる。PSに対する高いアフィニティーに加えて、アネキシンVは、免疫系及び細胞のクリアランスに影響する有力な特性も有する。実際、この10年間にわたる研究は、細胞の表面におけるホスファチジルセリンの曝露が免疫応答を阻害し得ることを示してきた。X. Yanらによる最近の研究により、PSを遮断すると、T細胞が媒介する腫瘍免疫が増強されて、腫瘍成長の阻害が起きることが示されている（Cancer Immunol Immunother. 2012年、61、1917〜27）。実際、本発明者らは、免疫療法薬としてのアネキシンを主体とする治療薬の使用を実用化する、新たな組成物を本明細書に記載している。

臨床に関連したアネキシンVの別の特徴は、食細胞をリクルートして、N末端におけるRGTトライアドからRGDトライアドへの突然変異のときにエフェロサイトーシスに関わる能力である（K. Schuttersら、Cell Death Differ. 2013年20、49〜56）。最近、単核食細胞系列（mononuclear phagocyte lineage）は、癌患者用の新規な処置に活用され得る、生物学的及び臨床的に顕著な腫瘍増強作用を有することが見出された（D.S. Dickensら、J Pediatr Hematol Oncol. 2009年、31、14〜7）。その結果、T細胞抗腫瘍免疫を引き出す（unlock）アネキシンの能力及びアネキシンのエフェロサイトーシス可能性は、ホーミング剤及び複数の治療用カーゴ（therapeutic cargo）の送達系としてのアネキシンの役割にさらなる特質をもたらす。

本明細書に記載の治療用タンパク質において、アネキシンタンパク質（及びバイオマーカーへのさらなるリガンド）は標的化用成分として働き、薬物は弾頭として働く。上記で示したように、アネキシンタンパク質は、作用物質にさらなる特質を与える、抗腫瘍免疫を促進する可能性も有する。

本明細書に記載のモジュール式合成手法は、この複合治療薬（multi-therapeutic agent）の要素を集合させる際に多数の利点を提供する。モジュール式合成手法は、生物学的利用能パラメータ及び生体要素と標的細胞との相互作用を最適化するために鋳型中で体系的に変更され得るスペーサーアミノ酸、ポリエチレングリコール及びアルキル鎖を含む、分子多様性に関する基礎をもたらす。アミノ酸の位置と同様に、例えばアミノ酸の組成を調節する能力もまた変動し得るものであり、治療上の意義をもたらす可能性がある。

したがって、本明細書に記載の治療用タンパク質は、アネキシンタンパク質をさらなる標的療法用として並外れて魅力的な送達媒体にする、免疫療法的特性、エフェロサイトーシス的特性及び癌細胞表面バイオマーカーに対するアフィニティー、を包含する3つで一組の特性をもたらし得る。特に、これらのタンパク質は、要素を様々な生体活性と結合させるための骨格（スキャホールド）として働き得、アネキシンのホーミング能力を強化して高精度標的化を達成するために、標的癌細胞に対して、（1）プロドラッグ形式での細胞毒性薬、抗血管新生薬及びその他の抗癌剤の配合剤を部位特異的に結合させ、（2）高いアフィニティーを有するさらなる要素も部位特異的に結合させる要件を満たし得る。

療法（癌療法を含む）
特に、治療用ペプチドは、細胞内での壊死活性又はアポトーシス活性の増大を特徴とする疾患の処置又は予防に有用であり得る。例えば、治療用ペプチド及びその医薬組成物は、癌及びその他の増殖性疾患、炎症及び炎症性疾患（例えば、炎症性腸疾患及び関節リウマチ）、クローン病並びに糖尿病の処置又は予防に有用であり得る。

本明細書に記載の方法に従って処置され得る癌としては、限定されるわけではないが、白血病（例えば、急性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、急性骨髄芽球性白血病、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病、急性単球性白血病、急性赤白血病、慢性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病）、真性赤血球増加症、リンパ腫（例えば、ホジキン病又は非ホジキン病）、ワルデンシュトレームマクロブリン血症（Waldenstrom's macroglobulinemia）、多発性骨髄腫、重鎖病、並びに、肉腫及び癌腫（例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫（lymphangioendotheliosarcoma）、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、子宮癌、精巣癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、シュワン腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫及び網膜芽細胞腫）等の固形腫瘍が挙げられる。

本明細書に記載の方法に従って処置され得る増殖性疾患としては、異形成、良性増殖異常性障害（benign dysproliferative disorder）、白板症、ボーエン病、角化症、農夫皮膚、日光口唇炎、日光角化症、肥満症、良性前立腺肥大症、乾癬、異常角化、リンパ増殖性障害（例えば、リンパ系の細胞が異常増殖する障害）、慢性関節リウマチ、動脈硬化、再狭窄及び糖尿病網膜症が挙げられる。さらに別の増殖性疾患が、参照により本明細書に組み込む米国特許第5,639,600号及び米国特許第7,087,648号に記載されている。

生物活性作用物質
治療薬の種類の例としては、限定されるわけではないが、炭水化物、抗菌薬、抗増殖薬（antiproliferative agent）、ラパマイシンマクロライド、鎮痛剤、麻酔剤、血管新生阻害薬、血管作動薬、抗凝血薬、免疫調節剤、細胞毒性作用物質、抗ウイルス薬、テルブロゲル（terbrogel）及びラマトロバン等の抗血栓剤、抗体、神経伝達物質、向精神薬、オリゴヌクレオチド、タンパク質、脂質並びにこれらの組合せが挙げられる。

本明細書に記載の方法に使用され得るさらなる治療薬としては、限定されはしないが、成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン、カルシトニン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GMCSF）、毛様体神経栄養因子及び上皮小体ホルモンが挙げられる。その他の特定の治療薬としては、上皮小体ホルモン関連ペプチド、ソマトスタチン、テストステロン、プロゲステロン、エストラジオール、ニコチン、フェンタニル、ノルエチステロン、クロニジン、スコポロミン（scopolomine）、サリチレート、サルメテロール、ホルメテロール（formeterol）、アルベテロール（albeterol）、ヴァリウム、ヘパリン、デルマタン、フェロクロムA、エリスロポエチン、ジエチルスチルベストロール、ルプロン、エストロゲンエストラジオール、アンドロゲンハロテスチン（androgen halotestin）、6-チオグアニン、6-メルカプトプリン、ゾロデックス（zolodex）、タキソール、リシノプリル/ゼストリル、ストレプトキナーゼ、アミノ酪酸、止血用アミノカプロン酸、パルロデル（parlodel）、タクリン、ポタバ（potaba）、アジペックス（adipex）、メムボラル（memboral）、フェノバルビタール、インスリン、γグロブリン、アザチオプリン、パペイン（papein）、アセトアミノフェン、イブプロフェン、アセチルサリチル酸、エピネフリン、フルクロロニド（flucloronide）、オキシコドンパーコセット、ダルガン（dalgan）、フレニリンブタビタール（phreniline butabital）、プロカイン、ノボカイン（novocain）、モルヒネ、オキシコドン、アロキシプリン、ブロフェナク（brofenac）、ケトプロフェン、ケトロラク、ヘミン、ビタミンB-12、葉酸、マグネシウム塩、ビタミンD、ビタミンC、ビタミンE、ビタミンA、ビタミンU、ビタミンL、ビタミンK、パントテン酸、アミノフェニル酪酸、ペニシリン、アシクロビル、オフラキサシン（oflaxacin）、アモキシシリン、トブラマイシン、レトロビオル（retrovior）、エピビル、ネビラピン、ゲンタマイシン、デュラセフ（duracef）、アブレセット（ablecet）、ブトキシカイン、ベノキシネート、トロペンジル、ジポニウム塩、ブタベリン、アポアトロピン、フェクレミン、レイオピロール、オクタミルアミン、オキシブチニン、アルブテロール、メタプロテレノール、ベクロメタゾンジプロピオネート、トリアムシノロンアセトアミド、ブデソニドアセトニド、イプラトロピウムブロミド、フルニソリド、クロモリンナトリウム、エルゴタミンタルトレート、並びに、TNFアンタゴニスト又はインターロイキンアンタゴニスト等のタンパク質薬物又はペプチド薬物が挙げられる。例えば、生物活性又は生体適合性の作用物質は、NSAID、コルチコステロイド又はCOX-2阻害剤、例えばロフェコキシブ、セレコキシブ、バルデコキシブ又はルミラコキシブ等の抗炎症剤であり得る。治療薬は、抗生物質も含み得る。

診断薬
本明細書に記載の方法に使用され得る診断薬の例としては、限定されはしないが、陽電子放射断層法（PET）、コンピュータ支援断層撮影法（computer assisted tomography）（CAT）、単一光子放射型コンピュータ断層撮影法、X線透視法及び磁気共鳴映像法（MRI）に使用されるイメージング剤等のイメージング剤が挙げられる。MRIにおける造影剤としての使用に適した材料としては、ガドリニウムキレート、並びに鉄、マグネシウム、マンガン、銅及びクロムのキレートが挙げられる。CAT及びX線に有用な材料の例としては、ヨウ素を主体とした材料が挙げられる。本明細書に記載の方法に使用され得るその他の診断薬は、その全体を参照により本明細書に組み込む米国特許出願公開第20100099649号に記載された診断薬が挙げられる。

癌療法に使用される治療薬
癌の処置に使用するための例示的な治療用ペプチド及びその医薬組成物が提供され、開示されている。本発明は、腫瘍血管系内皮細胞又は癌細胞の外側表面にある外部の受容体又は結合部位に特異的に結合する能力を有するリガンドを含み、外部の受容体又は結合部位が腫瘍血管系内皮細胞又は癌細胞に対して特異的である（すなわち、腫瘍血管系内皮細胞又は癌細胞の管腔表面に一意に発現又は過剰発現している）コンジュゲートを提供する。

数多くの癌治療薬は、投与した患者の大多数にわずかな利益しかもたらさない。最も厄介な治療上の難点のうちの2つは、健常な組織を害してしまうのを避けるための癌細胞に対する選択的毒性、並びに腫瘍の不均一性及び進行に対処するための併用療法の選択及び送達を必要とするものである。細胞毒性作用物質への健常な細胞の曝露を低減する戦略の1つは、癌細胞の表面のバイオマーカーを活用してこのような作用物質を腫瘍細胞に優先的に送達する、標的療法の使用であろう。このような作用物質の1つが、標的バイオマーカーに対する抗体のアフィニティーを活用して抗癌剤を関連細胞に送達する、抗体-薬物コンジュゲート（ADC）である。

現在のタンパク質コンジュゲートの開発における問題は、生成物の均質性に関する需要を満たす均一な作用物質を生成することの難しさである。例えば、上記のADC戦略は一般的に、別個の構造的同一性をそれぞれが有する種の混合物からなる。ADCの形成は、抗体上の特異的なアミノ酸に対する制御された化学反応を必要とするプロセスである、薬物と抗体とのコンジュゲートを伴う。システイン残基及びリシン残基は、しばしば、これらの残基の反応性及びこれらの残基が優先的に修飾される可能性を理由としてコンジュゲートの標的とされる。それにも拘わらず、これら2つのアミノ酸に絞り込んで集中してさえ、タンパク質の特異的な場所だけにコンジュゲートを制限する難しさは、複数のリシンの存在により、また、同様の反応性を有するシステインアミノ酸残基の存在によりリシンほどではないにせよ、タンパク質表面の全域にわたって同時に見受けられる。その結果、コンジュゲートにより、抗体に結合した薬物の数だけでなく薬物との結合の部位も異なっているADC種の混合物が生じる。したがって、抗体に結合した薬物の量は一般に、平均薬物対抗体比（DAR）として報告され、平均薬物対抗体比は、相異なる数及び場所の細胞毒性薬を含んだADCの不均一な群を評するものである。システインとコンジュゲートしたADCは、0から8までの範囲のDAR比を有する混合物であり、より多数のリシンとコンジュゲートしたADCは、さらにより大きく変動し得る可能性がある。

構造が特性決定されていない一揃いの成分を含む不均一な混合物を生成することの最終的な結果は、（1）古典的な先例の開発の構造的考察に基づいて最適な薬物を体系的に開発する現実的可能性がほとんどないこと、（2）活性を損なう部位への結合による活性の喪失を解明するのが困難であること、（3）このような複雑な製剤に関する毒性又は制約を加えるその他の特性を解き明かすことが非常に困難な作業になってしまい、潜在的な高次の懸念事項にもなること、及び（4）免疫反応及び抵抗性の見込みが大きくなることである。

タンパク質コンジュゲートに関しては、生成物を均一にするには、同じ要素が同じタンパク質部位に達するという、部位特異的方法の不足を考慮すると厄介な難点を必要とする。癌療法用として魅力的な作用物質は、細胞毒性作用物質を癌細胞に選択的に送達するだけでなく、抗腫瘍免疫を刺激することにより有効な併用療法を可能にすることもできる、単一の作用物質であろう。この種類の作用物質は、癌療法の目標となった標的療法及び併用療法に関する2つの特質を包含する。このような複合治療薬は、癌療法に関する有力な複数の特徴を併せ持つが、生成物の均質性を保障して製造され得る単一の化学組成物のコンジュゲートからなる均一な調製物の開発方法は足りていない。こうした調製物は、癌治療薬に関する用品（armamentarium）に加えるものとして有用であろう。

十分に特性決定された実用的な治療薬を実現するため及び御し難い混合物を無くすためには、複数の要素を担持し且つインビボでの循環時間が延長された均一なタンパク質コンジュゲートの構築が明らかに必要である。その結果、実現技術を構成する本発明の主要な態様は、治療に関連したいくつかの要素を、排泄に関する糸球体ろ過閾値を超えている融合タンパク質キャリアに部位特異的にグラフトするものである。これらの要素のそれぞれは、別個の治療方法又はバイオマーカーに対するリガンドを表すが、タンパク質コンジュゲートの集合体は、均一な調製物を表し、例えば、別個の構造的同一性を有する単一の種を表す。本発明の別の態様は、標的癌細胞に対する高いアフィニティー、抗腫瘍免疫を促進する能力及び作用の持続期間を理由として選択される、送達系としての融合タンパク質の選択に対処する。

いくつかの実施形態において、抗癌剤は、下記の治療薬からなる群より選択することができ、ここで、治療薬は、タンパク質に共有結合するために必須の官能性を有する。

13-cis-レチノイン酸、
2-CdA2-クロロデオキシアデノシン、
5-アザシチジン5-フルオロウラシル5-FU、
6-メルカプトプリン6-MP6-TG6-チオグアニン、
アブラキサン、アキュテイン(登録商標)、アクチノマイシン-アドリアマイシン(登録商標)、アドルシル(登録商標)、アフィニトール(登録商標)、アグリリン(登録商標)、アラ-コート(登録商標)、アルデスロイキン、アレムツズマブ、アリムタ（ALIMTA）、アリトレチノイン、アルカバン-AQ(Alkaban-AQ)(登録商標)、アルケラン(登録商標)、全トランス型レチノイン酸、α型インターフェロン、アルトレタミン、アメトプテリン、アミホスチン、アミノグルテチミド、アナグレリド、アナンドロン(登録商標)、アナストロゾール(Anastrozole)、アラビノシルシトシン、アラネスプ(登録商標)、アレジア(Aredia)(登録商標)、アリミデックス(登録商標)、アロマシン(登録商標)、アラノン(登録商標)、三酸化ヒ素、アルゼラ(商標)、アスパラギナーゼ、アトラ、アバスチン(登録商標)、アザシチジン、
BCG、BCNU、ベンダムスチン、ベバシズマブ、ベキサロテン、BEXXAR(登録商標)、ビカルタミド、BiCNU、ブレノキサン(登録商標)、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブスルファン、ブスルフェクス(登録商標)、
C225、カルシウムロイコボリン、キャンパス(登録商標)、カンプトサール(登録商標)、カンプトテシン-11、カペシタビン、カラク(Carac)(商標)、カルボプラチン、カルムスチン、カルムスチン、ウェハーカソデックス(WaferCasodex)(登録商標)、CC-5013、CCI-779、CCNU、CDDP、シーヌ(CeeNU)、セルビジン(Cerubidine)(登録商標)、セツキシマブ、クロラムブシル、シスプラチン、シトロボルム因子、クラドリビン、コルチゾン、コスメゲン(登録商標)、CPT-11、シクロホスファミド、シタドレン(登録商標)、シタラビン、リポソーマルシタラビン(Cytarabine Liposomal)、シトサール-U(登録商標)、サイトキサン(登録商標)、
ダカルバジン、ダコゲン、ダクチノマイシン、ダルベポエチンアルファ、ダサチニブ、ダウノマイシン、ダウノルビシン、ダウノルビシンヒドロクロリド、リポソーマルダウノルビシン(Daunorubicin Liposomal)、ダウノキソーム(登録商標)、デカドロン、デシタビン、デルタ-コルテフ(Delta-Cortef)(登録商標)、デルタゾン(登録商標)、デニロイキン、ディフィトックス(Diftitox)、デポサイト(商標)、デキサメタゾン、デキサメタゾンアセテート、デキサメタゾンナトリウムホスフェートデキサゾン、デクスラゾキサン、DHAD、DIC、ジオデックス(Diodex)、ドセタキセル、ドキシル(登録商標)、ドキソルビシン、リポソーマルドキソルビシン(Doxorubicin Liposomal)、ドロキシア(商標)、DTIC、DTICドーム(登録商標)、デュラロン(Duralone)(登録商標)、
エフデックス(登録商標)、エリガード(商標)、エレンス(商標)、エロキサチン(商標)、エルスパール(Elspar)(登録商標)、エムサイト(Emcyt)(登録商標)、エピルビシン、エポエチンアルファ、エルビタックス、エルロチニブ、エルウィニアL-アスパラギナーゼ、エストラムスチン、エチオール、エトポホス(登録商標)、エトポシド、エトポシドホスフェート、ユーレキシン(Eulexin)(登録商標)、エベロリムスエビスタ(登録商標)、エキセメスタン、
ファレストン(登録商標)、ファスロデックス(登録商標)、フェマーラ(登録商標)、フィルグラスチムフロクスウリジンフルダラ(登録商標)、フルダラビンフルオロプレックス(登録商標)、フルオロウラシルフルオロウラシル(クリーム)フルオキシメステロンフルタミドフォリン酸FUDR(登録商標)、フルベストラント
G-CSF、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ゲムツズマブオゾガマイシン、ゲムザール(Gemzar)、グリベック(商標)、ギリアデル(Gliadel)(登録商標)、ウェハーGM-CSF(WaferGM-CSF)、ゴセレリン、顆粒球コロニー刺激因子顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、
ハロテスチン(登録商標)、ハーセプチン(登録商標)、ヘキサドロールヘキサレン(登録商標)、ヘキサメチルメラミンHMMハイカムチン(登録商標)、ヒドレア(登録商標)、ヒドロコートアセテート(登録商標)、ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾンナトリウムホスフェート、ヒドロコルチゾンナトリウムスクシネート、ハイドロコートンホスフェートヒドロキシ尿素、
イブリツモマブ、イブリツモマブチウキセタン、イダマイシン(登録商標)、イダルビシンイフェックス(IdarubicinIfex)(登録商標)、IFN-α、イホスファミド、IL-11、IL-2イマチニブメシレート、イミダゾールカルボキサミド、インターフェロンα、インターフェロンα-2b(PEGコンジュゲート)、インターロイキン-2、インターロイキン-11、イントロンA(登録商標)、(インターフェロンα-2b)、イレッサ(登録商標)、イリノテカン、イソトレチノイン、イキサベピロン、イキセムプラ(Ixempra)(商標)、
キドロラーゼ(t)、
ラナコート(登録商標)、ラパチニブ、L-アスパラギナーゼ、LCR、レナリドミド、レトロゾール、ロイコボリン、リューケラン、ロイキン(商標)、ロイプロリド、ロイロクリスチン、ロイスタチン(商標)、リポソーマルAra-C、リキッドプレド(Liquid pred)(登録商標)、ロムスチン、L-PAML-サルコリシン、ルプロン(登録商標)、ルプロンデポ(登録商標)、
マツラン(Matulane)(登録商標)、マキシデックス、メクロレタミン、メクロレタミンヒドロクロリド、メドラロン(Medralone)(登録商標)、メドロール(登録商標)、メガス(Megace)(登録商標)、メゲストロール、メゲストロールアセテート、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メスネックス(Mesnex)(商標)、メトトレキサート、メトトレキサートナトリウム、メチルプレドニゾロン、メチコルテン(登録商標)、マイトマイシン、マイトマイシン-C、ミトキサントロン、M-プレドニゾール(M-Prednisol)(登録商標)、MTC、MTX、ムスタルゲン(登録商標)、ムスチン、ムタマイシン(登録商標)、ミレラン(登録商標)、マイロセル(Mylocel)(商標)マイロターグ(Mylotarg)(登録商標)、
ナベルビン(登録商標)、ネララビンネオサール(登録商標)、ニューラスタ(Neulasta)(商標)ニューメガ(Neumega)(登録商標)、ニューポゲン(Neupogen)(登録商標)、ネクサバール(登録商標)、ニランドロン(登録商標)、ニロチニブニルタミドニペント(NilotinibNilutamideNipent)(登録商標)、ナイトロジェンマスタード、ノバルデックス(Novaldex)(登録商標)、ノバントロン(登録商標)、エヌプレート(Nplate)、
オクトレオチド、オクトレオチドアセテート、オファツムマブ、オンコスパー(Oncospar)(登録商標)、オンコビン(登録商標)、オンタック(登録商標)、オンキサル(Onxal)(商標)オクレルベキンオラプレド(OprelvekinOrapred)(登録商標)、オラソン(Orasone)(登録商標)、オキサリプラチン
パクリタキセル、タンパク質結合パクリタキセル、パミドロネート、パニツムマブ、パンレチン(登録商標)、パラプラチン(登録商標)、パゾパニブ、ペジアプレド(Pediapred)(登録商標)、PEGインターフェロン、ペガスパルガーゼ、ペグフィルグラスチム、PEG-INTRON(商標)、PEG-L-アスパラギナーゼ、ペメトレキセド、ペントスタチン、フェニルアラニンマスタード、プラチノール(登録商標)、プラチノール-AQ(登録商標)、プレドニゾロン、プレドニゾン、プレロン(登録商標)、プロカルバジン、プロクリット(登録商標)、プロロイキン(登録商標)、カルムスチンインプラント含有プロリフェプロスパン20(Prolifeprospan 20 with Carmustine Implant)、プリネトール(登録商標)、
ラロキシフェン、レブリミド(登録商標)、リウマトレックス(登録商標)、リツキサン(登録商標)、リツキシマブロフェロン-A(登録商標)、(インターフェロンα-2a)、ロミプロスチムルベックス(登録商標)、ルビドマイシンヒドロクロリド、
サンドスタチン(登録商標)、サンドスタチンLAR(登録商標)、サルグラモスチムソル-コルテフ(SargramostimSolu-Cortef)(登録商標)、ソル-メドロール(登録商標)、ソラフェニブスプリセル(商標)STI-571ストレプトゾシンSU11248スニチニブスーテント(登録商標)、
タモキシフェン、タルセバ(登録商標)、タルグレチン(登録商標)、タシグナ(登録商標)、タキソール(登録商標)、タキソテール(登録商標)、テモダール(登録商標)、テモゾロミド、テムシロリムス、テニポシド、TESPA、サリドマイド、サロミド(登録商標)、テラシス(TheraCys)(登録商標)、チオグアニン、チオグアニンタブロイド(登録商標)、チオホスホアミドチオプレックス(ThiophosphoamideThioplex)(登録商標)、チオテパTICE(登録商標)、トポサル(Toposar)(登録商標)、トポテカン、トレミフェン、トリセル(登録商標)、トシツモマブ、トラスツズマブ、トレアンダ(登録商標)、トレチノイン、トレキサル(Trexall)(商標)トリセノックス(登録商標)、トスパチケルブ(TSPATYKERB)(登録商標)、
VCRベクチビックス(商標)ベルバン(Velbanベルバン)(登録商標)、ベルケイド(登録商標)、ベペシド(VePesid)(登録商標)、ベサノイド(登録商標)、ビアヅール(Viadur)(商標)ビダーザ(登録商標)、ビンブラスチン、ビンブラスチンスルフェート、ビンカサルPfs(Vincasar Pfs)(登録商標)、ビンクリスチン、ビノレルビン、ビノレルビンタルトレート、VLBVM-26、ボリノスタット、ボトリエントVP-16、ブモン(登録商標)、
ゼローダ(登録商標)、
ザノサール(登録商標)、ゼバリン(商標)ジネカルド(登録商標)、ゾラデックス(登録商標)、ゾレドロン酸、ゾリンザ及びゾメタ(登録商標)。

別の実施形態において、治療薬は、化学療法レジメンに使用することができ且つ本明細書に記載の部分のいずれか又はこれらの任意の組合せへのコンジュゲートに適した官能基を有し得る、表Aに記載の治療薬のいずれかである。

別の実施形態において、治療用タンパク質は、表Bに記載された化学療法レジメンのいずれかに使用される薬物のうちの1つ以上を含み得る。

併用化学療法レジメンのさらに別の組合せが当技術分野で公知であり（例えば、http://www.hci.utah.edu/patientdocs/hci/drugs/Chemoregimen/combocancer.htmlを参照されたい。）、例示的な概要を表Cに示している。

受容体及び/又はバイオマーカーに対するリガンド
本明細書に記載の治療用タンパク質は、場合により、細胞表面に存在する受容体及び/又はバイオマーカーに共有結合したリガンドを含む。特に興味深い治療用タンパク質は例えば、アネキシンV、アネキシンVI、アネキシンV-128、又はシステインを含む任意のアネキシンV若しくはアネキシンVIタンパク質、又はアミノ基転移によってN末端修飾することもでき且つ/若しくはシステインチオールのところをアルキル化され得るアネキシンV-128、又はカルボニル基を含む任意のアネキシンVの突然変異体若しくは伸長配列（extended sequence）、及び、受容体若しくは結合部位若しくはこれらの任意の組合せへの結合能力を実質的に保持している任意のアネキシンタンパク質断片若しくはそのバリアント等のヒトアネキシンから選択される構成タンパク質を含むものである。

所望の治療用タンパク質を得るための共有結合用のリガンドの例としては、限定されるわけではないが、タンパク質へのコンジュゲートのために修飾されたフォレート及びその誘導体、RGDモチーフペプチド（受容体:インテグリンαVβ3及びαVβ5）、NGRモチーフペプチド（受容体:アミノペプチダーゼN、CD13としても公知）、HMGN2の34アミノ酸塩基性ペプチドであるF3（受容体:細胞表面ヌクレオリン）、HWGF（ゼラチナーゼA及びゼラチナーゼBとしても公知のマトリックスメタロプロテイナーゼ-2及びマトリックスメタロプロテイナーゼ-9に対する選択的阻害剤）、合成ペプチドCTTHWGFTLC（血管新生による血管を標的とし、ヒト内皮細胞及び腫瘍細胞の遊走を阻害し、さらには動物モデルにおける腫瘍成長及び浸潤を防止し、ヒト腫瘍を有するマウスの生存を改善する）、及び、ウロキナーゼのアミノ末端断片（ATF）（ウロキナーゼA鎖のアミノ酸1〜135）が挙げられる。ATFは、ウロキナーゼ受容体に結合するが、全長ウロキナーゼとは異なり、内在化されない。

別の実施形態において、治療用タンパク質は、次の群から選択されるリガンドを含む: RGDモチーフペプチド、葉酸及び葉酸受容体に対するアフィニティーを有する葉酸の誘導体、ウロキナーゼ、上皮成長因子（EGF）、トランスフォーミング成長因子-α（TGFα）、インスリン様成長因子、インターロイキン-4（IL-4）、インターロイキン-6（IL-6）、血小板由来成長因子（PDGF）、線維芽細胞成長因子（FGF）、ラミニン、血管内皮成長因子（VEGF）、抗体又は抗体フラグメント（限定されるわけではないが、トランスフェリン受容体又はフィブロネクチンのED-Bドメインに対する抗体等）等。上記で列挙した成長因子のいくつかの構造及び特性は非常に類似しており、したがって、ある成長因子を利用すれば、別の受容体を標的とすることができる（例えば、TGFαは、EGF受容体に結合するのに利用することができる）。

治療用タンパク質は、リガンドのバリアントを含み得る。例えば、望ましくない生体活性を有するリガンドの一部を修飾することが望ましく、又は、リガンドの一部を修飾して抗癌剤の結合を可能にすることが望ましい。リガンドのバリアントがコンジュゲート中に存在する場合の唯一の要件は、リガンドバリアントがリガンドの受容体又は標的化用分子結合活性を実質的に保持していることである。さらに、配列は、修飾されたリガンドがリガンドの受容体結合活性を実質的に保持している限り、修飾中にリガンドに付加され得、又はリガンド内に挿入され得る。したがって、「リガンドバリアント」という用語は、置換（限定されるわけではないが保存的置換及び半保存的置換を含む）と、リガンドの受容体結合活性に実質的に影響しない天然リガンドの配列への付加及び挿入との両方を含むと理解すべきである。このような変異は、コンジュゲートを発現させることになる構築体の構築中の核酸レベルにおいて生じさせることができ、又はこうした変異は、限定されるわけではないが突然変異及び化学修飾を含む当業者に公知のその他の転写後の手段若しくは翻訳後の手段によって生じさせることができる。

本明細書で上述した受容体結合リガンドのうちの1つを修飾して、天然受容体結合リガンドの受容体結合能力を実質的に維持している断片又はそのバリアントを得ることは、当業者の技能に完全に含まれており、したがって本発明の範囲内でもある。「天然受容体結合リガンドの受容体結合能力を実質的に維持している」という用語は、タンパク質断片又はバリアントが、天然リガンドの受容体結合能力の少なくとも50％、好ましくは天然リガンドの受容体結合能力の少なくとも75％、より好ましくは天然リガンドの受容体結合能力の少なくとも90％を維持していることを意味する。

いくつかの実施形態において、治療用タンパク質は場合により、リガンドに機能的に結合している抗癌剤（例えば、本明細書に記載の抗癌剤のいずれか）をさらに含み、ここで、抗癌剤は、癌細胞に対して選択的に毒性（傷害性）であり、癌細胞の死を誘導し、又は癌細胞の成長若しくは増殖を阻害する。

本発明の治療用タンパク質のリガンドは、癌細胞又は腫瘍血管系内の細胞の表面（例えば、アミノリン脂質）に一意に存在する受容体又はその他の標的化用分子に結合し、且つ場合により、治療用タンパク質を形成するタンパク質と異なっている（例えば、治療用タンパク質がアネキシンのモノマー又はマルチマーである場合、標的化用タンパク質がアネキシンタンパク質ではない）、その他の任意の標的化用タンパク質又は組成物であってもよい。リガンドが結合タンパク質である場合、リガンドは、所望の受容体若しくはその他の標的化用分子に結合するタンパク質全体を含み得、又はリガンドは、結合タンパク質の一部のみを含み得る。例えば、望ましくない生体活性を有する結合タンパク質の一部を除去することが望ましく、又は、抗癌剤の結合を可能にするために、結合タンパク質の一部を除去することが望ましい。結合タンパク質の一部がリガンドとしてコンジュゲート中に存在する場合の唯一の要件は、タンパク質の一部がタンパク質の受容体又は標的化用分子結合活性を実質的に保持していることである。「一部」及び「断片」という用語は、本明細書で互換的に使用される。

本発明に従ってコンジュゲート又はマルチマーによって標的とされ得る受容体の例は、ウロキナーゼ受容体、上皮成長因子（EGF）受容体亜型、インスリン様成長因子受容体、インターロイキン-4（IL-4）受容体、インターロイキン-6（IL-6）受容体、角化細胞成長因子（KGF）受容体、血小板由来成長因子（PDGF）受容体、線維芽細胞成長因子（FGF）受容体、ラミニン受容体、血管内皮成長因子（VEGF）受容体、トランスフェリン受容体、ホスファチジルセリン（PS）、ホスファチジルエタノールアミン（PE）及びフィブロネクチン等も挙げられるし、さらには、本発明のコンジュゲートのリガンドへの結合能力を実質的に維持しており、且つコンジュゲートが実質的に内在化することなくコンジュゲートを細胞の表面に維持している、これらの一部及びバリアントも挙げられる。いくつかの実施形態において、受容体に対するリガンドは、ウロキナーゼ、上皮成長因子（EGF）、トランスフォーミング成長因子-α（TGFα）、インスリン様成長因子、インターロイキン-4（IL-4）、インターロイキン-6（IL-6）、血小板由来成長因子（PDGF）、線維芽細胞成長因子（FGF）、ラミニン、血管内皮成長因子（VEGF）からなる群より選択することができる。

本発明の治療用タンパク質は、従来技術の方法のいくつかの利点を提供する。第一に、殺滅しようとする細胞又は殺滅しようとする細胞を供給する血管系に抗癌剤が標的化されているため、抗癌剤を含むコンジュゲートの投薬量は、抗癌剤を単独で全身投与する場合の投薬量より著しく少なくすべきである。コンジュゲートのリガンドとその受容体のそれぞれとの相互作用により、天然リガンド（ウロキナーゼ又は成長因子等）が受容体から除かれるので、天然リガンドが癌細胞の侵襲力又は生物学的利点に関与している場合は、癌細胞の増殖及び/又は侵襲力が大きく阻害される。

ポリペプチド生物活性作用物質
さらに別の実施形態において、治療用タンパク質に共有結合した生物活性作用物質はポリペプチドである。場合により、生物活性ポリペプチドは、治療用タンパク質を形成するタンパク質とは異なる（例えば、治療用タンパク質がアネキシンのモノマー又はマルチマーである場合、生物活性ポリペプチドがアネキシンタンパク質ではない）。例示的な生物活性ポリペプチドとしては、限定されるわけではないが、バソプレシン、オキシトシン、メラニン細胞刺激ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン、成長ホルモン等の下垂体ホルモン；成長ホルモン放出因子、コルチコトロピン放出因子、プロラクチン放出ペプチド、ゴナドトロピン放出ホルモン及びその関連ペプチド、黄体形成ホルモン放出ホルモン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、オレキシン並びにソマトスタチン等の視床下部ホルモン；カルシトニン、カルシトニン前駆体及びカルシトニン遺伝子関連ペプチド等の甲状腺ホルモン；上皮小体ホルモン及びその関連タンパク質；インスリン及びインスリン様ペプチド、グルカゴン、ソマトスタチン、膵ポリペプチド、アミリン、ペプチドYY並びに神経ペプチドY等の膵臓ホルモン；ガストリン、ガストリン放出ペプチド、ガストリン阻止ペプチド、コレシストキニン、セクレチン、モチリン及び血管作動性腸ペプチド等の消化ホルモン；心房性ナトリウム利尿ペプチド、脳性ナトリウム利尿ペプチド及びC型ナトリウム利尿ペプチド等のナトリウム利尿ペプチド；ニューロキニンA、ニューロキニンB及びサブスタンスP等のニューロキニン；レニン基質及びレニン阻害剤並びにアンギオテンシン等のレニン関連ペプチド；ビッグエンドセリン、エンドセリンA受容体アンタゴニスト及びサラホトキシンペプチドを含むエンドセリン；並びにその他のペプチド、例えばアドレノメデュリンペプチド、アラトスタチンペプチド、アミロイドβタンパク質断片、抗生物質ペプチド及び抗菌性ペプチド、アポトーシス関連ペプチド、嚢細胞ペプチド、ボンベシン、骨Glaタンパク質ペプチド、CARTペプチド、走化性ペプチド、コルチスタチンペプチド、フィブロネクチン断片及びフィブリン関連ペプチド、FMRF及びFMRF類縁体ペプチド、ガラニン及びガラニン関連ペプチド、成長因子及び成長因子関連ペプチド、治療用ペプチド結合Gタンパク質断片、グアニリン及びウログアニリン、インヒビンペプチド、インターロイキン及びインターロイキン受容体タンパク質、ラミニン断片、レプチン断片ペプチド、ロイコキニン、肥満細胞脱顆粒ペプチド、下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド、パンクレアスタチン、ペプチドT、ポリペプチド、ウイルス関連ペプチド、シグナル伝達試薬、毒素、並びに種々のペプチド、例えばアジュバントペプチド類縁体、α接合因子、抗不整脈性ペプチド、不凍ポリペプチド、食欲抑制性ペプチド、ウシ松果体抗再生性ペプチド、ブルシン（bursin）、C3ペプチドP16、腫瘍壊死因子、カドヘリンペプチド、クロモグラニンA断片、避妊用テトラペプチド、コナントキンG、コナントキンT、甲殻類心臓作動性ペプチド、C-テロペプチド、シトクロムb588ペプチド、デコルシン、デリシャスペプチド（delicious peptide）、デルタ睡眠誘導ペプチド、ジアゼパム結合インヒビター断片、一酸化窒素合成酵素遮断ペプチド、OVAペプチド、血小板カルパイン阻害剤（P1）、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤1、リギン（rigin）、統合失調症関連ペプチド、血清胸腺因子、ナトリウムカリウムA治療用ペプチダーゼ阻害剤-1、スペラクト、精子活性化ペプチド、システミン、トロンビン受容体アゴニスト、胸腺液性γ2因子、チモペンチン、チモシンα1、胸腺因子、タフトシン、脂肪動員ホルモン、尿毒性ペンタペプチド、グルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチド（GIP）、グルカゴン様ペプチド-1（GLP-1）、グルカゴン様ペプチド-2（GLP-1）、エキセンジン-3、エキセンジン-4並びにその他の治療用ペプチド又はこれらの断片が挙げられる。ペプチドのさらなる例としては、グレリン、オピオイドペプチド（カソモルフィンペプチド、デモルフィン（demorphin）、エンドルフィン、エンケファリン、デルトルフィン、ダイノルフィン並びにこれらの類縁体及び誘導体）、胸腺ペプチド（チモポエチン、チムリン、チモペンチン、チモシン、胸腺液性因子（THF）、細胞接着ペプチド、補体阻害剤、トロンビン阻害剤、トリプシン阻害剤、α-1アンチトリプシン、ウニ精子活性化ペプチド、SHU-9119 MC3-R及びMC4-Rアンタゴニスト、グラスピモド（glaspimod）（細菌感染、真菌感染、免疫不全免疫障害、白血球減少症に対して有用な免疫刺激剤）、HP-228（化学療法に誘導される嘔吐、毒性、疼痛、糖尿病、炎症、関節リウマチ、肥満症に対して有用なメラノコルチン）、α2-プラスミン阻害剤（プラスミン阻害剤）、APC腫瘍抑制剤（新生物に対して有用な腫瘍抑制剤）、早期妊娠因子（免疫抑制剤）、エンドゼピンジアゼパム結合阻害剤（受容体ペプチド）、γインターフェロン（白血病に対して有用）、腺性カリクレイン-1（免疫刺激剤）、胎盤リボヌクレアーゼ阻害剤、サルコレシン結合タンパク質（sarcolecin binding protein）、サーファクタントプロテインD、ウィルムス腫瘍抑制因子、GABAB 1b受容体ペプチド、プリオン関連ペプチド（iPrPl3）、コリン結合タンパク質断片（細菌関連ペプチド）、テロメラーゼ阻害剤、カルジオスタチンペプチド（cardiostatin peptide）、エンドスタチン由来ペプチド（血管新生阻害剤）、プリオン阻害ペプチド、N-メチルD-アスパラギン酸受容体アンタゴニスト、C-ペプチド類縁体（糖尿病性合併症に対して有用）、RANTES、NTY受容体、NPY2-R（神経ペプチドY型2-受容体）リガンド、NC4Rペプチド又はこれらの断片が挙げられる。参照により本明細書に組み込む米国特許第6,849,714号を参照されたい。同様に、α-1アンチトリプシン、アンギオスタチン、抗溶血性因子、抗体、アポリポタンパク質、アポタンパク質、心房性ナトリウム利尿因子、心房性ナトリウム利尿ポリペプチド、心房性ペプチド、C--X--Cケモカイン（例えば、T39765、NAP-2、ENA-78、Gro-a、Gro-b、Gro-c、IP-10、GCP-2、NAP-4、SDF-1、PF4、MIG）、カルシトニン、CCケモカイン（例えば、単球走化性タンパク質-1、単球走化性タンパク質-2、単球走化性タンパク質-3、単球炎症性タンパク質-1α、単球炎症性タンパク質-1β、RANTES、1309、R83915、R91733、HCC1、T58847、D31065、T64262）、CD40リガンド、C-kitリガンド、コラーゲン、コロニー刺激因子（CSF）、補体因子5a、補体阻害剤、補体受容体1、サイトカイン（例えば、上皮好中球活性化ペプチド-78、GRO（求積法）/MGSA（GRO.quadrature./MGSA）、GRO、GRO、MIP-1、MIP-1、MCP-1）、上皮成長因子（EGF）、エリスロポエチン（「EPO」）、表皮剥離毒素A及び表皮剥離毒素B、第IX因子、第VII因子、第VIII因子、第X因子、線維芽細胞成長因子（FGF）、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、G-CSF、GM-CSF、グルコセレブロシダーゼ、ゴナドトロピン、成長因子、ヘッジホッグタンパク質（例えば、ソニックヘッジホッグ、インディアンヘッジホッグ、デザートヘッジホッグ）、ヘモグロビン、肝細胞成長因子（HGF）、ヒルジン、ヒト血清アルブミン、インスリン、インスリン様成長因子（IGF）、インターフェロン（例えば、IFN-α、IFN-β、IFN-γ）、インターロイキン（例えば、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12等）、角化細胞成長因子（KGF）、ラクトフェリン、白血病抑制因子、ルシフェラーゼ、ニュールツリン、好中球抑制因子（NIF）、オンコスタチンM、骨形成タンパク質、上皮小体ホルモン、PD-ECSF、PDGF、ペプチドホルモン（例えば、ヒト成長ホルモン）、プレイオトロピン（Pleiotropin）、プロテインA、プロテインG、発熱性外毒素A、発熱性外毒素B及び発熱性外毒素C、リラキシン、レニン、SCF、可溶性補体受容体I、可溶性I-CAM 1、可溶性インターロイキン受容体（IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15）、可溶性TNF受容体、ソマトメジン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ストレプトキナーゼ、スーパー抗原、すなわち、ブドウ球菌エンテロトキシン（SEA、SEB、SEC1、SEC2、SEC3、SED、SEE）、スーパーオキシドジスムターゼ、毒素性ショック症候群毒素（TSST-1）、チモシンα1、組織プラスミノーゲン活性化因子、腫瘍壊死因子β（TNFβ）、腫瘍壊死因子受容体（TNFR）、腫瘍壊死因子-α（TNFα）、血管内皮成長因子（VEGF）、ウロキナーゼ、T-20、SS-14、LHRH、エリスロポエチン（EPO）、G-CSF、TPO、アキソカイン（axokine）、レプチン、及びその他諸々も挙げられる。生物活性分子とコンジュゲート、結合又は融合したhAの例は、参照により本明細書に組み込む米国特許第7,056,701号、米国特許第7,041,478号、米国特許第7,045,318号、米国特許第6,994,857号、米国特許第6,987,006号、米国特許第6,972,322号、米国特許第6,946,134号、米国特許第6,926,898号、米国特許第6,905,688号、米国特許第6,686,179号、米国特許第6,548,653号、米国特許第6,423,512号、米国特許第5,773,417号及び米国特許第5,594,110号に見出すことができる。

アネキシン
本明細書で示されたように、アネキシンV及びアネキシンV-128等、アネキシンを含む治療用タンパク質は、特に有用であり得る。

本明細書の実施形態のいずれかにおいて、アネキシンは、ヒトアネキシンである、又はヒトアネキシンに対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％若しくは少なくとも95％の配列同一性を有するタンパク質である。さらに別の実施形態において、アネキシンは、ヒトアネキシンVである、又はヒトアネキシンVに対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％若しくは少なくとも95％の配列同一性を有するタンパク質である。例えば、いくつかの実施形態において、アネキシンは、表Dに示されたヒトアネキシンV（配列番号1）（アクセッション番号P08758）である、又は該タンパク質に対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％若しくは少なくとも95％の配列同一性を有するタンパク質である。

アネキシンV-128は、例えば、Jinら、Journal of Biological Chemistry、279:40351〜347、2204に記載されている。アネキシンV-128は、野生型ヒトアネキシン1に類似しているが、(Met)-Ala-Gly-Gly-Cys-Gly-HisのN末端伸長、野生型アネキシンVの1位におけるイニシエーターMetの除去、そして3つ目にCys-316からSerへの点突然変異という、3つの修飾を有する組換えヒトタンパク質である（前掲）。本明細書の実施形態のいずれかにおいて、アネキシンは、アネキシンV-128である、又はアネキシンV-128に対して少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％若しくは少なくとも95％の配列同一性を有するタンパク質である。

過去10年間、アネキシンVの有用性は、インビトロでのアポトーシス細胞の検出への集中から、潜在的な臨床用途を伴うインビボ分子イメージング技術まで発展してきた。アネキシンVの特異的内在化特性という主要な発見により、治療への用途応用の基礎としてアネキシンVを使用する見込みが高まった。PSは、大半の細胞中で形質膜の細胞質表面に限局されたアニオン性リン脂質であり、アポトーシス細胞、特定の腫瘍細胞及びウイルスの表面に外在化する。van Genderenら（Extracellular annexin V: functions of phosphatidylserine-binding and two-dimensional crystallization. Biochim Biophys Acta. 2008年、1783(6):953-63。）は、PSを発現している細胞への細胞侵入の入口がアネキシンVにより開かれることを報告した。アネキシンVは、PSに密接に結合するだけでなく、要素が共有結合し合うことに伴ってアネキシンVの内在化が起きることになる表面に二次元的な網目構造を形成しもする。癌細胞の近傍への抗癌剤の放出を伴わせることによってアネキシンコンジュゲートを局在化するための戦略は、有効な治療薬の送達には十分であり得るが、アネキシンVの特異的内在化特性は、このタンパク質を、アネキシンVに対する高いアフィニティーを有する細胞を送達の標的とすることより疾患から回復させ得る要素のキャリアとして使用するさらなる誘因をもたらす。PSを発現している細胞の細胞内区画を薬理学的化合物が標的とするようになる可能性は、アネキシンV及びそのバリアントの部位特異的修飾並びに均一な付加物の形成によって大幅に高められるであろう。

したがって、アポトーシスが起きている細胞への送達系としてアネキシンVを利用することの実現性は、部分的には、アネキシンVが、PS結合を著しく損なうことなく結果としてアポトーシス細胞結合特性までも著しく損なってしまうことなく幅広い範囲のレポーター化合物とコンジュゲートし得ることに基づいている。この現象は、PSを発現している細胞の細胞内区画に薬理学的化合物を標的化する可能性を切り開いた。アネキシンVが腫瘍細胞等の生細胞に結合することができ、且つ結合したときに生細胞に入り込むことができるという根拠もある。PSは、腫瘍の血管内の血管内皮細胞の表面には曝露されているが、正常な内皮には曝露されていない（S. Ran、A. Downes、P.E. Thorpe、Increased exposure of anionic phospholipids on the surface of tumor blood vessels、Cancer Res.62 (2002年) 6132〜6140; S. Ran、P.E. Thorpe、Phosphatidylserine is a marker of tumor vasculature and a potential target for cancer imaging and therapy、Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 54 (2002年)1479〜1484）。

PSが腫瘍細胞の外側表面に発現するという豊富な根拠もある（T. Utsugi、A.J. Schroit、J. Connor、C.D. Bucana、I.J. Fidler、Elevated expression of phosphatidylserine in the outer membrane leaflet of human tumor cells and recognition by activated human blood monocytes、Cancer Res. 51 (1991年) 3062〜3066; M. Sugimura、R. Donato、V.V. Kakkar、M.F. Scully、Annexin V as a probe of the contribution of anionic phospholipids to the procoagulant activity of tumour cell surfaces、Blood Coagul. Fibrin. 5 (1994年)365〜373）。

癌治療薬に関するさらなる基礎は、PSに密接に結合して抗腫瘍免疫を促進するアネキシンダイマー及びマルチマーの構築を活発化させている、X. Yanらの業績（Cancer Immunol. Immunother. Annexin V promotes anti-tumor immunity and inhibits neuroblastoma growth in vivo. 2012年、4月5日. DOI 10.1007/s00262-012-1250-4）に由来する。

これらの観察により、腫瘍細胞に対する抗癌剤の細胞標的化をアネキシンが媒介する有力な論拠がもたらされた。

癌細胞又はアポトーシスが起きている細胞への送達系としてのアネキシンタンパク質の広範な利用には、タンパク質が、PSに対するコンジュゲートの結合能力を著しく損なうことなく結果としてアポトーシス特性又は癌細胞結合特性までも著しく損なってしまうことなく、幅広い範囲の有機化合物及び生物学的製剤とコンジュゲートすることができる方法が有益である。部位特異性は、ホスファチジルセリンに対するアネキシンVに固有のアフィニティーの維持において重要であり、このタンパク質の非特異的標識は、アネキシンコンジュゲートのPSへの結合を厳しく制限し得ることが実証されている。本明細書に記載の方法の顕著な利点は、アネキシンタンパク質（例えば、アネキシンV及びアネキシンV-128）のフレームワークに官能基を部位特異的に導入し、このような官能基と、そのうちの数多くが生物活性要素である様々なペイロード（payload）とを結合することができる点である。実際、本発明者らが達成したアネキシンタンパク質の示差的反応性について理解すると、前記タンパク質の相対的反応性の実験観察結果に依存していた本発明者らの方法の開発が導かれた。

したがって、高度に相同な抗血栓性タンパク質のファミリーであるアネキシンであってそのうち10がいくつかのヒト組織中に発現させるものであるアネキシンにより、癌細胞及び腫瘍を特異的に破壊するための戦略が提供される（Benz及びHofmann、Biol. Chem. 378:177〜183(1997年）。アネキシンは、両方とも血液凝固のために必要とされる、カルシウムと負に帯電したリン脂質とを結合する特性を共有している。生理条件下では、負に帯電したリン脂質は主に、活性化した細胞膜又は損傷した細胞膜中のホスファチジルセリン（PS）によって供給される。無傷の細胞中では、PSは、形質膜二重層の内葉に限定されており、表面に接触することができない。

アネキシンI、II、IV、V及びVIIIを含むいくつかのアネキシンは、高いアフィニティーでPSと結合する。アネキシンVは、負に帯電したリン脂質に対する第X因子、第Xa因子及び第Va因子のアフィニティーより大きな、非常に高いアフィニティー（K_d=1.7 nmol/L）でPSと結合する（Thiagarajan及びTait、J. Biol. Chem. 265:17420〜17423(1990年）。

これらの観察により、このような血管及び腫瘍細胞に対する抗癌剤の細胞標的化をアネキシンが媒介する有力な論拠がもたらされた。アネキシンVが媒介する内在化は、癌及び心血管疾患を含む様々な疾患を処置するための標的化薬物送達及び細胞進入に関する新規な治療のプラットフォームを創出する。アネキシンタンパク質等の高分子キャリアと化学療法剤とが結合していれば、遊離薬物の分布容積が著しく低減され、遊離薬物の濃度を、腫瘍又は腫瘍内皮の中に向かっていくにつれて濃くすることができ、結果として、非特異的毒性の量及び種類を減少し、薬物要素の投薬当量当たりで腫瘍に効果的に送達され得る薬物の量を増大することができる。この戦略は、低分子要素を用いたアネキシンの部位特異的標識を含む本発明の一実施形態に用いられる。本発明の第2の実施形態において、元の形態（parent form）又は修飾された形態の2つ以上のアネキシンタンパク質が、治療用途において循環タンパク質としてのアネキシンの作用の持続期間を延長するための化学修飾又は組換えDNA技術によって一緒に結合している。

治療用タンパク質の部位特異的合成
制御しながら共通の腫瘍部位に送達される薬物の組合せにおける標的療法の有用性にも関わらず、治療用タンパク質（例えば、アネキシンコンジュゲート）の構築中に、各有機化学的要素（薬物及びホーミング剤を含む）をこれらの要素に固有の排他的部位に部位特異的にコンジュゲートするための化学的方法が不足している。このような戦略は、併用療法に有利な戦略を実現するために複数の治療薬を含むタンパク質の調製において、特に有用であろう。骨格（スキャホールド）上の複数の治療要素の利益を実現するため、並びに開発、製造及び規制の遵守を損なう不均一な混合物を無くすためには、部位特異的なコンジュゲート方法が必要とされる。

さらなる有益な作用が、循環時間の改善等の有益な臨床作用を与え得るマルチマータンパク質の使用によってもたらされ得る。閾値要件を満たすために、本発明は、アネキシンのマルチマー、アネキシン融合タンパク質、並びに循環時間がアネキシンモノマーと比較して延長されたこれらの化学修飾を含むタンパク質マルチマーに関する方法及び物質の組成物を開示している。

さらに、アネキシン架橋酸化鉄（H. Chenら、Nanomedicine. 2012年、8、291〜8）粒子等、アネキシン標識された特定のナノ粒子は、マウスの体内での血液半減期が延長されており、本明細書に記載の治療用タンパク質中に使用することができる。

アネキシン融合タンパク質のN末端のところ及び/又はシステインチオールのところに要素を部位特異的に結合するための方法が、本明細書に記載されている。これらの方法は、特異的な癌細胞表面を標的とする複数の治療薬、特に有機化学的ファーマコフォアを担持する均一な融合タンパク質コンジュゲートを調製する目的を実現可能にする。

分析に関して、部位特異性の判定の必要条件は、標的タンパク質を有する1当量の反応性要素が理論的質量に相当する単一の新たな質量のみをもたらす、質量分析法による観察である。例えば、タンパク質への付加反応は、部位特異性が達成されていた場合、タンパク質と反応性要素を合わせた質量のみをもたらすはずである。タンパク質の95％〜100％が消費された場合においてさえ部位特異的反応がただ1つの新たな質量を示すため、この判定基準を適用することは容易である。例外なく、複数の残基の標識を示す複数の質量が非特異的反応により示された後で、標的タンパク質が消費された。したがって、質量スペクトログラムを閲覧しても、非特異的反応が明白である。

採用されてきたものでより厳格な判定基準は、単一標識された種（monolabeled species）を酵素により消化した後、標識の正確な標識部位を判定するのに使用される質量分析法（当技術分野で十分に確立された技法）による分析を行うものである。

一実施形態において、本発明者らは、アネキシンV又はアネキシンV-128を実質的に（通常は定量的に）アミノ基転移させ、末端にカルボニルアミドを有するタンパク質を生成することができた。アミノ基転移したこれらのタンパク質は、アミノキシ、ヒドラジド等のカルボニル試薬を用いたさらなる修飾、ピクテ-スペングラー連結反応（P. Agarwal、A Pictet-Spengler ligation for protein chemical modification. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013年110、46〜51）の対象であり、また、還元的アミノ化のための基質としてのアミンを用いたさらなる修飾の対象でもある。実際、本発明者らは、アニリン基質を用いてタンパク質中に取り付けたカルボニルの高い収率を達成し、場合によっては定量的に高い収率を達成した。代替的には、アネキシンタンパク質の選択的アシル化を、一次の条件（first order condition）下でタンパク質が過剰になっている、速度論的に制御された技法を用いて達成した。これらの選択的縮合反応は一般に、要素をアネキシンタンパク質に部位特異的に結合するための基礎をもたらす。

別の実施形態において、本発明者らは、アネキシンタンパク質のシステインチオールを部位選択的に修飾するための経験的特異点を解明することができた。本発明者らは、チオール求核性及びその局所環境に応じて、複合治療に関連した要素を含む様々なモジュールを結合することができた。例えば、本発明者らは、α-ハロメチルケトンは一般に、アネキシンV及びアネキシンV-128をチオール特異的にアルキル化することができるが、プロパルギルハライド及びアリルハライド、マレイミド、ハロ-アセトアミド、アクリルアミド並びにベンジルハライド基質は、アネキシンV-128に対してのみチオール特異的であることを決定した。

複数の要素を担持するアネキシンコンジュゲートの調製は、タンパク質表面に沿った各要素に一意な部位に要素を取り付けるために部位特異的方法が利用可能であることを条件にして、各要素を一意なアミノ酸に直接結合することで達成され得る。第2の手法は、緻密な鋳型に要素を結合して、タンパク質キャリアに最終的には同時に結合し得る一連のペイロードを生成することであろうし、したがって、この後者の手法は多数の利点をもたらす。

第一に、標準的な低分子合成方法は、要素を鋳型に特異的に配置するのに用いることができる。第二に、標準的な分析方法は、所望の要素を取り付けた修飾済み鋳型を明確に特性決定するのに用いることができる。すべての必要な特徴を「ペイロード付き」鋳型の所定位置に集合させた後、この鋳型を次いで、クリックケミストリー技法を用いた最終ステップにより結合させることができる。最後に、融合タンパク質への付属品として鋳型を事前に集合させることは、鋳型がタンパク質系と化学的に適合し且つ最終的な治療薬の生物学的利用能要件を満たすことを条件にして、多数の鋳型の使用を可能にする。

現行技術において、有識者の見解（informed opinion）では、個々の薬物のいずれか1つの使用ではなく併用療法が癌のための大半の癌処置の鍵だと考えられている。実際、強力な細胞毒性作用物質の組合せの特異的標的化が有力である。これに関連して、作用物質の抗癌活性を最大化して有用な相乗効果を得るために、アネキシンVについて報告された抗腫瘍免疫は、化学療法剤、抗血管新生薬、及び癌細胞表面バイオマーカーに対するリガンド等によって強化することができる。これに応じて、これらの要素のそれぞれの結合のための化学的戦略を以下に述べている。

アネキシンの修飾
本発明の重要な実施形態は、アネキシンタンパク質のマルチマー並びにアネキシンコンジュゲートのマルチマーを調製するのに化学修飾を使用することができることである。PSのアネキシンV遮断は、T細胞が媒介する腫瘍免疫を強化して腫瘍成長を阻害し得る。抗癌剤の特異性、腫瘍の成長及び増殖もまた、様々なリガンドを用いて制御することができるため、リガンドをアネキシンVに結合すると、骨格アネキシンについて観察された強化された腫瘍免疫を活用することができる。特異的な癌への適用の場合、アネキシンタンパク質及びそのコンジュゲートの循環時間は、アネキシンタンパク質又はそのコンジュゲートがあまりに急速に循環から除去される場合、効力を限定することになる。68,000Daという腎臓ろ過閾値を克服するための臨界量は、融合タンパク質技術を用いて達成することができる。ダイアネキシンは、このような手段によって生成されており、再灌流虚血による傷害を処置するのに使用されているものであり、本発明者らは、ヒト及び家庭用のペットの癌の処置のための使用としてのダイアネキシンを主張している。ホルミルグリシンを産生する酵素の使用（Rushら、J. Am. Chem. Soc.、2008年130 (37)、12240〜12241）等、その他の組換え方法により、有機化学的要素が付加し得る官能基を有するマルチマーを生成することができる。

多様な官能基を導入するための有機化学反応を用いてアネキシンを修飾してアネキシンを様々な要素、例えば薬物、細胞表面バイオマーカーに対するリガンド及び/又はタンパク質分子へのリガンドに結合させて、循環中の治療特性を最適化することは、特に有利である。化学修飾によるタンパク質の架橋は、線形配列のペプチド結合の確立に限定されるDNA組換え技術単独での柔軟性を大幅に上回る柔軟性を可能にする。アネキシンの場合は特に、腫瘍免疫を促進する固有の能力は、（1）標的癌細胞の表面又は内部に輸送され得る様々なリガンドを付加すること、（2）アネキシンをより正確に標的とするためのさらなるバイオマーカーに対するリガンドを特異的な癌細胞に結合すること、及び（3）さらなる生物学的特性を有するその他のタンパク質又は薬物動態に肯定的に影響するその他のタンパク質によってさらに活用され得る。その質量により分子量68,000Daという腎臓ろ過閾値を超えているアネキシンタンパク質のコンジュゲートが、いくつかの方法により、組換えDNA技術によるマルチマーの形成を用いて生成され得、化学修飾によるマルチマーの形成を用いて生成され得、又はアネキシンV若しくはそのバリアント若しくは突然変異体のPEG化によって生成され得る。

本発明者らは、タンパク質又はその修飾物を結合させて、マルチマー形態又はPEG化形態を有することの潜在的な利点を利用するためのいくつかの方法を考案した。例えば、68,000Daという腎臓ろ過閾値を超えているアネキシン及びマルチマーのPEG化形態は、作用の持続期間が延長されたホスファチジルセリンを遮断する要素としての使用が見出されるはずであり、本発明者らは、本明細書で略述したこのような種のいくつかを調製した。化学量論を修正すれば、ダイアネキシン等のアネキシンタンパク質のマルチマーもまた、モノマーアネキシンと同じ化学反応の対象であることに注目すべきである。例えば、融合タンパク質、ダイアネキシンは、両方のシステインのところで官能化され得るが、ただ1つのN末端しかアミノ基転移用には存在しない。カルボニル官能基及びチオール官能基を用いた例示的な戦略が本明細書に記載されている。

架橋又はコンジュゲートのための部位を取り付けるためのタンパク質修飾
カルボニル戦略
例えば、本発明者らは、アネキシンV及びアネキシンV-128等のアネキシンタンパク質（（1）=アネキシンタンパク質）をN-末端のところで実質的に転換させて、カルボニルアミド、特にN末端ケトアミド（2）を生成することができており（スキーム1）、これにより、広範囲のリンカーをタンパク質の本体部に結合する見込みがもたらされる。

スキーム1. タンパク質からN末端カルボニルアミドへの変換

例えば、本発明者らは、アルコキシルアミン（X₁又はX₂=O）又はヒドラジド官能基（X₁又はX₂=C=ONH）を有する二官能性カルボニル試薬と、N末端α-カルボニルアミドとを縮合することができた（スキーム2）。第3のステップにおいて、（4）に示したように反応性で求核性の取っ手部分（handle）を生じさせる前述した二官能性試薬の縮合（3）の結果、本発明者らは、広範囲のアルデヒド及びケトン（図示せず）によって窒素求核基（nitrogen nucleophile）をさらに官能化することができた。実際に、アネキシンタンパク質を用いて、本発明者らは、α,ω-アミノキシ-ヒドラジドによるヒドラゾン形成よりもオキシム形成が優先されること、及びN末端ケトアミドを有するオキシムをこのような試薬が選択的に形成することを判定した。

スキーム2. 二官能性作用物質とタンパク質のN末端α-カルボニルアミドとの縮合

実際、N末端カルボニルアミドは、生物活性要素をタンパク質に架橋する2つの経路を与える。一方の経路は、当量のホモ二官能性架橋剤（homo- bifunctional cross linker）又はヘテロ二官能性架橋剤（hetero-bifunctional cross linker）と、アルデヒド又はケトン官能基を含む修飾タンパク質との縮合により、新規な反応性窒素求核基を有するタンパク質が生じて、（4）、図2（α-カルボニルアミドについて図示しているが、DNA組換え技術によりタンパク質中に取り付けられたアルデヒド及びケトンにも適用可能）のような修飾タンパク質が得られる、二段階の順序を伴う。第2の反応において、窒素求核基が、アルデヒド又はケトン官能基（5）を含む適当な生体要素（ペイロード）と縮合すると、架橋が完結する（スキーム3）。

スキーム3. α-求核基を含むタンパク質によって媒介される、ペイロードのタンパク質への架橋

別の選択肢は、最初に1当量の架橋剤（4）への結合のための生物活性要素を調製し、次いで得られた単一付加物（mono-adduct）（7）を、目的タンパク質のカルボニル修飾部位のところに縮合させることである（スキーム4）。アントラサイクリン薬物のための主要ステップの例を、スキーム5とスキーム6の両方の経路に関して以下に示している。

スキーム4. ペイロード-リンカーコンジュゲート(7)によって媒介される、ペイロード(5)のカルボニル含有タンパク質への架橋

スキーム5. アントラサイクリン薬物(8)のα-求核基を含むタンパク質(4)への架橋

スキーム6. 二官能性カルボニル反応性求核試薬(3)を用いた初期の官能化によるアントラサイクリン薬物(8)のカルボニル含有タンパク質への架橋

アントラサイクリンに対する上記のような直接結合のための官能基を含まない分子の場合、これらの分子は、しばしば、架橋のために必須の官能基を含むように修飾され得る。例えば、スキーム7において、タキソールペイロードは、レブリン酸及び類似した当技術分野で公知の部分を導入するのに使用される標準的な手順によって、（11）の第二級ヒドロキシル基をアシル化することにより、架橋のために調製することができる。付加物（12）は次いで、いずれかの二官能性試薬（3）によって処理され得、又は（4）に直接結合し得る（図示せず）。

スキーム7. カルボニル含有タンパク質への架橋を可能にするタキソール薬物の修飾

代替的には、（11）中の第二級ヒドロキシル基（スキーム8）は、上記経路により基質として働き得るカルボニル置換基を有するアリール基質を用いて、アシル化することができる。

スキーム8. カルボニル含有タンパク質への架橋のためのカルボニル含有タキソール誘導体の利用

カンプトテシン（16）（スキーム9）は、上記経路による架橋のために調製され得る抗癌剤の別の例である。抗癌剤は、第三級ヒドロキシルのところをアシル化することができ、キャリアタンパク質への結合のために調製して、式（17）の構造によって表される前駆体を得ることができる。

スキーム9. 結合点としてカルボニル又はアジドを用いたタンパク質への架橋のためのカンプトテシンの官能化

本発明者らは、アネキシンタンパク質をN-末端のところで部位特異的にアミノ基転移することもできた。アミノ基転移は、アルキン（19）及び（21）又は対応するアジドを生じさせる、スキーム10に示した還元的アミノ化及びカルボニル試薬との反応（図示せず）の見込みをもたらし得る。実際、クリックケミストリー、アジド-アルキンの組み合わせは、N末端にアジドを有するタンパク質及びアルキンを有するペイロード型要素を用いて、逆にして設計され得る。カルボニル要素は、組換えDNA方法（D. Rabukaら、Site-specific chemical protein conjugation using genetically encoded aldehyde tags. Nat Protoc. 2012年、7、1052〜67; C.C. Liu及びP.G. Schultz、Adding new chemistries to the genetic code. Annu Rev Biochem. 2010年、9、413〜44）によっても導入され得る。なお、アジドを担持するペイロードと組み合わされ得るアネキシン修飾についてのスキーム10における例は、チオール特異的反応のためのシステインを保存することに留意されたい。

スキーム10. アネキシンタンパク質のN末端アミノ基転移及び窒素カップリング反応

チオール戦略
遊離システイン含有タンパク質（例えば、アネキシンタンパク質）の場合、遊離システインがチオール特異的試薬を用いて官能化され得るため、さらなる選択肢が利用可能である。

実際、アネキシンV-128等の溶媒接触可能システインチオールを有するアネキシンは、定量的にプロパルギル化して、スキーム11に示した付加環化反応を受けさせることができる。

スキーム11. アネキシンタンパク質の部位特異的プロパルギル化及びアジド結合型ペイロードとのカップリング

選んだアネキシンシステインのプロパルギル化以外にも、本発明者らは、α-ブロモピルベートを利用してアネキシンチオールを官能化し、ピルビル-アネキシンを得ることもできたし、さらには、ベンジルブロミドを官能化して特定の誘導体化アネキシン得ることもできた。両方の反応種が、上述したカルボニル反応（スキーム12）によるさらなる修飾の対象である。

スキーム12. ペイロードのコンジュゲートに適用可能なアネキシンのチオール特異的反応

スキーム13に示したもの等の既製のマレイミド結合型要素を、ペプチド鋳型内に取り付けられたシステインチオールと縮合することにより、いくつかの抗癌剤がペプチド鋳型内にペイロードとして組み込まれ得ることは注目すべきである。

スキーム13. チオール特異的コンジュゲートのためのマレイミド結合型プロドラッグ

本発明者らは、アネキシンV-128等の特定のシステイン含有タンパク質中のプロパルギル基により、遊離システインを選択的に官能化することもできた。プロパルギル化タンパク質は、付加環化によって1,2,3-トリアゾールに変換可能であり、チオール結合型コンジュゲートを調製するための現在のプロトコルを上回るいくつかの利点をもたらすが、その利点の少なからぬ部分は、マレイミドと比較しての1,2,3-トリアゾールのインビボ安定性である。トリアゾール官能基は、プロパルギル基が中心的役割を果たすスキーム14に示した二段階の順序でチオールを修飾することによって取り付け（導入し）得る。

スキーム14. タンパク質中の遊離システインチオールの選択的プロパルギル化

プロパルギル基質によってアセチレン部分を導入すると、アジド置換基を介した1,3-付加環化が可能になる（スキーム15）。アジド基は、極性反応において比較的不活性な官能基だと判明しているが、一般には、1,3-付加環化においてアセチレンと円滑に反応する。したがって、ペイロードを二官能性アジドリンカー（23）によって導入して（24）を得て、続いてカルボニル含有タンパク質（5）、例えばアントラサイクリン（8）によって処理してもよい。

スキーム15. 二官能性アジドを含むリンカーの1,3-付加環化を利用したペイロードの、タンパク質のプロパルギル化チオールへの架橋

代替的には、リンカー（23）を、アルド-又はケト-官能基（5）、例えば（8）を含むペイロードと縮合して式（25）の化合物を得て、続いてプロパルギル化チオールタンパク質（22）への付加環化によって（26）を得ることもできる（スキーム16）。

スキーム16. アジドとペイロードとの二成分付加物(25)によって媒介されるペイロードの架橋

ペイロードは、（22）と縮合させると架橋生成物に対するカルボニル前駆体（28）を得ることができる、α-アジドカルボニルリンカー（27）の使用によって導入することもできる（スキーム17）。

スキーム17. プロパルギル化タンパク質とアジド-カルボニル種との1,3-付加環化によるカルボニル要素のタンパク質への結合

いくつかの化学療法剤は、ヒドラジド形態（29）で入手可能である。デスアセチルビンブラスチンを例とするこのような治療薬は、ヒドラジド形態のアネキシンタンパク質に結合し得る（スキーム18）。

スキーム18. ビンブラスチンヒドラジド誘導体

したがって、α,ω-アジドヒドラジド等を取り付けると、ヒドラゾン又はオキシムの開裂によってペイロードを放出できるリンカーを得ることができる。α,ω-アミノキシ-アジド又はα,ω-アミノキシ-ヒドラジドは、訓練された当技術分野の化学者ならば、いくつかの方法によって調製することができる。例えば、ω-ブロモアルコールを使用して、最初にアジドによってブロミドを置換し、続いて光延反応又はN-ヒドロキシ-フタルイミドを用いた等価な方法によってアルコールからアミノキシ官能基に変換することにより、アミノキシ-アジドを得ることができる。アミノ基は、エルマン法又は当技術分野で公知のその他の方法によって導入することもできる。α,ω-アミノキシ-ヒドラジドは、アジドによってブロミドを置換し、続いて酸をヒドラジドに変換することにより、ω-ブロモ酸又はω-ブロモエステルを介して利用できるようになる。α,ω-アジドカルボン酸又はアミンは、1,3-付加環化クリックケミストリーを用いるのと同程度にアジドがポリマーに容易に取り付けられ得、次いでペイロードを有するプロパルギル化タンパク質に結合し得る場合、ポリマー治療薬に関して特に有益である。例えば、ポリマー治療薬は、PEGアミンをある種のリンカー（27、R₁=OH）と縮合することによって調製することができ、そのアミド生成物は次いで、（22）のP、例えばN末端に結合したアントラサイクリンの中に含まれるペイロードを有するプロパルギルタンパク質に結合し得る。

このような手法の分かり易い例は、以下のスキーム19において示しており、ここで、アントラサイクリン薬物及びフォレートリガンド（受容体が過剰発現している癌細胞を標的とする）は、アネキシンタンパク質に部位特異的に結合している。この種のコンジュゲートは、フォレート受容体を過剰発現し且つその細胞表面にホスファチジルセリンが曝露されている、卵巣癌細胞を標的とし得る。

スキーム19. フォレートリガンドとアントラサイクリン抗癌剤の両方のアネキシンタンパク質への架橋

単一のアネキシンタンパク質のN末端カルボニル修飾と、プロパルギル化されたシステインチオールとの両方を活用して2当量のペイロード付き鋳型を得て、規定した組成のコンジュゲートをもたらすことも明らかなはずである。スキーム20を参照されたい。

スキーム20. フォレートが伸長されたシステインの一部になっているアネキシンタンパク質の二重フォレート-アントラサイクリンコンジュゲート

スキーム21は、二重に官能化されたアネキシンタンパク質の別の例を示している。

スキーム21. アントラサイクリン及びプロパルギル基を有する二重に官能化されたアネキシンタンパク質

PEG化化合物の調製
PEG化は、最初にアネキシンV-128をプロパルギル化し、次いでプロパルギル化した生成物をポリエチレングリコールアジドと縮合して生成物を得ることにより、部位特異的に実施することができる（スキーム22）。アネキシンV-128のシステインもまた、スキーム23及びスキーム24に示した順序によりPEG（ポリエチレングリコールポリマー）基質をこのようなタンパク質に架橋する可能性をもたらす、ブロモ-アセトフェノン、ブロモベンジル基質（図示せず）又はブロモピルベート等の種々の求電子性基質と反応する。

スキーム22. PEG-アジドの1,3-付加環化によるプロパルギル化タンパク質のPEG化

スキーム23. a-ハロアセトフェノン基質によるアネキシンタンパク質のPEGポリマーへの架橋

スキーム24. アネキシンタンパク質のピルビル基質によるPEGポリマーへの架橋

RGD部分の結合
フォレート標的化に加えて、癌細胞を標的とするRGDは、結合し合った要素をこのような細胞に輸送するのに有効であると判明している。こうした観察を続けている間、αVβ3インテグリンに対する強いアフィニティー及び選択性を示すアルギニン-グリシン-アスパラギン酸（RGD）トライアドを含むペプチドリガンドが、αVβ3受容体を発現している腫瘍関連細胞を標的とするために開発された。アネキシン-薬物-RGDコンジュゲートは、アネキシンに対して強い結合を同様に有するこのような受容体に対して特異的な標的療法を成り立たせるはずである。このようなコンジュゲートは、α,ω-アミンアジドリンカーのアミノ基を用いて様々なリンカー分子（34）によって官能化され得る、シクロ(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Glu)等のRGDペプチド（33）から組み立て得る。ある種のリンカー（27、R₁=OH）との複合にシクロ(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys)を用いた全く同じ経路（図示せず）もまた、プロパルギル化タンパク質への結合を可能にし得る（スキーム25）（p=0、m=nとして図示している）。

スキーム25. α(V)β(3)受容体を標的とするための、RGDリガンドのアネキシンタンパク質へのコンジュゲートまでの1,3-付加環化経路

本発明者らが発明した化学反応は、コンジュゲートのペイロードローディングに適用することもできる。例えば4アーム型PEGアミン（スキーム26）が市販されており、単官能化用のプロトコルを適用して、Ding H、Yong KT、Roy I、Hu R、Wu F、Zhao L、Law WC、Zhao W、Ji W、Liu L、Bergey EJ、Prasad PN. Bioconjugated PLGA-4-arm-PEG branched polymeric nanoparticles as novel tumor targeting carriers. Nanotechnology. 2011年、22(16):165101の後には、<,ωアジド-カルボン酸を用いてモノアジドを生成できる。

スキーム26. アミンを末端とする4アーム型PEGポリマーの一般構造

RGD標的化もまた、創傷及び細胞の修復に適用され得ることに留意すべきである（Fong E、Tzlil S、Tirrell DA. Boundary crossing in epithelial wound healing. Proc Natl Acad Sci USA. 2010年、107(45):19302-7）。チモシンβ₄及びRGDペプチドとアネキシンとの結合を伴う、上記の戦略と全く同じ戦略が細胞及び組織の修復のために主張されている。

官能化していないアミノ基を次いでRGDペプチドと縮合すると、アジド-アミドを得ることができ、その集合体全体が、1,3-付加環化反応によってプロパルギル化タンパク質に結合し得る。タンパク質には、PEGアミノ基を伴うアシル化経路により、複数の薬物を装填することもできる。

本明細書で示したように、ペプチド前駆体の多様性及び商業化可能性（市販性）は、本明細書に記載の多官能性要素の構築に関して魅力的である。しかしながら、原則的に、クリックケミストリーにおける結合相手（click chemistry partner）、開裂可能な薬物、及び細胞表面バイオマーカーに対するリガンドを組み込むための汎用性をもたらすあらゆる鋳型は、骨格（足場）として使用することができ、特定の癌標的のための顕著な利点を提供し得る。骨格の多数の例が、本発明の対象である多官能性骨格に適し得るパラレル合成のために開発されている。

十分に特性決定された系の利点は、多面的なものである。重要なことに、法外に複雑な出発用のタンパク質コンジュゲート混合物とは反対に、投与された単一の分子に対する作用を追跡する能力は、有望なリードコンジュゲートの特性を改善するためのより妥当な基礎をもたらすはずである。あるリードの特性を体系的に改質して構造と活性との関係を発展させることは、数十年間製薬産業において定法であった。実際、本発明の魅力的な態様は、治療に関連した分子の構造を体系的にモジュール式に変更して、活性の傾向を明らかにできることである。
タンパク質のダイマー化
治療用タンパク質（例えば、アネキシンコンジュゲート）の調製に専用の化学反応に加えて、本発明は、マルチマーコンジュゲートの調製の態様にも関する。本開示において、本発明者らは、最初に組換え方法によって調製し、次いでマルチマー形態で化学修飾したマルチマーを記述している。ヒトアネキシンVのホモダイマーは、十分に確立された組換えDNA技術による方法を用いて調製することができる。ホモダイマーのアネキシン分子は、ペプチド結合を介して柔軟なリンカーに結合し得る。Ca²⁺とPSとを結合するモノマーの凸面が両方とも外在化したPSに接触し得るように、ダイマーを折り畳みできることが重要である。柔軟なリンカー、例えば(GGGGS)(n)（n=3〜4）は当技術分野で公知であり、ヘリカルリンカー(EAAAK)(n)がAraiら、Proteins. 2004年、57(4)、829〜38に記載されている。X. Chenら、Fusion protein linker: Property, design and functionality. Adv Drug Deliv Rev. 2012年9月29日. [Epub ahead of print]もまた参照されたい。

ダイマーの高い分子量は腎臓ろ過の閾値を超えており、半減期が延長された循環時間をもたらす。本発明において、本発明者らは、化学修飾されていないビス-アネキシンの使用と、薬物ファーマコフォア等のさらなるカーゴ及び/又はバイオマーカーを標的とするリガンドを有するように化学修飾されたビス-アネキシンの使用を両方とも開示している。このような修飾は、最初にペイロード付き鋳型を構築し、次いで第2の段階において、ペイロード付き部分をマルチマーアネキシンタンパク質に縮合させることにより、最も好都合に得られる。

アネキシンタンパク質をN-末端とシステインチオールの両方のところで部位特異的に修飾する能力により、癌細胞を特異的に標的とする複数の治療薬を担持するダイマー形態の単一の作用剤の部位特異的構築が可能になる。本発明において、アネキシン融合タンパク質は、癌細胞に対するそのアフィニティーのため送達系として機能し、同様に、薬物及び治療に関連したその他の要素を担持する鋳型の運搬体としても機能する。実際には、アネキシン融合タンパク質が送達手段（vesicle）であり、ペイロード付き鋳型がカーゴ（cargo）又は積荷（freight）である。

アネキシンダイマーの形成は、いくつかの方法により取り組まれてきた。1つの手法は、システインチオール（Cys 316）によるアネキシンタンパク質とベンゾキノンとの縮合により、環を攻撃するものである（スキーム27）。1当量のアネキシンVは、1,4-ベンゾキノンと定量的に単一付加物を形成するが、1,4-ベンゾキノンのみを用いて2個の分子のアネキシンVを架橋することはいまだ可能ではない。しかしながら、アネキシンVの単一付加物は、アネキシンV-128と反応して、アネキシンVと架橋したアネキシンV-128の分子を1個含むダイマーを生じさせる。アネキシンV-128がアネキシンVより大幅に求核性であるので、第2のタンパク質分子を小さな架橋剤のフレームワークに導入する能力は一般に、単一付加物の形成より大幅に困難であることは、注目すべきである。このようなアネキシンタンパク質をその遊離システインを介してカップリングすることには、タンパク質フレームワークに保持すべきタンパク質に対するその他の修飾を可能にするという利点がある。

スキーム27. 1,4-ベンゾキノンによって媒介されるアネキシンタンパク質の架橋

本発明者らは、ビス-マレイミドによりダイマーを形成するアネキシンV-128の反応を観察した（スキーム28）。マレイミドを過剰に使用すると、単一標識された系を得ることができ、この系は次いで、反応性チオールを有する第2の種と一緒に使用することができる。アネキシンV-128とビス-マレイミドとの反応が、タンパク質システインチオールのところで急速に起きる。第2の当量のアネキシンV-128の付加が第1の当量より困難であるという事実により、各タンパク質又はペプチドが適度に反応性のチオールを有する場合、ヘテロダイマーの部位特異的形成が可能になる。

スキーム28. ビス-マレイミドによる架橋を用いたアネキシンV-128ダイマーの形成

システインチオールのプロパルギル化は、1,3-付加環化によってアネキシンV-128をアルキンに架橋するための選択肢をもたらし、これにより、架橋が速度論的に不可逆的になる（スキーム29）。この選択肢は、チオール要素の反応性と反応の特異性に依存する。アネキシンVは、ハライド及びトシレート等のプロパルギル基質とゆっくりと反応でき、最終的には非特異的に反応し得る。対照的に、アネキシンV-128は、チオール特異的にプロパルギル化され得、次いでアジド基質と縮合され得る。この反応は次いで、線形α,ω-ビスアジド又はビス-1,4-アジドメチルベンゼン等のビス-アジド基質を用いて活用され得る（スキーム29）。このようなビス-アジド系は、対応するビス-ジオール又はビス-ハライドから調製することができる。

スキーム29. ビス-アジドとプロパルギル化タンパク質との縮合によるタンパク質ダイマーの形成

用いられ得る別の順序は、最初にタンパク質チオールをアルキル化し、次いでオレフィン側鎖を組み込んだタンパク質によるメタセシス反応を起こすための、アリルブロミド等のアリル基質の使用を伴う。

標的療法のさらに別の重要な特徴は、このような細胞に対する特異性が増大するように修飾されたアネキシンダイマーにより、細胞の表面の1個を超えるバイオマーカーを標的化することができることである。したがって、組換えDNA技術によってアネキシンV-128ダイマーを調製することができるし、続いて、ホスファチジルセリンとフォレート受容体の両方を標的とするようにフォレート誘導体によってチオールを修飾することもできる（図10を参照）。

アネキシンのN末端を修飾することができれば、スキーム30に指示した種のリンカー（58）を用いた種々の方法によって、N末端を介してさらなる官能基を導入することにより、アネキシンVに対するPSのアフィニティーを強化する。

スキーム30. N末端アネキシンケトアミドの架橋における主要な中間体としてのヘテロ二官能性リンカー

アネキシンVとアネキシンV-128は両方とも、アミノ基転移を受けると、N末端ケトアミドが生じる。この修飾は、図27によって示唆したようにペイロードと結合するのに使用され得る側鎖末端において、タンパク質主鎖及び場合による官能基のところにオキシム又はカルバゾン官能基を結合させる、ヘテロ二官能性リンカーを利用する見込みをもたらす。特に留意する点は、カルバゾン結合（59、X₁=CONH）をシアノ水素化ホウ素ナトリウムで還元することによって、リンカーをタンパク質フレームワークに不可逆的に結合することにより、タンパク質-リンカー付加物が安定化され得ることである。
マルチマータンパク質の官能化
複数のカーゴの可能性を説明するために、スキーム31では、修飾されたビス-アネキシンフレームワーク（25）に対して可能な攻撃点を描写している。通常のチオール反応性を有する2個の溶媒接触可能チオールを含むホモ-ビス-アネキシンフレームワーク（2つの同一のアネキシン配列を有するもの）の場合、チオール同士を識別することは実現できない。しかしながら、このようなホモダイマーは、ペイロードによって対称的に置換され得る。アラニン若しくはグリシンN末端アミノ酸を有するアネキシン、又は図7に概略的に示したようにアルデヒドをタンパク質フレームワークに組み込んだアネキシンのアミノ基転移により、さらなる特徴をダイマーフレームワークに組み込むことができる。カルボニル修飾は、還元的アミノ化を含む種々の反応の対象である。したがって、チオール結合の他にも、さらなる特徴をN末端に導入することができる。

スキーム31. アネキシン融合タンパク質中の潜在的な3つの結合点の説明

本発明者らは、ダイマー修飾のために好ましい順序には、反応性チオールのプロパルギル化、続いてアジドの付加環化が伴うことを判定した（スキーム32）。

スキーム32. 対称的に置換された融合タンパク質への経路におけるアネキシンシステインチオールのプロパルギル化

ヘテロダイマーは、1個のアネキシンV-128及び1個のアネキシンVアミノ酸配列を用いて、例えばスキーム33を用いて作り出すことができる。このようなハイブリッドダイマー（29）は、示差的チオール反応性を有する。したがって、別個のカーゴは、アネキシンVのものより大幅に反応性であるアネキシンV-128チオールに結合させることができ、図9に記述されているようにアネキシンVの埋没した非反応性チオールの存在下で、プロパルギル化及びベンジル化によって特異的に官能化され得る。続いて、アネキシンVのCys 316が、α-ハロケトン又はマレイミド結合型ペイロードによって修飾され得る。したがって、このようなダイマーは、多様なペイロードを担持するように各チオールのところで特異的に官能化され得る。ビス-チオールアクセプターにおけるチオール反応性要素を適切に選択すれば、ダイマーを反応性チオールと合わせてテトラマーを形成することができる。

アネキシンは、特異的な癌細胞に対するアフィニティーを強化するペプチド又はタンパク質とも融合し得る。したがって、アネキシンは、対応する受容体に対するEGFのアフィニティーを獲得するために上皮成長因子と融合することができ、又はトランスフェリン若しくはヒト血清アルブミンと融合することができる。

スキーム33. アネキシン単位中の埋没したシステインを含むヘテロダイマー融合タンパク質(29)からの選択的にプロパルギル化された融合タンパク質(30)の形成

銅を使わないクリックケミストリーを実施すると、スキーム34に示したようにアネキシンコンジュゲートを得ることができることには注目すべきである。この例示的な順序において、（33）を例とする市販のシクロオクチンは、（34）の酸臭化物（又は活性エステル）と優先的に反応し、次いでアネキシン又はHSA等のチオール含有タンパク質と合わせることができる。中間体（34）及び中間体（35）は非常に有益であり、様々な態様のアジド又はビス-アジドと組み合わせて、薬物コンジュゲート又はダイマーを形成し得る（図示せず）。ブロモベンジル基質とブロモアセトアミド（図示せず）基質の使用が、特に安定なチオエーテルC-S結合をもたらす特権的な合成モチーフであることには留意すべきである。

スキーム34. 銅を使わないプロトコルによるタンパク質チオールと治療に関連したアジド結合型カーゴとの結合のためのシクロオクチン中間体(35)の形成

同様に、シクロオクチン（33）を活性化ジカルボン酸と合わせると、ビス-シクロオクチンを得ることができ、ビス-シクロオクチンを中間体として使用すると、アジド官能基によって置換されたダイマーの反応（図示せず）により、テトラマーを担持したカーゴを形成することができる。
固相タンパク質合成
例として、プロドラッグ形態になったいくつかの化学療法要素と、フォレート受容体を過剰発現している特異的な癌細胞を標的とするフォレート部分とを有する、ダイマーアネキシンコンジュゲートの構築が考えられ得る。

このような作用剤は、スキーム35に説明したように、従来の技法及び市販の材料を用いて組み立てることができる。（非連続的なペイロードのためにアミノ酸及びペプチドスペーサーを用いた全く同じスキームは、訓練された当技術分野の化学者ならば容易に調製することができる。）第一に、固相タンパク質合成（SPPS）を用いれば、市販のO-メチルグルタミン酸エステル（（1）、固体支持体に結合して示している）の2個の分子を結合させて、ジペプチドジエステル（2）を得ることができる。アミノ酸の第3の分子、フォレート修飾アジドリシン（図示せず）を結合させてトリペプチド（4）を得ることもできるし、又は代替的には、t-Bocにより保護されたアジドリシンアミノ酸（3）によって（2）を処理し、続いてt-Bocによる脱保護及びフォレートによるアシル化を行って（4）を得ることもできる。

ヒドラジンによる処理後、グルタミン酸エステルは、対応するヒドラジドに変換され、次いで固体支持体から放出されて（5）を形成する。次いで溶液化学を用いれば、ビス-ドキソルビシン生成物（6）を調製することができる。原則的に、後者の「ペイロード付」系を次いで、クリックケミストリー方式でアルキニル化タンパク質と合わせると、複合治療薬を得ることができる。この薬は、アネキシンと、外側表面にPSを発現しており且つフォレート受容体を過剰発現している癌細胞を特異的に標的とする結合ペプチドカーゴとを合わせた特性を有する。このプロトコルは、バイオマーカーを標的とするリガンド、抗癌剤を変更すること、並びに保護されたアミノキシ側鎖によってアミノ酸を置換してオキシム結合型薬物コンジュゲートを調製することを含む顕著な変更が可能である。（ペイロード付き要素との部位特異的反応を起こすためには、タンパク質合成の通常のレパートリーに含まれない相補的な反応用官能基が必要とされる。鋳型とダイマーアネキシンとの間に必要な部位特異的コンジュゲートを実現するために、本発明者らは、アネキシンタンパク質中へのアルキン官能基の取り付け（下記参照）を可能にする方法を発明した）。

スキーム35. 治療に関連したペイロード用の鋳型を構築するためのアミノ酸の逐次的なカップリングの例

この鋳型手法は、薬物修飾側鎖を有するように設計されたn-アミノ酸の逐次的な付加により、2つより多い同一の薬物要素を担持したペイロード付きペプチド鋳型にも拡張され得る。Fmocによる化学反応は、伸長中のペプチド鎖に薬物修飾アミノ酸を直接結合するのに使用することもできる。

上記の手法、スキーム36の変形例において、相異なる2つの化学療法剤を鋳型に集合させることができる。Fmocにより保護されたヒドラジンとt-Bocにより保護されたヒドラジンの両方が入手可能であるため、示差的に保護されたビス-ヒドラジド（7）及び（8）を集合させることができ、最終的にはオルトゴナルに脱保護することができる。SPPSの標準的な技法を用いれば、2つの別個の化学療法剤（9）及び（10）（例えば、ドキソルビシン及びタキソール）を担持する修飾された鋳型が、2つの別個の構成になって位置特異的に構築され得る。タキソール、アントラサイクリン及びビンカアルカロイドを含むいくつかの薬物の種類の送達のために、酸に感受性のヒドラゾンリンカーが使用されたことには、留意すべきである。加水分解又は酵素に対して不安定で、例えばタキソール、白金薬物、カンプトテシンを組み込んでいる同様の結合ならば、上記で開示された鋳型戦略を用いて活用することができる。

スキーム36. 示差的に保護されたヒドラジドとペイロード付き鋳型の位置異性体との構造的関係

ペイロード付き要素を用いて部位特異的反応を実施するためには、タンパク質合成の通常のレパートリーに含まれない相補的な反応用官能基が必要とされる。本発明者らは、アネキシンタンパク質中で、適当なシステインチオール、例えばアネキシンV-128のところ又はアネキシン融合タンパク質に同様に適用され得るアネキシンのN-末端、例えばダイマーのところに、相補的な官能基すなわちアルキン官能基を取り付けることが可能になる方法を発明した。

抗癌剤とリガンドは、直接結合していてもよいし、又はリンカーを介して間接的に結合していてもよい。さらに、抗癌剤がPEGとコンジュゲートしていてもよいし、又はコンジュゲートがリポソーム中に封入されていてもよい。
別の実施形態
本明細書中で言及したすべての公報、特許及び特許出願は、独立したそれぞれの公報又は特許出願が参照により組み込まれることを具体的且つ個別に示した場合と同じ程度に、参照により本明細書に組み入れられる。

本発明については本発明の特定の実施形態に関して記述してきたが、さらなる変更形態が可能であることは理解されようし、また、本発明の原理に全般的に従う本発明のあらゆる変形例、使用又は改変を、本発明が属する分野において公知又は慣例的な行為に含まれ且つここまでに記載した本質的な特徴に適用され得るような本開示からの逸脱まで含めて包含することを本出願が意図していること、及び本出願が特許請求の範囲に含まれることも理解されよう。

別の実施形態も特許請求の範囲に含まれる。

Claims

式（I）の構造：

〔式中、
Pは、モノマータンパク質又はマルチマータンパク質を表し、Pは、細胞標的化タンパク質、細胞結合タンパク質、細胞トラッフィキングタンパク質及び輸送タンパク質又はこれらの任意の組合せから独立に選択される1個、2個、3個又は4個のタンパク質を含み、
各Lは独立に有機リンカー基を表し、
各Tは独立に、治療薬、タンパク質、又はバイオマーカーに対するリガンドを表し、
nは、0から10までの整数であり、
存在する各L-T部分は、Pのアミノ酸残基に部位特異的に結合している。〕
を有する治療用タンパク質を含む医薬組成物であって、
式（I）の化合物は、医薬組成物中に存在する生物活性タンパク質の少なくとも約75％に相当する、医薬組成物。
nが、1から10までの整数である、請求項1に記載の医薬組成物。
Pが、モノマータンパク質を表す、請求項1又は2に記載の医薬組成物。
Pが、マルチマータンパク質を表す、請求項1又は2に記載の医薬組成物。
前記マルチマータンパク質が、ダイマー、トリマー又はテトラマーである、請求項4に記載の医薬組成物。
Pが、癌細胞を標的とする細胞結合タンパク質であるタンパク質を含む、請求項1から5のいずれかに記載の医薬組成物。
Pが、アネキシンタンパク質、シナプトタグミンタンパク質、ラクトアドヘリン、α-フェトプロテイン、レプチン、トランスフェリンタンパク質若しくはヒト血清アルブミン、又は前記タンパク質のいずれかに対して少なくとも90％の配列同一性を有するタンパク質であるタンパク質を含む、請求項1から5のいずれかに記載の医薬組成物。
Pが、アネキシンタンパク質、シナプトタグミンタンパク質、ラクトアドヘリン、α-フェトプロテイン、レプチン、トランスフェリンタンパク質又はヒト血清アルブミンであるタンパク質を含む、請求項1から7のいずれかに記載の医薬組成物。
Pが、アネキシンタンパク質、求電子性カルボニルを含む修飾アミノ酸残基を含むアネキシンタンパク質、又はアネキシンタンパク質に対して少なくとも90％の配列同一性を有するタンパク質を含み、場合により前記タンパク質は、溶媒接触可能チオールを含む、請求項1から8のいずれかに記載の医薬組成物。
Pが、アネキシンV、アネキシンV-128、アネキシンVに対して少なくとも90％の配列同一性を有するタンパク質、アネキシンV-128に対して少なくとも90％の配列同一性を有するタンパク質、又はこれらのタンパク質の任意の組合せを含む、請求項9に記載の医薬組成物。
Pが、アネキシンVを含むか、又はPが、アネキシンVに対して少なくとも95％の配列同一性を有し且つアネキシンV-128ではないタンパク質を含む、請求項1から10のいずれかに記載の医薬組成物。
Pが、アネキシンV-128を含むか、又はPが、アネキシンV-128に対して少なくとも95％の配列同一性を有し且つアネキシンVではないタンパク質を含む、請求項1から10のいずれかに記載の医薬組成物。
Pが、RGD配列を含むように修飾されたアネキシンタンパク質を含む、請求項8から12のいずれかに記載の医薬組成物。
Pが、アルデヒド又はケトンを含むように修飾されたアネキシンタンパク質を含む、請求項8から12のいずれかに記載の医薬組成物。
Pが、アルデヒド又はケトンを含むように修飾されたアネキシンタンパク質を含む、請求項14に記載の医薬組成物。
Pが、N末端残基にカルボニル基を含むように修飾されたアネキシンタンパク質を含む、請求項8から12のいずれかに記載の医薬組成物。
Pが、N末端残基にアルデヒド基を含むように修飾されたアネキシンタンパク質を含む、請求項16に記載の医薬組成物。
カルボニル基に、芳香族アミンによる還元的アミノ化を受けさせることができる、請求項13から17のいずれかに記載の医薬組成物。
L-T部分が、カルボニル官能基を有する修飾アミノ酸を芳香族アミンによって還元的アミノ化することにより、Pの構成タンパク質に共有結合させたものである、請求項8から12のいずれかに記載の医薬組成物。
存在する各タンパク質が、アネキシンVである、請求項8に記載の医薬組成物。
存在する各タンパク質が、アネキシンV-128である、請求項8に記載の医薬組成物。
Pがダイマーである、請求項9から22のいずれかに記載の医薬組成物。
アネキシンサブユニットが、あるタンパク質のC末端を別のタンパク質のN末端に結合させるペプチドリンカーによって結合されている、請求項22に記載の医薬組成物。
Pが、アネキシンV-128であるタンパク質又はアネキシンV-128に対して少なくとも95％の配列同一性を有し且つアネキシンVではないタンパク質であって、N末端の位置にグリシンを有する該タンパク質を含み、前記タンパク質は、C末端で他のタンパク質と結合している、請求項9から23のいずれかに記載の医薬組成物。
前記他のタンパク質がアネキシンV-128であるか、又は前記他のタンパク質が、アネキシンV-128に対して少なくとも95％の配列同一性を有し且つアネキシンVではない、請求項24に記載の医薬組成物。
nが0である、22から25のいずれかに記載の医薬組成物。
nが1、2、3又は4である、請求項1から25のいずれかに記載の医薬組成物。
各Lが独立に、
- C1〜C20アルキレン、
- ポリエチレングリコール、
- 2個から25個の間のアミノ酸残基を有するペプチド、
- 2個から25個の間の残基を有するペプトイド、
- α,ω-二官能性化合物から形成されたリンカーであって、α,ω-二官能性化合物の各末端官能基が、アミノオキシ、ヒドラジン、セミカルバジド、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、マレイミド、チオール、アルキン、アジド、アルデヒド及びアルコキシルアミンから独立に選択されるリンカー、
- ビス-無水物部分、ビス-イミデート部分若しくはビス-カルボニルイミダゾール部分から形成されたリンカー、又は
- アルキン部分とアジドとの付加環化反応から形成されたリンカー
からなる群より選択されるリンカー基である、請求項1から25及び請求項27のいずれかに記載の医薬組成物。
各Lが独立に、
-ビス-アミノオキシアルカンNH₂O(CH₂)_nONH₂（式中、nは1から20の間の整数である）、
- 2個から15個の間の残基を有するペプトイド又はペプチドであって、場合により、D型立体配置の少なくとも1つのアミノ酸、チオール側鎖を含む残基、求核性窒素を含む側鎖を含む残基、ヒドラジン基若しくはアミノオキシ基を含む側鎖を有する残基、カルボン酸若しくはカルボン酸エステルを含む側鎖を有する残基、又はこれらの任意の組合せを含むペプトイド又はペプチド、
-ビス-ヒドラジノ-アルカンNH₂NH(CH₂)_nONHNH₂（式中、nは1から20の間の整数である）、
-ビス-セミカルバジド-アルカンNH₂NRCO(CH₂)_nOCNRNH₂（式中、nは1から20の間の整数である）、
- 一方の末端官能基がアジドであり、他方の末端基がアミノオキシ又はヒドラジンである、α,ω-二官能性化合物から形成されたリンカー、
- 最大で1000個のモノマー部分を含む1,ω-置換ポリエチレングリコールポリマー、及び
- トリアゾールを含むリンカー
からなる群より選択されるリンカー基である、請求項28に記載の医薬組成物。
前記治療用タンパク質が、キレート、タンパク質、ビタミン、酵素、ペプチド、ペプトイド、抗体、薬物、プロドラッグ、バイオマーカーに対するリガンド、及びエフェロサイトーシスの刺激物質から独立に選択される1個以上のT基を含む、請求項1から29のいずれかに記載の医薬組成物。
各T基が、キレート、タンパク質、ビタミン、酵素、ペプチド、ペプトイド、抗体、薬物、プロドラッグ、バイオマーカーに対するリガンド、ポリマー、及びエフェロサイトーシスの刺激物質から独立に選択される、請求項30に記載の医薬組成物。
キレートであるT基を含む、請求項30又は31に記載の医薬組成物。
Tが磁性材料を含む、請求項32に記載の医薬組成物。
前記磁性材料が、常磁性又は超常磁性である、請求項33に記載の医薬組成物。
ビタミン、酵素、ペプチド、ペプトイド、抗体、薬物、プロドラッグ、及びバイオマーカーに対するリガンド、及びエフェロサイトーシスの刺激物質であるT基を含む、請求項30又は31に記載の医薬組成物。
バイオマーカーに対するリガンドであるT基を含む、請求項35に記載の医薬組成物。
前記リガンドが、フォレート、EGFR、ALK、MET、MUC-1及びKRASからなる群より選択される、請求項36に記載の医薬組成物。
アントラサイクリン、タキソール、オーリスタチン、カンプトテシン、ブレオマイシン、カルボプラチナム、シタラビン、5-フルオロウラシル、タモキシフェン、カリケアマイシン、メイタンシン、ツブリシン、エトポシド、フォレート及びRGD結合部分からなる群より選択されるTを含む、請求項1から37のいずれかに記載の医薬組成物。
前記アントラサイクリンが、ドキソルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチンである、又は
前記タキソールがパクリタキセルである、
請求項38に記載の医薬組成物。
L₁-T₁によって表され、Pの構成タンパク質のいずれかのN末端残基に部位特異的に結合している-L-T部分を含む、請求項1から39のいずれかに記載の医薬組成物であって、
医薬組成物中に存在する式（I）の化合物の少なくとも約75％が、前記L₁-T₁部分に共有結合した前記N末端残基を有する、上記医薬組成物。
前記N末端残基が、下記の部分構造：

〔式中、
両方のR_XはHである、又は両方のR_Xは、一緒になって炭素-窒素二重結合を形成しており、
R₁は、水素、場合により置換されていてもよいC1〜C20アルキル及びα-アミノ酸残基からなる群より選択され、
R₂は、場合により置換されていてもよいC1〜C20アルキル、C2〜C20アルケニル及びC2〜C20アルキニル、(CH₂)_q(OCH₂CH₂)_r（式中、q=0〜3、r=1〜1000）、又は(CH₂)_1-3CO-ペプチジル（式中、ペプチジルは1〜40個のα-アミノ酸からできた鎖である）からなる群より独立に選択され、
X₁及びX₂のそれぞれは、共有結合、O、NR、NRCO及びNRCONRからなる群より独立に選択され、式中、Rは、水素からなる群より選択されるか、又は、C1〜C10アルキル、C2〜C10アルケニル、C2〜C10アルキニル、C6〜C10アリール、C3〜C9シクロアルキル及び3員から9員のヘテロシクロアルキルから選択される場合により置換されていてもよい基であり、
L^Xは、存在しないか、又はカルボニルを介してT₁及びアミノ部分のそれぞれに共有結合したリンカーである。〕
によって表される、請求項40に記載の医薬組成物。
アントラサイクリン、タキソール、アウリスタチン、カンプトテシン、ブレオマイシン、カルボプラチナム、シタラビン、5-フルオロウラシル、タモキシフェン、カリケアマイシン、メイタンシン、ツブリシン及びエトポシドからなる群より選択されるT₁を含む、請求項40又は41に記載の医薬組成物。
医薬組成物中に存在する式（I）の化合物の少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％又は少なくとも約95％が、前記L₁-T₁部分に共有結合した前記N末端残基を有する、請求項40から42のいずれかに記載の医薬組成物。
両方のR_XがHである、請求項40から43のいずれかに記載の医薬組成物。
L₂-T₂によって表され、且つPの構成タンパク質のいずれかの表面利用可能チオール又は表面利用可能チオールから形成された官能基に部位特異的に結合している-L-T部分を含む、請求項1から44のいずれかに記載の医薬組成物であって、
医薬組成物中に存在する式（I）の化合物の少なくとも約75％が、前記L₂-T₂部分に共有結合した前記表面利用可能チオールを有する、上記医薬組成物。
L₂-T₂が、表面活性チオールから形成されたS-プロパルギル官能基を介して、前記タンパク質に共有結合している、請求項45に記載の医薬組成物。
L₂-T₂が、表面活性チオールに共有結合したペンダントアジド部分を介して、前記タンパク質に共有結合している、請求項45に記載の医薬組成物。
フォレート又はRGD結合部分のいずれかであるT₂を含む、請求項45から47のいずれかに記載の医薬組成物。
医薬組成物中に存在する式（I）の化合物の少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％又は少なくとも約95％が、前記L₂-T₂部分に共有結合した前記表面利用可能チオールを有する、請求項45から48のいずれかに記載の医薬組成物。
（i） L₃-によって表され、Pの構成タンパク質のいずれかのN末端残基に部位特異的に結合している-L-T部分であって、医薬組成物中に存在する式（I）の化合物の少なくとも約75％が、前記L₃-T₃部分に共有結合した前記N末端残基を有する、-L-T部分、又は
（ii） L₃-T₃によって表され、Pの構成タンパク質のいずれかの表面利用可能チオールに部位特異的に結合している-L-T部分であって、医薬組成物中に存在する式（I）の化合物の少なくとも約75％が、前記L₃-T₃部分に共有結合した前記表面利用可能チオールを有する、-L-T部分
をさらに含む、請求項40から49のいずれかに記載の医薬組成物。
医薬組成物中に存在する式（I）の化合物の少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％又は少なくとも約95％が、前記L₃-T₃部分に共有結合した前記N末端残基を有する、請求項50に記載の医薬組成物。
医薬組成物中に存在する式（I）の化合物の少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％又は少なくとも約95％が、前記L₃-T₃部分に共有結合した前記表面利用可能チオールを有する、請求項50に記載の医薬組成物。
式（I）の前記化合物が、下記の構造：

〔式中、
TとL^Xとの結合は、単結合又は二重結合であり、
両方のR^XはHであるか、又は両方のR^Xは、一緒になって炭素-窒素二重結合を形成しており、
Pは、アネキシンタンパク質、シナプトタグミンI、トランスフェリン、ラクトアドヘリン、α-フェトプロテイン及びレプチン及びヒト血清アルブミンからなる群より選択され、
R₁は、水素、場合により置換されていてもよいC1〜C20アルキル及びα-アミノ酸残基からなる群より選択され、
R₂は、場合により置換されていてもよいC1〜C20アルキル、C2〜C20アルケニル及びC2〜C20アルキニル、(CH₂)_q(OCH₂CH₂)_r（式中、q=0〜3、r=1〜1000）、又は(CH₂)_1-3CO-ペプチジル（ペプチジルは、1〜40個のα-アミノ酸からできた鎖である）からなる群より独立に選択され、
X₁及びX₂のそれぞれは、共有結合、O、NR、NRCO及びNRCONRからなる群より独立に選択され、式中、Rは、水素からなる群より選択されるか、又は、C1〜C10アルキル、C2〜C10アルケニル、C2〜C10アルキニル、C6〜C10アリール、C3〜C9シクロアルキル及び3員から9員のヘテロシクロアルキルから選択される場合により置換されていてもよい基であり、
L^Xは、存在しないか、カルボニルを介してT及びアミノ部分のそれぞれに共有結合したリンカーであるか、又は二重結合を介してTに結合したリンカーであり、
Tは、抗癌剤である生物活性作用物質であり、L^Xが存在しない場合、Tは、カルボニルを介してアミノ基に共有結合している。〕
を有する、請求項1に記載の医薬組成物。
式IIの化合物。

〔式中、
両方のR_XはHであるか、又は両方のR_Xは、一緒になって炭素-窒素二重結合を形成しており、
Pは、アネキシンタンパク質、シナプトタグミンI、ラクトアドヘリン、α-フェトプロテイン及びレプチン及びヒト血清アルブミンからなる群より選択され、
R₁は、水素、場合により置換されていてもよいC1〜C20アルキル及びα-アミノ酸残基からなる群より選択され、
R₂は、場合により置換されていてもよいC1〜C20アルキル、C2〜C20アルケニル及びC2〜C20アルキニル、(CH₂)_q(OCH₂CH₂)_r（式中、q=0〜3、r=1〜1000）、又は(CH₂)_1-3CO-ペプチジル（ペプチジルは、1〜40個のα-アミノ酸からできた鎖である）からなる群より独立に選択され、
X₁及びX₂のそれぞれは、共有結合、O、NR、NRCO及びNRCONRからなる群より独立に選択され、式中、Rは、水素からなる群より選択されるか、又はC1〜C10アルキル、C2〜C10アルケニル、C2〜C10アルキニル、C6〜C10アリール、C3〜C9シクロアルキル及び3員から9員のヘテロシクロアルキルから選択される場合により置換されていてもよい基であり、
Lは、存在しないか、又はカルボニルを介してT及びアミノ部分のそれぞれに共有結合したリンカーである。〕
両方のR_XがHである、請求項53又は54に記載の化合物。
請求項55に記載の化合物を架橋する方法であって、前記化合物がカルボニル基を有し、前記化合物を請求項1で規定された基Tと接触させ、治療用タンパク質を形成することによる、上記方法。
薬物、バイオマーカーに対するリガンド、及びその他の生物活性要素を架橋して治療用タンパク質を形成する方法であって、
（i）以下：

に示されるカルボニル基を含む前記治療薬（III）（式中、R₃はHである）を、
化合物（IV）の架橋剤：

〔式中、
X₁及びX₂のそれぞれは独立にO、NH又はCONHであり、
R₁はH、CH₃又はアミノ酸側鎖であり、
R₂は場合により置換されていてもよいフェニルであるか、又は(CH₂)_m(OCH₂CH₂)_pであり、式中、mは1から8の間の整数であり、pは0から1000の間の整数であり、Pがタンパク質である。〕
と接触させて、下記の式の構造：

を有する化合物を形成すること、並びに
（ii）式（V）の化合物を、カルボニル官能基を含む式（VI）のタンパク質：

と接触させて、式（VII）の架橋タンパク質：

を生成することによる、上記方法。
式（VII）の前記タンパク質が、場合により還元剤によって処理されて、対応する化合物（VII-A）：

〔式中、窒素とR₃を有する炭素との結合は、二重結合又は単結合である。〕
を形成する、請求項57に記載の方法。
前記タンパク質が、アネキシンモノマーであるか、又はアネキシンマルチマーであり、前記モノマー又はマルチマーが、カルボニル部分を含む、請求項57又は58に記載の方法。
前記治療薬が、アントラサイクリン、タキソール、アウリスタチン、カンプトテシン、ブレオマイシン、カルボプラチナム、シタラビン、5-フルオロウラシル、タモキシフェン、カリケアマイシン、メイタンシン、ツブリシン及びエトポシドからなる群より選択される、請求項59に記載の方法。
前記アントラサイクリンが、ドキソルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチンである、又は
前記タキソールが、パクリタキセルである、
請求項60に記載の方法。
前記構造VIIが、タンパク質システイン官能基において生物活性要素によってさらに修飾されている、請求項57又は58に記載の方法。
生物活性要素が、フォレート又はRGD結合部分のいずれかである、請求項62に記載の方法。
構造（VI）が、構造（VIII）：

〔式中、Xは、H又は生物活性作用物質である。〕
のN末端修飾タンパク質である、請求項57又は58に記載の方法。
最初に、遊離チオールを含み且つケトン官能基又はアルデヒド官能基もまた含むように修飾されたタンパク質の遊離チオールをチオール反応性基質と縮合させ、次いでさらなるステップにおいて、（必要ならば反応性カルボニルを含むように修飾された）カルボニルを含む薬物を縮合させて炭素-窒素二重結合を形成することによって、前記タンパク質を（癌細胞を標的とする生物活性要素と）縮合することにより、2個の生物活性要素に結合した治療用タンパク質を調製する方法。
最初にカルボニルを含む薬物を式IIIの分子と縮合させ、次いでタンパク質生成物をチオール反応性作用物質と接触させることにより、癌細胞を標的とする2個の生物活性要素に結合した治療用タンパク質を調製する方法。
構造XII：

〔式中、R₁はH、CH₃又はアミノ酸側鎖である。〕
のプロパルギル化されたシステイン含有タンパク質を、アジド基質（XIII）：

〔式中、X₁=O、NH、CONH、NHCONH、R₂は(CH₂)_m(OCH₂CH₂)_pであり、式中、mは1から8の間の整数であり、pは0から1000の間の整数であり、Tは治療薬であり、R₃はH又はCH₃である。〕
と接触させて、式（XIV）の化合物：

を得ることにより、要素をタンパク質に架橋する方法。
式（VII）の前記タンパク質を、場合により還元剤によって処理して、対応するジアミン（XIV-A）：

を形成する、請求項67に記載の方法。
式（XIV）の化合物：

を、式（XV）の化合物：

〔式中、X₁はO、NH、CONH又はNHCONHであり、R₂は場合により置換されていてもよいフェニルであるか又は(CH₂)_m(OCH₂CH₂)_pであり、式中、mは1から8の間の整数であり、pは0から1000の間の整数であり、Tは治療薬である。〕
と合わせて、式（XVI）の化合物：

を得ることにより、要素をタンパク質に架橋する方法。
式Iの分子の遊離システインをプロパルギル化し、次いでプロパルギル化されたタンパク質を用いたアジド基質の1,3-付加環化によって生体要素を導入して、式（XVI）の構造を得ることにより、タンパク質を2個の要素に架橋する方法。
請求項55から70に記載の方法のいずれかによって得られる治療用タンパク質。
式（X）の構造を有する治療用タンパク質。
式（XVI）の構造を有する治療用タンパク質。
タンパク質Pが、アネキシン、又はアネキシンVに対して少なくとも95％の配列同一性を有し且つアネキシンV-128ではないタンパク質を含む、請求項48から60のいずれかに記載の方法又は請求項71から73のいずれかに記載の治療用タンパク質。
Pが、モノマー、ダイマー、トリマー又はテトラマーである、請求項74に記載の方法又は治療用タンパク質。
Pが、ダイアネキシン、アネキシンVに対して少なくとも95％の配列同一性を有し且つアネキシンV-128ではないタンパク質のダイマー、アネキシンV-128のダイマー、又はアネキシンV-128に対して少なくとも95％の配列同一性を有し且つアネキシンVではないタンパク質のダイマーである、請求項74又は75に記載の方法又は治療用タンパク質。
タンパク質Pが、ホモダイマー又はヘテロダイマーアネキシンであり、2個のシステインが標識されている、請求項76に記載の方法又は治療用タンパク質。
タンパク質Pが、ホモダイマー又はヘテロダイマーアネキシンであり、その少なくとも1つのアネキシン成分が突然変異体である、請求項76に記載の方法又は治療用タンパク質。
タンパク質Pが、ホモダイマー又はヘテロダイマーアネキシンであり、その少なくとも1つのアネキシン成分が突然変異体であり、2個のシステインが標識されている、請求項76に記載の方法又は治療用タンパク質。
各T基が独立に、ビタミン、酵素、ペプチド、ペプトイド、抗体、薬物、プロドラッグ、及びバイオマーカーに対するリガンド、及びエフェロサイトーシスの刺激物質から選択される、請求項55から79のいずれかに記載の方法又は治療用タンパク質。
バイオマーカーに対するリガンドであるT基を含む、請求項80に記載の方法又は治療用タンパク質。
前記リガンドが、フォレート、EGFR、ALK、MET、MUC-1及びKRASからなる群より選択される、請求項80に記載の方法又は治療用タンパク質。
アントラサイクリン、タキソール、アウリスタチン、カンプトテシン、ブレオマイシン、カルボプラチナム、シタラビン、5-フルオロウラシル、タモキシフェン、カリケアマイシン、メイタンシン、ツブリシン、エトポシド、フォレート及びRGD結合部分からなる群より選択されるTを含む、請求項80に記載の方法又は治療用タンパク質。
前記アントラサイクリンが、ドキソルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチンである、又は
前記タキソールが、パクリタキセルである、
請求項83に記載の方法又は治療用タンパク質。
請求項71から84のいずれかに記載の治療用タンパク質を含む医薬組成物であって、前記治療用タンパク質が、医薬組成物中に存在する生物活性タンパク質の少なくとも約80％を占める、医薬組成物。
請求項1から52及び請求項85のいずれかに記載の有効量の医薬組成物を、それを必要としている患者に投与することを含む、患者の癌を処置する方法。
前記医薬組成物が、抗腫瘍免疫を促進する又はT細胞が媒介する抗腫瘍免疫を促進する治療用タンパク質を含む、請求項86に記載の方法。
コンジュゲート型治療薬Tの有効量が、非コンジュゲート型治療薬Tの投与に必要とされる量より少ない、請求項86又は87に記載の方法。
コンジュゲート型治療薬Tの有効量が、非コンジュゲート型治療薬Tの投与に必要される量の約95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％又は25％より少ない、請求項88に記載の方法。
式（X）の化合物：

の合成方法であって、表面利用可能チオールを有するタンパク質Pを、式（IX）のプロパルギルアルコール：

〔式中、XはBr、Cl、R、アルキルスルホネート又はアリールスルホネートである。〕
と接触させることによる、上記方法。
前記タンパク質が、アネキシンV-128である、請求項90に記載の方法。
式（XII）を有する化合物：

の合成方法であって、式（XI）の下記の構造：

〔式中、Pはタンパク質を表し、R₁はH、CH₃又はアミノ酸側鎖である。〕
を有するタンパク質を、式（IX）のプロパルギルアルコール：

〔式中、XはBr、Cl、R、アルキルスルホネート又はアリールスルホネートである。〕
と接触させることによる、上記方法。
式（XVII）の化合物。

〔式中、X₁は、存在しないか、又はO、NH、CONH、NHCONHであり、R₂は、(CH₂)_m(OCH₂CH₂)_pであり、式中、mは、1から8の間の整数であり、pは、0から1000の間の整数である。〕
式（XVIII）の化合物。

〔式中、R₁は、H、C1〜C20アルキル、C6〜C10アリール、C2〜C20アルケニル又はOHであり、R₂は、(CH₂)_m(OCH₂CH2)_pであり、式中、mは、1から8の間の整数であり、pは、0から1000の間の整数である。〕
式（XIX）の化合物。

〔式中、
X₁は、O、NH又はCONHであり、
X₂は、存在しないか、又はO、NH又はCONHであり、
R₁は、H、CH₃又はアミノ酸側鎖であり、
R₂は、(CH₂)_m(OCH₂CH₂)_pであり、式中、mは、1から8の間の整数であり、pは、0から1000の間の整数である。〕
式（XXI）の構造：

を有するタンパク質ダイマーを調製する方法であって、アルキン部分とアジド部分との付加環化反応を起こす条件下で、式（X）の2つの化合物：

を、式（XX）の化合物：

〔式中、R₂は(CH₂)_m(OCH₂CH₂)_pであり、式中、mは1から8の間の整数であり、pは0から1000の間の整数である。〕
と接触させることによる、上記方法。
ホスファチジルセリンとRGDペプチド又はフォレート受容体の両方を発現している癌細胞に薬物を送達する方法。
シアノ水素化ホウ素ナトリウムの存在下又は非存在下で、式（II）の化合物を、ポリエチレングリコールカルバジド（XXII）：

と接触させることにより、式（II）のアネキシンケトアミドを部位特異的にPEG化する方法。
溶媒接触可能システインを含むアネキシンタンパク質を部位特異的に修飾する方法であって、最初に前記タンパク質を請求項14に記載のプロパルギル基質IXと接触させ、次いでXをPEG化アジドと縮合させて、XXIVを得ること等による、上記方法。
前記タンパク質が、アネキシンV-128である、請求項99に記載の方法。
式（XXV）の化合物。

〔式中、
X₁は、O、NH又はCONHであり、
R₂は、(CH₂)_m(OCH₂CH₂)_pであり、式中、mは、1から8の間の整数であり、pは、0から1000の間の整数であり、
X₃は、N₃、SH又はプロパルギルである。〕
式（XXVIII）の化合物：

〔式中、Yはハロゲンである。〕
を、遊離システインを含むアネキシンタンパク質によって処理して、

〔式中、AN-Sは、アネキシンタンパク質を表す。〕
を得ることを含む、アネキシンタンパク質をPEG化する方法。
式（XXIX）の化合物：

〔式中、Yはハロゲンである。〕
を、遊離システインを含むアネキシンタンパク質によって処理して、

〔式中、AN-Sは、アネキシンタンパク質を表す。〕
を得ることを含む、アネキシンタンパク質をPEG化する方法。
タンパク質を、式（XXXII）のビス-マレイミド：

〔式中、R₂は(CH2)_m(OCH₂CH₂)_pであり、式中、mは1から8の間の整数であり、pは0から1000の間の整数である。〕
によって処理して、式（XXXIII）の化合物：

〔式中、AN^V-128は、アネキシンV-128を表す。〕
を得ることにより、アネキシンV-128のダイマーを形成する方法。
式（XXXIII）の分子。
下記の式の化合物：

を、式P-SHを有する化合物（式中、Pは、アネキシンVタンパク質又はアネキシンV-128タンパク質である）と合わせて、中間体化合物（XXXIV）：

を得、次いで、中間体化合物（XXXIV）を、式（XXXV）によって表される化合物：

〔式中、Pは、アネキシンVタンパク質又はアネキシンV-128タンパク質であり、Lは、アジド部分をタンパク質に共有結合させているリンカーである。〕
によって処理して、式（XXXVI）の化合物：

又はその位置異性体を得ることができることにより、アネキシンVのダイマー若しくはアネキシンV-128のダイマー又はこれらの組合せを形成する方法。
下記の式の化合物：

を、式P-SHを有する化合物（式中、Pは、アネキシンVタンパク質又はアネキシンV-128タンパク質である）と合わせて、中間体化合物（XXXVIII）：

を得、次いで、中間体化合物（XXXVIII）を、式（XXXV）によって表される化合物：

〔式中、Pは、アネキシンVタンパク質又はアネキシンV-128タンパク質であり、Lは、アジド部分をタンパク質に共有結合させているリンカーである。〕
によって処理して、式（XXXIX）の化合物：

又はその位置異性体を得ることができることにより、アネキシンVのダイマー若しくはアネキシンV-128のダイマー又はこれらの組合せを形成する方法。