JP2018525971A - 皮膚細胞の増殖及び抗酸化効果の増大したボツリヌス毒素−ヒト上皮細胞成長因子の融合タンパク質及びこれを有効成分として含む皮膚再生及びしわ改善のための化粧料組成物 - Google Patents

皮膚細胞の増殖及び抗酸化効果の増大したボツリヌス毒素−ヒト上皮細胞成長因子の融合タンパク質及びこれを有効成分として含む皮膚再生及びしわ改善のための化粧料組成物 Download PDF

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Abstract

本発明は、配列番号２のアミノ酸配列からなる皮膚細胞の増殖及び抗酸化効果の増大したボツリヌス毒素−ヒト上皮細胞成長因子の融合タンパク質、大膓菌コドンに最適化した配列番号１の塩基配列からなるボツリヌス毒素−ヒト上皮細胞成長因子の融合タンパク質をコードする遺伝子、遺伝子を含む組換えベクター、組換えベクターに形質転換された宿主細胞、組換えベクターに宿主細胞を形質転換させてボツリヌス毒素−ヒト上皮細胞成長因子の融合タンパク質を生産する方法、及びボツリヌス毒素−ヒト上皮細胞成長因子の融合タンパク質を有効成分として含む皮膚しわの改善及び皮膚弾力維持のための化粧料組成物に係り、本発明の化粧料組成物は、皮膚しわの改善及び皮膚再生効果を増進させられるため、今後機能性化粧品分野または美容成形分野に有用に使われうる。

Description

本発明は、皮膚細胞の増殖及び抗酸化効果の増大したボツリヌス毒素−ヒト上皮細胞成長因子の融合タンパク質及びこれを有効成分として含む皮膚再生及びしわ改善のための化粧料組成物に関する。
現代化粧品産業の核心は、化粧品原料の枯渇による新素材原料の開発及び適用にある。現在化粧品産業の全般にわたって新素材開発のための技術と機能性化粧品の開発などが持続的に行われている。特に、ヒト上皮細胞成長因子（Ｈｕｍａｎ Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ、ｈＥＧＦ）は、しわ改善、美白などの皮膚再生効果に優れて消費者の注目を引いている素材の一つである。
ヒトの皮膚は、成年（〜２５才）以後から新陳代謝や細胞の再生能力が低下するため色素沈着及びしわ形成などが引き起こされ、皮膚老化現象が進む。皮膚再生効果に優れたｈＥＧＦは皮膚再生のための医薬品治療剤として使われてきており皮膚の低下した再生能力を助け、かつ皮膚細胞の新たな細胞成長を促進できる機能を持つ老化防止用機能性化粧品の原料として使うための研究が集中的に行われてきた。
ｈＥＧＦは、細胞表面に存在する上皮細胞成長因子受容体と結合して上皮細胞成長因子受容体の二量化反応を誘導する。二量体の上皮細胞成長因子受容体は、受容体内に存在するチロシンキナーゼを活性化させて細胞内のシグナル伝逹システムを誘導し、このような過程を通じて細胞内では解糖作用及びタンパク質合成が促進されて最終的に細胞の成長が進む。
皮膚再生の重要な役割を行う上皮細胞成長因子は老化が進行するほど低減するが、上皮細胞成長因子の低減は皮膚細胞の増殖及び移動の低減を引き起こして皮膚の老化、しわ増大、弾力低減などの現象を示す。
ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）から初めて見つけられたボツリヌス毒素は、筋肉神経を麻痺させる作用を通じて医療用として初めて使われた。特に、極少量のボツリヌス毒素を限定された部位に選択的に使用すると筋肉及び神経疾患などの症状を治療できる。アメリカの製薬会社であるアラガン社（Ａｌｌｅｒｇａｎ Ｉｎｃ．）で低濃度のボツリヌス毒素Ａをボトックス（Ｂｏｔｏｘ）という商品名で販売しており、現在韓国内にはボトックス、ボツレックス（Ｂｏｔｕｌａｘ、韓国産）、メディトキシン（Ｍｅｄｉｔｏｘｉｎ、韓国産）、ディスポート（Ｄｙｓｐｏｒｔ、ヨーロッパ産）、ＢＴＸＡ（中国産）など全４種が販売されている。１９９０年代にボトックスがしわ除去に効果があるということが知られて以来、現在は美容整形分野でしわ除去の目的で全世界的に広く使われている。
２００２年アメリカ食品医薬局（Ｕ．Ｓ．Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ、ＦＤＡ）はボトックスを眉間曲線ライン治療剤として承認し、化粧用治療剤として現在まで最も脚光を浴びている。化粧品産業でしわ改善治療剤として一番人気があるボツリヌス毒素は注射療法を使っており、その効果が３〜６ヶ月前後という点と非常に高コストという点とを最大短所として持っている。
本発明では、美容整形分野でしわ除去効果に優れたボツリヌス毒素の機能をさらに効果的に持続させるために、特に皮膚再生効果を付与させるための新たなタンパク質開発を進めた結果、皮膚再生効果に優れたｈＥＧＦを結合して新たな二重機能性融合タンパク質がしわ改善及び皮膚再生促進を極大化させられるということを確認した。
一方、韓国公開特許第２０１５−０１４４７３５号明細書には「フィラーとボトルリヌム毒素とを含む皮膚しわ、老化改善または神経筋肉関連疾患治療用の組成物」が開示されており、韓国公開特許第２０１５−００５６０２２号明細書には「上皮細胞成長因子の融合タンパク質を含む皮膚改善のための化粧料組成物」が開示されているが、本発明の細胞の増殖及び抗酸化効果の増大したボツリヌス毒素−ｈＥＧＦの融合タンパク質及びこれを有効成分として含む皮膚再生及びしわ改善のための化粧料組成物については記載されていない。
本発明は、前記のような要求に応じて導出されたものであり、本発明者はボツリヌス毒素タンパク質にヒト上皮細胞成長因子を融合して新規細胞の増殖及び抗酸化効果の増大したボツリヌス毒素−ヒト上皮細胞成長因子の融合タンパク質を生産した。前記ボツリヌス毒素−ヒト上皮細胞成長因子の融合タンパク質は皮膚細胞の増殖及び抗酸化効果がヒト上皮細胞成長因子よりも非常に優れたことが分かった上で本発明を完成した。
前記課題を解決するために、本発明は配列番号２のアミノ酸配列からなる、皮膚細胞の増殖及び抗酸化効果の増大したボツリヌス毒素−ヒト上皮細胞成長因子の融合タンパク質を提供する。
また、本発明は前記融合タンパク質をコードする遺伝子を提供する。
また、本発明は前記遺伝子を含む組換えベクターを提供する。
また、本発明は前記組換えベクターに形質転換された宿主細胞を提供する。
また、本発明は前記組換えベクターに宿主細胞を形質転換させてボツリヌス毒素−ヒト上皮細胞成長因子の融合タンパク質をコードする遺伝子を過発現させるステップを含む、宿主細胞でのボツリヌス毒素−ヒト上皮細胞成長因子の融合タンパク質の生産方法を提供する。
また、本発明は前記方法によって生産されたボツリヌス毒素−ヒト上皮細胞成長因子の融合タンパク質を提供する。
また、本発明は配列番号２のアミノ酸配列からなるボツリヌス毒素−ヒト上皮細胞成長因子の融合タンパク質を有効成分として含む皮膚再生及びしわ改善のための化粧料組成物を提供する。
本発明の大腸菌コドンに最適化したボツリヌス毒素−ヒト上皮細胞成長因子の融合タンパク質のコーディング遺伝子を用いた大膓菌での生産方法は、大膓菌内でタンパク質が凝集体状に発現して生産工程を簡素化し、かつタンパク質の大量生産を可能にし、前記方法によって生産されたボツリヌス毒素−ヒト上皮細胞成長因子の融合タンパク質は皮膚しわの改善及び皮膚再生機能に優れ、機能性化粧料の原料として有用に使われる。
ボツリヌス毒素−ヒト上皮細胞成長因子の融合タンパク質の暗号遺伝子を含む組換えプラスミド（ｐＥＴ２２ｂ：：ＢＴＡＬＥＧＦ）の製作過程及び大膓菌への形質転換に関する模式図である。 図２Ａは、大腸菌でのボツリヌス毒素−ヒト上皮細胞成長因子の融合タンパク質（ＢＴＡＬ−ＥＧＦ）の発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに電気泳動して確認した結果であり、図２Ｂは、融合タンパク質内のヒト上皮細胞成長因子の含有如何を調べるためにＥＧＦ検出キットを使ってＥＧＦドメインを確認した結果である。Ｍは分子量マーカー、１は発現誘導前の細胞粗溶解物（ｃｒｕｄｅ ｌｙｓａｔｅ）、２は発現誘導後の細胞粗溶解物、ＣはＥＧＦ対照群、Ｔはテスト試料（融合タンパク質）である。 ボツリヌス毒素−ヒト上皮細胞成長因子の融合タンパク質を皮膚線維芽細胞で処理した後、皮膚線維芽細胞の細胞増殖効果をクリスタルバイオレット染色によって確認した写真である。 ボツリヌス毒素−ヒト上皮細胞成長因子の融合タンパク質の抗酸化能をＤＰＰＨ実験によって確認した結果を示すものである。
本発明の目的を達成するために、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列からなる、皮膚細胞の増殖及び抗酸化効果の増大したボツリヌス毒素−ヒト上皮細胞成長因子の融合タンパク質を提供する。
本発明によるボツリヌス毒素−ヒト上皮細胞成長因子の融合タンパク質の範囲は、配列番号２のアミノ酸配列を持つタンパク質及び前記タンパク質の機能的同等物を含む。「機能的同等物」とは、アミノ酸の付加、置換または欠失の結果、前記配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも７０％以上、望ましくは８０％以上、さらに望ましくは９０％以上、もっと望ましくは９５％以上の配列相同性を持つものであって、配列番号２で表示されるタンパク質と実質的に同質の活性を示すタンパク質をいう。「実質的に同質の活性」とは、皮膚しわの改善及び皮膚再生の活性を意味する。本発明はまた、ボツリヌス毒素−ヒト上皮細胞成長因子の融合タンパク質の断片、誘導体及び類似体を含む。本願に使われた用語「断片」、「誘導体」及び「類似体」とは、本発明のボツリヌス毒素−ヒト上皮細胞成長因子の融合タンパク質と実質的に同じ生物学的機能または活性を持つポリペプチドをいう。
本発明のボツリヌス毒素−ヒト上皮細胞成長因子の融合タンパク質は、望ましくは配列番号２のアミノ酸配列からなり、前記アミノ酸配列のうち１番目ないし４４８番目のアミノ酸配列からなるボツリヌス毒素タンパク質と、４４９番目ないし５０１番目のアミノ酸配列からなるヒト上皮細胞成長因子タンパク質とを融合させて製作した新規タンパク質でありうる。
本発明はまた、前記皮膚細胞の増殖及び抗酸化効果の増大したボツリヌス毒素−ヒト上皮細胞成長因子の融合タンパク質をコードする遺伝子を提供する。前記遺伝子は大腸菌コドンに最適化した配列番号１の塩基配列からなりうるが、これに制限されるものではない。
本発明による前記皮膚細胞の増殖及び抗酸化効果の増大したボツリヌス毒素−ヒト上皮細胞成長因子の融合タンパク質をコードする遺伝子は、配列番号１の塩基配列を含むことができる。また、前記塩基配列の相同体が本発明の範囲内に含まれる。具体的には、前記遺伝子は配列番号１の塩基配列からなる群から選択される塩基配列とそれぞれ７０％以上、さらに望ましくは８０％以上、もっと望ましくは９０％以上、一番望ましくは９５％以上の配列相同性を持つ塩基配列を含む。ポリヌクレオシドについての「配列相同性の％」は最適に配列された二つの配列と比較領域とを比べることで認められ、比較領域でのポリヌクレオシド配列の一部は二つの配列の最適の配列についての参照配列（追加または削除を含まない）に比べて追加または削除（すなわち、ギャップ）を含むことができる。
「コドンに最適化」は、コードされたタンパク質が有機体でさらに効率的に発現するように特定有機体で優先的に使われることでタンパク質をコードするポリヌクレオシドのコドンを変化させることを意味する。ほとんどのアミノ酸が「同義語」または「同意」コドンという、いくつかのコドンによって表示されるという点で、遺伝子コードが縮退的であるが、特定有機体によるコドン用法は任意的ではなく特定コドントリプレットに偏向的である。このようなコドン用法偏向性は、所定遺伝子、共通機能または先祖起源の遺伝子、高度に発現するタンパク質に比べて低い複製数のタンパク質、及び有機体ゲノムの集合的タンパク質コーディング領域に関してさらに高い。本発明の前記配列番号１の塩基配列は、ボツリヌス毒素−ヒト上皮細胞成長因子の融合タンパク質をコードする遺伝子が大腸菌内で発現するように大腸菌のコドンに最適化した配列である。
本発明はまた、前記遺伝子を含む組換えベクター及び前記組換えベクターに形質転換された宿主細胞を提供する。
用語「組換え」とは、細胞が異種の核酸を複製するか、前記核酸を発現するか、またはペプチド、異種のペプチドまたは異種の核酸によって暗号化されたタンパク質を発現する細胞を称する。組換え細胞は、前記細胞の天然形態では見つけられない遺伝子または遺伝子の切片をセンスまたはアンチセンス形態のうち一つで発現できる。また組換え細胞は、天然状態の細胞で見つけられる遺伝子を発現できるものの、前記遺伝子は変形されたものであって、人為的な手段によって細胞内に再導入されたものである。
本発明で、前記ボツリヌス毒素−ヒト上皮細胞成長因子の融合タンパク質をコードする遺伝子は組換え発現ベクター内に挿入され得る。用語「組換え発現ベクター」とは、細菌プラスミド、ファージ、酵母プラスミド、植物細胞ウイルス、哺乳動物細胞ウイルス、または他のベクターを意味する。大体、任意のプラスミド及びベクターは宿主内で複製及び安定化できるものであれば使われうる。前記発現ベクターの重要な特性は、複製原点、プロモータ、マーカ遺伝子及び翻訳調節シグナルを持つことである。
ボツリヌス毒素−ヒト上皮細胞成長因子の融合タンパク質をコードする遺伝子配列及び適当な転写／翻訳調節シグナルを含む発現ベクターは当業者に周知の方法によって構築される。前記方法は、試験管内の組換えＤＮＡ技術、ＤＮＡ合成技術及び生体内の組換え技術などを含む。前記ＤＮＡ配列は、ｍＲＮＡ合成を導くために発現ベクター内の適当なプロモータに効果的に連結されうる。また発現ベクターは翻訳開始部位として、リボソーム結合部位及び転写ターミネーターを含む。
本発明の一具現例による組換えベクターは、ｐＥＴ２２ｂベクターに合成したボツリヌス毒素−ヒト上皮細胞成長因子の融合タンパク質をコードする遺伝子（配列番号１）を５’末端（ＮｄｅＩ制限酵素サイト）及び３’末端（ＸｈｏＩ制限酵素サイト）にインフレームに融合して製造し、前記遺伝子をｌａｃプロモータ及びｌａｃＩリプレッサーとによって効果的に発現させてボツリヌス毒素−ヒト上皮細胞成長因子の融合タンパク質を製造することを特徴とするベクターである。
本発明のベクターを原核細胞に安定して連続的にクローニング及び発現できる宿主細胞ならば当業者に公知のいかなる宿主細胞も用いられ、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｒｏｓｅｔｔａ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１、Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＲ１、Ｅ．ｃｏｌｉ ＬＥ３９２、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｘ１７７６、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０、バチルス・サブチリス、バチルス・チューリンゲンシスのようなバチルス属菌株、そしてネズミチフス菌、セラチア・マルセッセンス及び多様なシュードモナス属のような腸内菌と菌株などがある。
また、本発明のベクターを真核細胞に形質転換させる場合には、宿主細胞として、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、昆虫細胞、ヒト細胞（例えば、ＣＨＯ細胞株（Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ）、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ−７、２９３、ＨｅｐＧ２、３Ｔ３、ＲＩＮ及びＭＤＣＫ細胞株）及び植物細胞などが用いられる。
本発明の一具現例による組換えベクターに形質転換された宿主細胞はＥ．ｃｏｌｉ Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ大膓菌でありうるが、これに制限されるものではない。
本発明のベクターを宿主細胞内で運ぶ方法は、宿主細胞が原核細胞である場合、ＣａＣｌ２方法、ハナハン方法（Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．，１９８３ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６６，５５７−５８０）及び電気穿孔方法などによって施される。また、宿主細胞が真核細胞である場合には、微細注入法、カルシウムポスフェート沈澱法、電気穿孔法、リポソーム媒介形質感染法、ＤＥＡＥ−デキストラン処理法、及び遺伝子衝撃（ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）などによってベクターを宿主細胞内に注入できる。
本発明はまた、前記組換えベクターに宿主細胞を形質転換させてボツリヌス毒素−ヒト上皮細胞成長因子の融合タンパク質をコードする遺伝子を過発現させるステップを含む、宿主細胞でのボツリヌス毒素−ヒト上皮細胞成長因子の融合タンパク質の生産方法を提供する。
本発明の一具現例による方法で、前記宿主細胞は望ましくは大腸菌であり、さらに望ましくはＥ．ｃｏｌｉ Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ大腸菌であるが、これに制限されるものではない。
本発明はまた、前記方法によって生産されたボツリヌス毒素−ヒト上皮細胞成長因子の融合タンパク質を提供する。
本発明はまた、配列番号２のアミノ酸配列からなるボツリヌス毒素−ヒト上皮細胞成長因子の融合タンパク質を有効成分として含む皮膚再生及びしわ改善のための化粧料組成物を提供する。
本発明の一具現例による化粧料組成物で前記ボツリヌス毒素−ヒト上皮細胞成長因子の融合タンパク質の含量は、化粧料組成物の総重量対比０．０００００２ないし０．００２重量％で含まれうるが、これに制限されるものではない。
本発明の化粧料組成物には前記有効成分以外に化粧品組成物に通常に用いられる成分を含むが、例えば、脂質、有機溶媒、溶解剤、濃縮剤及びゲル化剤、軟化剤、抗酸化剤、懸濁剤、安定化剤、発泡剤、芳香剤、界面活性剤、水、イオン型または非イオン型乳化剤、充填剤、金属イオン封鎖剤とキレート化剤、保存剤、ビタミン、遮断剤、湿潤剤、エッセンシャル・オイル、染料、顔料、親水性または親油性の活性剤、脂質小胞のような通常の補助剤、そして担体を含む。
本発明の組成物は、当業界で通常的に製造されるいかなる剤型にも製造でき、例えば、溶液、懸濁液、乳濁液、ペースト、ゲル、クリーム、ローション、パウダー、オイル、粉末ファンデーション、乳濁液ファンデーション、ワックスファンデーション及びスプレーなどに剤型化できるが、これに限定されるものではない。さらに詳細には、スキン、皮膚軟化剤、スキントナー、アストリンゼント、ローション、ミルクローション、モイスチャーローション、栄養ローション、マッサージクリーム、栄養クリーム、アイクリーム、モイスチャークリーム、ハンドクリーム、エッセンス、栄養エッセンス、パック、クレンジングフォーム、クレンジングウォーター、クレンジングローション、クレンジングクリーム、ボディローション、ボディクレンザー、石鹸及びパウダーの化粧品剤型に製造できる。
本発明の化粧料組成物の剤型がペースト、クリームまたはゲルである場合には、担体成分として動物性油、植物性油、ワックス、パラフィン、澱粉、トラカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、シリカ、タルクまたは酸化亜鉛などが用いられる。
本発明の化粧料組成物の剤型がパウダーまたはスプレーである場合には、担体成分としてラクトース、タルク、シリカ、アルミニウムヒドロキシド、カルシウムシリケートまたはポリアミドパウダーが用いられ、特にスプレーである場合には、クロロフルオロヒドロカーボン、プロパン／ブタンまたはジメチルエーテルのような噴射剤をさらに含む。
本発明の化粧料組成物の剤型が溶液または乳濁液である場合には、担体成分として溶媒、溶解剤または油濁剤が用いられ、例えば、水、エタノール、イソプロパノール、エチルカーボネート、エチルアセテート、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート、プロピレングリコール、１，３−ブチルグリコールオイル、グリセロール脂肪族エステル、ポリエチレングリコールまたはソルビタンの脂肪酸エステルがある。
本発明の化粧料組成物の剤型が懸濁液である場合には、担体成分として水、エタノールまたはプロピレングリコールのような液状の希釈剤、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールエステル、及びポリオキシエチレンソルビタンエステルのような懸濁液剤、微結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、アガまたはトラカントなどが用いられる。
以下、本発明を実施例によって詳細に説明する。但し、下記の実施例は本発明を例示するものであるだけであり、本発明の内容が下記の実施例に限定されるものではない。
＜実施例１＞ボツリヌス毒素−ヒト上皮細胞成長因子の融合タンパク質の生産のための組換え発現ベクター及び形質転換組換え微生物の製造
ボツリヌス毒素−ヒト上皮細胞成長因子の融合タンパク質をコードする最適化した遺伝子、組換え発現ベクター及び形質転換組換え微生物は、次の方法で製作した。
ボツリヌス毒素（Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ ｔｏｘｉｎ、以下、ＢＴＡＬ）タンパク質とパートナータンパク質として使われるヒト上皮細胞成長因子（Ｈｕｍａｎ Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ、以下、ｈＥＧＦ）タンパク質とをコードする遺伝子を鋳型として使って宿主微生物内で発現されるように最適化した、５０１個のアミノ酸からなるＢＴＡＬ−ｈＥＧＦの融合タンパク質をコードする遺伝子（配列番号１）断片を製作及び合成した。
ＢＴＡＬのカルボキシル末端（Ｃ−末端）にｈＥＧＦタンパク質が結合されたＢＴＡＬ−ｈＥＧＦの融合タンパク質（配列番号２）をコードする遺伝子を合成するために、フォワードプライマー１（５’−ＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＣＣＧＴＴＣＧＴＴＡＡＣ−３’、配列番号３）及びリバースプライマー１（５’−ＧＴＣＴＧＡＧＴＴＴＴＴＧＴＴＧＴＡＡＣ−３’、配列番号４）を用いて大腸菌に好適に最適化したＢＴＡＬをコードする１３４４個のヌクレオシド（配列番号１の１〜１３４４番目の塩基配列）を合成し、フォワードプライマー２（５’−ＧＴＴＡＣＡＡＣＡＡＡＡＡＣＴＣＡＧＡＣ−３’、配列番号５）及びリバースプライマー２（５’−ＧＴＧＣＴＣＧＡＧＧＣＧＣＡＡＣＴＣＣＣ−３’、配列番号６）を使って大腸菌に好適に最適化したｈＥＧＦタンパク質をコードする１５９個のヌクレオシド（配列番号１の１３４５〜１５０３番目の塩基配列）を合成した。前記の方法で合成したそれぞれのＢＴＡＬタンパク質及びｈＥＧＦとをコードする遺伝子を鋳型として正方向プリマー１（配列番号３）及び逆方向プリマー２（配列番号６）を使って、最終的にＢＴＡＬのカルボキシル末端にｈＥＧＦタンパク質が結合された融合タンパク質をコードする１５０３個のヌクレオシドからなる遺伝子を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を通じて合成した。
前記遺伝子断片及び組換えプラスミドを同じ制限酵素（５’末端ＮｄｅＩ及び３’末端ＸｈｏＩ）で切断して挿入し、図１に示す組換えプラスミド（ｐＥＴ２２ｂ：：ＢＴＡＬＥＧＦ）を製作した。製造された組換えプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ ＴＯＰ１０に形質転換させて宿主微生物から大量の遺伝子コンストラクトを得た。
次いで、製造された組換えプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ、ドイツ）に形質転換させて、ＢＴＡＬ−ｈＥＧＦの融合タンパク質生産のための組換え微生物を製作した。
＜実施例２＞ＢＴＡＬ−ｈＥＧＦの融合タンパク質の発現誘導、分離及び精製
実施例１で製造したＥ．ｃｏｌｉ Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳをそれぞれ１ｌＬＢ培地（１０％トリプトファン、１０％塩化ナトリウム及び５％酵母抽出物）あるいはＢＳＢ培地（１％トリプトファン、０．５％酵母抽出物、１％グルコース及び０．１％ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、（株）ネクスジェンバイオテク）を使って回分培養する時にＯＤ６００＝０．６〜０．８になるまで、または２０Ｌの発酵器を使って連続培養する時にはＯＤ６００＝１５〜２０になるまで培養した。次いで、細胞培養培地にそれぞれ最終１〜５ｍＭ ＩＰＴＧまたは２％ラクトースを加えて組換え大腸菌の遺伝子発現を誘導した。遺伝子発現の誘導後に３〜４時間さらに培養して細胞を遠心分離方法を用いて回収した。この細胞を緩衝溶液（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ、８ｇの塩化ナトリウム、０．２ｇの塩化カリウム、１．４４ｇの第２リン酸ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４）、０．２４ｇのリン酸二水素カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）／Ｌ、ｐＨ７．４）に完全に懸濁させた後、超音波破砕機を使って細胞を破壊して細胞内タンパク質を含む溶液を分離した。
前記分離された溶液を試料として１５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの電気泳動でタンパク質の発現如何を確認した。その結果、ＩＰＴＧまたはラクトースを通じて発現を誘導した細胞粗溶解物でＢＴＡＬ−ｈＥＧＦの融合タンパク質の発現が確認できた（図２Ａ）。
ＢＴＡＬ−ｈＥＧＦの融合タンパク質内のｈＥＧＦの有無を確認するためにＥＧＦ検出キット（韓国のネクスジェンバイオテク社製）を使った。その結果、図２Ａで確認されたＢＴＡＬ−ｈＥＧＦの融合タンパク質内にｈＥＧＦが存在するということが分かった（図２Ｂ）。
発現の確認されたＢＴＡＬ−ｈＥＧＦの融合タンパク質を分離、精製するために凝集体を可溶化緩衝溶液（５Ｍ尿素、ｐＨ１１）に可溶化した後、超微細ろ過方法（０．４５μｍ精密ろ過膜と１Ｋ超微細膜）を用いてリフォールディング過程を行い、保存用緩衝溶液（ＰＢＳ）を使って最終的にＢＴＡＬ−ｈＥＧＦの融合タンパク質を分離した。
＜実施例３＞ＢＴＡＬ−ｈＥＧＦの融合タンパク質の活性測定−皮膚線維芽細胞の細胞増殖効果
実施例２で分離及び精製されたＢＴＡＬ−ｈＥＧＦの融合タンパク質の存在が確認された試料を選んでＢＴＡＬ−ｈＥＧＦの融合タンパク質の活性を測定した。
皮膚線維芽細胞（Ｈｕｍａｎ Ｄｅｒｍａｌ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ａｄｕｌｔ、ＨＤＦａ ｃｅｌｌ）を培養した後、細胞にそれぞれ０、０．０２ｐｐｍ、０．２ｐｐｍ濃度の融合タンパク質を処理した後、３日間３７℃で培養した。次いで、クリスタルバイオレット染色法で皮膚線維芽細胞の増殖如何を確認した。
その結果、ＢＴＡＬ−ｈＥＧＦの融合タンパク質の濃度（０．０２〜０．２ｐｐｍ）を増大させるほど無処理対照群（０ｐｐｍ）に比べて皮膚線維芽細胞の増殖効果が優秀であるということが分かった（図３）。また、ＢＴＡＬタンパク質を融合しないｈＥＧＦタンパク質の単独処理群に比べて融合タンパク質の細胞増殖効果がさらに高く観察された。前記結果を通じて、ＢＴＡＬとｈＥＧＦとが融合したタンパク質の相乗効果を確認した。
＜実施例４＞ＢＴＡＬ−ｈＥＧＦの融合タンパク質の抗酸化活性の測定
ＢＴＡＬ−ｈＥＧＦの融合タンパク質の抗酸化効能を測定するために、フリーラジカル消去効果の測定方法の一つであるＤＰＰＨ（１，１−ｄｉｐｈｅｎｙｌ−２−ｐｉｃｒｙｌ ｈｙｄｒａｚｙｌ）分析を行った。前記試薬は、比較的安定したフリーラジカルとして存在してフリーラジカル消去作用を確認するために一次的に使われる試験管的な方法の一つである。
ＤＰＰＨ分析時に陽性対照群としてＬ−アスコルビン酸を使った。実験方法としては、Ｌ−アスコルビン酸、ＢＴＡＬ−ｈＥＧＦの融合タンパク質及びｈＥＧＦタンパク質をそれぞれ１μＭ濃度で用意し、ＤＰＰＨは最終濃度が２００μＭになるように用意した。前記各タンパク質とＤＰＰＨとを１：１に混合した後、３７℃で３０分放置した。次いで、ＥＬＩＳＡリーダで５２０ｎｍ吸光度を測定した。フリーラジカル消去能（％）は下記の式１で計算し、その結果を図４に示す。
その結果、ＢＴＡＬ−ｈＥＧＦの融合タンパク質はＬ−アスコルビン酸対照群より約１．５倍高いフリーラジカル消去能を示し、ＢＴＡＬを融合しないｈＥＧＦタンパク質に比べても約２．５倍高いフリーラジカル消去能を示した（図４）。よって、本発明の融合タンパク質はＢＴＡＬによってさらに高い抗酸化効能を持つということが分かり、これは前記融合タンパク質の抗酸化効能による皮膚老化防止効果を持つことができるということを意味する。
＜実験例１＞皮膚しわの改善、皮膚弾力維持効果及び皮膚刺激の官能試験
前記実施例２で分離、精製したＢＴＡＬ−ｈＥＧＦの融合タンパク質を有効成分として、製造例１、２、３及び４と比較例１、２、３及び４の化粧料組成物を製造して官能試験を施した（表１、３、５及び７参照）。
具体的には、しわ改善事項を確認するために３０才以上６０才未満の女性と男性計３０人（３０代１０人、４０代１０人、５〜６０代１０人）を対象として、しわが多く分布する顔面の左側目元には比較例（対照群）を、顔面の右側目元には製造例（試験群）を１日１回２週間持続的に使うようにした。そして目の周りの部分のシワが広がる程度を評価した。皮膚刺激項目についても同じ方法で皮膚のかゆみ、痛み及び紅斑現象などに関して官能試験を施した。評価基準は、非常に優秀（５点）、優秀（４点）、普通（３点）、悪い（２点）、非常に悪い（１点）の五点法基準とした。但し、官能試験結果で整数で表示し難い場合には小数で表示した。その結果を下記の表２、４、６及び８に示す。
＜製造例１及び比較例１＞
ＢＴＡＬ−ｈＥＧＦの融合タンパク質を有効成分として添加し、下記の表１に記載の成分及び含量で製造例１のスキンケア組成物を製造した。また、ＢＴＡＬ−ｈＥＧＦの融合タンパク質を有効成分として添加せずに、下記の表１に記載の成分及び含量で比較例１のスキンケア組成物を製造した。
前記製造例１及び比較例１の官能試験結果は、下記の表２の通りである。
＜製造例２及び比較例２＞
ＢＴＡＬ−ｈＥＧＦの融合タンパク質を有効成分として添加し、下記の表３に記載の成分及び含量で製造例２のエッセンスを製造した。また、ＢＴＡＬ−ｈＥＧＦの融合タンパク質を有効成分として添加せずに、下記の表３に記載の成分及び含量で比較例２のエッセンスを製造した。
前記製造例２及び比較例２の官能試験結果は、下記の表４の通りである。
＜製造例３及び比較例３＞
ＢＴＡＬ−ｈＥＧＦの融合タンパク質を有効成分として添加し、下記の表５に記載の成分及び含量で製造例３のローションを製造した。また、ＢＴＡＬ−ｈＥＧＦの融合タンパク質を有効成分として添加せずに、下記の表５に記載の成分及び含量で比較例３のローションを製造した。
前記製造例３及び比較例３の皮膚しわの改善効果及び皮膚刺激の官能試験結果は、下記の表６の通りである。
＜製造例４及び比較例４＞
ＢＴＡＬ−ｈＥＧＦの融合タンパク質を有効成分として添加し、下記の表７に記載の成分及び含量で製造例４のクリームを製造した。また、ＢＴＡＬ−ｈＥＧＦの融合タンパク質を有効成分として添加せずに、下記の表７に記載の成分及び含量で比較例４のクリームを製造した。
前記製造例４及び比較例４の官能試験結果は、下記の表８の通りである。
前記の官能試験結果を通じて、本発明のＢＴＡＬ−ｈＥＧＦの融合タンパク質を有効成分として含む製造例１、２、３及び４が該比較例に比べて皮膚しわの改善効果があるということが分かった。

Claims (9)

  1. 配列番号２のアミノ酸配列からなる、皮膚細胞の増殖及び抗酸化効果の増大したボツリヌス毒素−ヒト上皮細胞成長因子の融合タンパク質。
  2. 請求項１に記載の皮膚細胞の増殖及び抗酸化効果の増大したボツリヌス毒素−ヒト上皮細胞成長因子の融合タンパク質をコードする遺伝子。
  3. 前記遺伝子は大膓菌コドンに最適化した配列番号１の塩基配列からなることを特徴とする請求項２に記載の遺伝子。
  4. 請求項２または３に記載の遺伝子を含む組換えベクター。
  5. 請求項４に記載の組換えベクターに形質転換された宿主細胞。
  6. 請求項４に記載の組換えベクターに宿主細胞を形質転換させてボツリヌス毒素−ヒト上皮細胞成長因子の融合タンパク質をコードする遺伝子を過剰発現させるステップを含む、宿主細胞でのボツリヌス毒素−ヒト上皮細胞成長因子の融合タンパク質の生産方法。
  7. 前記宿主細胞は大膓菌であることを特徴とする、請求項６に記載のボツリヌス毒素−ヒト上皮細胞成長因子の融合タンパク質の生産方法。
  8. 請求項６に記載の方法によって生産されたボツリヌス毒素−ヒト上皮細胞成長因子の融合タンパク質。
  9. 配列番号２のアミノ酸配列からなる皮膚細胞の増殖及び抗酸化効果の増大したボツリヌス毒素−ヒト上皮細胞成長因子の融合タンパク質を有効成分として含む皮膚再生及びしわ改善のための化粧料組成物。
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