WO2017213287A1 - 피부 세포 증식 및 항산화 효과가 증가한 보툴리눔 톡신-인간상피세포성장인자 융합단백질 및 이를 유효성분으로 함유하는 피부 재생 및 주름 개선용 화장료 조성물 - Google Patents

피부 세포 증식 및 항산화 효과가 증가한 보툴리눔 톡신-인간상피세포성장인자 융합단백질 및 이를 유효성분으로 함유하는 피부 재생 및 주름 개선용 화장료 조성물 Download PDF

Info

Publication number
WO2017213287A1
WO2017213287A1 PCT/KR2016/007985 KR2016007985W WO2017213287A1 WO 2017213287 A1 WO2017213287 A1 WO 2017213287A1 KR 2016007985 W KR2016007985 W KR 2016007985W WO 2017213287 A1 WO2017213287 A1 WO 2017213287A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
growth factor
botulinum toxin
fusion protein
epidermal growth
human epidermal
Prior art date
Application number
PCT/KR2016/007985
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
이선교
유한봉
이성란
최종남
최태원
김태현
정태화
권형일
Original Assignee
(주)넥스젠바이오텍
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=56500037&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=WO2017213287(A1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by (주)넥스젠바이오텍 filed Critical (주)넥스젠바이오텍
Priority to EP16904720.6A priority Critical patent/EP3299385B1/en
Priority to ES16904720T priority patent/ES2760547T3/es
Priority to US15/522,160 priority patent/US10266817B2/en
Priority to CN201680035335.4A priority patent/CN108350042A/zh
Priority to JP2017562980A priority patent/JP6592112B2/ja
Publication of WO2017213287A1 publication Critical patent/WO2017213287A1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/1858—Platelet-derived growth factor [PDGF]
    • A61K38/1866—Vascular endothelial growth factor [VEGF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A61K38/4886—Metalloendopeptidases (3.4.24), e.g. collagenase
    • A61K38/4893—Botulinum neurotoxin (3.4.24.69)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/64—Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/64—Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
    • A61K8/66—Enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A61Q19/08—Anti-ageing preparations
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/33—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Clostridium (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/485—Epidermal growth factor [EGF], i.e. urogastrone
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/24—Metalloendopeptidases (3.4.24)
    • C12Y304/24069—Bontoxilysin (3.4.24.69), i.e. botulinum neurotoxin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/55—Fusion polypeptide containing a fusion with a toxin, e.g. diphteria toxin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones

Definitions

  • the present invention relates to a botulinum toxin-human epidermal growth factor fusion protein having increased skin cell proliferation and antioxidant effects, and a cosmetic composition for improving skin regeneration and wrinkles containing the same as an active ingredient.
  • human epidermal growth factor is one of the materials attracting consumer attention because of its excellent skin regeneration effects such as wrinkle improvement and whitening.
  • Human skin has a decrease in metabolism and cellular regeneration after adulthood ( ⁇ 25 years), causing pigmentation and wrinkle formation, and skin aging.
  • Human epidermal growth factor with excellent skin regeneration effect has been used as a drug treatment for skin regeneration, but it is a raw material of anti-aging functional cosmetics that has a function to help reduced regeneration of skin and promote new cell growth of skin cells. Research has been concentrated for use as a.
  • Human epidermal growth factor binds to the epidermal growth factor receptor on the cell surface and induces dimerization of the epidermal growth factor receptor.
  • the epidermal growth factor receptor of the dimer activates the intracellular signaling system by activating the tyrosine kinase present in the receptor. This process promotes glycolysis and protein synthesis in the cell, resulting in cell growth. This is going on.
  • Epithelial growth factor which plays an important role in skin regeneration, decreases as aging progresses. Decreased epithelial growth factor causes skin cell proliferation and migration to decrease, resulting in aging of the skin, increased wrinkles, and decreased elasticity. .
  • Botulinum toxin first discovered from Clostridium botulinum, was first used for medical purposes through the effect of paralyzing muscle nerves.
  • a small amount of botulinum toxin is selectively used in a limited area, it can treat symptoms such as muscle and neurological diseases, and thus, a low concentration of botulinum toxin A is sold by the US pharmaceutical company Allergan Inc. under the trade name Botox.
  • Botox Currently, four types of Botox, Botulex (domestic), Medytoxin (domestic), Dispot (Europe) and BTXA (China) are sold in Korea.
  • Botox was known to have the effect of removing wrinkles in the 1990s, it is now widely used all over the world for the purpose of wrinkle removal in the cosmetic molding field.
  • Botox As a treatment for glaucoma curve lines, and is currently the most popular cosmetic treatment.
  • Botulinum toxin the most popular anti-wrinkle treatment in the cosmetics industry, uses rosacea, which has three to six months of effect and is very expensive.
  • Korean Patent Publication No. 2015-0144735 discloses 'compositions for the treatment of skin wrinkles, aging, or neuromuscular-related diseases containing fillers and bottlelinum toxin'
  • Korean Patent Publication No. 2015-0056022 A cosmetic composition for skin improvement comprising a fusion protein of epidermal growth factor 'is disclosed, but a botulinum toxin-human epidermal growth factor fusion protein having increased cell proliferation and antioxidant effects of the present invention and skin regeneration containing the same as an active ingredient And it does not describe about the cosmetic composition for wrinkle improvement.
  • the present invention was derived from the above requirements, and the present inventors fused a human epidermal growth factor to a botulinum toxin protein to produce a botulinum toxin-human epithelial cell growth factor fusion protein with increased cell proliferation and antioxidant effects. .
  • the botulinum toxin-human epidermal growth factor fusion protein has completed the present invention by confirming that the proliferation and antioxidant effects of skin cells are much superior to those of human epidermal growth factor.
  • the present invention provides a botulinum toxin-human epithelial cell growth factor fusion protein with increased skin cell proliferation and antioxidant effect consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the present invention also provides a gene encoding the fusion protein.
  • the present invention also provides a recombinant vector comprising the gene.
  • the present invention also provides a host cell transformed with the recombinant vector.
  • the present invention comprises the step of transforming the host cell with the recombinant vector overexpressing the gene encoding the botulinum toxin-human epidermal growth factor fusion protein, botulinum toxin-human epithelial cell growth factor fusion protein in the host cell To provide a production method.
  • the present invention also provides a botulinum toxin-human epidermal growth factor fusion protein produced by the above method.
  • the present invention also provides a cosmetic composition for skin regeneration and wrinkle improvement comprising a botulinum toxin-human epidermal growth factor fusion protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 as an active ingredient.
  • the production method of Escherichia coli using the E. coli codon optimized botulinum toxin-human epidermal growth factor fusion protein coding gene of the present invention simplifies the production process by expressing the protein in the form of aggregates in Escherichia coli, allowing mass production of the protein.
  • the botulinum toxin-human epidermal growth factor fusion protein produced by the above method is excellent in skin wrinkle improvement and skin regeneration function, and thus may be usefully used as a functional cosmetic raw material.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of the production of recombinant plasmid (pET22b :: BTALEGF) containing a botulinum toxin-human epidermal growth factor fusion protein coding gene and transformation to E. coli.
  • Figure 2 shows the results of electrophoresis of the expression of botulinum toxin-human epidermal growth factor fusion protein (BTAL-EGF) in SDS-PAGE gel in E. coli (A) and to determine whether it contains human epidermal growth factor in the fusion protein.
  • BTAL-EGF botulinum toxin-human epidermal growth factor fusion protein
  • FIG. 3 is a photo of the botulinum toxin-human epidermal growth factor fusion protein treated with skin fibroblasts, the cell proliferation effect of the skin fibroblasts through crystal violet staining.
  • Figure 4 is the result of confirming the antioxidant efficacy of the botulinum toxin-human epidermal growth factor fusion protein through DPPH experiment.
  • the present invention provides a botulinum toxin-human epithelial cell growth factor fusion protein with increased skin cell proliferation and antioxidant effect consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the range of the botulinum toxin-human epidermal growth factor fusion protein according to the present invention includes a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and a functional equivalent of the protein.
  • “Functional equivalent” means at least 70%, preferably at least 80%, more preferably at least 90%, even more preferably at least 95% of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 as a result of the addition, substitution or deletion of the amino acid It refers to a protein having a sequence homology of% or more and exhibiting substantially homogeneous activity with the protein represented by SEQ ID NO: 2.
  • “Substantially homogeneous activity” means skin wrinkle improvement and skin regeneration activity.
  • the present invention also includes fragments, derivatives and analogues of botulinum toxin-human epidermal growth factor fusion protein.
  • fragment refers to a polypeptide that retains a biological function or activity substantially the same as the botulinum toxin-human epidermal growth factor fusion protein of the invention.
  • the botulinum toxin-human epidermal growth factor fusion protein of the present invention is preferably composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, the botulinum toxin protein consisting of the 1st to 448th amino acid sequences of the amino acid sequence and the 449th to 501st amino acids. It may be a novel protein produced by fusing human epidermal growth factor protein consisting of a sequence.
  • the present invention also provides a gene encoding the botulinum toxin-human epidermal growth factor fusion protein having increased skin cell proliferation and antioxidant effects.
  • the gene may be composed of the base sequence of E. coli codon optimized SEQ ID NO: 1, but is not limited thereto.
  • the gene encoding the botulinum toxin-human epidermal growth factor fusion protein having increased skin cell proliferation and antioxidant effect according to the present invention may include the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
  • homologues of the above nucleotide sequences are included within the scope of the present invention.
  • the gene is at least 70%, more preferably at least 80%, even more preferably at least 90%, most preferably at least 95% of each nucleotide sequence selected from the group consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 1. It may include a base sequence having the above sequence homology.
  • the "% sequence homology" for a polynucleotide is identified by comparing two optimally arranged sequences with a comparison region, wherein part of the polynucleotide sequence in the comparison region is the reference sequence (addition or deletion) for the optimal alignment of the two sequences. It may include the addition or deletion (ie, gap) compared to).
  • Codon optimization refers to changing the codon of a polynucleotide encoding a protein to be used preferentially in a particular organism so that the encoded protein is expressed more efficiently in the organism.
  • the genetic code is degenerate in that most amino acids are represented by several codons, called “synonyms” or “synonyms” codons
  • codon usage by certain organisms is not arbitrary and biases to certain codon triplets. Such codon usage bias may be higher with respect to certain genes, genes of common function or ancestor origin, highly expressed proteins versus low copy number proteins, and collective protein coding regions of the organism genome.
  • the base sequence of SEQ ID NO: 1 of the present invention is a sequence optimized for the codon of E. coli so that the gene encoding the botulinum toxin-human epidermal growth factor fusion protein can be expressed in E. coli.
  • the present invention also provides a recombinant vector comprising the gene and a host cell transformed with the recombinant vector.
  • recombinant refers to a cell in which a cell replicates a heterologous nucleic acid, expresses the nucleic acid, or expresses a protein encoded by a peptide, a heterologous peptide, or a heterologous nucleic acid.
  • Recombinant cells can express genes or gene fragments that are not found in their natural form in either the sense or antisense form.
  • Recombinant cells can also express genes found in natural cells, but the genes are modified and reintroduced into cells by artificial means.
  • the gene encoding the botulinum toxin-human epidermal growth factor fusion protein may be inserted into a recombinant expression vector.
  • recombinant expression vector means a bacterial plasmid, phage, yeast plasmid, plant cell virus, mammalian cell virus, or other vector. In principle, any plasmid and vector can be used as long as it can replicate and stabilize in the host.
  • An important feature of the expression vector is that it has an origin of replication, a promoter, a marker gene and a translation control element.
  • Expression vectors comprising gene sequences encoding botulinum toxin-human epidermal growth factor fusion proteins and appropriate transcriptional / translational control signals can be constructed by methods well known to those of skill in the art. Such methods include in vitro recombinant DNA techniques, DNA synthesis techniques, in vivo recombinant techniques, and the like. The DNA sequence can be effectively linked to a suitable promoter in the expression vector to drive mRNA synthesis. Expression vectors may also include ribosomal binding sites and transcription terminators as translation initiation sites.
  • the gene encoding the botulinum toxin-human epidermal growth factor fusion protein synthesized in the pET22b vector (SEQ ID NO: 1) and the 5 'end ( Nde I restriction site) and 3' Botulinum toxin-human epithelial cells were prepared by fusing in-frame at the end ( Xho I restriction site) and expressing the genes effectively by lac promoter and lac I repressor. It is a vector characterized by producing a growth factor fusion protein.
  • a host cell capable of continuously cloning and expressing the vector of the present invention in a prokaryotic cell while being stable can be used as any host cell known in the art, for example, E. coli Rosetta, E. coli JM109, E. coli BL21. , Bacillus genus strains such as E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, and Salmonella typhimurium, Ceratia Enterobacteria and strains such as Marsesons and various Pseudomonas species.
  • yeast Sacharomyce cerevisiae
  • insect cells e.g., human cells (e.g., CHO cell line (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293) as host cells , HepG2, 3T3, RIN and MDCK cell lines) and plant cells and the like
  • human cells e.g., CHO cell line (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293
  • W138 e.g., BHK, COS-7, 293
  • HepG2, 3T3, RIN and MDCK cell lines e.g., CHO cell line (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293) as host cells , HepG2, 3T3, RIN and MDCK cell lines
  • plant cells and the like can be used.
  • the host cell transformed with the recombinant vector according to an embodiment of the present invention may be E. coli Rosetta2 (DE3) pLysS Escherichia coli, but is not limited thereto.
  • the method of carrying the vector of the present invention into a host cell includes a CaCl 2 method, one method (Hanahan, D., 1983 J. Mol. Biol. 166, 557-580) and electroporation when the host cell is a prokaryotic cell. It may be carried out by a method or the like.
  • the vector may be injected into the host cell by microinjection, calcium phosphate precipitation, electroporation, liposome-mediated transfection, DEAE-dextran treatment, gene bombardment, or the like. Can be.
  • the present invention further comprises overexpressing a gene encoding a botulinum toxin-human epidermal growth factor fusion protein by transforming the host cell with the recombinant vector, the botulinum toxin-human epidermal growth factor fusion protein in the host cell.
  • the host cell may be preferably E. coli , and more preferably E. coli Rosetta2 (DE3) pLysS E. coli, but is not limited thereto.
  • the present invention also provides a botulinum toxin-human epidermal growth factor fusion protein produced by the above method.
  • the present invention also provides a cosmetic composition for skin regeneration and wrinkle improvement comprising the botulinum toxin-human epidermal growth factor fusion protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 as an active ingredient.
  • the content of the botulinum toxin-human epidermal growth factor fusion protein in the cosmetic composition according to the embodiment of the present invention may be included in an amount of 0.000002 to 0.002% by weight based on the total weight of the cosmetic composition, but is not limited thereto.
  • the cosmetic composition of the present invention includes components conventionally used in cosmetic compositions in addition to the active ingredient, and include, for example, fatty substances, organic solvents, solubilizers, thickeners and gelling agents, softeners, antioxidants, suspending agents, stabilizers, foaming agents ( foaming agents), fragrances, surfactants, water, ionic or nonionic emulsifiers, fillers, metal ion sequestrants and chelating agents, preservatives, vitamins, blocking agents, wetting agents, essential oils, dyes, pigments, hydrophilic or lipophilic active agents , Conventional adjuvants such as lipid vesicles, and carriers.
  • fatty substances organic solvents, solubilizers, thickeners and gelling agents, softeners, antioxidants, suspending agents, stabilizers, foaming agents ( foaming agents), fragrances, surfactants, water, ionic or nonionic emulsifiers, fillers, metal ion sequestrants and chelating agents, pre
  • compositions of the present invention can be prepared in any formulation commonly prepared in the art, for example, solutions, suspensions, emulsions, pastes, gels, creams, lotions, powders, oils, powder foundations, emulsion foundations It may be formulated as a wax foundation, a spray, and the like, but is not limited thereto. More specifically, Skin, Skin Softener, Skin Toner, Astringent, Lotion, Milk Lotion, Moisture Lotion, Nutrition Lotion, Massage Cream, Nutrition Cream, Eye Cream, Moisture Cream, Hand Cream, Essence, Nutrition Essence, Pack, Cleansing It can be prepared in cosmetic formulations of foams, cleansing water, cleansing lotions, cleansing creams, body lotions, body cleansers, soaps and powders.
  • the carrier component is animal oil, vegetable oil, wax, paraffin, starch, tracant, cellulose derivative, polyethylene glycol, silicone, bentonite, silica, talc or zinc oxide. This can be used.
  • the formulation of the cosmetic composition of the present invention is a powder or a spray
  • lactose, talc, silica, aluminum hydroxide, calcium silicate or polyamide powder may be used as the carrier component, and in particular, in the case of a spray, additionally chlorofluoro hydro Propellant such as carbon, propane / butane or dimethyl ether.
  • a solvent, solubilizing agent or emulsifying agent is used as the carrier component, such as water, ethanol, isopropanol, ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl benzoate, propylene.
  • the formulation of the cosmetic composition of the present invention is a suspension
  • a liquid diluent such as water, ethanol or propylene glycol
  • suspending agents such as ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbitol ester and polyoxyethylene sorbitan ester as carrier components
  • Microcrystalline cellulose, aluminum metahydroxy, bentonite, agar or tracant and the like can be used.
  • Optimized genes encoding recombinant botulinum toxin-human epidermal growth factor fusion proteins, recombinant expression vectors, and transformed recombinant microorganisms were constructed by the following method.
  • BTAL botulinum toxin
  • hEGF human epidermal growth factor
  • Forward primer 1 (5'-) to synthesize a gene encoding a botulinum toxin-human epidermal growth factor fusion protein (SEQ ID NO: 2), which binds the human epidermal growth factor protein to the carboxyl terminus (C-terminus) of the botulinum toxin.
  • 1344 nucleotides (SEQ ID NO: 1) encoding botulinum toxin optimized for E. coli using AAGGAGATATA CATATG CCGTTCGTTAAC-3 ', SEQ ID NO: 3) and reverse primer 1 (5'-GTCTGAGTTTTTGTTGTAAC-3', SEQ ID NO: 4) 1-1344 base sequence) was synthesized, and E.
  • coli was prepared using forward primer 2 (5'-GTTACAACAAAAACTCAGAC-3 ', SEQ ID NO: 5) and reverse primer 2 (5'-GTG CTCGAG GCGCAACTCCC-3', SEQ ID NO: 6).
  • 159 nucleotides (SEQ ID NO: 1345-11503 nucleotide sequence) encoding a human epidermal growth factor protein optimized for DNA synthesis were synthesized.
  • the forward botulinum toxin was finally obtained by using the forward primer 1 (SEQ ID NO: 3) and the reverse primer 2 (SEQ ID NO: 6).
  • the gene fragment and the recombinant plasmid were cut and inserted with the same restriction enzymes (5 'terminal Nde I and 3' terminal Xho I) to prepare a recombinant plasmid (pET22b :: BTALEGF) shown in FIG.
  • the recombinant plasmid thus prepared was transformed into E. coli TOP10 to obtain a large amount of gene construct from the host microorganism.
  • the prepared recombinant plasmid was transformed into E. coli Rosetta2 (DE3) pLysS (Novagen, Germany) to prepare a recombinant microorganism for botulinum toxin-human epidermal growth factor fusion protein production.
  • the cells were further cultured for 3-4 hours, and the cells were recovered by centrifugation.
  • the cells were completely immersed in phosphate buffered saline (8 g sodium chloride, 0.2 g potassium chloride, 1.44 g sodium diphosphate (Na 2 HPO 4 ), 0.24 g potassium dihydrogen phosphate (KH 2 PO 4 ) / L, pH 7.4).
  • phosphate buffered saline 8 g sodium chloride, 0.2 g potassium chloride, 1.44 g sodium diphosphate (Na 2 HPO 4 ), 0.24 g potassium dihydrogen phosphate (KH 2 PO 4 ) / L, pH 7.4
  • the separated solutions were used as samples to confirm protein expression by 15% SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.
  • the expression of the botulinum toxin-human epithelial growth factor fusion protein was confirmed in the cell lysate induced by IPTG or lactose (FIG. 2A).
  • Botulinum toxin-human epidermal growth factor EGF detection kit (Nexgen Biotech, Korea) was used to confirm the presence or absence of human epidermal growth factor in the fusion protein. As a result, it was confirmed that human epidermal growth factor exists in the botulinum toxin-human epidermal growth factor fusion protein identified in FIG. 2A (FIG. 2B).
  • botulinum toxin-human epidermal growth factor fusion protein In order to isolate and purify the expressed botulinum toxin-human epidermal growth factor fusion protein, the aggregate body was solubilized with solubilization buffer solution (5M urea, pH 11) and then ultrafiltration method (0.45 ⁇ m) Refolding was performed using a filtration membrane and 1K ultrafiltration membrane), and finally, botulinum toxin-human epidermal growth factor fusion protein was separated using a storage buffer (PBS).
  • solubilization buffer solution 5M urea, pH 11
  • ultrafiltration method (0.45 ⁇ m) Refolding was performed using a filtration membrane and 1K ultrafiltration membrane
  • botulinum toxin-human epidermal growth factor fusion protein was separated using a storage buffer (PBS).
  • the activity of the botulinum toxin-human epithelial cell growth factor fusion protein was measured by selecting a sample in which the presence of the purified and purified botulinum toxin-human epithelial cell growth factor fusion protein was determined in Example 2.
  • Human dermal fibroblasts Human Dermal Fibroblasts adult, HDFa cells
  • fusion proteins 0, 0.02ppm, 0.2ppm concentration, respectively, and incubated at 37 °C for 3 days. After that, the growth of dermal fibroblasts was confirmed by crystal violet staining.
  • DPPH (1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl) analysis was performed to determine the antioxidant efficacy of the botulinum toxin-human epidermal growth factor fusion protein.
  • the reagent is present as a relatively stable free radical and is one of the in vitro methods used primarily to confirm free radical scavenging action.
  • L-Ascorbic acid was used as a positive control for DPPH analysis.
  • L-ascorbic acid, botulinum toxin-human epidermal growth factor fusion protein, and human epidermal growth factor protein were prepared at a concentration of 1 ⁇ M, respectively, and DPPH was prepared to have a final concentration of 200 ⁇ M.
  • Each protein and DPPH were mixed 1: 1 and left at 37 ° C. for 30 minutes. Thereafter, 520 nm absorbance was measured by an ELISA reader. Free radical scavenging ability (%) was calculated by the following equation 1, the results are shown in FIG.
  • the botulinum toxin-human epidermal growth factor fusion protein showed 1.5 times higher free radical scavenging ability than the L-ascorbic acid control group, and about 2.5 times as compared to the human epidermal growth factor protein that did not fuse the botulinum toxin. Showed a high free radical scavenging ability (Fig. 4). Therefore, the fusion protein of the present invention was confirmed to have a higher antioxidant effect by the botulinum toxin, which means that it can have an anti-aging effect according to the antioxidant effect of the fusion protein.
  • Botulinum toxin-human epidermal growth factor fusion protein was added as an active ingredient, and the skin of Preparation Example 1 was prepared using the ingredients and contents shown in Table 1 below.
  • the skin of Comparative Example 1 was prepared with the ingredients and contents shown in Table 1 below.
  • Botulinum toxin-human epidermal growth factor fusion protein was added as an active ingredient, and the essence of Preparation Example 2 was prepared using the ingredients and contents shown in Table 3 below. In addition, without adding the botulinum toxin-human epidermal growth factor fusion protein as an active ingredient, the essence of Comparative Example 2 was prepared with the ingredients and contents shown in Table 3 below.
  • Botulinum toxin-human epidermal growth factor fusion protein was added as an active ingredient, and the lotion of Preparation Example 3 was prepared using the ingredients and contents shown in Table 5 below. In addition, without the addition of the botulinum toxin-human epidermal growth factor fusion protein as an active ingredient, the lotion of Comparative Example 3 was prepared with the ingredients and contents shown in Table 5.
  • Botulinum toxin-human epidermal growth factor fusion protein was added as an active ingredient, and the cream of Preparation Example 4 was prepared using the ingredients and contents shown in Table 7 below.
  • the cream of Comparative Example 4 was prepared with the ingredients and contents shown in Table 7 below.
  • Cream composition ingredient Preparation Example 4 (wt%) Comparative Example 4 (weight%)
  • Botulinum toxin-human epidermal growth factor fusion protein 0.001 - Amino acid stock 0.05 0.05 Mineral mixtures 0.0007 0.0007 Glycerol 2 2
  • Mineral oil 10 10
  • Olive oil wax 3 3
  • Cetyl alcohol 2 Purified water Remaining amount Remaining amount

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Gerontology & Geriatric Medicine (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Cosmetics (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 피부 세포 증식 및 항산화 효과가 증가한 보툴리눔 톡신-인간상피세포성장인자 융합단백질, 대장균 코돈 최적화된 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 보툴리눔 톡신-인간상피세포성장인자 융합단백질을 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포, 상기 재조합 벡터로 숙주세포를 형질전환시켜 보툴리눔 톡신-인간상피세포성장인자 융합단백질을 생산하는 방법 및 보툴리눔 톡신-인간상피세포성장인자 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 피부 주름 개선 및 피부 탄력 유지용 화장료 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 화장료 조성물은 피부 주름 개선 및 피부 재생 효과를 증진시킬 수 있는 효과가 있으므로, 추후 기능성 화장품 분야 또는 미용성형 분야에 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

Description

피부 세포 증식 및 항산화 효과가 증가한 보툴리눔 톡신-인간상피세포성장인자 융합단백질 및 이를 유효성분으로 함유하는 피부 재생 및 주름 개선용 화장료 조성물
본 발명은 피부 세포 증식 및 항산화 효과가 증가한 보툴리눔 톡신-인간상피세포성장인자 융합단백질 및 이를 유효성분으로 함유하는 피부 재생 및 주름 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.
현대 화장품 산업의 핵심은 화장품 원료의 고갈에 따른 신소재 원료 개발과 적용에 있다. 현재 화장품 산업 전반에 걸쳐 신소재 개발을 위한 기술과 고기능성 화장품의 개발 등이 지속적으로 이루어지고 있는 실정이다. 특히 인간 상피세포성장인자(Human Epidermal Growth Factor, hEGF)는 주름 개선, 미백 등 피부 재생 효과가 뛰어나 소비자의 주목을 받고 있는 소재 중 하나이다.
사람의 피부는 성년(~25세) 이후 신진대사나 세포의 재생 능력이 저하됨에 따라 색소 침착 및 주름 형성 등이 유발되며 피부 노화 현상이 진행된다. 피부 재생 효과가 우수한 인간 상피세포성장인자는 피부 재생을 위한 의약품 치료제로서 사용되어 왔으나, 피부의 저하된 재생능력을 돕고 피부 세포의 새로운 세포 성장을 촉진할 수 있는 기능을 가진 노화 방지용 기능성 화장품의 원료로 사용하기 위한 연구가 집중되어 왔다.
인간 상피세포성장인자(Human epidermal growth factor, hEGF)는 세포 표면에 존재하는 상피세포성장인자 수용체와 결합하여 상피세포성장인자 수용체의 이합체화 반응(dimerization)을 유도한다. 이합체의 상피세포성장인자 수용체는 수용체 내에 존재하는 타이로신 키나아제를 활성화시켜 세포 내 신호전달 시스템을 유도하게 되고, 이러한 과정을 통해 세포 내에서는 해당 작용(glycolysis)과 단백질 합성이 촉진되어 최종적으로 세포의 성장이 진행된다.
피부 재생의 중요한 역할을 하는 상피세포성장인자는 노화가 진행될수록 감소되는데, 상피세포성장인자의 감소는 피부 세포 증식 및 이동의 감소를 유발하여 피부의 노화, 주름 증가, 탄력 감소 등의 현상을 나타낸다.
클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum)으로부터 처음 발견된 보툴리눔 톡신(Botulinum toxin)은 근육 신경을 마비시키는 효과를 통해 의료용으로 처음 사용되었다. 특히 극소량의 보툴리눔 톡신을 한정된 부위에 선택적으로 사용시 근육 및 신경질환 등의 증상을 치료할 수 있어 미국의 제약회사 엘러간(Allergan Inc.)사에서 저농도의 보툴리눔 톡신 A를 보톡스(Botox)라는 상품명으로 판매하고 있으며, 현재 국내에는 보톡스, 보툴렉스(국내산), 메디톡신(국내산), 디스포트(유럽산), BTXA(중국산) 등 모두 4종이 판매되고 있다. 1990년대에 보톡스가 주름제거의 효과가 있는 것이 알려지면서 현재는 미용 성형 분야에서 주름제거 목적으로 전 세계적으로 널리 사용되고 있다.
2002년 미국 식품 의약국(U.S. Food and Drug Administration, FDA)은 보톡스를 미간 곡선 라인 치료제로 승인하였으며, 화장용 치료제로 현재까지 가장 각광받고 있다. 화장품 산업에서 주름 개선 치료제로 가장 인기가 있는 보툴리눔 톡신은 주사 요법을 사용하고 있으며, 그 효과가 3~6개월 내외라는 점과 매우 고가라는 최대 단점을 가지고 있다.
본 발명에서는 미용 성형 분야에서 주름제거 효과가 우수한 보툴리눔 톡신의 기능을 보다 효과적으로 지속하기 위해, 특히 피부재생효과를 부각시키기 위한 새로운 단백질 개발을 진행한 결과, 피부 재생 효과가 우수한 인간상피세포성장인자를 결합하여 새로운 이중 기능성 융합단백질이 주름 개선 및 피부재생 촉진을 극대화시킬 수 있음을 확인하였다.
한편, 한국공개특허 제2015-0144735호에는 '필러와 보틀리눔 독소를 포함하는 피부 주름, 노화 개선 또는 신경근육 관련 질환 치료용 조성물'이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2015-0056022호에는 '상피세포 성장인자의 융합단백질을 포함하는 피부개선용 화장료 조성물'이 개시되어 있으나, 본 발명의 세포 증식 및 항산화 효과가 증가한 보툴리눔 톡신-인간상피세포성장인자 융합단백질 및 이를 유효성분으로 함유하는 피부 재생 및 주름 개선용 화장료 조성물에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 보툴리눔 톡신 단백질에 인간상피세포성장인자를 융합하여 신규의 세포 증식 및 항산화 효과가 증가한 보툴리눔 톡신-인간상피세포성장인자 융합단백질을 생산하였다. 상기 보툴리눔 톡신-인간상피세포성장인자 융합단백질은 피부 세포의 증식 및 항산화 효과가 인간상피세포성장인자보다도 매우 우수함을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 피부 세포 증식 및 항산화 효과가 증가한 보툴리눔 톡신-인간상피세포성장인자 융합단백질을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 융합단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 숙주세포를 형질전환시켜 보툴리눔 톡신-인간상피세포성장인자 융합단백질을 코딩하는 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는, 숙주세포에서 보툴리눔 톡신-인간상피세포성장인자 융합단백질의 생산 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 생산된 보툴리눔 톡신-인간상피세포성장인자 융합단백질을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 보툴리눔 톡신-인간상피세포성장인자 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 피부 재생 및 주름 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 대장균 코돈 최적화된 보툴리눔 톡신-인간상피세포성장인자 융합단백질 코딩 유전자를 이용한 대장균에서의 생산 방법은 대장균 내에서 단백질이 응집체 형태로 발현되어 생산공정을 간소화하였으며, 단백질의 대량생산을 가능하게 하였고, 상기 방법에 의해 생산된 보툴리눔 톡신-인간상피세포성장인자 융합단백질은 피부 주름 개선 및 피부 재생 기능이 우수하여, 기능성 화장료 원료로 유용하게 사용될 수 있을 것이다.
도 1은 보툴리눔 톡신-인간상피세포성장인자 융합단백질 암호 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드(pET22b::BTALEGF)의 제작 과정 및 대장균으로의 형질전환에 관한 모식도이다.
도 2는 대장균에서 보툴리눔 톡신-인간상피세포성장인자 융합단백질(BTAL-EGF)의 발현을 SDS-PAGE 겔에 전기영동하여 확인한 결과(A)와 융합단백질 내 인간 상피세포성장인자 함유 여부를 알아보기 위해 EGF 검출 키트를 사용하여 EGF 도메인을 확인한 결과(B)이다. M, 크기 마커; 1, 발현 유도(induction) 전 세포 조용해물(crude lysate); 2, 발현 유도 후 세포 조용해물; C, EGF 대조군; T, 테스트 시료(융합단백질).
도 3은 보툴리눔 톡신-인간상피세포성장인자 융합단백질을 피부섬유아세포에 처리한 후, 피부섬유아세포의 세포 증식 효과를 크리스탈 바이올렛 염색을 통해 확인한 사진이다.
도 4는 보툴리눔 톡신-인간상피세포성장인자 융합단백질의 항산화 효능을 DPPH 실험을 통해 확인한 결과이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 피부 세포 증식 및 항산화 효과가 증가한 보툴리눔 톡신-인간상피세포성장인자 융합단백질을 제공한다.
본 발명에 따른 보툴리눔 톡신-인간상피세포성장인자 융합단백질의 범위는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2의 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 활성"이란 피부 주름 개선 및 피부 재생 활성을 의미한다. 본 발명은 또한 보툴리눔 톡신-인간상피세포성장인자 융합단백질의 단편, 유도체 및 유사체 (analogues)를 포함한다. 본원에 사용된, 용어 "단편", "유도체" 및 "유사체"는 본 발명의 보툴리눔 톡신-인간상피세포성장인자 융합단백질과 실질적으로 같은 생물학적 기능 또는 활성을 보유하는 폴리펩타이드를 말한다.
본 발명의 보툴리눔 톡신-인간상피세포성장인자 융합단백질은 바람직하게는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지며, 상기 아미노산 서열 중 1번째 내지 448번째 아미노산 서열로 이루어진 보툴리눔 톡신 단백질과 449번째 내지 501번째 아미노산 서열로 이루어진 인간상피세포성장인자 단백질을 융합시켜 제작된 신규 단백질일 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 피부 세포 증식 및 항산화 효과가 증가한 보툴리눔 톡신-인간상피세포성장인자 융합단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다. 상기 유전자는 대장균 코돈 최적화된 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 상기 피부 세포 증식 및 항산화 효과가 증가한 보툴리눔 톡신-인간상피세포성장인자 융합단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로는, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
"코돈 최적화"는 코딩된 단백질이 유기체에서 보다 효율적으로 발현되도록 특정 유기체에서 우선적으로 사용되는 것으로 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 코돈을 변화시키는 것을 의미한다. 대부분의 아미노산이 "동의어" 또는 "동의" 코돈이라고 하는, 몇몇 코돈에 의해 표시된다는 점에서, 유전자 코드가 축퇴적이지만, 특정 유기체에 의한 코돈 용법은 임의적이지 않고 특정 코돈 트리플렛에 편향적이다. 이러한 코돈 용법 편향성은 소정 유전자, 공통 기능 또는 조상 기원의 유전자, 고도로 발현되는 단백질 대 낮은 복제수 단백질, 및 유기체 게놈의 집합적 단백질 코딩 영역과 관련하여 더 높을 수 있다. 본 발명의 상기 서열번호 1의 염기서열은 보툴리눔 톡신-인간상피세포성장인자 융합단백질을 코딩하는 유전자가 대장균 내에서 발현될 수 있도록 대장균의 코돈에 최적화된 서열이다.
본 발명은 또한, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.
용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
본 발명에서, 상기 보툴리눔 톡신-인간상피세포성장인자 융합단백질을 코딩하는 유전자는 재조합 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다. 용어 "재조합 발현 벡터"는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스, 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소(translation control element)를 가지는 것이다.
보툴리눔 톡신-인간상피세포성장인자 융합단백질을 코딩하는 유전자 서열 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보좀 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 재조합 벡터는, pET22b 벡터에 합성한 보툴리눔 톡신-인간상피세포성장인자 융합단백질을 코딩하는 유전자(서열번호 1)를 5' 말단(NdeI 제한효소 사이트)과 3' 말단 (XhoI 제한효소 사이트)에 인프레임(in frame)으로 융합하여 제조하였고, 상기 유전자를 lac 프로모터(lac promoter)와 lacI 리프레서(lacI repressor)에 의하여 효과적으로 발현시켜 보툴리눔 톡신-인간상피세포성장인자 융합단백질을 제조하는 것을 특징으로 하는 벡터이다.
본 발명의 벡터를 원핵세포에 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli Rosetta, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.
또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포(예컨대, CHO 세포주(Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포는 E. coli Rosetta2(DE3) pLysS 대장균일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법, 하나한 방법(Hanahan, D., 1983 J. Mol. Biol. 166, 557-580) 및 전기천공 방법 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 재조합 벡터로 숙주세포를 형질전환시켜 보툴리눔 톡신-인간상피세포성장인자 융합단백질을 코딩하는 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는, 숙주세포에서 보툴리눔 톡신-인간상피세포성장인자 융합단백질의 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 숙주세포는 바람직하게는 대장균일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 E. coli Rosetta2(DE3) pLysS 대장균일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 생산된 보툴리눔 톡신-인간상피세포성장인자 융합단백질을 제공한다.
본 발명은 또한, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 보툴리눔 톡신-인간상피세포성장인자 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 피부 재생 및 주름 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 화장료 조성물에서 상기 보툴리눔 톡신-인간상피세포성장인자 융합단백질의 함량은 화장료 조성물 총 중량 대비 0.000002 내지 0.002 중량%로 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 화장료 조성물에는 상기 유효성분 이외에 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온 봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭과 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.
본 발명의 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 스킨, 스킨 소프트너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐로션, 영양로션, 마사지크림, 영양크림, 아이 크림, 모이스쳐 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 클렌징폼, 클렌징 워터, 클렌징 로션, 클렌징 크림, 바디로션, 바디클렌져, 비누 및 파우더의 화장품 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로 히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 보툴리눔 톡신 - 인간상피세포성장인자 융합단백질의 생산을 위한 재조합 발현벡터 및 형질전환 재조합 미생물의 제조
보툴리눔 톡신-인간상피세포성장인자 융합단백질을 코딩하는 최적화된 유전자, 재조합 발현벡터 및 형질전환 재조합 미생물은 다음의 방법으로 제작하였다.
보툴리눔 톡신(Botulinum toxin, 이하 BTAL) 단백질과 파트너 단백질로 사용되는 인간상피세포성장인자 단백질(Human epidermal growth factor, 이하 hEGF)을 코딩하는 유전자를 주형으로 사용하여 숙주 미생물 내에서 발현될 있도록 최적화된, 501개의 아미노산으로 이루어진 보툴리눔 톡신-인간상피세포성장인자 융합단백질을 코딩하는 유전자(서열번호 1) 단편을 제작 및 합성하였다.
보툴리눔 톡신의 카복실 말단(C-말단)에 인간상피세포성장인자 단백질이 결합된 보툴리눔 톡신-인간상피세포성장인자 융합단백질(서열번호 2)을 코딩하는 유전자를 합성하기 위해 정방향 프라이머1(5'-AAGGAGATATACATATGCCGTTCGTTAAC-3', 서열번호 3) 및 역방향 프라이머1(5'-GTCTGAGTTTTTGTTGTAAC-3', 서열번호 4)을 이용하여 대장균에 적합하도록 최적화된 보툴리눔 톡신을 코딩하는 1344개의 뉴클레오티드(서열번호 1의 1~1344번째 염기 서열)를 합성하였으며, 정방향 프라이머2(5'-GTTACAACAAAAACTCAGAC-3', 서열번호 5)와 역방향 프라이머2(5'-GTGCTCGAGGCGCAACTCCC-3', 서열번호 6)를 사용하여 대장균에 적합하도록 최적화된 인간상피세포성장인자 단백질을 코딩하는 159개의 뉴클레오티드(서열번호 1의 1345~1503번째 염기 서열)를 합성하였다. 상기의 방법으로 합성한 각각의 보툴리눔 톡신 단백질과 인간상피세포성장인자를 코딩하는 유전자를 주형으로 하여 정방향 프라이머1(서열번호 3)과 역방향 프라이머2(서열번호 6)를 사용하여 최종적으로 보툴리눔 톡신의 카복실 말단에 인간상피세포성장인자 단백질이 결합된 융합단백질을 코딩하는 1503개의 뉴클레오티드로 구성된 유전자를 중합효소 연쇄반응(PCR)을 통해 합성하였다.
상기 유전자 단편과 재조합 플라스미드를 동일한 제한효소(5' 말단 NdeI 및 3' 말단 XhoI)로 절단하고 삽입하여, 도 1에 나타낸 재조합 플라스미드(pET22b::BTALEGF)를 제작하였다. 제조된 재조합 플라스미드를 E. coli TOP10에 형질전환시켜서, 숙주 미생물로부터 유전자 컨스트럭트를 대량 얻었다.
그 후, 제조된 재조합 플라스미드를 E. coli Rosetta2(DE3) pLysS(Novagen, 독일)에 형질전환시켜서, 보툴리눔 톡신-인간상피세포성장인자 융합단백질 생산을 위한 재조합 미생물을 제작하였다.
실시예 2. 보툴리눔 톡신 - 인간상피세포성장인자 융합단백질의 발현 유도, 분리 및 정제
실시예 1에서 제조한 E. coli Rosetta2(DE3) pLysS를 각각 1ℓ LB 배지(10% 트립토판, 10% 염화나트륨 및 5% 효모 추출물) 혹은 BSB 배지(1% 트립토판, 0.5% 효모 추출물, 1% 글루코스 및 0.1% HEPES(pH 7.0), ㈜넥스젠바이오텍)를 사용하여 회분 배양(batch culture) 시 OD600=0.6~0.8이 될 때까지 또는 20ℓ 발효기를 사용하여 연속 배양 시에는 OD600=15~20이 될 때까지 배양하였다. 이 후, 세포 배양 배지에 각각 최종 1~5mM IPTG 또는 2% 락토오즈를 가하여 재조합 대장균의 유전자 발현을 유도하였다. 유전자 발현 유도 후 3~4시간 더 배양하고 세포들을 원심분리방법으로 회수하였다. 이 세포들을 완충용액(Phosphate buffered saline, 8g 염화나트륨, 0.2g 염화칼륨, 1.44g 제2인산나트륨(Na2HPO4), 0.24g 인산이수소칼륨(KH2PO4)/ℓ, pH 7.4)에 완전히 현탁시킨 후, 초음파 파쇄기를 사용하여 세포를 파괴하고 세포 내 단백질을 포함하는 용액을 분리하였다.
상기 분리된 용액들을 시료로 하여 15% SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동으로 단백질 발현 여부를 확인하였다. 그 결과, IPTG 또는 락토오즈를 통해 발현 유도를 한 세포 조용해물에서 보툴리눔 톡신-인간상피세포성장인자 융합단백질의 발현을 확인할 수 있었다(도 2A).
보툴리눔 톡신-인간상피세포성장인자 융합단백질 내의 인간상피세포성장인자의 유무를 확인하기 위하여 EGF 검출 키트(넥스젠바이오텍, 한국)를 사용하였다. 그 결과 도 2A에서 확인된 보툴리눔 톡신-인간상피세포성장인자 융합단백질 내에 인간상피세포성장인자가 존재함을 확인할 수 있었다 (도 2B).
발현 확인된 보툴리눔 톡신-인간상피세포성장인자 융합단백질을 분리, 정제하기 위해서 응집체(inclusion body)를 가용화 완충용액(5M 요소(urea), pH 11)으로 가용화한 후 초미세 여과방법(0.45㎛ 정밀여과막과 1K 초미세여과막)을 이용하여 재접힘(refolding) 과정을 수행하였으며, 저장용 완충용액(PBS)을 사용하여 최종적으로 보툴리눔 톡신-인간상피세포성장인자 융합단백질을 분리하였다.
실시예 3. 보툴리눔 톡신 - 인간상피세포성장인자 융합단백질의 활성 측정- 피부섬유아세포의 세포 증식 효과
실시예 2에서 분리, 정제된 보툴리눔 톡신-인간상피세포성장인자 융합단백질의 존재가 확인된 시료를 택하여 보툴리눔 톡신-인간상피세포성장인자 융합단백질의 활성을 측정하였다.
피부섬유아세포(Human Dermal Fibroblasts adult, HDFa cell)를 배양한 후 세포에 각각 0, 0.02ppm, 0.2ppm 농도의 융합단백질을 처리한 후 3일 동안 37℃에서 배양하였다. 이 후 크리스탈 바이올렛 염색법으로 피부섬유아세포의 증식 여부를 확인하였다.
그 결과 보툴리눔 톡신-인간상피세포성장인자 융합단백질의 농도(0.02~0.2 ppm)를 증가시킬수록 무처리 대조군(0ppm)과 비교하여 피부섬유아세포의 증식 효과가 우수함을 확인할 수 있었다(도 3). 또한, 보툴리눔 톡신 단백질을 융합하지 않은 인간 상피세포성장인자 단백질 단독 처리군에 비해서 융합단백질의 세포 증식 효과가 더 높게 관찰되었다. 상기 결과를 통해, 보툴리눔 톡신과 인간상피세포성장인자가 융합된 단백질의 상승효과를 확인하였다.
실시예 4. 보툴리눔 톡신 - 인간상피세포성장인자 융합단백질의 항산화 활성 측정
보툴리눔 톡신-인간상피세포성장인자 융합단백질의 항산화 효능을 측정하기 위해 자유라디칼 소거 효과 측정 방법 중 하나인 DPPH(1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl) 분석을 수행하였다. 상기 시약은 비교적 안정한 자유라디칼로 존재하여 자유라디칼 소거 작용을 확인하는데 일차적으로 사용되는 시험관적 방법 중 하나이다.
DPPH 분석 시 양성 대조군으로 L-아스코르브산(L-Ascorbic acid)을 사용하였다. 실험 방법은 L-아스코르브산, 보툴리눔 톡신-인간상피세포성장인자 융합단백질 및 인간 상피세포성장인자 단백질을 각각 1μM 농도로 준비하였으며, DPPH는 최종 농도가 200μM이 되도록 준비하였다. 상기 각 단백질과 DPPH를 1:1로 혼합한 후 37℃에서 30분 방치하였다. 이 후 ELISA 리더로 520nm 흡광도를 측정하였다. 자유라디칼 소거능(%)은 하기 식 1로 계산하였으며, 그 결과는 도 4에 나타내었다.
자유라디칼 소거능(%) = 100-((B/A)*100) (식 1)
[A: 시료를 처리하지 않은 대조군의 흡광도
B: 시료를 처리한 대조군 또는 실험군의 흡광도]
그 결과, 보툴리눔 톡신-인간상피세포성장인자 융합단백질은 L-아스코르브산 대조군보다 약 1.5배의 높은 자유라디칼 소거능을 보였으며, 보툴리눔 톡신을 융합하지 않은 인간 상피세포성장인자 단백질과 비교해도 약 2.5배의 높은 자유라디칼 소거능을 보여주었다(도 4). 따라서, 본 발명의 융합단백질은 보툴리눔 톡신에 의해 더욱 높은 항산화 효능을 갖게 된 것을 확인할 수 있었고, 이는 상기 융합단백질의 항산화 효능에 따른 피부 노화 방지 효과를 가질 수 있다는 것을 의미하였다.
실험예 1. 피부 주름 개선, 피부 탄력 유지 효과 및 피부 자극 관능시험
상기 실시예 2에서 분리, 정제한 보툴리눔 톡신-인간상피세포성장인자 융합단백질을 유효성분으로 하여 제조예 1, 2, 3 및 4와 비교예 1, 2, 3 및 4의 화장료 조성물을 제조하여 관능시험을 실시하였다(표 1, 3, 5 및 7 참조).
구체적으로는, 주름 개선 사항을 확인하기 위해 30세 이상 60세 미만의 여성과 남성 총 30명(30대 10명, 40대 10명, 5~60대 10명)을 대상으로 하여, 주름이 많이 분포하는 안면 왼쪽 눈가 부분에는 비교예(대조군)를, 안면 오른쪽 눈가 부분에는 제조예(시험군)를 1일 1회 2주간 지속적으로 사용하게 하였다. 평가는 눈 주위 부분의 주름 펴짐 정도를 평가하였다. 피부 자극 항목에 대해서도 동일한 방법으로 피부의 가려움, 따가움 및 홍반 현상 등에 관하여 관능시험을 실시하였다. 평가 기준은 매우 우수(5점), 우수(4점), 보통(3점), 나쁨(2점), 매우 나쁨(1점)의 오점법 기준에 의거하여 수행하였다. 단, 관능시험 결과에서 정수로 표시하기 힘든 경우에는 소수로 표시하였다. 그 결과는 하기 표 2, 4, 6 및 8에 나타내었다.
<제조예 1 및 비교예 1>
보툴리눔 톡신-인간상피세포성장인자 융합단백질을 유효성분으로 첨가하고, 하기 표 1에 기재된 성분과 함량으로 제조예 1의 스킨을 제조하였다. 또한, 보툴리눔 톡신-인간상피세포성장인자 융합단백질을 유효성분으로 첨가하지 않고, 하기 표 1에 기재된 성분과 함량으로 비교예 1의 스킨을 제조하였다.
스킨 조성물
성분 제조예 1(중량 %) 비교예 1 (중량 %)
보툴리눔 톡신-인간상피세포성장인자 융합단백질 0.002 -
아미노산 스탁 0.1 0.1
미네랄 혼합물 0.0007 0.0007
정제수 잔량 잔량
상기 제조예 1 및 비교예1의 관능시험 결과는 하기 표 2와 같다.
Figure PCTKR2016007985-appb-T000001
< 제조예 2 및 비교예 2>
보툴리눔 톡신-인간상피세포성장인자 융합단백질을 유효성분으로 첨가하고, 하기 표 3에 기재된 성분과 함량으로 제조예 2의 에센스를 제조하였다. 또한, 보툴리눔 톡신-인간상피세포성장인자 융합단백질을 유효성분으로 첨가하지 않고, 하기 표 3에 기재된 성분과 함량으로 비교예 2의 에센스를 제조하였다.
에센스 조성물
성분 제조예 2 (중량 %) 비교예 2 (중량 %)
보툴리눔 톡신-인간상피세포성장인자 융합단백질 0.002 -
아미노산 스탁 0.05 0.05
미네랄 혼합물 0.0007 0.0007
글리세롤 5 5
1,3-부틸렌글리콜 10 10
카보폴 940 0.3 0.3
정제수 잔량 잔량
상기 제조예 2 및 비교예 2의 관능시험 결과는 하기 표 4와 같다.
Figure PCTKR2016007985-appb-T000002
<제조예 3 및 비교예 3>
보툴리눔 톡신-인간상피세포성장인자 융합단백질을 유효성분으로 첨가하고, 하기 표 5에 기재된 성분과 함량으로 제조예 3의 로션을 제조하였다. 또한, 보툴리눔 톡신-인간상피세포성장인자 융합단백질을 유효성분으로 첨가하지 않고, 하기 표 5에 기재된 성분과 함량으로 비교예 3의 로션을 제조하였다.
로션 조성물
성분 제조예 3 (중량 %) 비교예 3 (중량 %)
보툴리눔 톡신-인간상피세포성장인자 융합단백질 0.001 -
아미노산 스탁 0.05 0.05
미네랄 혼합물 0.0007 0.0007
글리세롤 3 3
1,3-부틸렌글리콜 10 10
미네랄 오일 5 5
세틸알코올 2 2
잔탄검 0.5 0.5
정제수 잔량 잔량
상기 제조예 3 및 비교예 3의 피부 주름 개선 효과 및 피부자극 관능시험 결과는 하기 표 6과 같다.
Figure PCTKR2016007985-appb-T000003
<제조예 4 및 비교예 4>
보툴리눔 톡신-인간상피세포성장인자 융합단백질을 유효성분으로 첨가하고, 하기 표 7에 기재된 성분과 함량으로 제조예 4의 크림을 제조하였다. 또한, 보툴리눔 톡신-인간상피세포성장인자 융합단백질을 유효성분으로 첨가하지 않고, 하기 표 7에 기재된 성분과 함량으로 비교예 4의 크림을 제조하였다.
크림 조성물
성분 제조예 4 (중량 %) 비교예 4 (중량 %)
보툴리눔 톡신-인간상피세포성장인자 융합단백질 0.001 -
아미노산 스탁 0.05 0.05
미네랄 혼합물 0.0007 0.0007
글리세롤 2 2
미네랄 오일 10 10
올리브 유화 왁스 3 3
세틸알코올 2 2
정제수 잔량 잔량
상기 제조예 4 및 비교예 4의 관능시험 결과는 하기 표 8과 같다.
Figure PCTKR2016007985-appb-T000004
상기의 관능시험 결과들을 통해, 본 발명의 보툴리눔 톡신-인간상피세포성장인자 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 제조예 1, 2, 3 및 4가 해당 비교예에 비해 피부 주름 개선 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

Claims (9)

  1. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 피부 세포 증식 및 항산화 효과가 증가한 보툴리눔 톡신-인간상피세포성장인자 융합단백질.
  2. 제1항의 피부 세포 증식 및 항산화 효과가 증가한 보툴리눔 톡신-인간상피세포성장인자 융합단백질을 코딩하는 유전자.
  3. 제2항에 있어서, 상기 유전자는 대장균 코돈 최적화된 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 유전자.
  4. 제2항 또는 제3항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
  5. 제4항의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포.
  6. 제4항의 재조합 벡터로 숙주세포를 형질전환시켜 보툴리눔 톡신-인간상피세포성장인자 융합단백질을 코딩하는 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는, 숙주세포에서 보툴리눔 톡신-인간상피세포성장인자 융합단백질의 생산 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 숙주세포는 대장균인 것을 특징으로 하는 보툴리눔 톡신-인간상피세포성장인자 융합단백질의 생산 방법.
  8. 제6항의 방법에 의해 생산된 보툴리눔 톡신-인간상피세포성장인자 융합단백질.
  9. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 피부 세포 증식 및 항산화 효과가 증가한 보툴리눔 톡신-인간상피세포성장인자 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 피부 재생 및 주름 개선용 화장료 조성물.
PCT/KR2016/007985 2016-06-08 2016-07-22 피부 세포 증식 및 항산화 효과가 증가한 보툴리눔 톡신-인간상피세포성장인자 융합단백질 및 이를 유효성분으로 함유하는 피부 재생 및 주름 개선용 화장료 조성물 WO2017213287A1 (ko)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP16904720.6A EP3299385B1 (en) 2016-06-08 2016-07-22 Botulinum toxin-human epidermal growth factor fusion protein with increased skin cell proliferation and anti-oxidation effect, and cosmetic composition containing the same as effective component
ES16904720T ES2760547T3 (es) 2016-06-08 2016-07-22 Proteína de fusión de la toxina botulínica y el factor de crecimiento epidérmico humano con aumento de la proliferación de las células cutáneas y efecto antioxidante, y composición cosmética que contiene la misma como componente eficaz
US15/522,160 US10266817B2 (en) 2016-06-08 2016-07-22 Botulinum toxin-human epidermal growth factor fusion protein with increased skin cell proliferation and anti-oxidation effect and cosmetic composition for regenerating skin and improving skin wrinkle comprising the same as effective component
CN201680035335.4A CN108350042A (zh) 2016-06-08 2016-07-22 皮肤细胞增殖及抗氧化效果得到增加的肉毒杆菌毒素-人表皮细胞生长因子融合蛋白及含有其作为有效成分的用于皮肤再生及改善皱纹的化妆料组合物
JP2017562980A JP6592112B2 (ja) 2016-06-08 2016-07-22 皮膚細胞の増殖及び抗酸化効果の増大したボツリヌス毒素−ヒト上皮細胞成長因子の融合タンパク質及びこれを有効成分として含む皮膚再生及びしわ改善のための化粧料組成物

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2016-0071284 2016-06-08
KR1020160071284A KR101636846B1 (ko) 2016-06-08 2016-06-08 피부 세포 증식 및 항산화 효과가 증가한 보툴리눔 톡신-인간상피세포성장인자 융합단백질 및 이를 유효성분으로 함유하는 피부 재생 및 주름 개선용 화장료 조성물

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2017213287A1 true WO2017213287A1 (ko) 2017-12-14

Family

ID=56500037

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2016/007985 WO2017213287A1 (ko) 2016-06-08 2016-07-22 피부 세포 증식 및 항산화 효과가 증가한 보툴리눔 톡신-인간상피세포성장인자 융합단백질 및 이를 유효성분으로 함유하는 피부 재생 및 주름 개선용 화장료 조성물

Country Status (7)

Country Link
US (1) US10266817B2 (ko)
EP (1) EP3299385B1 (ko)
JP (1) JP6592112B2 (ko)
KR (1) KR101636846B1 (ko)
CN (1) CN108350042A (ko)
ES (1) ES2760547T3 (ko)
WO (1) WO2017213287A1 (ko)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101678392B1 (ko) * 2016-09-30 2016-11-22 (주)넥스젠바이오텍 항산화 기능 및 피부 세포 증식 효과가 증가된 부동화 단백질 및 인간 상피세포성장인자를 포함하는 융합단백질 및 이를 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물
KR101776013B1 (ko) * 2017-05-26 2017-09-07 (주)넥스젠바이오텍 항산화 활성 및 피부 세포 증식 효과가 증가한 열 충격 단백질 10과 브라제인 단백질의 융합단백질 및 이를 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물
KR102010404B1 (ko) 2018-06-04 2019-08-13 주식회사 익스플즌 피부 재생 효과를 갖는 화장료 조성물 및 이를 이용한 화장품
CN112399971A (zh) * 2018-06-14 2021-02-23 爱维斯健有限公司 与细胞穿透肽结合的融合蛋白及包含融合蛋白、或细胞穿透肽和上皮细胞生长因子作为活性成分的组合物
KR102174197B1 (ko) * 2019-06-12 2020-11-04 주식회사 앤씨비아이티 생산성이 향상된 비독성 프로테아제
CN111286511B (zh) * 2019-12-20 2022-11-25 鲁东大学 一种生产人表皮生长因子与灵芝免疫调节蛋白方法和应用
CN116239667B (zh) * 2022-07-21 2024-05-10 西南大学 具有促细胞增殖活性的ehEGF重组蛋白及其制备方法和应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20050027838A (ko) * 2003-09-16 2005-03-21 (주)넥스젠 식물체에서 발현된 재조합 인간 성장호르몬
KR20150056022A (ko) 2013-11-14 2015-05-22 주식회사 엘지생활건강 상피세포 성장인자의 융합단백질을 포함하는 피부개선용 화장료 조성물
KR20150144735A (ko) 2015-12-07 2015-12-28 서울대학교산학협력단 필러와 보틀리눔 독소를 포함하는 피부 주름, 노화 개선 또는 신경근육 관련 질환 치료용 조성물

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2003201513A1 (en) * 2002-01-11 2003-07-24 Nexia Biotechnologies, Inc. Methods of producing silk polypeptides and products thereof
WO2004060384A2 (en) * 2002-12-20 2004-07-22 Botulinum Toxin Research Associates, Inc. Pharmaceutical botulinum toxin compositions
WO2007008708A2 (en) * 2005-07-08 2007-01-18 Ohio University Methods of predicting hyp-glycosylation sites for proteins expressed and secreted in plant cells, and related methods and products
GB0820970D0 (en) * 2008-11-17 2008-12-24 Syntaxin Ltd Suppression of cancer
KR101169178B1 (ko) * 2010-12-03 2012-07-30 주식회사 씨맥스코리아 이산화탄소 발생을 통해 피부를 활성화시키는 방법
KR20160083884A (ko) * 2013-11-01 2016-07-12 스페리움 바이오메드 에스.엘. 치료제 및 미용제의 경피 전달을 위한 봉입체
US9321821B2 (en) * 2013-11-14 2016-04-26 Lg Household & Health Care Ltd. Cosmetic composition for improving skin conditions comprising fusion protein
CA2949653C (en) * 2014-05-29 2019-12-17 Procell Therapeutics Inc. Novel cell penetrating peptide, conjugate thereof with botulinum toxin, and use thereof

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20050027838A (ko) * 2003-09-16 2005-03-21 (주)넥스젠 식물체에서 발현된 재조합 인간 성장호르몬
KR20150056022A (ko) 2013-11-14 2015-05-22 주식회사 엘지생활건강 상피세포 성장인자의 융합단백질을 포함하는 피부개선용 화장료 조성물
KR20150144735A (ko) 2015-12-07 2015-12-28 서울대학교산학협력단 필러와 보틀리눔 독소를 포함하는 피부 주름, 노화 개선 또는 신경근육 관련 질환 치료용 조성물

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHANDRAMOHAN ET AL.: "Toxin-based Targeted Therapy for Malignant Brain Tumors", CLINICAL AND DEVELOPMENTAL IMMUNOLOGY, vol. 2012, 2012, pages 1 - 15, XP055447360 *
DATABASE GenBank [O] 8 February 2007 (2007-02-08), XP055454821, Database accession no. ABM73969.1 *
FAHRER ET AL.: "A Cell -permeable Fusion Protein Based on Clostridium Botulinum C2 Toxin for Delivery of p53 Tumorsuppressor into Cancer Cells", P]OS ONE, vol. 8, no. 9, pages e72455, XP055447370 *
HANAHAN, D., J. MOL. BIOL., vol. 166, 1983, pages 557 - 580
THAKUR ET AL.: "Targeted Tumor Therapy by Epidermal Growth Factor Appended Toxin and Purified Saponin: An Evaluation of Toxicity and Therapeutic Potential in Syngeneic Tumor Bearing Mice", MOLECULAR ONCOLOGY, vol. 7, 2013, pages 475 - 483, XP028543805 *
YANG ET AL.: "Diphtheria Toxin-epidermal Growth Factor Fusion Protein DAB389EGF for the Treatment of Bladder Cancer", CLINICAL CANCER RESEARCH, vol. 19, no. 1, 2013, pages 148 - 157, XP055447358 *

Also Published As

Publication number Publication date
ES2760547T3 (es) 2020-05-14
US10266817B2 (en) 2019-04-23
JP6592112B2 (ja) 2019-10-16
CN108350042A (zh) 2018-07-31
EP3299385A4 (en) 2019-01-30
EP3299385A1 (en) 2018-03-28
US20190093095A1 (en) 2019-03-28
KR101636846B1 (ko) 2016-07-07
JP2018525971A (ja) 2018-09-13
EP3299385B1 (en) 2019-09-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2017213287A1 (ko) 피부 세포 증식 및 항산화 효과가 증가한 보툴리눔 톡신-인간상피세포성장인자 융합단백질 및 이를 유효성분으로 함유하는 피부 재생 및 주름 개선용 화장료 조성물
WO2018062701A1 (ko) 항산화 기능 및 피부 세포 증식 효과가 증가된 부동화 단백질 및 인간 상피세포성장인자를 포함하는 융합단백질 및 이를 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물
WO2017209347A1 (ko) 피부 세포 증식 효과가 증가한 열 안정성 인간 상피세포성장인자-거미독 융합단백질 및 이를 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선 및 탄력 유지용 화장료 조성물
KR101652956B1 (ko) 항산화 기능 및 세포 증식 효과가 증가된 인간 상피세포재생인자 융합단백질 및 이를 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선 및 항노화 화장료 조성물
KR101613302B1 (ko) Sv82 폴리펩타이드 및 이를 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선 및 탄력 유지용 화장료 조성물
WO2017122969A1 (ko) 열 안정성이 증가한 인간성장호르몬 융합단백질 및 이를 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선 및 탄력 유지용 화장료 조성물
WO2018038567A1 (ko) 피부 세포 증식 효과가 증가한 전갈독 융합단백질 및 이를 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선, 피부 탄력 증대 및 항노화 화장료 조성물
WO2018199393A1 (ko) 항산화 활성 및 피부 세포 증식 효과가 증가한 열 충격 단백질의 융합단백질 및 이를 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물
KR101657298B1 (ko) 세포 증식 효과가 증가한 인간 상피세포재생인자 융합단백질 및 이를 유효성분으로 함유하는 피부 주름 및 탄력 개선용 화장료 조성물
WO2018216842A1 (ko) 항산화 활성 및 피부 세포 증식 효과가 증가한 성장 분화 인자 11과 상피세포 성장인자의 융합단백질 및 이를 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물
WO2018216841A1 (ko) 항산화 활성 및 피부 세포 증식 효과가 증가한 열 충격 단백질 10과 브라제인 단백질의 융합단백질 및 이를 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물
WO2018199392A1 (ko) 피부 세포 증식 효과가 증가한 성장 분화 인자 11과 열 충격 단백질 10의 융합단백질 및 이를 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물
KR101657299B1 (ko) 세포 증식 효과가 증가한 인간 상피세포재생인자와 인간 성장호르몬의 융합단백질 및 이를 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선 및 항노화 화장료 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2017562980

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2016904720

Country of ref document: EP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE