JP2018515628A - 超明色ダイマーまたはポリマー染料 - Google Patents

Abstract

蛍光染料または有色染料として有用な化合物が開示される。上記化合物は、以下の構造（Ｉ）（その立体異性体、塩および互変異性体を含む）を有し、ここでＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｍ、ｍおよびｎは、本明細書で定義されるとおりである。このような化合物の調製および使用と関連する方法もまた、提供される。本発明は一般に、ダイマーおよびポリマーの蛍光染料または有色染料、ならびにそれらの調製法および種々の分析法における使用に関する。

Description

（背景）
（分野）
本発明は一般に、ダイマーおよびポリマーの蛍光染料または有色染料、ならびにそれらの調製法および種々の分析法における使用に関する。

（関連技術の説明）
蛍光染料および／または有色染料は、高感度検出試薬が望ましい用途に特に適していることが公知である。サンプル中の特定の成分または構成要素を優先的に標識し得る染料は、研究者がその特定の成分または構成要素の存在、量および／または位置を決定することを可能にする。さらに、多様な環境での空間的および時間的分布に関して、特定の系がモニターされ得る。

蛍光法および比色法は、化学および生物学において極めて広く行き渡っている。これらの方法は、生体分子の存在、構造、距離、配向、錯体形成（ｃｏｍｐｌｅｘａｔｉｏｎ）および／または位置に関する有用な情報を与える。さらに、時間分解法は、ダイナミクスおよびキネティクスの測定においてますます使用されている。結果として、生体分子（例えば、核酸およびタンパク質）の蛍光または色による標識に関する多くのストラテジーが開発されてきた。生体分子の分析は、代表的には、水性環境において起こるので、焦点は、水溶性の染料の開発および使用に当てられている。

高度な蛍光染料または有色染料（「明色化剤（ｂｒｉｇｈｔｅｒ）」）は、このような染料の使用がシグナル対ノイズ比を増大させかつ他の関連する利益を提供するので望ましい。よって、既知の蛍光部分および／または有色部分からのシグナルを増大させる試みがなされてきた。例えば、２もしくはこれより多くの蛍光部分および／または有色部分を含むダイマーおよびポリマーの化合物は、このような化合物がより明るい染料を生じることを期待して調製されてきた。しかし、分子内蛍光クエンチングの結果として、上記ダイマーおよびポリマーの染料は、明度の望ましい増大を達成しなかった。

従って、増大したモルあたりの明度を有する水溶性染料が当該分野で必要である。理想的には、このような染料および生体マーカーは、強く有色であるかまたは蛍光性であるべきであり、種々の色および蛍光波長において利用可能であるべきである。本発明は、この必要性を満たしかつさらなる関連の利点を提供する。

（簡単な要旨）
簡潔には、本発明は一般に、分析物分子（例えば、生体分子）の視覚的検出を可能にする水溶性の蛍光または有色の染料およびプローブとして有用な化合物、ならびにそれらの調製のための試薬に関する。上記染料を使用して分析物分子を視覚的に検出するための方法もまた、記載される。

本開示の染料の実施形態は、１〜１４の範囲に及ぶｐＨにおいて、例えば、７より高いｐＨにおいて代表的には荷電するリンカーによって共有結合的に連結される２もしくはこれより多くの蛍光部分および／または有色部分を含む。ダイマーおよび／またはポリマーの染料の以前の報告とは対照的に、本発明の染料は、その対応するモノマー染料化合物より有意に明るい。理論によって拘束されることは望まないが、上記荷電したリンカーの静電反発力が、上記蛍光部分および／または有色部分の間で空間的距離を維持するように作用し、従って、分子内蛍光クエンチングは低減および／または排除されると考えられる。

本発明の水溶性の蛍光染料または有色染料は、強く有色および／または蛍光性であり、目視または他の手段によって容易に観察され得る。いくつかの実施形態において、上記化合物は、事前の照射または化学的もしくは酵素的活性化なしに観察され得る。本明細書で記載されるように、上記染料の適切な選択によって、種々の色の視覚的に検出可能な分析物分子が、得られ得る。

一実施形態において、以下の構造（Ｉ）を有する化合物：

またはその立体異性体、互変異性体もしくは塩が提供され、ここでＲ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｌ^１、Ｌ^２、Ｌ^３、Ｌ^４、Ｍ、ｍおよびｎは、本明細書で定義されるとおりである。

別の実施形態において、サンプルを染色するための方法が提供され、上記方法は、上記サンプルに、本明細書で記載されるとおりの代表的化合物を、上記サンプルが適切な波長で照射される場合に光学的応答を生成するために十分な量で添加する工程を包含する。

さらに他の実施形態において、本開示は、分析物分子を視覚的に検出するための方法を提供し、上記方法は、
（ａ）本明細書で記載される代表的化合物を提供する工程；および
（ｂ）上記化合物をその視覚的特性によって検出する工程
を包含する。

他の開示される方法は、生体分子を視覚的に検出するための方法を包含し、上記方法は、
（ａ）開示される化合物のうちのいずれかと１もしくはこれより多くの生体分子とを混合する工程；および
（ｂ）上記化合物をその視覚的特性によって検出する工程
を包含する。

他の実施形態は、開示される化合物のうちのいずれか１つおよび１もしくはこれより多くの生体分子を含む組成物に関する。上記１もしくはこれより多くの生体分子の検出のための分析法におけるこのような組成物の使用もまた、提供される。

本発明のこれらおよび他の局面は、以下の詳細な説明を参照すれば明らかになる。

図面において、同一の参照番号は、類似の要素を同定する。図面の中の要素のサイズおよび相対的位置は、必ずしも同一縮尺で書かれておらず、これら要素のうちのいくつかは、図面の読みやすさを改善するために、自由裁量によって拡大されかつ配置されている。さらに、書かれているとおりの要素の特定の形状は、その特定の要素の実際の形状に関して何らかの情報を知らせる意図はなく、図面の中で認識しやすくするために選択されているに過ぎない。

図１は、比較染料化合物のＵＶ吸収スペクトルを提供する。

図２は、比較染料化合物の蛍光発光スペクトルの重ね合わせである。

図３は、例示的染料化合物のＵＶ吸収スペクトルを示す。

図４は、図３の染料化合物の蛍光発光スペクトルを示す。

図５は、代表的染料化合物のＵＶ吸収スペクトルの別の重ね合わせである。

図６は、代表的染料化合物の蛍光発光スペクトルを示す。

図７は、親発蛍光団に対する代表的染料化合物の蛍光発光スペクトルの別の重ね合わせを提供する。

図８は、親発蛍光団に対する代表的染料化合物の蛍光発光スペクトルの別の重ね合わせである。

図９は、親発蛍光団に対する代表的化合物のさらなる蛍光発光スペクトルを提供する。

図１０ａおよび１０ｂは、細胞の添加回収アッセイ（ｓｐｉｋｅ ａｎｄ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ａｓｓａｙ）からの用量依存性データを提供する。

図１１ａおよび１１ｂは、７−ＡＡＤを挿入したＤＮＡを使用して染料染色した細胞の生存／死滅ゲート制御に相関させたるフローサイトメトリーデータを提供する。

図１２は、膜透過性の等級付けされた状態に相関する生存力勾配を示すフローサイトメトリーデータを提供する。

図１３は、２つの異なる培養物間および形態解釈間での生存力状態の高感度検出を図示する。

図１４ａおよび１４ｂは、死細胞において見出される有糸分裂のパターンを図示する。

図１５ａおよび１５ｂは、死細胞およびアポトーシス細胞の増殖効果のパターンを図示する。

（詳細な説明）
以下の説明において、ある種の具体的詳細が、本発明の種々の実施形態の完全な理解を提供するために示される。しかし、当業者は、これら詳細なしに本発明が実施され得ることを理解する。

状況が別段要求しなければ、本明細書および特許請求の範囲全体を通じて、文言「含む、包含する（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」ならびにそのバリエーション（例えば、「含む、包含する（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含む、包含する（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」）は、開放系の包括的な意味で、すなわち、「が挙げられるが、これらに限定されない」として解釈されるべきである。

本明細書全体を通じて「一実施形態（ｏｎｅ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」または「ある実施形態（ａｎ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」への言及は、上記実施形態と関連して記載される特定の特徴、構造、または特性が、本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。従って、本明細書全体を通じて種々の箇所での語句「一実施形態において」または「ある実施形態において」の存在は、必ずしも全てが、同じ実施形態に言及しているわけではない。さらに、特定の特徴、構造、または特性は、１もしくはこれより多くの実施形態において任意の適切な様式で組み合わせられ得る。

「アミノ」とは、−ＮＨ_２基をいう。

「カルボキシ」とは、−ＣＯ_２Ｈ基をいう。

「シアノ」とは、−ＣＮ基をいう。

「ホルミル」とは、−Ｃ（＝Ｏ）Ｈ基をいう。

「ヒドロキシ」または「ヒドロキシル」とは、−ＯＨ基をいう。

「イミノ」とは、＝ＮＨ基をいう。

「ニトロ」とは、−ＮＯ_２基をいう。

「オキソ」とは、＝Ｏ置換基をいう。

「スルフヒドリル」とは、−ＳＨ基をいう。

「チオキソ」とは、＝Ｓ基をいう。

「アルキル」とは、炭素原子および水素原子のみからなり、飽和または不飽和であり（すなわち、１個もしくはこれより多くの二重結合および／または三重結合を含み）、１〜１２個の炭素原子（Ｃ_１−Ｃ_１２アルキル）、好ましくは１〜８個の炭素原子（Ｃ_１−Ｃ_８アルキル）または１〜６個の炭素原子（Ｃ_１−Ｃ_６アルキル）を有し、そして単結合によって分子の残部に結合される直鎖状または分枝状の炭化水素鎖の基（例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、１−メチルエチル（イソ−プロピル）、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、１，１−ジメチルエチル（ｔ−ブチル）、３−メチルヘキシル、２−メチルヘキシル、エテニル、プロパ−１−エニル、ブタ−１−エニル、ペンタ−１−エニル、ペンタ−１，４−ジエニル、エチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニルなど）をいう。「アルケニル」とは、少なくとも１個の炭素−炭素二重結合を含むアルキルである。「アルキニル」とは、少なくとも１個の炭素−炭素三重結合を含むアルキルである。本明細書で別段具体的に述べられなければ、アルキル、アルケニルおよびアルキニル基は、必要に応じて置換される。

「アルキレン」または「アルキレン鎖」とは、分子の残部を置換基に連結し、炭素および水素のみからなり、飽和または不飽和であり（すなわち、１個もしくはこれより多くの二重結合および／または三重結合を含み）、そして１〜１２個の炭素原子を有する直鎖状または分枝状の二価の炭化水素鎖（例えば、メチレン、エチレン、プロピレン、ｎ−ブチレン、エテニレン、プロペニレン、ｎ−ブテニレン、プロピニレン、ｎ−ブチニレンなど）をいう。「アルケニレン」とは、少なくとも１個の炭素−炭素二重結合を含むアルキレンである。「アルキニレン」とは、少なくとも１個の炭素−炭素三重結合を含むアルキレンである。上記アルキレン鎖は、単結合または二重結合を介して分子の残部に結合され、単結合または二重結合を介して置換基に結合される。分子の残部へのまたは置換基への上記アルキレン鎖の結合点は、上記鎖の中の１個の炭素または任意の２個の炭素を介し得る。本明細書で別段具体的に述べられなければ、アルキレン、アルケニレンおよびアルキニレンは、必要に応じて置換される。

「アルキルエーテル」とは、上記で定義されるとおりの任意のアルキル基であって、ここで少なくとも１個の炭素−炭素結合が炭素−酸素結合で置き換わっているものをいう。この炭素−酸素結合は、末端部分に（アルコキシ基の中にあるように）あってもよいし、炭素酸素結合は、内部に（すなわち、Ｃ−Ｏ−Ｃ）あってもよい。アルキルエーテルは、少なくとも１個の炭素酸素結合を含むが、１個より多く含んでいてもよい。例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、アルキルエーテルの意味の中に含まれる。本明細書で別段具体的に述べられなければ、アルキルエーテル基は、必要に応じて置換される。例えば、いくつかの実施形態において、アルキルエーテルは、アルコールまたはホスフェートで置換される。

「アルコキシ」とは、式−ＯＲ_ａであって、ここでＲ_ａは、１〜１２個の炭素原子を含む上記で定義されるとおりのアルキル基である基をいう。本明細書で別段具体的に述べられなければ、アルコキシ基は、必要に応じて置換される。

「ヘテロアルキレン」とは、少なくとも１個のヘテロ原子（例えば、Ｎ、ＯまたはＳ）を含むアルキレン基をいう。いくつかの実施形態において、上記ヘテロ原子は、アルキレン鎖の中にある（すなわち、上記ヘテロアルキレンは、少なくとも１個の炭素−ヘテロ原子−炭素結合を含む）。他の実施形態において、上記ヘテロ原子は、アルキレンの末端にあり、従って、上記アルキレンを分子の残部に結合するように働く（例えば、Ｍ１−Ｈ−Ａ−Ｍ２、ここでＭ１およびＭ２は、分子の一部であり、Ｈは、ヘテロ原子であり、Ａは、アルキレンである）。「ヘテロアルケニレン」とは、少なくとも１個の炭素−炭素二重結合を含むヘテロアルキレンである。「ヘテロアルキニレン」とは、少なくとも１個の炭素−炭素三重結合を含むヘテロアルキレンである。本明細書で別段具体的に述べられなければ、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニレンおよびヘテロアルキニレンは、必要に応じて置換される。

例示的なヘテロアルキレン連結基は、以下に図示される：

上記のＣ−リンカーのマルチマーは、ヘテロアルキレンリンカーの種々の実施形態の中に含まれる。

「ヘテロ原子リンカー」に関して「ヘテロ原子（の）」とは、１個もしくはこれより多くのヘテロ原子からなるリンカー基をいう。例示的なヘテロ原子リンカーは、Ｏ、Ｎ、ＰおよびＳからなる群より選択される１個の原子、および複数のヘテロ原子を含む（例えば、式−Ｐ（Ｏ⁻）（＝Ｏ）Ｏ−または−ＯＰ（Ｏ⁻）（＝Ｏ）Ｏ−ならびにそのマルチマーおよび組み合わせを有するリンカー）。

「ホスフェート」とは、−ＯＰ（＝Ｏ）（Ｒ_ａ）Ｒ_ｂ基であって、ここでＲ_ａは、ＯＨ、Ｏ⁻またはＯＲ_ｃであり；そしてＲ_ｂは、ＯＨ、Ｏ⁻、ＯＲ_ｃ、チオホスフェート基またはさらなるホスフェート基であり、ここでＲ_ｃは、対イオン（例えば、Ｎａ^＋など）であるものをいう。

「ホスホアルキル」とは、−ＯＰ（＝Ｏ）（Ｒ_ａ）Ｒ_ｂ基であって、ここでＲ_ａは、ＯＨ、Ｏ⁻またはＯＲ_ｃであり；そしてＲ_ｂは、−Ｏアルキルであり、ここでＲ_ｃは、対イオン（例えば、Ｎａ^＋など）であるものをいう。本明細書で別段具体的に述べられなければ、ホスホアルキル基は、必要に応じて置換される。例えば、ある種の実施形態において、ホスホアルキル基の中の上記−Ｏアルキル部分は、ヒドロキシル、アミノ、スルフヒドリル、ホスフェート、チオホスフェート、ホスホアルキル、チオホスホアルキル、ホスホアルキルエーテルまたはチオホスホアルキルエーテルのうちの１個もしくはこれより多くで必要に応じて置換される。

「ホスホアルキルエーテル」とは、−ＯＰ（＝Ｏ）（Ｒ_ａ）Ｒ_ｂ基であって、ここでＲ_ａは、ＯＨ、Ｏ⁻またはＯＲ_ｃであり；そしてＲ_ｂは、−Ｏアルキルエーテルであり、ここでＲ_ｃは、対イオン（例えば、Ｎａ^＋など）であるものをいう。本明細書で別段具体的に述べられなければ、ホスホアルキルエーテル基は、必要に応じて置換される。例えば、ある種の実施形態において、ホスホアルキルエーテル基の中の−Ｏアルキルエーテル部分は、ヒドロキシル、アミノ、スルフヒドリル、ホスフェート、チオホスフェート、ホスホアルキル、チオホスホアルキル、ホスホアルキルエーテルまたはチオホスホアルキルエーテルのうちの１個もしくはこれより多くで必要に応じて置換される。

「チオホスフェート」とは、−ＯＰ（＝Ｒ_ａ）（Ｒ_ｂ）Ｒ_ｃ基であって、ここでＲ_ａは、ＯまたはＳであり；Ｒ_ｂは、ＯＨ、Ｏ⁻、Ｓ⁻、ＯＲ^ｄまたはＳＲ^ｄであり；そしてＲ_ｃは、ＯＨ、ＳＨ、Ｏ⁻、Ｓ⁻、ＯＲ_ｄ、ＳＲ_ｄ、ホスフェート基またはさらなるチオホスフェート基であり、ここでＲ_ｄは、対イオン（例えば、Ｎａ^＋など）であり、そしてただし：ｉ）Ｒ_ａは、Ｓであり；ｉｉ）Ｒ_ｂは、Ｓ⁻またはＳＲ_ｄであり；ｉｉｉ）Ｒ_ｃは、ＳＨ、Ｓ⁻またはＳＲ_ｄであるか；あるいはｉｖ） ｉ）、ｉｉ）および／またはｉｉｉ）の組み合わせであるものをいう。

「チオホスホアルキル」とは、−ＯＰ（＝Ｒ_ａ）（Ｒ_ｂ）Ｒ_ｃ基であって、ここでＲ_ａは、ＯまたはＳであり；Ｒ_ｂは、ＯＨ、Ｏ⁻、Ｓ⁻、ＯＲ^ｄまたはＳＲ^ｄであり；そしてＲ_ｃは、−Ｏアルキルであり、ここでＲ_ｄは、対イオン（例えば、Ｎａ^＋など）であり、そしてただし：Ｒ_ａは、Ｓであるか、またはＲ_ｂは、Ｓ⁻もしくはＳＲ_ｄであるか；あるいはただしＲ_ａは、Ｓであり、そしてＲ_ｂは、Ｓ⁻またはＳＲ_ｄであるものをいう。本明細書で別段具体的に述べられなければ、チオホスホアルキル基は、必要に応じて置換される。例えば、ある種の実施形態において、チオホスホアルキル基の中の−Ｏアルキル部分は、ヒドロキシル、アミノ、スルフヒドリル、ホスフェート、チオホスフェート、ホスホアルキル、チオホスホアルキル、ホスホアルキルエーテルまたはチオホスホアルキルエーテルのうちの１個もしくはこれより多くで必要に応じて置換される。

「チオホスホアルキルエーテル」とは、−ＯＰ（＝Ｒ_ａ）（Ｒ_ｂ）Ｒ_ｃ基であって、ここでＲ_ａは、ＯまたはＳであり、Ｒ_ｂは、ＯＨ、Ｏ⁻、Ｓ⁻、ＯＲ^ｄまたはＳＲ^ｄであり；そしてＲ_ｃは、−Ｏアルキルエーテルであり、ここでＲ_ｄは、対イオン（例えば、Ｎａ^＋など）であり、そしてただし：Ｒ_ａは、Ｓであるか、またはＲ_ｂは、Ｓ⁻もしくはＳＲ_ｄであるか；あるいはただしＲ_ａは、Ｓであり、そしてＲ_ｂは、Ｓ⁻またはＳＲ_ｄであるものをいう。本明細書で別段具体的に述べられなければ、チオホスホアルキルエーテル基は、必要に応じて置換される。例えば、ある種の実施形態において、チオホスホアルキル基の中の−Ｏアルキルエーテル部分は、ヒドロキシル、アミノ、スルフヒドリル、ホスフェート、チオホスフェート、ホスホアルキル、チオホスホアルキル、ホスホアルキルエーテルまたはチオホスホアルキルエーテルのうちの１個もしくはこれより多くで必要に応じて置換される。

「炭素環式」とは、３〜１８個の炭素原子を含む安定な３〜１８員の芳香族または非芳香族の環をいう。本明細書で別段具体的に述べられなければ、炭素環式環は、縮合環系もしくは架橋環系を含み得、部分的にまたは完全に不飽和であり得る単環式、二環式、三環式または四環式の環系であり得る。非芳香族カルボシクリルラジカルとしては、シクロアルキルが挙げられる一方で、芳香族カルボシクリルラジカルは、アリールが挙げられる。本明細書で別段具体的に述べられなければ、炭素環式基は、必要に応じて置換される。

「シクロアルキル」とは、縮合環系もしくは架橋環系を含み得、３〜１５個の炭素原子を有し、好ましくは、３〜１０個の炭素原子を有し、そして飽和または不飽和であり、単結合によって分子の残部に結合される安定な非芳香族の単環式または多環式の炭素環式環をいう。単環式シクロアルキル（ｃｙｃｌｏｃａｌｋｙｌ）としては、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、およびシクロオクチルが挙げられる。多環式シクロアルキルとしては、例えば、アダマンチル、ノルボルニル、デカリニル、７，７−ジメチル−ビシクロ−［２．２．１］ヘプタニルなどが挙げられる。本明細書で別段具体的に述べられなければ、シクロアルキル基は、必要に応じて置換される。

「アリール」とは、少なくとも１個の炭素環式芳香環を含む環系をいう。いくつかの実施形態において、アリールは、６〜１８個の炭素原子を含む。このアリール環は、縮合環系もしくは架橋環系を含み得る単環式、二環式、三環式または四環式の環系であり得る。アリールとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：アセアントリレン、アセナフチレン、アセフェナントリレン、アントラセン、アズレン、ベンゼン、クリセン、フルオランテン、フルオレン、ａｓ−インダセン、ｓ−インダセン、インダン、インデン、ナフタレン、フェナレン、フェナントレン、プレイアデン、ピレン、およびトリフェニレンに由来するアリール。本明細書で別段具体的に述べられなければ、アリール基は、必要に応じて置換される。

「複素環式」とは、１〜１２個の炭素原子ならびに窒素、酸素および硫黄からなる群より選択される１〜６個のヘテロ原子を含む安定な３〜１８員の芳香族または非芳香族の環をいう。本明細書で別段具体的に述べられなければ、上記複素環式環は、縮合環系もしくは架橋環系を含み得、上記複素環式環の中の窒素、炭素または硫黄原子は、必要に応じて酸化され得；窒素原子は、必要に応じて四級化され得；そして上記複素環式環は、部分的にまたは完全に不飽和であり得る単環式、二環式、三環式または四環式の環系であり得る。芳香族複素環式環の例は、ヘテロアリールの定義の中で以下に列挙される（すなわち、ヘテロアリールは、複素環式の部分セットである）。非芳香族複素環式環の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ジオキソラニル、チエニル［１，３］ジチアニル、デカヒドロイソキノリル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、イソチアゾリジニル、イソオキサゾリジニル、モルホリニル、オクタヒドロインドリル、オクタヒドロイソインドリル、２−オキソピペラジニル、２−オキソピペリジニル、２−オキソピロリジニル、オキサゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、４−ピペリドニル、ピロリジニル、ピラゾリジニル、ピラゾロピリミジニル、キヌクリジニル、チアゾリジニル、テトラヒドロフリル、トリオキサニル、トリチアニル、トリアジナニル（ｔｒｉａｚｉｎａｎｙｌ）、テトラヒドロピラニル、チオモルホリニル、チアモルホリニル、１−オキソ−チオモルホリニル、および１，１−ジオキソ−チオモルホリニル。本明細書で別段具体的に述べられなければ、複素環式基は、必要に応じて置換される。

「ヘテロアリール」とは、１〜１３個の炭素原子、窒素、酸素および硫黄からなる群より選択される１〜６個のヘテロ原子、ならびに少なくとも１個の芳香環を含む５〜１４員の環系をいう。本発明のある種の実施形態の目的に関して、ヘテロアリールラジカルは、縮合環系もしくは架橋環系を含み得；上記ヘテロアリールラジカルの中の窒素、炭素または硫黄原子は、必要に応じて酸化され得；上記窒素原子は、必要に応じて四級化され得る単環式、二環式、三環式または四環式の環系であり得る。例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：アゼピニル、アクリジニル、ベンゾイミダゾリル、ベンズチアゾリル、ベンゾインドリル、ベンゾジオキソリル、ベンゾフラニル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾ［ｂ］［１，４］ジオキセピニル、１，４−ベンゾジオキサニル、ベンゾナフトフラニル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾジオキソリル、ベンゾジオキシニル、ベンゾピラニル、ベンゾピラノニル、ベンゾフラニル、ベンゾフラノニル、ベンゾチエニル（ベンゾチオフェニル）、ベンゾトリアゾリル、ベンゾ［４，６］イミダゾ［１，２−ａ］ピリジニル、ベンゾオキサゾリノニル、ベンゾイミダゾールチオニル、カルバゾリル、シンノリニル、ジベンゾフラニル、ジベンゾチオフェニル、フラニル、フラノニル、イソチアゾリル、イミダゾリル、インダゾリル、インドリル、インダゾリル、イソインドリル、インドリニル、イソインドリニル、イソキノリル、インドリジニル、イソオキサゾリル、ナフチリジニル、オキサジアゾリル、２−オキソアゼピニル、オキサゾリル、オキシラニル、１−オキシドピリジニル、１−オキシドピリミジニル、１−オキシドピラジニル、１−オキシドピリダジニル、１−フェニル−１Ｈ−ピロリル、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサジニル、フタラジニル、プテリジニル、プテリジノニル、プリニル、ピロリル、ピラゾリル、ピリジニル、ピリジノニル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリミジノニル（ｐｒｙｒｉｍｉｄｉｎｏｎｙｌ）、ピリダジニル、ピロリル、ピリド［２，３−ｄ］ピリミジノニル、キナゾリニル、キナゾリノニル、キノキサリニル、キノキサリノニル、キノリニル、イソキノリニル、テトラヒドロキノリニル、チアゾリル、チアジアゾリル、チエノ［３，２−ｄ］ピリミジン−４−オニル、チエノ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オニル、トリアゾリル、テトラゾリル、トリアジニル、およびチオフェニル（すなわち、チエニル）。本明細書で別段具体的に述べられなければ、ヘテロアリール基は、必要に応じて置換される。

「縮合された」とは、少なくとも２個の環を含み、ここでこの２個の環が少なくとも１個の共通環原子、例えば、２個の共通環原子を共有する環系をいう。縮合環がヘテロシクリル環またはヘテロアリール環である場合、その共通環原子は、炭素または窒素であり得る。縮合環は、二環式、三環式、四環式などを含む。

本明細書で使用される用語「置換された」とは、上記基のうちのいずれか（例えば、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニレン、ヘテロアルキニレン、アルコキシ、アルキルエーテル、ホスフェート、ホスホアルキル、ホスホアルキルエーテル、チオホスフェート、チオホスホアルキル、チオホスホアルキルエーテル、炭素環式、シクロアルキル、アリール、複素環式および／またはヘテロアリール）であって、ここで少なくとも１個の水素原子（例えば、１個、２個、３個または全ての水素原子）が、非水素原子（例えば、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩのようなハロゲン原子；ヒドロキシル基、アルコキシ基、およびエステル基のような基の中の酸素原子；チオール基、チオアルキル基、スルホン基、スルホニル基、およびスルホキシド基のような基の中の硫黄原子；アミン、アミド、アルキルアミン、ジアルキルアミン、アリールアミン、アルキルアリールアミン、ジアリールアミン、Ｎ−オキシド、イミド、およびエナミンのような基の中の窒素原子；トリアルキルシリル基、ジアルキルアリールシリル基、アルキルジアリールシリル基、およびトリアリールシリル基のような基の中のケイ素原子；ならびに種々の他の基の中の他のヘテロ原子）への結合によって置き換えられることを意味する。「置換された」とはまた、１個もしくはこれより多くの水素原子が、ヘテロ原子（例えば、オキソ、カルボニル、カルボキシル、およびエステル基の中の酸素；ならびにイミン、オキシム、ヒドラゾンおよびニトリルのような基の中の窒素）へのより高次の結合（例えば、二重結合または三重結合）によって置き換えられる上記の基のうちのいずれかを意味する。例えば、「置換された」は、１個もしくはこれより多くの水素原子が−ＮＲ_ｇＲ_ｈ、−ＮＲ_ｇＣ（＝Ｏ）Ｒ_ｈ、−ＮＲ_ｇＣ（＝Ｏ）ＮＲ_ｇＲ_ｈ、−ＮＲ_ｇＣ（＝Ｏ）ＯＲ_ｈ、−ＮＲ_ｇＳＯ_２Ｒ_ｈ、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ_ｇＲ_ｈ、−ＯＲ_ｇ、−ＳＲ_ｇ、−ＳＯＲ_ｇ、−ＳＯ_２Ｒ_ｇ、−ＯＳＯ_２Ｒ_ｇ、−ＳＯ_２ＯＲ_ｇ、＝ＮＳＯ_２Ｒ_ｇ、および−ＳＯ_２ＮＲ_ｇＲ_ｈで置き換えられる上記の基のうちのいずれかを含む。「置換された」はまた、１個もしくはこれより多くの水素原子が−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ_ｇ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ_ｇ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ_ｇＲ_ｈ、−ＣＨ_２ＳＯ_２Ｒ_ｇ、−ＣＨ_２ＳＯ_２ＮＲ_ｇＲ_ｈで置き換えられる上記基のうちのいずれかを意味する。前述において、Ｒ_ｇおよびＲ_ｈは、同じであるかまたは異なっており、そして独立して、水素、アルキル、アルコキシ、アルキルアミノ、チオアルキル、アリール、アラルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ハロアルキル、ヘテロシクリル、Ｎ−ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、Ｎ−ヘテロアリールおよび／またはヘテロアリールアルキルである。「置換された」とは、１個もしくはこれより多くの水素原子がアミノ、シアノ、ヒドロキシル、イミノ、ニトロ、オキソ、チオキソ、ハロ、アルキル、アルコキシ、アルキルアミノ、チオアルキル、アリール、アラルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ハロアルキル、ヘテロシクリル、Ｎ−ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、Ｎ−ヘテロアリールおよび／またはヘテロアリールアルキル基への結合によって置き換えられる上記の基のうちのいずれかをさらに意味する。さらに、前述の置換基の各々はまた、上記の置換基のうちの１個もしくはこれより多くで必要に応じて置換され得る。

「共役」とは、１つのｐ軌道と別のｐ軌道とが、間に挟まるσ結合を横断して重なり合っていることをいう。共役は、環式または非環式の化合物で起こり得る。「共役度」とは、少なくとも１つのｐ軌道と別のｐ軌道とが間に挟まっている二重結合を横断して重なり合っていることをいう。例えば、１，３−ブタジエンは、１の共役度を有する一方で、ベンゼンおよび他の芳香族化合物は、代表的には、多重の共役度を有する。蛍光および有色化合物は、代表的には、少なくとも１の共役度を含む。

「蛍光（性）（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ）」とは、特定の周波数の光を吸収し、異なる周波数の光を発することができる分子をいう。蛍光（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）は、当業者に周知である。

「有色（の）（ｃｏｌｏｒｅｄ）」とは、有色のスペクトル内の光（すなわち、赤、黄、青など）を吸収する分子をいう。

「リンカー」とは、分子の一部をその同じ分子の別の部分にまたは異なる分子、部分もしくは固体支持体（例えば、微粒子）に接続する、少なくとも１個の原子（例えば、炭素、酸素、窒素、硫黄、リンおよびこれらの組み合わせ）の連続する鎖に言及する。リンカーは、共有結合または他の手段（例えば、イオン結合または水素結合相互作用）を介して上記分子を接続し得る。

用語「生体分子」とは、種々の生物学的物質のうちのいずれか（核酸、炭水化物、アミノ酸、ポリペプチド、糖タンパク質、ホルモン、アプタマーおよびこれらの混合物が挙げられる）をいう。より具体的には、この用語は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、オリゴヌクレオチド、改変または誘導体化されたヌクレオチド、酵素、レセプター、プリオン、レセプターリガンド（ホルモンを含む）、抗体、抗原、および毒素、ならびに細菌、ウイルス、血球、および組織細胞が挙げられるが、これらに限定されないことが意図される。本発明の視覚的に検出可能な生体分子（すなわち、生体分子が連結されている構造（Ｉ）の化合物）は、本明細書でさらに記載されるように、生体分子と化合物（これは、上記生体分子上のアミノ、ヒドロキシ、カルボキシル、またはスルフヒドリル基のような任意の利用可能な原子または官能基を介して上記化合物への生体分子の結合を可能にする反応性基を有する）とを接触させることによって調製される。

用語「視覚的」および「視覚的に検出可能な」とは、事前の照射、または化学的活性化もしくは酵素的活性化なしで、目視によって観察可能である物質に言及するために、本明細書で使用される。このような視覚的に検出可能な物質は、約３００〜約９００ｎｍの範囲に及ぶスペクトルの領域にある光を吸収し、発する。好ましくは、このような物質は、強く有色であり、好ましくは、少なくとも約４０，０００、より好ましくは、少なくとも約５０，０００、さらにより好ましくは、少なくとも約６０，０００、なおさらにより好ましくは、少なくとも約７０，０００、および最も好ましくは、少なくとも約８０，０００Ｍ^−１ｃｍ^−１のモル吸光係数を有する。本発明の化合物は、裸眼で、または光学ベースの検出デバイス（吸光分光光度計、透過型光学顕微鏡（ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｌｉｇｈｔ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）、デジタルカメラおよびスキャナが挙げられるが、これらに限定されない）の助けを借りて観察することによって検出され得る。視覚的に検出可能な物質は、可視スペクトルの中の光を発するおよび／または吸収するものに限定されない。紫外線（ＵＶ）領域（約１０ｎｍ〜約４００ｎｍ）、赤外線（ＩＲ）領域（約７００ｎｍ〜約１ｍｍ）の中の光を発するおよび／または吸収する物質、ならびに電磁スペクトルの他の領域において発するおよび／または吸収する物質はまた、「視覚的に検出可能な」物質の範囲内に含まれる。

本発明の目的のために、用語「光安定性視覚的染料（ｐｈｏｔｏｓｔａｂｌｅ ｖｉｓｉｂｌｅ ｄｙｅ）」とは、本明細書上記で定義されるように、視覚的に検出可能であり、そして光に曝露した際に、顕著に変化も分解もしない化学部分に言及する。好ましくは、上記光安定性視覚的染料は、少なくとも１時間光に曝された後に、顕著な漂白も分解も示さない。より好ましくは、上記視覚的染料は、少なくとも１２時間、さらにより好ましくは、少なくとも２４時間、さらになおより好ましくは、少なくとも１週間、および最も好ましくは、少なくとも１ヶ月間光に曝した後に安定である。本発明の化合物および方法における使用に適した光安定性視覚的染料の非限定的例としては、アゾ染料、チオインディゴ染料、キナクリドン顔料、ジオキサジン、フタロシアニン、ペリノン、ジケトピロロピロール、キノフタロン、およびトルアリーカルボニウム（ｔｒｕａｒｙｃａｒｂｏｎｉｕｍ）が挙げられる。

本明細書で使用される場合、用語「ペリレン誘導体」とは、視覚的に検出可能である任意の置換されたペリレンを含むことが意図される。しかし、この用語は、ペリレン自体を含むことは意図されない。用語「アントラセン誘導体」、「ナフタレン誘導体」、および「ピレン誘導体」が、同様に使用される。いくつかの好ましい実施形態において、誘導体（例えば、ペリレン、ピレン、アントラセンまたはナフタレンの誘導体）は、ペリレン、アントラセン、ナフタレン、またはピレンのイミド、ビスイミドまたはヒドラザムイミド（ｈｙｄｒａｚａｍｉｍｉｄｅ）誘導体である。

本発明の視覚的に検出可能な分子は、特定の分析物（例えば、生体分子）の存在、位置、または量を決定する必要がある広く種々の分析用途（例えば、生化学的および生物医学的用途）に有用である。従って、別の局面において、本発明は、生体分子を視覚的に検出するための方法を提供し、上記方法は、（ａ）生物学的系に、生体分子に連結された構造（Ｉ）の化合物を含む視覚的に検出可能な生体分子を提供する工程；および（ｂ）上記生体分子をその視覚的特性によって検出する工程を包含する。本発明の目的のために、語句「生体分子をその視覚的特性によって検出する」とは、生体分子が、照射または化学的もしくは酵素的活性化なしに、裸眼で、または光学ベースの検出デバイス（吸光分光光度計、透過型光学顕微鏡、デジタルカメラおよびスキャナが挙げられるが、これらに限定されない）の助けを借りて観察されることを意味する。デンシトメーターは、存在する視覚的に検出可能な生体分子の量を定量するために使用され得る。例えば、２つのサンプル中の上記生体分子の相対的量は、相対的光学密度を測定することによって決定され得る。１生体分子あたりの染料分子の化学量論が既知でありかつ上記染料分子の吸光係数が既知である場合、上記生体分子の絶対濃度もまた、光学密度の測定から決定され得る。本明細書で使用される場合、用語「生物学的系」は、視覚的に検出可能な生体分子に加えて、１もしくはこれより多くの生体分子を含む任意の溶液または混合物をいうために使用される。このような生物学的系の非限定的例としては、細胞、細胞抽出物、組織サンプル、電気泳動ゲル、アッセイ混合物、およびハイブリダイゼーション反応混合物が挙げられる。

「固体支持体」とは、分子の固相支持のための当該分野で公知の任意の固体基材をいい、例えば、「微粒子」とは、本発明の化合物への結合に有用な多くの小さな粒子のうちのいずれか（ガラスビーズ、磁性ビーズ、ポリマービーズ、非ポリマービーズなどが挙げられるが、これらに限定されない）をいう。ある種の実施形態において、微粒子は、ポリスチレンビーズを含む。

「塩基対合部分」とは、相補的な複素環式部分と水素結合（例えば、ワトソン−クリック塩基対合）を介してハイブリダイズし得る複素環式部分をいう。塩基対合部分は、天然および非天然の塩基を含む。塩基対合部分の非限定的例は、ＲＮＡ塩基およびＤＮＡ塩基（例えば、アデノシン、グアノシン、チミジン、シトシンおよびウリジンならびにこれらのアナログ）である。

本明細書で開示される本発明の実施形態はまた、１個もしくはこれより多くの原子が異なる原子質量または質量数を有する原子によって置き換わることによって、同位体標識されている構造（Ｉ）の全ての化合物を包含することが意味される。開示される化合物に組み込まれ得る同位体の例としては、水素、炭素、窒素、酸素、リン、フッ素、塩素、およびヨウ素の同位体（例えば、それぞれ、^２Ｈ、^３Ｈ、^１１Ｃ、^１３Ｃ、^１４Ｃ、^１３Ｎ、^１５Ｎ、^１５Ｏ、^１７Ｏ、^１８Ｏ、^３１Ｐ、^３２Ｐ、^３５Ｓ、^１８Ｆ、^３６Ｃｌ、^１２３Ｉ、および^１２５Ｉ）が挙げられる。

構造（Ｉ）の同位体標識された化合物は一般に、当業者に公知の従来技術によって、または以下でおよび以下の実施例において記載されるものに類似のプロセスによって、以前に使用されていた標識されていない試薬の代わりに適切な同位体標識された試薬を使用して調製され得る。

「安定な化合物」および「安定な構造」とは、反応混合物から有用な純度への単離および有効な治療剤への製剤化に耐えるように十分に強い化合物を示すことが意味される。

「選択肢的な（ｏｐｔｉｏｎａｌ）」または「必要に応じて（ｏｐｔｉｏｎａｌｌｙ）」とは、その後に記載される事象または状況が起こっても起こらなくてもよいこと、ならびにその記載が上記事象または状況が起こる場合およびそれが起こらない場合を含むことを意味する。例えば、「必要に応じて置換されたアルキル」とは、そのアルキル基が置換されていてもされていなくてもよいこと、ならびにその記載が、置換されたアルキル基および置換を有しないアルキル基の両方を含むことを意味する。

「塩」とは、酸付加塩および塩基付加塩の両方を包含する。

「酸付加塩」とは、無機酸（例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などが挙げられるが、これらに限定されない）および有機酸（例えば、酢酸、２，２−ジクロロ酢酸、アジピン酸、アルギン酸、アスコルビン酸、アスパラギン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、４−アセトアミド安息香酸、カンファー酸、カンファー−１０−スルホン酸、カプリン酸、カプロン酸、カプリル酸、炭酸、ケイ皮酸、クエン酸、シクラミン酸、ドデシル硫酸、エタン−１，２−ジスルホン酸、エタンスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、ギ酸、フマル酸、ガラクタル酸、ゲンチジン酸、グルコヘプトン酸、グルコン酸、グルクロン酸、グルタミン酸、グルタル酸、２−オキソ−グルタル酸、グリセロリン酸、グリコール酸、馬尿酸、イソ酪酸、乳酸、ラクトビオン酸、ラウリン酸、マレイン酸、リンゴ酸、マロン酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、ムチン酸、ナフタレン−１，５−ジスルホン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸、ニコチン酸、オレイン酸、オロト酸、シュウ酸、パルミチン酸、パモ酸、プロピオン酸、ピログルタミン酸、ピルビン酸、サリチル酸、４−アミノサリチル酸、セバシン酸、ステアリン酸、コハク酸、酒石酸、チオシアン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、トリフルオロ酢酸、ウンデシレン酸などが挙げられるが、これらに限定されない）と形成される塩をいう。

「塩基付加塩」とは、遊離酸に無機塩基または有機塩基を添加することから調製される塩をいう。無機塩基に由来する塩としては、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、銅、マンガン、アルミニウムの塩などが挙げられるが、これらに限定されない。有機塩基に由来する塩としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：一級、二級、および三級アミン、置換されたアミン（天然に存在する置換されたアミン、環式アミンおよび塩基性イオン交換樹脂（例えば、アンモニア、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、ジエタノールアミン、エタノールアミン、デアノール、２−ジメチルアミノエタノール、２−ジエチルアミノエタノール、ジシクロヘキシルアミン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、カフェイン、プロカイン、ヒドラバミン、コリン、ベタイン、ベネタミン、ベンザチン、エチレンジアミン、グルコサミン、メチルグルカミン、テオブロミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、プリン、ピペラジン、ピペリジン、Ｎ−エチルピペリジン、ポリアミン樹脂など）が挙げられる）の塩。特に好ましい有機塩基は、イソプロピルアミン、ジエチルアミン、エタノールアミン、トリメチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、コリンおよびカフェインである。

しばしば、結晶化は、本発明の化合物の溶媒和物を生じる。本発明は、記載される化合物の全ての溶媒和物を包含する。本明細書で使用される場合、用語「溶媒和物」とは、１分子もしくはこれより多くの本発明の化合物と、１分子もしくはこれより多くの溶媒とを含む凝集物をいう。上記溶媒は水であり得、この場合、この溶媒和物は水和物であり得る。あるいは、上記溶媒は、有機溶媒であり得る。従って、本発明の化合物は、水和物（一水和物、二水和物、半水和物、セスキ水和物、三水和物、四水和物などが挙げられる）ならびにその対応する溶媒和形態として存在し得る。本発明の化合物は、真の溶媒和物であり得る一方で、他の場合には、本発明の化合物は、偶発の水もしくは別の溶媒を保持しているに過ぎなくてもよいし、水と何らかの偶発の溶媒との混合物であってもよい。

本発明の化合物またはそれらの塩、互変異性体もしくは溶媒和物は、１もしくはこれより多くの不斉中心を含み得、従って、エナンチオマー、ジアステレオマー、および絶対立体化学の点から、（Ｒ）−もしくは（Ｓ）−として、またはアミノ酸に関しては（Ｄ）−もしくは（Ｌ）−として定義され得る他の立体異性形態を生じ得る。本発明は、全てのこのような考えられる異性体、ならびにそれらのラセミ形態および光学的に純粋な形態を含むことが意味される。光学的に活性な（＋）および（−）、（Ｒ）−および（Ｓ）−、または（Ｄ）−および（Ｌ）−異性体は、キラルシントンもしくはキラル試薬を使用して調製され得るか、または従来技術（例えば、クロマトグラフィーおよび分別結晶化）を使用して分離され得る。個々のエナンチオマーの調製／単離のための従来技術としては、適切な光学的に純粋な前駆体からのキラル合成、あるいは例えば、キラル高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用するラセミ混合物（または塩もしくは誘導体のラセミ混合物）の分離が挙げられる。本明細書で記載される化合物がオレフィン性二重結合または他の幾何的非対称性の中心を含み、そして別段特定されなければ、上記化合物がＥおよびＺ両方の幾何異性体を含むことは、意図される。同様に、全ての互変異性形態がまた、含まれることが意図される。

「立体異性体」とは、同じ結合によって結合されるが、交換可能ではない異なる三次元構造を有する同じ原子から構成される化合物をいう。本発明は、種々の立体異性体およびその混合物を企図し、分子が互いに重ね合わせることができない鏡像である２つの立体異性体をいう「エナンチオマー」を含む。

「互変異性体」とは、分子の１つの原子からその同じ分子の別の原子へのプロトンシフトに言及する。本発明は、任意の上記化合物の互変異性体を含む。上記化合物の種々の互変異性形態は、当業者によって容易に導き出される。

本明細書で使用される化学的命名法プロトコルおよび構造図は、ＡＣＤ／Ｎａｍｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ９．０７ソフトウェアプログラムおよび／またはＣｈｅｍＤｒａｗ Ｕｌｔｒａ Ｖｅｒｓｉｏｎ １１．０ソフトウェア命名プログラム（ＣａｍｂｒｉｄｇｅＳｏｆｔ）を使用するＩ．Ｕ．Ｐ．Ａ．Ｃ．命名法体系の改変形態である。当業者が精通する一般名もまた、使用される。

上記のように、本発明の一実施形態において、種々の分析法において蛍光染料および／または有色染料として有用な化合物が提供される。一般論として、本発明の実施形態は、蛍光部分および／または有色部分のダイマーおよびより高次のポリマーに関する。蛍光部分および／または有色部分は、アッセイが行われるｐＨにおいて複数の正に荷電した部分または複数の負に荷電した部分を有するリンカーによって連結される。理論によって拘束されることは望まないが、上記リンカー内の複数の荷電した部分の静電反発力が、分子内クエンチングが低減または排除され、このことが、より高いモル「明度」（例えば、高蛍光発光）を有する染料化合物を生じるように、蛍光部分および／または有色部分の間で十分な空間的距離を維持する一助となると考えられる。

例えば、上記リンカーは、負電荷が所望される場合に、ホスフェートおよび／またはチオホスフェート部分を含み得る。正電荷が所望される場合には四級アミン基および／または正電荷を保持し得る他の基を含む連結基が使用され得る。よって、いくつかの実施形態において、上記化合物は、以下の構造（Ａ）：

を有し、

ここでＬは、複数の正に荷電した部分または複数の負に荷電した部分を含むリンカーであり、他の変数は、構造（Ｉ）に関して定義されるとおりである。「荷電した部分」とは、それら部分があるｐＨにおいて、例えば、上記化合物を使用するアッセイが行われるｐＨにおいて荷電しているが、全てのｐＨにおいてその「荷電した部分」が荷電していることが要件ではないことは、理解される。

いくつかの他の実施形態において、上記化合物は、以下の構造（Ｉ）：

またはその立体異性体、互変異性体もしくは塩を有し、ここで：
Ｍは、各存在において、独立して、２個もしくはこれより多くの炭素−炭素二重結合および少なくとも１の共役度を含む部分であり；
Ｌ^１、Ｌ^２およびＬ^３は、各存在において、独立して、選択肢的なアルキレン、アルケニレン、アルキニレン、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニレン、ヘテロアルキニレンまたはヘテロ芳香族リンカーであり；
Ｌ^４は、各存在において、独立して、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニレンまたはヘテロアルキニレンリンカーであり；
Ｒ^１は、各存在において、独立して、Ｈ、アルキルまたはアルコキシであり；
Ｒ^２およびＲ^３は、各々独立して、Ｈ、ＯＨ、ＳＨ、アルキル、アルコキシ、アルキルエーテル、−ＯＰ（＝Ｒ_ａ）（Ｒ_ｂ）Ｒ_ｃ、Ｑ、Ｑへの共有結合を含むリンカー、分析物分子への共有結合を含むリンカー、固体支持体への共有結合を含むリンカーまたは構造（Ｉ）のさらなる化合物への共有結合を含むリンカーであり、ここで：Ｒ_ａは、ＯまたはＳであり；Ｒ_ｂは、ＯＨ、ＳＨ、Ｏ⁻、Ｓ⁻、ＯＲ_ｄまたはＳＲ_ｄであり；Ｒ_ｃは、ＯＨ、ＳＨ、Ｏ⁻、Ｓ⁻、ＯＲ_ｄ、ＳＲ_ｄ、アルキル、アルコキシ、アルキルエーテル、アルコキシアルキルエーテル、ホスフェート、チオホスフェート、ホスホアルキル、チオホスホアルキル、ホスホアルキルエーテルまたはチオホスホアルキルエーテルであり；
Ｒ^４は、各存在において、独立して、ＯＨ、ＳＨ、Ｏ⁻、Ｓ⁻、ＯＲ_ｄまたはＳＲ_ｄであり；
Ｒ^５は、各存在において、独立して、オキソ、チオキソまたは非存在であり；
Ｑは、各存在において、独立して、分析物分子、固体支持体または相補的反応性基Ｑ′と共有結合を形成し得る反応性基を含む部分であり；
Ｒ^ｄは、カチオンであり；
ｍは、各存在において、独立して、０またはこれより大きな整数であるが、ただしｍのうちの少なくとも１個の存在は、３またはこれより大きな整数であり；そして
ｎは、１またはこれより大きな整数である。

いくつかの実施形態において、ｍは、各存在において、独立して、３またはこれより大きな整数である。

いくつかの実施形態において、Ｌ^１、Ｌ^２およびＬ^３は、各存在において、独立して、選択肢的なアルキレンまたはヘテロアルキレンリンカーである。

構造（Ｉ）の化合物のいくつかの他の実施形態において：
Ｍは、各存在において、独立して、２個もしくはこれより多くの炭素−炭素二重結合および少なくとも１の共役度を含む部分であり；
Ｌ^１、Ｌ^２およびＬ^３は、各存在において、独立して、選択肢的なアルキレンまたはヘテロアルキレンリンカーであり；
Ｌ^４は、各存在において、独立して、長さが２０原子までのアルキレン、アルケニレン、アルキニレン、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニレンまたはヘテロアルキニレンリンカーであり；
Ｒ^１は、各存在において、独立して、Ｈ、アルキルまたはアルコキシであり；
Ｒ^２およびＲ^３は、各々独立して、Ｈ、ＯＨ、−ＯＰ（＝Ｒ_ａ）（Ｒ_ｂ）Ｒ_ｃ、Ｑ、Ｑへの共有結合を含むリンカー、分析物分子への共有結合を含むリンカーまたは固体支持体への共有結合を含むリンカーであり、ここで：Ｒ_ａは、ＯまたはＳであり；Ｒ_ｂは、ＯＨ、ＳＨ、Ｏ⁻、Ｓ⁻、ＯＲ_ｄまたはＳＲ_ｄであり；Ｒ_ｃは、ＯＨ、ＳＨ、Ｏ⁻、Ｓ⁻、ＯＲ_ｄ、ＳＲ_ｄ、ホスフェート、チオホスフェート、ホスホアルキル、チオホスホアルキル、ホスホアルキルエーテルまたはチオホスホアルキルエーテルであり；
Ｒ^４は、各存在において、独立して、ＯＨ、ＳＨ、Ｏ⁻、Ｓ⁻、ＯＲ_ｄまたはＳＲ_ｄであり；
Ｒ^５は、各存在において、独立して、オキソ、チオキソまたは非存在であり；
Ｑは、分析物分子または固体支持体と結合し得る部分であり；
Ｒ_ｄは、カチオンであり；
ｍは、各存在において、独立して、０またはこれより大きな整数であるが、ただしｍのうちの少なくとも１個の存在は、３またはこれより大きな整数であり；そして
ｎは、１またはこれより大きな整数である。

いくつかの実施形態において、上記化合物は、以下の構造（ＩＡ）：

を有し、ここでｘ^１、ｘ^２およびｘ^３は、各存在において、独立して、０〜６の整数である。

上記Ｌ^４リンカーは、所望の蛍光および／または色を提供する（上記蛍光および／または色を「整調する」）ために、他の変数とともに選択され得る。いくつかの実施形態において、Ｌ^４は、長さが２０原子まで、長さが１３原子まで、例えば、長さが１０原子までまたは長さが６原子までのリンカーである。ある種の実施形態において、Ｌ^４は、ジスルフィド結合を含まない。他の実施形態において、Ｌ^４は、各存在において、独立して、Ｃ_１−Ｃ_６アルキレンまたはＣ_２−Ｃ_６アルキニレンである。いくつかの実施形態において、Ｌ^４は、２個の炭素のリンカーである。

いくつかの他の異なる実施形態において、上記化合物は、以下の構造（ＩＢ）：

を有し、ここで：
ｘ^１、ｘ^２およびｘ^３は、各存在において、独立して、０〜６の整数であり；そして
ｙは、各存在において、独立して、１〜６の整数である。

前述のうちのある種の実施形態において、ｙは、２である。他の実施形態において、ｘ^１、ｘ^２およびｘ^３は、各存在において各々１である。いくつかの異なる実施形態において、各存在において、ｘ^２は、０であり、ｘ^３は、１である。

さらに他の実施形態において、Ｒ^４は、各存在において、独立して、ＯＨ、Ｏ⁻またはＯＲ_ｄである。「ＯＲ_ｄ」および「ＳＲ_ｄ」は、カチオンと会合したＯ⁻およびＳ⁻をいうことが意図されることは、理解される。例えば、ホスフェート基の二ナトリウム塩は、

として表され得、ここでＲ^ｄは、ナトリウム（Ｎａ^＋）である。

前述の実施形態のうちのさらなるものにおいて、Ｒ^５は、各存在において、オキソである。

いくつかの他の実施形態において、上記化合物は、以下の構造（ＩＢ′）または（ＩＢ′′）：

のうちの一方を有する。

前述のうちのいずれかの実施形態において、Ｒ^１は、Ｈである。

異なる実施形態において、Ｒ^２およびＲ^３は、各々独立して、ＯＨまたは−ＯＰ（＝Ｒ_ａ）（Ｒ_ｂ）Ｒ_ｃである。例えば、いくつかの実施形態において、Ｒ^２およびＲ^３は、各々独立して、ＯＨまたは−ＯＰ（＝Ｒ_ａ）（Ｒ_ｂ）Ｒ_ｃであり、ここでＲ^ａは、Ｏであり、Ｒ_ｂは、ＯＨ、Ｏ⁻またはＯＲ^ｄであり；Ｒ_ｃは、ＯＨ、Ｏ⁻、ＯＲ^ｄ、ホスフェート、チオホスフェート、ホスホアルキル、チオホスホアルキル、ホスホアルキルエーテルまたはチオホスホアルキルエーテルであり；そしてＲ^ｄは、対イオンである。

さらに他の異なる実施形態において、Ｒ^２またはＲ^３のうちの一方は、ＯＨまたは−ＯＰ（＝Ｒ_ａ）（Ｒ_ｂ）Ｒ_ｃであり、かつＲ^２またはＲ^３のうちの他方は、ＱまたはＱへの共有結合を含むリンカーである。例えば、いくつかの実施形態において、Ｒ^２またはＲ^３のうちの一方は、ＯＨまたは−ＯＰ（＝Ｒ_ａ）（Ｒ_ｂ）Ｒ_ｃであり、かつＲ^２またはＲ^３のうちの他方は、ＱまたはＱへの共有結合を含むリンカーであり、ここでＲ^ａは、Ｏであり、Ｒ_ｂは、ＯＨ、Ｏ⁻またはＯＲ^ｄであり；Ｒ_ｃは、ＯＨ、Ｏ⁻、ＯＲ^ｄ、ホスフェート、チオホスフェート、ホスホアルキル、チオホスホアルキル、ホスホアルキルエーテルまたはチオホスホアルキルエーテルであり；そしてＲ^ｄは、対イオンである。

さらに他の実施形態において、Ｑは、分析物分子もしくは固体支持体と結合し得る部分であるかまたはこの部分を含む。ある種の実施形態において、Ｑは、構造（Ｉ）の化合物を分析物分子または固体支持体に（例えば、共有結合によって）接続する手段を提供する。例えば、いくつかの実施形態において、Ｑは、分析物分子もしくは固体支持体と共有結合を形成し得る反応性基であるかまたはこの基を含む。この点では、Ｑ基のタイプおよび構造（Ｉ）の化合物の残りへのＱ基の接続は、限定されない。ある種の実施形態において、上記Ｑは、水性条件下で加水分解を受けにくい部分であるが、分析物分子または固体支持体上の対応する基（例えば、アミン）と結合を形成するために十分に反応性である。

構造（Ｉ）の化合物のある種の実施形態は、生体結合反応の分野において一般に使用されるＱ基を含む。例えば、いくつかの実施形態において、Ｑは、求核反応性基、求電子反応性基もしくは環化付加反応性基であるかまたはこれらを含む。いくつかのより具体的な実施形態において、Ｑは、スルフヒドリル、ジスルフィド、活性化エステル、イソチオシアネート、アジド、アルキン、アルケン、ジエン、ジエノフィル、酸ハライド、スルホニルハライド、ホスフィン、α−ハロアミド、ビオチン、アミノもしくはマレイミドであるかまたはこれらを含む。いくつかの実施形態において、上記活性化エステルは、Ｎ−スクシンイミドエステル、イミドエステルまたはポリフルオロフェニルエステルである。他の実施形態において、上記アルキンは、アルキルアジドまたはアシルアジドである。

例示的なＱ部分は、以下の表Ｉに提供される。

ＱがＳＨであるいくつかの実施形態において、このＳＨ部分は、構造（Ｉ）の別の化合物上の別のスルフヒドリル基とジスルフィド結合を形成する傾向にあることに注意するべきである。よって、いくつかの実施形態は、ジスルフィドダイマーの形態にあり、このジスルフィド結合がＳＨ Ｑ基に由来する構造（Ｉ）の化合物を含む。

いくつかの他の実施形態において、Ｒ^２またはＲ^３のうちの一方は、ＯＨまたは−ＯＰ（＝Ｒ_ａ）（Ｒ_ｂ）Ｒ_ｃであり、かつＲ^２またはＲ^３のうちの他方は、分析物分子への共有結合を含むリンカーまたは固体支持体への共有結合を含むリンカーである。いくつかの異なる実施形態において、Ｒ^２またはＲ^３のうちの一方は、ＯＨまたは−ＯＰ（＝Ｒ_ａ）（Ｒ_ｂ）Ｒ_ｃであり、かつＲ^２またはＲ^３のうちの他方は、分析物分子への共有結合を含むリンカーまたは固体支持体への共有結合を含むリンカーであり、ここでＲ^ａは、Ｏであり、Ｒ_ｂは、ＯＨ、Ｏ⁻またはＯＲ^ｄであり；Ｒ_ｃは、ＯＨ、Ｏ⁻、ＯＲ^ｄ、ホスフェート、チオホスフェート、ホスホアルキル、チオホスホアルキル、ホスホアルキルエーテルまたはチオホスホアルキルエーテルであり；そしてＲ^ｄは、対イオンである。例えば、いくつかの実施形態において、上記分析物分子は、核酸、アミノ酸またはこれらのポリマーである。他の実施形態において、上記分析物分子は、酵素、レセプター、レセプターリガンド、抗体、糖タンパク質、アプタマーまたはプリオンである。さらに異なる実施形態において、上記固体支持体は、ポリマービーズまたは非ポリマービーズである。

値の形態は、所望の蛍光および／または色の強度に基づいて選択され得る別の変数である。いくつかの実施形態において、ｍは、各存在において、独立して、３〜１０の整数である。他の実施形態において、ｍは、各存在において、独立して、７〜９の整数である。

蛍光強度はまた、ｎの種々の値の選択によって整調され得る。ある種の実施形態において、ｎは、１〜１００の整数である。他の実施形態において、ｎは、１〜１０の整数である。

Ｍは、所望の光学的特性に基づいて、例えば、所望の色および／または蛍光発光波長に基づいて選択される。いくつかの実施形態において、Ｍは、各存在において同じである；しかし、Ｍの各存在が同一のＭである必要はないことに注意することは重要であり、ある種の実施形態は、Ｍが各存在において同じでない化合物を含む。Ｍは、Ｍ上の任意の位置（すなわち、原子）から分子の残部に結合され得る。当業者は、Ｍを分子の残部に結合する手段を認識する。

いくつかの実施形態において、Ｍは、蛍光部分または有色部分である。当該分野で公知でありかつ比色アッセイ、ＵＶアッセイ、および／または蛍光アッセイにおいて代表的に使用される任意の蛍光部分および／または有色部分が、使用され得る。本発明の種々の実施形態において有用なＭ部分の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：キサンテン誘導体（例えば、フルオレセイン、ローダミン、オレゴングリーン、エオシンまたはテキサスレッド）；シアニン誘導体（例えば、シアニン、インドカルボシアニン、オキサカルボシアニン、チアカルボシアニンまたはメロシアニン）；スクアライン誘導体および環置換されたスクアライン（Ｓｅｔａ、ＳｅＴａｕ、およびＳｑｕａｒｅ染料が挙げられる）；ナフタレン誘導体（例えば、ダンシルおよびプロダン誘導体）；クマリン誘導体；オキサジアゾール誘導体（例えば、ピリジルオキサゾール、ニトロベンゾオキサジアゾールまたはベンゾオキサジアゾール）；アントラセン誘導体（例えば、アントラキノン（ＤＲＡＱ５、ＤＲＡＱ７およびＣｙＴＲＡＫオレンジが挙げられる））；ピレン誘導体（例えば、カスケードブルー）；オキサジン誘導体（例えば、ナイルレッド、ナイルブルー、クレシルバイオレット、オキサジン１７０）；アクリジン誘導体（例えば、プロフラビン、アクリジンオレンジ、アクリジンイエロー）；アリールメチン誘導体：オーラミン、クリスタルバイオレット、マラカイトグリーン；ならびにテトラピロール誘導体（例えば、ポルフィン、フタロシアニンまたはビリルビン）。他の例示的なＭ部分としては、以下が挙げられる：シアニン染料、キサンテート染料（例えば、Ｈｅｘ、Ｖｉｃ、Ｎｅｄｄ、ＪｏｅまたはＴｅｔ）；Ｙａｋｉｍａイエロー；Ｒｅｄｍｏｎｄレッド；ｔａｍｒａ；テキサスレッドおよびａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ（登録商標）染料。

前述のうちのいずれかのさらに他の実施形態において、Ｍは、３個もしくはこれより多くのアリールもしくはヘテロアリール環、またはこれらの組み合わせ、例えば、４個もしくはこれより多くのアリールもしくはヘテロアリール環、またはこれらの組み合わせ、あるいはさらには５個もしくはこれより多くのアリールもしくはヘテロアリール環、またはこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、Ｍは、６個のアリールまたはヘテロアリール環、またはこれらの組み合わせを含む。さらなる実施形態において、上記環は縮合される。例えば、いくつかの実施形態において、Ｍは、３個もしくはこれより多くの縮合環、４個もしくはこれより多くの縮合環、５個もしくはこれより多くの縮合環、またはさらには６個もしくはこれより多くの縮合環を含む。

いくつかの実施形態において、Ｍは、環式である。例えば、いくつかの実施形態において、Ｍは、炭素環式である。他の実施形態において、Ｍは、複素環式である。前述のうちのさらに他の実施形態において、Ｍは、各存在において、独立して、アリール部分を含む。これら実施形態のうちのいくつかにおいて、上記アリール部分は、多環式である。他のより具体的な実施形態において、上記アリール部分は、縮合多環式アリール部分であり、例えば、これは、少なくとも３個、少なくとも４個、またはさらには４個より多くのアリール環を含み得る。

構造（Ｉ）の前述の化合物のうちのいずれかの他の実施形態において、Ｍは、各存在において、独立して、少なくとも１個のヘテロ原子を含む。例えば、いくつかの実施形態において、上記ヘテロ原子は、窒素、酸素または硫黄である。

前述のうちのいずれかのさらにより多くの実施形態において、Ｍは、各存在において、独立して、少なくとも１個の置換基を含む。例えば、いくつかの実施形態において、上記置換基は、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、ヒドロキシ、スルフヒドリル、アルコキシ、アリールオキシ、フェニル、アリール、メチル、エチル、プロピル、ブチル、イソプロピル、ｔ−ブチル、カルボキシ、スルホネート、アミド、またはホルミル基である。

前述のうちのいくつかのさらにより具体的な実施形態において、Ｍは、各存在において、独立して、ジメチルアミノスチルベン、キナクリドン、フルオロフェニル−ジメチル−ＢＯＤＩＰＹ、ｈｉｓ−フルオロフェニル−ＢＯＤＩＰＹ、アクリジン、テリレン、セキシフェニル、ポルフィリン、ベンゾピレン、（フルオロフェニル−ジメチル−ジフルオロボラ−ジアザ−インダセン）フェニル、（ビス−フルオロフェニル−ジフルオロボラ−ジアザ−インダセン）フェニル、クアテルフェニル、ビ−ベンゾチアゾール、ター−ベンゾチアゾール、ビ−ナフチル、ビ−アントラシル、スクアライン、スクアリリウム、９，１０−エチニルアントラセンまたはター−ナフチル部分である。他の実施形態において、Ｍ^１は、各存在において、独立して、ｐ−ターフェニル、ペリレン、アゾベンゼン、フェナジン、フェナントロリン、アクリジン、チオキサントレン、クリセン、ルブレン、コロネン、シアニン、ペリレンイミド、もしくはペリレンアミドまたはその誘導体である。さらにより多くの実施形態において、Ｍは、各存在において、独立して、クマリン染料、レゾルフィン染料、ジピロメテンボロンジフルオリド染料、ルテニウムビピリジル染料、エネルギー移動染料、チアゾールオレンジ染料、ポリメチンまたはＮ−アリール−１，８−ナフタルイミド染料である。

前述のうちのいずれかのさらにより多くの実施形態において、Ｍは、各存在において同じである。他の実施形態において、各Ｍは、異なる。さらにより多くの実施形態において、１個もしくはこれより多くのＭは、同じであるか、または１個もしくはこれより多くのＭは、異なる。

いくつかの実施形態において、Ｍは、ピレン、ペリレン、ペリレンモノイミドもしくは６−ＦＡＭまたはその誘導体である。いくつかの他の実施形態において、Ｍ^１は、以下の構造：

のうちの１つを有する。

いくつかの他の実施形態において、Ｍ^１は、以下の構造：

を有する。

いくつかの具体的実施形態において、上記化合物は、表２から選択される化合物である：

表２において、および本願全体を通じて使用される場合、Ｆ、ＥおよびＹとは、それぞれ、フルオレセイン、ペリレンおよびピレン部分をいい、以下の構造を有する：

本開示の染料化合物は、「整調可能」であり、これは、前述の化合物のうちのいずれかにおいて変数を適切に選択することによって、当業者は、所望のおよび／または所定のモル蛍光（モル明度）を有する化合物に到達し得ることを意味する。上記化合物の整調可能性は、特定のアッセイにおいて、または目的の特定の分析物を同定するために使用するために、使用者が所望の蛍光および／または色を有する化合物に容易に到達することを可能にする。全ての変数は上記化合物のモル蛍光に対して影響を有し得るが、Ｍ、ｍ、ｎおよびＬ^４の適切な選択は、上記化合物のモル蛍光において重要な役割を果たすと考えられる。よって、一実施形態において、所望のモル蛍光を有する化合物を得るための方法が提供され、上記方法は、既知の蛍光を有するＭ部分を選択する工程、このＭを含む構造（Ｉ）の化合物を調製する工程、およびｍ、ｎおよびＬ^４に関して適切な変数を選択して、所望のモル蛍光を達成する工程を包含する。

ある種の実施形態においてモル蛍光は、親発蛍光団（例えば、モノマー）の蛍光発光に対しての倍数増加または減少の点で表され得る。いくつかの実施形態において、本発明の化合物のモル蛍光は、上記親発蛍光団に対して１．１×、１．５×、２×、３×、４×、５×、６×、７×、８×、９×、１０×またはさらにはより高い。種々の実施形態は、ｍ、ｎおよびＬ^４の適切な選択によって、親発蛍光団に対して蛍光の所望の倍数増加を有する化合物を調製することを包含する。

例証を容易にするために、リン部分（例えば、ホスフェートなど）を含む種々の化合物は、アニオン状態（例えば、−ＯＰＯ（ＯＨ）Ｏ⁻、−ＯＰＯ_３ ^２−）で示される。当業者は、その電荷がｐＨに依存し、荷電していない（例えば、プロトン化または塩（例えば、ナトリウムもしくは他のカチオン））形態がまた、本発明の範囲に含まれることを容易に理解する。

前述の化合物のうちのいずれかおよび１もしくはこれより多くの分析物分子（例えば、生体分子）を含む組成物は、種々の他の実施形態において提供される。いくつかの実施形態において、上記１もしくはより多くの分析物分子の検出のための分析方法でのこのような組成物の使用がまた、提供される。

さらに他の実施形態において、上記化合物は、種々の分析法において有用である。例えば、ある種の実施形態において、本開示は、サンプルを染色するための方法を提供し、上記方法は、上記サンプルに構造（Ｉ）の化合物（ここでＲ^２またはＲ^３のうちの一方は、分析物分子（例えば、生体分子）または微粒子への共有結合を含むリンカーであり、かつＲ^２またはＲ^３のうちの他方は、Ｈ、ＯＨ、ホスフェートまたはチオホスフェートである）を、上記サンプルが適切な波長で照射される場合に光学的応答を生じるために十分な量で添加する工程を包含する。

前述の方法のうちのいくつかの実施形態において、Ｒ^２は、分析物分子（例えば、生体分子）への共有結合を含むリンカーである。例えば、核酸、アミノ酸またはこれらのポリマー（例えば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド）。さらにより多くの実施形態において、上記生体分子は、酵素、レセプター、レセプターリガンド、抗体、糖タンパク質、アプタマーまたはプリオンである。

前述の方法のうちのさらに他の実施形態において、Ｒ^２、固体支持体（例えば、微粒子）への共有結合を含むリンカーである。例えば、いくつかの実施形態において、上記微粒子は、ポリマービーズまたは非ポリマービーズである。

さらにより多くの実施形態において、上記光学的応答は、蛍光応答である。

他の実施形態において、上記サンプルは、細胞を含み、いくつかの実施形態は、フローサイトメトリーによって上記細胞を観察する工程をさらに含む。

さらにより多くの実施形態において、上記方法は、上記蛍光応答を、検出可能に異なる光学的特性を有する第２の発蛍光団のものから区別する工程をさらに包含する。

他の実施形態において、本開示は、分析物分子（例えば、生体分子）を視覚的に検出するための方法を提供し、上記方法は、
（ａ）構造（Ｉ）の化合物（ここでＲ^２またはＲ^３のうちの一方は、上記分析物分子への共有結合を含むリンカーであり、かつＲ^２またはＲ^３のうちの他方は、Ｈ、ＯＨ、ホスフェートまたはチオホスフェートである）を提供する工程；および
（ｂ）上記化合物をその視覚的特性によって検出する工程
を包含する。

いくつかの実施形態において、上記分析物分子は、核酸、アミノ酸またはこれらのポリマー（例えば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド）である。さらにより多くの実施形態において、上記分析物分子は、酵素、レセプター、レセプターリガンド、抗体、糖タンパク質、アプタマーまたはプリオンである。

他の実施形態において、分析物分子（例えば、生体分子）を視覚的に検出するための方法が提供され、上記方法は、
（ａ）前述の化合物のうちのいずれかと１もしくはこれより多くの分析物分子とを混合する工程；および
（ｂ）上記化合物をその視覚的特性によって検出する工程
を包含する。

いくつかの他の異なる実施形態において、構造（Ｉ）の化合物は、細胞分析のための種々の方法において使用され得る。例えば、フローサイトメトリーの使用によって、上記化合物は、生細胞と死細胞との間を識別し、細胞の健康状態を評価し（例えば、壊死 対 早期のアポトーシス 対 後期のアポトーシス 対 生細胞）、細胞周期の間の倍数性および有糸分裂を追跡し、そして細胞増殖の種々の状態を決定するために使用され得る。理論によって拘束されることは望まないが、構造（Ｉ）の化合物の実施形態は、正に荷電した部分と優先的に結合または会合すると考えられる。よって、いくつかの実施形態において、上記化合物は、インタクトでない細胞、例えば、壊死細胞の存在を決定するための方法において使用され得る。例えば、いくつかの実施形態において、壊死細胞の存在を決定するための方法が提供され、上記方法は、細胞を含むサンプルと構造（Ｉ）の化合物とを混合する工程、および上記混合物をフローサイトメトリーによって分析する工程を包含する。構造（Ｉ）の化合物は、壊死細胞と結合または会合し、従って、壊死細胞の存在は、フローサイトメトリー条件下で検出可能である。壊死細胞に結合するためにアミン反応性基（または他の反応性基）を要する他の染色試薬とは対照的に、構造（Ｉ）の化合物を使用する染色法の実施形態は、タンパク質を含まないインキュベーション緩衝液を要せず、従って、上記方法は、関連する公知の方法より効率的に行われる。

よって、いくつかの実施形態において、本発明は、サンプル中の死細胞（またはインタクトでない細胞もしくは壊死組織など）の存在を決定するための方法を提供し、上記方法は、上記サンプルと構造（Ｉ）の化合物とを接触させ、それによって、上記化合物と上記死細胞とを結合または会合させる工程、および上記死細胞と結合または会合した上記化合物からの蛍光シグナルを観察する工程を包含する。例えば、いくつかの実施形態は、上記死細胞と結合または会合した上記化合物を観察するために、フローサイトメトリーの使用を含む。上記のように、ある種の方法は、上記死細胞と結合または会合するために反応性基の使用を要しない。よって、ある種の実施形態において、死細胞の同定における使用のための構造（Ｉ）の化合物は、Ｒ^２およびＲ^３は、各々独立して、ＯＨまたは−ＯＰ（＝Ｒ_ａ）（Ｒ_ｂ）Ｒ_ｃである、構造（Ｉ）の化合物である。

種々の他の実施形態において、上記化合物は、インタクトなもしくはインタクトでない細胞、アポトーシス小体、脱分極した膜および／または透過化した膜における正に荷電した部分の存在を決定するための関連法において使用され得る。

上記の方法に加えて、構造（Ｉ）の化合物の実施形態は、種々の学問分野および方法における有用性（以下が挙げられるが、これらに限定されない：がん組織および他の組織の同定のための内視鏡検査手順における画像化；死細胞への上記化合物の優先的結合による壊死組織の同定；単一細胞および／または単一分子分析法、例えば、増幅がほぼないかもしくは全くないポリヌクレオチドの検出；例えば、がん細胞に優先的に結合する抗体もしくは糖または他の部分への構造（Ｉ）の化合物の結合によるがんの画像化；手術手順における画像化；種々の疾患の同定のためのヒストンの結合；例えば、構造（Ｉ）の化合物におけるＭ部分を活性薬物部分で置き換えることによる薬物送達；ならびに／あるいは例えば、種々の叢および／または生物への構造（Ｉ）の化合物の優先的結合による歯科作業および他の手順における造影剤）が見出される。

構造（Ｉ）の化合物のうちの任意の実施形態（上で示されるとおり）ならびに構造（Ｉ）の化合物においてＲ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｌ^１、Ｌ^２、Ｌ^３、Ｌ^４、Ｍ、ｍおよびｎの変数について本明細書で示される任意の具体的選択（上で示されるとおり）は、独立して、構造（Ｉ）の化合物の他の実施形態および／または変数と組み合わされて、上では具体的には示されない本発明の実施形態を形成し得ることは理解される。さらに、選択肢のリストが、特定の実施形態および／または請求項における任意の特定のＲ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｌ^１、Ｌ^２、Ｌ^３、Ｌ^４、Ｍ、ｍおよびｎの変数に関して列挙される場合において、各個々の選択は、上記特定の実施形態および／または請求項から削除され得ること、ならびにその残りの選択の列挙は、本発明の範囲内にあると考えられることは、理解される。

本明細書において、示される式の置換基および／または変数の組み合わせは、このような寄与が安定な化合物を生じる場合にのみ許容可能であることは、理解される。

本明細書で記載されるプロセスにおいて、中間体化合物の官能基が、適切な保護基によって保護される必要があり得ることはまた、当業者によって認識される。このような官能基としては、ヒドロキシ、アミノ、メルカプトおよびカルボン酸が挙げられる。ヒドロキシの適切な保護基としては、トリアルキルシリルまたはジアリールアルキルシリル（例えば、ｔ−ブチルジメチルシリル、ｔ−ブチルジフェニルシリルまたはトリメチルシリル）、テトラヒドロピラニル、ベンジルなどが挙げられる。アミノ、アミジノおよびグアニジノの適切な保護基としては、ｔ−ブトキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニルなどが挙げられる。メルカプトの適切な保護基としては、−Ｃ（Ｏ）−Ｒ”（ここでＲ”は、アルキル、アリールまたはアリールアルキルである）、ｐ−メトキシベンジル、トリチルなどが挙げられる。カルボン酸の適切な保護基としては、アルキル、アリールまたはアリールアルキルエステルが挙げられる。保護基は、当業者に公知でありかつ本明細書で記載されるとおりである標準的技術に従って付加または除去され得る。保護基の使用は、Ｇｒｅｅｎ， Ｔ．Ｗ． ａｎｄ Ｐ．Ｇ．Ｍ． Ｗｕｔｚ、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（１９９９）、３ｒｄ Ｅｄ．， Ｗｉｌｅｙに詳細に記載される。当業者が認識するように、上記保護基はまた、ポリマー樹脂（例えば、Ｗａｎｇ樹脂、Ｒｉｎｋ樹脂または２−クロロトリチル−クロリド樹脂）であり得る。

さらに、遊離塩基または酸形態で存在する全ての本発明の化合物は、当業者に公知の方法による適切な無機塩基もしくは有機塩基または無機酸もしくは有機酸での処理によって、それらの塩に変換され得る。本発明の化合物の塩は、標準的技術によってそれらの遊離塩基形態または遊離酸形態へと変換され得る。

以下の反応スキームは、本発明の化合物を作製するための例示的方法を例証する。当業者がこれら化合物を類似の方法によってまたは当業者に公知の他の方法を組み合わせることによって作製する能力があり得ることは、理解される。当業者が以下に記載されるのと類似の様式で、適切な出発構成要素を使用し、必要な場合には、合成のパラメーターを改変することによって、以下で具体的に例証されない構造（Ｉ）の他の化合物を作製し得ることもまた、理解される。一般に、出発構成要素は、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｌａｎｃａｓｔｅｒ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｉｎｃ．、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＴＣＩ、およびＦｌｕｏｒｏｃｈｅｍ ＵＳＡなどのような供給源から得られ得るか、または当業者に公知の出典に従って合成され得る（例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ： Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ， Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ， ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗｉｌｅｙ， Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２０００）を参照のこと）か、または本発明において記載されるとおり調製され得る。

反応スキームＩ

反応スキームＩは、構造（Ｉ）の化合物（ここでＲ^１、Ｌ^１、Ｌ^２、Ｌ^３およびＭは、上記で定義されるとおりであり、そしてＲ^２およびＲ^３は、上記で定義されるとおりであるかまたはこれらの保護された改変体である）の調製のために有用な中間体を調製するための例示的方法を例証する。反応スキーム１を参照すると、構造ａの化合物は、購入され得るかまたは当業者に周知の方法によって調製され得る。Ｍ−Ｘ（ここでｘは、ブロモのようなハロゲンである）との、当該分野で公知の鈴木カップリング条件下での反応は、構造ｂの化合物を生じる。構造ｂの化合物を、以下で記載されるように構造（Ｉ）の化合物の調製のために使用し得る。

反応スキームＩＩ

反応スキームＩＩは、構造（Ｉ）の化合物の調製に有用な中間体の化合物を調製するための代替法を例証する。反応スキームＩＩ（ここでＲ^１、Ｌ^１、Ｌ^２、Ｌ^３およびＭは上記で定義されるとおりであり、そしてＲ^２およびＲ^３は、上記で定義されるとおりであるかまたはその保護された改変体である）を参照すると、構造ｃの化合物（これは、購入され得るかまたは周知の技術によって調製され得る）をＭ−Ｚと反応させて、構造ｄの化合物を得る。ここでＹおよびＺは、相補的反応性を有する官能基（すなわち、反応して共有結合を形成する官能基）を表す。Ｚは、Ｍへのペンダントであり得るかまたはＭの構造的骨格（例えば、環式無水物）の一部であり得る。Ｙは、アミノのような任意の数の官能基であり得る。

ある種の実施形態において、構造Ｉの化合物は、２〜１００個の反復単位を含むオリゴマーである。このようなオリゴマーは、周知の自動化ＤＮＡ合成法に類似の方法を使用して調製され得る。ＤＮＡ合成法は、当該分野で周知である。簡潔には、２個のアルコール基（例えば、上記の中間体ｂまたはｄの中のＲ^２およびＲ^３）は、それぞれ、ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）基および２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノホスホロアミダイト基で官能化される。上記ホスホロアミダイト基は、代表的には、テトラゾールのような活性化因子の存在下でアルコール基にカップリングされ、続いて、ヨウ素でリン原子の酸化が行われる。上記ジメトキシトリチル基は、酸（例えば、クロロ酢酸）で除去されて、遊離アルコールを露出させ得、これは、ホスホロアミダイト基と反応させられ得る。この２−シアノエチル基は、水性アンモニアでの処理によるオリゴマー化の後に除去され得る。

上記オリゴマー化方法において使用されるホスホロアミダイトの調製もまた、当該分野で周知である。例えば、一級アルコール（例えば、Ｒ^３）は、ＤＭＴ−Ｃｌとの反応によって、ＤＭＴ基として保護され得る。次いで、二級アルコール（例えば、Ｒ^２）は、２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホロアミダイトのような適切な試薬との反応によってホスホロアミダイトとして官能化される。ホスホロアミダイトの調製およびそれらのオリゴマー化の方法は、当該分野で周知であり、実施例の中でより詳細に記載される。

中間体ｂまたはｄのオリゴマーは、上記の周知のホスホロアミダイト化学に従って調製される。ｍ個の反復単位の所望の数は、上記ホスホロアミダイトカップリングを、適切な中間体、例えば、以下の構造を有する中間体：

で所望の回数反復することによって、分子の中に組み込まれる。

以下の実施例は、例証目的で提供されるのであって、限定目的で提供されるのではない。

一般的方法
^１Ｈおよび^３１Ｐ ＮＭＲスペクトルを、ＪＥＯＬ ４００ＭＨｚ分光計で得た。^３１Ｐ ＮＭＲスペクトルは、８５％ 水性リン酸を基準とし、^１Ｈスペクトルは、ＴＭＳを基準とした。逆相ＨＰＬＣ染料分析を、４５℃で保持した２．１ｍｍ×５０ｍｍ Ａｃｑｕｉｔｙ ＢＥＨ−Ｃ１８カラム付きのＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＨＰＬＣシステムを使用して行った。質量分析を、Ｗａｔｅｒｓ／Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ ＱｕａｔｔｒｏマイクロＭＳ／ＭＳシステムで（ＭＳのみモードで）、ＭａｓｓＬｙｎｘ ４．１獲得ソフトウェアを使用して行った。染料に関してＬＣ／ＭＳに使用した移動相は、１００ｍＭ １，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール（ＨＦＩＰ）、８．６ｍＭ トリエチルアミン（ＴＥＡ）、ｐＨ８であった。ホスホロアミダイトおよび前駆体分子を、ダイオードアレイ検出器および高速オートサンプラーのＡｇｉｌｅｎｔ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ １２６０ ＵＨＰＬＣシステムを使用して、Ａａｐｐｔｅｃ^（Ｃ） Ｓｐｉｒｉｔ^ＴＭ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃ１８カラム（４．６ｍｍ×１００ｍｍ、５μｍ粒度）を使用して分析した。励起および発光プロフィール実験を、Ｃａｒｙ Ｅｃｌｉｐｓｅ分光光度計で記録した。

全ての反応を、別段述べられなければ、窒素雰囲気下でオーブン乾燥したガラス器具の中で行った。市販のＤＮＡ合成試薬を、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ， ＶＡ）から購入した。無水ピリジン、トルエン、ジクロロメタン、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、酢酸、ピリジン、およびＴＨＦを、Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。全ての他の化学物質を、ＡｌｄｒｉｃｈまたはＴＣＩから購入し、さらに精製せずにそのまま使用した。

全てのオリゴマー（すなわち、ダイマーおよびより高次の）染料を、ＡＢＩ ３９４ ＤＮＡ合成機で、ホスホロアミダイトベースのカップリングアプローチの標準プロトコルを使用して合成した。オリゴマー合成のための鎖アセンブリサイクルは、以下であった：（ｉ）脱トリチル化、ジクロロメタン中３％ トリクロロ酢酸、１分間；（ｉｉ）カップリング、アセトニトリル中０．１Ｍ ホスホロアミダイトおよび０．４５Ｍ テトラゾール、１０分間；（ｉｉｉ）キャップ形成、ＴＨＦ／ルチジン、１／１（ｖ／ｖ）中０．５Ｍ 無水酢酸、１５秒間；（ｉｖ）酸化、ＴＨＦ／ピリジン／水、１０／１０／１（ｖ／ｖ／ｖ）中０．１Ｍ ヨウ素、３０秒間。

上記サイクル内の化学的工程の次に、アセトニトリル洗浄および乾燥アルゴンでのフラッシュを０．２〜０．４分間行った。支持体からの切断ならびに塩基およびホスホロアミダイト保護基の除去を、１時間、室温においてアンモニアで処理することによって達成した。次いで、オリゴマー染料を、上記のように逆相ＨＰＬＣによって分析した。

実施例１：ホスホロアミダイト染料モノマーの合成

１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル−２−メチレン−１，３−プロパンジオール（１）。乾燥５００ｍＬ丸底フラスコの中に撹拌子を入れた。窒素でフラッシュした後、乾燥ピリジン（２４０ｍＬ）を添加し、そのフラスコを氷浴の中で１５分間冷却した。冷却の際に、ＤＭＴｒＣｌ（７．６５ｇ， ２２．５ｍｍｏｌ）を添加し、その後、そのフラスコを一晩４℃の冷蔵庫の中で、窒素雰囲気下で撹拌した。次いで、数滴のメタノールを添加し、その反応を真空中で粘性のガム状物へと濃縮した。その得られたガム状物をＥｔＯＡｃ（２００ｍＬ）に溶解し、ＮａＨＣＯ_３（２５０ｍＬ）および飽和ＮａＣｌ（２５０ｍＬ）で洗浄した。その有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、真空中で粘性のガム状物へと濃縮した。次いで、その単離された粗製生成物洗浄物を、ＥｔＯＡｃ：ヘキサン（２５：７５ ｖ／ｖ）〜（１：１ ｖ／ｖ）の勾配で溶離するシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製して、１を透明ガム状物として得た（５．２１ｇ， ６０％）。^１Ｈ ＮＭＲを記録したところ、化合物１の構造と一致していることが見出された。

１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２−ヒドロキシメチル−３−ピレニルプロパノール（２）。冷却器を備えた乾燥２５０ｍＬ丸底フラスコの中に、撹拌子を入れた。そのフラスコを窒素でパージし、乾燥ＴＨＦ（４０ｍＬ）および化合物１（５．０ｇ， １２．８ｍｍｏｌ）を添加した。ＴＨＦ中の０．５Ｍ ９−ＢＢＮ（６５ｍＬ， ３２ｍｍｏｌ）をシリンジによって添加し、その反応物を加熱して１２時間還流させた。反応を室温へと冷却させた後、３Ｍ Ｋ_２ＣＯ_３（１１ｍｌ）および乾燥ＤＭＦ（１００ｍＬ）を添加した。１−ブロモピレン（２．０ｇ， ６．５ｍｍｏｌ）およびＰｄＣｌ_２（ｄｐｐｆ）（０．６５ｇ， ０．８ｍｍｏｌ）を添加し、その溶液を１５時間室温において撹拌させた。その反応混合物をＣＨ_２Ｃｌ_２（３００ｍＬ）へと注ぎ、Ｈ_２Ｏ（５００ｍＬ）で洗浄した。次いで、その水層を、さらなるＣＨ_２Ｃｌ_２（２００ｍＬ）で逆抽出した。その合わせた有機層を飽和ＮａＣｌ（３００ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、真空中で粘性のガム状物へと濃縮した。次いで、その単離された粗製生成物洗浄物をＥｔＯＡｃ：ヘキサン（２５：７５ ｖ／ｖ）〜（１：１ ｖ／ｖ）の勾配で溶離するシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製して、２を透明ガム状物として得た（３．０ｇ， ７９％）。^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを記録したところ、化合物２の構造と一致することが見出された。

１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２−メチルピレン−３−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）プロパンホスホロアミダイト（３）。乾燥１００ｍＬ丸底フラスコの中に撹拌子を入れた。そのフラスコを窒素でパージした後、ＣＨ_２Ｃｌ_２（２０ｍＬ）および化合物２（０．３０ｇ， ０．５０ｍｍｏｌ）を添加した。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．８８ｍＬ， ５．０ｍｍｏｌ）および２−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホロアミダイト（０．４５ｍＬ， ２．０ｍｍｏｌ）をシリンジによって添加した。室温で１時間撹拌した後、その反応は完了していることがＴＬＣ分析によって決定された。次いで、その粗製反応混合物を、ＥｔＯＡｃ：ヘキサン：ＴＥＡ（２２．５：７２．５：５ ｖ／ｖ／ｖ）の勾配で溶離するシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって直接精製して、３を白色泡状物として得た（０．２８ｇ， ７０％）。その^３１Ｐ ＮＭＲスペクトルを記録したところ、化合物３の構造と一致することが見出された：純度を、２５４ｎｍおよび３４０ｎｍでの検出を用いるＨＰＬＣ分析によって決定した。

異なるＡｒ基（例えば、本明細書で記載される「Ｍ」基のうちのいずれか）を有する他の化合物を、類似の様式で調製した。

実施例２：ペリレンカルボジイミド染料モノマーの合成

Ｎ−（２，３−プロパンジオール）ペリレンモノイミド（４）。冷却器を備えた乾燥２００ｍＬ丸底フラスコの中に、撹拌子およびペリレン一無水物^１（１．８３ｇ， ５．６７ｍｍｏｌ）を入れた。３−アミノ−１，２−プロパンジオール（１．１ｇ， ２．１ｍｍｏｌ）およびイミダゾール（１４．３ｇ， ０．２１ｍｏｌ）を添加した後、その容器を油浴の中で１５時間、１４０℃へと加熱した。その反応物を室温へと冷却させ、次いで、１０％ ＨＣｌを添加した（５００ｍＬ）。その得られた濃赤色沈殿物を、濾過によって集め、水で十分に洗浄し、１８０℃で数時間乾燥させて、４を濃赤色固体として得た（１．９５ｇ， ８６％）。

Ｎ−（３−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル−２−ヒドロキシプロパン）ペリレンモノイミド（５）。乾燥２００ｍＬ丸底フラスコの中に、撹拌子を入れた。そのフラスコを窒素でパージした後、乾燥ピリジン（１２０ｍＬ）、化合物４（０．４４ｇ， １．１ｍｍｏｌ）、およびジメトキシトリチルクロリド（０．４５ｇ， １．３ｍｍｏｌ）を全て添加し、その反応物を室温において４８時間撹拌させた。次いで、数滴のメタノールを添加し、その反応物を真空中で粘性のガム状物へと濃縮した。その得られたガム状物をＣＨ_２Ｃｌ_２（２００ｍＬ）に溶解し、飽和ＮａＣｌ（２００ｍＬ）で洗浄した。その水層をＣＨ_２Ｃｌ_２中で洗浄した（３×１００ｍＬ）。その合わせた有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、真空中で粘性のガム状物へと濃縮した。次いで、その単離された粗製生成物洗浄物を、ＥｔＯＡｃ：ＣＨ_２Ｃｌ_２（０：１００ ｖ／ｖ）〜（２：３ ｖ／ｖ）の勾配で溶離するシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製して、５を赤色泡状物として得た（０．２５ｇ， ５０％）。

Ｎ−（３−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル−２−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノホスホロアミダイト）ペリレン−モノイミド（６）。乾燥５０ｍＬ丸底フラスコの中に、撹拌子を入れた。そのフラスコを窒素でパージした後、ＣＨ_２Ｃｌ_２（５ｍＬ）および化合物５（０．２５ｇ， ０．３６ｍｍｏｌ）を添加した。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．２４ｍＬ， １．７９ｍｍｏｌ）および２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト（０．１６ｍＬ， ０．７２ｍｍｏｌ）をシリンジによって添加した。室温で１時間撹拌した後、その反応は完了していることがＴＬＣ分析によって決定された。次いで、その粗製反応混合物を、ＣＨ_２Ｃｌ_２：ＴＥＡ（９５：５ ｖ／ｖ）で溶離するシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって直接精製して、６を暗赤色泡状物として得た（０．２６ｇ， ８０％）。その精製した化合物を２５４ｎｍおよび５００ｎｍでの観察を用いるＲＰ−ＨＰＬＣによって分析した。２つのジアステレオマーが存在することを見出した。

異なるＭ基を有する他の染料モノマーを、類似の様式で調製した。

実施例３：オリゴマー染料の合成
オリゴマー染料を、１μｍｏｌまたは１０μｍｏｌスケールのいずれかで、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機またはＧＥ ＡＫＴAE １０ ＯｌｉｇｏＰｉｌｏｔで合成したところ、３’−ホスフェート基を有した。染料を、ＣＰＧビーズまたはポリスチレン固体支持体上に直接合成した。その染料を３’から５’方向において、標準的固相ＤＮＡ法によって合成した。カップリング法は、標準的β−シアノエチルホスホロアミダイト化学条件を使用した。異なる数の「ｍ」個の反復単位を、合成サイクルを所望の回数、適切なホスホロアミダイトで反復することによって組み込んだ。全てのホスホロアミダイトモノマーを、アセトニトリル／ジクロロメタン（０．１Ｍ 溶液）に溶解し、以下の合成サイクルを使用して連続順序で付加した：１）トルエン中のジクロロ酢酸での５’−ジメトキシトリチル保護基の除去、２）次のアセトニトリル中のホスホロアミダイトと活性化因子とのカップリング、３）ヨウ素／ピリジン／水での酸化、および４）無水酢酸／１−メチルイミダゾール（１−ｍｅｔｈｙｌｉｍｉｄｉｚｏｌｅ）／アセトニトリルでのキャップ形成。合成サイクルを、５’オリゴフロロシド（Ｏｌｉｇｏｆｌｏｒｏｓｉｄｅ）がアセンブリされるまで反復した。鎖アセンブリの最後に、上記モノメトキシトリチル（ＭＭＴ）基またはジメトキシトリチル（ＤＭＴ）基を、ジクロロメタン中のジクロロ酢酸またはトルエン中のジクロロ酢酸で除去した。

上記染料を、以下のように固体支持体から切断し、脱保護した：
１ｍＬマイクロピペッターを使用して、４５０μＬの濃ＮＨ_４ＯＨを１．５ｍＬエッペンドルフチューブの中の約２５ｍｇの反応済みＣＰＧ固体支持体へと添加した。そのスラリーを、ボルテックスミキサーを使用して短時間混合し、沈殿させ、その後、ガス形成（および発泡）が減少し始めるまで５５℃の加熱ブロックの上に（開けて）置いた。その時点で、チューブをきつく閉めた。加熱処理は、２時間（±１５分間）であり、次いで、チューブを取り出して、室温へと冷却した。上記チューブおよびその内容物を、その最大速（１３４００ｒｐｍ）において１分間遠心機の中で遠沈させ、次いで、支持体を含まないように注意して、その上清をガラスピペットで除去し、第２のラベル付き１．５ｍＬエッペンドルフチューブの中に入れた。その支持体を洗浄し、約１５０μＬのアセトニトリルで２回遠沈して、染料除去を最大にする助けとし、その洗浄物を、注意深く支持体から除去し、上記のラベル付きの２番目のチューブに添加した。清澄になった上清をＣｅｎｔｒｉＶａｐ濃縮器の中で４０℃において完全に乾燥させて、ＮＨ_４ＯＨを除去した。

実施例４：オリゴマー染料の特徴付け
１ｍＬの脱イオン水を、実施例３に従って調製した乾燥させた染料連続物に添加して再構成し、約０．３〜１．０ｍＭ（後に決定）の濃ストックを確立した。各染料構築物のうちの２μＬアリコートを、ＨＰＬＣ−ＭＳによって分析して、１５０ｍＭ ＨＦＩＰ／ＴＥＡ（ｐＨ９）移動相、および有機溶離構成要素としてのメタノールを用いる、４５℃に加熱した超高速２．１ｍｍ×５０ｍｍ Ｃ１８カラム（１．７μｍ）を使用して、同一性および相対純度を決定した。勾配は、１０分間かけて１〜１００％であった。エレクトロスプレーイオン化を（ネガティブモードで）使用して、上記染料連続物の分子量を決定し、不純物を特徴付ける助けとした。

サンプルを、マイクロピペッターを使用して濃ストックから採取し、０．１×ＰＢＳ中で、ＮａｎｏＤｒｏｐ ＵＶ−ｖｉｓ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の線形範囲内であるように適切に（１×〜１００×）希釈した。ブランクの測定を、０．１×ＰＢＳを使用してＮａｎｏＤｒｏｐで行い、次いで、希釈した染料連続物の吸光度を適切な波長で記録した。吸光係数（ε）を、染料構築物中の蛍光体（Ｍ部分）の総数によって、上記連続物に存在する各フルオレセイン（Ｆ；４９４ｎｍでの読み取り）に関しては７５，０００Ｍ^−１ｃｍ^−１；各ピレン（Ｙ；３４３ｎｍでの読み取り）に関しては３４，５００；および各ペリレン（Ｅ；４４０ｎｍでの読み取り）に関しては４０，０００を使用して決定した。スペーサーは、εに関して何ら影響を有しないと推測される。構造［Ｆ（ＣＣＣＣＣＣＣＦ）_５］を有する染料のモル濃度の例示的計算は、以下のとおりである：
式１：染料のモル濃度＝｛Ａ_４９４／（Ｌ×ε_染料）｝×希釈率
Ε_染料＝４５０，０００Ｍ ^−１ ｃｍ ^−１
Ｌ_{ナノドロップ}＝０．１ｃｍ
Ａ_４９４＝０．２５４ＡＵ
希釈率＝１００
染料のモル濃度＝５．６４×１０ ^−０４ Ｍ、すなわち、０．５６４ｍＭ。

濃度を決定したとともに、染料ストックをＮａＰＯ_４緩衝液（ｐＨ７．５で０．１Ｍ）およびＮａＣＯ_３緩衝液（ｐＨ９．０で０．１Ｍ）中で希釈して、最終容積約３．５ｍＬにおいて２μＭ（または５μＭ（上記機器の線形範囲で機能するものはなんでも））の溶液を作製した。これら溶液を、ＵＶ／Ｖｉｓによってスキャンし、次いで、それらを使用して、１０〜５０ｎＭの範囲において、蛍光計での読み取りに適切な緩衝液中で第２の希釈物を作製した。必要な濃度は、Ｍ部分が何であるかに依存して変動する。上記の染料に関しては、２５ｎＭ溶液を使用した。

１ｃｍ石英キュベットを使用して、３００ｎｍから７００ｎｍまでスキャンして、上記２μＭサンプルの吸光度を決定した。スキャン速度を中程度に設定した。

１ｃｍ石英キュベットおよびＣａｒｙ Ｅｃｌｉｐｓｅ分光計を使用して、上記２５ｎＭサンプルの発光を、適切な励起波長（上記染料に関しては４９４ｎｍ）を使用し、そして４９９ｎｍから７００ｎｍまでスキャンして読み取った。スキャン速度を中程度に設定した。

実施例５：オリゴマー染料のＵＶおよび蛍光特性
表３に列挙される染料化合物を、上記の一般的手順に従って調製し、それらのＵＶおよび蛍光特性を、２ｎＭおよびｐＨ９において決定した。図１中のＵＶスペクトルから見られ得るように、この種々の染料化合物の吸光係数は、その理論値におよそ相当する（すなわち、吸光係数は、相加的である）。

表３中の染料の４９９ｎｍから７００ｎｍまでの蛍光発光スペクトルもまた、決定した（図２）。吸光係数とは対照的に、複数の蛍光部分を含む染料の発光は、親化合物（Ｆ）よりも有意に低かった。理論によって拘束されることは望まないが、この現象は、複数の蛍光部分による蛍光の分子内クエンチングによって説明され得ると考えられる。

ε_ｔ＝理論的モル吸光係数

実施例６：オリゴマー染料のＵＶおよび蛍光特性
蛍光部分の間の種々のリンカーの長さの効果を調べるために、表４中に列挙される染料化合物を、上記の一般的手順に従って調製し、それらのＵＶおよび蛍光特性を決定した。

表４中のフルオレセインダイマー染料の各々の吸光係数は、２個のフルオレセイン部分の合計に基づいて予測される理論値とおよそ一致する（図３）。驚くべきことに、このダイマーの蛍光発光スペクトルは、リンカーの長さがその染料の蛍光発光に対して有意な効果を有することを示す（図４）。具体的には、フルオレセイン部分の間に少なくとも「Ｃ」スペーサー（以下の構造を参照のこと）を含めると、単一のフルオレセインと比較して全体的な発光の増加が生じるのに対して、フルオレセイン部分の間のリンカーがより短いと、単一のフルオレセインと比較して減少した蛍光が生じることが見出された。

ε_ｔおよびＦは、上記で定義されるとおりであり、「Ｃリンカー」は、以下の構造を有する：

実施例７：オリゴマー染料のＵＶおよび蛍光特性
染料分子内の蛍光部分の数の効果を調べるために、表５中に列挙される染料化合物を、上記の一般的手順に従って調製し、それらのＵＶおよび蛍光特性を２ｎＭおよびｐＨ９において決定した。

この場合もまた、表５中のフルオレセインダイマー染料の各々の吸光係数は相加的であり、その予測される理論値とおよそ一致する（図５）。表５中の化合物の各々の蛍光発光は、親（すなわち、モノマー）発蛍光団より明るい（図６）。

ε_ｔおよびＦは、上記で定義されるとおりである。

実施例８：オリゴマー染料のＵＶおよび蛍光特性
表６中に列挙される染料化合物を、上記の一般的手順に従って調製し、それらの蛍光発光特性を、２５ｎＭおよびｐＨ９において決定した。

蛍光発光スペクトルは、これらの化合物の各々が親（すなわち、モノマー）発蛍光団より明るく、１つの化合物はおよそ６倍明るいことを示す（図７）。

ε_ｔおよびＦは、上記で定義されるとおりである。

実施例９：オリゴマー染料のＵＶおよび蛍光特性
表７中の化合物を、上記の一般的手順に従って調製し、それらの蛍光発光特性を、１０ｎＭおよびｐＨ９において決定した。

これらの化合物の蛍光発光スペクトルは、この場合もまた、これら化合物が親（すなわち、Ｆ）発蛍光団より明るいことを示す（図８、単位値は示さず）。

Ｆは、上記で定義されるとおりである。

実施例１０：ペリレンを含むオリゴマー染料のＵＶおよび蛍光特性
ペリレン部分（「Ｅ」）を含む染料化合物を、上記の一般的手順に従って調製し、それらの蛍光発光特性を、５０ｎＭおよびｐＨ９において決定した。これらの染料の構造は、表８に示される。

その蛍光発光スペクトルは、これら化合物の各々が親（すなわち、「単位」）発蛍光団より明るいことを示す（図９）。水性環境中でペリレンを使用し、その明度をモルベースで増大させることができることは、この発蛍光団の疎水性特性を考慮すれば、大きな前進である。

Ｅは、上記で定義されるとおりである。

実施例１１：一般的なフローサイトメトリー法および用途
一般的なフローサイトメトリー作業フローは、以下の工程を含む：

１．細胞を培養し、代謝ストレスの徴候について視覚的に観察し、そして／または新鮮な、誘導された、もしくは刺激された細胞を使用する。

２．染料化合物を作業容積へと希釈する。

３．細胞を採取し、死滅またはアポトーシスを誘導することなしに調製する。

４．細胞を遠心分離し、適切な緩衝液で洗浄する。

５．血球計算板およびトリパンブルー排除法を使用して細胞計数を行う。

６．細胞を遠心分離し、洗浄する。

７．細胞密度を試験サイズへと調節する。

８．染料（予備希釈物）または目的の他の共染色物を適用する。

９．細胞／染色物／染料混合物をインキュベートする。

１０．細胞を遠心分離し、適切な緩衝液で洗浄する。

１１．獲得緩衝液中で細胞を再懸濁する。

１２．細胞データをフローサイトメトリーによって獲得する。

上記の一般的作業フローは、具体的用途に従って改変され得る。具体的用途のためのいくつかの改変は、以下に記載される。

生存／死滅識別
細胞を、壊死細胞を陽性染色することによって生存性について試験して、損傷した細胞とインタクトな細胞とを比較する。アッセイを、正に荷電した部分を有するインタクトでない（固定されているおよび固定されていない）細胞、細胞デブリ、アポトーシス小体、脱分極した細胞膜、および透過化した膜を標的とするために使用する。次いで、細胞を、慣用的な細胞調製物（新鮮であるかまたは固定されている）を使用して染料で染色し、フローサイトメトリーを使用して分析する。

細胞の健康状態
死細胞（すなわち、壊死細胞）、早期アポトーシス細胞、後期アポトーシス細胞、および生細胞の間で比較を行う。死細胞は陽性染色され、アポトーシス小体は中程度に染色され、そして生細胞は陰性のままである。このストラテジーは、非常に明るい壊死細胞を生じ、細胞透過性を評価するためにも機能する。アッセイを、正に荷電した部分を有するインタクトでない（固定されているおよび固定されていない）細胞、細胞デブリ、アポトーシス小体、脱分極した細胞膜、および透過化した膜を標的とするために使用する。染料での染色を、生体異物で処理したインビトロ培養物、初代細胞、およびサンプルに対して行い、フローサイトメトリーを使用して分析する。

細胞周期
細胞周期における細胞倍数性および有糸分裂を、核酸および細胞周期関連タンパク質を含む全ての細胞および細胞体において陽性染色するＤＮＡ挿入剤（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｏｒ）に相関して染色することによって追跡する。アッセイを、正に荷電した部分を有するインタクトでない（固定されていないのみ）細胞、細胞デブリ、アポトーシス小体、脱分極した細胞膜、および透過化した膜を標的とするために使用する。アッセイを、細胞の保存物を固定し、細胞内染色のために透過化した後に、正に荷電した部分を染色することによってインタクトな（固定されたおよび透過化した）細胞を標的とするために使用する。染料での染色（他の染料と組み合わせて）を、生体異物で処理したインビトロ培養物、初代細胞、およびサンプルに対して行い、フローサイトメトリーを使用して分析する。

増殖
細胞増殖を、核酸および細胞周期関連タンパク質を含む全ての細胞および細胞体において陽性染色するＤＮＡ挿入剤に相関して染色することによってモニターする。アッセイを、正に荷電した部分を有するインタクトでない（固定されていないのみ）細胞、細胞デブリ、アポトーシス小体、脱分極した細胞膜、および透過化した膜を標的とするために使用する。アッセイを、細胞の保存物を、細胞内染色のために固定し、透過化した後に正に荷電した部分を染色することによって、インタクトな（固定されているおよび透過化されている）細胞を標的とするために使用する。染料での染色（細胞増殖に関するモニタリングマーカー、例えば、Ｋｉ６７、ＢＲＤＵと組み合わせて）を、生体異物で処理したインビトロ培養物、初代細胞、およびサンプルに対して行い、フローサイトメトリーを使用して分析する。

実施例１２：Ｊｕｒｋａｔ細胞の細胞培養
Ｊｕｒｋａｔ細胞（クローンＥ６−１；ＡＴＣＣ（登録商標）ＴＩＢ−１５２^ＴＭ）は、末梢血組織中で見出され、急性Ｔ細胞白血病のモデル作製のために使用されるヒトリンパ球である。細胞を、ＲＰＭＩ−１６４０培地、ウシ胎仔血清１０％、０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ、ＰｅｎＳｔｒｅｐおよびＬ−グルタミン中で培養した。

培養物を、１×１０^５生細胞／ｍＬ〜５×１０^６細胞／ｍＬの間で、新鮮な培地を添加するかまたは培地交換によって維持した。あるいは、培養物を、遠心分離と１×１０^５生細胞／ｍＬでのその後の再懸濁とによって確立した。新鮮な培地を、細胞密度に依存して、２〜３日ごとに添加した。

実施例１３：Ｒａｍｏｓ細胞の細胞培養
Ｒａｍｏｓ（ＲＡ １；ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５９６）は、ヒトＢリンパ球であり、バーキットリンパ腫（米国人）のモデル作製のために使用される。細胞を、熱非働化ウシ胎仔血清１０％、０．１ ＨＥＰＥＳ、ＰｅｎＳｔｒｅｐおよびＬ−グルタミンを含むＲＰＭＩ−１６４０培地中で培養した。

培養物を、１×１０^５生細胞／ｍＬ〜５×１０^６細胞／ｍＬの間で新鮮な培地を添加するかまたは培地交換によって維持した。あるいは、培養物を、遠心分離と１×１０^５生細胞／ｍＬでのその後の再懸濁とによって確立した。新鮮な培地を、細胞密度に依存して、２〜３日ごとに添加した。

実施例１４：細胞死を誘発し、死細胞を回収するための一般的手順
培養した細胞を、インビトロで壊死およびアポトーシスへと誘導して、死細胞、細胞デブリ、およびアポトーシス小体を形成した。細胞を、熱ストレスおよび／または代謝ストレスを導入することによって誘導した。熱ストレスを、培養物を５７〜６０℃へと３〜５分間供し、次いで、細胞培養物を氷へと１０分間移すことによって行った。代謝ストレスを、対数増殖期後のクラウディング（ｃｒｏｗｄｉｎｇ）、毒素、または生体異物処理（例えば、１０ｎＭカンプトテシン（ｍａｐｔｏｔｈｅｃｉｎ））によって行った。新鮮な細胞を、培養物を処置に供さないことによって維持した。

細胞調製物を、染色緩衝液中で再懸濁し、次いで、６０〜８０％の間のインタクトな細胞の生存集団（すなわち、フローサイトメトリーパラメーターＦＳＣ対ＳＳＣを使用する形態によって測定される場合、２０〜４０％のインタクトでない細胞デブリ様事象）を標的とするための割合で混合した。細胞生存性を、生存／死滅トリパンブルー排除法によって、またはフローサイトメトリーによる７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）によって顕微鏡で確認した。いくつかの実験では、誘導された／誘導されていない細胞の混合物は、不要であった。代わりに、３０〜４０％壊死細胞およびアポトーシス細胞を含む代謝ストレスを受けている対数増殖期後の培養物を使用した。

実施例１５：Ｊｕｒｋａｔ細胞およびＲａｍｏｓ細胞に関して細胞死を誘導し、死細胞を回収する
対数増殖期中期のＪｕｒｋａｔ細胞およびＲａｍｏｓ細胞または初代ＰＢＭＣ細胞を、死細胞および細胞デブリを形成するために、インビトロで壊死へと誘導した。培養した細胞をまず５８℃に３〜５分間供し、次いで、氷へと１０〜１５分間移すことによって、細胞を熱ストレスによって誘導した。新鮮な細胞を、培養物を処置に供さないことによって維持した。

細胞を、Ｃａ^＋＋／Ｍｇ^＋＋を有する１×ＤＢＳ中に、１０×１０^６細胞／ｍＬの細胞密度で再懸濁した。次いで、新鮮な細胞（約８％壊死）およびストレスを受けた細胞（約２０％壊死）を、以下の比で混合して、生細胞対壊死細胞の測定可能な勾配を生成した：
１． １００％生存：０％死滅
２． ５０％生存：５０％死滅
３． ２５％生存：７５％死滅
４． １２．７５％生存：８５．２５％死滅
５． ６％生存：９４％死滅

予測した生存性は、８〜３０％の範囲であった。出発時および終了時の生存性は、フローサイトメトリーによる７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）によって、またはトリパンブルー排除法によって確認した。

実施例１６：死細胞、壊死細胞、およびアポトーシス細胞とＦ（Ｃ_１０Ｆ）_９およびＦ（Ｃ_１０Ｆ）_９ＳＨ染料との反応
細胞および染料（例えば、バルクのＦ（Ｃ_１０Ｆ）_９またはＨＮＳＡ活性化アミン反応性Ｆ（Ｃ_１０Ｆ）_９ＳＨ（表２を参照のこと））を、９６ウェルＵ底ポリプロピレンプレートの中で一緒に反応させた。染料を、２５〜２００μＬの容積において１５，０００〜０．００１μＭの濃度範囲へと純粋な脱イオン水または滅菌濾過リン酸緩衝化溶液中で連続希釈した。リン酸緩衝化生理食塩水を、アミン反応性染料（すなわち、Ｆ（Ｃ_１０Ｆ）_９ＳＨ）のために使用した。次いで、上記染料溶液を、細胞調製物に適用した。水中で希釈した染料を、細胞に適用する場合、≦２５μＬの試験容積に制限した。細胞密度を、２〜３×１０^６細胞／ｍＬ／試験ウェル（Ｖ_ｆ範囲＝タンパク質および代謝インヒビターを含む１００〜２００μＬの染色緩衝液またはリン酸緩衝化生理食塩水）において維持した。

染料とのインキュベーションの前に、細胞を、完全増殖培地中で２回もしくはこれより多くバルク洗浄し（１５〜５０ｍＬコニカルチューブ）（第１の洗浄）、タンパク質、リン酸緩衝化生理食塩水、および代謝インヒビターを含む洗浄緩衝液中で、２〜３×１０^５個の細胞／試験／洗浄液のｍＬの比でバルク洗浄した（後の洗浄）。大容積の洗浄物を１０分間遠心分離した（ｇ×５００）。Ｆ（Ｃ_１０Ｆ）_９ＳＨを使用した場合、細胞をリン酸緩衝化生理食塩水中で再懸濁し、その後、染料で染色した。

次いで、上記染料混合物を、２３〜２５℃で３０〜４０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を、６００〜８００μＬ／ウェルの添加によって、緩衝液（タンパク質、リン酸緩衝化生理食塩水、および代謝インヒビターを含む）で２回洗浄した。次いで、混合物を５分間遠心分離した（ｇ×３５０）。

図１０ａおよび図１０ｂのデータは、壊死細胞の染色が、使用される染料（例えば、Ｆ（Ｃ_１０Ｆ）_９ＳＨまたはＦ（Ｃ_１０Ｆ）_９）の濃度に関して用量依存性であることを示す。

実施例１７：細胞の健康状態を評価するにあたっての細胞材料のＦ（Ｃ_１０Ｆ）_９染色
リンパ系癌細胞株を、完全増殖培地中で、または密度勾配、磁性細胞ソーティング、もしくはＦＡＣＳによる初代組織および／もしくは血液サンプルからの単離によって調製した。次いで、細胞を、インビトロで壊死およびアポトーシスへと誘導して、熱ストレスもしくは代謝ストレス（ストレスパラメーターについては実施例１４を参照のこと）によって、死細胞、細胞デブリ、およびアポトーシス小体を形成した。新鮮な細胞を、誘導なしによって維持した。

次いで、細胞を、標準的フローサイトメトリー洗浄技術を使用して遠心分離および洗浄したか、またはタンパク質、リン酸緩衝化生理食塩水、および代謝インヒビターを含む染色緩衝液で洗浄した。次いで、Ｆ（Ｃ_１０Ｆ）_９染料溶液を、５０μＭにおいて０．５ｍＬの細胞とともに染色緩衝液の試験ウェルあたり細胞密度２〜３×１０^６細胞／ｍＬにおいてインキュベートした。その混合物を、２０〜２５℃において３０〜４０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を、６００〜８００μＬの洗浄緩衝液（実施例１６に記載される）中で洗浄し、５分間遠心分離した（ｇ×３５０）。

ＤＮＡ挿入剤７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）生存性染色およびヨウ化プロピジウム（ＰＯ−ＰＲＯ（登録商標）−１）を一緒に使用して、マルチカラーの５パラメーターアッセイにおいて壊死細胞およびアポトーシス細胞を同定した。細胞を遠心分離し、洗浄して、過剰な染料を標準的なフローサイトメトリー洗浄技術を使用して除去したか、またはタンパク質、リン酸緩衝化生理食塩水、および代謝インヒビターを含む染色緩衝液で洗浄した。

細胞を、フローサイトメトリーによって獲得し、分析して、細胞調製物中に存在する生細胞、早期アポトーシス小体および後期アポトーシス小体を同定した。これは、５０００個のインタクトな生細胞を標的とし、細胞内デブリ（ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｅｂｒｉｓ）を測定するために十分低いＦＳＣ−Ｌｉｎ閾値を維持することによって達成した。蛍光検出を、フローサイトメトリーによって４８８ｎＭ青色レーザー線において行い、ピーク発光（５２１ｎＭ）を５２５／５０バンドパスフィルタを使用して検出した。

新鮮な培養物と比較した場合、この細胞調製物の染色パターンは、広い蛍光範囲、および７−ＡＡＤで検出されない新鮮な培養物において検出感度を示す。図１１において（すなわち、Ｆ（Ｃ_１０Ｆ）_９ＳＨを使用して）見出される蛍光パターンは、７−ＡＡＤおよびヨウ化プロピジウムによって共染色される場合に、核酸に類似する細胞構造に相関した３．５対数の蛍光という高分離能および広いダイナミックレンジを提供する。細胞の生存力についての詳細な情報は、染料（すなわち、Ｆ（Ｃ_１０Ｆ）_９またはＦ（Ｃ_１０Ｆ）_９ＳＨ）が単独で使用される場合、および上記染料が他の試薬（すなわち、７−ＡＡＤおよびヨウ化プロピジウム）と組み合わせられる場合に抽出され得る。

この調製物を使用して、４つの集団を明らかにする（生細胞［Ｌ］、染料陽性でないアポトーシス細胞［Ａ１］、低〜中程度の明度を有する細胞［Ａ２］、および壊死細胞［Ｄ］；図１２を参照のこと）。この蛍光強度は、膜透過性の等級付けされた状態に相関するはずである勾配を明らかにする。インタクトな細胞が分析から除外される場合、さらなる生細胞／損傷した細胞の詳細なパターンは、形態によってゲート制御される「インタクトな」細胞内に入らないことを明らかにする。

図１３は、新鮮な培養物ならびに集められた事象の２つの異なる培養物および２つの異なる形態解釈の間の生存力状態の高感度検出を示す。

実施例１８：Ｆ（Ｃ_１０Ｆ）_９での細胞の染色
実施例１７において記載される調製物において使用されるＦ（Ｃ_１０Ｆ）_９バルク染料は、実施例１６に記載されるアミン反応性染料に非常によく似て、死細胞を予測外にかつ有利に染色する。これは、溶液中のＦ（Ｃ_１０Ｆ）_９染料が結合するために官能化される必要がないことを示す。代表的な生細胞／死細胞プロトコルに対するこの発見の影響は、タンパク質を含まないインキュベーション緩衝液の必要条件を免除し、死細胞を染色するための使用の容易さを劇的に増大させる。旧来のアミン反応性（すなわち、固定性の）染料は、染色する前に、タンパク質を含まない緩衝液中で細胞を再懸濁する必要がある。

実施例１９：死細胞／アポトーシス細胞のパターンおよび効果
有糸分裂のパターンを、死細胞を分析するにあたって見出した。Ｆ（Ｃ_１０Ｆ）_９を使用して得たフローサイトメトリーデータは、ＤＮＡヒストグラムに似たパターンを示す（図１４ａ〜ｂを参照のこと）。さらに、Ｆ（Ｃ_１０Ｆ）_９染料で染色した細胞は、増殖アーク（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｒｃ）に似たパターンを示す（図１５ａ〜ｂを参照のこと）。これらの知見は、染料がインタクトな細胞でない細胞材料の複数のサイズを結合するが、倍数性の核酸染色パターンの古典的解釈に相関することを示す。染料は、「インタクトでない細胞」を標識するようであるという事実にも拘わらず、それらは、固定されかつ透過化された細胞中のＤＮＡまたはＤＮＡと会合したタンパク質を結合すると推測される。

染料での染色は、複数の染色体を発現し、高二倍体状態にあるＪｕｒｋａｔ細胞を示す（図１４ａ〜ｂ）。染料で染色したＪｕｒｋａｔ細胞材料およびＲａｍｏｓ細胞材料は、増殖の古典的パターンに相関する（図１５ａ〜ｂ）。

本明細書において言及される米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許刊行物の全ては、米国仮特許出願第６２／１５９，７７１号（２０１５年５月１１日出願）を含め、本記載と矛盾しない程度までそれらの全体において本明細書に参考として援用される。

前述から、本発明の具体的実施形態が例証目的のために本明細書で記載されてきたものの、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、種々の改変がなされ得ることは認識される。よって、本発明は、添付の特許請求の範囲による場合を除いて限定されない。

Claims (48)

1. 以下の構造（Ｉ）：
   

   

   を有する化合物、またはその立体異性体、塩もしくは互変異性体であって、ここで：
   Ｍは、各存在において、独立して、２個もしくはこれより多くの炭素−炭素二重結合および少なくとも１の共役度を含む部分であり；
   Ｌ^１、Ｌ^２およびＬ^３は、各存在において、独立して、選択肢的なアルキレン、アルケニレン、アルキニレン、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニレン、ヘテロアルキニレンまたはヘテロ芳香族リンカーであり；
   Ｌ^４は、各存在において、独立して、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニレンまたはヘテロアルキニレンリンカーであり；
   Ｒ^１は、各存在において、独立して、Ｈ、アルキルまたはアルコキシであり；
   Ｒ^２およびＲ^３は、各々独立して、Ｈ、ＯＨ、ＳＨ、アルキル、アルコキシ、アルキルエーテル、−ＯＰ（＝Ｒ_ａ）（Ｒ_ｂ）Ｒ_ｃ、Ｑ、Ｑへの共有結合を含むリンカー、分析物分子への共有結合を含むリンカー、固体支持体への共有結合を含むリンカーまたは構造（Ｉ）のさらなる化合物への共有結合を含むリンカーであり、ここで：Ｒ_ａは、ＯまたはＳであり；Ｒ_ｂは、ＯＨ、ＳＨ、Ｏ⁻、Ｓ⁻、ＯＲ^ｄまたはＳＲ^ｄであり；Ｒ_ｃは、ＯＨ、ＳＨ、Ｏ⁻、Ｓ⁻、ＯＲ^ｄ、ＳＲ^ｄ、アルキル、アルコキシ、アルキルエーテル、アルコキシアルキルエーテル、ホスフェート、チオホスフェート、ホスホアルキル、チオホスホアルキル、ホスホアルキルエーテルまたはチオホスホアルキルエーテルであり；
   Ｒ^４は、各存在において、独立して、ＯＨ、ＳＨ、Ｏ⁻、Ｓ⁻、ＯＲ^ｄまたはＳＲ^ｄであり；
   Ｒ^５は、各存在において、独立して、オキソ、チオキソまたは非存在であり；
   Ｑは、各存在において、独立して、分析物分子、固体支持体または相補的反応性基Ｑ′との共有結合を形成できる反応性基を含む部分であり；
   Ｒ^ｄは、カチオンであり；
   ｍは、各存在において、独立して、０またはこれより大きな整数であるが、ただしｍの少なくとも１個の存在は、３またはこれより大きな整数であり；そして
   ｎは、１またはこれより大きな整数である、
   化合物、またはその立体異性体、塩もしくは互変異性体。
2. 前記化合物は、以下の構造（ＩＡ）：
   

   

   を有し、ここでｘ^１、ｘ^２およびｘ^３は、各存在において、独立して、０〜６の整数である、請求項１に記載の化合物。
3. Ｌ^４は、各存在において、独立して、Ｃ_１−Ｃ_６アルキレンまたはＣ_２−Ｃ_６アルキニレンである、請求項１〜２のいずれか１項に記載の化合物。
4. 前記化合物は、以下の構造（ＩＢ）：
   

   

   を有し、ここで：
   ｘ^１、ｘ^２およびｘ^３は、各存在において、独立して、０〜６の整数であり；そして
   ｙは、１〜６の整数である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物。
5. ｙは、２である、請求項４に記載の化合物。
6. ｘ^１、ｘ^２およびｘ^３は、各存在において各々１である、請求項２〜５のいずれか１項に記載の化合物。
7. ｘ^２は、０であり、ｘ^３は、各存在において１である、請求項２〜５のいずれか１項に記載の化合物。
8. Ｒ^４は、各存在において、独立して、ＯＨ、Ｏ⁻またはＯＲ^ｄである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の化合物。
9. Ｒ^５は、各存在において、オキソである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の化合物。
10. 前記化合物は、以下の構造（ＩＢ′）または（ＩＢ′′）：
    

    

    

    のうちの一方を有する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の化合物。
11. Ｒ^１は、Ｈである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の化合物。
12. Ｒ^２およびＲ^３は、各々独立して、ＯＨまたは−ＯＰ（＝Ｒ_ａ）（Ｒ_ｂ）Ｒ_ｃである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の化合物。
13. Ｒ^２またはＲ^３のうちの一方は、ＯＨまたは−ＯＰ（＝Ｒ_ａ）（Ｒ_ｂ）Ｒ_ｃであり、Ｒ^２またはＲ^３のうちの他方は、ＱまたはＱへの共有結合を含むリンカーである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の化合物。
14. Ｑは、求核性反応性基、求電子性反応性基または環化付加反応性基を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の化合物。
15. Ｑは、スルフヒドリル、ジスルフィド、活性化エステル、イソチオシアネート、アジド、アルキン、アルケン、ジエン、ジエノフィル、酸ハライド、スルホニルハライド、ホスフィン、α−ハロアミド、ビオチン、アミノまたはマレイミド官能基を含む、請求項１４に記載の化合物。
16. 前記活性化エステルは、Ｎ−スクシンイミドエステル、イミドエステルまたはポリフルオロフェニルエステルである、請求項１５に記載の化合物。
17. 前記アルキンは、アルキルアジドまたはアシルアジドである、請求項１５に記載の化合物。
18. Ｑは、表１から選択される部分を含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の化合物。
19. Ｒ^２またはＲ^３のうちの一方は、ＯＨまたは−ＯＰ（＝Ｒ_ａ）（Ｒ_ｂ）Ｒ_ｃであり、Ｒ^２またはＲ^３のうちの他方は、分析物分子への共有結合を含むリンカーまたは固体支持体への共有結合を含むリンカーである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の化合物。
20. 前記分析物分子は、核酸、アミノ酸またはこれらのポリマーである、請求項１９に記載の化合物。
21. 前記分析物分子は、酵素、レセプター、レセプターリガンド、抗体、糖タンパク質、アプタマーまたはプリオンである、請求項１９〜２０のいずれか１項に記載の化合物。
22. 前記固体支持体は、ポリマービーズまたは非ポリマービーズである、請求項１９に記載の化合物。
23. ｍは、各存在において、独立して、３〜１０の整数である、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の化合物。
24. ｍは、各存在において、独立して、７〜９の整数である、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の化合物。
25. ｎは、１〜１００の整数である、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の化合物。
26. ｎは、１〜１０の整数である、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の化合物。
27. Ｍは、各存在において、独立して、４個もしくはこれより多くのアリールもしくはヘテロアリール環、またはこれらの組み合わせを含む部分である、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の化合物。
28. Ｍは、各存在において、独立して、蛍光性または有色である、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の化合物。
29. Ｍは、蛍光性である、請求項２８に記載の化合物。
30. Ｍは、各存在において、独立して、少なくとも４個の縮合環を含む縮合多環式アリール部分を含む、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の化合物。
31. Ｍは、各存在において、独立して、ジメチルアミノスチルベン、キナクリドン、フルオロフェニル−ジメチル−ＢＯＤＩＰＹ、ｈｉｓ−フルオロフェニル−ＢＯＤＩＰＹ、アクリジン、テリレン、セキシフェニル、ポルフィリン、ベンゾピレン、（フルオロフェニル−ジメチル−ジフルオロボラ−ジアザ−インダセン）フェニル、（ビス−フルオロフェニル−ジフルオロボラ−ジアザ−インダセン）フェニル、クアテルフェニル、ビ−ベンゾチアゾール、ター−ベンゾチアゾール、ビ−ナフチル、ビ−アントラシル、スクアライン、スクアリリウム、９，１０−エチニルアントラセンまたはター−ナフチル部分である、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の化合物。
32. Ｍは、各存在において、独立して、ｐ−ターフェニル、ペリレン、アゾベンゼン、フェナジン、フェナントロリン、アクリジン、チオキサントレン、クリセン、ルブレン、コロネン、シアニン、ペリレンイミド、もしくはペリレンアミドまたはその誘導体である、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の化合物。
33. Ｍは、各存在において、独立して、クマリン染料、レゾルフィン染料、ジピロメテンボロンジフルオリド染料、ルテニウムビピリジル染料、エネルギー移動染料、チアゾールオレンジ染料、ポリメチンまたはＮ−アリール−１，８−ナフタルイミド染料である、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の化合物。
34. Ｍは、各存在において、独立して、ピレン、ペリレン、ペリレンモノイミドもしくは６−ＦＡＭまたはその誘導体である、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の化合物。
35. Ｍは、各存在において、独立して、以下の構造：
    

    

    のうちの１つを有する、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の化合物。
36. 表２から選択される化合物。
37. サンプルを染色するための方法であって、該方法は、該サンプルに、請求項１〜３６のいずれか１項に記載の化合物を、該サンプルが適切な波長で照射される場合に光学的応答を生じるために十分な量で添加する工程を包含する方法。
38. 前記光学的応答は、蛍光応答である、請求項３７に記載の方法。
39. 前記サンプルは、細胞を含む、請求項３７〜３８のいずれか１項に記載の方法。
40. 前記細胞をフローサイトメトリーによって観察する工程をさらに包含する、請求項３９に記載の方法。
41. 前記蛍光応答を、検出可能に異なる光学的特性を有する第２の発蛍光団の蛍光応答から区別する工程をさらに包含する、請求項３８に記載の方法。
42. 分析物分子を視覚的に検出するための方法であって、該方法は、
    （ａ）Ｒ^２またはＲ^３は、該分析物分子への共有結合を含むリンカーである請求項１のいずれかの化合物を提供する工程；および
    （ｂ）該化合物をその視覚的特性によって検出する工程、
    を包含する方法。
43. 分析物分子を視覚的に検出するための方法であって、該方法は、
    （ａ）Ｒ^２またはＲ^３は、ＱまたはＱへの共有結合を含むリンカーである請求項１に記載の化合物と、該分析物分子とを混合する工程；
    （ｂ）該化合物および該分析物分子の結合体を形成する工程；ならびに
    （ｃ）該共役をその視覚的特性によって検出する工程、
    を包含する方法。
44. 請求項１〜３６のいずれか１項に記載の化合物および１もしくはこれより多くの分析物分子を含む、組成物。
45. 前記１もしくはこれより多くの分析物分子の検出のための分析方法における請求項４４に記載の組成物の使用。
46. サンプル中の死細胞の存在を決定するための方法であって、該方法は、該サンプルと請求項１〜３６のいずれか１項に記載の化合物とを接触させ、それによって、該化合物と該死細胞とを結合または会合させる工程、および該死細胞と結合または会合した該化合物からの蛍光シグナルを観察する工程、を包含する方法。
47. 前記死細胞と結合または会合した前記化合物を観察するために、フローサイトメトリーの使用をさらに包含する、請求項４６に記載の方法。
48. Ｒ^２およびＲ^３は、各々独立して、ＯＨまたは−ＯＰ（＝Ｒ_ａ）（Ｒ_ｂ）Ｒ_ｃである、請求項４６または４７のいずれか１項に記載の方法。

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