JP2018515105A - アフコシル化タンパク質、前記タンパク質を発現する細胞、及び関連する方法 - Google Patents
アフコシル化タンパク質、前記タンパク質を発現する細胞、及び関連する方法 Download PDFInfo
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- C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
- C12Y204/01068—Glycoprotein 6-alpha-L-fucosyltransferase (2.4.1.68), i.e. FUT8
Abstract
Description
真核生物におけるグリコシル化は、最も一般的な共有結合性の翻訳後タンパク質修飾機構として、数十年にわたり集中的に試験されてきた。ヒトトランスクリプトーム(約250〜500個の糖鎖遺伝子)の約1〜2%が、グリコシル化に関与するタンパク質を翻訳するものと予測されている(Campbell及びYarema、2005年)。細胞タンパク質のグリコシル化は、多くの生物学的機能、例えばタンパク質フォールディング、安定性、細胞内及び細胞間の輸送、細胞−細胞相互作用及び細胞マトリックス相互作用等において重要な役割を演じている。
したがって、本開示は、抗体依存性細胞媒介性細胞障害(ADCC)に関与する抗体をコードする遺伝子を含む細胞、並びに配列番号11及び配列番号13、又はその組合せからなる群より選択されるCRISPRのDNA結合ドメインを含むベクター;フコースノックアウト細胞を得る方法であって、CRISPRヌクレアーゼ構築物を細胞にトランスフェクトして、フコースノックアウト細胞を得るステップを含む上記方法;アフコシル化タンパク質を得る方法であって、上記のような方法により得られたフコースノックアウト細胞が発現したタンパク質を得るステップを含む上記方法;アフコシル化タンパク質;任意選択的に薬学的に許容される添加剤と共に、上記のようなタンパク質を含む組成物;がん、自己免疫障害、ウイルス感染性疾患、細菌感染性疾患、炎症、及び腫瘍、又はその組合せからなる群より選択される障害の管理における使用のための上記のようなアフコシル化タンパク質;並びにがん、自己免疫障害、ウイルス感染性疾患、細菌感染性疾患、炎症、及び腫瘍、又はその組合せからなる群より選択される障害を管理する方法であって、上記のようなアフコシル化タンパク質を、それを必要としている対象に投与するステップを含む上記方法に関する。
・ベクターのコピー毎に単一の組み込み部位を有すること
・選択マーカーを必要としないこと
が挙げられる。
a)CRISPRヌクレアーゼ構築物のトランスフェクションにより、フコースノックアウト細胞系を得るステップと、
b)フローサイトメトリーアッセイを介して、細胞系のフコースノックアウト状態を確認するステップと、
c)最適化培地及びフィード組成物を使用して、発酵装置中で抗Her2モノクロナール抗体を発現するフコースノックアウト細胞系を増殖させるステップと、
d)フコースノックアウトクローン細胞系から産生された抗Her2モノクロナール抗体を精製するステップと、
e)精製されたアフコシル化抗Her2抗体を分析するステップと
を含む。
・ADCCを介して腫瘍細胞死を標的とする任意のモノクロナール抗体を用いた併用療法、
・二重特異性抗体に基づく療法、
・キメラ抗原受容体(CAR)媒体を用いた、異質遺伝子的NK細胞に基づく療法、
・自己NK細胞移植、
・サイトカイン刺激性NK細胞に基づく療法、及び
・キメラ抗原受容体−T細胞療法による併用療法(CAR−T細胞療法)
で用いられる。
1.タンパク質安定剤:この添加剤は、タンパク質の本来の立体構造を安定化する。例として、ポリオール、糖、アミノ酸、アミン、及び塩析用の塩が挙げられる。スクロース及びトレハロースが、最も頻繁に用いられる糖であり、また大型のポリオールが、小型のポリオールよりも良好な安定剤である。
2.ポリマー及びタンパク質:親水性ポリマー、例えばポリエチレングリコール(PEG)、多糖類、及び不活性タンパク質等が、タンパク質を安定化するのに非限定的に用いられ、またタンパク質の会合を増強する。例として、デキストラン、ヒドロキシルエチルスターチ(HETA)、PEG−4000、及びゼラチンが挙げられる。
3.界面活性剤:非イオン性界面活性剤が、タンパク質の安定化、凝集の抑制、またタンパク質のリフォールディング支援を目的として幅広く用いられる。ポリソルベート80及びポリソルベート20は、それぞれツイーン80及びツイーン20として知られており、mAb治療薬で一般的に用いられる。その他の例として、Brij35、トリトンX−10、プルロニックF127、及びドデシル硫酸ナトリウム(SDS)が挙げられる。
4.アミノ酸:この添加剤は、様々な機構によりタンパク質を安定化させる。例としてヒスチジン、アルギニン、及びグリシンが挙げられる。処方物添加剤として用いられるその他のアミノ酸には、メチオニン、プロリン、リシン、グルタミン酸、及びアルギニン混合物が含まれる。
5.防腐剤:この化合物は、微生物の増殖を防止するために、処方物に含まれる。例として、ベンジルアルコール、m−クレゾール、及びフェノールが挙げられる。
FUT8は、3つのドメイン、すなわちN末端コイルドコイルドメイン、触媒ドメイン、及びC末端SH3ドメインを含む。
フコースノックアウトプラットフォームは、非フコシル化モノクロナール抗体の分子を実現するのに有用である。多くの事例では、完全に非フコシル化された抗体を開発することが好ましい結果であり、したがって、フコース生合成経路遺伝子の完全ノックアウトを生み出す戦略が、本開示において策定される。
1.乳がん患者の早期段階における治療選択肢−アフコシル化抗Her2抗体産物は、低レベルの腫瘍抗原、この場合Her2抗原を発現する腫瘍を有するがん患者で使用可能である。
2.低用量の薬物を用いた治療選択肢−アフコシル化抗Her2抗体産物は、乳がん患者を有効に治療するために、低用量で使用可能である。
3.この薬物による有害な副作用がより少ない治療選択肢−アフコシル化抗Her2抗体産物では、乳がん患者を有効に治療するのに必要とされる用量はより少なく、したがって生成する有害な副作用もより少ない。
4.この薬物による免疫原性効果がより小さい治療選択肢−アフコシル化抗Her2抗体産物は、グリカン鎖にフコースを一切有しない点を除き、アフコシル化抗Her2抗体産物は、イノベータートラスツズマブ産物と構造的に厳密に類似する。アフコシル化抗Her2抗体産物は、より低用量で使用可能であり、したがって産物が引き起こす免疫原性は低い。
5.治療コストが低い治療選択肢−アフコシル化抗Her2抗体産物による治療が必要とする用量は、トラスツズマブと比較してはるかに少ない。したがって、この産物は、患者一人当たりの治療コスト削減を実現する。
Advanced DMEM完全増殖培地−500ml
1.50ml FBS(終濃度10%)を500mlフィルターユニットの上部チャンバーに添加する。
2.10mlの200mMグルタミン(終濃度4mM)を添加する。
3.5mlの100X Pen−strep溶液(終濃度1X)を添加する。
4.容積をadvanced DMEM培地で500mlにする。
5.完全培地を、0.22μmフィルターに通し濾過する。
6.上部チャンバーを解体し、リザーバー又は培地ビンを閉める。
7.培地は調製の30日以内に使用できる。
8.培地は2℃〜8℃に保存し、連続的な感光を避ける。
9.LCA選択培地を調製する場合、10mlの10mg/mlストックLCA試薬を500mlの調製したDMEM培地と混合し、DMEM培地中終濃度200μg/mlのLCAにする。
1.パワーCHO−2CD完全増殖培地−500mlを採取する。
2.10mlの200mMグルタミン(終濃度4mM)を、500mlフィルターユニットの上部チャンバーに添加する。
3.5mlの100×Pen−strep溶液(終濃度1×)を添加する。
4.容積をパワーCHO−2CD培地で500mlにする。
5.完全培地を0.22μmフィルターを通し濾過する。
6.上部チャンバーを解体し、リザーバー又は培地ビンを閉める。
7.培地は調製の30日以内に使用できる。
8.培地は2℃〜8℃に保存し、連続的な感光を避ける。
1.バイオセイフティーキャビネット
2.Sorvall ST 16R遠心分離機
3.ウォーターバス
4.倒立位相差顕微鏡
5.Millipore GUAVA 8HT easyCyteベンチトップフローサイトメーター
6.Vi−cell XR生死細胞オートアナライザー
7.血球計算盤
8.冷蔵庫
9.Eppendorf minispin遠心分離機
10.マイクロピペット
11.マイクロチップ
12.96ウェル組織培養プレート
13.12ウェル組織培養プレート
14.6ウェル組織培養プレート
15.Serologicalピペット(10ml、25ml、及び50ml)
16.1000ml濾過ユニット−孔径0.22μm
17.70%エタノール
18.Advanced DMEM
19.DPBS
20.ウシ胎仔血清
21.Penstrep
22.グルタミン
23.0.05%トリプシンEDTA
24.0.4%トリパンブルー
25.マイクロチューブ(1.5ml及び2ml)
26.ファルコンチューブ(15ml及び50ml)
27.ウシ血清アルブミン画分V
28.フルオレセインレンズマメアグルチニン(LCA−FITC)
29.フルオレセインストレプトアビジン(Strep−FITC)
CRISPR/Cas構築物の設計
本実施例の目的は、FUT8対立遺伝子の特異的な不活性化のためのCRISPR/Cas複合体を設計することである。
CRISPRは、化膿性連鎖球菌において見出された微生物の適応免疫系由来のCas9として公知のRNA誘導型エンドヌクレアーゼのクラスに基づく。Cas9ヌクレアーゼはガイドRNA(gRNA)によってゲノム上の特異的部位へと導かれる。Cas9/gRNA複合体は、編集する必要がある特異的遺伝子上の3bpのプロトスペーサー活性化モチーフ(PAM)NGG又はNAGが続く20bpの標的配列に結合する(Jinek、2012年;Mali、2013年)。したがって、この全複合体の結合は二本鎖切断(DSB)を生成する。
CAGGTTGCTGCTCTGGCTTAGGCCATCTATGACCCTGGTGGTGTTTTCATTCACTATAAGTCCTTCCCATCTTTATTAACTGAGCAAGTTCAGctagtaattttagagaccgaggttcaagcaataacacctatctctgcaataccgtgtggctttcttcaatgtcttacatcctaaggaaaggaagCATGTAGAGCCCAGGAAGCACAGGACAAGAAAGCTGCCTCCTTGTATCACCAGGAAGATCTTTTTGTAAGAGTCATCACAGTATACCAGAGAGACTAATTTTGTCTGAAGCATCATGTGTTGAAACAACAGAAACTTATTTTCCTGTGTGGCTAACTAGAACCAGAGTACAATGTTTCCAATTCTTTGAGCTCCGAGAAGACAGAAGGGAGTTGAAACTCTGAAAATGCGGGCATGGACTGGTTCCTGGCGTTGGATTATGCTCATTCTTTTTGCCTGGGGGACCTTATTGTTTTATATAGGTGGTCATTTGGTTCGAGATAATGACCACCCTGACCATTCTAGCAGAGAACTCTCCAAGATTCTTGCAAAGCTGGAGCGCTTAAAACAACAAAATGAAGACTTGAGGAGAATGGCTGAGTCTCTCCGaataccagaaggccctattgatcaggggacagctacaggaagagtccgtgttttagaagaacagcttgttaaggccaaagaacagattgaaaattacaagaaacaagctaggaatgATCTGGGAAAGGATCATGAAATCTTAAGGAGGAGGATTGAAAATGGAGCTAAAGAGCTCTGGTTTTTTCTACAAAGTGAATTGAAGAAATTAAAGAAATTAGAAGGAAACGAACTCCAAAGACATGCAGATGAAATTCTTTTGGATTTAGGACATCATGAAAGgtctatcatgacagatctatactacctcagtcaaacagatggagcaggtgagtggcgggaaaaagaagccaaagatctgacagagctggtccagcggagaataacatatctgcagAATCCCAAGGACTGCAGCAAAGCCAGAAAGCTGGTATGTAATATCAACAAAGGCTGTGGCTATGGATGTCAACTCCATCATGTGGTTTACTGCTTCATGATTGCTTATGGCACCCAGCGAACACTCATCTTGGAATCTCAGAATTGGCGCTATGCTACTGGAGGATGGGAGACTGTGTTTAGACCTGTAAGTGAGACATGCACAGACAGGTCTGGCCTCTCCACTGGACACTGGTCAGgtgaagtgaaggacaaaaatgttcaagtggtcgagctccccattgtagacagcctccatcctcgtcctccttacttacccttggctgtaccagaagaccttgcagatcgactcctgagagtccatggtgatcctgcagtgtggtgggtatcccagtttgtcaaatacttgatccgtccacaaccttggctggaaagggaaatagaagaaaccaccaagaagcttggcttcaaacatccagttattggAGTCCATGTCAGACGCACTGACAAAGTGGGAACAGAAGCAGCCTTCCATCCCATTGAGGAATACATGGTACACGTTGAAGAACATTTTCAGCTTCTCGAACGCAGAATGAAAGTGGATAAAAAAAGAGTGTATCTGGCCACTGATGACCCTTCTTTGTTAAAGGAGGCAAAGACAAAgtactccaattatgaatttattagtgataactctatttcttggtcagctggactacacaaccgatacacagaaaattcacttcggggcgtgatcctggatatacactttctctcccaggctgacttccttgtgtgtactttttcatcccagGTCTGTAGGGTTGCTTATGAAATCATGCAAACACTGCATCCTGATGCCTCTGCAAACTTCCATTCTTTAGATGACATCTACTATTTTGGAGGCCAAAATGCCCACAACCAGATTGCAGTTTATCCTCACCAACCTCGAACTAAAGAGGAAATCCCCATGGAACCTGGAGATATCATTGGTGTGGCTGGAAACCATTGGAATGGTTACTCTAAAGGTGTCAACAGAAAACTAGGAAAAACAGGCCTGTACCCTTCCTACAAAGTCCGAGAGAAGATAGAAACAGTCAAATACCCTACATATCCTGAAGCTGAAAAATAGAGATGGAGTGTAAGAGATTAACAACAGAATTTAGTTCAGACCATCTCAGCCAAGCAGAAGACCCAGACTAACATATGGTTCATTGACAGACATGCTCCGCACCAAGAGCAAGTGGGAACCCTCAGATGCTGCACTGGTGGAACGCCTCTTTGTGAAGGGCTGCTGTGCCCTCAAGCCCATGCACAGTAAAATAATGTACTCACACATAACATACAAATGGATTATTTTCTACTTTGCCCTTTAAATATTCTGTCCCCATGAAACAAACACTGCCACATTATGTAATTTAAGTGACACAGACGTTTTGTGTGAGACTTCAAACATGGTGCCTATATCTGAGAGACCTCTGTGATTTACTGAGAAGATGAGAACAGCTCCCTTCTGTGGGGAAGTTGGTTCTTAGTCAGTGGTGGACTGGCCACTGAATTCACTGCAATCAACAGATTCAGAATGAGAATGGATGTTTTTCCTTTATATGGTTGTCTGGATTTTTTTTAAAGTAATTTCATCAGTTCAGTTCATCCACCTCATTAATAAATGAAGGAATATACCAATAAAATCAAATGAAATATTCACTGTCCATTAGGAAGTTTTATAAAACAATGCCATGAACAAAAAATTCTTTAGTACTCAATGTTTCTGGACATTCTCTTTGATAACAAAAATAAATTTTAAAAAGGAATTTTGTAAAGTTTCTGGGATTCTGTATCACTGGATGATGTAGTTATAAGCTTTGTAGTAGAAATATGGGAAGTGGGTTTATAGCTTTTAAGATTTTTTTCTACTTTTGTCCTACTTTTTCTATTTCTGATAGAATAATCATATTTCAAGAGAAGCATTGGTCCCCTCTAATACTAGTAACTGCCTTTAGTCATGCATATTATATGAAGTTGCTAAGAACACGCTTTGGGGGAGGTGTTCACTCTCTTAGTTTGATATTGTTGACTTGATATAATTGAATGAAATAGTCATTCTCTTGCTTCCAG
選択的エクソンは大文字及び小文字で表す。
AATCCCAAGGACTGCAGCAAAGCCAGAAAGCTGGTATGTAATATCAACAAAGGCTGTGGCTATGGATGTCAACTCCATCATGTGGTTTACTGCTTCATGATTGCTTATGGCACCCAGCGAACACTCATCTTGGAATCTCAGAATTGGCGCTATGCTACTGGAGGATGGGAGACTGTGTTTAGACCTGTAAGTGAGACATGCACAGACAGGTCTGGCCTCTCCACTGGACACTGGTCAG
Fut8遺伝子のエクソン7において、以下に示す配列はCRISPR−Cas複合体への結合に使用される。
AATTGGCGCTATGCTACTGGAGG
AAUUGGCGCUAUGCUACUGGAGG
CCAGCGAACACTCATCTTGGAAT
CCAGCGAACACUCAUCUUGGAAU
ATTCCAAGATGAGTGTTCGC
AUUCCAAGAUGAGUGUUCGC
AATTGGCGCTATGCTACTGG
AAUUGGCGCUAUGCUACUGG
2つの成分が細胞又は生物に導入及び/又は発現して、CRISPRに基づくゲノム編集を実行しなければならない:Cas9ヌクレアーゼ;及び「ガイドRNA」(gRNA)。
a)Cas9−化膿性連鎖球菌のCRISPRシステムの成分として最初に発見され、哺乳動物細胞での利用に適用されてきたヌクレアーゼである。RNA誘導型Cas9ヌクレアーゼは、高い効率で哺乳動物細胞の内因性ゲノム座位に正確な二本鎖切断を効果的に導入することができる。
b)Cas9−D10A−Cas9ヌクレアーゼのD10A突然変異体(Cas9n)は一本鎖にニックを入れ、標的ゲノム座位の逆鎖に相補的な一対のオフセットガイドRNAと組み合わせる。これは、野生型Cas9に見られる非特異的な活性を減らすのに役立つ。
c)キメラgRNA足場−キメラガイドRNA(gRNA)足場は、20個のヌクレオチドの標的特異的な相補性領域、42個のヌクレオチドのCas9結合RNA構造、及びゲノム改変のための標的部位へCas9ヌクレアーゼを導く、化膿性連鎖球菌(S. pyogenes)由来の40個のヌクレオチドの転写ターミネーターからなる。この場合、2つのgRNA足場があり、それぞれ各gRNA用である。
d)カナマイシン−r−それによりミスコードを引き起こすリボソーム転位を阻害する有効な抗細菌剤である。カナマイシン耐性をコードする遺伝子はネオマイシンリン酸転移酵素II(NPT II/Neo)である。カナマイシン耐性遺伝子を含有するプラスミドでトランスフォームした大腸菌は、25μg/mlのカナマイシンを含有する培地で増殖することができる。
e)P_CMV−CMVプロモーターは、構成的な哺乳動物プロモーターであり、様々な細胞システムで強い発現を媒介する。
f)P_hU6.1−RNA発現のためのヒトAタイプ3コアプロモーター。
1.CRISPR標的の設計。
2.ベクター骨格を有するベクター構築物、すなわちgRNAインサートを有するpD1401ベクター。
3.CRISPR構築物pD1401(gRNA514〜553)による、大腸菌コンピテントセル(DH10B又はDH5アルファ)のトランスフォーメーション、及びカナマイシンを補足したLB(Luria Bertani)−アガーへのプレーティング。
4.カナマイシンを含むLBブロス中へのトランスフォームした細胞(CRISPR構築物を含む)の接種。
5.DH10B又はDH5アルファ細胞からのプラスミドDNA pD1401(gRNA514〜553)の単離。
6.CHO−S細胞のトランスフェクション;LCAアッセイによるスクリーニング及び選択。
7.QIAGEN DNeasy Blood&Tissue Kitを使用する選択したクローンのゲノムDNA単離。
8.分光光度法による定量。
9.PCR条件の最適化。
10.PCRによるゲノムDNA試料のクロスチェック。
11.アガロースゲルでの電気泳動。
12.Phusionポリメラーゼを使用するPCR増幅及びTaqポリメラーゼを使用するテーリング。
13.QIAGENキットを使用するPCR産物のゲル溶出。
14.pTZ57R/Tベクターを使用するTAクローニング。
15.DH10B又はDH5アルファ細胞のライゲートした試料pTZ57R/T+CRISPR(PCR)によるトランスフォーメーション。
16.アンピシリンブロスを含むLBへのトランスフォームした細胞(pTZ57R/T+CRISPR(PCR))の接種。
17.QIAGENプラスミドDNA単離キットを使用するDH5アルファ及びDH10B細胞からのプラスミドDNA(pTZ57R/T+CRISPR(PCR))の単離。
18.制限酵素消化によるインサートの存在のクロスチェック。
19.配列決定プライマー;及び
20.配列決定によるINDELの確認。
高力価の抗Her2抗体を発現するCHO−S細胞系
モノクロナール抗体産物は、任意の技術を使用して、任意のチャイニーズハムスター卵巣細胞系において産生可能である。そのような技術の例として、GPEx(商標)、UCOE(商標)、SURE(商標)技術、Light Path(商標)技術、及びその他の多くの技術が挙げられるが、これらに限定されない。この特定の例では、抗Her2抗体遺伝子が、GPEx技術を利用してチャイニーズハムスター卵巣(CHO−S)細胞系内で発現される。GPEx(登録商標)は、標的細胞を100%トランスフェクトする非常に効率的なレトロウイルスベクターに基づく。GPEx(登録商標)の長所として、
・ベクターのコピー毎に単一の組み込み部位を有すること
・選択マーカーを必要としないこと
が挙げられる。
MGWSCIILFLVATATGVHSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.
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CRISPR構築物による細胞のトランスフェクション
本実施例は、抗Her2抗体を過剰発現するCHO S細胞系のトランスフェクションの手順を含む。これまでの節に記載されている、FUT8遺伝子を標的とするCRISPR/Cas構築物を、CHO S細胞系にトランスフェクトする。また、本実施例は、CRISPR/Cas技術を使用して、抗Her2抗体を過剰発現するFUT8ノックアウトCHO−S細胞系を開発するために、単一細胞の安定な細胞系を選択及び確認する方法、並びにフローサイトメトリーに基づく機能アッセイにより陽性クローンを選択する方法について記載する。
本実施例は、CRISPR構築物による抗Her2抗体を過剰発現するCHO−S細胞系のトランスフェクションの手順を含む。0.5μg〜5μgの範囲のDNA濃度を、様々なインキュベーション時間、例えば4時間、24時間、及び48時間について試験する。リポソーム及び修飾リポソーム媒介型トランスフェクション試薬は、例えばLipofectamine2000、Lipofectamine3000、PlusTM試薬とLipofectamineLTX、MIRUS TransIT X2、MIRUS TransIT 2020、MIRUS TransIT 293、MIRUS TransIT CHOトランスフェクションキットについて試験する。複数のDNA対トランスフェクション試薬の比(μg:μl)も試験する。最適なトランスフェクション効率は、1:5のDNA対トランスフェクション試薬の比、24時間のインキュベーション、及びPlusTM試薬とLipofectamineLTXを使用して達成される。最適化実験は、RFP発現プラスミドDNAで実施した。
トランスフェクション効率=(RFP発現細胞の数/全細胞数)*100
CHO−S細胞は、90%より高い生存率、6ウェル組織培養プレート中2×106個の細胞/ウェルの密度で播種し、24時間接着させる。Plus(商標)試薬と共にLipofectamineLTXを使用して、pD1401(gRNA 514〜553)CRISPR Cas構築物をトランスフェクトする。10μgの構築物を1:5のDNA対トランスフェクション試薬の比で使用する。細胞を、トランスフェクション後20〜24時間インキュベートする。トランスフェクションの前に、DNAの量及び質を紫外分光光度法によって概算する。A260/280値DNAは、質及びタンパク質の夾雑を表す。260nm及び280nmでの吸光度の比を使用して、DNAの純度を評価する。A260/280>1.8は通常「純粋」又は質の良いDNAとして許容される。3〜4μlのDNA試料をマイクロキュベット上に置き、DNA濃度をEppendorf Biophotometer D30を使用して、好適な対照に対して概算する。
段階希釈及びプレーティング:
細胞は、クローニングする1日前に、0.25×106個の細胞/mlの密度に分裂させる。細胞数をVicell XR自動細胞カウンターにより数え、プレーティング当日に生存率が90%を超えるように保証する。細胞懸濁液を段階的に希釈して、細胞密度を1細胞/ウェルとする。各ステップにおいて、1:10の比で希釈を行う。未処理96ウェル丸底プレート中の、10%FBS、4mMグルタミン、1×PenStrep、及び1×Clona Cell CHO ACF(動物成分を含まない)が補充されたパワーCHO 2CD培地内に、細胞を100μl/ウェルでプレーティングする。プレートを倒立位相差顕微鏡下でスキャンして単一細胞を同定する。単一細胞を含有するウェルを目視で確認し、更にモニターするためにマークする。細胞2個及び細胞6個を含有するウェルもマークし、増幅用として保存する。プレートを5%CO2インキュベーター中、37℃、相対湿度75%で、10〜15日間インキュベートする。
10〜15日後、96ウェルプレートの1ウェルから24ウェルプレートの1ウェルへと、培養容積1ml中でクローンを増幅する。増幅で用いられる培地は、10%FBS、4mMグルタミン、及び1×PenStrepを含むパワーCHO2 CDである。24ウェルプレートを、5%CO2インキュベーター中、37℃、75%相対湿度で2〜3日間インキュベートする。
次いで、クローン及びミニプールを、24ウェルプレートの1ウェルから6ウェルプレートの1ウェルへと、培養容積3ml中で増幅する。6ウェルプレートを5%CO2インキュベーター中、37℃、75%相対湿度で4〜5日間インキュベートする。増幅で用いられる培地は、4mMグルタミン及び1×PenStrepを含むパワーCHO2 CDである。このステップ以降、FBSフリー培地を増幅用として使用する。
それぞれのクローンのLCA−FITC結合プロファイルを決定し、2つの細胞6個のミニプール(CR2TMCHO 6A、CR2TMCHO 6B)、及び2つの単一細胞クローン(CR2TMCHO 1A、CR2TMCHO 1B)を、更なる試験用として選択する。LCA−FITC結合アッセイの詳細は、以下の節に記載されている。
クローン及びミニプールを、平底125mlエルレンマイヤー振盪フラスコ中で、培養容積10mlに更に増幅する。フラスコを5%CO2インキュベーターシェイカー中、37℃、120rpm、75%相対湿度で4〜5日間インキュベートする。その後、クローンを、125mlエルレンマイヤー振盪フラスコ中で、培養容積30mlまで増幅し、5%CO2インキュベーターシェイカー中、37℃、120rpm、75%相対湿度で、4〜5日間インキュベートする。パワーCHO2 CD培地は、4mMグルタミン及び1×PenStrep溶液と共に増幅するのに使用する。最終的に、細胞数、生存率、及びLCA−FITC結合プロファイルを決定する。細胞上清を1400rpmで4分間遠心分離して回収し、プロテインA精製用及び更なる特徴付け用として使用する。リサーチセルバンクを調製し、確立されたプロトコールに従い凍結保存する。
LCA−FITC(レンズマメアグルチン−フルオレセインイソチオシアネート)結合アッセイ
フルオレセインイソチオシアネート(FITC)はLCAにコンジュゲートする蛍光色素である。したがって、対照のCHO S細胞の細胞膜上のフコシル化タンパク質の存在は、フルオレセインコンジュゲートLCAによって認識される。これらの細胞は、特定のフローサイトメーターチャネルでより明るい蛍光を発する。観察される蛍光は、蛍光単位として表す。フコース経路が破壊された細胞、ノックアウト系は、フコシル化細胞タンパク質を産生することができず、したがって細胞膜タンパク質はフコシル化されていない。これらの細胞をフルオレセイン−LCAコンジュゲートで試験すると、バックグラウンドと同等の蛍光をもたらす。したがって、フコースノックアウト細胞は、対照のCHO S細胞系と比較してより低いレベルの蛍光を発する。
図5A及び5Bは、抗Her2抗体を過剰発現し、FUT8遺伝子を標的とするCRISPR/CasシステムをトランスフェクトしたCHO S細胞に観察された蛍光シフトを示す。蛍光シフトは、抗Her2抗体を過剰発現するCHO S細胞におけるFUT8遺伝子ノックアウト表現型の成功を示す。試料CR2TMCHO 1A及びCR2TMCHO 1Bは、FUT8遺伝子を標的とするCRISPR/Casシステムをトランスフェクトした、抗Her2抗体を過剰発現するCHO S細胞に由来する代表的な単一細胞クローン細胞系を示す。試料CR2TMCHO 6A及びCR2TMCHO 6Bは、FUT8遺伝子を標的とするCRISPR/Casシステムをトランスフェクトした、抗Her2抗体を過剰発現するCHO S細胞に由来する細胞集団から得られた代表的なミニプールを示す。
抗Her2抗体を発現するCHO S細胞系を、CRISPR/Cas構築物でトランスフェクトし、フコースノックアウト表現型について分析する。トランスフェクトした細胞系のプールを、フコースノックアウト表現型の安定性を理解するために、複数回継代した場合について分析する。
FUT8ノックアウトクローンの増殖曲線決定:
0.5X106個の細胞/mlを125mlエルレンマイヤー振盪フラスコ内に播種する。生存細胞の計測は、1、2、3、及び4日目に、Vi−cell XR生死細胞オートアナライザーを使用して実施する。それぞれの増殖曲線を作成し、図7に示す。データより、親CHO S細胞系、及びアフコシル化抗Her2抗体を過剰発現するフコースノックアウトCHO S細胞系の増殖曲線は同等であることが示唆された。親CHO S細胞系についてCRISPR/Casにより媒介されるトランスフォーメーションを行っても、増殖曲線及び生存率プロファイルに影響を及ぼさない。このデータから、CRISPR/Casの設計は、細胞増殖、及びここに記載するトランスフェクトした細胞系内でのモノクロナール抗体産生に影響を及ぼすその他の細胞生物学パラメーターに対して有害効果を有さないことが示唆される。
FUT8遺伝子を標的とするCRISPR/CASシステムをトランスフェクトした、抗Her2抗体を過剰発現するCHO S細胞系のゲノム配列決定分析
機能アッセイ、主にLCA−FITCフローサイトメトリーアッセイによって選択した、CRISPR/CasをトランスフェクトしたCHO S細胞系をゲノム配列分析で使用する。チャイニーズハムスターのFUT8ゲノム座位は文献(NW_003613860)に十分に報告されており、各細胞系クローンにおいて遺伝子改変の型を理解するために野生型配列として使用される。本実施例の目的は、CRISPR/Casシステムをトランスフェクトし、アフコシル化抗Her2抗体産物を発現するCHO S細胞系から得られるゲノムDNA配列決定結果を分析することである。本明細書で報告する全ての細胞系は、クローン細胞系であり、LCA−FITCフローサイトメトリーアッセイから選択される。
A.選択したクローンからのゲノムDNA単離
B.各細胞系の特定のゲノム座位を増幅するPCR戦略
C.配列決定ベクターへのPCR産物のクローニング
D.配列データ分析及びINDELの同定
クローンCHO S細胞系は、振盪フラスコで4mMグルタミン、100ユニット/mlペニシリン及び100μg/mlストレプトマイシンを含むパワーCHO2 CD培地中、制御した条件のインキュベーター内で、5%CO2及び75%相対湿度の存在下、120rpm、37℃で増殖する。細胞の増殖は、毎日観察し、生存率をモニターする。生存率が90%を上回ったときに細胞を回収する。単離の日、細胞集団を遠心分離することにより培養培地を除去する。次いで細胞を10mlのDPBSと混合し、1500rpmで5分間遠心分離する。使用した培地を除去し、細胞ペレットを10ml DPBS中に再懸濁する。細胞は、1500rpmで5分間の遠心分離を使用して再び洗浄する。DPBSを吸引により完全に除去する。最後の細胞ペレットをゲノムDNA単離に使用する。
チャイニーズハムスターのゲノムDNA配列を、一般に利用可能なデータベース配列NW_003613860から分析する。FUT8エクソン7DNA配列及び部分的なイントロン配列を、FUT8標的座位を増幅するPCR戦略を設計するために使用する。
ゲノムPCRは、表7に記載の以下のプライマーを使用するQIAGEN gDNA抽出キットを使用して実施する。
実験を設計し、PCR条件を標準化する。試験したパラメーターは、ゲノムDNA濃度(100ng〜1000ng)、プライマー濃度(2nmole〜20nmole)、PCRアニーリング温度(55.8℃〜62.9℃)、及び時間(20秒〜50秒)、PCR産物の伸長時間(30秒〜60秒)を含み、PCRサイクル数を30サイクルに設定する。到達した最適化条件は以下の節に記載する。
ゲノムDNA PCR産物をアガロースゲル電気泳動で分析し、産物長は分子量標準を使用して確認する。はっきりとした増幅プロファイルを有するPCR試料を、次の処理ステップに使用する。
増幅したPCR産物を、新しく調製した1%アガロースゲルにロードし、100Vで1時間電気泳動して、増幅したPCR産物を、未使用のプライマー及び増幅プロセス中に生成された任意のその他の二量体から分離する。増幅した産物をゲルから切り取り、市販のQiagenゲル溶出キットを使用して溶出する。DNAは、高純度の分子生物学等級の水で溶出する。
アガロースゲルで精製したPCR増幅産物は、次いでDNAライゲーションプロセスによって市販のpTZ57R/Tベクターにクローニングするために使用する。DNAライゲーションの条件は、以前に標準化されている。
ライゲートしたDNAにより、市販の大腸菌DH5アルファ コンピテントセルをトランスフォームする。製造業者によって記載されるトランスフォーメーションプロトコールに従って、高レベルのトランスフォーメーション効率を達成する。トランスフォーメーション後、大腸菌細胞は、トランスフォームしたコロニーの増殖のため、アンピシリン抗生物質の存在下で増殖する。
各別々のコロニーを、5ml培養容積のLB+アンピシリンブロス中に接種し、プラスミドDNA単離のため一晩増殖する。
4.5mlの一晩増殖した培養物を、製造業者のプロトコールに従って、市販のQIAGENプラスミドDNA単離キットを使用するプラスミドDNA単離のために使用する。プラスミドDNAは、高純度の分子生物学等級の水で溶出する。
各プラスミド調製物は、好適な制限酵素消化後、続いてアガロースゲル電気泳動を使用して、インサートの存在を試験する。インサートのサイズは、好適な分子量標準と比較する。
まず、二本鎖DNA鋳型を94℃の高温で変性する。次いで、表7に記載の配列特異的プライマーを標的配列の両側の部位にアニールする(60.4℃)。熱安定性のDNAポリメラーゼ(Phusionポリメラーゼ)によりアニールしたプライマーを伸長し(72℃)、それにより最初のDNA配列の量を倍にする。次いでこの新しく合成された産物は、増幅の続くサイクルの更なる鋳型になる。これらの3ステップを30サイクル反復し、標的DNA濃度の109倍の増加をもたらす。TAクローニングベクターへのクローニングのために、PCR産物にdATPオーバーハングを付加するため、PCR Phusionポリメラーゼ増幅産物を72℃で20分間Taqポリメラーゼとインキュベートする。
PCR増幅及びゲル溶出産物は市販のpTZ57R/Tベクターにライゲートする。ライゲーションプロトコールを以下に記載する。
細菌細胞をトランスフォームする目的は、プラスミドDNAをクローン化し増やすことである。コンピテント大腸菌セル(DH5アルファ)の20μL分取物を−80℃の冷凍庫から取り出し、5分間氷上で溶かす。ライゲートした試料(pTZ57R/T+CRISPR(PCR))の50%をコンピテントセルに添加し、優しく混合し、20分間氷上でインキュベートする。混合物を含有するチューブを50秒間42℃でウォーターバス/ドライバスに置く。チューブを2分間氷上に戻す。0.950mlの37℃に温めたLBブロス(アンピシリン抗生物質なし)を、シェイカー中220rpmで1時間、37℃でインキュベートする。生じた培養物の100μLを温めたLB+アンピシリン培養プレート上に広げる。プレートは37℃のインキュベーターで一晩インキュベートする。
本手順の目的は、以下の実験に使用する特異的DNAプラスミドを含有する細菌を増殖/培養することである。5mlのLB+アンピシリンブロスを、オートクレーブ処理したチューブに添加し、単離した細菌コロニーを培養プレートからLBブロス+アンピシリン培養チューブに接種する。チューブは、220rpm、37℃で一晩インキュベートする(細菌の増殖に応じて、およそ16〜18時間)。4.5mlの一晩培養した培養物を13rpmで1分間遠心分離する。プラスミドDNAは、市販のQIAGENプラスミド単離キットを使用して単離する。プラスミドDNAは、高純度の分子生物学等級の水で溶出し、更なる使用まで、−20℃の冷凍庫に保管する。
したがって、単離したプラスミドDNAはインサート、この場合はPCR増幅断片の存在を試験する。pTZ57R/Tベクターは、クローン化PCR産物の両側に複数の制限酵素部位を含有する。制限部位EcoRI及びHindIIIを以下の表に記載するように制限消化のために選択する。反応は、プラスミドDNAの完全な消化のために37℃で2時間実行する。制限消化に続いて、混合物を1%アガロースゲルで1時間電気泳動する。PCR産物インサートは、存在する場合、pTZ57R/Tベクター骨格から分離され、確認された細菌クローンをDNA配列決定のために使用する。
配列データ分析及びINDELの同定
配列決定−確認したプラスミドは、次いでpTZ57R/Tベクター骨格に存在する特異的な配列決定プライマーによって配列決定する。配列データは、適切なプロトコールに従って自動DNA配列決定機器で生成する。配列決定は、フォワード及びリバース配列決定プライマー両方で実行し、正確な配列情報を確かめる。
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CHO S親細胞系、及び抗Her2抗体を過剰発現し、FUT8遺伝子を標的とするCRISPR/CasシステムをトランスフェクトしたCHO S細胞系のFUT8座位におけるゲノムDNA配列を更に分析し、FUT8タンパク質の状態に対してDNA配列INDELの影響を理解する。標的FUT8座位のDNA配列は、脊椎動物のコドンバイアスを使用してアミノ酸配列へと翻訳される。エクソン7領域のアミノ酸配列を厳密に研究し、結果は以下の表12に要約する。CHO S親細胞系と比較すると、FUT8ノックアウト細胞系では、フレームシフト突然変異及び終止コドンの導入を含む改変が判明した。
アフコシル化抗Her2抗体産物を発現する単一細胞クローン細胞系からの上流プロセスの開発:
アフコシル化抗Her2抗体を過剰発現するフコースノックアウトクローンCHO S細胞系を含有するワーキングセルバンクのバイアルを、2リットルバイオリアクター培養プロトコールを開始するのに使用する。細胞を解凍し、シードトレイン培養を、150mlバッフル付き振盪フラスコ内で開始する。2Lバイオリアクターの接種用として11日間にわたり、250mlバッフル付き振盪フラスコまで培養物を更に増やす。接種ステップ毎に、1ミリリットル当たり約0.3〜約0.5×106個の生存細胞の開始細胞密度を使用する。
単一細胞クローン細胞系のフェッドバッチ培養からのアフコシル化抗Her2抗体の精製
FUT8ゲノム座位を標的とするCRISPR/Casシステムを使用して、フコース生合成経路を破壊するように、抗Her2抗体を過剰発現するCHO S細胞系を遺伝的に改変する。2リットルフェッドバッチバイオリアクター製造から得られた細胞培養材料は、生存率が80%を超える10日間の培養後に回収する。アフコシル化抗Her2抗体を精製するために培養物を処理するが、その手順を以下に記載する。
1.2リットルバイオリアクターから得られた細胞培養試料を含有するアフコシル化抗Her2抗体
2.清澄化(遠心分離及び深層濾過)
3.アフィニティークロマトグラフィー
4.低pHウイルス不活性化
5.AEXクロマトグラフィー(NB)
6.CEXクロマトグラフィー
7.アフコシル化抗Her2抗体の分析
生存率が79.7%のKO CHO細胞培養回収物、約1410mlを遠心分離に供して、細胞及び細胞デブリを除去する。濁度が22.5NTUの上清を慎重に収集し、ZetaPlus BC25深度フィルター(面積25cm2)を通過させて、宿主細胞タンパク質及び懸濁状態の固体粒子を除去する。二次的な清澄化試料を、0.22μmフィルター(面積47mm)を使用して濾過し、無菌ビン内に収集した濾過液を、プロテインAアフィニティーカラムにロードする。
カルボキシペプチダーゼB、12ミリグラムを、清澄化済みの試料、約1400ミリリットル(2400ミリグラム)に添加し、37℃で1時間インキュベートして、C末端リシン変異体を除去する。インキュベーション後、清澄化済みの試料を、平衡緩衝液(30mMリン酸ナトリウム緩衝液、150mM NaCl、pH7.20±0.20)内で事前平衡化したMabSelectSure、約70mlのXK26/20カラムに、流速8.8ml/分でロードする。約1550mlの通過画分を収集する。次の通過ステップは、弱く結合した不純物及び宿主細胞タンパク質を除去するために、平衡緩衝液を経由する。次の通過ステップは、不純物を除去するために、1カラム容積の高塩濃度ish緩衝液(30mMリン酸ナトリウム緩衝液、1M NaCl、pH7.20±0.20)、その後に3カラム容積の低pH Ish緩衝液(30mMリン酸ナトリウム緩衝液、50mM NaCl、pH6.0±0.20)を経由する。結合したタンパク質を溶出緩衝液(30mMリン酸緩衝液、50mM NaCl、pH3.0±0.20)により溶出させる。
ウイルス不活性化のために、プロテインA溶出物のpHを3.0±0.2に調整し、試料を24℃±2℃で30分間インキュベートする。試料を、次いで1Mトリスを使用してpH6.0±0.2に中和して、更に精製する。
ウイルス不活性化後、pH6.0の試料を、精製水を使用して希釈し、電導度を低下させ、pHを6±0.2に再度調整する。希釈した試料(約1000ミリリットル)を事前平衡化したXK16/40Qセファロース6FFカラムにロードし、通過画分を収集するが、このクロマトグラフィーステップは陰性結合モードに設定されるので、生成物は通過画分に溶出する。このステップには、単一ステップ(100%の濃度B)での溶出緩衝液(30mMリン酸ナトリウム緩衝液、1M NaCl、pH7.20±0.20)による、結合した不純物、宿主細胞DNA、及びトランケートされた種の溶出が後続する。溶出物を単一の画分として収集する。
AEXクロマトグラフィーから得た通過画分を、平衡緩衝液(50mMヒスチジン緩衝液、pH6.0、約2.23ミリジーメンス)内で事前平衡化したXK26/40Capto Sカラムにロードする。通過画分試料を収集する。次の通過ステップは、痕跡量の不純物を除去するために、約2カラム容積の平衡緩衝液を経由する。溶出は、0%から開始して、単一ステップで20%の濃度B(溶出緩衝液:50mMヒスチジン緩衝液、pH6.0、約14.50ミリジーメンス)に至り(約2.5mS〜約7.30ミリジーメンス)、単一ステップで20〜22.5%(約7.30ミリジーメンス〜約7.50ミリジーメンス)が後続する。グラジエント溶出は、22.5%から開始して、グラジエント方式で80%に至る(20カラム容積のグラジエント長さ)。約6mlサイズの画分を収集する。次いで、100%の濃度Bを通過させ、高塩濃度の溶出緩衝液(30mMリン酸ナトリウム緩衝液、1M NaCl、pH7.20)が後続する。
二次的な清澄化試料は、深層濾過による清澄化後、5比濁計濁度単位(NTU)未満の濁度を示す。プロテインAアフィニティークロマトグラフィープロファイル(図14A)より、高塩濃度ishで、いくつかの宿主細胞タンパク質(HCP)が除去されることが明らかであり、低pH緩衝液(pH3.0)を使用して、結合したタンパク質を溶出させると、プロテインA溶出において、合理的な収率が観察される。プロテインA溶出プロファイルに基づけば、その他のテーリングピークは観察されないが、これは、溶出期間中に生成物の凝集が認められないことを示す。プロテインA溶出試料のA280分析に基づけば、回収物からの回収率は約95%を超えることが観察される。
アフコシル化抗Her2抗体産物の特徴付け
FUT8遺伝子ノックアウトを標的とするCRISPR/CasシステムでトランスフォームしたCHO S細胞系から産生されるアフコシル化抗Her2抗体産物を特徴付けるために、複数の分析方法を使用する。
1.抗体産物の等電点電気泳動
2.アフコシル化抗Her2抗体産物のSDS PAGE分析
3.アフコシル化抗Her2抗体産物の免疫ブロッティング
4.アフコシル化抗Her2抗体産物によるHER2抗原結合ELISA
5.細胞表面上のHer2抗原認識を示す、細胞に基づくELISAアッセイ
6.FUT8遺伝子を標的とするCRISPR/CasシステムでトランスフォームしたCHO S細胞系から得られた、精製済みのアフコシル化抗Her2抗体産物のタンパク質濃度
7.アフコシル化抗Her2抗体の弱陽イオン交換による電荷変異体分析
8.100%アフコシル化を立証する、アフコシル化抗Her2抗体産物のN−グリカンプロファイリング
9.用量依存様式のHer2抗原認識を明らかにする、アフコシル化抗Her2抗体産物のフローサイトメトリー分析
10.アフコシル化抗Her2抗体によるFcγRIII結合改善を確かめるSPR結合反応速度
11.アフコシル化抗Her2抗体産物の生物学的機能性を確かめるHer2過剰発現細胞系の抗増殖アッセイ
12.腫瘍細胞の細胞毒性の改善を立証する、アフコシル化抗Her2抗体産物によるADCCアッセイ
等電点電気泳動法は、タンパク質の電荷の差異に基づくタンパク質分離で幅広く適用される。等電点電気泳動(IEF)は、タンパク質の等電点(pI)に基づき、タンパク質を分離するための電気泳動技術である。等電点電気泳動の原理はpHグラジエントにあり、試料成分が、その正味電荷がゼロとなるpH値(試料成分のpI)まで、アノード又はカソードに向かって移動する。
電荷変異体を識別する試験で使用される試料は、トラスツズマブ(Rocheから得られる)、及びFUT8遺伝子を標的とするCRISPR/CasシステムをトランスフェクトしたCHO S細胞系から開発したアフコシル化抗Her2抗体である。全ての試料を希釈し、希釈剤として超純粋のミリQ水を使用して1mg/mlの濃度に保ち、そしてタンパク質試料20μgをIEF試料アプリケーターにロードする。標準的なIEF条件を使用する。1M水酸化ナトリウム及び1Mオルトリン酸をカソード緩衝液及びアノード緩衝液としてそれぞれ使用する。この試験で使用するゲル混合物は5%である。泳動後、ゲルを2%トリクロル酢酸で30分間固定する。クマシーブリリアントブルー溶液を、溶液の染色に使用する。
10%(v/v)分離ゲルを使用して、還元及び非還元条件下で、抗体試料をSDS−PAGEにより分析する。トリスグリシンSDS PAGEは、供給業者のプロトコール(Biorad)により実施する。アクリルアミド及びビス−アクリルアミドストック溶液(29:1)、スタッキング緩衝液(1Mトリス−HCl、pH6.8)、分離緩衝液(2Mトリス−HCl、pH8.8)、10%SDS、APS、並びに触媒としてTEMEDからポリアクリルアミドゲルを調製する。スタッキングゲルは、4%濃度で使用する。
SDS−ポリアクリルアミドゲルに溶解した抗体試料をPVDF膜に転写する。0.05%ツイーン/PBS(PBST)中1%(w/v)BSAで30分間ブロッキングした後、膜を、PBSTを用いて1回、10分間ishし、1:5000希釈のヤギ抗マウスIgG二次抗体HRPコンジュゲート抗体を用いて、室温で30分間更にインキュベートし、DAB基質を使用して検出する。
ヒト化抗ヒト上皮増殖因子受容体−2(HER2)モノクロナール抗体である、抗HER2 IgG1トラスツズマブは、腫瘍細胞上でHER2を過剰発現する転移性乳がん患者の治療で用いられる。抗HER2モノクロナール抗体の定量は、異なる方法、例えばELISAに基づく方法を使用して実施可能である。ACROBiosystemsのヒト293細胞(HEK293)内で産生されるヒトHer2/ErbB2タンパク質(ヒトHer2、His Tag)Thr23−Thr652(受託番号AAA75493)を用いて、96ウェルプレートをコーティングする。受容体はヒトHer2である;His Tagは、C端でポリ−ヒスチジンタグと融合しており、70.2kDaのMWを計算上有する。予測されるN端はThr23である。DTT還元型タンパク質は、グリコシル化により、110〜115kDaとしてSDS−PAGE内を移動する。
濃度1μg/ml(100mM重炭酸緩衝液、pH9.6で希釈)のHER2タンパク質(Acro bio systems、米国)、100μlを96ウェルプレートにコーティングする(細胞培養デルタ表面処理プレート)。プレートを2〜4℃、一晩インキュベートを継続し、その後、洗浄緩衝液(PBS+0.05%ツイーン20)2×200μlで洗浄する。非特異的結合を、ブロッキング緩衝液(洗浄緩衝液+0.1%BSA)で2時間(200μl)ブロックし、洗浄緩衝液で2回洗浄する。標準/試料、100μlを添加し、インキュベーションを1.5時間継続する。試料及び標準を2倍ずつ連続希釈して、1.953〜250ng/mlの範囲にする。二次抗体をプレートに添加し、インキュベーションを1時間継続する。TMBを基質として使用する。プレートを、620nmをバックグラウンドとして450nmで読み取る。全ての測定を2回行う。測定した試料/標準の濃度を、4パラメーター非線形回帰曲線近似プログラムを使用して決定して、結合曲線を生成する(Gen5)。
細胞に基づくELISAは、特異的受容体発現細胞を用いて特異的標的分子の結合能力を見積もる方法の1つである。SKBR3及びBT474細胞系(ATCCから得られる)は、細胞表面上でHER2受容体を過剰発現する。抗Her2抗体の結合能力を評価するのに、該細胞系を使用する。細胞に基づくELISAアッセイでは、下記のプロトコールに従う、
1.細胞をマイクロタイタープレートに播種する;
2.CO2インキュベーター中、37℃、一晩インキュベーション;
3.細胞を10%ホルマリンで固定する;
4.表面をish及びブロックする;
5.標的抗Her2抗体を添加する;
6.Ishし、酵素コンジュゲート抗体を添加する;
7.基質を添加し、読み取りを行う。
2つの細胞系、すなわちSKBR3及びBT474細胞をこの試験で使用する。SKBR3及びBT474細胞を継代し、10%FBSが補充されたRPMI1640及びDMEM培地内でそれぞれ37℃及び5%CO2で維持する。細胞を、1ウェル当たり5000個の細胞(100μL)の密度で、96ウェルプレートデルタ処理表面にプレーティングし、接着させたまま、37℃及び5%CO2で、一晩放置する。翌日、2×200μLの冷却PBSで細胞を洗浄して、非接着粒子を除去する。次に、細胞を10%ホルマリン、100μLで固定し、室温で10分間インキュベートする。固定溶液を除去し、2×200μLの冷却PBSで洗浄し、ブロッキング溶液[PBS+ツイーン20(0.05%)+0.1%BSA]、200μLで、プレートを1時間ブロックする。2×200μLの洗浄緩衝液(PBS+0.05%ツイーン20)でプレートを洗浄して、過剰のブロッキング溶液を除去する。試料/標準、100μLを各ウェルに添加し、プレートシェイカー内で30分間インキュベートする。2×200μLのish緩衝液(PBS+0.05%ツイーン20)でプレートをishして非特異的相互作用を除去する。二次抗体(抗ヒトFc IgG1)、100μLを添加し、1時間インキュベートする。TMB基質100μLを添加し、620nmをバックグラウンドとして、450nmで発色した色を読み取る。全ての試料/標準について2回行う。測定した試料/標準の濃度を、4パラメーター非線形回帰曲線近似プログラムを使用して決定し、結合曲線を生成する(Gen5)。表13は、両細胞系(BT474及びSKBR3)で使用する試料/標準の濃度を示す。
タンパク質濃度は、Shimadzu Prominence−i HPLC上で、MAbPacプロテインAカラム(12μm;4×35mm)を使用して、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーにより決定する。移動相は、流速が2.5mL/分のDulbecco’s酸緩衝液である。モノクロナール抗体を3%氷酢酸グラジエントで溶出させる。カラム温度は、25℃であり、検出は280nmで行う。ラボソリューションソフトウェアを使用してクロマトグラムを統合し、公知の標準の濃度に対して、ピーク下面積をプロットした標準曲線を使用して濃度を見積もる。
電荷変異体を、4.0×250mmのDionex ProPac陽イオン交換(IEC)カラムWCX−10上で分離する。移動相Aは、10mM MES緩衝液、pH6.8であり、移動相Bは、250mM塩化ナトリウムを含む10mM MES緩衝液、pH6.8であり、流速は1.0mL/分、稼働時間は21分間である。カラム温度は30℃であり、検出は280nmで行う。ラボソリューションソフトウェアを使用してクロマトグラムを統合し、ピーク面積の相対割合を得る。
N−グリカンをプロファイリングするための試料調製は、GlycoWorks RapiFluor−MS N−グリカンキット(Waters、Milford、MA、米国)を使用して実施する。キットは4ステップを有する。
ステップ1:高速脱グリコシル化、
ステップ2:グリコシルアミンの高速ラベリング、
ステップ3:ラベリングしたグリコシルアミンのHILIC Clean−Up、
ステップ4:HILIC−FLR UPLC分析用の、ラベリングしたグリカンの調製。
2−AB誘導型N−グリカンは、Empower3クロマトグラフィーワークステーションソフトウェアの制御下に置かれた、クオターナリーソルベントマネージャー、試料マネージャー、及び蛍光検出器からなるWaters Acquity(商標)UPLC H−クラス装置(Waters、Milford、MA、米国)上で、蛍光検出機能を有する超高性能液体クロマトグラフィー(UPLC)により分離する。1mL/分、26分で80〜60%アセトニトリルのリニアグラジエントを使用するThermo Accucore−150−アミド−HILICカラム、100×2.1mm i.d.、2.6μm粒子を使用して、HILIC分離を実施する。溶媒Aは、アンモニア溶液を用いてpH4.4に調整した50mMギ酸アンモニウムであり、溶媒Bは、アセトニトリルである。試料の注入容積は、10μLである。注入前に試料を5℃に維持し、カラム温度は60℃である。蛍光検出励起/発光波長は、それぞれex=265nm及びem=425nmである。
mAb試料のHER2抗原への特異的結合を、間接的フローサイトメトリー法を使用して調査する。細胞表面上で高レベルのHER2受容体を発現するBT−474細胞系を、ATCCから得る。10%FBSを含有するDMEM/F12増殖培地内で、BT−474細胞を培養する。
異なる電荷変異体に関する結合反応速度試験を、Biacore3000装置を使用して、表面プラズモン共鳴(SPR)により実施する。HER2結合反応速度及びFcガンマRIII(CD16a)結合反応速度について、変異体及び主要な種を分析する。HER2及びCD16aリガンドを、製造業者のプロトコールに記載されている標準アミンカップリング手順を使用してCM5チップ(GE Healthcare)上に固定する。
HER2は、neu及びc−erbB2としても公知であり、上皮増殖因子(EGF)受容体のメンバー、又はHER1(EGFR/c−erbB1)、HER3(c−erbB3)、及びHER4(c−erbB4)も含まれるチロシンキナーゼ受容体のHERファミリーである。HER2の過剰発現は、乳がん及び卵巣がんで頻繁に観察され、不良な予後と関連する。
BT474細胞系を本試験で使用し、10%FBSが補充されたDMEM培地を使用して細胞を、37℃及び5%CO2で増殖及び維持する。1ウェル当たり2000個の細胞を本試験で使用する。試料/標準の希釈を、DMEMアッセイ培地(2%FBSを含有)内で実施する。試料/標準、100μLを、細胞100μLと共に96ウェルプレートに添加し、インキュベーションを37℃、5%CO2で6日間継続する。6日後、アラマーブルー30μLを添加し、インキュベーションを6時間継続する。次いで、プレートを530nmの励起波長及び590nmの励起波長で読み取る。4点非線形回帰曲線を、PLAソフトウェアから得る。下記の表14は、BT474抗増殖アッセイで使用する試料/標準の濃度を示す。
末梢血液単核球(PBMC)を、フィコールグラジエント遠心分離により、ヘパリン添加血から単離する。細胞をDPBS(1×)内で、次いで完全培地内で再度ishし、次いで最適なエフェクター:標的(E:T)比を得るのに必要とされる細胞濃度に調整する。
BT−474標的細胞(1ウェル当たり10,000個の細胞)を、アフコシル化モノクロナール抗体試料とRPMI 1640アッセイ培地内で混合し、96ウェルプレートに分配する。30分間のインキュベーション後、エフェクター細胞を1:20(BT474細胞のエフェクター細胞に対する)の比で、細胞及び薬物反応混合物に添加する。アッセイプレートを、CO2インキュベーター内、37℃で7時間インキュベートする。細胞より放出された死亡細胞プロテアーゼレベル(細胞死の指標)を、Cytotoxgloアッセイキット(Promega)を使用して測定する。インキュベーション後、均一に混合するために、プレートを30分間シェイカー上で維持する。最大細胞毒性レベルを決定するために、溶解緩衝液20μlを対照ウェルに添加する。Cytotoxglo試薬20μlを各試料及び対照ウェルに添加し、室温で15分間インキュベートする。発光を、Biotek ELISAリーダーを使用して測定する。細胞毒性割合の値を以下の通り計算する:[(試験試料−低対照)/(最大対照−低対照)]×100。低対照は、自発細胞死を表し、最大対照は、完全細胞死を表す。
アフコシル化抗Her2抗体の見通しについて、一連の分析実験により試験及び特徴付けを行う。アフコシル化抗Her2抗体とトラスツズマブとの比較により、生物活性を比較する。
IEFを実施して、存在する電荷変異体(酸性及び塩基性の種)を識別する。4つのバンドが、イノベーターにおいて明らかに目視可能である。主要なバンド(図15)が、トラスツズマブ及びアフコシル化抗Her2抗体産物の両方に観察される。
非還元条件下では、未変化の抗体を示す、分子量(MW)150kDaに対応する単一の主要なバンドが観察される(図16)。還元条件下で、2つのバンドが、25kDa及び50kDaにおいて明らかであるが、それぞれ、抗体の軽鎖及び重鎖と関連する。アフコシル化抗Her2抗体産物について観察されたバンドパターンは、トラスツズマブのバンドパターンと類似する。
ウェスタンブロッティング分析は、抗体試料を特異的に検出するために実施する。トラスツズマブは、タンパク質パターンを評価及び比較するのに使用する。非還元型抗体試料は、二次抗体でプローブしたとき、単一の異なるバンドを示す。但し、還元型の試料の場合、重鎖(約50kDa)の単一バンドのみが検出され、モノクロナール抗体の軽鎖は検出されない。これは、使用される二次抗体は、抗体のFc領域に対してのみ特異的であり、軽鎖領域に対しては特異的でないことによる。図17において、アフコシル化抗Her2抗体産物は、ウェスタンブロット実験においてまったく同一のバンディングパターンを示す。
連続希釈して得られた異なる濃度(60ng/mL〜0.48ng/mL)のトラスツズマブ及びアフコシル化抗Her2抗体を、結合効率についてHER2コーティングELISAプレートにおいて分析する。観察された結果(図18)より、トラスツズマブと比較して、アフコシル化抗Her2抗体は、固定化したHER2ドメインに対して類似した相互作用を有することが示される。
細胞に基づくELISA(図19A及び19B)より、アフコシル化抗Her2抗体とトラスツズマブは同等の活性を有することが明らかである。この方法は、乳がん細胞上で発現するHER2抗原と、アフコシル化抗Her2抗体及びトラスツズマブとの間の結合活性を決定する。理想的には、表面上でのHER2抗原の発現量は、SKBR3細胞と比較したとき、BT474細胞では、それよりも高い。アフコシル化抗Her2抗体分子は、両細胞系において同等の結合能力を示す。SKBR3及びBT474細胞に対するアフコシル化抗Her2抗体の結合能力は、それぞれ89.1%及び80.3%である。細胞に基づくELISAに関する結合能力基準は、平行線定量法計算ソフトウェア(PLAソフトウェア)において75〜125%に設定する。
プロトタイププロテインAカラムを、回収後の細胞培養物(HCC)から医薬品段階まで、モノクロナール抗体力価を測定するのに使用する。クロマトグラム(図20)では、各試料50μLをプロトタイププロテインAカラムに注入する。本方法の初期部分において溶出した最初のピークは、未結合物質に該当する。モノクロナール抗体は、低pHの3%氷酢酸を通過させることにより放出される。モノクロナール抗体力価を、これまでに作成した校正曲線を使用して決定する。各試料の代表的なクロマトグラムを図20に示し、各試料の力価を以下の表にまとめる(表15)。
イオン交換プロファイルのピークは、一般的に3つの異なる成分に対応する。初期及び後期の溶出ピークは、酸性及び塩基性変異体とそれぞれ呼ばれる。最も大きなピークは、主要ピークと呼ぶ。図21に示すように、Propac WCX−10カラムは、モノクロナール抗体の酸性及び塩基性変異体分析において、優れたピーク効率及び高分解能を提供するが、酸性、塩基性及び主要のピークを、21分間の稼働時間内で分解し、それぞれの割合を下記の表16にまとめる。
治療用モノクロナール抗体に関する重要な品質特性の1つは、グリコシル化プロファイルである。トラスツズマブ及びアフコシル化抗Her2抗体産物におけるグリカンの分布をチェックするために、HILIC N−グリカンプロファイリング法により分析する。主要なグリカン、例えばG0、G1、G1’、G2、G0F、G1F、G1F’、及びG2F等を、トラスツズマブ及びアフコシル化抗Her2抗体産物について、下記の表17に列挙する。トラスツズマブ及びアフコシル化抗Her2抗体試料におけるアフコシル化グリカンの全体的な割合は、それぞれ8.95%及び100%である。トラスツズマブ及びアフコシル化抗Her2抗体におけるグリカンプロファイルを、図22に示す。
本方法は、フローサイトメトリーに基づくアッセイによって、乳がん細胞系のBT−474上で発現するHer2受容体のリガンド結合親和力を測定する手段を提供する。ビオチン化された抗体試料による受容体結合レベルを、FITC標識ストレプトアビジンを用いてプロービングすること、及びフローサイトメーターを使用して蛍光レベルを測定することにより評価する。アフコシル化抗Her2抗体産物は、「非染色細胞のみ」の対照と比較して右側に寄ったピークシフトを示し、乳がん細胞上のHer2受容体に対するこの試料の特異性を示す。トラスツズマブ及びアフコシル化抗Her2抗体のオーバーレイデータ(図23)は同等であり、アフコシル化抗Her2抗体産物は、トラスツズマブと類似した結合親和力を有することを示唆する。またこれらの結果は、生成したアフコシル化抗Her2抗体産物の適切なフォールディング、正確な会合、及び生物活性も示す。
SPRデータ(図24A)より、アフコシル化抗Her2抗体産物に対するHER2の結合は、トラスツズマブに匹敵することが明らかである。アフコシル化抗Her2抗体に関するKD値は、4.21E−09(4.2nM)であり、トラスツズマブの場合、3.69E−09(3.6nM)であることが判っている。会合及び解離(ka及びkd)値から、アフコシル化抗Her2抗体は、HER2リガンドに対して非常に強いアフィニティーを有することが示される。しかし、FcγRIII受容体(CD16aリガンド)の場合、SPRセンサーグラムは、トラスツズマブ及びアフコシル化抗Her2抗体産物との結合において顕著な差異を示す。データより、トラスツズマブは、一般的にFcγRIII受容体(CD16aリガンド)に対して非常に弱い結合を有し、HER2リガンドとは強い結合を有することが示唆される。一方、本開示に記載するアフコシル化抗Her2抗体は、FcγRIII受容体に対して有意に高レベルの結合を示す。反応速度データ(図24B)は、アフコシル化抗Her2抗体(KD 4.00E−08M)の結合親和力は、トラスツズマブ(KD 1.08E−07M)よりも約3倍高いことを示唆する。
抗増殖アッセイ(図25)では、乳がん細胞系の細胞増殖を阻害する薬物の能力について調べた。アフコシル化抗Her2抗体は、トラスツズマブと比較して同等の細胞増殖抑制能力(がん細胞が増殖するのを阻止する薬物の能力)を示し、また相対的効力値は、トラスツズマブに対して85.2%を示す。抗増殖アッセイに関する効力の規格は、平行線定量法計算ソフトウェア(PLAソフトウェア)において、70〜130%に設定する。
図26は、抗Her2抗体を過剰産生するCHO S細胞系から開発され、FUT8遺伝子を標的とするCRISPR/Casシステムでトランスフォームされたアフコシル化抗Her2抗体産物の生物学的能力を示す。異なる薬物濃度における細胞傷害レベルをアッセイするのに、アフコシル化抗Her2抗体産物及びトラスツズマブを使用する。データ分析には、Graphpad prismソフトウェアを使用する。結果は、アフコシル化抗Her2抗体産物を用いると、ADCCが8倍を超えて改善されることを示唆する。このデータは、モノクロナール抗体のアフコシル化は、モノクロナール抗体の生物学的機能において直接的な影響を有することを立証する。
Claims (24)
- 抗体依存性細胞媒介性細胞障害(ADCC)に関与する抗体をコードする遺伝子と、
配列番号11及び配列番号13、又はその組合せからなる群より選択されるCRISPR DNA結合ドメインを含むベクターと
を含む細胞。 - 前記ベクターが、ヌクレアーゼを更に含む、請求項1に記載の細胞。
- 抗体産生細胞であり、
前記抗体が、抗CD20抗体、抗EGFR抗体、抗Her2抗体、抗CD19抗体、抗LAG3抗体、抗CD40抗体、抗EpHA3抗体、抗HIV中和抗体、抗HCV中和抗体、及び抗デング熱中和抗体からなる群より選択される、
請求項1に記載の細胞。 - COS、CHO−S、CHO−K1、CHO−K1 GS(−/−)、CHO−DG44、CHO −DUXB11、CHO−DUKX、CHOK1SV、VERO、MDCK、W138、V79、B14AF28−G3、BHK、HaK、NS0、SP2/0−Ag14、HeLa、HEK293−F、HEK293−H、HEK293−T、YB23HL.P2.G11.16Ag.20、perC6、抗体産生ハイブリドーマ細胞、胚性幹細胞、ナマルバ細胞、スポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera fugiperda)(Sf)、ピキア属、サッカロミセス属、及びシゾサッカロミセス属由来の昆虫細胞系からなる群より選択される、請求項1に記載の細胞。
- CHO細胞であり、
前記抗体が、抗Her2抗体である、
請求項3に記載の細胞。 - フコースノックアウト細胞を得る方法であって、CRISPRヌクレアーゼ構築物を細胞にトランスフェクトして、フコースノックアウト細胞を得るステップを含む上記方法。
- 前記細胞が、抗体依存性細胞媒介性細胞障害(ADCC)に関与する抗体をコードする遺伝子を含む、請求項6に記載の方法。
- 前記抗体が、抗CD20抗体、抗EGFR抗体、抗Her2抗体、抗CD19抗体、抗LAG3抗体、抗CD40抗体、抗EpHA3抗体、抗HIV中和抗体、抗HCV中和抗体、及び抗デング熱中和抗体からなる群より選択される、請求項7に記載の方法。
- CRISPRヌクレアーゼ構築物が、配列番号11及び配列番号13、又はその組合せからなる群より選択されるCRISPR DNA結合ドメインを含む、請求項6に記載の方法。
- CRISPRヌクレアーゼ構築物が、細胞のFut8遺伝子を破壊し、
Fut8遺伝子の配列が、エクソン7における切断により破壊される、請求項9に記載の方法。 - 前記細胞が、COS、CHO−S、CHO−K1、CHO−K1 GS(−/−)、CHO−DG44、CHO−DUXB11、CHO−DUKX、CHOK1SV、VERO、MDCK、W138、V79、B14AF28−G3、BHK、HaK、NS0、SP2/0−Ag14、HeLa、HEK293−F、HEK293−H、HEK293−T、YB23HL.P2.G11.16Ag.20、perC6、抗体産生ハイブリドーマ細胞、胚性幹細胞、ナマルバ細胞、スポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera fugiperda)(Sf)、ピキア属、サッカロミセス属、及びシゾサッカロミセス属に由来する昆虫細胞系からなる群より選択される、請求項6に記載の方法。
- アフコシル化タンパク質を得る方法であって、請求項6に記載の方法により得られたフコースノックアウト細胞により発現されるタンパク質を得るステップを含む上記方法。
- 前記タンパク質が、抗体依存性細胞媒介性細胞障害(ADCC)に関与する抗体である、請求項12に記載の方法。
- 前記抗体が、抗CD20抗体、抗EGFR抗体、抗Her2抗体、抗CD19抗体、抗LAG3抗体、抗CD40抗体、抗EpHA3抗体、抗HIV中和抗体、抗HCV中和抗体、及び抗デング熱中和抗体からなる群より選択される、請求項13に記載の方法。
- 前記抗体が、抗Her2抗体である、請求項14に記載の方法。
- 前記細胞が、COS、CHO−S、CHO−K1、CHO−K1 GS(−/−)、CHO−DG44、CHO−DUXB11、CHO−DUKX、CHOK1SV、VERO、MDCK、W138、V79、B14AF28−G3、BHK、HaK、NS0、SP2/0−Ag14、HeLa、HEK293−F、HEK293−H、HEK293−T、YB23HL.P2.G11.16Ag.20、perC6、抗体産生ハイブリドーマ細胞、胚性幹細胞、ナマルバ細胞、スポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera fugiperda)(Sf)由来の昆虫細胞系、ピキア属、サッカロミセス属、及びシゾサッカロミセス属からなる群より選択される、請求項12に記載の方法。
- アフコシル化タンパク質。
- 抗体依存性細胞媒介性細胞障害(ADCC)に関与する抗体である、請求項17に記載のタンパク質。
- 抗CD20抗体、抗EGFR抗体、抗Her2抗体、抗CD19抗体、抗LAG3抗体、抗CD40抗体、抗EpHA3抗体、抗HIV中和抗体、抗HCV中和抗体、及び抗デング熱中和抗体からなる群より選択される抗体である、請求項18に記載のタンパク質。
- 前記抗体が、抗Her2抗体である、請求項19に記載のタンパク質。
- 請求項12に記載の方法により得られる、請求項17に記載のタンパク質。
- 任意選択的に薬学的に許容される添加剤と共に、請求項17に記載のタンパク質を含む組成物。
- がん、自己免疫障害、ウイルス感染性疾患、細菌感染性疾患、炎症、及び腫瘍、又はその組合せからなる群より選択される障害の管理における使用のための、請求項17に記載のアフコシル化タンパク質。
- がん、自己免疫障害、ウイルス感染性疾患、細菌感染性疾患、炎症、及び腫瘍、又はその組合せからなる群より選択される障害を管理する方法であって、請求項17に記載のアフコシル化タンパク質を、それを必要としている対象に投与するステップを含む上記方法。
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