JP2018201486A5 - - Google Patents
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Claims (16)
- FAD依存性グルコースデヒドロゲナーゼ(FAD-GDH)変異体であって、
i) 配列番号1で示されるアミノ酸配列、
ii) 配列番号1で示されるアミノ酸配列において、196位、228位、600位、267位、276位、55位、230位、235位、239位、435位、587位、588位、及び591位以外の位置で1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、
iii) 配列番号1、3、6若しくは40で示されるアミノ酸配列と90%以上の全長アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列、又は
iv) 配列番号1、3、若しくは6で示されるアミノ酸配列と70%以上の全長アミノ酸配列同一性を有し、かつ、相同性領域のアミノ酸配列が配列番号1で示されるアミノ酸配列における相同性領域と90%以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
配列番号1のアミノ酸配列における196位、228位、600位、267位、276位、55位、230位、235位、239位、435位、587位、588位、及び/又は591位に対応する位置に1以上のアミノ酸置換を有し、当該置換を有しない未改変のFAD依存性グルコースデヒドロゲナーゼと比較して、保存安定性が向上しているFAD依存性グルコースデヒドロゲナーゼ変異体。 - FAD-GDHにおいて、
配列番号1のアミノ酸配列における196位に対応する位置のアミノ酸がチロシン、フェニルアラニン、リシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、メチオニン、アラニン、若しくはアルギニンに置換されている、
配列番号1のアミノ酸配列における228位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギン、トレオニン、ヒスチジン、セリン、グルタミン、若しくはシステインに置換されている、配列番号1のアミノ酸配列における600位に対応する位置のアミノ酸がイソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン若しくはトリプトファンに置換されている、
配列番号1のアミノ酸配列における267位に対応する位置のアミノ酸がアルギニン、ヒスチジン若しくはグルタミンに置換されている、
配列番号1のアミノ酸配列における276位に対応する位置のアミノ酸がイソロイシン、ロイシン、バリン、メチオニン、システイン、フェニルアラニン、トリプトファン若しくはチロシンに置換されている、
配列番号1のアミノ酸配列における55位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギン、セリン、トレオニン、グルタミン若しくはシステインに置換されている、
配列番号1のアミノ酸配列における230位に対応する位置のアミノ酸がグルタミン、セリン、トレオニン、アスパラギン、アルギニン、リシン、若しくはヒスチジンに置換されている、
配列番号1のアミノ酸配列における235位に対応する位置のアミノ酸がアラニン、セリン若しくはグリシンに置換されている、
配列番号1のアミノ酸配列における239位に対応する位置のアミノ酸がアラニン、セリン若しくはグリシンに置換されている、
配列番号1のアミノ酸配列における435位に対応する位置のアミノ酸がセリン、トレオニン、アスパラギン若しくはグルタミンに置換されている、
配列番号1のアミノ酸配列における587位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸若しくはグルタミン酸に置換されている、
配列番号1のアミノ酸配列における588位に対応する位置のアミノ酸がセリン、トレオニン、アスパラギン若しくはグルタミンに置換されている、及び/又は
配列番号1のアミノ酸配列における591位に対応する位置のアミノ酸がリシン、アルギニン若しくはヒスチジンに置換されている、
FAD-GDH変異体であって、当該置換を有しない未改変のFAD-GDHと比較して、保存安定性が向上している、請求項1に記載のFAD-GDH変異体。 - FAD-GDHにおいて、
配列番号1のアミノ酸配列における196位に対応する位置のアミノ酸がチロシン、フェニルアラニン、リシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、メチオニン、若しくはアラニンに置換されている、
配列番号1のアミノ酸配列における228位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギン、トレオニン、若しくはヒスチジンに置換されている、
配列番号1のアミノ酸配列における600位に対応する位置のアミノ酸がイソロイシンに置換されている、
配列番号1のアミノ酸配列における267位に対応する位置のアミノ酸がアルギニンに置換されている、
配列番号1のアミノ酸配列における276位に対応する位置のアミノ酸がイソロイシンに置換されている、
配列番号1のアミノ酸配列における55位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギンに置換されている、
配列番号1のアミノ酸配列における230位に対応する位置のアミノ酸がグルタミンに置換されている、
配列番号1のアミノ酸配列における235位に対応する位置のアミノ酸がアラニンに置換されている、
配列番号1のアミノ酸配列における239位に対応する位置のアミノ酸がアラニンに置換されている、
配列番号1のアミノ酸配列における435位に対応する位置のアミノ酸がセリンに置換されている、
配列番号1のアミノ酸配列における587位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸に置換されている、
配列番号1のアミノ酸配列における588位に対応する位置のアミノ酸がセリンに置換されている、及び/又は
配列番号1のアミノ酸配列における591位に対応する位置のアミノ酸がリシンに置換されている、
FAD-GDH変異体であって、当該置換を有しない未改変のFAD-GDHと比較して、保存安定性が向上している、請求項1又は2に記載のFAD-GDH変異体。 - さらに、
配列番号1のアミノ酸配列における192位に対応する位置のアミノ酸がプロリンに置換されている、
配列番号1のアミノ酸配列における212位に対応する位置のアミノ酸がロイシンに置換されている、
配列番号1のアミノ酸配列における218位に対応する位置のアミノ酸がヒスチジンに置換されている、
配列番号1のアミノ酸配列における226位に対応する位置のアミノ酸がトレオニンに置換されている、及び/又は
配列番号1のアミノ酸配列における232位に対応する位置のアミノ酸がアラニンに置換されている、
請求項1〜3のいずれか1項に記載のFAD-GDH変異体。 - i)配列番号1のアミノ酸配列における196位に対応する位置のアミノ酸がチロシン、フェニルアラニン、リシン若しくはアスパラギンに置換され、かつ配列番号1のアミノ酸配列における228位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギン、トレオニン若しくはヒスチジンに置換されている変異体、
ii)配列番号1のアミノ酸配列における192位に対応する位置のアミノ酸がプロリンに置換され、かつ、配列番号1のアミノ酸配列における196位に対応する位置のアミノ酸がチロシン、フェニルアラニン、リシン若しくはアスパラギンに置換されている変異体、iii) 配列番号1のアミノ酸配列における226位に対応する位置のアミノ酸がトレオニンに置換され、かつ配列番号1のアミノ酸配列における228位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギン、トレオニン若しくはヒスチジンに置換されている変異体、
iv) 配列番号1のアミノ酸配列における230位に対応する位置のアミノ酸がグルタミンに置換され、配列番号1のアミノ酸配列における232位に対応する位置のアミノ酸がアラニンに置換され、配列番号1のアミノ酸配列における235位に対応する位置のアミノ酸がアラニンに置換され、かつ配列番号1のアミノ酸配列における239位に対応する位置のアミノ酸がアラニンに置換されている変異体、
v)配列番号1のアミノ酸配列における192位に対応する位置のアミノ酸がプロリンに置換され、配列番号1のアミノ酸配列における196位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギンに置換され、配列番号1のアミノ酸配列における212位に対応する位置のアミノ酸がロイシンに置換され、配列番号1のアミノ酸配列における218位に対応する位置のアミノ酸がヒスチジンに置換され、配列番号1のアミノ酸配列における226位に対応する位置のアミノ酸がトレオニンに置換され、かつ配列番号1のアミノ酸配列における228位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギンに置換されている192P/196N/212L/218H/226T/228N変異体、
vi) 前記v)の変異体において、さらに、配列番号1のアミノ酸配列における230位に対応する位置のアミノ酸がグルタミンに置換され、配列番号1のアミノ酸配列における232位に対応する位置のアミノ酸がアラニンに置換され、配列番号1のアミノ酸配列における235位に対応する位置のアミノ酸がアラニンに置換され、配列番号1のアミノ酸配列における239位に対応する位置のアミノ酸がアラニンに置換されている192P/196N/212L/218H/226T/228N/230Q/232A/235A/239A変異体、及び
vii) 前記vi)の変異体において、さらに配列番号40のアミノ酸配列を有するM3変異体、からなる群より選択され、当該置換を有しないFAD-GDHと比較して、保存安定性が向上している、請求項1〜4のいずれか1項に記載のFAD-GDH変異体。 - 加温前の未置換のFAD-GDHの酵素活性を100%としたときの、20-40℃でpH 7.4にて加温した未置換のFAD-GDHの残存活性(%)と、加温前のFAD-GDH変異体の酵素活性を100%としたときの、20-40℃でpH 7.4にて加温したFAD-GDH変異体の残存活性(%)とを比較して、
(a)1週間加温した後の残存活性(%)が1%以上向上している、
(b)2週間加温した後の残存活性(%)が3%以上向上している、
(c)3週間加温した後の残存活性(%)が3%以上向上している、又は
(d)4日間加温した後の残存活性(%)が1%以上向上している、
請求項1〜5のいずれか1項に記載のFAD-GDH変異体。 - 請求項1〜6のいずれか1項に記載のFAD-GDH変異体をコードするFAD-GDH遺伝子。
- 請求項7に記載のFAD-GDH遺伝子を含むベクター。
- 請求項8に記載のベクターが導入されている宿主細胞。
- 以下の工程を含むFAD-GDHを製造する方法:
請求項9に記載の宿主細胞を培養する工程、
前記宿主細胞中に含まれるFAD-GDH遺伝子を発現させる工程、及び
前記培養物からFAD-GDHを単離する工程。 - 請求項1〜6のいずれか1項に記載のFAD-GDH変異体を含むグルコースアッセイキット。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載のFAD-GDH変異体を含むグルコースセンサー。
- 請求項12に記載のグルコースセンサーを有する持続血糖測定デバイス。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載のFAD-GDH変異体を含む電極。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載のFAD-GDH変異体、請求項11に記載のキット、請求項12に記載のセンサー、若しくは請求項13に記載のデバイス又は請求項14に記載の電極を用いるグルコース測定方法。
- 20〜40℃で、1日〜2週間の連続測定を行う、請求項15に記載の方法。
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