JP2018138581A - 多量体融合タンパク質ワクチン及び免疫療法 - Google Patents

多量体融合タンパク質ワクチン及び免疫療法 Download PDF

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Abstract

【課題】免疫反応を増強するための新たな改善された構築物、特に、添加されるアジュバントの非存在下で免疫反応を増強するのに使用し得る、抗原を多量体化して、それらの免疫原性を増強するための固有の機構を組み込む融合タンパク質、及びワクチンの提供。【解決手段】リンカー配列で隔てられた少なくとも2つの抗原、又は他のワクチン関連タンパク質及びオリゴマー化ドメインを含み、発現させると多量体タンパク質複合体を形成する融合タンパク質、又は融合タンパク質をコードする核酸。更に、場合によりアジュバントを使用せずに被検体に投与される、融合タンパク質又は融合タンパク質をコードする核酸を含むワクチン組成物。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本特許出願は、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、2012年7月26日に出願された米国仮出願第61/675,948号に対する優先権を主張する。
政府の利益
本発明は部分的に、Uniformed Services University of the Health Services(助成金番号KM74LJ)及びNIH(助成金番号1R21AI073627)からの政府援助により行った。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
配列表
本明細書は、EFS-Webを介して、ASCIIフォーマットで提出された配列表を含有し、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。前記ASCIIコピーは、2013年7月25日に作成され、HMJ-134-PCT_SL.txtと称し、258,258バイトのサイズである。
臨床的に関連する抗原に対する体液性免疫又はT細胞免疫の誘導は、これらの抗原の免疫原性が脆弱なことにより、たびたび妨げられることがある。免疫反応を増強するために、外因性アジュバントが一般に使用される。これらのアジュバントは、多くの異なるカテゴリーに分けられるが、それらは全て、免疫反応を抗原非特異的な様式で刺激する特性を共有している(Schijns, V. E. 2000. Curr. Opin. Immunology 12: 456-463)。したがって、それらの臨床的使用は、望ましくない炎症反応又は自己免疫反応を刺激するとの懸念があるために、極めて限定されている。Toll様受容体を介して先天性免疫系を刺激する、より新しくより強力なアジュバントのうちの多くは、マクロファージ、樹状細胞、及び他の先天性免疫細胞を非特異的に活性化させ、望ましくない炎症促進性続発症を伴う(van Duin et al., 2005. Trends Immunol.)。したがって、添加されたアジュバントの非存在下で抗原特異的免疫反応を増進させる方途を考案することは極めて有用であろう。
タンパク質凝集物は、免疫反応を増強することが公知である(Rosenberg, 2006, The AAPS Journal, 8(3):E501-507)。例えば、高度に整列された構造で提示されるタンパク質抗原は、ヘルパーT細胞の非存在下であってもなお、高度に強力な抗体反応を誘導しうる。タンパク質凝集物が、このような強力な抗体反応を媒介する機構は、完全に理解されているわけではない。しかし、効力は、少なくとも部分的に、B細胞の細胞表面免疫グロブリンを広範に架橋し、B細胞を活性化させる、多価タンパク質の能力に起因すると考えられている。
分子量及び溶解性を含むいくつかの因子が、免疫反応を誘導するタンパク質凝集物の能力に影響を及ぼしうる(Rosenberg, 2006, The AAPS Journal, 8(3):E501-507)。二量体及び三量体などの低分子量凝集物は、一般に、大型の多量体ほど免疫反応を誘導するのに効果的ではない。サイズの大きな単量体のタンパク質は、サイズの小さな単量体のタンパク質より、必ずしも免疫原性が大きいわけではないため、サイズではなく、多量体化が、重要な免疫原性因子であると考えられる。加えて、粒子状(不溶性)抗原は、抗原提示細胞(APC)により、より急速にエンドサイトーシスされる。続いてAPCは、抗原をプロセシングし、それをT細胞及び/又はB細胞へと提示して、免疫反応を誘導する。タンパク質凝集物の免疫原性に影響を及ぼしうる他の因子には、生成物の由来(内因性と対比した外来性)、免疫調節活性を有する生成混入物の存在、ネオエピトープ(融合タンパク質により創出されうる)の存在、グリコシル化パターン、投与頻度、投与経路、宿主の免疫状態、付随する免疫調節物質の活性、及び、内因性タンパク質の場合、内因性タンパク質に対する免疫寛容の強度が含まれる(Rosenberg, 2006, The AAPS Journal, 8(3):E501-507)。
他の研究者らも、免疫反応を増強する取組みの中で、タンパク質凝集又は多量体を標的とした戦略を利用することを試みている。例えば、Hultbergらは、3つの異なるウイルスの異なるエピトープを標的とする多量体を構築した。(1)呼吸器合胞体ウイルス、(2)狂犬病ウイルス糖タンパク質、及び(3)H5N1インフルエンザウイルスの、三量体エンベロープタンパク質に対するラマ重鎖抗体断片(VHH)が、ファージディスプレイライブラリーから選択された(Hultberg et al., 2011. PloS ONE 6: e17665)。低ナノモル範囲のアフィニティーで3つの異なるエピトープを認識する中和重鎖が、3つのウイルス全てについて、ウイルス中和アッセイにより同定された。可変リンカー長を用いた融合により、RSVについて最大で4,000倍、狂犬病ウイルスについて最大で1,500倍、及びインフルエンザH5N1について最大で75倍中和効力を改善する多量体構築物が作製された。多量体VHH構築物は、それらの一価対応物と比較して、中和活性及び交差防御効力を増大させたことから、多量体を標的とした戦略により、抗ウイルス分子の効力を増強しうることが裏付けられた。
米国特許第6,749,857号は、フラビウイルスの切断型80％ Eタンパク質の単一コピー及び80％ Eタンパク質のC末端へと融合させたロイシンジッパードメインによる融合タンパク質について記載している。細胞内で発現させると、その融合タンパク質は、オリゴマー化して、天然で生じるフラビウイルス80％ Eタンパク質のホモ二量体の構造を模倣する、ホモ二量体ポリペプチド複合体を形成する。この手法は、天然の80％ Eタンパク質との構造的類似性を増大させ、免疫原のサイズ及び抗原的複雑性を増大させることにより、融合タンパク質の免疫効力を増大させるようにデザインされた。米国特許第6,749,857号の融合タンパク質は、免疫原の抗原的複雑性を部分的に増大させるようにデザインされた一方で、天然の80％タンパク質の構造を模倣しようと所望することにより、構築物の複雑性は制限された。それ自体、米国特許第6,749,857号の融合タンパク質構築物は、80％タンパク質の単一コピーだけを含有し、2つの融合タンパク質のオリゴマー化により形成される、結果として得られるポリペプチド複合体は、80％タンパク質の2つのコピーだけを含有したことから、この戦略を介して形成される多量体抗原のサイズは制限された。
タンパク質凝集物は、免疫反応を増強することが公知であるが、規定の費用対効果の高い様式でタンパク質を多量体化する、ワクチン使用のための簡単な手法であって、結果として得られる免疫原性の増大が直接的に検証された手法は限られていた。
目的の2つの細胞を近接させることにより、免疫反応を増強するための、他の多成分構築物がデザインされている。例えば、T細胞の活性化は、2つのシグナルを必要とする。第1のシグナルは、抗原提示細胞(APC)上のMHC分子により提示される抗原性ペプチドと結合するT細胞受容体により誘発される。第2の共刺激性シグナルは、APC上のCD80又はCD86と結合したときに、T細胞上のCD28により媒介される。共刺激活性を腫瘍細胞の表面へと選択的に局在化させ、腫瘍特異的T細胞の活性化を増強するため、Asanoらは、抗体様構造を伴う二重特異性共刺激性タンパク質を開発した(Asano et al., 2008. J. Immunother. 31: 752-761)。具体的には、Asanoらは、単一のポリペプチド鎖内に、ヒトCD86のIgV様CD28結合性ドメインを、ヒトIgG1のヒンジドメイン、CH2ドメイン、及びCH3ドメイン、並びに多くのヒト腫瘍細胞の表面上に高レベルで存在するErbB2がん原遺伝子を認識する、scFv抗体断片と共にアセンブルした。Asanoらの結果は、腫瘍細胞に対する特異的な標的化を、共刺激活性と組み合わせる、このような多価可溶性タンパク質が、T細胞介在性腫瘍特異的免疫反応を誘発及び/又は改善する有用なツールとなりうることを示唆する。
両方の細胞の同時的な標的化を可能とする成分を伴う構築物を使用して2つの異なる細胞型を近接させる、別の多成分ワクチン法がデザインされた(Asano et al., 2008. J. Immunother. 31: 752-761)。Asanoらは、腫瘍細胞上の上皮成長因子受容体とT細胞上のCD3とを共に標的化する組換え二重特異性抗体を作製した。二重特異性かつ二価のIgG様抗体は、各標的細胞との、一価ダイアボディーより強力な結合を示した。二重特異性構築物は、一価構築物の場合の10倍の腫瘍細胞細胞傷害作用を媒介した。さらに、二重特異性構築物のFc部分は、抗体依存性細胞傷害作用(ADCC)のための、血中単核細胞上のFc受容体との結合を介して、細胞傷害作用をさらに増強した。この構築物の成長阻害効果は、承認されている治療用抗体であり、同じ上皮成長因子受容体抗原を認識する、セツキシマブを上回った。
Miyataらは、抗原を特異的APCへと標的化する遺伝子融合タンパク質を創出することにより、免疫反応を増強する多成分ワクチン戦略を開発した(Miyata et al., 2011. Infect. Immun. 79: 4260-4275)。融合複合体は、3つの物理的に連結された分子実体: (1)ワクチン抗原、(2)多量体のαへリックスのコイルドコイルコア、及び(3)可動性リンカーを介してコアへと連結されたAPC標的化リガンドからなるものであった。マウスの三成分複合体による免疫化は、抗原だけによる免疫化と比較して、致死性のプラスモディウム・ヨエリー(Plasmodium yoelii)感染に対する防御の増大をもたらす、抗体反応の増強を誘導した。
米国特許第6,749,857号
Schijns, V. E. 2000. Curr. Opin. Immunology 12: 456-463 van Duin et al., 2005. Trends Immunol. Rosenberg, 2006, The AAPS Journal, 8(3):E501-507 Hultberg et al., 2011. PloS ONE 6: e17665 Asano et al., 2008. J. Immunother. 31: 752-761 Miyata et al., 2011. Infect. Immun. 79: 4260-4275
免疫反応を増強するための新たな改善された構築物、特に、添加されるアジュバントの非存在下で免疫反応を増強するのに使用しうる構築物が必要とされている。
本開示は、免疫反応を増強するための、新たな改善された戦略を提供する。これらの改善された戦略は、抗原を多量体化して、それらの免疫原性を増強するための固有の機構を組み込む、融合タンパク質を伴う。抗原を多量体化するための1つの機構は、融合タンパク質内の2つの抗原を隔てるリンカー配列の使用である。理論に束縛されることを意図せずに述べると、このようなリンカー配列は、2つの抗原が、それらが同じ場合であれ、異なる場合であれ、コンフォメーショナルフォールディングを受け、二量体又はより高次の多量体を形成することを可能としうると考えられる。抗原を多量体化するための別の機構は、ロイシンジッパー二量体化ドメイン、T4バクテリオファージフィブリチンモチーフ三量体化ドメイン、又は四量体化ドメインなどのオリゴマー化ドメインの使用である。リンカー配列と組み合わされると、オリゴマー化ドメインは、抗原のさらなる多量体化(例えば、四量体、六量体、八量体など)を可能とする。この手法を使用して、単一の抗原を多量体化することができ、又は2つ以上の異なる抗原を含む多量体を創出することができる。
この多量体化戦略はまた、2つ以上のワクチン関連タンパク質など、2つ以上の目的タンパク質を多量体化するのにも使用することができる。したがって、別の態様は、第1のタンパク質、リンカー配列、第2のタンパク質、及びオリゴマー化ドメインを含む融合タンパク質であって、リンカー配列により、第1のタンパク質が第2のタンパク質へと接続され、第1のタンパク質及び第2のタンパク質が、ワクチン標的タンパク質、アジュバントタンパク質、細胞表面標的化ドメイン、免疫抑制を媒介する分子、又は活性化細胞に結合する細胞表面標的ドメインなど、ワクチン関連タンパク質又はペプチドである、融合タンパク質を対象とする。
別の態様は、融合タンパク質又はオリゴマー化された融合タンパク質をコードする単離された核酸である。さらに別の態様は、被験体へと、融合タンパク質又は融合タンパク質をコードする核酸を含むワクチン組成物を投与することにより、被験体における免疫反応を誘導する方法であって、融合タンパク質が、被験体における免疫反応を誘導する、方法を対象とする。ある種の実施形態では、ワクチン組成物を使用して、アジュバントを使用せずに被験体における免疫反応を誘導する。
破傷風トキソイドが、gp350より強力な、肺炎球菌多糖コンジュゲートワクチンのための担体タンパク質であることを示す図である。マウスを、アラム+CpG-ODN中のマウス1匹当たり1又は5μg(1群当たり5匹ずつのマウス)のgp350-PPS14又はTT-PPS14で腹腔内免疫化し、14日目に、同様の形式でブースティングした。PPS14特異的IgG力価は、21日目に得られる血清からELISAにより測定した。*有意差、gp350-PPS14とTT-PPS14の間で、p≦0.05。 図2Aは、TT特異的CD4+ T細胞エピトープを含有する四量体gp350を産生させるためのDNAプラスミドマップを示す図である。「(Gly4Ser1)3」は、配列番号3として開示され、「His6」は、配列番号14として開示される。図2Bは、TT特異的CD4+ T細胞エピトープを含有する四量体gp350タンパク質の産生を、72A1 mAbで発色させたSDS-PAGE(変性)ゲル及びPAGE(非変性)ゲルにより示す図である。 生理食塩液中で投与される場合であれ、アジュバントと共に投与される場合であれ、四量体gp350の免疫原性が、単量体gp350タンパク質より顕著に大きいことを示す図である。これらの構築物によるDNAワクチン接種もまた、免疫反応の増大を誘導した。マウス(1群当たり5匹ずつ)を、(図3A)アラム又は(図3B)アラム+CpG-ODN中の、マウス1匹当たり表示用量の単量体gp350又は四量体gp350で腹腔内免疫化し、21日目に、同様の様式でブースティングした。マウス(1群当たり7匹ずつ)を、腹部皮内において、総用量4.0μgのDNAのための、1.0μgのDNAワクチンでコーティングした直径1〜3μmの金粒子0.5mgの、2回にわたるタンデム送達により免疫化した。マウスには、4週目に、同様の様式でブースティングした。gp350特異的IgGの血清力価は、表示の時点において、ELISAにより決定した(図3C)。四量体で免疫化されたマウスに由来する血清:「A」及び「B」(35日目、25μgの用量)及び「C」(6週目)を、IgGアイソタイプの血清力価について解析した(図3D)。*有意差、四量体と単量体の間で、p≦0.05。 生理食塩液中で投与される場合であれ、アジュバントと共に投与される場合であれ、四量体gp350の免疫原性が、単量体gp350タンパク質より顕著に大きいことを示す図である。これらの構築物によるDNAワクチン接種もまた、免疫反応の増大を誘導した。マウス(1群当たり5匹ずつ)を、(図3A)アラム又は(図3B)アラム+CpG-ODN中の、マウス1匹当たり表示用量の単量体gp350又は四量体gp350で腹腔内免疫化し、21日目に、同様の様式でブースティングした。マウス(1群当たり7匹ずつ)を、腹部皮内において、総用量4.0μgのDNAのための、1.0μgのDNAワクチンでコーティングした直径1〜3μmの金粒子0.5mgの、2回にわたるタンデム送達により免疫化した。マウスには、4週目に、同様の様式でブースティングした。gp350特異的IgGの血清力価は、表示の時点において、ELISAにより決定した(図3C)。四量体で免疫化されたマウスに由来する血清:「A」及び「B」(35日目、25μgの用量)及び「C」(6週目)を、IgGアイソタイプの血清力価について解析した(図3D)。*有意差、四量体と単量体の間で、p≦0.05。 gp350特異的IgG反応の増強は、四量体gp350によるプライミング及びブースティングの両方を必要とすることを示す図である。表示される通りに、マウス(1群当たり5匹ずつ)に、アラム中の四量体gp350又は単量体gp350により、プライミング及びブースティングした。gp350特異的IgGの血清力価は、ELISAにより決定した。*有意差、p≦0.05。 四量体gp350タンパク質によるマウスの免疫化は、単量体と比べて顕著に高レベルのgp350特異的中和抗体を誘導することを示す図である。ナイーブマウス又は免疫化マウス(35日目、アラム中の、マウス1匹当たり25μgの単量体gp350又は四量体gp350、図3Aを参照されたい)に由来する、25μlのプールされたマウス血清(各々5匹ずつのマウス)を、2.5μlのDyLight 633で標識されたgp350単量体と共にインキュベートした。次いで、CR2M1α細胞を、これらの混合物で染色し、フローサイトメトリーで解析した。多様な濃度の72A1 mAb(gp350特異的中和IgG)を血清の代わりに使用して、定量化のための検量線を作成した。 TTタンパク質によるプライミングが、四量体gp350に対するgp350特異的IgG反応は阻害したが、単量体gp350に対するgp350特異的IgG反応は阻害しなかったことを示す図である。図6Aでは、マウス(1群当たり5匹ずつ)を、アラム中の、マウス1匹当たり25μgの単量体gp350又は四量体gp350で免疫化した。脾臓細胞を各マウスから21日目に採取し、10U/mlのrmIL-2±5μg/mlのP2及びP30 TT特異的ペプチドを含有する培地中で、5時間にわたり個別に培養した。培養開始の1時間後に、Golgi Stopを添加した。次いで、細胞を細胞質IL-4又はIL-5について染色し、フローサイトメトリーで解析した。各サイトカインについて陽性染色のゲーティングされた(gated)CD4+細胞の百分率を、図6Aに例示する。*有意差、p≦0.05。図6B及び6Cでは、マウス(1群当たり5匹ずつ)を、アラム中の、マウス1匹当たり25μg(図6B)又はマウス1匹当たり0.25μg(図6C)の全TTで、14日間にわたり免疫化した。次いで、マウスに、アラム中の25μgの四量体gp350又は単量体gp350を投与し、14日後において、同様にブースティングした。gp350特異的IgGの血清力価は、ELISAにより決定した。*有意差、p≦0.05。 ナイーブマウスでは、四量体gp350内のTT特異的T細胞エピトープは、gp350特異的IgG反応に寄与しないことを示す図である。図7Aでは、マウス(1群当たり5匹ずつ)を、アラム中の、マウス1匹当たり25μg若しくは1.0μgの単量体gp350タンパク質、TTエピトープを含有する四量体gp350(「四量体」)、又はTTエピトープを伴わない四量体gp350(「四量体-tt」)で免疫化し、21日目に、同様の様式でブースティングした。gp350特異性の血清力価は、ELISAにより測定した(図7A)。*有意差、四量体と単量体の間で、p≦0.05、#有意差、四量体-ttと単量体の間で、p≦0.05。図7Bは、「A」に由来する血清のgp350特異的中和力価を示す(図5に記載される通り、マウス1匹当たり25μg、35日目); *有意差、単量体と対比した四量体又は四量体-ttについて、p≦0.05。図7Cは、図3Cに記載される通り、単量体、四量体、及び四量体-ttをコードするプラスミドによるDNA免疫化を示す; *有意差、単量体と対比した四量体又は四量体-ttについて、p≦0.05。 四量体gp350は、単量体gp350より強く、ヒトCD21に結合することを示す図である。CR2M1α細胞を、gp350単量体又はgp350四量体(0.05〜30μg/ml)と共に、氷上で30分間にわたりインキュベートし、洗浄し、次いで、2L10 mAb(マウスIgG1抗gp350 mAb)と共に、30分間にわたりさらにインキュベートした。次いで、細胞を洗浄した後、DyLight 633で標識されたヤギ抗マウスIgGにより染色した。細胞は、フローサイトメトリーにより解析した。破線: gp350を伴わないCR2M1α細胞、実線: gp350を伴うCR2M1α細胞。 単量体gp350も、四量体gp350も、ヒトB細胞を、ポリクローン的には活性化しないことを示す図である。精製された末梢血ヒトB細胞を、単量体gp350若しくは四量体gp350(10μg/ml)、組換えPspA(10μg/ml)、ヤギ抗ヒトIgM F(ab')2(20μg/ml)、又はSAC(1:100の希釈率)+組換えヒトIL-2(200IU/ml)と共に、24又は72時間にわたり培養した。次いで、細胞を、PEとコンジュゲートさせた抗CD69 mAb(刺激の24時間後)又はPEとコンジュゲートさせた抗CD25 mAb+FITCとコンジュゲートさせた抗CD86 mAb(刺激の72時間後)で染色し、フローサイトメトリーで解析した。 四量体gp350タンパク質(0.2μg、1.0μg、又は5.0μg)によるウサギの免疫化は、単量体と比べて顕著に高レベルのgp350特異的中和抗体を誘導することを示す図である。
本明細書に組み込まれ、本明細書の一部を構成する添付の図面は、ある種の実施形態を例示し、書かれた記載と共に、本明細書で開示される構築物及び方法の一定の原理を説明するのに用いられる。
以下の詳細な記載は、読者に、本発明の態様のある種の実施形態、特色、及び詳細についてのより十分な理解を与えるために提示されるものであり、本発明の範囲の限定として解釈すべきものではないことを理解されたい。
定義
本発明をよりたやすく理解しうるように、特定の用語をまず定義する。詳細な記載を通して、さらなる定義も示される。
本開示で使用される「抗体」という用語は、免疫グロブリン又はその抗原結合性断片を指す。「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単一特異性抗体、多特異性抗体、非特異性抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、単鎖抗体、キメラ抗体、合成抗体、組換え抗体、ハイブリッド抗体、突然変異抗体、移植抗体、及びin vitro生成抗体を含むがこれらに限定されない。抗体は、定常領域、又はその部分、例えば、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン、及びミュー定常領域遺伝子を含みうる。例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD、及びIgEを含む、多様なアイソタイプの重鎖定常領域を使用することができる。例として、軽鎖定常領域は、カッパ又はラムダでありうる。
「抗原結合性ドメイン」及び「抗原結合性断片」という用語は、抗体と抗原との間の特異的結合を担うアミノ酸を含む抗体分子の一部を指す。ある種の抗原については、抗原結合性ドメイン又は抗原結合性断片は、抗原の一部だけに結合しうる。抗体によって特異的に認識され、結合される抗原の一部は、「エピトープ」又は「抗原決定基」と称される。抗原結合性ドメイン及び抗原結合性断片は、Fab(抗原結合性断片); F(ab')2断片、ヒンジ領域においてジスルフィド架橋により連結した2つのFab断片を有する二価断片; Fv断片; 単鎖Fv断片(scFv)(例えば、Bird et al. (1988) Science 242:423-426、及びHuston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883を参照されたい); 2つのVH及びCH1ドメインを有するFd断片; dAb(Ward et al., (1989) Nature 341:544-546)、並びに抗原結合性機能を保持する他の抗体断片を含む。Fab断片は、定常領域の間でジスルフィド結合により共有結合的に連結された、VH-CH1及びVL-CLドメインを有する。Fv断片とは、小型であり、非共有結合的に連結されているVH及びVLドメインを有する。非共有結合的に連結されたドメインが解離する傾向を克服するため、scFvを構築することができる。scFvは、(1)VHのC末端を、VLのN末端へと連結する可動性ポリペプチド、又は(2)VLのC末端を、VHのN末端へと連結する可動性ポリペプチドを含有する。15マーの(Gly4Ser)3ペプチド(配列番号3)をリンカーとして用いうるが、当技術分野では、他のリンカーも公知である。これらの抗体断片は、当業者に公知の従来の技法を使用して得られ、その断片は無傷抗体と同じ様式で機能について評定される。
「融合タンパク質」という用語は、第1のタンパク質をコードする第1の核酸配列と、第2のタンパク質をコードする少なくとも第2の核酸とを組み合わせることにより作製された核酸転写物から翻訳されたタンパク質を指し、この場合、融合タンパク質は、天然で生じるタンパク質ではない。核酸構築物は、融合タンパク質内で接続される2つ以上のタンパク質をコードしうる。
「アジュバントタンパク質」という用語は、抗原に対する免疫系の応答を増強するタンパク質を指す。アジュバントタンパク質は、特異的抗原と組み合わせて使用されると、抗原特異的免疫反応を加速化し、延長し、又は増強しうる。例示的なアジュバントタンパク質は、フラジェリン、熱ショックタンパク質、toll様受容体リガンド、又はアジュバント化特性を保持するこれらの断片若しくは誘導体を含むがこれらに限定されない。
「細胞表面標的化ドメイン」という用語は、抗原、ワクチン、又は特定の細胞を、特定の細胞表面受容体との結合により、別の特定の細胞型へと向かわせる任意の部分を指す。例示的な細胞表面標的化ドメインは、抗体又はその抗原結合性断片を含むがこれらに限定されない。
「細胞活性化ドメイン」という用語は、細胞に特異的又は非特異的に結合し、細胞活性化を誘導することが可能な任意の部分を指す。例示的な細胞活性化ドメインは、B細胞上のCD40及びT細胞上のCD28を含むがこれらに限定されない。
「免疫抑制媒介分子」又は「免疫抑制を媒介する分子」という用語は、細胞と結合すると、例えば、増殖、分化、又は分泌を含む、活性化の任意の段階において、細胞の活性化の抑制を誘導する分子を指す。例示的な免疫抑制を媒介する分子は、B-7、CTLA-4、PD-1、Lag-3、Tim-3、CD200:CD200R、2B4、CD160、PIR-B、BTLA、及びGP49bを含むがこれらに限定されない。
「製薬上許容される担体」又は「製薬上許容される添加剤」という用語は、医薬の投与に適合した溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤、並びに吸収遅延剤などを意味する。当技術分野では、薬学的に活性な物質のためのこのような媒体及び薬剤の使用が周知である。
ポリペプチド又は核酸の文脈で使用される場合の「単離された」という用語は、その天然の環境を実質的に含まず、したがって、偶然に天然で生じうるポリペプチド又は核酸からは識別しうるポリペプチド又は核酸を意味する。例えば、単離されたポリペプチド又は核酸は、それが由来する細胞又は組織供給源に由来する、細胞物質又は他のポリペプチド若しくは核酸を実質的に含まない。「単離された」という用語はまた、単離されたポリペプチド又は核酸が医薬組成物のために十分に純粋であるか、又は少なくとも70〜80％(w/w)純粋であるか、又は少なくとも80〜90％(w/w)純粋であるか、又は少なくとも90〜95％純粋であるか、又は少なくとも95％、96％、97％、98％、99％、若しくは100％(w/w)純粋である調製物も指す。
本明細書では、「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語を、アミノ酸のポリマーを指すのに互換的に使用する。
融合タンパク質
本開示は、ワクチン関連構築物又は他の免疫療法構築物中のタンパク質抗原を多量体化するための新たな戦略に関する。戦略は、コードされた融合タンパク質が、単一の核酸構築物から二量体の複合体、三量体の複合体、四量体の複合体、六量体の複合体、七量体の複合体、又は八量体の複合体を形成しうるように、オリゴマー化モチーフと、2つ以上の抗原を隔てるリンカー配列とを有する核酸構築物を創出することを伴う。この戦略をまず、リンカーで隔てられた2コピーの切断型EBV gp350タンパク質と、ロイシンジッパーオリゴマー化ドメインとをコードする核酸構築物で検査した。構築物の免疫原性を増強するために、破傷風トキソイドに由来する2つの強力なT細胞エピトープを組み入れた。なぜなら、それらは十分なT細胞ヘルプを動員するのに必要であると考えられるからである。ロイシンジッパードメインにより、この構築物は、発現させると、四量体のgp350複合体を形成した。従来の単量体gp350と比較して、四量体は、弱い外因性アジュバント及び強い外因性アジュバントの存在下の両方で、特異的抗体の産生について、約25〜50倍高い免疫原性を示した。しかし、驚くべきことに、破傷風トキソイドのT細胞エピトープを含有する四量体は、実際には、破傷風トキソイドであらかじめ免疫化された動物では、免疫抑制を誘導し、これは、臨床で使用される場合の潜在的問題である。これらの結果に基づき、破傷風トキソイドエピトープを伴わない別の核酸構築物を調製した。この構築物は、リンカーで隔てられた2コピーの切断型EBV gp350タンパク質と、ロイシンジッパーオリゴマー化ドメインとをコードした。破傷風トキソイドエピトープを伴わない構築物は、破傷風トキソイドエピトープを含有する構築物により誘導される抗体反応と同等なgp350特異的抗体反応を誘導し、このことから、破傷風トキソイドエピトープは、プライミングされていない動物における最適な免疫原性を達成するのには必要とされず、実のところ、抑制性でありうることが予測外に示される。
タンパク質を多量体化するためのこの戦略は、他のウイルス抗原、細菌抗原、寄生虫抗原、自己免疫抗原、及び腫瘍抗原を含む、EBV gp350/220タンパク質以外のタンパク質に対しても利用することができる。このプラットフォームを使用して、EBV gp350/220抗原など、目的とする単一の抗原の複数コピーを含む多量体融合タンパク質を創出することができる。例えば、ホモ二量体、ホモ三量体、又は四量体は、同じ抗原の2つ、3つ、又は4つのコピーを、二量体化ドメイン、三量体化ドメイン、又は四量体化ドメインと共に使用して創出することができる。オリゴマー化ドメインが一体に会合すると、構築物は、4つの同じ抗原のコピーを含む四量体(二量体化ドメインを使用する場合)、6つの同じ抗原のコピーを含む六量体(三量体化ドメインを使用する場合)、又は8つの同じ抗原のコピーを含む八量体(四量体化ドメインを使用する場合)を形成する。
代替的に、このプラットフォームを使用して、2つ以上の異なる目的抗原を含む多量体融合タンパク質を創出することができる。例えば、ヘテロ二量体は、第1の抗原を第2の異なる抗原へと連結されることにより創出することができる(又は2つ若しくは3つの異なる抗原を含むヘテロ三量体)。オリゴマー化ドメインが一体に会合すると、構築物は、第1の抗原及び第2の抗原の両方について二量体である四量体(二量体化ドメインを使用する場合)、少なくとも第1の抗原及び第2の抗原について二量体である六量体、又は第1の抗原、第2の抗原、及び第3の抗原について三量体である六量体(構築物中で三量体化ドメインを使用する場合)、あるいは八量体(四量体化ドメインを使用する場合)を形成する。代替的に、元のタンパク質が、三量体化ドメインと結合させた単量体形態で提示される場合は、三量体のタンパク質を形成することができる。
一態様は、第1の抗原、リンカー配列、第2の抗原、及びオリゴマー化ドメインを含む融合タンパク質であって、リンカー配列により、第1の抗原が第2の抗原へと接続され、破傷風トキソイドタンパク質を含まない、融合タンパク質を対象とする。一実施形態では、第1の抗原と第2の抗原とは、同じである。別の実施形態では、第1の抗原及び第2の抗原は、異なる。第1の抗原及び第2の抗原は、ウイルス抗原、細菌抗原、寄生虫抗原、自己免疫抗原、又は腫瘍抗原でありうる。一実施形態では、第1の抗原及び第2の抗原は、ポリペプチド及び/又は多糖を含む。一実施形態では、融合タンパク質は、宿主細胞内で発現させると、多量体タンパク質を形成する。別の実施形態では、第1の抗原、第2の抗原、及び第3の抗原は、天然では、多量体タンパク質として生じない。
融合タンパク質は、第3のタンパク質及び第2のリンカー配列をさらに場合により含みうるが、この場合、第2のリンカー配列により、第2の抗原は、第3の抗原、第1の抗原、又はオリゴマー化ドメインへと接続される。他の実施形態では、融合タンパク質は、4つ以上のタンパク質及びさらなるリンカーを含む。一実施形態では、融合タンパク質は、宿主細胞内で発現させると、多量体タンパク質を形成する。別の実施形態では、第1の抗原及び第2の抗原は、天然では、多量体タンパク質として生じない。
ある種の実施形態では、オリゴマー化ドメインは、二量体化ドメインである。他の実施形態では、オリゴマー化ドメインは、三量体化ドメイン又は四量体ドメインである。一実施形態では、二量体化ドメインは、酵母GCN4ロイシンジッパードメイン又はその誘導体を含むがこれらに限定されない、ロイシンジッパードメインである。別の実施形態では、三量体化ドメインは、T4バクテリオファージフィブリチンモチーフ若しくは真核細胞GNC4転写因子モチーフ又はそれらの誘導体である。他の実施形態では、四量体ドメインは、改変された真核細胞GCN4転写因子モチーフ又はその誘導体である。2つの抗原を伴う実施形態では、オリゴマー化ドメインは、第1の抗原の前の、融合タンパク質のN末端に配置することもでき、第2の抗原の後の、融合タンパク質のC末端に配置することもでき、又は第1の抗原と第2の抗原との間に配置することもできる。融合タンパク質が第3のタンパク質をさらに含む実施形態では、オリゴマー化ドメインは、第1の抗原の前の、融合タンパク質のN末端に配置することもでき、第3の抗原の後の、融合タンパク質のC末端に配置することもでき、第1の抗原と第2の抗原との間又は第2の抗原と第3のタンパク質との間に配置することもできる。融合タンパク質が4つ以上のタンパク質を含む実施形態では、オリゴマー化ドメインは、第1の抗原の前の、融合タンパク質のN末端に配置することもでき、最後の抗原の後の、融合タンパク質のC末端に配置することもでき、又は融合タンパク質内の任意の抗原の間に配置することもできる。
一実施形態では、第1の抗原及び第2の抗原は、gp350/220抗原、gH、gL、gB、又はgp42を含むがこれらに限定されないEBV抗原である。一実施形態では、融合タンパク質は、EBV gp350/220、gH、gL、gB、又はgp42のホモ二量体又はホモ三量体を含む。別の実施形態では、融合タンパク質は、gHとgL、gBとgp42、gp350/220とgB、gp350/220とgp42のヘテロ二量体、又はgHとgLとgB、gHとgLとgp42、gp350/220とgHとgL、又はgp350/220とgBとgp42のヘテロ三量体など、gp350/220、gH、gL、gB、又はgp42から選択されるEBV抗原のヘテロ二量体又はヘテロ三量体を含む。
別の実施形態では、第1の抗原及び第2の抗原は、gB、gL、gH、又はpp65を含むがこれらに限定されないCMV抗原である。さらに別の実施形態では、第1の抗原は、gp350/220抗原を含むがこれらに限定されないEBV抗原であり、第2の抗原は、gB、gL、gH、又はpp65を含むがこれらに限定されないCMV抗原である。一実施形態では、融合タンパク質は、gB、gL、gH、又はpp65のホモ二量体又はホモ三量体を含む。別の実施形態では、融合タンパク質は、gBとgL、gBとgH、gBとpp65、gLとgH、gLとpp65、若しくはgHとpp65のヘテロ二量体、又はgBとgLとgH、gBとgLとpp65、gBとgHとpp65、若しくはgLとgHとpp65のヘテロ三量体など、gB、gL、gH、及びpp65から選択されるCMV抗原のヘテロ二量体又はヘテロ三量体を含む。
さらに別の実施形態では、第1の抗原は、gp350/220抗原、gH、gL、gB、又はgp42を含むがこれらに限定されないEBV抗原であり、第2の抗原は、gB、gL、gH、又はpp65を含むがこれらに限定されないCMV抗原である。一実施形態では、第1の抗原は、gp350/220抗原であり、第2の抗原は、CMV gB、gL、gH、又はpp65である。
別の実施形態では、第1の抗原は、gp350/220抗原、gH、gL、gB、又はgp42を含むがこれらに限定されないEBV抗原であり、第2の抗原は、Env(gp160、gp140、gp120、及びgp41、gp140、gp120、又はgp41を含むがこれらに限定されないエンベロープタンパク質)、Gag(カプシドタンパク質)、Pol(ポリメラーゼタンパク質)、Tat、Vif、Vpu、Vpr、Rev及びNefを含むがこれらに限定されないHIV抗原である。当然ながら、これらの特異的なウイルス抗原は、例示的なものである。一実施形態では、第1の抗原は、gp350/220抗原であり、第2の抗原は、HIV Env(gp160、gp140、gp120、及びgp41、gp140、gp120、又はgp41を含むがこれらに限定されないエンベロープタンパク質)、Gag(カプシドタンパク質)、Pol(ポリメラーゼタンパク質)、Tat、Vif、Vpu、Vpr、Rev、又はNefである。本明細書の開示を踏まえれば、当業者は、任意の目的抗原を、本明細書で記載される融合タンパク質構築物へと代入しうる。本明細書の他のセクションでは、さらなるウイルス、細菌、寄生虫、自己免疫、及び腫瘍抗原について、より詳細に論じる。
別の態様は、第1のタンパク質、リンカー配列、第2のタンパク質、及びオリゴマー化ドメインを含む融合タンパク質であって、リンカー配列により、第1のタンパク質が第2のタンパク質へと接続され、第1のタンパク質及び第2のタンパク質が、ワクチン標的タンパク質、アジュバントタンパク質、細胞表面標的化ドメイン、免疫抑制を媒介する分子、又は細胞活性化ドメインなどのワクチン関連タンパク質である、融合タンパク質を対象とする。
一実施形態では、融合タンパク質は、第1のタンパク質、リンカー配列、第2のタンパク質、及びオリゴマー化ドメインを含み、リンカー配列により、第1のタンパク質が第2のタンパク質へと接続され、第1のタンパク質は、ウイルス抗原、細菌抗原、寄生虫抗原、自己免疫抗原、腫瘍抗原、又は他のタンパク質抗原であり、第2のタンパク質は、アジュバントタンパク質であるか、又は細胞表面標的化ドメインを含む。ある種の実施形態では、第2のタンパク質は、フラジェリン、又は熱ショックタンパク質、又はtoll様受容体(TLR)リガンドなどのアジュバントタンパク質である。ある種の実施形態では、細胞表面標的化ドメインは、マクロファージ、樹状細胞、又はBリンパ球を含むがこれらに限定されない抗原提示細胞に特異的である。別の実施形態では、第1のタンパク質は、ウイルス抗原、細菌抗原、寄生虫抗原、自己免疫抗原、又は腫瘍抗原であり、第2のタンパク質は、細胞表面標的化ドメインを含み、融合タンパク質は、第3のタンパク質をさらに含み、第3のタンパク質は、細胞活性化ドメインを含む。このようにして、融合タンパク質を使用して、抗原を特定の細胞へと標的化し、同時に、特定の細胞を活性化させることができる。
別の実施形態では、融合タンパク質は、第1のタンパク質、リンカー配列、第2のタンパク質、及びオリゴマー化ドメインを含み、リンカー配列により、第1のタンパク質が第2のタンパク質へと接続され、第1のタンパク質は、第1の細胞表面標的化ドメインを含み、第2のタンパク質は、第2の細胞表面標的化ドメインを含み、第1の細胞表面標的化ドメインと第2の細胞表面標的化ドメインとは、異なる細胞を標的とする。このようにして、融合タンパク質を使用して、ナチュラルキラー細胞又は細胞傷害性Tリンパ球と腫瘍細胞となど、異なる種類の細胞を互いに近接させることができる。一実施形態では、第1の細胞表面標的化ドメインは、ナチュラルキラー細胞上のリガンドに結合する。
別の実施形態では、融合タンパク質は、第1のタンパク質、リンカー配列、第2のタンパク質、及びオリゴマー化ドメインを含み、リンカー配列により、第1のタンパク質が第2のタンパク質へと接続され、第1のタンパク質は、免疫抑制を媒介する分子であり、第2のタンパク質は、活性化細胞に結合する細胞表面標的ドメインである。一実施形態では、免疫抑制を媒介する分子は、抗体のFc受容体(例えば、Fcガンマ受容体、Fcアルファ受容体、又はFcイプシロン受容体)に結合し、活性化細胞に結合する細胞表面標的ドメインは、マスト細胞上のリガンドに結合する。一実施形態では、Fc受容体は、Fcガンマ受容体である。このようにして、融合タンパク質構築物を使用して、例えば、アレルギー反応時に、特定の細胞の活性化を抑制することができる。
さらに別の実施形態では、融合タンパク質は、第1のタンパク質、リンカー配列、第2のタンパク質、及びオリゴマー化ドメインを含み、リンカー配列により、第1のタンパク質が第2のタンパク質へと接続され、第1のタンパク質及び第2のタンパク質は、HIVタンパク質である。一実施形態では、第1のタンパク質及び第2のタンパク質は、Env(gp160、gp140、gp120、及びgp41、gp140、gp120、又はgp41を含むがこれらに限定されないエンベロープタンパク質)、Gag(カプシドタンパク質)、Pol(ポリメラーゼタンパク質)、Tat、Vif、Vpu、Vpr、Rev、及びNefから選択される。一実施形態では、第1のHIVタンパク質は、gp120であり、第2のHIVタンパク質は、gp41であり、オリゴマー化ドメインは、三量体化ドメインである。ある種の実施形態では、第1のタンパク質及び第2のタンパク質は、gp120及びgp41などのHIVタンパク質であり、オリゴマー化ドメインは、三量体化ドメインであり、融合タンパク質は、第3のタンパク質及び第2のリンカー配列をさらに含み、場合により、第4のタンパク質及び第3のリンカー配列をさらに含む。一実施形態では、第3のタンパク質は、EBV gp350/220抗原である。別の実施形態では、第3のタンパク質及び第4のタンパク質は、EBV gp350/220抗原である。
ある種の実施形態では、オリゴマー化ドメインは、二量体化ドメインである。他の実施形態では、オリゴマー化ドメインは、三量体化ドメイン又は四量体ドメインである。一実施形態では、二量体化ドメインは、酵母GCN4ロイシンジッパードメイン又はその誘導体を含むがこれらに限定されない、ロイシンジッパードメインである。別の実施形態では、三量体化ドメインは、T4バクテリオファージフィブリチンモチーフ若しくは真核細胞GNC4転写因子モチーフ又はそれらの誘導体である。他の実施形態では、四量体ドメインは、改変された真核細胞GNC4転写因子モチーフ又はその誘導体である。
2つのタンパク質を伴う実施形態では、オリゴマー化ドメインは、第1のタンパク質の前の、融合タンパク質のN末端に配置することもでき、第2のタンパク質の後の、融合タンパク質のC末端に配置することもでき、又は第1のタンパク質と第2のタンパク質との間に配置することもできる。3つのタンパク質を伴う実施形態では、オリゴマー化ドメインは、第1のタンパク質の前の、融合タンパク質のN末端に配置することもでき、第3のタンパク質の後の、融合タンパク質のC末端に配置することもでき、第1のタンパク質と第2のタンパク質との間又は第2のタンパク質と第3のタンパク質との間に配置することもできる。融合タンパク質が4つ以上のタンパク質を含む実施形態では、オリゴマー化ドメインは、第1の抗原の前の、融合タンパク質のN末端に配置することもでき、最後の抗原の後の、融合タンパク質のC末端に配置することもでき、又は融合タンパク質内の任意の抗原の間に配置することもできる。
抗原
本明細書で使用される「抗原」とは、動物又はヒトの細胞又は組織内で発現させると、免疫反応を誘発することが可能な、タンパク質若しくはその断片、又はタンパク質担体へと連結された多糖を意味する。タンパク質又はその断片は、グリコシル化されてもよく、又はグリコシル化されなくてもよい。例は、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、寄生虫タンパク質、自己免疫タンパク質、及び腫瘍タンパク質を含むがこれらに限定されない。抗原は、野生型タンパク質、そのタンパク質の切断形態、そのタンパク質の突然変異形態、又はそのタンパク質の他の任意の変異体であってよく、各場合において、ワクチン接種される動物又はヒト宿主において発現すると、免疫反応に寄与することが可能である。ある種の実施形態では、抗原は、例えば、それらの開示が参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、以下の米国特許出願公開:US2011/0097357及びUS2011/0274720において記載されている通り、グリコシル化コンセンサス配列を含むタンパク質担体へと連結された、病原性細菌に由来する抗原的多糖などの多糖である。
ウイルス抗原が由来するウイルス性病原体は、オルトミクソウイルス、例えば、インフルエンザウイルス; レトロウイルス、例えば、RSV、HTLV-I、及びHTLV-II、ヘルペスウイルス、例えば、エプスタイン-バーウイルス(EBV); サイトメガロウイルス(CMV)、又は単純ヘルペスウイルス; レンチウイルス、例えば、1型ヒト免疫不全ウイルス(HIV-1)及びHIV-2; ヘパドナウイルス、例えば、B型肝炎ウイルス(HBV); フラビウイルス、例えば、デング熱ウイルス; ラブドウイルス、例えば、狂犬病ウイルス; ピコルナウイルス、例えば、ポリオウイルス; ポックスウイルス、例えば、ワクシニアウイルス; ロタウイルス; 及びパルボウイルス、例えば、アデノ随伴ウイルス(AAV)を含むがこれらに限定されない。
ウイルス抗原の例は、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)抗原であるRev、Pol、Nef、Gag、Env、Tat、Tatの突然変異誘導体、例えば、Tat-δ31-45、gp120のT細胞エピトープ及びB細胞エピトープ、HIV-1 Env及びgp120のキメラ誘導体、例えば、gp120とCD4の融合体、gp41、切断型若しくは改変型HIV-1 Env、例えば、gp140、又はHIV-1 Env及び/若しくはgp140の誘導体を含むがこれらに限定されない群内で見出すことができる。他の例は、EBVエンベロープ糖タンパク質、例えば、gp350/220; CMV抗原、例えば、gB、gL、gH、又はpp65; B型肝炎表面抗原; ロタウイルス抗原、例えば、VP4及びVP7; インフルエンザウイルス抗原、例えば、ヘマグルチニン、ノイラミニダーゼ、M2、又は核タンパク質; フラビウイルス抗原、例えば、非構造タンパク質NS1; 及び単純ヘルペスウイルス抗原、例えば、チミジンキナーゼである。EBV gp350/220抗原については、下記でより詳細に論じる。
細菌抗原が由来しうる細菌性病原体の例は、連鎖球菌(Streptococcus)属種(肺炎連鎖球菌(S. pneumoniae)を含む)、腸球菌(Enterococcus)属種、赤痢菌(Shigella)属種、サルモネラ(Salmonella)属種、マイコバクテリウム(Mycobaterium)属種、クロストリジウム(Clostridium)属種、リケッチア(Rickettsia)属種、ピロリ菌(Helicobacter pylori)種、大腸菌(Escherichia coli)種、シュードモナス(Pseudomonas)属種、リステリア(Listeria)属種、レジオネラ・ニューモニエ(Legionella pneumonia)、ボレリア・ブルグドルフェリ(Borellia burgdorferi)、ジフテリア菌(Corynebacterium diphtheria)、百日咳菌(Bordetella pertussis)、クラミジア・トラコマチス(Chlamydia trachomitis)、インフルエンザ菌(Haemophilus influenza)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、コレラ菌(Vibrio cholera)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、又は炭疽菌(Bacillus anthracus)を含むがこれらに限定されない。
細菌性病原体の防御抗原の例は、肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)のニューモリシン、PsaA、PspC、ヒスチジントライアド(histidine triad)タンパク質、及び線毛タンパク質; 腸管毒素原性大腸菌(E. coli)の体細胞抗原、例えば、CFA/I線毛抗原及び易熱性毒素の非毒性Bサブユニット; 百日咳菌(Bordetella pertussis)のパータクチン、百日咳菌(B. pertussis)のアデニル酸シクラーゼ溶血毒素、破傷風菌(Clostridium tetani)の破傷風毒素のCフラグメント、ボレリア・ブルグドルフェリ(Borellia burgdorferi)のOspA、発疹チフスリケッチア(Rickettsia prowazekii)及び発疹熱リケッチア(Rickettsia typhi)の防御性準結晶表層タンパク質、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)のリステリオリシン(「Llo」及び「Hly」としても公知の)及び/若しくはスーパーオキシドジスムターゼ(「SOD」及び「p60」としても公知の)、ピロリ菌(Helicobacter pylori)のウレアーゼ、並びに致死毒素の受容体結合性ドメイン、及び/又は炭疽菌(Bacillus anthracus)の防御抗原を含む。
寄生虫抗原が由来する寄生虫病原体は、マラリア原虫(Plasmodium)属種、例えば、熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)、トリパノソーマ(Trypanosome)属種、例えば、クルーズトリパノソーマ(Trypanosoma cruzi)、ジアルジア(Giardia)属種、例えば、ランブル鞭毛虫(Giardia intestinalis)、ウシマダニ(Boophilus)属種、バベシア(Babesia)属種、例えば、バベシア・ミクロチ(Babesia microti)、エントアメーバ(Entamoeba)属種、例えば、赤痢アメーバ(Entamoeba histolytica)、アイメリア(Eimeria)属種、例えば、アイメリア・マキシマ(Eimeria maxima)、リーシュマニア(Leishmania)属種、住血吸虫(Schistosome)属種、ブルギア(Brugia)属種、ファスシダ(Fascida)属種、イヌ糸状虫(Dirofilaria)属種、糸状虫(Wuchereria)属種、及びオンコセレア(Onchocerea)属種を含むがこれらに限定されない。
寄生虫病原体の防御抗原の例は、マラリア原虫(Plasmodium)属種のスポロゾイト周囲(CS)又は肝臓期特異的抗原(LSA)であるLSA-1及びLSA-3、例えば、P.ベルゲリー(P. bergerii)又は熱帯熱マラリア原虫(P. falciparum)のCS又はLSA-1及びLSA-3、又はこれらの免疫原性突然変異体; マラリア原虫属種のメロゾイト表面抗原、赤痢アメーバ(Entamoeba histolytica)のガラクトース特異的レクチン、リーシュマニア(Leishmania)属種のgp63、森林型熱帯リーシュマニア(Leishmania major)のgp46、マレー糸状虫(Brugia malayi)のパラミオシン、マンソン住血吸虫(Schistosoma mansoni)のトリオースリン酸イソメラーゼ、コルブリフォルミス毛様線虫(Trichostrongylus colubriformis)の分泌性グロビン様タンパク質、カンテツ(Frasciola hepatica)、ボビス住血吸虫(Schistosoma bovis)、及び日本住血吸虫(S. japonicum)のグルタチオン-S-トランスフェラーゼ、並びにボビス住血吸虫及び日本住血吸虫のKLHを含む。
融合タンパク質はまた、レシピエント細胞内で発現する任意の細胞タンパク質でありうる宿主抗原、例えば、限定されないが、腫瘍抗原、移植抗原、及び自己免疫抗原も含みうる。このような抗原の例は、前立腺特異抗原、ムチン1(MUC1)、gp100、HER2、AE37、E75、GP2、TAG-72、癌胎児抗原(CEA)、黒色腫関連抗原1(MAGE-1)、チロシナーゼ、CD3、及びIASベータ鎖を含むがこれらに限定されない。
エプスタイン-バーウイルス
4型ヒトヘルペスウイルスとしても公知のエプスタイン-バーウイルス(EBV)は、有病率及び死亡率の主要な全世界的原因であり、バーキットリンパ腫、鼻咽頭癌、伝染性単核症、ホジキン病のサブセット、及び免疫抑制患者におけるリンパ増殖性症候群などの病原性実体の一因となっている[1〜3]。EBVは、二本鎖の直鎖状DNAゲノムを有する。EBVゲノムのヌクレオチド配列(配列番号15)及びこれによりコードされるウイルスタンパク質のアミノ酸配列は、公知であり、NCBI参照番号NC_009334、バージョンNC_009334.1、GI:139424470の下に示されており、これらの配列は、参照により本明細書に組み込まれる。
開発途上世界では、EBV血清転換(seroconversion)は、幼児期に生じることが典型的であるが、先進国では、青年期に罹患する可能性が高い。伝染性単核症は、この後者の群だけにおいて生じることが典型的である[3]。潜伏性EBV及びEBV伝染の主要なヒト保有細胞は、休止メモリーBリンパ球である[4]。EBVは、B細胞へのウイルス侵入について、gp350-CD21間結合イベントに依存し[5、6]、このイベントは、感染性及びB細胞の新生物性形質転換に極めて重要である[2]。gp350が、主要なEBV外膜糖タンパク質であるのに対し、2型補体受容体(CR2)としてもまた公知のCD21は、iC3b補体タンパク質に結合する、B細胞の表面上の受容体である。活性EBV感染を伴う患者に由来する血清は、B細胞へのEBVの侵入を防止する抗体(「中和」抗体)を含有する。これらの血清にgp350を吸着させると、この中和活性の大半が消失し[7]、このことから、gp350は、防御性体液性免疫反応が指向する主要なEBV抗原として機能することが示される。
多数の研究が、アジュバント中のサブユニットgp350ワクチンで非ヒト霊長動物を免疫化すると、実験的なEBV誘導型リンパ腫又はEBV複製に対する防御がなされることを裏付けている。こうして、精製された天然gp350を、リポソーム、ISCOM、又はムラミルジペプチドと会合させてワタボウシマーモセット(CTM)へと注射したところ、EBV誘導型リンパ腫に対する防御がなされた[8、9]。アラム中又はムラミルジペプチド中の組換えgp350も同様に防御性であった[10、11]。また、コモンマーモセットも、アラム中の組換えgp350による免疫化に続くEBV感作後に、ウイルス複製の減少を示した[12]。アデノウイルスベクター又はワクシニアウイルスベクターにより発現させたgp350を使用する非ヒト霊長動物研究も同様に、CTM又はコモンマーモセットにおける実験的EBV誘導型リンパ腫又はEBV複製に対する防御を示した[13〜15]。
また、ヒトにおけるパイロット研究も、EBVに対する宿主防御におけるgp350ワクチン接種の潜在的役割を示唆した。Guら[16]による研究では、ワクシニアウイルス(VV)により発現させたgp350/220の単回投与を、スカリフィケーションにより、EBV血清陰性及びVV血清陰性の1〜3歳児へと施した。これらの小児は、EBVに対する中和抗体(1:40〜1:160)を発生させた。ワクチン接種されなかった10例の対照中10例が、追跡の16カ月後に感染し、ワクチン接種された9例の小児のうち、この時点で感染したのは3例だけであった。より近年になって、健康なEBV血清陰性成人をアラム±モノホスホリルリピドA中の組換え単量体gp350タンパク質で免疫化するI/II相研究が行われた[17、18]。3回の投与の後、被験体のうちの最大で82％が、検出可能な中和血清抗gp350抗体力価を示した。ワクチンは、伝染性単核症の発症の防止では、78.0％の有効性を示したが、無症候性EBV感染の防止では、有効性を示さなかった。最後に、慢性腎疾患を伴う小児に対して施された、アラム中の組換え単量体gp350タンパク質についてのさらなるI相試験は、少数の被験体だけが、検出可能な中和血清抗gp350力価を発生させることを示した[19]。
gp350誘導型IgG反応を評価するI/II相ヒト臨床試験で使用された単量体のタンパク質は、それ自体、多量体の様式で発現させたタンパク質、又は凝集させたタンパク質と比べて、比較的弱い免疫原である[20〜25]。理論に束縛されることを意図せずに述べると、多量体タンパク質の免疫原性の増大は、少なくとも部分的に、B細胞受容体とのそれらのより強い結合及びB細胞受容体の架橋形成、それに続く、より強力なシグナル伝達及びB細胞による抗原の取込みの増強に起因する可能性が極めて高い。
gp350/220
EBVの糖タンパク質であるgp350及び関連のスプライス変異体であるgp220は、EBVの、B細胞上のCR2との高アフィニティーでの結合を担う。EBVの結合を遮断する、gp350/220に対する抗体は、B細胞への感染を中和する。gp350/220とは、高度にグリコシル化された1回貫通型膜タンパク質である。代替的スプライシングの結果として、ウイルス糖タンパク質は、約350及び220kDaの質量を伴う2つの形態で現れる。200kDaのスプライス形態は、全長gp350の残基500〜757を欠く。gp350及びgp220は共に、アミノ末端においてCR2結合性ドメインを保持する。gp350のアミノ酸1〜470を有するgp350/220の切断型は、CR2に結合する能力を保持し、EBVのCR2への結合を阻害しうる[29]。加えて、gp350配列のアミノ酸21〜26の間、又はアミノ酸372〜378の間のgp350/220タンパク質の部分は、CR2への結合と連関している(Tanner et al., Cell 203-213 (1987)、及びNemerow et al. 61:1416-20 (1987))。したがって、gp350/220タンパク質又はgp350/220抗原という用語は、全長gp350又はgp220タンパク質のほか、CR2に結合する能力を保持するその断片又は修飾変異体も指す。
GenBankにおいて受託番号M10593、バージョンM10593.1、GI 330360の下に示されている、gp350のアミノ酸配列及び核酸配列は、参照により本明細書に組み込まれる。gp350のアミノ酸配列は、
MEAALLVCQY TIQSLIHLTG EDPGFFNVEI PEFPFYPTCN VCTADVNVTI 50
NFDVGGKKHQ LDLDFGQLTP HTKAVYQPRG AFGGSENATN LFLLELLGAG 100
ELALTMRSKK LPINVTTGEE QQVSLESVDV YFQDVFGTMW CHHAEMQNPV 150
YLIPETVPYI KWDNCNSTNI TAVVRAQGLD VTLPLSLPTS AQDSNFSVKT 200
EMLGNEIDIE CIMEDGEISQ VLPGDNKFNI TCSGYESHVP SGGILTSTSP 250
VATPIPGTGY AYSLRLTPRP VSRFLGNNSI LYVFYSGNGP KASGGDYCIQ 300
SNIVFSDEIP ASQDMPTNTT DITYVGDNAT YSVPMVTSED ANSPNVTVTA 350
FWAWPNNTET DFKCKWTLTS GTPSGCENIS GAFASNRTFD ITVSGLGTAP 400
KTLIITRTAT NATTTTHKVI FSKAPESTTT SPTLNTTGFA DPNTTTGLPS 450
STHVPTNLTA PASTGPTVST ADVTSPTPAG TTSGASPVTP SPSPWDNGTE 500
SKAPDMTSST SPVTTPTPNA TSPTPAVTTP TPNATSPTPA VTTPTPNATS 550
PTLGKTSPTS AVTTPTPNAT SPTLGKTSPT SAVTTPTPNA TSPTLGKTSP 600
TSAVTTPTPN ATGPTVGETS PQANATNHTL GGTSPTPVVT SQPKNATSAV 650
TTGQHNITSS STSSMSLRPS SNPETLSPST SDNSTSHMPL LTSAHPTGGE 700
NITQVTPASI STHHVSTSSP EPRPGTTSQA SGPGNSSTST KPGEVNVTKG 750
TPPQNATSPQ APSGQKTAVP TVTSTGGKAN STTGGKHTTG HGARTSTEPT 800
TDYGGDSTTP RPRYNATTYL PPSTSSKLRP RWTFTSPPVT TAQATVPVPP 850
TSQPRFSNLS MLVLQWASLA VLTLLLLLVM ADCAFRRNLS TSHTYTTPPY 900
DDAETYV (配列番号1) 907
である。
GenBankにおいて受託番号M10593、バージョンM10593.1、GI 330360の下に示されており、参照により本明細書に組み込まれる、gp220のアミノ酸配列は、
MEAALLVCQY TIQSLIHLTG EDPGFFNVEI PEFPFYPTCN VCTADVNVTI 50
NFDVGGKKHQ LDLDFGQLTP HTKAVYQPRG AFGGSENATN LFLLELLGAG 100
ELALTMRSKK LPINVTTGEE QQVSLESVDV YFQDVFGTMW CHHAEMQNPV 150
YLIPETVPYI KWDNCNSTNI TAVVRAQGLD VTLPLSLPTS AQDSNFSVKT 200
EMLGNEIDIE CIMEDGEISQ VLPGDNKFNI TCSGYESHVP SGGILTSTSP 250
VATPIPGTGY AYSLRLTPRP VSRFLGNNSI LYVFYSGNGP KASGGDYCIQ 300
SNIVFSDEIP ASQDMPTNTT DITYVGDNAT YSVPMVTSED ANSPNVTVTA 350
FWAWPNNTET DFKCKWTLTS GTPSGCENIS GAFASNRTFD ITVSGLGTAP 400
KTLIITRTAT NATTTTHKVI FSKAPESTTT SPTLNTTGFA DPNTTTGLPS 450
STHVPTNLTA PASTGPTVST ADVTSPTPAG TTSGASPVTP SPSPWDNGTE 500
STPPQNATSP QAPSGQKTAV PTVTSTGGKA NSTTGGKHTT GHGARTSTEP 550
TTDYGGDSTT PRPRYNATTY LPPSTSSKLR PRWTFTSPPV TTAQATVPVP 600
PTSQPRFSNL SMLVLQWASL AVLTLLLLLV MADCAFRRNL STSHTYTTPP 650
YDDAETYV (配列番号2) 658
である。
EBV gH、gL、gB、及びgp42
EBVとは、それ自身の脂質膜を宿主細胞膜と融合させることにより宿主細胞への侵入を果たす、エンベロープウイルスである。EBVは、B細胞及び上皮細胞のいずれにも感染しうる。B細胞とのウイルス融合のための最小限の要件は、EBVの糖タンパク質であるgH、gL、gB、及びgp42を含む。B細胞の感染のために、gp42は、宿主細胞のMHCクラスII分子に結合して、ウイルスの細胞膜融合を誘発する。他方、上皮細胞の感染のために、gp42は必要とされない。そうではなく、EBV gH、gL、及びgBタンパク質で、上皮細胞とのウイルス融合には十分である。EBV gH/gLは、非共有結合的に会合した複合体として存在する。EBV gLは、gHと独立して発現しうるが、EBV gHが適正にフォールドし、細胞表面へとトラフィキングされるためには、gLもまた、存在しなければならない。
EBV gHのアミノ酸配列は、
MQLLCVFCLV LLWEVGAASL SEVKLHLDIE GHASHYTIPW TELMAKVPGL 50
SPEALWREAN VTEDLASMLN RYKLIYKTSG TLGIALAEPV DIPAVSEGSM 100
QVDASKVHPG VISGLNSPAC MLSAPLEKQL FYYIGTMLPN TRPHSYVFYQ 150
LRCHLSYVAL SINGDKFQYT GAMTSKFLMG TYKRVTEKGD EHVLSLIFGK 200
TKDLPDLRGP FSYPSLTSAQ SGDYSLVIVT TFVHYANFHN YFVPNLKDMF 250
SRAVTMTAAS YARYVLQKLV LLEMKGGCRE PELDTETLTT MFEVSVAFFK 300
VGHAVGETGN GCVDLRWLAK SFFELTVLKD IIGICYGATV KGMQSYGLER 350
LAAVLMATVK MEELGHLTTE KQEYALRLAT VGYPKAGVYS GLIGGATSVL 400
LSAYNRHPLF QPLHTVMRET LFIGSHVVLR ELRLNVTTQG PNLALYQLLS 450
TALCSALEIG EVLRGLALGT ESGLFSPCYL SLRFDLTRDK LLSMAPQEAM 500
LDQAAVSNAV DGFLGRLSLE REDRDAWHLP AYKCVDRLDK VLMIIPLINV 550
TFIISSDREV RGSALYEAST TYLSSSLFLS PVIMNKCSQG AVAGEPRQIP 600
KIQNFTRTQK SCIFCGFALL SYDEKEGLET TTYITSQEVQ NSILSSNYFD 650
FDNLHVHYLL LTTNGTVMEI AGLYEERAHV VLAIILYFIA FALGIFLVHK 700
IVMFFL (配列番号16) 706
である。
EBV gLのアミノ酸配列は、
MRTVGVFLAT CLVTIFVLPT WGNWAYPCCH VTQLRAQHLL ALENISDIYL 50
VSNQTCDGFS LASLNSPKNG SNQLVISRCA NGLNVVSFFI SILKRSSSAL 100
TGHLRELLTT LETLYGSFSV EDLFGANLNR YAWHRGG (配列番号17) 137
である。
EBV gBのアミノ酸配列は、
MTRRRVLSVV VLLAALACRL GAQTPEQPAP PATTVQPTAT RQQTSFPFRV 50
CELSSHGDLF RFSSDIQCPS FGTRENHTEG LLMVFKDNII PYSFKVRSYT 100
KIVTNILIYN GWYADSVTNR HEEKFSVDSY ETDQMDTIYQ CYNAVKMTKD 150
GLTRVYVDRD GVNITVNLKP TGGLANGVRR YASQTELYDA PGWLIWTYRT 200
RTTVNCLITD MMAKSNSPFD FFVTTTGQTV EMSPFYDGKN KETFHERADS 250
FHVRTNYKIV DYDNRGTNPQ GERRAFLDKG TYTLSWKLEN RTAYCPLQHW 300
QTFDSTIATE TGKSIHFVTD EGTSSFVTNT TVGIELPDAF KCIEEQVNKT 350
MHEKYEAVQD RYTKGQEAIT YFITSGGLLL AWLPLTPRSL ATVKNLTELT 400
TPTSSPPSSP SPPAPPAARG STSAAVLRRR RRDAGNATTP VPPAAPGKSL 450
GTLNNPATVQ IQFAYDSLRR QINRMLGDLA RAWCLEQKRQ NMVLRELTKI 500
NPTTVMSSIY GKAVAAKRLG DVISVSQCVP VNQATVTLRK SMRVPGSETM 550
CYSRPLVSFS FINDTKTYEG QLGTDNEIFL TKKMTEVCQA TSQYYFQSGN 600
EIHVYNDYHH FKTIELDGIA TLQTFISLNT SLIENIDFAS LELYSRDEQR 650
ASNVFDLEGI FREYNFQAQN IAGLRKDLDN AVSNGRNQFV DGLGELMDSL 700
GSVGQSITNL VSTVGGLFSS LVSGFISFFK NPFGGMLILV LVAGVVILVI 750
SLTRRTRQMS QQPVQMLYPG IDELAQQHAS GEGPGINPIS KTELQAIMLA 800
LHEQNQEQKR AAQRAAGPSV ASRALQAARD RFPGLRRRRY HDPETAAALL 850
GEAETEF (配列番号18) 857
である。
EBV gp42のアミノ酸配列は、
MVSFKQVRVP LFTAIALVIV LLLAYFLPPR VRGGGRVSAA AITWVPKPNV 50
EVWPVDPPPP VNFNKTAEQE YGDKEIKLPH WTPTLHTFQV PKNYTKANCT 100
YCNTREYTFS YKERCFYFTK KKHTWNGCFQ ACAELYPCTY FYGPTPDILP 150
VVTRNLNAIE SLWVGVYRVG EGNWTSLDGG TFKVYQIFGS HCTYVSKFST 200
VPVSHHECSF LKPCLCVSQR SNS (配列番号19) 223
である。
CR2に結合する修飾gp350/220ポリペプチドは、gp350又はgp220ポリペプチド(例えば、配列番号1及び2)と実質的に同一であるが、1つ以上の欠失、挿入、又は置換のために、gp350又はgp220のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を有する、天然で生じるか又は合成によりプログラムされた変異体ポリペプチドを含む。EBVの異なる株のDNAシークエンシングにより、いくつかのgp350/220の変異体配列が既に同定されており、当業者にたやすく利用可能である(Beisel et al., J. Viriol. 1985, 54(3):665-74)。同様に、修飾gH、gL、gB、及びgp42ポリペプチドは、gH、gL、gB、又はgp42ポリペプチド(例えば、配列番号16、17、18、又は19)のいずれかと実質的に同一であるが、1つ以上の欠失、挿入、又は置換のために、gH、gL、gB、又はgp42のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を有する、天然で生じるか又は合成によりプログラムされた変異体ポリペプチドを含む。
変異体アミノ酸配列は、配列番号1若しくは2のgp350/220ポリペプチド、又は配列番号16、17、18、若しくは19のgH、gL、gB、若しくはgp42ポリペプチドと、好ましくは少なくとも60％、65％、70％、又は80％同一であり、より好ましくは少なくとも85％同一であり、なおより好ましくは少なくとも90％同一であり、最も好ましくは少なくとも95％同一である。同一性パーセントは、例えば、Devereuxら(Nucl. Acids Res. 12:387, 1984)により記載されており、University of Wisconsin Genetics Computer Group(UWGCG)から入手可能な、GAPコンピュータプログラム、バージョン6.0を使用して配列情報を比較することにより決定することができる。GAPプログラムでは、Smith及びWaterman(Adv. Appl. Math 2:482, 1981)により改定された、Needleman及びWunsch(J. Mol. Biol. 48:443, 1970)のアライメント法を利用する。GAPプログラムの好ましいデフォルトパラメータは、(1)ヌクレオチドについての単項比較マトリックス(同一の場合の値1及び非同一の場合の値0を含有する)、及びSchwartz及びDayhoff編, Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp.353-358, 1979により記載されている、Gribskov及びBurgess, Nucl. Acids Res. 14:6745, 1986の重みづけ比較マトリックス、(2)各ギャップについての3.0のペナルティー、及び各ギャップ内の各シンボルについてのさらなる0.10のペナルティー、並びに(3)エンドギャップについてのペナルティーなし、を含む。
変異体ポリペプチドは、gp350/220、gH、gL、gB、又はgp42ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を突然変異させることにより得ることができる。アミノ酸配列の改変は、天然で生じうるか、又は多数の従来の方法のうちのいずれかにより達成しうる。突然変異は、天然配列の断片とのライゲーションを可能とする制限部位に挟まれた突然変異配列を含有するオリゴヌクレオチドを合成することにより、特定の遺伝子座に導入することができる。ライゲーションに続き、結果として得られる、再構築された配列は、所望のアミノ酸の挿入、置換、又は欠失を有する類似体をコードする。
代替的に、オリゴヌクレオチド指向性部位特異的突然変異誘発手順を採用して、所定のコドンを置換、欠失、又は挿入により変化させうる改変遺伝子をもたらすことができる。上で示した改変を施す例示的な方法は、それらの全てが参照により組み込まれる、Walderら(Gene 42:133, 1986)、Bauerら(Gene 37:73, 1985)、Craik(BioTechniques, Jan. 12-19、1985)、Smithら(Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press, 1981)、Kunkel(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488, 1985)、Kunkelら(Methods in Enzymol. 154:367, 1987)、並びに米国特許第4,518,584号及び同第4,737,462号により開示されている。
オリゴマー化ドメイン
オリゴマー化ドメインとは、それらを含むポリペプチドにオリゴマー化させる、すなわち、対応するオリゴマー化ドメインを含む別のポリペプチドとの共有結合的会合及び/又は非共有結合的会合を形成させるポリペプチドである。したがって、2つ以上のポリペプチドは、それらがオリゴマー化ドメインを介して互いに結合する場合に「オリゴマー化」する。当技術分野で公知の任意のオリゴマー化ドメインを使用することができる。例は、ロイシンジッパードメイン及びフィブリチンドメインを含む。オリゴマー内のポリペプチドは、同一のポリペプチド配列を有するか、類似のポリペプチド配列を有するか、又は異なるポリペプチド配列を有することができる。
ホモ二量体化及びホモオリゴマー化とは、二量体又はオリゴマーを形成する、同じポリペプチド成分の会合を指す。ヘテロ二量体化及びヘテロオリゴマー化とは、二量体又はオリゴマーを形成する、異なるポリペプチドの会合を指す。したがって、ホモオリゴマーが、特定のポリペプチドの複数コピーの会合を含むのに対し、ヘテロオリゴマーは、異なるポリペプチドのコピーの会合を含む。接頭辞を伴うか又は伴わない、「オリゴマー化」、「オリゴマー化する」、及び「オリゴマー」は、「二量体化」、「二量体化する」、及び「二量体」を包摂することを意図する。したがって、一実施形態では、オリゴマー化ドメインは、2つの融合タンパク質の自己会合を媒介する二量体化ドメインである。別の実施形態では、オリゴマー化ドメインは、3つの融合タンパク質の自己会合を媒介する三量体化ドメインである。別の実施形態では、オリゴマー化ドメインは、4つの融合タンパク質の自己会合を媒介する四量体化ドメインである。一実施形態では、三量体化ドメインは、フィブリチンモチーフ若しくは真核細胞GCN4転写因子モチーフ又はそれらの誘導体である。
一実施形態では、オリゴマー化ドメインは、ロイシンジッパードメインを含む。ロイシンジッパードメインとは、それらが見出されるタンパク質のオリゴマー化を促進するペプチドである。ロイシンジッパーは元来、いくつかのDNA結合性タンパク質内で同定され(Landschulz et al., Science 240:1759, 1988)、それ以来、様々な異なるタンパク質内で見出されている。公知のロイシンジッパーの中には、二量体化又は三量体化する天然で生じるペプチド及びその誘導体がある。例えば、酵母GCN4ロイシンジッパーを使用して、目的ポリペプチドを二量体化することができる[27、28]。可溶性の多量体タンパク質を産生させるのに適するロイシンジッパードメインの他の例は、PCT出願第WO94/10308号において記載されており、肺サーファクタントタンパク質D(SPD)に由来するロイシンジッパーは、Hoppeら、FEBS Lett. 344:191, 1994において記載されている。それに融合させた異種タンパク質の安定的な三量体化を可能とする修飾ロイシンジッパーの使用は、Fanslowら、Semin. Immunol. 6:267, 1994において記載されている。
さらに別の実施形態では、オリゴマー化ドメインは、フィブリチン三量体化モチーフ、特に、バクテリオファージフィブリチン三量体化モチーフ、より具体的には、バクテリオファージT4若しくはファージRB69若しくはファージAR1に由来するフィブリチン三量体化ドメイン又はそれらの誘導体である。T4フィブリチン三量体化ドメイン及びその変異体は、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第6,911,205号、米国特許第8,147,843号、及びWO01/19958において記載されている。
リンカー配列
リンカー配列は、融合タンパク質内で、融合タンパク質の異なる成分を隔てるために使用する。したがって、リンカー配列のアミノ末端は、ペプチド結合により第1のポリペプチドへと接続され、リンカー配列のカルボキシ末端は、ペプチド結合により第2のポリペプチドへと接続される。第1のポリペプチド又は第2のポリペプチドは、抗原、オリゴマー化ドメイン、アジュバントタンパク質、細胞表面標的化ドメイン、免疫抑制を媒介する分子、又は細胞活性化ドメインでありうる。介在するポリペプチド配列を伴わずに接続される第1のポリペプチド及び第2のポリペプチドとは対照的に、このようなリンカー配列は、第1のポリペプチドと第2のポリペプチドとを接続する。したがって、リンカー配列は、2つの抗原、抗原とオリゴマー化ドメイン、抗原とアジュバントタンパク質、抗原と細胞表面標的化ドメイン、抗原と免疫抑制を媒介する分子、並びに抗原と細胞活性化ドメイン、アジュバントタンパク質とオリゴマー化ドメインなどを接続しうる。第1のポリペプチドと第2のポリペプチドとが、天然では偶然に一体に組み合わされて存在する場合、リンカー配列は、天然では第1のポリペプチドと第2のポリペプチドとを隔てる配列ではないことが理解される。
一実施形態では、リンカー配列は、5〜25アミノ酸、特に、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、又は20アミノ酸の長さを有するポリペプチドである。別の実施形態では、リンカー配列は、10〜25アミノ酸を有するポリペプチドである。リンカー配列は、好ましくは、グリシン及びセリンアミノ酸を含む。一実施形態では、リンカー配列は、15アミノ酸の長さであり、アミノ酸配列(Gly4Ser)3(配列番号3)を有する。
他の適切なペプチドリンカーは、それらの各々が参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第4,751,180号、同第4,935,233号、及び同第5,073,627号において記載されている、ペプチドリンカーである。当技術分野で公知の従来の技法を使用して、所望のリンカー配列をコードするDNA配列を、例えば、第1のポリペプチドをコードするDNA配列と第2のポリペプチドをコードするDNA配列の間に、かつそれらと同じリーディングフレームで、挿入しうる。例えば、リンカーをコードする、化学合成されたオリゴヌクレオチドを、第1のポリペプチドをコードする配列と第2のポリペプチドをコードする配列との間にライゲーションしうる。
核酸、クローニング、及び発現系
本開示は、開示される融合タンパク質をコードする単離核酸をさらに提示する。核酸は、DNA又はRNAを含んでよく、全体的又は部分的に合成又は組換えであってよい。本明細書で示されるヌクレオチド配列に対する言及は、配列が指定されたDNA分子を包摂し、文脈により別段に要請されない限り、TがUに置換されている、配列が指定されたRNA分子を包摂する。
本開示はまた、融合タンパク質又はその部分をコードする少なくとも1つの核酸を含むプラスミド、ベクター、ファージミド、転写カセット又は発現カセットの形態にある構築物も提示する。本開示は、1つ以上の上記の構築物を含む宿主細胞もさらに提示する。
また、これらの核酸によりコードされる融合タンパク質を作製する方法も提示される。融合タンパク質は、組換え法を使用して作製しうる。当技術分野では、組換えタンパク質の産生及び発現が周知であり、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual(4版、2012), Cold Spring Harbor Pressにおいて開示されている手順など、従来の手順を使用して実行することができる。例えば、融合タンパク質の発現は、融合タンパク質をコードする核酸を含有する組換え宿主細胞を適切な条件下で培養することにより達成しうる。発現による産生に続き、融合タンパク質は、任意の適切な技法を使用して単離及び/又は精製され、次いで、適宜使用されうる。
当技術分野では、ポリペプチドを様々な異なる宿主細胞内でクローニングし、及び発現させるための系が周知である。本明細書において開示される構築物と適合する任意のタンパク質発現系を使用して、開示される融合タンパク質を産生させてよい。
適切なベクターを、それらが適切な調節的配列、例えば、プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子、及び他の適切な配列を含有するように、選択又は構築することができる。
本開示のさらなる態様は、本明細書で開示される核酸を含む宿主細胞を提示する。なおさらなる態様は、このような核酸を、宿主細胞へと導入することを含む方法を提示する。導入は、任意の利用可能な技法を採用しうる。真核細胞では、適切な技法は、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE-デキストラン、電気穿孔、リポソーム介在型トランスフェクション、及びレトロウイルス若しくは他のウイルス、例えば、ワクシニアウイルス、若しくは昆虫細胞にはバキュロウイルスを使用する形質導入を含みうる。細菌細胞では、適切な技法は、塩化カルシウム形質転換、電気穿孔、及びバクテリオファージを使用するトランスフェクションを含みうる。当技術分野では、これらの技法が周知である。例えば、Current Protocols in Molecular Biology, Ausubelら編, John Wiley & Sons (2010)を参照されたい。DNAの導入に続いて、ベクターを含有する細胞を選択する選択法(例えば、抗生物質耐性)を行いうる。
ワクチン組成物
本明細書で記載される融合タンパク質、及び融合タンパク質をコードする核酸は、被験体における免疫原性の増強を達成するワクチンを開発するためのプラットフォームの改善をもたらす。
したがって、一態様は、融合タンパク質をコードする核酸、若しくは融合タンパク質、少なくとも1つの製薬上許容される添加剤、及び場合によりアジュバントを含む組成物(以下では、「ワクチン組成物」と称する)を対象とする。ある種の実施形態では、ワクチン組成物は、アジュバントを含まない。
製薬上許容される添加剤は、例えば、希釈剤、例えば、デンプン、微晶質セルロース、リン酸二カルシウム、ラクトース、ソルビトール、マンニトール、スクロース、メチルデキストリン; 結合剤、例えば、ポビドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ジヒドロキシプロピルセルロース、及びカルボキシルメチルセルロースナトリウム; 並びに崩壊剤、例えば、クロスポビドン、デンプングリコール酸ナトリウム、クロスカルメロースナトリウム、並びに前出のうちのいずれかの混合物から選択することができる。製薬上許容される添加剤はさらに、滑沢剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸、ベヘン酸グリセリル、水素化植物油、フマル酸グリセリン、及び流動促進剤、例えば、コロイド状二酸化ケイ素、並びにこれらの混合物からも選択することができる。いくつかの実施形態では、製薬上許容される添加剤は、微晶質セルロース、デンプン、タルク、ポビドン、クロスポビドン、ステアリン酸マグネシウム、コロイド状二酸化ケイ素、ドデシル硫酸ナトリウム、及び前出のうちのいずれかの混合物から選択される。添加剤は、粒内添加剤、粒間添加剤、又はこれらの混合物でありうる。
ワクチン組成物は、当技術分野の任意の適切な手段に従い、凍結乾燥調製物、又は液体調製物として製剤化することができる。液体形態調製物の非限定的な例は、溶液、懸濁液、シロップ、スラリー、及びエマルジョンを含む。適切な液体担体は、好ましくは滅菌形態の、任意の適切な有機又は無機溶媒、例えば、水、アルコール、生理食塩液、緩衝生理食塩液、生理的食塩液、デキストロース溶液、プロピレングリコール水溶液などを含む。製剤化の後、ワクチン組成物は、滅菌容器へと組み込み、次いで、これを、密封し、低温(例えば、4℃)で保存するか、又は凍結乾燥させることができる。
ワクチン組成物は、中性形態又は塩形態で製剤化することができる。製薬上許容される塩は、酸添加塩(活性ポリペプチドの遊離アミノ基により形成される)を含み、例えば、塩酸若しくはリン酸などの無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸により形成される。遊離カルボキシル基から形成される塩はまた、無機塩基、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、若しくは水酸化第二鉄、及び有機塩基、例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどにも由来しうる。
ワクチン組成物は、場合により、アジュバントなど、ワクチンの防御有効性を増強する薬剤を含みうる。アジュバントは、融合タンパク質により送達される抗原に対する免疫反応を増大させ、これにより、ワクチン中の必要な融合タンパク質(又は融合タンパク質をコードする核酸)の量、及び/又は防御的免疫反応を発生させるのに必要な投与頻度を低減するように作用する、任意の1つ以上の化合物を含む。アジュバントは、例えば、乳化剤、ムラミルジペプチド、アブリジン、水性アジュバント、例えば、水酸化アルミニウム、キトサンベースのアジュバント、及び多様なサポニンのうちのいずれか、油、並びに当技術分野で公知の他の物質、例えば、Amphigen、LPS、細菌細胞壁抽出物、細菌DNA、CpG配列、合成オリゴヌクレオチド、及びこれらの組合せ(Schijns et al. (2000) Curr. Opin. Immunol. 12:456)、チモテ菌(Mycobacterialphlei (M. phlei))細胞壁抽出物(MCWE)(米国特許第4,744,984号)、チモテ菌DNA(M-DNA)、及びチモテ菌細胞壁複合体(MCC)を含みうる。乳化剤として用いられうる化合物は、天然乳化剤及び合成乳化剤のほか、アニオン性化合物、カチオン性化合物、及び非イオン性化合物を含む。合成化合物の中では、アニオン性乳化剤は、例えば、ラウリン酸及びオレイン酸のカリウム塩、ナトリウム塩、及びアンモニウム塩、脂肪酸のカルシウム塩、マグネシウム塩、及びアルミニウム塩、並びにラウリル硫酸ナトリウムなどの有機スルホン酸塩を含む。合成カチオン性薬剤は、例えば、セチルトリメチルアンモニウムブロミドを含み、一方、合成非イオン性薬剤は、グリセリルエステル(例えば、モノステアリン酸グリセリン)、ポリオキシエチレングリコールエステル及びポリオキシエチレングリコールエーテル、並びにソルビタン脂肪酸エステル(例えば、モノパルミチン酸ソルビタン)及びそれらのポリオキシエチレン誘導体(例えば、モノパルミチン酸ポリオキシエチレンソルビタン)により例示される。天然の乳化剤は、アカシア、ゼラチン、レシチン、及びコレステロールを含む。
他の適切なアジュバントは、単一の油、油の混合物、油中水エマルジョン、又は水中油エマルジョンなどの油成分により形成することができる。油は、鉱油、植物油、又は動物油でありうる。鉱油とは、蒸留法を介してワセリンから得られる液体炭化水素であり、当技術分野ではまた、液体パラフィン、液体ワセリン、又は白色鉱油とも称する。適切な動物油は、例えば、それらの全てが市販されている、タラ肝油、ハリバ油、メンヘーデン油、オレンジラフィー油、及びサメ肝油を含む。適切な植物油は、例えば、キャノーラ油、アーモンド油、綿実油、トウモロコシ油、オリーブ油、ピーナッツ油、サフラワー油、ゴマ油、ダイズ油などを含む。フロイント完全アジュバント(FCA)及びフロイント不完全アジュバント(FIA)は、ワクチン調製物中で一般に使用される2つの一般的なアジュバントであり、また、本発明における使用にも適する。FCA及びFIAのいずれも、鉱油中水エマルジョンであるが、FCAはまた、死滅させたマイコバクテリウム(Mycobacterium)属種も含有する。
ワクチン組成物ではまた、例えば、アジュバントとして、ワクチンの有効性を増強するのに、免疫調節性サイトカインも使用することができる。このようなサイトカインの非限定的な例は、インターフェロンアルファ(IFN-α)、インターロイキン2 (IL-2)、及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、又はこれらの組合せを含む。
ワクチン組成物は、混合、超音波処理、及び顕微溶液化を含むがこれらに限定されない、当業者に周知の技法を使用して調製することができる。アジュバントは、ワクチン組成物の約10％〜約80％(v/v)、より好ましくは約20％〜約50％(v/v)、より好ましくは約20％〜約30％(v/v)、又はこれらの範囲内の任意の整数パーセントを構成することができる。
ワクチン組成物は、任意の動物へと投与することができ、動物は、好ましくは哺乳動物、例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、サル、ウシ、ウマ、ブタなどである。ヒトが最も好ましい。
ワクチン組成物の投与は、注入又は注射(例えば、静脈内、筋内、皮内、皮下、髄腔内、十二指腸内、腹腔内などによる)により行うことができる。ワクチン組成物はまた、鼻腔内、膣内、直腸内、経口、扁桃内、又は経皮投与することもできる。加えて、ワクチン組成物は、「無針」送達系により投与することができる。
ワクチン組成物の有効量は、限定しないが、種、種族、サイズ、身長、体重、年齢、患者の全般的な健康、製剤の種類、又は投与方式若しくは投与様式を含む、任意の数の変数に依存しうる。適切な有効量は、当業者が、日常的な最適化法、及び投与従事者の熟練した熟知による判断、並びに当業者に明白な他の因子を使用して日常的に決定することができる。好ましくは、本明細書で記載されるワクチン組成物の治療有効用量は、実質的な毒性を被験体に引き起こすことなく、治療的な防止利益をもたらす。
ワクチン組成物は、EBV gp350/220又は他の任意の目的タンパク質に対する免疫反応を誘導し、及び/又は持続させるのに適切な任意のスケジュールで患者へと投与することができる。例えば、患者に、ワクチン組成物を、本明細書で記載及び例示される一次免疫化として投与し、それに続いて、防御性免疫を強化及び/又は維持するための二次免疫化の投与又はブースター投与を行うことができる。
一次免疫化及びブースター投与を含むワクチンの投与スケジュールは、患者に必要とされる限り、例えば、数年間から患者の生涯にわたり持続させることができる。一次ワクチン及びブースター投与の頻度並びに投与される用量は、当技術分野で適切な任意の手段に従い投与する医師により決定される通りに、個々の患者の特定のニーズを満たすように適合及び/又は調整することができる。
ワクチン組成物は、予防的に(目的の抗原又は病原体に対する曝露の前に)、又は治療的に(目的の抗原又は病原体に対する曝露の後で)投与しうる。
免疫反応を誘導又は抑制する方法
別の態様では、融合タンパク質(又は融合タンパク質をコードする核酸)を含むワクチン組成物は、免疫反応を誘導又は抑制する方法において使用することができる。免疫反応は、EBV、CMV、又はHIV(又は他のいくつかの外来性病原体)へといまだ曝露されていないナイーブ被験体において誘導することができる。代替的に、免疫反応は、EBV、CMV、又はHIV(又は他のいくつかの外来性病原体)へと既に曝露された被験体において誘導又は抑制することができ、既存の免疫反応を増強するのに使用することができる。
一実施形態では、免疫反応を増強又は抑制する方法は、本明細書で記載される融合タンパク質を含むワクチン組成物を被験体へと投与することを含み、融合タンパク質が、融合タンパク質中の抗原に対する免疫反応を、被験体において誘導又は抑制する。別の実施形態では、免疫反応を増強又は抑制する方法は、本明細書で記載される融合タンパク質をコードする核酸構築物を含むワクチン組成物を被験体へと投与することを含み、融合タンパク質が、被験体において発現され、融合タンパク質内の抗原に対する免疫反応を、被験体において誘導又は抑制する。
免疫反応を誘導又は抑制するこれらの方法では、免疫反応は、本明細書において開示される日常的な方法など、当技術分野における日常的な方法を使用して測定することができる。これらの日常的な方法は、抗体反応、例えば、組換えベクターによりコードされるタンパク質を指向する抗体反応を測定すること、及び細胞増殖を測定すること、例えば、トリチウム化チミジンの取込み又はサイトカイン(例えば、IFN-γ)産生を測定することによって細胞増殖を測定することを含むがこれらに限定されない。
別段に規定されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者により一般に理解される意味と同じ意味を有する。本発明を実施又は試行するのに、本明細書で記載される方法及び材料と類似の方法及び材料又は同等な方法及び材料を使用しうるが、以下では、適切な方法及び材料について記載する。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、参照によりそれらの全体において組み込まれる。矛盾する場合は、定義を含め、本明細書により規制される。加えて、材料、方法、及び例は、例示的なものであるに過ぎず、限定的であることを意図するものではない。
タンパク質の多量体化により、免疫反応を増強して、目的抗原を標的化するための費用対効果が高く再現可能な手段をもたらしうるのかどうかを調べるため、リンカー配列で隔てられた第1の抗原及び第2の抗原並びにオリゴマー化ドメインを含む融合タンパク質をコードするように組換え核酸プラスミドをデザインした。系を検証するために調製された被験構築物では、2つの同一なgp350配列を、適正なタンパク質フォールディングを可能とする(Gly4Ser)3(配列番号3)リンカー[26]で隔て、gp350二量体の自己会合を媒介し、したがって四量体gp350を形成させる出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)GCN4ロイシンジッパー配列[27、28]が続いた。プラスミドDNA自体又は結果として得られる四量体のタンパク質によるマウスの免疫化は、強力なアジュバントの存在下でもなお、gp350単量体と比べて顕著に高いgp350特異的IgGの力価を結果としてもたらす。最も重要なことは、四量体のタンパク質を構成するgp350サブユニットが、コンフォメーション的に無傷であり、単量体により誘導される中和抗体の血清力価より19倍高い中和抗体の血清力価を誘発することである。これらのデータは、将来の臨床試験のための有望で新たな予防的EBVワクチンのほか、ワクチン目的の他のタンパク質の免疫原性を増強するための、より一般的な手法をも強く示唆する。
材料及び方法
単量体gp350及び四量体gp350を産生するためのプラスミドの構築
アミノ酸1〜470をコードするgp350 cDNA断片を、切断型gp350を発現させる組換えバキュロウイルスから単離されたDNAをPCR増幅することによりクローニングした[29]。以下のプライマーセット:
フォワード 5'-CACCATGGAGGCAGCCTTGCTTGT-3' (配列番号4)及び
リバース 5'-AGATCTTTAGGATACAGTGGGGCCTGT GC-3' (配列番号5)
を使用し、全25サイクルにわたり、94℃で30秒間にわたり変性させ、52℃で30秒間にわたりアニールさせ、68℃で2分間にわたり伸長させた。cDNA断片を、pENTR/SD/D-TOPOディレクショナルクローニングベクター(Invitrogen、Grand Island、NY)へと挿入し、シークエンシングにより確認した。
gp350単量体構築物
gp350単量体を発現させる構築物を作製するため、GF1: 5'-GCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACGCGGCCCAGCCGGCCAGGCGCGCGCGCCGTACGAAGCTCGCCCTT-3' (配列番号6)およびGR6: 5'-TCAATGGTGATGGTGATGATGGGTGGATACAGTGGGGCCTGT-3' (配列番号7)と称するプライマーセットを使用して、上に記載した条件下でPCR増幅を実施した。GF1はIgGκリーダー配列を含有し、GR6はHis6タグ(配列番号14)をコードする配列を含有した。PCR産物は、pOptiVEC-TOPOベクター(Invitrogen)へとクローニングし、シークエンシングにより確認した。
TTエピトープを伴うgp350四量体構築物
2つの別個のgp350ユニットであるgp350F1R1及びgp350F2R5を創出し、続いて、2つのユニットを一体にライゲーションすることにより、gp350四量体を発現させる構築物を作製した。gp350F1R1は、プライマーセットGF1(上記の)及びGR1: 5'-CCATCGATGGCTAGCTAGCGGTGGATACAGTGGGGCCTGT-3'(配列番号8)を使用するPCRを介して作製した。GR1は、リンカー配列(Gly4Ser)3(配列番号3)並びに制限酵素であるNhe I及びCla Iに特異的な配列を含有した。PCR産物は、pOptiVEC-TOPOベクターへとクローニングし、シークエンシングにより確認した。gp350F2R5は、ユニバーサル破傷風トキソイド(TT)特異的CD4+ T細胞エピトープであるP2及びP30をコードする配列[30]、ロイシンジッパー[27、28]、及びHis6タグ(配列番号14)を含有し、コード配列を逐次的に付加する3ラウンドのPCRにより創出した。最初の2ラウンドのPCRはそれぞれ、GF: 5'-ATGGAGGCAGCCTTGCTTGT-3'(配列番号9)と称する同じフォワードプライマー及びリバースプライマーであるGR2: 5'-TCAACCAAAAGCTAACGGTAAAATTATTAAATTTTAGTTCAGTTATACCTATAAATTTAGAATTTGCTTTTATATACTGGGTGGATACAGTGGGGCCTGT-3' (配列番号10)およびGR3: 5'-TTTTTGCTCAACAGCTCTTCCACTTTATCTTCCAGCTGTTTCATGCGTTCTAAATGACTAGCAGATACTTTAGGAACCCTCAACCAAAAGCTAACGGTAA-3' (配列番号11)を使用して行った。最後のPCRは、GF2: 5'-CTAGCTAGC GGT GGC GGA GGG AGT GGT GGC GGA GGG AGC GGT GGC GGA GGG AGT ATGGAGGCAGCCTTGCTTGT-3' (配列番号12)と称するフォワードプライマー及びリバースプライマーであるGR5: 5'-CCATCGATTCAATGGTGATGGTGATGATGGCTAGTGCGTTCGCCCACCAGCTTTTTCAGACGCGCCACTTCGTTTTCCAGATGATAGTTTTTGCTCAACAGCTCTTCC-3' (配列番号13)を使用して実施した。GF2及びGR5はそれぞれ、制限酵素であるNhe I及びCla Iのための配列を含有した。PCR産物は、PCRII-TOPOベクター(Invitrogen)へとクローニングし、シークエンシングにより確認した。プラスミドであるgp350F1R1及びgp350F2R5は、Nhe I及びCla Iで消化し、gp350を含有する断片をゲル精製し、T4 DNAリガーゼにより、4℃で一晩にわたりライゲーションし、続いて、「Top 10F」大腸菌(Invitrogen)を、ライゲーション混合物で形質転換した。シークエンシングによる確認に続き、さらなる研究のために2つのクローンを選択した。
TTエピトープを伴わないgp350四量体構築物
上に記載したのと類似の手法を使用してプラスミドを構築したが、P2及びP30をコードする配列は欠失させた。
チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞(クローンDG44)のトランスフェクション
DG44細胞を「CD DG44」培地(Invitrogen)中で維持し、2×107個の細胞を、トランスフェクションに使用した。30μgのgp350単量体又は四量体構築物を、PvuIによる直鎖化の後、1.2mlの「OptiPro SFM」培地中で再懸濁させ、続いて、30μlの「FreeStyle Max Reagent」を添加し、静かに混合し、室温で10分間にわたりインキュベートした。DNA-Freestyle Max Reagent複合体を、2×107個のDG44細胞を含有するフラスコへと、静かに振とうさせながらゆっくり添加した。細胞を、37℃、5％CO2で、48時間にわたりインキュベートした。細胞を1,200rpmで遠心分離し、「CD OptiCHO」無血清培地中で維持した。メトトレキサート(MTX、Sigma、St. Louis、MO)を使用して、MTXの濃度を50nMから4μMへと漸増させながら、高度な組換えタンパク質分泌細胞を選択した。
中空糸バイオリアクター内のCHO培養及び組換えgp350タンパク質の精製
MTXによる選択の後、gp350単量体を発現するCHO細胞及びgp350四量体を発現するCHO細胞を、「Fibercell」カートリッジ(それぞれ、「C2008」[5kD MWのカットオフ]及び「C2011」[20kD MWのカットオフ]、FiberCell Systems, Inc.、Frederick、MD)へとロードし、濃縮された上清を毎日回収した。カットオフ30,000 MWの「Centriprep Centrifugal Filter Unit」(Thermo Scientific、Waltham、MA)を使用して、上清を、3,000rpmで30分間にわたる遠心分離によりさらに濃縮した。製造元の指示書に従い、コバルトカラム(Thermo Scientific)を使用して、アフィニティー精製を実施した。略述すると、濃縮された上清を、等容量の平衡化緩衝液と混合し、コバルト精製カラムへと添加した。カラムを、静かに振とうしながら4℃で60分間にわたりインキュベートし、洗浄緩衝液で3回にわたり洗浄した。gp350組換えタンパク質を、溶出緩衝液で溶出させ、変性条件下又は非変性条件下における、3〜8％NuPAGE Tris-Acetate Mini Gel上の電気泳動により解析し、Simple Blue(Invitrogen)で染色した。gp350タンパク質はまた、ニトロセルロース膜に転写し、抗His抗体(Invitrogen)を使用するウェスタンブロットにより解析した。gp350タンパク質は、g350特異的mAbである72A1[31]を用いた免疫ブロット法によりさらに解析し、4℃で一晩にわたりインキュベートした。次いで、ニトロセルロース膜を、HRP標識ヤギ抗マウスIgGと共にインキュベートし、続いて、化学発光基質(Thermo Scientific)で10分間にわたり発色させ、X線フィルム上でシグナルを検出した。72A1 B細胞のハイブリドーマは、Jonathan Hannan博士(University of Edinburgh、Edinburgh、UK)から恵与された。72A1 mAbは、プロテインGカラム上で培養物上清から精製した。
マウス
National Cancer Institute(Frederick、MD)から購入された雌BALB/cマウスは、7〜10週齢で、全てのタンパク質免疫化に使用した。Harlan Laboratories(Indianapolis、IN)から購入された雌BALB/cマウスは、4〜6週齢で、全てのプラスミドDNAワクチン接種に使用した。これらの研究は、「Guide for Care and Use of Laboratory Animals」(Institute of Laboratory Animal Resources、National Research Council、1996年改定)に示される原則に従って行い、Uniformed Services University of the Health Sciences及びUniversity of Washington Institutional Animal Care and Use Committeesにより承認された。
抗原及び免疫化
精製された14型肺炎球菌莢膜多糖(PPS14)は、ATCC(Manassas、VA)から購入した。gp350-PPS14及びTT-PPS14コンジュゲートは、既に記載されている[32]のと同様の形式で合成した。gp350及びTTのPPS14に対するモル比は、約8:1であった。アラム(2％Allhydrogel)は、Brenntag Biosector(Denmark)から得た。30マーの刺激性CpG含有オリゴデオキシヌクレオチド(CpG-ODN)を、既に記載されている[33]通りに合成した。マウスを、25μgのCpG-ODNと混合された13μgのアラムへと吸着させたコンジュゲートで腹腔内免疫化した。単量体及び四量体のgp350タンパク質を、アラム±CpG-ODNにおいて腹腔内注射した。ELISAアッセイのための血清試料は、尾静脈から採取された血液から得た。
粒子媒介表皮送達(PMED: particle-mediated epidermal delivery)
既に記載されている[34]通りに、PowderJect XR-1 DNAワクチン送達系を使用する、腹部皮内における粒子媒介表皮送達(PMED)により、マウスにワクチン接種した。各回の免疫化は、既に記載されている[34]通りに製剤化された、総用量4.0μgのDNAのための、1.0μgのDNAワクチンでコーティングした直径1〜3μmの金粒子0.5mgによる、2回にわたるタンデム送達からなった。DNAワクチンは、0及び4週において、350psiのヘリウム圧で、PMEDにより投与した。
抗原特異的IgG及びIgGアイソタイプの血清力価のELISAによる測定
Immulon 4 ELISAプレート(Dynex Technologies, Inc.、Chantilly、VA)を、PBS中の単量体gp350、TT、又はPPS14(5μg/ml)により、4℃で一晩にわたりコーティングした(ウェル1つ当たり50μL)。プレートは、PBS+0.1％Tween 20で3回にわたり洗浄し、PBS+1％BSA中、37℃で1時間にわたりブロッキングした。次いで、PBS+1％BSA中に1/50の血清希釈率で始める3倍希釈の血清試料を、4℃で一晩にわたり添加し、プレートを、PBS+0.1％Tween 20で3回にわたり洗浄した。次いで、PBS+1％BSA中のアルカリホスファターゼコンジュゲートポリクローナルヤギ抗マウスIgG、IgG3、IgG1、IgG2b、又はIgG2a Ab(SouthernBiotech、Birmingham、AL)(200ng/mlの最終濃度)を添加し、プレートを、37℃で1時間にわたりインキュベートした。プレートは、PBS+0.1％Tween 20で5回にわたり洗浄した。次いで、色素を発色させるために、TM緩衝液(1Mトリス+0.3mM MgCl2、pH9.8)中に1mg/mlの基質(p-ニトロフェニルホスフェート、二ナトリウム、Sigma)を添加した。色は、Multiskan Ascent ELISA reader(Labsystems、Finland)において405nmにおける吸光度で読み取った。
血清gp350特異的中和抗体の測定
gp350単量体タンパク質を、Dylight 633(Thermo Scientific)で標識した。ナイーブマウス又は免疫化マウスに由来する25μlのマウス血清を、単量体の最終濃度を1μg/mlとする、2.5μlのDyLight 633で標識されたgp350単量体と共に、室温で30分間にわたりインキュベートした。5×105個のCR2M1α細胞のペレットを、氷上で30分間にわたり、血清/gp350単量体混合物中に再懸濁させ、0.5％BSA-PBSで3回にわたり洗浄し、4％パラホルムアルデヒド中で固定した。CR2M1α細胞系は、K562ヒト赤白血病細胞系に、ヒトCD21をトランスフェクトすることにより作製した[35]。検量線を作成するため、濃度を変化させる72A1 mAb(1〜256μg/mlの最終濃度)を、DyLight 633で標識された単量体gp350(1μg/mlの最終濃度)と共に、室温で30分間にわたりインキュベートし、続いて、上に記載した通りに、5×105個のCR2M1α細胞と共にインキュベーションを行った。次いで、CR2M1α細胞を、BD LSRII Flow Cytometer Cell Analyzer上で解析した。
細胞内IL-4及びIL-5のフローサイトメトリーによる検出
脾臓細胞を、アラム中のgp350単量体又はgp350四量体による腹腔内免疫化の21日後において、マウスから単離し、6ウェルプレート内、10U/ml rmIL-2及び5μg/ml P2及びP30 TT特異的ペプチドを含有する1mlのRPMI-1640+10％ウシ胎仔血清中にウェル当たりの細胞2×106個で、5時間にわたり培養した。培養開始の1時間後に、Golgi Stop(BD Biosciences、San Jose、CA)を添加した。次いで、細胞を、ラットIgG2b抗マウスCD16/CD32(クローン2.4G2)の存在下、FITC-ラットIgG2b抗マウスCD4(クローンGK1.5)により、氷上で30分間にわたり染色した。細胞を洗浄し、Cytofix/Cytoperm溶液(BD Biosciences)を使用して、固定し、透過処理した。Perm/Wash緩衝液中で2回にわたり洗浄した後、細胞を、APC標識ラットIgG2b抗マウスIL-4(クローンBVD4-1D11)又はPE標識ラットIgG1抗マウスIL-5(クローンTRFK5)と共に、氷上で30分間にわたりインキュベートし、続いて、Perm/Wash緩衝液中で2回にわたり洗浄した。FlowJoソフトウェアを使用して、細胞を、BD LSRII Flow Cytometer Cell Analyzer上で解析した。
単量体gp350タンパク質及び四量体gp350タンパク質のヒトCD21への結合
CR2M1α細胞を、gp350単量体又は四量体(0.05〜30μg/ml)と共に、氷上で30分間にわたりインキュベートし、0.5％BSA-PBSで3回にわたり洗浄し、マウス抗gp350 mAb(2L10、Thermo Scientific)と共に、30分間にわたりさらにインキュベートした。2L10 mAbは、72A1により認識される中和エピトープとは異なる、gp350上の非中和エピトープに結合する[36、37]。次いで、細胞を、0.5％BSA-PBS中で3回にわたり洗浄し、続いて、DyLight 633で標識されたヤギ抗マウスIgGと共にインキュベーションを行った。細胞を、4％パラホルムアルデヒド中で固定し、BD LSRII Flow Cytometer Cell Analyzer上で解析した。
ヒトB細胞活性化の解析
末梢血単核細胞(PBMC)を、Ficoll-Hypaque(Roche、Indianapolis、IN)密度勾配遠心分離により、ドナーの軟膜(Blood Bank、National Institutes of Health、Bethesda、MD)から単離し、1×PBS中で2回にわたり洗浄した。B細胞を、3×108個のPBMCの開始集団から、磁気ビーズ細胞分離(B cell isolation kit II、Miltenyi Biotec、Auburn、CA)により精製し、フローサイトメトリーによる評価で>94％の精製CD19+ B細胞を得た。分取されたB細胞を、10％ウシ胎仔血清(FCS、Lonza)、2mMグルタミン、並びに各々100U/mlずつのペニシリン及びストレプトマイシン(Invitrogen)を含有する、完全RPMI 1640培地(Lonza、Walkersville、MD)中、細胞1×106個/mlで再懸濁させた。B細胞を、24ウェルプレート内に等分(ウェル1つ当たりの細胞0.5〜1×106個)し、37℃のインキュベーター(5％CO2)内で24又は72時間にわたり、単量体gp350又は四量体gp350(10μg/ml)、組換えPspA(10μg/ml)、ヤギ抗ヒトIgM F(ab')2(Jackson ImmunoResearch、West Grove、PA、20μg/ml)、又は熱により死滅させた黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)Cowan株I(SAC、Sigma、St. Louis、MO、1:100の希釈率)に由来するプロテインA+組換えヒトIL-2(Peprotech、Rocky Hill、NJ、200IU/ml)と共にインキュベートした。その後、細胞を、PEとコンジュゲートさせた抗CD69 mAb(刺激の24時間後)又はPEとコンジュゲートさせた抗CD25 mAb+FITCとコンジュゲートさせた抗CD86 mAb(刺激の72時間後)で染色することにより、細胞表面活性化マーカーの上方制御を測定した。全ての抗体は、BD Biosciencesから購入した。細胞(3×105個)を、100μlのFACS緩衝液(1×PBS、1％FCS、0.1％アジ化ナトリウム)中で5μlの各抗体と共に、30分間にわたりインキュベートし、2mlのFACS緩衝液中で洗浄し、LSR IIフローサイトメーター(Becton Dickinson、Franklin Lakes、NJ)上で回収した。FlowJoソフトウェア(TreeStar、Ashland、OR)を使用して、データ解析を実施した。
統計学的解析
抗原特異的Igの血清力価は、個々の血清力価の幾何平均±SEMとして表した。細胞質IL-4又はIL-5を発現するCD4+ T細胞の百分率は、個々の試料の算術平均±SEMとして表した。有意性は、スチューデントのt検定により決定した。≦0.05のp値を、統計学的に有意であると考えた。
[実施例1]
DNAプラスミド、及びTT特異的CD4+ T細胞エピトープを含有する四量体gp350タンパク質の産生
タンパク質抗原に対する最適な抗体反応は、ドミナントなB細胞エピトープ及びT細胞エピトープの両方を必要とする。EBV gp350エンベロープタンパク質は、抗体ベースの予防的EBVワクチンの潜在的な標的であるが、そのT細胞エピトープの相対強度及びドミナンスは、知られていない。破傷風トキソイド(TT)など、高度に免疫原性の担体タンパク質が、多糖コンジュゲートワクチンにおいて、関連するIgG抗多糖反応に対するCD4+ T細胞ヘルプを動員するのに利用されている。当初は、TTをEBV構築物へと付加すれば、gp350タンパク質に対する抗体反応を増強及び最適化する一助となると考えられた。この当初の考えは、肺炎球菌多糖14血清型(PPS14)に特異的なIgG反応を促進し、したがって、CD4+ T細胞ヘルプを間接的に動員する、gp350の相対能力を、TTと対比して比較する初期の実験により強められた。マウスを、アジュバントとしてアラム+CpG-ODN中に1又は5μgのgp350-PPS14又はTT-PPS14で腹腔内免疫化し、14日目に同様にブースティングした。21日目に測定したPPS14特異的IgGの血清力価は、1又は5μgのコンジュゲートを使用したTT-PPS14の使用において、gp350-PPS14と比べて有意に高かった(図1)ことから、TTは、より強力なCD4+ T細胞エピトープを含有したことが強く示唆される。
タンパク質の多量体化は、免疫原性の増大を付与しうる[21、22、25、38、39]。したがって、四量体g350の産生を指向するDNA構築物をデザインした。予防的ワクチンの奏効に必要とされるEBV中和抗体は、ヒトB細胞上のCD21との結合を媒介し、EBVの侵入を媒介するgp350のコンフォメーショナルエピトープに特異的である。したがって、四量体内の個々のgp350分子の適正なフォールディングが重要であると考えられた。CD4ヘルパーT細胞の強力な誘導剤としてのTTの公知の特性、及び図1に例示されるデータを踏まえ、2つのヒトユニバーサルTT特異的CD4+ T細胞エピトープ(P2及びP30)[30]を構築物へと導入して、gp350特異的IgG反応のためのT細胞ヘルプの動員を最大化した。構築物のデザインを、図2Aに例示する。具体的には、タンパク質の分泌を容易にするIgG軽鎖リーダー配列を5'側に導入し、適正なタンパク質フォールディングを可能とする(Gly4Ser)3リンカー(配列番号3)で隔てられた2つの同一のgp350配列が続いた[26]。P2及びP30をコードする配列を、第2のgp350の3'側に導入し、gp350二量体の自己会合を媒介し、したがって、四量体gp350を形成させる出芽酵母GCN4ロイシンジッパー配列[27、28]が続いた。His6タグ(配列番号14)は、精製の目的で、ロイシンジッパーの3'側に配置した。また、TT特異的エピトープを欠く単量体gp350をコードするDNA構築物も、比較のために作製した。
タンパク質を産生させるため、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞に、四量体又は単量体gp350 DNAを安定的にトランスフェクトし、培養培地において濃度を増大させたメトトレキサートを使用して、産生度の高いCHO細胞を選択した。タンパク質を培養物上清から精製し、CD21結合性のコンフォメーショナルエピトープ[31]を認識するgp350特異的72A1 mAbを使用するSDS-PAGE(変性)及びPAGE(非変性)により検出した(図2B)。ロイシンジッパー結合が破壊される変性条件下では、結果として得られるgp350二量体について、約200Kdの単一のバンドが観察されたのに対し、非変性条件下では、約400Kdの無傷の四量体gp350を表す単一のバンドが検出された。いずれの場合においても、単量体gp350は、約100Kdのバンドとして検出された。変性条件下において、検出可能なバンドの発色に必要とされる72A1 mAbの濃度が、非変性条件下で必要な濃度より10倍高かったことは、前者におけるgp350のコンフォメーションの喪失を反映している可能性が高く、注目に値する。
[実施例2]
四量体gp350は、強力なアジュバントの存在下においても、免疫原性が単量体gp350タンパク質より顕著に大きい、及び続くDNAワクチン接種
gp350特異的IgG反応を誘導する四量体gp350の、単量体gp350と対比した相対能力を決定した。マウスに、アラムアジュバントの存在下で、マウス1匹当たり25、1.0、又は0.2μgの四量体gp350又は単量体gp350を腹腔内注射し、21日目に、同様の形式でブースティングした。gp350特異的IgGの血清力価は、ELISAにより、表示の日に測定した(図3A)。四量体gp350は、高用量(25μg)において単量体gp350と比べて18倍高い二次血清gp350特異的IgG力価を誘導した。1.0μgの四量体gp350が、25μgの単量体を施されるマウスと同等な血清力価を誘導したのに対し、マウス1匹当たり0.2μgの用量の四量体は、かろうじて検出可能なgp350特異的IgG反応を誘発した(データは示さない)。したがって、四量体gp350は、重量当たりのベースで、単量体と比べて約25倍高い免疫原性を呈示した。四量体とは顕著に異なり、単量体は、1.0μgで、かろうじて検出可能なgp350特異的IgG反応を誘導した。
次に、アラムより強力なアジュバントの効果を調べて、四量体gp350と単量体gp350の免疫原性間で観察される差違が、より強力なアジュバントの存在下でもなお顕示されるのかどうかを決定した。マウスを、アラム、及び25μgの刺激性30マーCpG含有オリゴデオキシヌクレオチド(CpG-ODN)、Toll様受容体(TLR)9のリガンド[40]の存在下において、マウス1匹当たり25又は1.0μgの四量体又は単量体gp350で腹腔内免疫化した。CpG-ODNのアラムへの添加は、25μgの四量体gp350に反応する二次血清gp350特異的IgG力価において、アラムだけをアジュバントとして使用して観察される力価と比べて21倍の増強を結果としてもたらした(図3B)。同様に、CpG-ODNは、25μgの単量体gp350に対する反応を54倍増強した。それにもかかわらず、25μgの用量において、四量体gp350は、25μgの単量体と比べて11倍高いgp350特異的IgG力価をなおも誘導した。アラム+CpG-ODNの存在下で、1μgの四量体gp350が、25μgの単量体を施されるマウスと同等な反応を誘導したことは、注目に値する。1μgという、低量であり、はるかに弱い免疫原性用量でもなお、四量体gp350は、単量体と比べて21倍高いgp350特異的IgGの血清力価を誘導した。したがって、四量体gp350は、比較的強力なアジュバントの存在下でもなお、免疫原性が単量体gp350より顕著に大きい。
プラスミドDNAによるワクチン接種は、体液性免疫及び細胞介在性免疫の両方を、安全、且つ、費用対効果が高い様式で誘発する能力を含む、タンパク質による免疫化を凌ぐ多数の利点を付与しうる[41]。したがって、単量体をコードするDNAによる一次免疫化及び4週間後におけるブースティングに続く、gp350特異的IgGの誘導のレベルを、四量体をコードする等量のDNAと比較した。DNAを、顕微金粒子(すなわち、粒子媒介表皮送達(PMED))[42、43]により表皮へと導入した。いずれのプラスミドによる一次免疫化も、4週までに、最小限のgp350特異的IgGの血清力価を誘導した(図3C)。しかし、ブースティングしたところ、6週までに、いずれのプラスミドも、顕著なgp350特異的IgG反応を誘導した。四量体gp350をコードするDNAに対するgp350特異的IgG二次反応は、単量体をコードするDNAにより誘発される二次反応の8倍高かった(p=0.0004)ことは、注目に値する。アラム±CpG-ODN中の四量体gp350タンパク質(25μgの用量)に対する血清gp350特異的IgGアイソタイプ力価の解析を、四量体gp350をコードするDNAと比較した(図3D)。予期される通り、アラム単独中のgp350タンパク質は、主に、IgG1反応を誘発した。CpG-ODNの添加は、アラム単独について見られたgp350特異的IgG1反応を凌ぐgp350特異的IgG1反応を、有意にブースティングし、gp350特異的IgG2b及びIgG2aの血清力価もさらに誘導した。DNAワクチン接種は、アラム+CpG-ODN中のgp350タンパク質について観察されるのと同等のgp350特異的IgG1の血清力価、及びアラム+CpG-ODN中のgp350タンパク質について観察されるより低い(約3倍)gp350特異的IgG2aの血清力価を誘導したが、検出可能なIgG2bが、DNAに反応して観察されることはなかった(図3D)。gp350特異的IgG3の最小限の力価は、3つの免疫化群のうちのいずれに対する反応においても産生された。
[実施例3]
gp350特異的IgG反応の増強は、gp350の四量体形態によるプライミング及びブースティングの両方を必要とする
T細胞依存性二次反応を誘発するための刺激の要件は、一次反応を誘導するための要件ほど厳密ではないことが典型的である[44、45]。四量体gp350によるプライミング及びブースティングに続いて観察される、単量体と比べて実質的により高度なgp350特異的IgG二次反応は、一次免疫化及び/又は二次免疫化において四量体gp350により引き起こされた可能性がある。これを決定するため、マウスの4つの群を確立し、アラムをアジュバントとして使用して、四量体gp350及び単量体gp350によるプライミング及びブースティングの多様な組合せを実施した。図4に例示される通り、四量体gp350によるプライミング及びブースティングの両方だけが、単量体によるプライミング及びブースティングと比べて有意に高度なgp350特異的IgGの二次血清力価を結果としてもたらした。
[実施例4]
四量体gp350タンパク質による免疫化は、単量体と比べて顕著により高レベルのgp350特異的中和Igを誘導する
EBV gp350のCD21への結合は、感染性及びB細胞の新生物性形質転換に極めて重要なイベント[2]である、B細胞へのウイルス侵入のために必要である[5、6]。したがって、この相互作用を遮断する抗体(すなわち、「中和」抗体)[7]の誘発は、有効な予防的EBVワクチンのためのベースとして役立ちうる[17、18]。この点で、gp350特異的mAb(クローン72A1)を既に産生させたが、これは、gp350のヒトCD21との結合を特異的に遮断することができる[31]。gp350で免疫化されたマウスに由来する血清中の中和抗体の量を測定するため、ヒトCD21をトランスフェクトされた赤白血病細胞系(CR2M1α)を使用した。まず、単量体gp350を、蛍光色素であるDyLight 633で直接標識し、CR2M1α細胞とのインキュベーションの前に、量を変化させる72A1 mAbと混合した。添加された72A1 mAbの量を、gp350-DyLight 633の固定量と関連付ける中和検量線を作成し、その後、CR2M1α細胞の染色の平均蛍光強度(MFI)を求めた。次いで、単量体gp350-DyLight 633を、非希釈の免疫前血清又は25μgの四量体gp350若しくは単量体gp350によるプライミング及びブースティングに続くマウスに由来する非希釈の血清と混合し、その後、CR2M1α細胞と共にインキュベートした。図5に例示される通り、免疫前血清は、<4.0μg/mlの72A1 mAbと同等量の中和活性を含有した。単量体gp350が、13μg/mlの中和活性を誘導したのに対し、四量体は、253μg/mlの中和活性を誘導し、単量体より19倍高い活性レベルであった。単量体で免疫化されたマウスから得られる血清の、四量体で免疫化されたマウスから得られる血清と対比した中和活性の差違が、gp350特異的IgGの全(中和及び非中和)血清力価について観察される差違を緊密に反映したことは興味深い(図3を参照されたい)。これらのデータは、四量体gp350が、単量体gp350より有効なEBVワクチン候補であることを示し、後者は、I/II相臨床試験において、安全であり、伝染性単核症の発症率の低減において部分的に有効であることが既に示されている[17、18]。
[実施例5]
TTタンパク質によるプライミングは、四量体に対するgp350特異的IgG反応を阻害することができるが、単量体gp350に対するgp350特異的IgG反応を阻害することはできない
2つのユニバーサルTT特異的TTエピトープを、これがgp350特異的IgG反応の単量体gp350と比べた増強に寄与することを期待して、四量体gp350ワクチンへと導入した。この点で、小児は、TTを破傷風菌に対する防御のためのワクチンとして施されることが典型的であり、したがって、TTでプライミングされたCD4+ T細胞を有する可能性が高い。マウスのTTによるあらかじめの免疫化は、TTへとコンジュゲートさせた合成ペプチドに対するその後の抗体反応を抑制し[46]、これはクローナルドミナンスに起因し[47]、その誘導にはCD4+ T細胞が必要とされた[48]ことが示されている。したがって、四量体gp350が、in vivoにおいて、TT特異的CD4+ T細胞をプライミングしたのかどうか、そして全TTタンパク質によるマウスの最初のプライミングが、四量体に対するその後のgp350特異的IgG反応に影響を及ぼすのかどうかをまず決定した。マウスを、アラム中の25μgの四量体gp350又は単量体gp350で免疫化した。21日目に脾臓細胞を単離し、P2及びP30 TTペプチドと共に培養し、続いて、IL-4及びIL-5の細胞質内発現についてゲーティングされたCD4+ T細胞のフローサイトメトリー解析を行った。四量体gp350によりプライミングされたマウスに由来するCD4+ T細胞は、in vitroにおけるTTペプチドによる誘発に続き、細胞質IL-4及びIL-5を発現するCD4+ T細胞の有意な増大を呈示した(培地単独の存在下では呈示しなかった)が、単量体によりプライミングされたマウス又はナイーブマウスはこれを呈示しなかった(図6A)。これは、四量体gp350が、TT特異的CD4+ T細胞を、in vivoにおいてプライミングしたことを示した。次に、ナイーブマウスを、アラム中の25μgの全TTタンパク質で免疫化し、14日目に同様の形式でブースティングした結果、21日目までに、TT特異的IgGのたやすく検出可能な血清力価がもたらされた(データは示さない)。次いで、TTプライミングマウス及び非プライミングマウスを、アラム中の25μgの単量体gp350又は四量体gp350で免疫化し、14日後において、同様の形式でブースティングした。四量体gp350で免疫化された非プライミングマウスは、既に裏付けられている(図3A)通り、単量体と比べて有意により高度なgp350特異的IgG反応を誘発した(図6B)。しかし、TTプライミングマウスでは、gp350特異的IgG反応が、四量体gp350に対する反応において阻害されたが、単量体gp350に対する反応においては阻害されず、2つの群の間で血清力価の有意な差違は観察されなかった。プライミングのために25μgのTTを使用して観察されたTT特異的IgGの二次血清力価の約3分の1のTT特異的IgGの二次血清力価を誘導した(データは示さない)、100分の1の用量のTTを利用したところ、阻害は観察されず、四量体に対するgp350特異的IgG反応の増強も観察されなかった(図6C)。ELISAアッセイにより示される通り、TTに反応して誘発されるTT特異的IgG抗体は、四量体gp350に結合せず(データは示さない)、P2及びP30がT細胞エピトープであり、B細胞エピトープではないことと一致した。したがって、TTプライミングは、用量依存的な形で、TT特異的T細胞エピトープを含有するタンパク質抗原に対する抗体反応の阻害を結果としてもたらしうるが、これは、かつての報告と一致した[46〜48]。
[実施例6]
ナイーブマウスでは、四量体gp350内のTT特異的T細胞エピトープは、gp350特異的IgG反応に寄与しない
TTエピトープが、ナイーブマウスにおける、四量体gp350の、単量体gp350と対比したより強力な免疫原性に寄与することがある場合の寄与の程度を決定するために、TT特異的T細胞エピトープが、四量体内のTTをコードするDNAを欠失させた、新たなDNAプラスミドを構築した(「四量体-tt」と称する)。新たなプラスミドは、シークエンシング及び72A1 mAbを使用したCHO細胞発現タンパク質の免疫電気泳動により確認した。マウスの新たなセットを、アラム中の25又は1.0μgの単量体、四量体、又は四量体-ttで免疫化し、21日目に、同様の形式でブースティングした。図7Aに例示される通り、四量体及び四量体-ttは、用量依存的なgp350特異的IgG反応を誘導し、これらは、互いに有意に異ならなかったが、各々が、2つの用量の各々において、単量体により誘発されるgp350特異的IgG反応の約25倍高かった。ここでもまた、1μgの四量体又は四量体-ttについて観察される頑健なgp350特異的IgG反応とは対照的に、1μgの単量体は、かろうじて検出可能な反応を誘導した。同様に、四量体及び四量体-ttは、25μgの用量で、同程度のgp350特異的中和抗体反応を誘発し、これらは、各々が、単量体により誘発されるgp350特異的中和抗体反応の40倍以上高かった(図7B)。最後に、四量体及び四量体-ttをコードするプラスミドDNAによる免疫化は、同様のgp350特異的IgG反応を誘発したが、これらは、単量体gp350をコードするプラスミドDNAを使用して観察されるgp350特異的IgG反応の約8倍高かった(図7C)。これらのデータは、四量体gp350に対するgp350特異的IgG反応の、単量体gp350と対比した顕著な増強が、タンパク質の多量体化にもっぱら基づくものであり、より強力なT細胞エピトープを施すことに基づくものではないことを強く示唆する。
[実施例7]
四量体gp350は、ヒトCD21に、単量体より強く結合する
B細胞受容体(BCR)を介してコグネイト抗原に結合し、結果として得られるペプチド/MHC-IIを、CD4+ T細胞へと提示するB細胞の能力は、T細胞依存性体液性免疫反応の発生において極めて重要なイベントである。この点で、抗原の多量体化は、少なくとも部分的に、特異的B細胞とのより強いBCR結合を促進することにより、免疫原性をブースティングしうる。gp350は、ヒトCD21のリガンドではあるが、マウスCD21のリガンドではない。したがって、CR2M1αにより発現させたヒトCD21を、gp350に結合するBCRの代理(surrogate)として使用して、四量体gp350の結合の効率を単量体gp350と比較した。これを達成するため、CR2M1α細胞を、濃度を増大させる非標識の単量体又は四量体(0.05〜30μg/ml)と共にインキュベートし、続いて、非標識の2L10 mAb(マウスIgG1抗gp350)と共にインキュベートした。このmAbは、gp350に、CD21の結合部位とは異なる部位で結合し、よって、gp350/CD21結合がなされても遮断されない。これに続いて、DyLight 633で標識されたヤギ抗マウスIgGによる染色、及びフローサイトメトリーによる解析を行った。CR2M1α細胞の、濃度を増大させる単量体gp350及び四量体gp350とのインキュベーションは、いずれの場合においても、MFI染色の用量依存的漸増を結果としてもたらした(図8)。1.25μg/mlの四量体gp350を使用する染色が、30μg/mlの単量体gp350と同等なMFIを結果としてもたらしたことは注目に値する。これは、四量体の結合アビディティーが、単量体と対比して約24倍高いこと示唆する。この見かけの結合アビディティーの差違の程度は、四量体に反応した、gp350特異的IgGの及び中和抗体の、単量体と対比した誘導について観察される差異の程度と類似する。これらのデータは、gp350特異的B細胞による、四量体gp350とのBCR結合の増大が、少なくとも部分的に、in vivoにおけるその免疫原性の増大の原因となりうるという考えと一致する。
[実施例8]
単量体gp350も、四量体gp350も、ヒトB細胞をポリクローン的には活性化しない
精製された組換えgp350は、ヒトB細胞内のIL-6 mRNAの合成を、CD21依存的な様式で上方制御することが示されている[49]。これは、CD21のヒトB細胞上への架橋形成を誘導することが予測される四量体gp350が、ワクチンとして使用された場合に望ましくない副作用を伴う可能性がある、ポリクローナルのB細胞活性化剤として潜在的に作用しうることを示唆する。これを決定するために、精製された末梢血ヒトB細胞を、10μg/mlの単量体gp350若しくは四量体gp350、又は陰性対照タンパク質(肺炎球菌表面タンパク質A(PspA))と共にインキュベートした。陽性対照としては、B細胞を活性化させるための抗IgM抗体又はSAC+IL-2を使用した。図9に例示される通り、単量体gp350も、四量体gp350も、PspAも、活性化マーカーであるCD69(24時間後)も、CD25(24又は72時間後)も、共刺激分子であるCD86(24又は72時間後)も上方制御しなかった。これに対し、抗IgM又はSAC+IL-2は、これらのマーカーの3つ全てを強く上方制御した。さらに、抗IgM又はSAC+IL-2とは対照的に、単量体gp350も、四量体gp350も、B細胞サイズの増大を誘導しなかった(データは示さない)。これらのデータは、CD21を架橋する凝集又はラテックス結合性C3dgが、休止ヒトB細胞によるG1期の開始を直接誘発する能力を欠くことを裏付けるかつての報告[50]と一致する。これらのデータは、四量体gp350ワクチンが、in vivoにおけるポリクローナルのB細胞活性化を誘導しないことを強く示唆する。
[実施例9]
許容状態ウサギモデルにおける四量体gp350による免疫化
ウサギは、マウスとは対照的に、EBV感染についての許容状態モデルであり、したがって、EBVワクチンの前臨床試験に理想的である[67]。これは、ウサギB細胞が、マウスB細胞とは対照的に、B細胞のCD21との結合によりgp350に結合する可能性が極めて高いという、本発明者ら自身による観察を部分的に反映する可能性が高い。したがって、B細胞を染色するためのDylight標識gp350及びFITC-抗ウサギIgM mAbを使用したフローサイトメトリー解析を行って、gp350が、ウサギB細胞に結合するのかどうかを決定した。ニュージーランドホワイトウサギから単離された末梢血B細胞及び脾臓B細胞はいずれも、強力な二重染色を示した。陰性対照である、Dylightで標識された肺炎球菌表面タンパク質A(PspA)を使用したところ、染色は観察されなかった(データは示さない)。
次に、単量体gp350と対比した四量体gp350についての一連の用量反応免疫化研究を実施して、ウサギにおける単量体gp350及び四量体gp350の相対的な免疫原性を決定した。ウサギ(1群当たり4匹ずつ)を、アラム中の5.0、1.0、又は0.2μgの単量体gp350又は四量体gp350で皮下免疫化し、14日目に、同様の形式でブースティングした。血清は、ELISAによりgp350特異的IgG力価を測定するために、0、14、及び28日目において回収した(図10)。例示される通り、四量体gp350は、全ての用量で、免疫原性が、単量体gp350より顕著に大きかった。ウサギにおける、四量体と単量体と間のgp350特異的IgGの血清力価の差違は、マウスにおいて観察される約20倍の差違と比較して、最大で100倍であった。CD21とB細胞受容体(BCR)との共架橋形成は、相乗作用的なB細胞シグナル伝達を誘導するので、四量体gp350はまた、ウサギにおける分子内アジュバントとしても(及びこの延長上でヒトにおける分子内アジュバントとしても)作用しうる。
[実施例10]
他のEBV多量体構築物の構築
EBV感染及びその持続は、B細胞及び鼻咽頭上皮細胞へのウイルス侵入に大きく依存する。B細胞への感染は、EBV gp350のB細胞CD21への最初の結合に続いて、EBV gp42のB細胞MHCクラスII分子への結合を伴う。これは、EBV gH/gLヘテロ二量体及びgBにより媒介されるウイルスの融合及び侵入を結果としてもたらす。EBVによる上皮細胞感染もまた、gH/gL及びgBを伴うが、gp350又はgp42は伴わない。本明細書に記載される多量体化法は、三量体化ドメインによりEBV gH/gLヘテロ二量体を産生させるのに使用されている。多量体化法は同様に、多量体のgB又はgp42構築物を産生させるのにも使用することができる。
考察
この研究では、CD21結合性中和エピトープを含有する切断型gp350の2つのコピーを、コンフォメーショナルフォールディングを可能とするリンカーで隔てた、プラスミドを構築することにより、EBVのエンベロープタンパク質であるgp350の四量体を創出した。この二量体gp350は、トランスフェクトされたCHO細胞内の翻訳に続いて、3'側ロイシンジッパーモチーフの同型結合を介して、さらなる二量体化を経て、四量体を形成した。このタンパク質の多量体化戦略は、中和抗体を含むgp350特異的IgGの誘発の、単量体gp350と比べて顕著な増強を結果としてもたらした。単量体gp350と対比した四量体gp350の免疫原性の増強は、アラム+CpG-ODNなどの強力なアジュバントの存在下においてもなお、プラスミド又はタンパク質による直接的な免疫化に続いて観察された。四量体gp350は、ヒトCD21へと、はるかにより効率的に結合したが、ヒトB細胞をポリクローン的には活性化させなかった。さらに、多量体構築物の免疫原性について、許容状態ウサギモデルにおいて調べたところ、ウサギにおける、四量体と単量体と間のgp350特異的IgGの血清力価の差違は、マウスにおいて観察される20倍の差違と比較して、最大で100倍であった。したがって、これらのデータは、かつての小規模のヒト研究[16〜19]において使用された単量体gp350とは対照的に、伝染性単核症などのEBV介在性疾患、及び、おそらくは、新生物性形質転換に対して、より大きな防御性免疫を誘発するその潜在的可能性について、臨床試験において、四量体gp350を調べることの価値を裏付ける。これらのデータはまた、ワクチン対象の他のタンパク質に対する体液性免疫反応を増強するこの多量体化戦略の、再現可能で、且つ、費用対効果が高い様式での使用も裏付ける。
タンパク質/ペプチドの多量体化は、それらの免疫原性を増強することが示されている。したがって、凝集を媒介する長いポリグルタミンテールへと融合させた緑色蛍光タンパク質(GFP)をコードするプラスミドは、非凝集化GFPと比べて、マウスにおけるプライム/ブーストによる免疫化に続いて、有意に高度な血清GFP特異的Ig力価を誘導し、GFP特異的CD8+ CTL活性を増強した[21]。2×106 MWのデキストラン当たり20〜30個のBSAの比における、BSA又はハプテン化BSAのデキストランへの共有結合による、ウシ血清アルブミン(BSA)の多量体化は、非コンジュゲートタンパク質と比べて、それぞれ、BSA特異的IgG1又はハプテン特異的IgG1の誘発マウス血清力価の強力な増強を結果としてもたらした[25]。コピー数を増大させたインフルエンザウイルスM2タンパク質のペプチドエピトープ(M2e)とのグルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)の融合タンパク質で免疫化されたウサギは、GST-(M2e)8に反応して、GST-(M2e)1により誘導されるM2e特異的IgGより最大で2桁大きい平均アフィニティー定数(KA)で、M2e特異的IgGを誘発した[20]。コピー数を増大させたペプチドの、ウイルス様粒子(VLP)への共有結合は、エピトープ密度と、免疫化に続くペプチド特異的マウスIgG反応の大きさとの間では正の相関を結果としてもたらしたが、IgMについてはもたらさなかった[23]。高いエピトープ密度はまた、2型補体受容体(CD21)の非存在下における効果的なIgG反応も可能とした。治療用タンパク質、例えば、ヒト成長ホルモン、静脈内免疫グロブリン(IVIG)、ヒト血清アルブミン、ヒトインターロイキン2、及びヒトインターフェロンβの使用については、タンパク質の多量体化の望ましくない帰結が観察されており[22、24]、それでは、調製物中の凝集タンパク質が、治療有効性を低下させる中和抗体を含む免疫反応を優先的に誘導した。最後に、臨床用ワクチンにおいて一般に使用されるアジュバントであるアラム自体が、注射部位において抗原を捕捉する凝集物を形成する[51]。にもかかわらず、本研究において、CpG-ODNによるさらなるアジュバント処理を伴うか又は伴わないアラム中の四量体gp350は、同じアジュバントにより送達される単量体gp350より、免疫原性が顕著に大きかったことは、注目に値する。in vivoにおける直接的な証拠は限定されており、いかなる理論によって束縛されることも意図しないが、多量体タンパク質の免疫原性の増大は、より効果的な補体の活性化、BCRとの結合の増強、より効果的なBCR介在型シグナル伝達、B細胞による取込みの増強、並びにタンパク質由来ペプチドのCD4+ T細胞への提示及び/又は濾胞性樹状細胞の表面上の多量体タンパク質の捕捉の増強から生じる可能性が高い[24、52]。
B細胞エピトープに加えて、強力なCD4+ T細胞エピトープの存在が、タンパク質抗原に対する頑健なT細胞依存性(TD)IgG反応に重要である。この点で、TTは、コンジュゲートワクチンの一部として、肺炎球菌多糖に特異的なTD IgG反応を誘発するのに、gp350より有意に強力な担体タンパク質であることが示された。これは、TTが、ヘルパー機能をB細胞へと送達するのに、gp350より強力なCD4+ T細胞エピトープを含有することを強く示唆した。したがって、初期のgp350四量体デザインには、2つの公知のユニバーサルTT特異的CD4+ T細胞エピトープを組み込んだ。しかし、本研究におけるデータは、TTエピトープが、ナイーブマウスにおける四量体の免疫原性に寄与しないだけでなく、実際には、TTプライミングマウスにおける抗体反応の阻害を媒介したことを予測外に示す。この後者の観察は、TTの臨床用ワクチンとしての広範な使用に照らして関連性があった。この点で、マウスのTTによるあらかじめの免疫化は、TTへとコンジュゲートさせた合成ペプチドに対するその後の抗体反応を抑制し[46]、これはクローナルドミナンスに起因し[47]、その誘導のためにCD4+ T細胞を必要とした[48]ことが示されている。しかし、N19[53、54]又はPADRE[55、56]など、他のユニバーサルヒトCD4+ T細胞エピトープの組入れは、より奏効すると判明しうる可能性がある。
EBV gp350は、ヒト(及びウサギ)CD21には結合するが、マウスCD21には結合しない[57]。生理学的に、B細胞上及び濾胞性樹状細胞(FDC)上で発現したCD21は、抗原と会合すると免疫原性を促進する補体のC3dフラグメントに結合する[26、58、59]。これは、BCRとCD21との共架橋形成を介して生じる可能性が高く、高度に相乗作用的なB細胞シグナル伝達[60]及びFDC上のCD21を介する抗原の捕捉による胚中心の形成の促進[61]をもたらす。かつての研究は、gp350が、BCR/CD21共架橋形成を介してヒトB細胞シグナル伝達を促進することにより、アジュバントとして、潜在的にC3dの代用となりうることもさらに示している[62]。C3dを介する抗原特異的抗体反応の増強は、1つの抗原分子当たり少なくとも2つのC3dのコピーを伴う。したがって、ヒトにおいて、単一のBCRを介するgp350特異的B細胞の四量体gp350との結合は、CD21との結合のための、2〜3個のgp350分子へのアクセスをもたらし、これは、特異的BCR/CD21共架橋形成及び相乗作用的なB細胞シグナル伝達を促進しうるが、単量体gp350との結合はこのようなアクセスをもたらさない。四量体のヒトCD21との結合の効率の、単量体と対比した顕著な増大を示すこのデータに照らし、本発明者らは、四量体gp350はまた、特異的BCRのほか、CD21を発現させるヒトFDCにも、単量体gp350より大きなアビディティーで結合することを予測する。まとめると、これらの観察は、四量体として発現させたgp350が、臨床用EBVワクチンのための分子的アジュバントとして、及び特異的標的化抗原としての両方で作用することを強く示唆する。重要なことに、四量体gp350はそれ自体、ヒトB細胞をポリクローン的には活性化させず、したがって、in vivoにおける望ましくない非特異的免疫刺激に対する懸念を未然に回避した。
本明細書で記載される、四量体gp350を創出するための分子的戦略はまた、gH/gL、gp42、及びgBなど、他のEBVタンパク質を含む、ワクチン対象の他のタンパク質に対する体液性免疫反応のブースティングにも適用しうる。さらに、gp350は、二量体化のためにロイシンジッパーへと連結されたヘテロ二量体の創出、又はT4バクテリオファージフィブリチン(FT)[63]若しくは真核細胞GCN4転写因子モチーフ(GCN4)[64]などの三量体化モチーフを介して、別の標的タンパク質のための分子的アジュバントとして有用でありうる。最後に、標的タンパク質と、フラジェリン[65]など、アジュバント活性を保有するさらなるタンパク質、又は、例えば、抗原提示細胞若しくは固有の受容体を標的化するscFv断片[66]とを含むヘテロ二量体は、ワクチン接種のための、さらなる、高度に免疫原性の多量体タンパク質を産生させうる。
参考文献
以下の参考文献は、本明細書において引用され、本発明の分野についての一般的な情報を提供し、本明細書において論じられるアッセイ及び他の詳細を提示する。以下の参考文献は、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる。
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免疫反応を誘導又は抑制するこれらの方法では、免疫反応は、本明細書において開示される日常的な方法など、当技術分野における日常的な方法を使用して測定することができる。これらの日常的な方法は、抗体反応、例えば、組換えベクターによりコードされるタンパク質を指向する抗体反応を測定すること、及び細胞増殖を測定すること、例えば、トリチウム化チミジンの取込み又はサイトカイン(例えば、IFN-γ)産生を測定することによって細胞増殖を測定することを含むがこれらに限定されない。
本発明は以下の実施形態を包含する：
（１）第1の抗原、リンカー配列、第2の抗原、及びオリゴマー化ドメインを含む融合タンパク質であって、リンカー配列により、第1の抗原が第2の抗原へと接続され、破傷風トキソイドタンパク質を含まない、融合タンパク質。
（２）第1の抗原と第2の抗原とが同じである、実施形態１に記載の融合タンパク質。
（３）第1の抗原及び第2の抗原が、ウイルス抗原、細菌抗原、寄生虫抗原、自己免疫抗原、又は腫瘍抗原である、実施形態１又は２に記載の融合タンパク質。
（４）第1の抗原及び第2の抗原が、ポリペプチドである、実施形態１又は２に記載の融合タンパク質。
（５）第1の抗原及び第2の抗原が、エプスタイン-バーウイルス(EBV)抗原、サイトメガロウイルス(CMV)抗原、B型肝炎ウイルス抗原、デング熱ウイルス抗原、又はインフルエンザウイルス抗原である、実施形態１〜３のいずれかに記載の融合タンパク質。
（６）第1の抗原及び第2の抗原が、gp350/220、gH、gL、gB、又はgp42から選択されるEBV抗原である、実施形態５に記載の融合タンパク質。
（７）第1の抗原及び第2の抗原が、gB、gL、gH、又はpp65抗原から選択されるCMV抗原である、実施形態５に記載の融合タンパク質。
（８）第1の抗原及び第2の抗原が、連鎖球菌(Streptococcus)属抗原、腸球菌(Enterococcus)属抗原、赤痢菌(Shigella)属抗原、サルモネラ(Salmonella)属抗原、マイコバクテリウム(Mycobaterium)属抗原、クロストリジウム(Clostridium)属抗原、リケッチア(Rickettsia)属抗原、シュードモナス(Pseudomonas)属抗原、リステリア(Listeria)属抗原、レジオネラ・ニューモニエ(Legionella pneumonia)抗原、ボレリア・ブルグドルフェリ(Borellia burgdorferi)抗原、ピロリ菌(Helicobacter pylori)抗原、大腸菌(Escherichia coli)抗原、ジフテリア菌(Corynebacterium diphtheria)抗原、百日咳菌(Bordetella pertussis)抗原、クラミジア・トラコマチス(Chlamydia trachomitis)抗原、インフルエンザ菌(Haemophilus influenza)抗原、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)抗原、コレラ菌(Vibrio cholera)抗原、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)抗原、又は炭疽菌(Bacillus anthracus)抗原である、実施形態３に記載の融合タンパク質。
（９）宿主細胞内で発現すると、多量体タンパク質複合体を形成する、実施形態１〜８のいずれかに記載の融合タンパク質。
（１０）第1の抗原及び第2の抗原が、天然では、多量体タンパク質複合体として生じない、実施形態１〜９のいずれかに記載の融合タンパク質。
（１１）第1のタンパク質、リンカー配列、第2のタンパク質、及びオリゴマー化ドメインを含む融合タンパク質であって、リンカー配列により、第1のタンパク質が第2のタンパク質へと接続され、
(a) 第1のタンパク質が、ウイルス抗原、細菌抗原、寄生虫抗原、自己免疫抗原、腫瘍抗原、若しくは他のタンパク質抗原であり、第2のタンパク質が、アジュバントタンパク質であるか、若しくは細胞表面標的化ドメインを含む、
(b) 第1のタンパク質が、第1の細胞表面標的化ドメインを含み、第2のタンパク質が、第2の細胞表面標的化ドメインを含み、第1の細胞表面標的化ドメインと第2の細胞表面標的化ドメインとが、異なる細胞を標的とする、
(c) 第1のタンパク質が、免疫抑制を媒介する分子であり、第2のタンパク質が、活性化細胞に結合する細胞表面標的ドメインである、又は
(d) 第1のタンパク質及び第2のタンパク質が、HIVタンパク質である、
融合タンパク質。
（１２）アジュバントタンパク質が、フラジェリン、熱ショックタンパク質、又はtoll様受容体リガンドである、実施形態１１に記載の融合タンパク質。
（１３）第1のタンパク質が、ウイルス抗原、細菌抗原、寄生虫抗原、自己免疫抗原、腫瘍抗原、又は他のタンパク質抗原であり、第2のタンパク質が、細胞表面標的化ドメインを含み、第3のタンパク質及び第2のリンカー配列をさらに含み、第3のタンパク質が、細胞活性化ドメインを含む、実施形態１１に記載の融合タンパク質。
（１４）第1のタンパク質が、第1の細胞表面標的化ドメインを含み、第1の細胞表面標的化ドメインが、ナチュラルキラー細胞上のリガンドに結合する、実施形態１１に記載の融合タンパク質。
（１５）第1のタンパク質が、抗体のFc受容体に結合し、第2のタンパク質が、マスト細胞上のリガンドに結合する、実施形態１１に記載の融合タンパク質。
（１６）第1のタンパク質及び第2のタンパク質が、HIVタンパク質であり、第1のHIVタンパク質が、gp120であり、第2のHIVタンパク質が、gp41である、実施形態１１に記載の融合タンパク質。
（１７）第3のタンパク質及び第2のリンカー配列をさらに含み、第3のタンパク質が、EBV gp350/220抗原である、実施形態１６に記載の融合タンパク質。
（１８）第4のタンパク質及び第3のリンカー配列をさらに含み、第4のタンパク質が、EBV gp350/220抗原である、実施形態１７に記載の融合タンパク質。
（１９）第1のタンパク質及び第2のタンパク質が、天然では、多量体タンパク質複合体として生じない、実施形態１６〜１８のいずれかに記載の融合タンパク質。
（２０）宿主細胞内で発現すると、多量体タンパク質複合体を形成する、実施形態１６〜１８のいずれかに記載の融合タンパク質。
（２１）オリゴマー化ドメインが、二量体化ドメイン、三量体化ドメイン、又は四量体化ドメインである、実施形態１〜２０のいずれかに記載の融合タンパク質。
（２２）二量体化ドメインが、酵母GCN4ロイシンジッパードメイン又はその誘導体である、実施形態２１に記載の融合タンパク質。
（２３）三量体化ドメインが、T4バクテリオファージフィブリチンモチーフ若しくは真核細胞GCN4転写因子モチーフ、又はそれらの誘導体である、実施形態２１に記載の融合タンパク質。
（２４）オリゴマー化ドメインが、融合タンパク質のC末端又はN末端に位置する、実施形態１〜２３のいずれかに記載の融合タンパク質。
（２５）第1のリンカー配列、第2のリンカー配列、又は第3のリンカー配列が、10〜25の間のアミノ酸を含むポリペプチドである、実施形態１〜２４のいずれかに記載の融合タンパク質。
（２６）実施形態１〜２５のいずれかに記載の融合タンパク質をコードする、単離された核酸。
（２７）被験体における免疫反応を誘導又は抑制する方法であって、被験体へと、実施形態１〜２５のいずれかに記載の融合タンパク質又は実施形態２６に記載の核酸を含むワクチン組成物を投与することを含み、融合タンパク質が、融合タンパク質中の抗原に対する免疫反応を、被験体において誘導又は抑制する、方法。

Claims (27)

  1. 第1の抗原、リンカー配列、第2の抗原、及びオリゴマー化ドメインを含む融合タンパク質であって、リンカー配列により、第1の抗原が第2の抗原へと接続され、破傷風トキソイドタンパク質を含まない、融合タンパク質。
  2. 第1の抗原と第2の抗原とが同じである、請求項１に記載の融合タンパク質。
  3. 第1の抗原及び第2の抗原が、ウイルス抗原、細菌抗原、寄生虫抗原、自己免疫抗原、又は腫瘍抗原である、請求項１又は２に記載の融合タンパク質。
  4. 第1の抗原及び第2の抗原が、ポリペプチドである、請求項１又は２に記載の融合タンパク質。
  5. 第1の抗原及び第2の抗原が、エプスタイン-バーウイルス(EBV)抗原、サイトメガロウイルス(CMV)抗原、B型肝炎ウイルス抗原、デング熱ウイルス抗原、又はインフルエンザウイルス抗原である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  6. 第1の抗原及び第2の抗原が、gp350/220、gH、gL、gB、又はgp42から選択されるEBV抗原である、請求項５に記載の融合タンパク質。
  7. 第1の抗原及び第2の抗原が、gB、gL、gH、又はpp65抗原から選択されるCMV抗原である、請求項５に記載の融合タンパク質。
  8. 第1の抗原及び第2の抗原が、連鎖球菌(Streptococcus)属抗原、腸球菌(Enterococcus)属抗原、赤痢菌(Shigella)属抗原、サルモネラ(Salmonella)属抗原、マイコバクテリウム(Mycobaterium)属抗原、クロストリジウム(Clostridium)属抗原、リケッチア(Rickettsia)属抗原、シュードモナス(Pseudomonas)属抗原、リステリア(Listeria)属抗原、レジオネラ・ニューモニエ(Legionella pneumonia)抗原、ボレリア・ブルグドルフェリ(Borellia burgdorferi)抗原、ピロリ菌(Helicobacter pylori)抗原、大腸菌(Escherichia coli)抗原、ジフテリア菌(Corynebacterium diphtheria)抗原、百日咳菌(Bordetella pertussis)抗原、クラミジア・トラコマチス(Chlamydia trachomitis)抗原、インフルエンザ菌(Haemophilus influenza)抗原、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)抗原、コレラ菌(Vibrio cholera)抗原、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)抗原、又は炭疽菌(Bacillus anthracus)抗原である、請求項３に記載の融合タンパク質。
  9. 宿主細胞内で発現すると、多量体タンパク質複合体を形成する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  10. 第1の抗原及び第2の抗原が、天然では、多量体タンパク質複合体として生じない、請求項１〜９のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  11. 第1のタンパク質、リンカー配列、第2のタンパク質、及びオリゴマー化ドメインを含む融合タンパク質であって、リンカー配列により、第1のタンパク質が第2のタンパク質へと接続され、
    (a) 第1のタンパク質が、ウイルス抗原、細菌抗原、寄生虫抗原、自己免疫抗原、腫瘍抗原、若しくは他のタンパク質抗原であり、第2のタンパク質が、アジュバントタンパク質であるか、若しくは細胞表面標的化ドメインを含む、
    (b) 第1のタンパク質が、第1の細胞表面標的化ドメインを含み、第2のタンパク質が、第2の細胞表面標的化ドメインを含み、第1の細胞表面標的化ドメインと第2の細胞表面標的化ドメインとが、異なる細胞を標的とする、
    (c) 第1のタンパク質が、免疫抑制を媒介する分子であり、第2のタンパク質が、活性化細胞に結合する細胞表面標的ドメインである、又は
    (d) 第1のタンパク質及び第2のタンパク質が、HIVタンパク質である、
    融合タンパク質。
  12. アジュバントタンパク質が、フラジェリン、熱ショックタンパク質、又はtoll様受容体リガンドである、請求項１１に記載の融合タンパク質。
  13. 第1のタンパク質が、ウイルス抗原、細菌抗原、寄生虫抗原、自己免疫抗原、腫瘍抗原、又は他のタンパク質抗原であり、第2のタンパク質が、細胞表面標的化ドメインを含み、第3のタンパク質及び第2のリンカー配列をさらに含み、第3のタンパク質が、細胞活性化ドメインを含む、請求項１１に記載の融合タンパク質。
  14. 第1のタンパク質が、第1の細胞表面標的化ドメインを含み、第1の細胞表面標的化ドメインが、ナチュラルキラー細胞上のリガンドに結合する、請求項１１に記載の融合タンパク質。
  15. 第1のタンパク質が、抗体のFc受容体に結合し、第2のタンパク質が、マスト細胞上のリガンドに結合する、請求項１１に記載の融合タンパク質。
  16. 第1のタンパク質及び第2のタンパク質が、HIVタンパク質であり、第1のHIVタンパク質が、gp120であり、第2のHIVタンパク質が、gp41である、請求項１１に記載の融合タンパク質。
  17. 第3のタンパク質及び第2のリンカー配列をさらに含み、第3のタンパク質が、EBV gp350/220抗原である、請求項１６に記載の融合タンパク質。
  18. 第4のタンパク質及び第3のリンカー配列をさらに含み、第4のタンパク質が、EBV gp350/220抗原である、請求項１７に記載の融合タンパク質。
  19. 第1のタンパク質及び第2のタンパク質が、天然では、多量体タンパク質複合体として生じない、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  20. 宿主細胞内で発現すると、多量体タンパク質複合体を形成する、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  21. オリゴマー化ドメインが、二量体化ドメイン、三量体化ドメイン、又は四量体化ドメインである、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  22. 二量体化ドメインが、酵母GCN4ロイシンジッパードメイン又はその誘導体である、請求項２１に記載の融合タンパク質。
  23. 三量体化ドメインが、T4バクテリオファージフィブリチンモチーフ若しくは真核細胞GNC4転写因子モチーフ、又はそれらの誘導体である、請求項２１に記載の融合タンパク質。
  24. オリゴマー化ドメインが、融合タンパク質のC末端又はN末端に位置する、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  25. 第1のリンカー配列、第2のリンカー配列、又は第3のリンカー配列が、10〜25の間のアミノ酸を含むポリペプチドである、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  26. 請求項１〜２５のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする、単離された核酸。
  27. 被験体における免疫反応を誘導又は抑制する方法であって、被験体へと、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の融合タンパク質又は請求項２６に記載の核酸を含むワクチン組成物を投与することを含み、融合タンパク質が、融合タンパク質中の抗原に対する免疫反応を、被験体において誘導又は抑制する、方法。
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