JP2018118980A

JP2018118980A - 鉄および関連する薬学的製剤のバイオアベイラビリティを増加させることによる障害の予防または治療方法

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Publication number: JP2018118980A
Application number: JP2018039343A
Authority: JP
Inventors: アンドレアスホールバウム; Andreas Hohlbaum; ヘンドリックジル; Gille Hendrik; ステファントレントマン; Trentmann Stefan; ローレントオドリ; Audoly Laurent; アンドレアアレアシュドルファー; Andrea Allersdorfer
Original assignee: Pieris Pharmaceuticals GmbH
Current assignee: Pieris Pharmaceuticals GmbH
Priority date: 2011-12-12
Filing date: 2018-03-06
Publication date: 2018-08-02
Also published as: SG11201402996WA; US20140323389A1; AU2012350654B2; DK2791684T3; AU2012350654A1; EP3309555A2; US20170224770A1; EP2791684A2; AU2012350654C1; US9610356B2; CN103998937A; SG10201604574UA; EP3309555A3; JP2015501822A; JP6305345B2; US20180311311A1; CA2858959A1; EP2791684B1; WO2013087654A3; WO2013087654A2

Abstract

【課題】鉄のバイオアベイラビリティを増加させることが可能である、鉄レベルの変化と関連する障害を治療、改善又は予防するための薬学的組成物の提供。
【解決手段】ヘプシジンへの結合親和性を有するリポカリンムテインまたはその断片を含む薬学的組成物。鉄レベルの変化と関連する障害としては、貧血、炎症による貧血、慢性炎症性貧血、鉄欠乏性貧血、鉄負荷性貧血、敗血症、遺伝性ヘモクロマトーシス、慢性腎疾患(CKD)に伴う貧血、癌に伴う貧血(AC)、化学療法誘発性貧血(CIA)、またはESA抵抗に関連した貧血など。
【選択図】なし

Description

発明の分野
本開示は、治療的有効量の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、障害の治療、改善または予防方法に関し、この組成物は、該対象における鉄のバイオアベイラビリティを増加させることが可能なリポカリンムテイン(lipocalin mutein)またはその断片もしくは変異体を含有する。鉄のバイオアベイラビリティは、例えば血液などの体液中で、増加させることができる。障害は、好ましくは、該対象における鉄レベルの変化と関連している。さらなる態様において、疾患または障害は、鉄ホメオスタシスの障害または、例えば血液などの体液中の、鉄レベルの減少と関連した炎症状態を伴う。本開示はまた、それを必要とする対象の血液などの体液中の鉄のバイオアベイラビリティを増加させることが可能な少なくとも1種のリポカリンムテインの濃縮された安定な薬学的製剤に関する。この濃縮製剤は、例えば、注射器などの多くの従来の送達器具による皮下投与に適している。さらに、リポカリンムテインを含有する組成物は、対象において異なる半減期(薬物動態プロファイル)を有する異なる組成物をもたらす、多様な半減期延長成分(タンパク質または非タンパク質ベースの成分を含む)のどれかを含むことができる。

背景
非共有結合相互作用を介して所定の標的と選択的に結合するタンパク質は、一般的に、バイオテクノロジー、医学、生物分析、ならびに生物および生命科学において試薬として極めて重要な役割を果たしている。抗体、すなわち免疫グロブリンは、このクラスのタンパク質の広く知られた例である。リガンド/標的の認識、結合および/または分離と併せてこのようなタンパク質の多種多様なニーズにもかかわらず、ほぼ例外なく免疫グロブリンが現在使用されている。

抗体様の機能を有する追加のタンパク質性結合分子は、リポカリンファミリーのメンバーであり、これらはリガンドに結合するように自然に進化してきた。リポカリンは、脊椎動物、昆虫、植物および細菌を含めて、多くの生物に存在している。リポカリンタンパク質ファミリーのメンバー(Pervaiz, S., & Brew, K. (1987) FASEB J. 1, 209-214（非特許文献1）)は、典型的には、小さな分泌タンパク質であり、単一のポリペプチド鎖を有する。それらは、さまざまな異なる分子認識特性によって特徴づけられる：すなわち、それらは、種々の、主に疎水性の分子(例えば、レチノイド、脂肪酸、コレステロール、プロスタグランジン、ビリベルジン、フェロモン、味物質および臭気物質など)と結合可能である；それらは特定の細胞表面受容体と結合する；およびそれらは巨大分子複合体を形成する。それらは、これまで、主に輸送タンパク質として分類されてきたが、リポカリンはさまざまな生理学的機能を果たすことが今や明らかである。これらには、レチノール輸送、嗅覚、フェロモンシグナル伝達、およびプロスタグランジンの合成における役割が含まれる。リポカリンはまた、免疫応答の調節および細胞ホメオスタシスの媒介にも関与している(例えば、Flower, D.R. (1996) Biochem. J. 318, 1-14（非特許文献2）およびFlower, D.R. et al. (2000) Biochim. Biophys. Acta 1482, 9-24（非特許文献3）にレビュー)。

リポカリン類は、しばしば20％未満の配列同一性を有する、異常に低レベルの全体的な配列保存を共有している。これとは著しく対照的に、これらの全体的な折りたたみパターンは高度に保存されている。リポカリン構造の中心部分は、単一の8本鎖逆平行βシートが、連続的に水素結合したβ-バレルを形成するために、それ自体に戻って閉じた構造をしている。このβ-バレルが中心の空洞を形成している。バレルの一端は、その底面にかかるN末端ペプチドセグメントならびにβ鎖をつなぐ3つのペプチドループによって立体的にブロックされている。β-バレルの他端は、溶媒に開放されており、かつ4つの柔軟なペプチドループによって形成される標的結合部位を包囲している。さまざまなサイズ、形状、および化学的特性の標的を収容することがそれぞれ可能な、多種多様な結合様式を生じさせるのは、他の点では柔軟性に欠けるリポカリン骨格におけるループのこの多様性である(例えば、Flower, D.R. (1996), 前掲; Flower, D.R. et al. (2000), 前掲；またはSkerra, A. (2000) Biochim. Biophys. Acta 1482, 337-350（非特許文献4）にレビュー)。

いくつかのPCT公開公報(例えば、WO 99/16873、WO 00/75308、WO 03/029463、WO 03/029471およびWO 2005/19256（特許文献1〜5）)は、各種リポカリン(例：NGALリポカリン)のムテインが、野生型リポカリンの天然リガンドと異なる標的に対して高い親和性および特異性を示すように構築され得る方法を開示している。これは、例えば、4つのうち少なくとも1つのペプチドループの1つまたは複数のアミノ酸位置を変異させることによって、行うことができる。また、PCT公開公報WO 2012/022742（特許文献6）は、ヘプシジン(hepcidin)に対して向けられたリポカリンムテインの作製方法を教示している。

ヘプシジンは、主に肝臓の肝細胞で産生される、典型的には20または25アミノ酸のいずれかからなる2つの形態で存在するペプチドホルモンであって、鉄ホメオスタシスの調節において中心的な役割を果たし、抗菌ペプチドとして作用し、かつほとんどの鉄欠乏/過剰症候群の発症に直接または間接的に関与している。ヘプシジンの主な作用は、すべての鉄排出細胞上に発現される鉄輸送体フェロポーチン(ferroportin)を内在化して分解することである。ヘプシジンはフェロポーチンに直接結合する。ヘプシジンレベルの低濃度は、マクロファージおよび肝細胞からの鉄放出の加速につながる。

鉄レベルの減少に関連する疾患および/または症状を治療するための薬剤ならびにヘプシジンを単離、分析および定量する方法は、国際特許出願WO 2008/011158、WO 2008/097461、WO 2009/094551A1、WO 2009/139822、WO 2009/058797およびWO 2010/017070（特許文献7〜12）に記載されている。しかし、本開示により提供されるタンパク質に付随する特性を備えたタンパク質は、以前に記載されていない。

したがって、体液中の鉄のバイオアベイラビリティを増加させることが可能であり、かつそれを必要とする対象においてインビボ治療活性を示す、ヒトNGALリポカリンの少なくとも1種のムテインを含有する組成物の治療的有効量を用いる、改善された治療方法を提供することが望ましいであろう。

WO 99/16873 WO 00/75308 WO 03/029463 WO 03/029471 WO 2005/19256 WO 2012/022742 WO 2008/011158 WO 2008/097461 WO 2009/094551 WO 2009/139822 WO 2009/058797 WO 2010/017070

Pervaiz, S., & Brew, K. (1987) FASEB J. 1, 209-214 Flower, D.R. (1996) Biochem. J. 318, 1-14 Flower, D.R. et al. (2000) Biochim. Biophys. Acta 1482, 9-24 Skerra, A. (2000) Biochim. Biophys. Acta 1482, 337-350

[本発明1001]
リポカリンムテインまたはその断片もしくは変異体を含有する薬学的組成物の治療的有効量をそれを必要とする対象に投与する段階を含む、障害の治療、改善または予防方法に使用するための、リポカリンムテインまたはその断片もしくは変異体であって、該リポカリンムテイン、断片もしくは変異体が、該対象における鉄のバイオアベイラビリティを増加させることができ、該量が、該対象において満足のいく治療結果（therapeutic readout）を生じさせるのに十分である、リポカリンムテインまたはその断片もしくは変異体。
[本発明1002]
前記組成物が非経口経路または経口経路を介して投与される、本発明1001の使用に従うリポカリンムテインまたはその断片もしくは変異体。
[本発明1003]
前記組成物が経腸経路を介して投与される、前記本発明のいずれかの使用に従うリポカリンムテインまたはその断片もしくは変異体。
[本発明1004]
前記組成物が1日2回まで、1日1回まで、1日おきに1回まで、2日おきに1回まで、週に2回まで、週に1回まで、および隔週に1回まで、および月に1回まで投与される、前記本発明のいずれかの使用に従うリポカリンムテインまたはその断片もしくは変異体。
[本発明1005]
前記組成物が、0.1〜1mg/kg、0.1〜40mg/kg、1〜20mg/kg、1〜10mg/kg、3〜20mg/kg、および1〜3mg/kgからなる群より選択される投与量レベルで、それを必要とする対象に毎回投与される、前記本発明のいずれかの使用に従うリポカリンムテインまたはその断片もしくは変異体。
[本発明1006]
前記リポカリンムテインが、SEQ ID NO:6に示される軽鎖可変領域およびSEQ ID NO:7に示される重鎖可変領域を有するヘプシジン特異的モノクローナル抗体へのヘプシジンの結合を阻害することができる、前記本発明のいずれかの使用に従うリポカリンムテインまたはその断片もしくは変異体。
[本発明1007]
前記リポカリンムテインが、それぞれSEQ ID NO:6および7に示される軽鎖可変領域および重鎖可変領域を有する抗体と、ヘプシジンへの結合について競合する、前記本発明のいずれかの使用に従うリポカリンムテインまたはその断片もしくは変異体。
[本発明1008]
前記リポカリンムテインが、SEQ ID NO:1に対して少なくとも75％の配列同一性または相同性を有する、前記本発明のいずれかの使用に従うリポカリンムテインまたはその断片もしくは変異体。
[本発明1009]
前記リポカリンムテインが、該ムテインの血清中半減期を延長する化合物にコンジュゲートされている、前記本発明のいずれかの使用に従うリポカリンムテインまたはその断片もしくは変異体。
[本発明1010]
血清中半減期を延長する前記化合物が、ポリアルキレングリコール分子、ヒドロキシエチルデンプン、タンパク質ドメイン、免疫グロブリンのFc部、免疫グロブリンのCH3ドメイン、免疫グロブリンのCH4ドメイン、アルブミン結合ペプチド、およびアルブミン結合タンパク質からなる群より選択される、本発明1008の使用に従うリポカリンムテインまたはその断片もしくは変異体。
[本発明1011]
鉄のバイオアベイラビリティを増加させることができる、本発明1009または本発明1010の任意の方法で使用される、コンジュゲートされたリポカリンムテイン。
[本発明1012]
ポリアルキレングリコールがポリエチレン(PEG)またはその活性化誘導体である、本発明1011のコンジュゲートされたムテイン。
[本発明1013]
ポリエチレン(PEG)が分子量30キロダルトンである、本発明1012のコンジュゲートされたムテイン。
[本発明1014]
貧血、炎症による貧血、慢性炎症性貧血、鉄欠乏性貧血、鉄負荷性貧血、敗血症、遺伝性ヘモクロマトーシス、慢性腎疾患(CKD)に伴う貧血、癌に伴う貧血(AC)、化学療法誘発性貧血(CIA)、ESA抵抗に関連した貧血、フェロポーチン病、ヘモクロマトーシス、末期腎不全、慢性腎疾患、炎症、糖尿病、関節リウマチ、動脈硬化症、血管炎、全身性エリテマトーデス、および異常ヘモグロビン症の治療または診断方法で使用するための、本発明1001〜1013のいずれかのリポカリンムテインまたはその断片もしくは変異体。
[本発明1015]
a. 約50〜350mg/mlのリポカリンムテイン；
b. 約1〜100mMの、pH5.5〜8を提供する緩衝剤；
c. 約1〜500mMの安定剤または2種以上の安定剤の混合物；
d. 約0.01〜0.08％の非イオン性界面活性剤；および
e. 有効量の少なくとも1種のヒアルロニダーゼ酵素
を含有する、それを必要とする対象における鉄のバイオアベイラビリティを増加させることができる少なくとも1種のリポカリンムテインの高度に濃縮された安定な薬学的製剤。
[本発明1016]
それを必要とする対象における鉄のバイオアベイラビリティを増加させることができるリポカリンムテインまたはその断片もしくは変異体を用いた治療に適している障害を治療する方法であって、該障害を治療するのに有効な量を該対象に投与する段階を含む方法
で使用するための、本発明1015の製剤。
[本発明1017]
本発明1015の製剤を含有する1つまたは複数のバイアルと、該製剤を患者に皮下投与するための注射器具とを含む、キット。

図1は、マウス(図1a)、ラット(図1b)、カニクイザル(図1c)における、10mg/kgでの単回静脈内(i.v.)投与、2コンパートメント薬物動態(PK)解析による、リポカリンムテインのPEG化型の血漿濃度プロファイル、ならびに分布容積V_DおよびクリアランスC_Lなどの主要な薬物動態パラメータ(図1d)を示す。データは、例えばPEGの選択を介して、リポカリンムテインのPK特性を調整することができることを示している。また、マウス、ラットおよび非ヒト霊長類からのPKデータのアロメトリック・スケーリング(allometric scaling)は、半減期などのヒトPK特性の予測を可能にする。図１ａの説明を参照のこと。図１ａの説明を参照のこと。図１ａの説明を参照のこと。図2は、マウス、ラットおよびカニクイザルにおける、リポカリンムテインのPEG化型を用いた単回投与PK試験で得られた分布容積V_DおよびクリアランスC_L値のアロメトリック・スケーリング(図2aおよび図2b)、線形回帰分析における適合度(R²)(図2c)、ならびにPEG化リポカリンムテインのヒト分布容積V_DおよびクリアランスC_Lのスケーリングされた値(図2d)を示す。また、消失速度定数およびヒト半減期は、V_DおよびC_Lの推定ヒト値からk_el = C_L/V_Dおよびt_1/2 = In2/k_elとして計算した。図２ａの説明を参照のこと。図２ａの説明を参照のこと。図２ａの説明を参照のこと。図3は、ヘプシジン特異的モノクローナル抗体(WO 2008/097461に開示される抗体12B9、軽鎖可変領域および重鎖可変領域はそれぞれSEQ ID NO:6および7に示される)へのビオチン化ヘプシジンの結合の溶液競合ELISAに基づく阻害を示す。このアッセイは、遊離/未結合ヘプシジンを測定するものであり、ヘプシジン-25の非常に低い濃度(25pM)がアッセイで使用されるように、非常に感度がよい。リポカリンムテインの4種のPEGコンジュゲートは、ピコモル親和性のIC50値で溶液中のヘプシジン-25と結合し、異なる半減期延長様式によって影響されることがない。図4は、ヘプシジンとリポカリンムテインのPEGコンジュゲートとの相互作用のために開発された薬物動態および薬力学(PK/PD)モデル構造を示す。A1fおよびA2fは、薬物動態モデルの中心および末梢コンパートメントにおける遊離コンジュゲート誘導体の量を指す。HPは全身循環中の遊離ヘプシジンの量であり、HPAはコンジュゲート-ヘプシジン複合体の量である。k21、k12およびk10または一次速度定数、kin,hおよびkout,hは、ヘプシジンの代謝回転速度定数である。konおよびkoffは、コンジュゲート-ヘプシジン複合体の形成および解離のための結合定数である。Vcは、コンジュゲートについての中心コンパートメントの分布容積である。Dは用量を意味する。図5は、カニクイザル(n＝3)に10mg/kgの用量で単回i.v.投与した後の、PEG12、PEG20、PEG30またはPEG40に連結させたリポカリンムテインの総(赤)および遊離(緑)濃度についての測定された(記号)およびモデル予測された(線)濃度-時間プロファイルを示す。また、それぞれのモデル導出パラメータが示される。具体的には、カニクイザル(n＝3)に10mg/kgの用量で単回i.v.投与した後の、PEG12、PEG20、PEG30またはPEG40に連結させたリポカリンムテインの総(赤)および遊離(緑)濃度についての測定された(記号)およびモデル予測された(線)濃度-時間プロファイルは図5aに示される。ムテインPEGコンジュゲートのための薬物動態および薬力学的パラメータ、Kon、Koff、およびKout,hは、この分析に先立って決定された値に固定した。それぞれのモデル導出パラメータは図5bに示される。図6は、カニクイザルにPEG化リポカリンムテインを10mg/kgの用量で単回投与した後の、総(結合および未結合)リポカリンムテイン(赤)、ヘプシジン-ムテイン複合体(青)、遊離リポカリンムテイン(緑)、および遊離ヘプシジン(赤)のシミュレートされた濃度-時間プロファイル(nMol)を示す。図6はまた、カニクイザルにリポカリンムテインの4種のPEGコンジュゲートを10mg/kgの用量で単回投与した後の、総(結合および未結合)コンジュゲート(赤)、ヘプシジン-コンジュゲート複合体(青)、遊離コンジュゲート(緑)、および遊離ヘプシジン(赤)のシミュレートされた濃度-時間プロファイル(nMol)を示す。図６ａの説明を参照のこと。図６ａの説明を参照のこと。図６ａの説明を参照のこと。図7は、カニクイザルにPEG化リポカリンムテインを10mg/kgの用量で反復投与した後の、総(結合および未結合)リポカリンムテイン(赤)、ヘプシジン-ムテイン複合体(青)、遊離リポカリンムテイン(緑)、および遊離ヘプシジン(赤)のシミュレートされた濃度-時間プロファイル(nMol)を示す。図7はまた、カニクイザルにリポカリンムテインの2種のPEGコンジュゲートを10mg/kgの用量で48時間ごとに反復投与した後の、総(結合および未結合)コンジュゲート(赤)、ヘプシジン-コンジュゲート複合体(青)、遊離コンジュゲート(緑)、および遊離ヘプシジン(赤)のシミュレートされた濃度-時間プロファイル(nMol)を示す。図8は、カニクイザル(n＝3)に10mg/kgの用量で単回i.v.投与した後の、PEG12、PEG20、PEG30またはPEG40に連結させたリポカリンムテインの血清鉄濃度対時間プロファイルを示す。具体的には、図8は、カニクイザル(n＝3)に10mg/kgの用量で単回i.v.投与した後の、リポカリンムテインの4種のPEGコンジュゲートの血清鉄濃度対時間プロファイルを示す。曲線下血清鉄面積の値は、それぞれのプロファイルの下にh^*μmol^*L^-1で示される。図9は、異なるモル濃度でのリポカリンムテインの3種のPEGコンジュゲートの粘度を示す。図10は、PEG30に連結させたリポカリンムテインのi.v.用量に依存するカニクイザル(n＝3)の鉄応答を示す。具体的には、図10は、カニクイザル(n＝3)における、0.5〜10mg/kgの単回i.v.投与後のPEG30に連結させたリポカリンムテイン、または10mg/kgでのPEG40に連結させた親野生型リポカリンの、血清鉄濃度対時間プロファイルを示す。曲線下血清鉄面積(もしあれば)の値は、それぞれのプロファイルの下にh^*μmol^*L^-1で示される。図１０ａの説明を参照のこと。図１０ａの説明を参照のこと。図１０ａの説明を参照のこと。図１０ａの説明を参照のこと。図１０ａの説明を参照のこと。図11は、PEG30に連結させたリポカリンムテインを大量に1回i.v.または皮下(s.c.)投与したときの各カニクイザルにおける鉄応答を示す。具体的には、図11は、カニクイザルに20/40/80/150mg/kgの用量で単回i.v.投与した後および20mg/kgの用量で単回s.c.投与した後の、PEG30に連結させたリポカリンムテインの血清鉄濃度対時間プロファイルを示す。図１１ａの説明を参照のこと。図１１ａの説明を参照のこと。図１１ａの説明を参照のこと。図１１ａの説明を参照のこと。図12は、PEG30に連結させたリポカリンムテインを大量に反復i.v.またはs.c.投与したときの各カニクイザルにおける鉄応答を示す。具体的には、図12は、150mg/kgまたは20mg/kgでのそれぞれ反復i.v.またはs.c.投与(5×Q2D)後の、PEG30に連結させたリポカリンムテインの血清鉄濃度対時間プロファイル(平均+/-SEM、n＝3、グループにつき1匹の非応答動物を除外した)を示す。図13は、Biacoreを用いた、SEQ ID NO:1の配列を有するリポカリンムテインの親和性および特異性の解析を示す。具体的には、図13は、ヘプシジン-25および他の関連または非関連分子に対するリポカリンムテインの動態パラメータおよび結合親和性を示す。

詳細な説明
本開示は、障害の治療、改善または予防方法に関し、この方法は、それを必要とする対象に、好ましくは、該対象における鉄のバイオアベイラビリティを増加させることが可能なリポカリンムテインまたはその断片もしくは変異体の治療的有効量を、投与することを含み、該リポカリンムテインまたはその断片もしくは変異体は、好ましくは、薬学的組成物の形態である。同様に、本開示は、それを必要とする対象に投与することを含む障害の治療、改善または予防方法において使用するための、該対象における鉄のバイオアベイラビリティを増加させることが可能なリポカリンムテインまたはその断片もしくは変異体に関する。いくつかの好ましい態様では、前記組成物は、それを必要とする対象に、例えば、以下からなる群より選択される頻度で投与される：1日2回まで、1日1回まで、1日おきに1回まで、2日おきに1回まで、週に2回まで、週に1回まで、隔週に1回まで、および月に1回まで。

好ましくは、治療、改善または予防される障害は、それを必要とする対象における鉄レベルの変化と関連している。

関連する態様において、前記疾患または障害は、鉄ホメオスタシスの障害または、例えば血液などの体液中の、鉄レベルの減少と関連した炎症状態を伴う。

さまざまな好ましい態様では、前記障害は炎症による貧血または鉄欠乏性貧血であり、好ましくは、炎症による貧血は慢性疾患に伴う貧血(anemia of chronic disease: ACD)または慢性障害に伴う貧血と関連している。

本明細書において提供される薬学的組成物は、対象における鉄のバイオアベイラビリティを増加させることが可能なリポカリンムテインを含有する。いくつかの態様では、対象における鉄のバイオアベイラビリティを増加させることができる、本明細書に記載のリポカリンムテインは、ヘプシジンとヘプシジン特異的モノクローナル抗体(WO 2008/097461に記載の抗体12B9、その軽鎖可変領域および重鎖可変領域は、それぞれ、SEQ ID NO:6および7に示されるが、WO 2008/097461では、12B9の軽鎖可変領域および重鎖可変領域は、SEQ ID NO:158および160に示される)の結合を阻害することができるリポカリンムテインである。したがって、リポカリンムテインは、前記モノクローナル抗体と同じエピトープを認識して、それに結合すると考えられる。それゆえ、本発明はまた、ヘプシジンへの結合について、それぞれ、SEQ ID NO:6および7に示される軽鎖可変領域および重鎖可変領域を有する12B9抗体と競合するリポカリンムテインを提供する。このようなリポカリンムテインは、好ましくは、本明細書に記載の方法および用途に適用される。いくつかの態様では、対象における鉄のバイオアベイラビリティを増加させることができる、本明細書に記載のリポカリンムテインは、ヒトNGALリポカリン(「hNGAL」ともいう)ムテインであってもよく、これは、成熟ヒト涙液リポカリンの線状ポリペプチド配列の位置96、100、および/または106に対応する位置のいずれか2つ以上のアミノ酸で変異したアミノ酸を有する。リポカリンムテインはさらに、hNGALの線状ポリペプチド配列の位置36、40、41、49、52、68、70、72、73、77、79、81、96、100、103、106、125、127、132、および/または134に対応する位置のいずれか1つまたは複数のアミノ酸で変異したアミノ酸を有してもよい。本明細書に記載のリポカリンムテインは、特に好ましい態様では、成熟ヒトNGALリポカリンの配列に対して少なくとも75％の同一性を有するものであり得る。

いくつかのさらなる態様では、対象における鉄のバイオアベイラビリティを増加させることができるリポカリンムテインは、SEQ ID NO:1で表されるリポカリンムテインまたはその断片もしくは変異体である。好ましくは、前記断片または変異体は、SEQ ID NO:1で表されるアミノ酸に対して少なくとも75％、80％、85％、90％または95％の配列同一性または相同性を有する。この点に関して、WO 2012/022742に開示されるSEQ ID NO:1〜14は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。したがって、これらのリポカリンムテインは、本明細書に記載の方法および用途に適用することができる。

さまざまな好ましい態様では、リポカリンムテインの半減期、およびしたがって薬物動態プロファイルを改変するために、本開示のリポカリンムテインに半減期改変成分を結合させることが可能である。これを行うための1つの方法は、半減期改変成分の結合点として機能することができるように、リポカリンムテイン中の少なくとも1つのアミノ酸残基を変異させるかまたは付加することである。これは、例えば、ポリエチレングリコール(PEG)、ヒドロキシエチルデンプン(HES)、ビオチン、ペプチドまたはタンパク質などの他の化合物へのコンジュゲーション用の、あるいは天然に存在しないジスルフィド結合形成用の、反応性基を導入するためのシステインの付加(またはシステインへの置換)であり得る。ヒトNGALのムテインに関して、システイン残基をhNGALムテインのアミノ酸配列に導入するための、そうした変異の例示的な可能性は、hNGALの野生型配列の配列位置14、21、60、84、88、116、141、145、143、146または158に対応する配列位置の少なくとも1つにシステイン(Cys)残基を導入することを含む。いくつかの態様では、hNGALムテインが、SWISS-PROT/UniProtデータバンクアクセッション番号P80188の配列と比較して、システインが別のアミノ酸残基で置き換えられている配列を有する場合、対応するシステインを該配列に再導入することができる。説明に役立つ例として、アミノ酸位置87のシステイン残基は、SWISS-PROTアクセッション番号P80188の配列に元々存在するシステインに戻すことによって、このような場合に導入され得る。アミノ酸位置14、21、60、84、88、116、141、145、143、146および/または158のいずれかの傍らに生成されたチオール部分は、例えば、それぞれのhNGALムテインの血清中半減期を増加させることを目的として、hNGALムテインをPEG化またはHES化するために使用することができる。

この点に関して、本明細書で提供されるリポカリンムテインは、対象におけるその薬物動態学的特性を変化させるために修飾することができる。例えば、リポカリンムテインの終末相半減期(terminal half-life)は、5キロダルトン〜40キロダルトンの範囲の、またはさらに大きい、PEG成分を含むことができる。本明細書に開示される(半減期を増加させるように改変された)薬学的組成物の半減期は、好ましくは、対象において少なくとも約1日、2日、4日、6日、7日、14日、または21日間である。実施例で行った試験を用いて、当業者は、以下の(i)および(ii)に及ぼすPEGの長さの影響を推測することができる：(i)動物およびヒトにおけるPK特性、(ii)薬力学的(PD)応答(例えば、リポカリンムテインが、所定の用量およびヘプシジン代謝回転率で、ヘプシジンを阻害できる、または血清鉄を増加できる時間の長さ）。その試験のデータから示されるように、一定の半減期は、対象の体内でリポカリンムテインの十分に高い濃度を維持するために必要であり、こうして、リポカリンムテインは、リポカリンムテインがクリアランスされる前に、ヘプシジンと結合する機会を持つことになる。

さまざまな好ましい態様では、PEG30またはPEG40が、それより短いPEGではなく、正常な腎臓ろ過を有する動物/ヒトにおいて提案されており、それはすなわち、PEG12またはPEG20のより速い排出が、ヘプシジン中和のそれらの有効性および持続時間を制限するからである。実施例7および図8に示すように、PEG12コンジュゲートは、より低いピーク血清鉄レベルおよびベースラインより上昇した血清鉄レベルのより短い持続時間をもたらした。

また、実施例6および図7に示すように、ヘプシジンのリポカリンムテインへの結合は、ヘプシジンフリーのリポカリンムテインの観察されたクリアランス速度に寄与した。この過程の速さは、以下の(i)および(ii)に依存する：(i)さまざまな疾患におけるヘプシジン血漿濃度(nM)、(ii)さまざまな疾患における基礎産生率。正常な動物/ヒトでは、その産生率は比較的高く、その結果、ヘプシジンフリーのリポカリンムテインのクリアランスは、例えばリポカリンムテインの腎臓ろ過によるクリアランスではなく、ヘプシジンの結合によって支配され、長い血清中半減期を有する他のアンタゴニスト(例えば抗体)の場合と同様である。したがって、さらなる好ましい態様では、PEG30が提案されるであろう。一方では、1nMの閾値以下の血清ヘプシジンの一定した抑制は、リポカリンムテイン-PEG30コンジュゲートとリポカリンムテイン-PEG40コンジュゲートの両方によって達成することができ、他方では、PEG40にコンジュゲートしたリポカリンムテインの反復投与は、さらなる有効性に貢献することなく、PEG30にコンジュゲートしたリポカリンムテインと比較して、コンジュゲート/ヘプシジン複合体のおよそ5倍高い蓄積をもたらす。

それにもかかわらず、さまざまな疾患において変化する2つの可変要因(腎臓ろ過およびヘプシジン産生率)が存在するので、リポカリンムテインは、特定の疾患を患う特定の患者集団に対して最適化され得る。例えば、慢性腎疾患(CKD)または特定の癌を有する患者における腎臓ろ過の低下は、より短いPEG変異体のクリアランス速度を低下させるかもしれず、こうした場合には、より短いPEG変異体は、正常な動物/ヒトにおいて開示されたPEG30またはPEG40にかなり匹敵する半減期をもつ可能性がある。したがって、さまざまな好ましい態様では、より短いPEGが好ましいであろう。また、本開示のPEG化リポカリンムテインの粘度はPEGのサイズとともに増加する。より短いPEG部分は、例えば皮下注射のために注射器でまだ注入できるより高い濃度の製剤を支持するので、さまざまな特定の態様では、より短いPEGが好ましいであろう。

さまざまな好ましい態様では、本開示のリポカリンムテインを含有する組成物の半減期などのPK特性はまた、それ自体が該ムテインの血清中半減期を延長するタンパク質によって変化させることができる。該ムテインは、例えば、免疫グロブリンのFc部、免疫グロブリンのCH3ドメイン、免疫グロブリンのCH4ドメイン、アルブミン結合ペプチド、およびアルブミン結合タンパク質からなる群より選択される成分とのコンジュゲートを形成させるか、または該成分との融合タンパク質として発現させることができる。

本開示に従って使用される用語「位置」は、本明細書に示されるアミノ酸配列内のアミノ酸の位置、または本明細書に示される核酸配列内のヌクレオチドの位置のいずれかを意味する。本明細書で使用される用語「対応する」はまた、位置が前述のヌクレオチド/アミノ酸の数によって単に決定されるのではないことを含む。したがって、置換することができる、本開示に従う所定のアミノ酸の位置は、(変異型または野生型)リポカリンの他の位置でのアミノ酸の欠失または付加のために変化しうる。同様に、置換することができる、本開示に従う所定のヌクレオチドの位置は、ムテインまたは野生型リポカリンの5'-非翻訳領域(UTR)(プロモーターおよび/または他の調節配列を含む)または遺伝子(エキソンおよびイントロンを含む)の他の位置でのヌクレオチドの欠失または付加のために変化しうる。

したがって本開示に従う「対応する位置」の下では、好ましくは、ヌクレオチド/アミノ酸は、示された数字が異なっていてよいが、それでもなお類似する隣接ヌクレオチド/アミノ酸を有し得ることを理解すべきである。交換、欠失または付加され得る前記ヌクレオチド/アミノ酸もまた、用語「対応する位置」によって含まれる。本明細書で「位置に対応する位置の」が使用される場合は、「クエリー」アミノ酸(またはヌクレオチド)配列中の位置が、「サブジェクト」アミノ酸(またはヌクレオチド)配列中の位置に対応していることを意味する。

本開示のムテインに関連して本開示で使用される用語「断片」は、N末端および/またはC末端で短縮された、すなわち、N末端および/またはC末端のアミノ酸の少なくとも1つを欠失している、完全長の成熟ヒト涙液リポカリンに由来するタンパク質またはペプチドに関する。このような断片は、成熟ヒト涙液リポカリンの一次配列の、好ましくは少なくとも10個、より好ましくは20個、最も好ましくは30個またはそれ以上連続したアミノ酸を含み、かつ成熟ヒト涙液リポカリンのイムノアッセイにおいて通常検出可能である。

本開示で使用される用語「変異体」は、例えば置換、欠失、挿入または化学的修飾による、アミノ酸配列の修飾を含むタンパク質またはペプチドの誘導体に関する。好ましくは、このような修飾はタンパク質またはペプチドの機能性を低下させない。そのような変異体には、1個または複数のアミノ酸がそれらのそれぞれのD-立体異性体によって、または天然に存在する20種のアミノ酸以外のアミノ酸、例えばオルニチン、ヒドロキシプロリン、シトルリン、ホモセリン、ヒドロキシリシン、ノルバリンなどによって置き換えられている、タンパク質が含まれる。しかし、そうした置換は保存的であってもよく、すなわち、アミノ酸残基が化学的に類似したアミノ酸残基で置き換えられる。保存的置換の例は次のグループのメンバー間の置換である：1)アラニン、セリン、およびトレオニン；2)アスパラギン酸およびグルタミン酸；3)アスパラギンおよびグルタミン；4)アルギニンおよびリシン；5)イソロイシン、ロイシン、メチオニン、およびバリン；および6)フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン。

本明細書で使用される用語「ヒト好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン」または「hNGAL」または「リポカリン2」または「Lcn2」は、SWISS-PROT/UniProtデータバンクアクセッション番号P80188を有する成熟ヒトNGALまたはSEQ ID NO:4に示される成熟ヒトNGALを指す。このタンパク質の成熟型は、アミノ酸1〜20のシグナルペプチドが切断されるので、アミノ酸21〜198の完全な配列を有する。このタンパク質はさらに、成熟タンパク質の位置76および175のアミノ酸残基間に形成されたジスルフィド結合を有する。

鉄代謝は、鉄のホメオスタシスを維持する一連の化学反応である。人体では、鉄は事実上すべての細胞に存在して、多数の生体機能に関与しており、例えば、ヘモグロビンの形で肺から組織への酸素の運搬体として、シトクロムの形で細胞内の電子の輸送媒体として、および/またはさまざまな組織における酵素反応の欠くことのできない部分として機能することができる。そのため、鉄の調節はヒトの健康の多くの側面の重要な部分である。鉄代謝の乱れは、さまざまな疾患、例えば貧血を引き起こすことがある。

ヘプシジンは、鉄ホメオスタシスの中心的な負の調節因子である。ヘプシジンの産生は鉄負荷および炎症とともに増加し、低鉄状態および低酸素状態の下で減少する。ヘプシジンは、哺乳動物細胞の唯一の既知の鉄輸送体であるフェロポーチンへの結合を介して機能し、その内在化と分解を誘導する。フェロポーチンは十二指腸の腸細胞、脾臓、および肝臓で発現されるので、ヘプシジンの増加と、その後のフェロポーチンの減少は、十二指腸での鉄吸収の抑制、マクロファージからのリサイクル鉄の放出、および肝臓での貯蔵鉄の動員をもたらす。ヘプシジンは、炎症性疾患に伴う貧血の発症に極めて重要な役割を果たすと考えられている。急性または慢性の炎症状態は、ヘプシジン発現のアップレギュレーションをもたらして、鉄の欠乏につながり、これは炎症性疾患に伴う貧血(ACD)、癌に伴う貧血(AC、CIA)および慢性腎疾患(CKD)に伴う貧血(CKDの貧血)を引き起こす可能性がある。

用語「ヘプシジン」は、肝臓発現抗菌ペプチド1または推定肝腫瘍リグレッサー(putative liver tumor regressor)とも呼ばれるタンパク質を指し、そのヒト型はUniProtKB/Swiss-Protアクセッション番号P81172を有する。一般的に、用語「ヘプシジン」は、脊椎動物種、例えば哺乳動物、しかし好ましくは霊長類(例えば、カニクイザルまたはヒト)に存在することが知られているヘプシジンタンパク質の任意の形態を意味する。プロセッシングされていないヒトタンパク質は84アミノ酸の長さを有し、「HEPC」または「LEAP1」の別名でも知られる遺伝子「HAMP」によってコードされる。これは2つの鎖に切断され、これらもまた、本明細書では用語「ヒトヘプシジン」に含まれる。これら2つの鎖は、それぞれ、ヘプシジン-25(Hepc25)であるアミノ酸60〜84、およびヘプシジン-20(Hepc20)であるアミノ酸65〜84の鎖である。ヘプシジン-25は、4つのジスルフィド結合によって安定化された、曲がったヘアピンの形に配置されている。天然の変異体は、これも用語「ヒトヘプシジン」に含まれるが、例えば、アミノ酸置換59 R→G (VAR 0425129)；アミノ酸置換70 C→R (VAR 042513)；アミノ酸置換71 G→D (VAR 026648)またはアミノ酸置換78 C→Y (VAR 042514)を有する。さらなる天然の変異体は、ヘプシジン-25の別のN末端切断型アイソフォーム(ヘプシジン-20以外)である、ヘプシジン-22である。

本明細書で使用される用語「成熟ヘプシジン」は、哺乳類などの脊椎動物において発現されるヘプシジンタンパク質の任意の成熟した生物活性型を指す。用語「ヒトヘプシジン」は、ヒトに存在するヘプシジンタンパク質の任意の型を指す。表現「ヘプシジン-25」は、SEQ ID NO:5に示されるアミノ酸配列を有するヒトヘプシジンの成熟型を指す。いくつかの態様では、本開示の1つまたは複数のリポカリンムテインは、それぞれのヘプシジン分子が生物学的/生理学的活性を示すかどうかに関係なく、そのタンパク質分解断片を含めて、ヒトヘプシジンのそれぞれの所与の型と結合することができる。したがって、ヘプシジン分子は、測定可能な生理学的関連性を有することなく、生物学的サンプル中に存在するだけでよい。例えば、ヘプシジン-22は、これまでのところ、尿中に見出されて尿中で検出されただけであり、今のところ単にヘプシジン-25の尿分解産物であると想定されている(Kemna et al., Haematologica. 2008 Jan; 93:(1)90-97にレビュー)。本開示のリポカリンムテインは、当然のことながら、成熟した生物活性ヘプシジン-25などの生理活性種と結合することもできる。したがって、本開示のリポカリンムテインは、認識されるように選ばれたヒトヘプシジンの型に応じて、さまざまな薬学的用途に使用することができる。

したがって、本開示に係るリポカリンムテインは、ヘプシジン受容体であるフェロポーチンとの相互作用をブロックすることによって、血液などの体液中の鉄レベルを増加させるために使用することができる。その結果、フェロポーチンの内在化と分解が防止される。リポカリンムテインは、それにより、貯蔵鉄の動員および改善された鉄の腸内吸収を可能にすることによって、赤血球生成を支持する。したがって本開示の適用を必要とする対象の例は、アップレギュレートされたヘプシジンが原因で、ヘモグロビン合成のための鉄のアベイラビリティが減少することによって引き起こされると考えられる、赤血球生成刺激因子製剤(ESA)療法に対して低応答性の対象(患者の約40〜50％)である。本開示に係るリポカリンムテインはまた、対象、例えばヒトにおける網状赤血球数、赤血球数、ヘモグロビン、および/またはヘマトクリットを増加させるために使用することができる。本開示のリポカリンムテインを含有する薬学的組成物は、これに関連して使用され得る。

本開示の別の局面は、血液などの体液中の鉄レベルの減少に関連する疾患または障害を患う対象の治療方法に関し、この方法は、本開示のリポカリンムテインまたは本開示のリポカリンムテインを含有する薬学的組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。それぞれの疾患または障害には、鉄の欠乏または過剰を引き起こす遺伝的または非遺伝的疾患/障害が含まれる。疾患状態または障害は、例えば細菌、真菌、酵母またはウイルスが関与する感染性疾患を含み得る。上で説明したように、いくつかの態様では、疾患または障害は、感染、炎症、慢性疾患、および/または癌に起因する貧血を含むが、これらに限定されない、貧血である。それは、いくつかの態様では、炎症性疾患、例えば関節炎および特定のタイプの癌、肝臓疾患または血液疾患を含み得る。いくつかの態様では、鉄レベルの減少に関連する疾患は、貧血または慢性腎疾患または慢性腎疾患に伴う貧血である。

本開示の1つまたは複数のリポカリンムテインは、例えば、鉄レベルの減少、鉄ホメオスタシスの障害、貧血、または鉄レベルの減少を伴う炎症状態を有する対象を治療するために使用することもできる。対象は、例えば、以下の疾患を患うヒトなどの哺乳動物であり得る：アフリカ型鉄過剰症、αサラセミア、アルツハイマー病、貧血、癌に伴う貧血、慢性疾患に伴う貧血、炎症に伴う貧血、動脈硬化症もしくはアテローム性動脈硬化症(冠動脈疾患、脳血管疾患または末梢閉塞性動脈疾患を含む)、運動失調症、鉄に関連した運動失調症、無トランスフェリン血症、癌、セルロプラスミン欠損症、化学療法誘発性貧血、末期腎不全または慢性腎不全を含む慢性腎疾患/腎臓病(特に慢性腎臓病に伴う貧血)、肝硬変、古典的ヘモクロマトーシス、コラーゲン誘導関節炎(CIA)、ヘプシジン過剰(上昇したヘプシジン)を伴う症状、先天性赤血球異形成貧血、うっ血性心不全、クローン病、糖尿病、鉄生体内分布障害、鉄ホメオスタシス障害、鉄代謝障害、フェロポーチン病、フェロポーチン変異ヘモクロマトーシス、葉酸欠乏、フリードライヒ運動失調症、索状脊髄症、薄束症候群、ピロリ菌(H. pyelori)感染などの細菌感染症、ハレルフォルデン・スパッツ(Hallervordan Spatz)病、ヘモクロマトーシス、トランスフェリン受容体2の変異に起因するヘモクロマトーシス、異常ヘモグロビン症、肝炎、肝炎(Brock)、C型肝炎、肝細胞癌、遺伝性ヘモクロマトーシス、HIVなどのウイルス感染症、ハンチントン病、高フェリチン血症、低色素性小球性貧血、低鉄血症、インスリン抵抗性、鉄欠乏性貧血、鉄欠乏障害、鉄過剰障害、ヘプシジン過剰による鉄欠乏状態、若年性ヘモクロマトーシス(HFE2)、多発性硬化症、鉄代謝に関与する遺伝子の変異、例えば、トランスフェリン受容体2、HFE、ヘモジュベリンまたはフェロポーチンなどのそれに関与するタンパク質を発現する遺伝子の変異、新生児ヘモクロマトーシス、鉄に関連する神経変性疾患、骨減少症、骨粗しょう症、膵炎、パントテン酸キナーゼ関連神経変性症、パーキンソン病、ペラグラ、異食症、ポルフィリン症、晩発性皮膚ポルフィリン症、偽脳炎、肺ヘモジデリン沈着症、赤血球障害、関節リウマチ、敗血症、鉄芽球性貧血、全身性エリテマトーデス、サラセミア、中間型サラセミア、輸血鉄過剰症、腫瘍、血管炎、ビタミンB6欠乏症、ビタミンB12欠乏症、ウィルソン病、または鉄レベルの減少に関連する炎症状態。

説明に役立つさらなる例として、本開示によるリポカリンムテインは、いくつかの態様において、エリスロポエチンと組み合わせて使用することができる。癌(AC)および/または慢性疾患(ACD)を有する患者の貧血は、血清鉄の欠乏、それゆえに赤血球生成の低減をもたらす、ヘプシジンの高濃度(約30nmol/L)に関連している。血清中13nmol/L未満のベースラインヘプシジン濃度を有する対象は、13nmol/L以上の濃度を有する対象よりもエリスロポエチン(EPO)療法に対して良好な応答を示すことが報告されている。したがって、対象における鉄のバイオアベイラビリティを増加させることが可能なリポカリンムテインでこれらの患者を治療することは、エリスロポエチンに対する応答性を向上させることができる。

本開示の適用を必要とする対象は、哺乳動物、ほんの数例を挙げれば、ヒト、イヌ、マウス、ラット、ブタ、カニクイザルのような類人猿などであり得る。用語「対象」は、脊椎動物、例えば哺乳動物、特にヒトを指し、その場合には、用語「患者」も使用され得る。いくつかの態様では、対象は、血清中の鉄の生物活性、網状赤血球数、赤血球数、ヘモグロビン、および/またはヘマトクリットの増加から恩恵を受ける障害を有する。

本開示の方法で対象に投与することができる薬学的組成物の量は、対象において満足のいく治療結果(therapeutic readout)を生じさせるのに十分であるべきである。本明細書で使用される「満足のいく治療結果」は、以下のいずれか1つまたは複数であり得る：(i)対象における血清鉄レベルを有意に増加させる、(ii)ヘプシジンのその受容体への結合に拮抗し、かつ対象における細胞のフェロポーチン(FPN)の内在化および分解をブロックする、(iii)対象における鉄制限赤血球生成を有意に高める、(iv)対象における血中ヘモグロビンレベルを有意に増加させる、(v)ESAに対する対象の応答性を向上させる、および(vi)対象における必要な輸血の頻度を減少させる。

しかし、対象に投与することができる薬学的組成物の定量的な量は、広い範囲および頻度に及ぶことが可能である。例えば、投与される薬学的組成物の量は、4週間ごとに1mg/kgほどに低くてもよいし、1日おきに40mg/kgほどに高くてもよい。好ましくは、1回分の量は、対象において少なくとも0.1mg/kg、少なくとも1mg/kg、少なくとも5mg/kg、少なくとも10mg/kg、少なくとも20mg/kg、少なくとも40mg/kgからなる群より選択され、一方、投与頻度は、4週間ごと、隔週、毎週、週2回、隔日または毎日からなる群より選択された期間より多い頻度でもよい。

本開示はまた、開示した方法において、少なくとも1種の本開示のリポカリンムテインまたはその融合タンパク質もしくはコンジュゲートと、任意で薬学的に許容される賦形剤を含む、薬学的組成物を用いることに関する。

開示した方法では、薬学的組成物は、さまざまな方法で、例えばタンパク質性薬剤にとって治療上有効な非経口または経口(経腸)の経路を介して、対象に投与する/服用させることができる。非経口適用方法には、例えば、注射液、輸液またはチンキ剤の剤形での、例えば皮内、皮下、筋肉内、または静脈内注射および注入技術が含まれる。投与が静脈内注入を介する場合、薬学的組成物は、15分まで、30分まで、1時間まで、2時間まで、および3時間までからなる群より選択された時間にわたって投与することができる。

したがって、本開示の1種または複数種のリポカリンムテインは、薬学的に許容される成分ならびに確立された調製方法を用いて、組成物に製剤化することができる(Gennaro and Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Ed., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA)。薬学的組成物を調製するために、薬学的に不活性な無機または有機賦形剤を使用することができる。

さまざまな好ましい態様では、前記1種または複数種のリポカリンムテインを含有する製剤は、高度に濃縮された安定な薬学的製剤とすることができ、以下が含まれる：約50〜350mg/mlのリポカリンムテイン；pH5.5〜8を提供する、約1〜100mMの緩衝剤；約1〜500mMの安定剤または2種以上の安定剤の混合物(例えば、NaCl₂、スクロース、ソルビトール、またはメチオニン)；約0.01〜0.08％の非イオン性界面活性剤；および有効量の少なくとも1種のヒアルロニダーゼ酵素。

いくつかの文献および文書が本明細書の本文を通して引用されている。本明細書に引用された文書(すべての特許、特許出願、科学刊行物、SWISS-PROTデータバンクアクセッション番号、Swiss-Prot ID、UniProt IDなどを含む)の各々は、前出または後出を問わず、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。本明細書中の何ものも、事前開示という理由でそのような開示に先行する権利が本開示にないことを承認するものとして、解釈されるべきでない。

以下の非限定的な実施例および図面は、本開示のさまざまな局面をさらに説明するものである。

実施例1：マウス、ラット、およびカニクイザルにおけるPEG化抗ヘプシジンリポカリンムテインの薬物動態(PK)パラメータの測定
PEG12、PEG20、PEG30またはPEG40に連結させた、SEQ ID NO:1の配列を有するhNGALムテインの主な薬物動態(PK)パラメータは、マウス、ラットおよびカニクイザル(Macacca fascicularis)に10mg/kgの用量でi.v.単回ボーラス投与した後に、サンプリング時点あたり3匹の動物を用いて測定した。所定の時点に採取した血液サンプルから血漿を調製し、総リポカリンムテインの濃度をサンドイッチELISAにより測定したが、その際、捕獲ステップとしてアフィニティ精製hNGAL特異的ウサギ抗体調製物(Pieris社, PL854)、および結合したコンジュゲートの検出のためにビオチン化アフィニティ精製hNGAL特異的ウサギ抗体調製物(Pieris社, PL1047)を使用した。薬物動態学的計算は、薬物動態ソフトウェアパッケージWinNonlin Professional 5.2 (Pharsight社, USA; 2007)を用いて行った。4種の試験物質についての平均血漿レベル(算術平均)対時間プロファイルは、片対数プロットで示される(図1a、図1b、および図1c)。10mg/kgのi.v.投与後にマウス、ラット、およびカニクイザルにおいて4種の試験物質について2コンパートメント解析により算出された主な薬物動態パラメータの要約は、図1dの表に示される。これらの結果からは、リポカリンムテインのPK特性はPEGの選択を介して調整することができ、3種の試験物質からの分布容積およびクリアランスなどのPKパラメータは、アロメトリック・スケーリングによってヒト半減期を予測するために使用され得ることが実証される。

実施例2：ヒトPKパラメータ
実施例1からの単回投与PK試験で測定された、SEQ ID NO:1の配列を有するリポカリンムテインの各PEG化型についてのマウス、ラットおよびカニクイザルでの分布容積V_DおよびクリアランスC_Lの実験的に測定された値は、アロメトリック・スケーリングによってヒトPKパラメータを予測するために使用された。分布容積V_DまたはクリアランスC_Lは、両対数目盛で、試験に用いた動物の体重に対してプロットして、線形回帰により適合させた。線形回帰は、PEG化リポカリンムテインのヒト分布容積V_DおよびクリアランスC_Lの値を推定するために使用された。また、消失速度定数およびヒト半減期は、k_el = C_L/V_Dおよびt_1/2 = In2/k_elとして算出することができる。図2cに示すように、推定されるヒト半減期は、リポカリンムテインの各種PEG化型について、それぞれ約5.6、17、50、および298時間の範囲である。

実施例3：溶液中のPEG化抗ヘプシジンリポカリンムテインの結合親和性の測定
特定部位のPEG化を達成するために、SEQ ID NO:2の配列を有するhNGALムテインの位置87のセリンを、部位特異的変異誘発(Quick-change変異誘発キット, Stratagene社)によって、もともとhNGAL野生型に存在するシステインに復帰変異させた。アミノ酸位置87に遊離のシステイン残基を有する、得られたhNGALムテイン(SEQ ID NO:1)は、直鎖状(例えば、PEG12、PEG20、PEG30)または分岐状(PEG40)PEGマレイミドでPEG化するために使用した。PEG化反応に先立って、遊離のシステイン残基を、リポカリンムテインとTCEPの1：1モル比において室温で3時間還元した。その後、該タンパク質を＞2モル過剰のPEG-マレイミド試薬と室温で1.5時間混合することによってPEG化を実施した。

SEQ ID NO:2の配列を有するhNGALムテインの結合親和性は、溶液競合電気化学発光(ECL)アッセイで、PEG12、PEG20、PEG30、またはPEG40に連結させたSEQ ID NO:1の配列を有するhNGALムテインの結合親和性と比較した。規定モル濃度のC末端ビオチン基含有ヘプシジン-25(25pM、ヘプシジン-25-C-bio)を、各種濃度のリポカリンムテインと室温で30分間インキュベートした。次いで、この溶液を、本明細書に記載した(かつWO2008/097461に開示される)ヒトヘプシジン特異的モノクローナル抗体12B9をコーティングしたECLプレートに移して、溶液中に残存する遊離のヘプシジン-25-C-bioの濃度を測定した。12B9に結合したヘプシジン-25-C-bioは、メソスケールのECLプラットフォーム上でストレプトアビジンスルホタグ(sulfotag)検出試薬を用いて検出し、ヘプシジン-25-C-bio標準曲線から濃度を決定した。25pMという極めて低濃度のヘプシジン-25が使用されたように、この溶液結合アッセイは低いpM範囲で親和性を区別するのに十分な高感度であった。このアッセイは、例えば、あるリポカリンムテイン(SEQ ID NO:2)の結合親和性を別のリポカリンムテイン(SEQ ID NO:3)の結合親和性から区別することができた。さらにそれは、リポカリンムテインのみならず、長さの異なるPEG鎖を有するコンジュゲートの異なる高親和性の直接比較を可能にした。このアッセイは数回実施され、平均IC50値と標準偏差が図3に報告される。これらの結果から、SEQ ID NO:1の配列を有するリポカリンムテインは、該リポカリンムテインの結合親和性に実質的に影響を及ぼすことなく、遊離のシステインを介して異なるサイズのPEGとコンジュゲートさせ得ることが実証される。

実施例4：カニクイザルにおける抗ヘプシジンリポカリンムテインのヘプシジンフリーPEGコンジュゲートの測定
ヘプシジンフリーのコンジュゲート(PEG30に連結されたSEQ ID NO:１の配列を有するリポカリンムテイン)の血漿濃度は、3匹のカニクイザル(Macacca fascicularis)に10mg/kgの用量でi.v.単回ボーラス投与した後で測定した。所定の時点に採取した血液サンプルから血漿を調製し、ヘプシジンフリーのコンジュゲートの濃度をサンドイッチELISAにより測定し、その際、捕獲ステップとしてストレプトアビジンを介して固定させたヘプシジン-25-C-bioと、結合したコンジュゲートの検出のためにポリクローナルウサギhNGAL特異的抗体調製物(Pieris社, PL713)を使用した。また、総コンジュゲートの濃度をサンドイッチELISAにより測定した、その際、捕獲ステップとしてアフィニティ精製hNGAL特異的ウサギ抗体調製物(Pieris社, PL854)と、結合したコンジュゲートの検出のためにビオチン化アフィニティ精製hNGAL特異的ウサギ抗体調製物(Pieris社, PL1047)を使用した。各動物における総コンジュゲートおよびヘプシジンフリーのコンジュゲートの異なる時点で測定された血漿濃度は、片対数プロットで示される(図5a、左下)。総コンジュゲートおよび遊離のリポカリンムテイン-PEG30コンジュゲートの濃度プロファイルを比較すると、標的結合はヘプシジンフリーのコンジュゲートのクリアランスに大きく関係していることが示される。これらのデータはまた、遊離のリポカリンムテイン-PEG30コンジュゲートの飽和速度に基づいてヘプシジン産生速度を予測するために使用することができ、かつ前臨床および臨床背景での反復投与試験用の投与量および投与計画を選択するための合理的根拠を提供することができる。

実施例5：PK/PDモデル
ヘプシジンと、SEQ ID NO:1のhNGALムテインをそれぞれPEG12、PEG20、PEG30、またはPEG40に連結させたPEGコンジュゲートとの相互作用のためのPK/PDモデルは、Xiaoら(Pharmacokinetics of Anti-hepcidin Monoclonal Antibody Ab 12B9m and Hepcidin in Cynomolgus Monkeys, AAPS J 2010, 12(4):646-57)により記載されたモデルに基づいて開発された。このモデルは、コンジュゲートについての2コンパートメント薬物動態モデル、内因性ヘプシジンのための代謝回転モデル、およびコンジュゲートとヘプシジンの間の相互作用のための可逆的結合モデルで構成されていた。このモデルの構造は図4に示されている。Xiaoらによる刊行物からの薬力学的パラメータを、ヘプシジンの代謝回転速度をモデル化するために使用した。表面プラズモン共鳴により測定されたコンジュゲートとカニクイザルヘプシジン25との相互作用の結合定数：Kon 3.74 106 M-1s-1、Koff 2.45 10-4 s-1、Kd 0.066nMをモデルへの追加入力として使用した。確立されたPK/PDモデルは、非線形回帰分析を用いて、カニクイザルにおける実験的総コンジュゲート濃度に適合させた。遊離ムテインの場合と同じ一次消失速度定数を用いてコンジュゲート-ヘプシジン複合体のための排出経路を含めた後、このモデルは、図5aに示すように、観察されたデータを十分に説明することができる。Kout,hの推定値および測定ヘプシジンベースラインを一定に保つことによって、開発されたモデリング手法は4種すべてのPEGコンジュゲートの濃度-時間プロファイルを説明することができる。各モデル導出パラメータは図5bに示される。ヘプシジンの分布容積に利用可能なデータがなかったので、このモデルは(Xiaoらと同様に)ムテインのVcと同一であると仮定した。

実施例6：PK/PDシミュレーション
確立されたPK/PDモデルおよび4種のコンジュゲート(PEG12、PEG20、PEG30、またはPEG40にそれぞれ連結されたSEQ ID NO:1のhNGALムテインを有する)のそれぞれのモデル導出パラメータに基づいて、遊離ヘプシジンおよびヘプシジン複合体後の時間経過を調べるために、これらの成分の両方の分布容積は遊離のコンジュゲートの分布容積と同一であると仮定して、シミュレーションを実施した。カニクイザルに各コンジュゲートを10mg/kgで投与した後の総(結合および未結合)コンジュゲート(赤)、ヘプシジン-コンジュゲート複合体(青)、遊離コンジュゲート(緑)、および遊離ヘプシジン(赤)の濃度-時間プロファイル(nMol)をシミュレートして、図5および図6に示した。単回投与シミュレーションは、遊離ヘプシジン濃度がヘプシジンを結合するために利用可能なコンジュゲートの絶対量によって決定されること、および遊離コンジュゲートの消失が、コンジュゲート、特により長い終末相半減期を有するコンジュゲートの消失速度定数ではなく、ヘプシジン合成速度(kin,h)によって主に駆動されること、を明確に示している。PEG30コンジュゲートとPEG40コンジュゲートのプロファイルの比較からは、PEG40コンジュゲートの低下したクリアランス、それゆえにより長い半減期は、単にヘプシジン-コンジュゲート複合体の循環を長引かせて、その蓄積を増加させるが、例えば1nMより下方への、ヘプシジン抑制の期間を引き延ばすことはないことが明らかである。このモデルはさらに、図7に示すように、1nMの閾値より低い血清ヘプシジンの恒常的な抑制がPEG30およびPEG40コンジュゲートの両方を反復投与した際に達成され得ることを予測した。とは言うものの、PEG40コンジュゲートの反復投与は、PEG30コンジュゲートと比較して、定常状態でおよそ5倍高いコンジュゲート/ヘプシジン複合体の蓄積につながる。

実施例7：リポカリンムテインのPEG12、PEG20、PEG30、およびPEG40コンジュゲートの単回i.v.用量の投与後のカニクイザルにおける血清鉄濃度の測定
血清鉄濃度は、SEQ ID NO:1のリポカリンムテインのPEG12、PEG20、PEG30、またはPEG40コンジュゲートを10mg/kgの用量でi.v.単回ボーラス投与した後にカニクイザルにおいて測定した(コンジュゲートにつきn＝3匹の動物)。3匹の動物からの平均血清鉄レベル対時間プロファイルを図8に示す。

結果は、ヘプシジン特異的リポカリンムテインのPEGコンジュゲートの単回投与が、正常な(非貧血)カニクイザルの血液中の鉄の血清濃度(バイオアベイラビリティ)を長期間にわたって大幅に高めることができることを実証した。結果はさらに、リポカリンムテインが、ヘプシジンにより誘発されるフェロポーチンの内在化および分解を防止することにより、インビボでのヘプシジンの機能活性に拮抗し、それによって、組織貯蔵鉄からの鉄の動員(細胞輸送)を増強することを示唆した。同様の応答がPEG20、PEG30、およびPEG40コンジュゲートで見られたが、PEG12コンジュゲートはより低いピーク血清鉄レベルおよびベースラインより上昇した血清レベルのより短い持続時間をもたらした。

実施例8：異なるモル濃度でのシムジア(Cimzia)の粘度に対するリポカリンムテインのPEG20、PEG30、およびPEG40コンジュゲートの粘度の測定
図9に示すように、コンジュゲートは、製剤(pH、緩衝系または賦形剤)の最適化なしにスピンカラムで段階的に濃縮したが、200mg/mlでの臨床使用のためにすでに製剤化されているシムジア(セルトリズマブペゴール、UCB社)は、リン酸緩衝生理食塩水で希釈した。タンパク質凝集(＜2％の二量体または凝集体)の非存在は、非希釈サンプルのHP-SECによって確認した。粘度は、100μlのサンプルおよび10〜200μl/分の流量のRheoSense m-VROC粘度計(RheoSense社)を用いて測定した。平均粘度値は2〜3分析ランから算出した。25G 1/2インチのシンウォール(thin wall)注射針での皮下注射用に200mg/ml溶液として製剤化された40kDa PEG化Fabフラグメントであるシムジアの、観察された粘度に基づいて、皮下注射用の25G 1/2インチのシンウォール注射針の使用を可能にする粘度/注射針通過(syringeability)閾値として、80mPa・sが規定された。結果は、SEQ ID NO:1の配列を有するヘプシジン特異的ムテインのPEG化型が150mg/ml以上に容易に濃縮され得ることを実証している。リポカリンムテインのPEGコンジュゲートの粘度はPEGのサイズとともに増加する。

したがって、より短いPEG部分は、例えば皮下注射のために、依然として注射針通過可能な、より高い濃度の製剤の一役を担うであろう。

実施例9：PEG30に連結させたリポカリンムテインのi.v.用量に依存するカニクイザル(n＝3)の鉄応答の測定
血清鉄濃度は、カニクイザルにおいて、PEG30に連結させたSEQ ID NO:1の配列を有するヘプシジン特異的リポカリンムテインを0.5/1/3/6/10mg/kgの用量でi.v.単回ボーラス投与した(用量レベルにつきn＝3匹の動物)後と、PEG40に連結させたhNGAL(SEQ ID NO:4)を10mg/kgの用量でi.v.単回ボーラス投与した後に測定した。3匹の動物からの平均血清鉄レベル対時間プロファイルを図10に示す。結果は、鉄動員に関しては用量依存性の薬理活性を実証し、かつ1〜3mg/kgが生物学的効果の最低レベルを構成することを示した。

実施例10：PEG30に連結させたリポカリンムテインを高用量レベルで静脈内(i.v.)または皮下(s.c.)に1回投与したときの各カニクイザルにおける鉄応答の測定
血清鉄濃度は、カニクイザルにおいて、各動物にPEG30に連結させたSEQ ID NO:1の配列を有するヘプシジン特異的リポカリンムテインを20/40/80/150mg/kgの用量で30分かけて単回i.v.注入した後と、20mg/kgの用量でs.c.単回ボーラス投与した後に測定した。20mg/mlの標準製剤を両方の投与経路(i.v.およびs.c.)に使用した。スタッガード(staggered)アプローチが採用され、この場合、グループ1の動物には20mg/kgを投与し、続いて6日間の休薬期間を設け、その後80mg/kgを投与したのに対し、グループ2の動物には40mg/kgを投与し、続いて6日間の休薬期間を設け、その後150mg/kgを投与した。各動物からの鉄レベル対時間プロファイルを図11に示す。結果は、図10および図11に示すように、リポカリンムテインを介したヘプシジン阻害により誘導された高鉄血が65μMの最大血清鉄(C_max)を上限としたことを示した。血清鉄のC_maxは、3〜6mg/kgの用量レベルですでに達成され、10〜150mg/kgのより高い用量で増加しなかった。それにもかかわらず、鉄応答は高用量でさえも一過性で可逆的である。さらに、図11の結果は、鉄応答の開始、程度、および持続時間が、少なくとも20mg/kgの飽和用量レベルにおいて、s.c.およびi.v.投与間で同等であることを示した。

実施例11：PEG30に連結させたリポカリンムテインを大量に反復してi.v.またはs.c.投与したときの各カニクイザルにおける鉄応答の測定
総血清鉄濃度は、カニクイザルにおいて、各動物にPEG30に連結させたSEQ ID NO:1の配列を有するヘプシジン特異的ムテインをそれぞれ150mg/kgおよび20mg/kgの用量で反復してi.v.注入(30分)およびs.c.ボーラス投与した後に測定した。20mg/mlの標準製剤を両方の投与経路(i.v.およびs.c.)に使用した。1グループにつき4匹の動物に、実施例10に記載した単回i.v.およびs.c.投与に続いて少なくとも14日間の休薬期間を設けた後、1日おきに5回投与した。5回目の投与後の総血漿鉄プロファイル(平均+/-SD、n＝3、グループにつき1匹の非応答動物を除外した)は、図12に示すように、48時間での剖検時までである。結果は、図11に示した初回投与と比較して、同様の鉄応答が反復投与後に観察されることを示した。この場合も、総血清鉄のC_maxは反復投与後に65μMを上限とした。さらに、耐性機構または対抗制御機構は、リポカリンムテイン媒介ヘプシジン阻害および結果として起こる血漿高鉄血の薬理効果を低減させないようであった。

実施例12：Biacoreを用いたリポカリンムテインの特異性の測定
リポカリンムテインの親和性および結合特異性は、表面プラズモン共鳴を用いた速度論的(kinetic)アッセイで測定した。SEQ ID NO:1の配列を有するヘプシジン特異的リポカリンムテインおよびSEQ ID NO:4の配列を有するhNGALリポカリンは、アミンカップリングキット(GE Healthcare社, BR-1000-50)を用いてCM5センサーチップ(GE Healthcare社, BR-1005-30)上に750〜1100レゾナンスユニット(RU)のレベルに固定化した。残留活性化基はエタノールアミンで飽和させた。リファレンス・チャネルはエタノールアミンに続いてEDC/NHSで処理した(ブランク固定化)。HBS-EP＋緩衝液(GE Healthcare社, BR-1006-69)中のヘプシジン-25(PeptaNova社)、Fe-エンテロバクチン(Genaxxon Bioscience社, S4035.0001)、β-ディフェンシン(Sigma Aldrich社, D9565)、VEGF_8-109(Pieris社, トランケート型VEGF)、およびHSA(Sigma Life sciences社, A1653)の希釈物を、調製したチップ表面にアプライした。次のパラメータを結合アッセイに用いた：接触時間60秒、解離時間600秒、流量30μL/分。すべての測定をBiacore T200装置(GE Healthcare社)で25℃にて実施した。固定化したリポカリンムテインの表面の再生は、2MグアニジンHCl(600秒)および10mMグリシンHCl pH2.0(210秒)のその後の注入と、これに続くランニング緩衝液による過度の洗浄および210秒の安定化期間によって達成された。タンパク質の測定に先立って、コンディショニングの目的のために3つのスタートアップサイクルを実施した。データは、Biacore T200評価ソフトウェア(V 1.0)で評価した。ダブルリファレンス(double reference)を使用した。1：1結合モデルを用いて生データを適合させた。リファレンス・チャネルへの結合は標的のすべてについて検出されなかった。図13aは、リポカリンムテインがピコモル親和性でヘプシジン-25に結合したが、試験した他のアナライトに対して測定可能な親和性を示さなかったことを示している。図13bに示すように、カニクイザルヘプシジン25に対するリポカリンムテインの親和性は、同じアッセイフォーマットで試験したとき、ヘプシジン-25に比べて同一のK_onおよびK_off速度を含み、同一であった。細菌の親鉄剤Fe-エンテロバクチンは、それがリポカリン(リポカリンムテインはそれに由来する)の天然リガンドの1つを構成するので、この分析のために選択された。哺乳動物の抗菌36アミノ酸ペプチドであるβ-ディフェンシンは、配列同一性が24％と非常に低くても、それがヘプシジンとのいくつかの構造的類似性、すなわち3つのジスルフィド結合、逆平行βシートおよびβターンを示すので、この分析のために選択された。HSAおよびVEGFは非関連タンパク質の例として用いられた。リポカリンムテインと比べて全く同じやり方でCM5チップ上に固定化されたhNGALリポカリンは、Fe-エンテロバクチンアナライトの陽性対照として使用された。文献に記載されるように、hNGALリポカリンはナノモル以下の親和性でFe-エンテロバクチンに結合したのに対し、ヘプシジンなどの他のアナライトはどれも結合しなかった。

本発明は、鉄レベルの減少に関連する疾患および/または症状の治療に関係した産業上の用途を有する。本明細書に説明的に記載した本発明は、本明細書に具体的に開示されていない任意の一つまたは複数の要素、一つまたは複数の限定の非存在下で適切に実施することができる。したがって、例えば、用語「含む」、「包含する」、「含有する」などは、拡大してかつ限定なしに解釈されるものとする。さらに、本明細書で用いる用語および表現は、限定の用語としてではなく、説明の用語として使用されており、そのような用語および表現の使用において、示されかつ説明された特徴またはその部分の任意の均等物を除外する意図はなく、さまざまな改変が請求項に記載された本発明の範囲内で可能であることが認識される。したがって、当然のことながら、本発明は好ましい態様および選択的特徴によって具体的に開示されているが、本明細書に具体化され開示された本発明の修飾および変形が当業者によって用いられてもよく、そうした修飾および変形は本発明の範囲内であると考えられる。本発明は、本明細書中に広範かつ一般的に説明されている。本明細書に記載のすべての特許、特許出願、テキストブックおよび論文審査された刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。また、参照により本明細書に組み入れられる参考文献中の用語の定義または使用が、本明細書で提供されるその用語の定義と矛盾するか反対である場合、本明細書で提供されるその用語の定義が適用され、参考文献中のその用語の定義は適用されない。上位概念(generic)の開示の範囲内にある、より狭義の下位概念(speciesおよびsubgeneric)のグループの各々もまた、本発明の一部を形成する。これは、削除された材料が本明細書に具体的に記載されているか否かにかかわらず、上位概念から任意の主題を除去する但し書きまたは否定的限定を含む本発明の包括的記述を含む。また、本発明の特徴または局面がマーカッシュグループで記載されている場合、当業者は、本発明がマーカッシュグループの個々のメンバーまたはメンバーのサブグループに関してもそれによって記載されていることを認識するであろう。本発明のさらなる態様は、以下の特許請求の範囲から明らかになるであろう。

Claims

それを必要とするヒト対象における鉄レベルの変化と関連する障害を治療、改善または予防するための、ヘプシジンへの結合親和性を有するリポカリンムテインまたはその断片を含む薬学的組成物であって、
該リポカリンムテインまたはその断片が、該対象における鉄のバイオアベイラビリティを増加させることができ、
鉄レベルの変化と関連する障害が、貧血、炎症による貧血、慢性炎症性貧血、鉄欠乏性貧血、鉄負荷性貧血、敗血症、遺伝性ヘモクロマトーシス、慢性腎疾患(CKD)に伴う貧血、癌に伴う貧血(AC)、化学療法誘発性貧血(CIA)、またはESA抵抗に関連した貧血であり、
該リポカリンムテインまたはその断片が、SEQ ID NO:1のアミノ酸に対して少なくとも90％の配列同一性を有する、
薬学的組成物。
前記リポカリンムテインが、成熟hNGALの線状ポリペプチド配列の位置36、40、41、49、52、68、70、72、73、77、79、81、96、100、103、106、125、127、132、および134に対応する位置において、SEQ ID NO:1に示されるムテインと同じアミノ酸を有する、請求項１に記載の薬学的組成物。
非経口経路または経口経路を介して投与されるものである、請求項1または2に記載の薬学的組成物。
皮内、皮下、筋肉内、もしくは静脈内注射または注入技術によって投与されるものである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
1日2回まで、1日1回まで、1日おきに1回まで、2日おきに1回まで、週に2回まで、週に1回まで、隔週に1回まで、または月に1回まで投与されるものである、請求項1〜4のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
0.1〜1mg/kg、0.1〜40mg/kg、1〜20mg/kg、1〜10mg/kg、3〜20mg/kg、および1〜3mg/kgからなる群より選択される投与量レベルで、それを必要とする対象に毎回投与されるものである、請求項1〜5のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
前記リポカリンムテインが、SEQ ID NO:6に示される軽鎖可変領域およびSEQ ID NO:7に示される重鎖可変領域を有するヘプシジン特異的モノクローナル抗体へのヘプシジンの結合を阻害することができる、請求項1〜6のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
前記リポカリンムテインが、それぞれSEQ ID NO:6および7に示される軽鎖可変領域および重鎖可変領域を有する抗体と、ヘプシジンへの結合について競合する、請求項1〜7のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
前記リポカリンムテインが、該ムテインの血清中半減期を延長する化合物にコンジュゲートされている、請求項1〜8のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
血清中半減期を延長する前記化合物が、ポリアルキレングリコール分子、ヒドロキシエチルデンプン、タンパク質ドメイン、免疫グロブリンのFc部、免疫グロブリンのCH3ドメイン、免疫グロブリンのCH4ドメイン、アルブミン結合ペプチド、およびアルブミン結合タンパク質からなる群より選択される、請求項9に記載の薬学的組成物。
前記リポカリンムテインが、鉄のバイオアベイラビリティを増加させることができ、および前記リポカリンムテインが、コンジュゲートされたムテインである、請求項9または請求項10に記載の薬学的組成物。
前記リポカリンムテインが、ポリアルキレングリコール分子にコンジュゲートされ、該ポリアルキレングリコールがポリエチレン(PEG)またはその活性化誘導体である、請求項11に記載の薬学的組成物。
ポリエチレン(PEG)が分子量30キロダルトンである、請求項12に記載の薬学的組成物。
a. 約50〜350mg/mlのリポカリンムテイン；
b. 約1〜100mMの、pH5.5〜8を提供する緩衝剤；
c. 約1〜500mMの安定剤または2種以上の安定剤の混合物；
d. 約0.01〜0.08％の非イオン性界面活性剤；および
e. 有効量の少なくとも1種のヒアルロニダーゼ酵素
を含有する、それを必要とする対象における鉄のバイオアベイラビリティを増加させることができる、請求項1〜13のいずれか一項に規定される少なくとも1種のリポカリンムテインの高度に濃縮された安定な薬学的製剤。
それを必要とする対象における鉄のバイオアベイラビリティを増加させることができるリポカリンムテインまたはその断片を用いた治療に適している障害を治療する方法であって、該障害を治療するのに有効な量を該対象に投与する段階を含む方法
で使用するための、請求項14に記載の製剤。
請求項14に記載の製剤を含有する1つまたは複数のバイアルと、該製剤を患者に皮下投与するための注射器具とを含む、キット。
ヘプシジンへの結合親和性を有するリポカリンムテインまたはその断片であって、
該リポカリンムテインまたはその断片が、対象における鉄のバイオアベイラビリティを増加させることができ、
該リポカリンムテインまたはその断片が、SEQ ID NO:1のアミノ酸に対して少なくとも90％の配列同一性を有する、
リポカリンムテインまたはその断片。