JP2018108080A - 褐色脂肪細胞及びその調製方法 - Google Patents
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- C12N2506/1307—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from adult fibroblasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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Abstract
【解決手段】哺乳動物の体細胞に褐色脂肪細胞関連遺伝子又はその発現産物とリプログラミング関連遺伝子又はその発現産物を導入することで、前記体細胞から褐色脂肪細胞を調製する方法であって、前記褐色脂肪細胞関連遺伝子がPRDM16(P)及びC/EBPβ(C)からなる群から選択される少なくとも1種であり、リプログラミング関連遺伝子がMycファミリーの遺伝子、GLISファミリーの遺伝子、Klfファミリーの遺伝子、Octファミリーの遺伝子、Soxファミリーの遺伝子、Lin-28からなる群から選択される少なくとも1種である、褐色脂肪細胞を調製する方法。
【選択図】図1
Description
マウス線維芽細胞→軟骨細胞(SOX9 + Klf4 + c-Myc遺伝子を導入、特許文献1)
マウス線維芽細胞→心筋細胞(GATA4 + Mef2c + Tbx5遺伝子を導入)
マウス線維芽細胞→肝細胞(Hnf4α+(Foxa1またはFoxa2またはFoxa3)
遺伝子を導入)
マウス線維芽細胞→神経幹細胞(Sox2 + FoxG1遺伝子を導入など)、
マウス、ヒト細胞→造血幹細胞
これまで、PRDM16とC/EBPβを筋芽細胞や線維芽細胞に遺伝子導入し、「褐色脂肪細胞様の細胞」に誘導することは知られている(特許文献2および非特許文献5)。しかし、PRDM16とC/EBPβで誘導した細胞は、UCP1の発現レベルが非常に低いなど、褐色脂肪細胞としての性質は不十分にしか有さない。
項1. 哺乳動物の体細胞に褐色脂肪細胞関連遺伝子又はその発現産物とリプログラミング関連遺伝子又はその発現産物を導入することで、前記体細胞から褐色脂肪細胞を調製する方法であって、前記褐色脂肪細胞関連遺伝子がPRDM16(P)及びC/EBPβ(C)からなる群から選択される少なくとも1種であり、リプログラミング関連遺伝子がMycファミリーの遺伝子、GLIS ファミリーの遺伝子、 Klfファミリーの遺伝子、Octファミリーの遺伝子、Soxファミリーの遺伝子、Lin-28からなる群から選択される少なくとも1種である、褐色脂肪細胞を調製する方法。
項2. 前記体細胞が線維芽細胞または白色脂肪細胞である、項1に記載の方法。
項3. 褐色脂肪細胞関連遺伝子又はその発現産物がC/EBPβである、項1又は2に記載の方法。
項4. リプログラミング関連遺伝子又はその発現産物がc-MycまたはL-Mycを含む、項1又は2に記載の方法。
項5. リプログラミング関連遺伝子又はその発現産物がc-Mycを含む、項1又は2に記載の方法。
項6. 体細胞に導入される褐色脂肪細胞関連遺伝子又はその発現産物とリプログラミング関連遺伝子又はその発現産物の組み合わせが、PCM、CM、PCL、CL、PCG、CG、PCML、CML、PCMOct3/4、CMOct3/4、PCMG、CMG、PCLOct3/4、CLOct3/4、PCLG、CLG、PCMLOct3/4、CMLOct3/4、PCMLG、CMLG、PCMOct3/4G、CMOct3/4G、PCLOct3/4G、CLOct3/4G、PCMLOct3/4G、CMLOct3/4G(ここで、Pは「PRDM16」を示し、Cは「C/EBPβ」を示し、Mは「c-Myc」を示し、Lは「L-Myc」を示し、Gは「Glis1」を示す)からなる群から選ばれるいずれかの組み合わせである、項1又は2に記載の方法。
項7. 体細胞に導入される褐色脂肪細胞関連遺伝子又はその発現産物とリプログラミング関連遺伝子又はその発現産物の組み合わせが、PCM、CM、PCL、CL、PCML、CML、PCMOct3/4、CMOct3/4、PCMG、CMG、PCLOct3/4、CLOct3/4、PCLG、CLG、PCMLOct3/4、CMLOct3/4、PCMLG、CMLG、PCMOct3/4G、CMOct3/4G、PCLOct3/4G、CLOct3/4G、PCMLOct3/4G、CMLOct3/4Gからなる群から選ばれるいずれかの組み合わせである、項6に記載の方法。
項8. 体細胞に導入される褐色脂肪細胞関連遺伝子又はその発現産物とリプログラミング関連遺伝子又はその発現産物の組み合わせが、PCM、CM、PCML、CML、PCMG、CMG、PCLG、CLG、PCMLG、CMLGからなる群から選ばれるいずれかの組み合わせである、項6に記載の方法。
項9. 哺乳動物の体細胞に由来し、褐色脂肪細胞関連遺伝子又はその発現産物とリプログラミング関連遺伝子又はその発現産物を有する褐色脂肪細胞であって、前記褐色脂肪細胞関連遺伝子がPRDM16(P)及びC/EBPβ(C)からなる群から選択される少なくとも1種であり、リプログラミング関連遺伝子がMycファミリーの遺伝子、GLIS ファミリーの遺伝子、 Klfファミリーの遺伝子、Octファミリーの遺伝子、Soxファミリーの遺伝子、Lin-28からなる群から選択される少なくとも1種である、褐色脂肪細胞。
項10. 肥満、糖尿病、耐糖能異常、脂質代謝異常、動脈硬化性疾患、高血圧、高尿酸血症、痛風、非アルコール性脂肪性肝疾患、メタボリックシンドロームの予防又は治療剤であって、項1〜8のいずれかに記載の方法により調製された褐色脂肪細胞、または、項9に記載の褐色脂肪細胞を有効成分とする、予防又は治療剤。
項11. 項1〜8のいずれかに記載の方法により調製された褐色脂肪細胞、または、項9に記載の褐色脂肪細胞の肥満、糖尿病、耐糖能異常、脂質代謝異常、動脈硬化性疾患、高血圧、高尿酸血症、痛風、非アルコール性脂肪性肝疾患、メタボリックシンドロームの予防又は治療のための使用。
項12. 項1〜8のいずれかに記載の方法により調製された褐色脂肪細胞、または、項9に記載の褐色脂肪細胞を含む、移植材料。
PCM Lin-28、PM Lin-28、CM Lin-28、PCL Lin-28、PL Lin-28、CL Lin-28、PCK Lin-28、PK Lin-28、CK Lin-28、PCG Lin-28、PG Lin-28、CG Lin-28、PCML Lin-28、PML Lin-28、CML Lin-28、PCMK Lin-28、PMK Lin-28、CMK Lin-28、PCMG Lin-28、PMG Lin-28、CMG Lin-28、PCLK Lin-28、PLK Lin-28、CLK Lin-28、PCLG Lin-28、PLG Lin-28、CLG Lin-28、PCKG Lin-28、PKG Lin-28、CKG Lin-28、PCMLK Lin-28、PMLK Lin-28、CMLK Lin-28、PCMLG Lin-28、PMLG Lin-28、CMLG Lin-28、PCMKG Lin-28、PMKG Lin-28、CMKG Lin-28、PCLKG Lin-28、PLKG Lin-28、CLKG Lin-28、PCMLKG Lin-28、PMLKG Lin-28、CMLKG Lin-28、
PCM Oct3/4、PM Oct3/4、CM Oct3/4、PCL Oct3/4、PL Oct3/4、CL Oct3/4、PCK Oct3/4、PK Oct3/4、CK Oct3/4、PCG Oct3/4、PG Oct3/4、CG Oct3/4、PCML Oct3/4、PML Oct3/4、CML Oct3/4、PCMK Oct3/4、PMK Oct3/4、CMK Oct3/4、PCMG Oct3/4、PMG Oct3/4、CMG Oct3/4、PCLK Oct3/4、PLK Oct3/4、CLK Oct3/4、PCLG Oct3/4、PLG Oct3/4、CLG Oct3/4、PCKG Oct3/4、PKG Oct3/4、CKG Oct3/4、PCMLK Oct3/4、PMLK Oct3/4、CMLK Oct3/4、PCMLG Oct3/4、PMLG Oct3/4、CMLG Oct3/4、PCMKG Oct3/4、PMKG Oct3/4、CMKG Oct3/4、PCLKG Oct3/4、PLKG Oct3/4、CLKG Oct3/4、PCMLKG Oct3/4、PMLKG Oct3/4、CMLKG Oct3/4、
PCM Sox2、PM Sox2、CM Sox2、PCL Sox2、PL Sox2、CL Sox2、PCK Sox2、PK Sox2、CK Sox2、PCG Sox2、PG Sox2、CG Sox2、PCML Sox2、PML Sox2、CML Sox2、PCMK Sox2、PMK Sox2、CMK Sox2、PCMG Sox2、PMG Sox2、CMG Sox2、PCLK Sox2、PLK Sox2、CLK Sox2、PCLG Sox2、PLG Sox2、CLG Sox2、PCKG Sox2、PKG Sox2、CKG Sox2、PCMLK Sox2、PMLK Sox2、CMLK Sox2、PCMLG Sox2、PMLG Sox2、CMLG Sox2、PCMKG Sox2、PMKG Sox2、CMKG Sox2、PCLKG Sox2、PLKG Sox2、CLKG Sox2、PCMLKG Sox2、PMLKG Sox2、CMLKG Sox2、
PCM Lin-28 Oct3/4、PM Lin-28 Oct3/4、CM Lin-28 Oct3/4、PCL Lin-28 Oct3/4、PL Lin-28 Oct3/4、CL Lin-28 Oct3/4、PCK Lin-28 Oct3/4、PK Lin-28 Oct3/4、CK Lin-28 Oct3/4、PCG Lin-28 Oct3/4、PG Lin-28 Oct3/4、CG Lin-28 Oct3/4、PCML Lin-28 Oct3/4、PML Lin-28 Oct3/4、CML Lin-28 Oct3/4、PCMK Lin-28 Oct3/4、PMK Lin-28 Oct3/4、CMK Lin-28 Oct3/4、PCMG Lin-28 Oct3/4、PMG Lin-28 Oct3/4、CMG Lin-28 Oct3/4、PCLK Lin-28 Oct3/4、PLK Lin-28 Oct3/4、CLK Lin-28 Oct3/4、PCLG Lin-28 Oct3/4、PLG Lin-28 Oct3/4、CLG Lin-28 Oct3/4、PCKG Lin-28 Oct3/4、PKG Lin-28 Oct3/4、CKG Lin-28 Oct3/4、PCMLK Lin-28 Oct3/4、PMLK Lin-28 Oct3/4、CMLK Lin-28 Oct3/4、PCMLG Lin-28 Oct3/4、PMLG Lin-28 Oct3/4、CMLG Lin-28 Oct3/4、PCMKG Lin-28 Oct3/4、PMKG Lin-28 Oct3/4、CMKG Lin-28 Oct3/4、PCLKG Lin-28 Oct3/4、PLKG Lin-28 Oct3/4、CLKG Lin-28 Oct3/4、PCMLKG Lin-28 Oct3/4、PMLKG Lin-28 Oct3/4、CMLKG Lin-28 Oct3/4、
PCM Oct3/4 Sox2、PM Oct3/4 Sox2、CM Oct3/4 Sox2、PCL Oct3/4 Sox2、PL Oct3/4 Sox2、CL Oct3/4 Sox2、PCK Oct3/4 Sox2、PK Oct3/4 Sox2、CK Oct3/4 Sox2、PCG Oct3/4 Sox2、PG Oct3/4 Sox2、CG Oct3/4 Sox2、PCML Oct3/4 Sox2、PML Oct3/4 Sox2、CML Oct3/4 Sox2、PCMK Oct3/4 Sox2、PMK Oct3/4 Sox2、CMK Oct3/4 Sox2、PCMG Oct3/4 Sox2、PMG Oct3/4 Sox2、CMG Oct3/4 Sox2、PCLK Oct3/4 Sox2、PLK Oct3/4 Sox2、CLK Oct3/4 Sox2、PCLG Oct3/4 Sox2、PLG Oct3/4 Sox2、CLG Oct3/4 Sox2、PCKG Oct3/4 Sox2、PKG Oct3/4 Sox2、CKG Oct3/4 Sox2、PCMLK Oct3/4 Sox2、PMLK Oct3/4 Sox2、CMLK Oct3/4 Sox2、PCMLG Oct3/4 Sox2、PMLG Oct3/4 Sox2、CMLG Oct3/4 Sox2、PCMKG Oct3/4 Sox2、PMKG Oct3/4 Sox2、CMKG Oct3/4 Sox2、PCLKG Oct3/4 Sox2、PLKG Oct3/4 Sox2、CLKG Oct3/4 Sox2、PCMLKG Oct3/4 Sox2、PMLKG Oct3/4 Sox2、CMLKG Oct3/4 Sox2、
PCM Lin-28 Sox2、PM Lin-28 Sox2、CM Lin-28 Sox2、PCL Lin-28 Sox2、PL Lin-28 Sox2、CL Lin-28 Sox2、PCK Lin-28 Sox2、PK Lin-28 Sox2、CK Lin-28 Sox2、PCG Lin-28 Sox2、PG Lin-28 Sox2、CG Lin-28 Sox2、PCML Lin-28 Sox2、PML Lin-28 Sox2、CML Lin-28 Sox2、PCMK Lin-28 Sox2、PMK Lin-28 Sox2、CMK Lin-28 Sox2、PCMG Lin-28 Sox2、PMG Lin-28 Sox2、CMG Lin-28 Sox2、PCLK Lin-28 Sox2、PLK Lin-28 Sox2、CLK Lin-28 Sox2、PCLG Lin-28 Sox2、PLG Lin-28 Sox2、CLG Lin-28 Sox2、PCKG Lin-28 Sox2、PKG Lin-28 Sox2、CKG Lin-28 Sox2、PCMLK Lin-28 Sox2、PMLK Lin-28 Sox2、CMLK Lin-28 Sox2、PCMLG Lin-28 Sox2、PMLG Lin-28 Sox2、CMLG Lin-28 Sox2、PCMKG Lin-28 Sox2、PMKG Lin-28 Sox2、CMKG Lin-28 Sox2、PCLKG Lin-28 Sox2、PLKG Lin-28 Sox2、CLKG Lin-28 Sox2、PCMLKG Lin-28 Sox2、PMLKG Lin-28 Sox2、CMLKG Lin-28 Sox2、
PCM Lin-28 Oct3/4 Sox2、PM Lin-28 Oct3/4 Sox2、CM Lin-28 Oct3/4 Sox2、PCL Lin-28 Oct3/4 Sox2、PL Lin-28 Oct3/4 Sox2、CL Lin-28 Oct3/4 Sox2、PCK Lin-28 Oct3/4 Sox2、PK Lin-28 Oct3/4 Sox2、CK Lin-28 Oct3/4 Sox2、PCG Lin-28 Oct3/4 Sox2、PG Lin-28 Oct3/4 Sox2、CG Lin-28 Oct3/4 Sox2、PCML Lin-28 Oct3/4 Sox2、PML Lin-28 Oct3/4 Sox2、CML Lin-28 Oct3/4 Sox2、PCMK Lin-28 Oct3/4 Sox2、PMK Lin-28 Oct3/4 Sox2、CMK Lin-28 Oct3/4 Sox2、PCMG Lin-28 Oct3/4 Sox2、PMG Lin-28 Oct3/4 Sox2、CMG Lin-28 Oct3/4 Sox2、PCLK Lin-28 Oct3/4 Sox2、PLK Lin-28 Oct3/4 Sox2、CLK Lin-28 Oct3/4 Sox2、PCLG Lin-28 Oct3/4 Sox2、PLG Lin-28 Oct3/4 Sox2、CLG Lin-28 Oct3/4 Sox2、PCKG Lin-28 Oct3/4 Sox2、PKG Lin-28 Oct3/4 Sox2、CKG Lin-28 Oct3/4 Sox2、PCMLK Lin-28 Oct3/4 Sox2、PMLK Lin-28 Oct3/4 Sox2、CMLK Lin-28 Oct3/4 Sox2、PCMLG Lin-28 Oct3/4 Sox2、PMLG Lin-28 Oct3/4 Sox2、CMLG Lin-28 Oct3/4 Sox2、PCMKG Lin-28 Oct3/4 Sox2、PMKG Lin-28 Oct3/4 Sox2、CMKG Lin-28 Oct3/4 Sox2、PCLKG Lin-28 Oct3/4 Sox2、PLKG Lin-28 Oct3/4 Sox2、CLKG Lin-28 Oct3/4 Sox2、PCMLKG Lin-28 Oct3/4 Sox2、PMLKG Lin-28 Oct3/4 Sox2、CMLKG Lin-28 Oct3/4 Sox2、
PC LIN-28、P LIN-28、C LIN-28、PC OCT3/4、P OCT3/4、C OCT3/4、PC SOX2、P SOX2、C SOX2、PC LIN-28 OCT3/4、P LIN-28 OCT3/4、C LIN-28 OCT3/4、PC LIN-28 SOX2、P LIN-28 SOX2、C LIN-28 SOX2、PC OCT3/4 SOX2、P OCT3/4 SOX2、C OCT3/4SOX2、PC LIN-28 OCT3/4 SOX2、P LIN-28 OCT3/4 SOX2、C LIN-28 OCT3/4 SOX2、
(ここで、Pは「PRDM16」を示し、Cは「C/EBPβ」を示し、Mは「c-Myc」を示し、Lは「L-Myc」を示し、Kは「KLF-4」を示し、Gは「Glis1」を示す)が挙げられる。このうち望ましいのは、PCM、CM、PCL、CL、PCG、CG、PCML、CML、PCMOct3/4、CMOct3/4、PCMG、CMG、PCLOct3/4、CLOct3/4、PCLG、CLG、PCMLOct3/4、CMLOct3/4、PCMLG、CMLG、PCMOct3/4G、CMOct3/4G、PCLOct3/4G、CLOct3/4G、PCMLOct3/4G、CMLOct3/4Gが挙げられる。このうち特に望ましいのはPCM、CM、PCL、CL、PCML、CML、PCMOct3/4、CMOct3/4、PCMG、CMG、PCLOct3/4、CLOct3/4、PCLG、CLG、PCMLOct3/4、CMLOct3/4、PCMLG、CMLG、PCMOct3/4G、CMOct3/4G、PCLOct3/4G、CLOct3/4G、PCMLOct3/4G、CMLOct3/4Gである。このうちさらに望ましいのは、PCM、CM、PCML、CML、PCMG、CMG、PCLG、CLG、PCMLG、CMLGである 。
文献1 Direct Reprogramming of Fibroblasts into Functional Cardiomyocytes
by Defined Factors; Masaki Ieda, Ji-Dong Fu, Paul Delgado-Olguin, Vasanth Vedantham, Yohei Hayashi, Benoit G. Bruneau, and Deepak Srivastava Cell 142: 375-386, 2010.
文献2 Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Thomas Vierbuchen, Austin Ostermeier, Zhiping P. Pang, Yuko Kokubu, Thomas C. Sudhof & Marius Wernig. Nature 463: 1035-1041, 2010
文献3 Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Pang ZP, Yang N, Vierbuchen T, Ostermeier A, Fuentes DR, Yang TQ, Citri A, Sebastiano V, Marro S, Sudhof TC, Wernig M. Nature 476: 220-223, 2011.
文献4 Generation of hyaline cartilaginous tissue from mouse adult dermal fibroblast culture by defined factors Kunihiko Hiramatsu, Satoru Sasagawa, Hidetatsu Outani, Kanako Nakagawa, Hideki Yoshikawa, and Noriyuki Tsumaki, Journal of Clinical Investigation, 121: 640-657, 2011.
文献5 Induction of functional hepatocyte-like cells from mouse fibroblasts by defined factors. Pengyu Huang, Zhiying He, Shuyi Ji, Huawang Sun, Dao Xiang, Changcheng Liu, Yiping Hu, XinWang & Lijian Hui, . Nature 475:386-389, 2011.
文献6 Direct conversion of mouse fibroblasts to hepatocyte-like cells by defined factors. Sayaka Sekiya & Atsushi Suzuki. Nature 475:390-393, 2011.
具体的には、褐色脂肪細胞に変換するための導入遺伝子を発現ベクターに組み込み、対象とする体細胞に発現ベクターを導入し、細胞内で発現させることが好ましい。
レトロウイルスベクタープラスミドpMXs.puroに、C/EBPβ等の種々の遺伝子のcDNAコーディング配列をGene artシステム組み込んだ。パッケージング細胞 Plat GP細胞を、100U/mL Penicillinと100μg/ml Streptomycinを含んだ1% NEAA 10% FBS DMEM(通常培地)に縣濁し、ゼラチンコートした10cm培養ディシュにディシュあたり5×106 個の濃度で播種した(第3日)。24時間培養後、種々の遺伝子を含むpMXsベクターを、種々の組み合わせで、pCMV VSVベクターと伴に、X-tremeGENE 9を用いて以下の比で導入した。すなわち導入遺伝子5μg、pCMV.VSV 2.5μg、Opti-MEM 500μl、X-tremeGENE 9 22.5μlの混和液を10mlの培地入りの10cmディシュに添加した(第2日)。24時間後、抗生剤を含まない通常培地に交換(第-1日)。同日(第1日)に、ヒト正常皮膚線維芽細胞株であるaHDF、またはヒト脂肪由来幹細胞であるADSCを、1.5×104〜2×104 cells/mLで培養ディッシュまたは12 wellプレートに播種した。24時間後(第 0日)、Plat GP培養上清を、ポアの直径が0.45μmのシリンジフィルターを通した後、ポリブレン(最終濃度4μg/mL)と混和した(ウイルス液)。aHDF の培養上清を吸引除去した後、すばやく上記のウイルス液を1mL加え24時間培養した(感染)。コントロール群として、ウイルス感染を行わない細胞も準備した。1日後(第 1日)、培養上清を吸引除去し、褐色脂肪誘導培地TypeI(通常培地に850nM human Insulin、1nM triiodothyronine(T3)、0.5mM 3-isobutyl-1-methylxanthine(IBMX)、100 nM Dexametazone、125nM Indometacin、1μg/ml Rosigritazone(いずれも最終濃度)を加えたもの)を加え2日間培養した。第3日に培地を吸引除去し、褐色脂肪誘導培地TypeII(通常培地に850nM human Insulin、1nM triiodothyronine(T3)、1μg/mL Rosigritazone(いずれも最終濃度)を加えたもの)を加え、その後2日おきに同じ組成の新しい培養液に交換した。第 12-22日に、OilRedO染色、Real-time RT-PCRを行った。レトロウイルスベクターを感染させずに、同じ培養を行った細胞をControlとした。
ヒト正常皮膚線維芽細胞であるaHDFを、12 wellプレートに培養し、図1のように実験した。第14日に各ウェルから培養液を吸引除去し、PBSで1回洗浄を行った後、60%イソプロパノールで固定。OilRedO染色液を加え、37℃で15分間静置した(OilRedO染色液は以下のように作成した。OilRedO粉末0.24gを99.7%イソプロパノール30mLに溶解したのち、20mLの蒸留水を添加。30分間室温放置したのち濾紙を用いて濾過し、OilRedO染色液とした)。60%イソプロパノールで1回洗浄したのち、純水で3回洗浄した。プレートの画像を図2A-Fに示す。プレートの各ウェルには異なる遺伝子の組み合わせが導入されており、どのナンバーのウェルにどの遺伝子の組み合わせが導入されたかは、図3に記載する(図3の下の表中で、No.は図2のNo.と共通でプレートのウェルの番号を指す。また各遺伝子の欄に「1」と記載があるものは、その遺伝子を含むレトロウイルスベクターを感染させたことを、空欄は、その遺伝子を含むレトロウイルスベクターを感染させていないことを表す)。赤く染まっているのは脂質であり、いくつかのウェルでは、小さな多房性の脂肪滴を含む褐色脂肪細胞が認められる。たとえば、図2のNo.36ウェルは、図3のNo. 36に示されるとおり、C/EBPβ、L-Myc、c-Mycの遺伝子を含むレトロウイルスベクターを感染させた細胞であり、多くの褐色脂肪細胞が含まれているのが分かる。
図2と同じ実験において、OilRedOの染色性を半定量するために、2名の評価者がそれぞれ独立に、プレートを実体顕微鏡観察し、OilRedOの染色性を4段階で評価した(OilRedOの染色性が強いものから順に、+++、++、+、−)。その結果を図3の下の表中に示す。図3の下の表中で、各遺伝子の欄に「1」と記載があるものは、その遺伝子を含むレトロウイルスベクターを感染させたことを、空欄は、その遺伝子を含むレトロウイルスベクターを感染させていないことを表す。
ヒト正常皮膚線維芽細胞であるaHDFを、12wellプレートに培養し、図1のように実験した。遺伝子導入12日後、一部のウェルからISOGEN IIにてtotal RNAを回収し、Rever Tra Ace qPCR RT Master Mixを用いてcDNAを合成した。UCP1とβアクチン遺伝子のmRNAレベルを定量する目的で、Real-time PCR Master Mix、Taqman probe、Specific PrimerおよびcDNAを混和し、AB7300 Real-time PCR systemを用いてReal-time RT-PCRを行った。各細胞のβアクチンmRNAレベルに対するUCP1 mRNAレベルの値を計算した。結果を図4に示す。図4の下の表中で、各遺伝子の欄に「1」と記載があるものは、その遺伝子を含むレトロウイルスベクターを感染させたことを、空欄は、その遺伝子を含むレトロウイルスベクターを感染させていないことを表す。グラフの縦軸は、No.64(遺伝子を導入していない細胞)の値を1として計算した相対値であり、バーに書かれた数値も同じである。ND(Not determined)と書かれたものはこの実験では測定していない。PRDM16、C/EBPβ, L-Myc, c-Mycの4つの遺伝子を導入した細胞(No.19)は、controlと比較し、遺伝子レベルにおいて褐色脂肪細胞特異的マーカーであるUncoupling protein-1(UCP-1)のもっとも強力な発現を認めた。また、C/EBPβ、L-Myc、c-Mycの3つの遺伝子を導入した細胞(No. 36)や、C/EBPβ、c-Myc、Glis1の3つの遺伝子を導入した細胞(No. 38)でも極めて高いUCP1の発現を認め、これらの遺伝子があればPRDM16がなくてもヒト線維芽細胞から褐色脂肪細胞へのダイレクト・リプログラミングが効率よく可能であることが分る。
ヒト正常皮膚線維芽細胞であるaHDFを、12wellプレートに培養し、図1のように実験した(図4とは遺伝子を組み合わせを変えて独立に行った実験である)。遺伝子導入12日後、一部のウェルからISOGEN IIにてtotal RNAを回収し、Rever Tra Ace qPCR RT Master Mixを用いてcDNAを合成した。UCP1とβアクチン遺伝子のmRNAレベルを定量する目的で、Real-time PCR Master Mix、Taqman probe、Specific PrimerおよびcDNAを混和し、AB7300 Real-time PCR systemを用いてReal-time RT-PCRを行った。各細胞のβアクチンmRNAレベルに対するUCP1 mRNAレベルの値を計算した。結果を図5に示す。図5の下の表中で、各遺伝子の欄に「+」と記載があるものは、その遺伝子を含むレトロウイルスベクターを感染させたことを、空欄は、その遺伝子を含むレトロウイルスベクターを感染させていないことを表す。グラフの縦軸は、遺伝子を導入していない細胞(一番右のバーに示す)の値を1として計算した相対値である。PRDM16、C/EBPβ, c-Mycの3つの遺伝子を導入した細胞(右から7番目のバー)は、mRNAレベルにおいて褐色脂肪細胞特異的マーカーであるUncoupling protein-1(UCP-1)のもっとも強力な発現を認めた。その発現レベルは、PRDM16とC/EBPβの2つの遺伝子を導入した細胞(左から8番目のバー)で認められるUCP1のmRNAレベルと比較して、100倍以上高いことが分る。
ヒト正常皮膚線維芽細胞 aHDFを、12wellプレートに培養し、図1のように実験した。遺伝子導入から12日後、位相差顕微鏡で観察した(図6左列)。また一部のウェルではミトコンドリアを可視化する目的で、培養液に終濃度200nMになるようにInvitrogen 社製のMito Tracker Red probeを添加し、5%CO2 /95%大気、37℃で15分間静置した後オリンパス社製の蛍光顕微鏡で観察した(図6中央列)。別の一部のウェルでは、図2と同様の方法でOilRedOで染色した(図6右列)。PRDM16、C/EBPβ, c-Mycの3つの遺伝子を導入した群では、多数のミトコンドリアを細胞内に集積した細胞が多数観察された。またこの群ではOilRedO染色により小さな多房性脂肪滴を含む褐色脂肪細胞が確認された。これに比べて、PRDM16、C/EBPβの2つの遺伝子を導入した群では、ミトコンドリア、脂肪滴ともにはるかに少なかった。
ヒト脂肪由来幹細胞(ADSC)を12wellプレートに培養し、図1のように実験した。遺伝子導入から22日後、図2と同様の方法でOilRedO染色を行った。結果を図7に示す。赤く染まっているのは脂質であり、脂肪細胞が誘導されたことを示す。PRDM16、C/EBPβ、cMycの遺伝子を含むレトロウイルスベクターを感染させた細胞では、小さな多房性の脂肪滴を含む褐色脂肪細胞が、数多く認められる(図7左上)。一方GFP(Green fluorescent protein)遺伝子を導入した細胞では、大きな単房性の脂肪滴を含む白色脂肪細胞が認められた(図7右下)。
ヒト脂肪由来幹細胞(ADSC)を12wellプレートに培養し、図1のように実験した。遺伝子導入22日後、UCP1、CIDEA、AdipoQのmRNA発現を定量する目的で、細胞からtotal RNAを回収し、図4と同様にReal-time RT-PCRを行った。その結果を図8に示す。PRDM16、C/EBPβ、c-Mycの3つの遺伝子を導入した群では、PRDM16、C/EBPβ、L-Mycの3つの遺伝子を導入した群や、PRDM16、C/EBPβ、Glis1の3つの遺伝子を導入した群、GFP遺伝子を導入したControl群と比較して、褐色脂肪細胞特異的因子であるUCP1とCIDEAを有意に高発現していた。一方、褐色脂肪細胞と白色脂肪細胞の共通のマーカーである、Adiponectin(AdipoQ)は、PRDM16、C/EBPβ、c-Mycを導入した群およびControl群で有意に高発現していた。
図9−12に、マウスiPSから褐色脂肪細胞を誘導し(iPS-derived BA細胞)、C57BL/6マウスに移植した実験を示す。熱産生、体重増加抑制を認め、また高カロリー食を与えると体重増加抑制と血清脂質異常改善を認めたことから、高カロリー食に伴う肥満と脂質代謝異常をiPS-derived BA細胞が是正できる可能性があることが分る。
マウスiPS-derived BA細胞、またはコントロールとして非誘導細胞を、同系マウスの腹部皮下に図左上のように移植した。iPS-derived BA細胞のグラフトは、OilRed染色陽性の脂肪組織の組織像を呈した(右上)。iPS-derived BA細胞を移植したマウスは、体重増加が有意に抑制され(左下)、体温が有意に上昇していた(右下)。
マウスiPS-derived BA細胞、またはコントロールとして非誘導細胞を、同系マウスの腹部皮下に移植した。各群、2匹のサーモグラフィーのイメージング像を示す。iPS-derived BA細胞のグラフト局所で温度が上昇していた(下)。褐色脂肪細胞への誘導を行わなかった細胞のグラフトは周囲組織と同じ温度であった(上)。
移植後、高カロリー食餌を与えたところiPS-derived BA細胞を移植したマウスのみ体重減少が有意に抑制された。
移植後、高カロリー食餌(QF)を与え、4週間後に血清の脂質を調べたところ、iPS-derived BA(iBA)細胞を移植したマウスのみ高脂血症が進行していなかった。NFは通常食餌を与えたマウスである。
図13−16では、2型糖尿病マウスの体細胞からiPS細胞を作り、そのiPS細胞から褐色脂肪細胞を誘導し(iPS-derived BA細胞)、糖尿病マウスに移植した実験を示す。移植によって随時血糖値低下、体重増加抑制、血清脂質異常改善が認められ、褐色脂肪細胞の移植が糖尿病を制御できることが分る。
2型糖尿病を発症するKK-Ayマウスの体細胞からiPS細胞を作った。得られたiPS細胞は典型的なES細胞様の形態を示し(中央、位相差顕微鏡像)、幹細胞マーカーを発現していた(下:real time RT-PCR、右:免疫蛍光染色)。KK-AyiPS1~4は、KK-Ayの体細胞由来の4つの異なるiPS細胞クローンであり、201B7は正常マウス由来のiPS細胞クローンである。
図13のiPS細胞から褐色脂肪細胞を誘導した(iPS-derived BA細胞)(上)。この細胞をKK-Ayマウスに移植したところ、随時血糖値の上昇が緩やかで(左下)、また尿糖はほとんど検出されなかった(右下)。コントロールとして、移植していないKK-Ayマウス(Non-transplant)と、褐色脂肪細胞への誘導を行わずGFP(green fluorescent protein)遺伝子を導入した細胞を移植したマウス(GFPコントロール)では、糖尿病が進行していた。
iPS由来のBA細胞を移植したKK-Ayマウスは、体重増加が有意に抑制され(上)、血清中のNEFA(左下)と中性脂肪(右下)も低かった。
iPS由来のBA細胞を移植したKK-Ayマウスは、血清中のアディポネクチンが有意に高値であった。摂食量はコントロールマウスと同じであった。
ヒト正常皮膚線維芽細胞およびiPS細胞から誘導した褐色脂肪細胞の性状(図17)
A,ヒト正常皮膚線維芽細胞 aHDFを、12wellプレートに培養し、図1に示す方法で、C/EBPβとc-Mycの2つの遺伝子を導入した群の結果を示す。遺伝子導入から12日後、位相差顕微鏡で観察した(左)。また一部のウェルではミトコンドリアを可視化する目的で、培養液に終濃度200nMになるようにInvitrogen 社製のMito Tracker Red probeを添加し、5%CO2 /95%大気、37℃で15分間静置した後オリンパス社製の蛍光顕微鏡で観察した(中央)。別の一部のウェルでは、図2と同様の方法でOilRedOで染色した(右)。多数のミトコンドリアが細胞内に集積し、また多房性脂肪滴を含む褐色脂肪細胞が、多数認められる。
ヒト正常皮膚線維芽細胞から誘導した褐色脂肪細胞の性状(図18)
A, ヒト正常皮膚線維芽細胞 aHDF、aHDFから図17Aの方法で誘導した褐色脂肪細胞(dBA)、dBAに100 nMのレプチンを添加後24時間培養した細胞(Lep)、およびdBAに1μMのイソプロテレノールを添加後2時間培養した細胞(Iso)からRNAを回収し、UCP1、レプチンレセプターに特異的なプライマー・プローブを用いたreal time RT-PCR解析を行った。各mRNAの発現量を、βアクチンのmRNA発現量で補正した後、aHDFでのmRNA発現量を1として算出した相対的なmRNA発現量を示す。dBAは、aHDFと比べて極めて高いレベルでUCP1とレプチンレセプターのmRNAを発現し、これらの発現はレプチンあるいはイソプロテレノールの刺激でさらに増強することが分かる。
ヒト正常皮膚線維芽細胞から誘導した褐色脂肪細胞の性状(図19)
A, ヒト正常皮膚線維芽細胞 aHDFから、図17Aの方法で褐色脂肪細胞(dBA)を誘導する実験を行い、遺伝子導入後0、3、6、9、12日後の細胞からRNAを採取した。MitoHDに特異的なプライマー・プローブを用いたreal time RT-PCR解析を行った。mRNAの発現量を、βアクチンのmRNA発現量で補正した後、aHDFでのmRNA発現量を1として算出した相対的なmRNA発現量を示す。線維芽細胞からdBAへの誘導にともなって、ミトコンドリアDNAのMT-ND1遺伝子の発現が増強することが分かる。
ヒトiPS細胞から図17Aの方法で褐色脂肪細胞を誘導する。得られた細胞は多房性脂肪滴を含み、UCP1を有意に発現する。また、ヒト白色脂肪細胞から図17Aの方法で褐色脂肪細胞を誘導する。得られた細胞は多房性脂肪滴を含み、UCP1を有意に発現する。
エピゾーマル・ベクターによるヒト正常皮膚線維芽細胞から褐色脂肪細胞へのダイレクト・リプログラミング(図20)
A、エピゾーマル・ベクターとプラスミド・ベクターの構造を示す。図左:エピゾーマル・ベクター。この中のcDNAとして、何も含まないものをpG.oriP9.E、PRDM16を含むものをpG.oriP9.E.P、CEBPbetaを含むものをpG.oriP9.E.C、c-Mycを含むものをpG.oriP9.E.Mと呼ぶ。図右:プラスミド・ベクター。この中のcDNAとして、何も含まないものをpG.4、PRDM16を含むものをpG.P、CEBPbetaを含むものをpG.C、c-Mycを含むものをpG.Mと呼ぶ。CAG prom:CAGプロモーター、polyA:Poly A additional signal,oriP: Epstein-Barr virus (EBV) origin of replication P,EBNA1: EBV nuclear antigen 1。
マウス胎仔線維芽細胞(MEF)から誘導した褐色脂肪細胞(図21)
実施例1と同様に、マウスのPRDM16(P)、C/EBPβ(C)、L-Myc(L)、およびc-Myc(M)遺伝子を有するレトロウイルスベクターを、種々の組み合わせでマウス胎仔線維芽細胞(MEF)に感染させ、その後褐色脂肪誘導培地で培養した。感染後第 20日目に、RNAを回収した。レトロウイルスベクターを感染させずに、同じ培養を行った細胞をControlとした。UCP1遺伝子特異的プライマー・プローブを用いてreal time RT-PCRを行った。UCP1遺伝子mRNAの発現量を、βアクチンのmRNA発現量で補正した後、線維芽細胞でのmRNA発現量を1として算出した相対的なmRNA発現量を示す。PRDM16(P),C/EBPβ(C),L-Myc(L)の3因子を導入したもので最も高くUCP1 mRNAが発現し、褐色脂肪細胞に誘導されたことがわかる。
マウス胎仔線維芽細胞(MEF)から誘導した褐色脂肪細胞の生体内機能(図22)
実施例13の方法で、C57BL/6マウスのMEFにPRDM16(P)、C/EBPβ(C)およびL-Myc(L)遺伝子を導入して、褐色脂肪細胞(dBA)を誘導した。この細胞、またはGFP遺伝子を導入したMEF(GFP-MEF)を、8週齢の同系マウスの皮下に移植した。これらのマウス、および移植しないマウスに、高脂肪食餌(QF)を与えた。コントロールとして、通常食餌(NF)を与えた非移植マウスも準備した。
マウス胎仔線維芽細胞(MEF)から誘導した褐色脂肪細胞の生体内機能(図23)
糖尿病モデルであるAAkyマウスのMEFから、PRDM16(P)、C/EBPβ(C)およびL-Myc(L)遺伝子を用いた実施例13の方法で、褐色脂肪細胞(dBA)を誘導した。この細胞、またはGFP遺伝子を導入したMEF(GFP-MEF)を、6週齢の同系マウスの皮下に移植(10 cm Dish confluentx2/マウス)した。これらのマウス、および移植しないマウスを、通常食餌で飼育した。
Claims (12)
- 哺乳動物の体細胞に褐色脂肪細胞関連遺伝子又はその発現産物とリプログラミング関連遺伝子又はその発現産物を導入することで、前記体細胞から褐色脂肪細胞を調製する方法であって、前記褐色脂肪細胞関連遺伝子がPRDM16(P)及びC/EBPβ(C)からなる群から選択される少なくとも1種であり、リプログラミング関連遺伝子がMycファミリーの遺伝子、GLIS ファミリーの遺伝子、 Klfファミリーの遺伝子、Octファミリーの遺伝子、Soxファミリーの遺伝子、Lin-28からなる群から選択される少なくとも1種である、褐色脂肪細胞を調製する方法。
- 前記体細胞が線維芽細胞または白色脂肪細胞である、請求項1に記載の方法。
- 褐色脂肪細胞関連遺伝子又はその発現産物がC/EBPβである、請求項1又は2に記載の方法。
- リプログラミング関連遺伝子又はその発現産物がc-MycまたはL-Mycを含む、請求項1又は2に記載の方法。
- リプログラミング関連遺伝子又はその発現産物がc-Mycを含む、請求項1又は2に記載の方法。
- 体細胞に導入される褐色脂肪細胞関連遺伝子又はその発現産物とリプログラミング関連遺伝子又はその発現産物の組み合わせが、PCM、CM、PCL、CL、PCG、CG、PCML、CML、PCM Oct3/4、CM Oct3/4、PCMG、CMG、PCL Oct3/4、CL Oct3/4、PCLG、CLG、PCML Oct3/4、CML Oct3/4、PCMLG、CMLG、PCM Oct3/4 G、CM Oct3/4 G、PCL Oct3/4 G、CL Oct3/4 G、PCML Oct3/4 G、CML Oct3/4 G(ここで、Pは「PRDM16」を示し、Cは「C/EBPβ」を示し、Mは「c-Myc」を示し、Lは「L-Myc」を示し、Gは「Glis1」を示す)からなる群から選ばれるいずれかの組み合わせである、請求項1又は2に記載の方法。
- 体細胞に導入される褐色脂肪細胞関連遺伝子又はその発現産物とリプログラミング関連遺伝子又はその発現産物の組み合わせが、PCM、CM、PCL、CL、PCML、CML、PCM Oct3/4、CM Oct3/4、PCMG、CMG、PCL Oct3/4、CL Oct3/4、PCLG、CLG、PCML Oct3/4、CML Oct3/4、PCMLG、CMLG、PCM Oct3/4 G、CM Oct3/4 G、PCL Oct3/4 G、CL Oct3/4 G、PCML Oct3/4 G、CML Oct3/4 Gからなる群から選ばれるいずれかの組み合わせである、請求項6に記載の方法。
- 体細胞に導入される褐色脂肪細胞関連遺伝子又はその発現産物とリプログラミング関連遺伝子又はその発現産物の組み合わせが、PCM、CM、PCML、CML、PCMG、CMG、PCLG、CLG、PCMLG、CMLGからなる群から選ばれるいずれかの組み合わせである、請求項6に記載の方法。
- 哺乳動物の体細胞に由来し、褐色脂肪細胞関連遺伝子又はその発現産物とリプログラミング関連遺伝子又はその発現産物を有する褐色脂肪細胞であって、前記褐色脂肪細胞関連遺伝子がPRDM16(P)及びC/EBPβ(C)からなる群から選択される少なくとも1種であり、リプログラミング関連遺伝子がMycファミリーの遺伝子、GLIS ファミリーの遺伝子、 Klfファミリーの遺伝子、Octファミリーの遺伝子、Soxファミリーの遺伝子、Lin-28からなる群から選択される少なくとも1種である、褐色脂肪細胞。
- 肥満、糖尿病、耐糖能異常、脂質代謝異常、動脈硬化性疾患、高血圧、高尿酸血症、痛風、非アルコール性脂肪性肝疾患、メタボリックシンドロームの予防又は治療剤であって、請求項1〜8のいずれかに記載の方法により調製された褐色脂肪細胞、または、請求項9に記載の褐色脂肪細胞を有効成分とする、予防又は治療剤。
- 請求項1〜8のいずれかに記載の方法により調製された褐色脂肪細胞、または、請求項9に記載の褐色脂肪細胞の肥満、糖尿病、耐糖能異常、脂質代謝異常、動脈硬化性疾患、高血圧、高尿酸血症、痛風、非アルコール性脂肪性肝疾患、メタボリックシンドロームの予防又は治療のための使用。
- 請求項1〜8のいずれかに記載の方法により調製された褐色脂肪細胞、または、請求項9に記載の褐色脂肪細胞を含む、移植材料。
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