WO2021095811A1 - 体細胞の直接分化転換方法 - Google Patents

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康司 岡崎
征仁 松本
裕子 萩原
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    • C12N5/067—Hepatocytes

Definitions

  • the present invention relates to a production method by direct transdifferentiation from a somatic cell to another somatic cell.
  • Somatic cells such as adipocytes, nerve cells, myocardial cells, and hepatocytes are expected to be used as materials for regenerative medicine and as materials for screening diseases involving these cells. Therefore, there is a strong demand for the development of a method for preparing a large amount of these somatic cells in vitro.
  • somatic cells may be referred to as embryonic stem cells (hereinafter, may be referred to as "ES cells”) or induced pluripotent stem cells (hereinafter, "iPS cells”).
  • ES cells embryonic stem cells
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • somatic cells for example, adipocytes are differentiated by culturing fibroblasts, mesenchymal stem cells or progenitor cells of these somatic cells in a medium containing a component involved in transcription factors. Methods of induction have also been reported. However, the differentiation-inducing efficiency of these differentiation-inducing methods is low, and there is a problem in terms of efficiency, and the present situation is that they have not been adopted as a means for mass preparation of somatic cells.
  • GLIS1 GLIS family zinc finger 1
  • GLIS3 GLIS family zinc finger 3
  • the present inventors can directly transform somatic cells into pancreatic secretory cells by introducing the GLIS family gene and Neurogenin3 gene into somatic cells, or by introducing the GLIS family gene, Neurogenin3 gene and Pdx1 gene into somatic cells.
  • transdifferentiation was possible and applied for a patent (Patent Documents 3 and 4).
  • GLIS family genes such as GLIS1 are involved in the direct conversion of somatic cells to other somatic cells other than pancreatic secretory cells alone, without going through stem cells.
  • An object of the present invention is to provide a production method by direct transdifferentiation from a somatic cell to another somatic cell in a short period of time, which is simple and has good reproducibility and excellent production efficiency.
  • the present inventor examined various effects of the GLIS family gene on transdifferentiation of somatic cells alone, and surprisingly, the somatic cells into which the GLIS family genes were introduced were introduced into the somatic cells. It has been found that when cultured in a medium containing a differentiation-inducing component, the efficiency of transdifferentiation of the somatic cell into other somatic cells is dramatically improved. Further, if a somatic cell into which a GLIS family gene and a transcription factor have been introduced is cultured in a medium containing the growth factor of the somatic cell, the transdifferentiation efficiency of the somatic cell into another somatic cell is dramatically improved. And completed the present invention.
  • the present invention provides the following [1] to [14].
  • [1] (a) a step of introducing a GLIS family gene, a transdifferentiated GLIS family gene or a gene product thereof into a somatic cell, and (b) the gene-introduced somatic cell from the somatic cell or a progenitor cell of the somatic cell.
  • a production method by direct transdifferentiation from a somatic cell to another somatic cell which comprises a step of culturing in a medium containing a component for inducing differentiation into somatic cells.
  • [4] The production method according to any one of [1] to [3], wherein the mutant GLIS family gene is a gene encoding a protein in which a part of the amino acid residue on the N-terminal side of the GLIS1 protein is deleted.
  • [5] The production method according to any one of [1] to [4], wherein the mutant GLIS family gene is a gene encoding a protein lacking 100 to 360 amino acid residues on the N-terminal side of the GLIS1 protein.
  • the somatic cell is a fibroblast or a mesenchymal stem cell.
  • Somatic cells are fibroblasts or mesenchymal stem cells, and other somatic cells are cells selected from adipocytes, nerve cells, myocardial cells, hepatocytes, bone cells and blood cells [10]. ] A direct transdifferentiation promoter from the listed somatic cells to other somatic cells. [12] A direct transdifferentiation agent from a somatic cell to another somatic cell, which comprises a GLIS family gene, a mutant GLIS family gene or a gene product thereof, and a component for inducing differentiation from a somatic cell to another somatic cell.
  • a direct transdifferentiation agent from a somatic cell to another somatic cell which comprises a GLIS family gene, a mutant GLIS family gene or a gene product thereof, a transcription factor, and a proliferation factor of another somatic cell.
  • Somatic cells are fibroblasts or mesenchymal stem cells, and other somatic cells are cells selected from adipocytes, nerve cells, myocardial cells, hepatocytes, bone cells and blood cell cells, [13] ] A direct transdifferentiation agent from the listed somatic cells to other somatic cells.
  • somatic cells it is simple, has good reproducibility, has excellent production efficiency, and can transdifferentiate directly from a somatic cell to another somatic cell in a short period of time. Therefore, it is possible to supply somatic cells as a material for regenerative medicine and as a research material for various diseases.
  • K1 # 14 shows the results of culturing in a medium containing a differentiation-inducing component after the introduction of the GLIS1 gene.
  • K2 # 9 (4-OH (-)) shows the result of culturing in a medium containing a differentiation-inducing component after introducing the mutant GLIS1 gene.
  • K2 (Ert) # 9 (4-OH (+)) shows the results of culturing in a medium containing a differentiation-inducing component and an estrogen receptor antagonist after introducing the mutant GLIS1 gene.
  • the green and light blue (bright blue) parts are the stained parts of the oil droplets in the adipocytes stained by Lipi Dye.
  • GFP indicates control.
  • K1 # 14 shows the results of culturing in a medium containing a differentiation-inducing component after the introduction of the GLIS1 gene.
  • K2 # 9 (4-OH (-)) shows the result of culturing in a medium containing a differentiation-inducing component after introducing the mutant GLIS1 gene.
  • K2 (Ert) # 9 (4-OH (+)) shows the results of culturing in a medium containing a differentiation-inducing component and an estrogen receptor antagonist after introducing the mutant GLIS1 gene. It is a figure which shows the induction efficiency to adipocyte after 2 weeks of culture.
  • K1 # 14 shows the results of culturing in a medium containing a differentiation-inducing component after the introduction of the GLIS1 gene.
  • K2 # 9 (4-OH (-)) shows the result of culturing in a medium containing a differentiation-inducing component after introducing the mutant GLIS1 gene.
  • K2 (Ert) # 9 (4-OH (+)) shows the results of culturing in a medium containing a differentiation-inducing component and an estrogen receptor antagonist after introducing the mutant GLIS1 gene. It is a figure which shows the induction efficiency to a nerve cell after 2 weeks of culture. The figure on the left shows the change in the expression level of the nerve cell marker (TUBB3).
  • the figure on the right shows changes in the expression level of the nerve cell differentiation-inducing component (Brn2). It is a figure which shows the induction efficiency to adipocyte after 2 weeks of culture.
  • the figure on the left shows the change in the expression level of the adipocyte marker (FABP4).
  • the figure on the right shows changes in the expression level of the adipocyte differentiation-inducing component (PPAR ⁇ ). It is a figure which shows the induction efficiency to the bone cell after 2 weeks of culture.
  • the figure on the left shows changes in the expression level of early bone cell markers (ALP).
  • the figure on the right shows changes in the expression level of the osteocalcin-inducing component (BGLAP). It is a figure which shows the induction efficiency to the cardiomyocyte after 10 days of culture.
  • the figure on the left shows changes in the expression level of the immature cardiomyocyte marker (Sall1).
  • the figure on the right shows changes in the expression level of cardiomyocyte transcription factor (Tbx5). It is a figure which shows the induction efficiency to the cardiomyocyte after 2 weeks of culture.
  • the figure on the left shows the change in the expression level of the cardiomyocyte marker (cTnT).
  • the figure on the right shows changes in the expression level of cardiomyocyte transcription factor (Tbx5). It is a figure which shows the induction efficiency to hepatocyte after 2 weeks of culture.
  • the figure on the left shows changes in the expression level of hepatocyte markers (MAOA).
  • the figure on the right shows changes in the expression level of hepatocyte transcription factor (GATA4).
  • FIG. 1 It is a figure which shows the induction efficiency to astrocyte after 2 weeks of culture.
  • the figure on the left shows changes in the expression level of the astrocyte marker (GFAP).
  • the figure on the right shows changes in the expression level of astrocyte transcription factor (NFIA).
  • the first aspect of the direct transdifferentiation method from a somatic cell to another somatic cell of the present invention is characterized by comprising the following steps (a) and (b).
  • the GLIS family gene used in the step (a) is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include GLIS1, GLIS2 and GLIS3. These may be used alone or in combination of two or more. Among the GLIS family, GLIS1 and GLIS3 are preferable, and GLIS1 is more preferable, because it is excellent in the effect of improving the efficiency of direct transdifferentiation from somatic cells to other somatic cells.
  • the origin of the GLIS family gene is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include humans and mice.
  • the sequence information of the GLIS family gene can be obtained from a known database.
  • accession numbers are NM_147193 (human GLIS1), NM_147221 (mouse GLIS1), NM_032575 (human GLIS2), NM_031184 (mouse GLIS2). ), NM_152629 (human GLIS3), NM_175459, and NM_172636 (mouse GLIS3).
  • a mutant of the GLIS family gene preferably a mutant of the GLIS1 gene, in which some amino acid residues on the N-terminal side of the GLIS1 protein are deleted.
  • the gene encoding the protein is more preferable, and the gene encoding the protein in which the 100 to 360 amino acid residue on the N-terminal side of the GLIS1 protein is deleted is even more preferable.
  • a gene having 85% or more sequence identity with the base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1 and 2 can be mentioned.
  • the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 is a sequence of a gene encoding a protein in which the N-terminal 360 amino acid residue of the mouse GLIS1 protein is deleted.
  • the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 is a sequence of a gene encoding a protein in which the N-terminal 190 amino acid residue of the human GLIS1 protein is deleted.
  • the sequence identity with the base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1 and 2 is not particularly limited as long as it is 85% or more, and can be appropriately selected depending on the intended purpose, but 90%. The above is preferable, 95% or more is more preferable, 98% or more is further preferable, and 99% or more is particularly preferable.
  • the method for determining sequence identity is not particularly limited, and a known method can be appropriately selected.
  • BLAST Karlin, S. & Altschul, SF (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-2268
  • Karlin, S. & Altschul, SF Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873.
  • the gene product refers to mRNA transcribed from a gene and protein translated from the mRNA.
  • Examples of the gene product used in the present invention include mRNA transcribed from the GLIS family gene, protein translated from the mRNA, mRNA transcribed from the mutant GLIS family gene, and protein translated from the mRNA.
  • the sequence of the GLIS family gene, the mutant GLIS family gene, or a gene product thereof may consist of only a portion of the sequence of each gene that is translated into a protein, or a portion other than the portion that is translated into a protein. It may be an embodiment including a portion.
  • the cell into which the gene or gene product is introduced is a somatic cell.
  • the somatic cell is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • the somatic cell may be an undifferentiated progenitor cell or a final differentiated mature cell.
  • the somatic cells may be derived from ES cells or iPS cells, but mature cells derived from somatic cells or progenitor cells of target somatic cells are preferable.
  • Specific examples of the somatic cells include adipose tissue-derived stromal (stem) cells, mesenchymal stem cells, fibroblasts and the like. Among these, fibroblasts and mesenchymal stem cells are more preferable.
  • the species of the individual from which the somatic cells are collected is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include humans and mice.
  • the individual from which the somatic cells are to be collected is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the purpose. However, when other somatic cells of interest are used for regenerative medicine, from the viewpoint of rejection, the individual may be selected.
  • the individuals themselves or other individuals of the same or substantially the same type of MHC are preferred.
  • the type of MHC is substantially the same as that of MHC to the extent that the transplanted cells can be engrafted when other somatic cells derived from the somatic cells are transplanted into an individual by using an immunosuppressant or the like. It means that the types match.
  • the time of the individual from which the somatic cells are collected is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the purpose.
  • the culture conditions for the somatic cells are not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include a culture temperature of about 37 ° C. and a CO 2 concentration of about 2% to 5%.
  • the medium used for culturing the somatic cells is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. For example, the minimum essential medium containing 5% by mass to 20% by mass of serum (hereinafter, "MEM"). (Sometimes referred to as), Dalveco's modified Eagle's medium (hereinafter, may be referred to as “DMEM”), RPMI1640 medium, 199 medium, F12 medium and the like.
  • the method for introducing each gene or its gene product into somatic cells in step (a) is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • a method using a vector or synthesized mRNA messenger
  • Examples include a method using RNA) and a method using a recombinant protein.
  • the vector is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include a viral vector and a non-viral vector. Specific examples of the virus vector include a retrovirus vector and a lentivirus vector. Specific examples of the non-viral vector include a plasmid vector and an episomal vector.
  • the method for introducing the vector into the somatic cells is not particularly limited, and a known method can be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • the retroviral vector when used, the method described in International Publication No. 2007/69666, Cell, 126,663-676 (2006), Cell, 131,861-872 (2007) and the like should be used.
  • the method for using the lentiviral vector the method described in Science, 318, 1917-1920 (2007) and the like can be used.
  • the method described in Science, 322, 949-953 (2008) and the like can be used, and when the episomal vector is used, the method is Science, 324: 797. -801 (2009), Biochemical and Biophysical Research Communications, 426: 141-147 (2012) and the like can be used.
  • virus particles obtained by using packaging cells may be used.
  • the packaging cell is a cell into which a gene encoding a structural protein of a virus has been introduced, and when a recombinant viral vector in which the target gene is incorporated into the cell is introduced, recombinant virus particles incorporating the target gene are produced. ..
  • the packaging cells are not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. For example, packaging cells based on HEK293 cells derived from human kidneys and NIH3T3 cells derived from mouse fibroblasts, over a long period of time.
  • Platinum-E expressing the viral structural proteins gag-pol and envelope capable of producing high-potency viruses under the control of MoMuLV (Moloney Murine Leukemia Virus) LTR (long tertiary reports).
  • E cells PLAT-A cells designed to express enveloped glycoproteins derived from Amphotropic virus, PLAT-GP cells designed to express enveloped glycoproteins derived from bullous stomatitis virus, etc. Can be mentioned.
  • the method for introducing the viral vector into the packaging cells is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include a lipofection method, an electroporation method and a calcium phosphate method.
  • the method for infecting the somatic cells with the obtained virus particles is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include the polybrene method.
  • the vector may contain a marker gene for confirming the introduction of each of the genes.
  • the marker gene refers to a gene that enables selection and selection of cells by introducing the marker gene into cells.
  • Specific examples of the marker gene include a drug resistance gene, a fluorescent protein gene, a luciferase gene, a color-developing enzyme gene, and the like. These may be used alone or in combination of two or more.
  • Specific examples of the drug resistance gene include neomycin resistance gene, tetracycline resistance gene, kanamycin resistance gene, zeosin resistance gene, hygromycin resistance gene and the like.
  • fluorescent protein gene examples include a green fluorescent protein (GFP) gene, a yellow fluorescent protein (YFP) gene, and a red fluorescent protein (RFP) gene.
  • GFP green fluorescent protein
  • YFP yellow fluorescent protein
  • RFP red fluorescent protein
  • luminescent enzyme gene examples include a luciferase gene and the like.
  • color-developing enzyme gene examples include ⁇ -galactosidase gene, ⁇ -glucuronidase gene, alkaline phosphatase gene and the like.
  • the method for introducing the mRNA into the somatic cell is not particularly limited, and a known method can be appropriately selected and used.
  • the method for introducing the recombinant protein into the somatic cell is not particularly limited, and a known method can be appropriately selected and used.
  • the number of times each gene or its gene product is introduced into a somatic cell is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose, and may be once or twice or more. ..
  • the time for introducing each gene or its gene product into somatic cells is not particularly limited and may be appropriately selected according to the purpose, and even if all of the above genes or their gene products are introduced at the same time. It may be introduced at different times.
  • the amount of each gene or its gene product introduced into somatic cells is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose, and all genes or their gene products may be introduced in equal amounts. Different amounts may be introduced.
  • the gene or its gene product may be a mode in which only the gene is used, a mode in which only the gene product is used, or a mode in which both are used for the same gene or the gene product thereof. Good.
  • the combination of different genes or their gene products is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. For each gene or its gene product, the same gene or a different gene product may be used. You may. In the step of introducing the gene or its gene product, a substance other than the gene or its gene product may be introduced as long as the effect of the present invention is not impaired.
  • Step (b) is a step of culturing the gene-introduced somatic cell in a medium containing a component for inducing differentiation of the somatic cell or a progenitor cell of the somatic cell into another somatic cell (also referred to as a target somatic cell). is there.
  • the combination of the raw material somatic cell and the target somatic cell in the step (b) is not particularly limited, but the raw material somatic cell is preferably the fibroblast or mesenchymal stem cell described above.
  • the mesenchymal stem cells bone marrow-derived stem cells are preferable.
  • target cells include adipocytes, nerve cells, myocardial cells, hepatocytes, osteoocytes and blood cells.
  • leukocytes and erythrocytes are particularly preferable.
  • the component contained in the medium used in step (b) is a component that induces differentiation of the somatic cell or a progenitor cell of the somatic cell into another somatic cell (also referred to as a target somatic cell).
  • a differentiation-inducing component a component known for each target somatic cell can be used.
  • 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), dexamethasone (DEX), insulin and the like are known, and one of them or Two or more types can be used in combination.
  • IBMX 3-isobutyl-1-methylxanthine
  • DEX dexamethasone
  • insulin is particularly preferred.
  • EGF epidermal growth factor
  • FGF-2 fibroblast growth factor-2
  • EGF epidermal growth factor-2
  • FGF-2 fibroblast growth factor-2
  • VEGF, Wnt / ⁇ -catenin inhibitor (IWP2, etc.) and the like are known as components for inducing differentiation of fibroblasts or mesenchymal stem cells into cardiomyocytes, and one or more of these are combined. Can be used. Among these components, it is particularly preferable to use VEGF, Wnt / ⁇ -catenin inhibitor (IWP2, etc.).
  • Oncostatin M (OsM), DEX, hepatocyte growth factor (HGF) and the like are known as components that induce differentiation of fibroblasts or mesenchymal stem cells into hepatocytes, and one or more of these are known. Can be used in combination. Of these components, it is particularly preferable to use OsM, DEX, and HGF.
  • the components that induce differentiation of fibroblasts or mesenchymal stem cells into blood cells vary depending on the target blood cells, but are BMP4, VEGF, FGF1, bFGF, SCF, FIt3-L, TPO, GM-CSF, IL-2. , IL-4, IL-15, G-CSF, IL-3, IL-6, IL-7, TNF- ⁇ , EPO, IGF-II, etc., and one or more of these are known. Can be used in combination.
  • components that induce differentiation of fibroblasts or mesenchymal stem cells into osteoocytes include Runx2, Runx3, Dlx5, ATF4, Osx, Smad1, Wnt, Fgf, Hedgehog, Msx2, Twist, AP-1, Tnc, Ncam1, and Pth1h. Etc., and one or a combination of two or more of these can be used.
  • an estrogen receptor antagonist in the medium as a differentiation-inducing component in terms of improving the direct transdifferentiation efficiency of the present invention.
  • the estrogen receptor antagonist include tamoxifen, fulvestrant, mepitiostane and the like. The addition of this estrogen receptor antagonist is particularly preferred when the transgene is a mutant GLIS1 gene.
  • the content of the differentiation-inducing component in the medium may be any amount known for each component, and is not particularly limited, but 0.001 ⁇ M to 50 ⁇ M, respectively, is preferable in the normal medium.
  • the basal medium to which the differentiation-inducing component can be added is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • the minimum essential medium containing 5% by mass to 20% by mass of serum hereinafter, “MEM”
  • MEM Dalveco's modified Eagle's medium
  • RPMI1640 medium RPMI1640 medium
  • 199 medium F12 medium
  • F12 medium F12 medium
  • some of the media containing the differentiation-inducing component are already on the market, and the commercially available medium can also be used.
  • the culture conditions in the step (b) are not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include a culture temperature of about 37 ° C. and a CO 2 concentration of about 2% to 5%.
  • Whether or not the target somatic cells have been obtained by culturing in step (b) can be confirmed by detecting known markers and the like of each target somatic cell.
  • the method for confirming the expression of the protein is not particularly limited, and a known method can be appropriately selected, and for example, it can be confirmed by immunostaining.
  • the method for confirming gene expression is not particularly limited, and a known method can be appropriately selected, and can be confirmed by, for example, quantitative PCR.
  • the second aspect of the direct transdifferentiation method from a somatic cell to another somatic cell of the present invention is characterized by comprising the following steps (c) and (d).
  • C A step of introducing a GLIS family gene, a mutated GLIS family gene or a gene product thereof, and a transcription factor into a somatic cell.
  • D A step of culturing the gene-introduced somatic cell in a medium containing a growth factor of another somatic cell.
  • the step (c) of the second aspect is the same as the above step (a) except that a transcription factor is introduced into a somatic cell in addition to the GLIS family gene and the like.
  • the transcription factor used is preferably a transcription factor known to be involved in the induction of differentiation of target somatic cells.
  • a transcription factor for example, in the case of cardiomyocytes, Tbx4, GATA4, Mef2c, Hand2 and the like can be used.
  • HNF4a For hepatocytes, HNF4a, FOXA3, HNF1a, GATA4, TCF-1, SALL4, TGIF1, MAB21L3, ZIC1, EGFLAM, PITX2, NRF1, ZNF281, CTCFL, TP73, TFE3, DLX6, TCF4 and the like can be used.
  • nerve cells NEUROG1, NEUROG2, NEUROG3, NOUROD1, NEUROD2 and the like can be used. If it is an astrocyte, Nfia, Nfib, Sox9 and the like can be used. The method for introducing these transcription factors into somatic cells is the same as the method for introducing the GLIS gene.
  • the growth factor used in the step (d) of the second aspect is a growth factor of other somatic cells, and known ones can be used.
  • cardiomyocyte growth factors include FGF, VEGF, BMP, EGF, Nrg, TGF, PGF, PDGF and the like.
  • hepatocyte growth factors include HGF, EGF, FGF, IGF and the like.
  • Growth factors for nerve cells and glial cells include NGF, EGF, BDNF, NT, HGF, GDNF, FGF, LIF, HIF, PDGF, M-CSF, IGF, VEGF, BMP and the like.
  • bone cell growth factors include M-CSF, BMP, TGF ⁇ , RANKL, and FGF. These growth factors can be used alone or in combination of two or more.
  • the culture of the step (d) of the second aspect can be carried out in the same manner as the step (b) of the first aspect.
  • iPS cells having a risk of tumor formation can be directly produced from somatic cells by transdifferentiation. It is advantageous in that a desired somatic cell can be produced without going through.
  • the direct transdifferentiation means direct transdifferentiation from a certain somatic cell to another somatic cell without passing through a stem cell.
  • a gene or a gene product thereof is introduced into the somatic cell, and the gene-introduced cell is cultured in a medium containing a growth factor or a differentiation-inducing component.
  • a direct transdifferentiation promoter from a somatic cell to another somatic cell containing a GLIS family gene, a mutant GLIS family gene or a gene product thereof can be mentioned. That is, as described above, it is not known at all that the GLIS family gene, the mutant GLIS family gene, or their gene products have a function of promoting transdifferentiation from a somatic cell to another somatic cell alone. That is.
  • the GLIS family gene, the mutant GLIS family gene, or a gene product thereof the same ones as described above are used, and the same ones as described above are preferable.
  • somatic cells are fibroblasts or mesenchymal stem cells, and other somatic cells are selected from adipocytes, nerve cells, myocardial cells, hepatocytes, bone cells and blood cell cells. It is especially useful when the cells are transdifferentiated. Further, the method of using the direct transdifferentiation agent of the present invention is the same as described above.
  • the direct transdifferentiation agent of the present invention is used in combination with a component for inducing differentiation of somatic cells or somatic cell precursor cells into other somatic cells as described above, as another aspect of somatic cells, a GLIS family gene, Examples thereof include a direct somatic cell-to-other somatic cell transdifferentiation agent containing a mutant GLIS family gene or a gene product thereof and a component for inducing somatic cell-to-other somatic cell differentiation. Also, a direct transdifferentiation agent from a somatic cell to another somatic cell containing a GLIS family gene, a mutant GLIS family gene or a gene product thereof, a transcription factor, and a proliferation factor of another somatic cell can be mentioned. it can.
  • the GLIS family gene, the mutant GLIS family gene, or a gene product thereof the same ones as described above are used, and the same ones as described above are preferable.
  • somatic cells are fibroblasts or mesenchymal stem cells, and other somatic cells are selected from adipocytes, nerve cells, myocardial cells, hepatocytes, bone cells and blood cell cells. It is especially useful when the cells are transdifferentiated. Further, the method of using the direct transdifferentiation agent of the present invention is the same as described above.
  • the direct transdifferentiation agent of the present invention may have a mode in which each of the genes or a gene product thereof is divided into individual containers, or a mode in which the genes are grouped in one container. It may be a mode in which any number is grouped in a container.
  • This direct transdifferentiation agent can be suitably used as a kit for producing somatic cells.
  • This somatic cell production kit contains at least the transdifferentiation agent, and may further contain other components if necessary.
  • Example 1 In order to verify the effect of the GLIS family gene on the efficiency of inducing differentiation into various cells, the GLIS1 gene was introduced into human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) using a lentiviral vector, and differentiation into each cell type was performed. A induction experiment was performed.
  • MSCs human bone marrow-derived mesenchymal stem cells
  • (1) In order to prepare lentivirus, HEK293FT cells (Thermo Fisher Scientific) cultured in 10 mL of 10% FBS, 1% penicillin / streptomycin, and DMEM medium were added to 2 in a 60 mm culture dish (TPP). ⁇ 10 The cells were seeded with a number of 6 cells and cultured in 4 mL of antibiotic-free medium.
  • Each plasmid carrying the GLIS1 gene was introduced using Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher) 16 hours after seeding, replaced with 3 mL of antibiotic-containing medium 24 hours after gene transfer, and the medium supernatant was collected 48 hours later.
  • a final concentration of 8 ⁇ g / mL Polybrene solution was added after filtration using a 0.45 mm pore size filter (Whatman).
  • MSC human bone marrow-derived mesenchymal stem cells, Lonza
  • the cells were replaced with 300 ⁇ L of each cell type-specific differentiation-inducing medium (PromoCell), and the medium was replaced every 2-3 days after the replacement. After fixing the sample 7, 14, and 21 days after the start of differentiation induction, immunocytochemistry was performed and observed using a fluorescence microscope.
  • PromoCell cell type-specific differentiation-inducing medium
  • a medium containing the differentiation-inducing components (EGF and FGF-2) from mesenchymal stem cells to nerve cells was used. Nerve cells were detected based on Tuj-1 nerve marker-positive cells, axon-like protrusions being elongated, and nuclei being significantly reduced as compared with MSCs. The results are shown in FIGS. 1 and 2.
  • Example 2 In order to verify the effect of the mutant GLIS family gene on the efficiency of inducing differentiation into various cells, the mutant GLIS1 gene was introduced into human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) using a lentiviral vector and into each cell type. Differentiation induction experiment was performed.
  • MSCs human bone marrow-derived mesenchymal stem cells
  • Differentiation induction experiment was performed.
  • (1) In order to prepare lentivirus, HEK293FT cells (Thermo Fisher Scientific) cultured in 10 mL of 10% FBS, 1% penicillin / streptomycin, and DMEM medium were added to 2 in a 60 mm culture dish (TPP). ⁇ 10 The cells were seeded with a number of 6 cells and cultured in 4 mL of antibiotic-free medium.
  • each plasmid carrying the mutant GLIS1 gene (SEQ ID NO: 2) was introduced using Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher), replaced with 3 mL of antibiotic-containing medium 24 hours after gene transfer, and on the medium 48 hours later. Qing was recovered. At the time of collecting the virus solution, a final concentration of 8 ug / mL Polybrene solution was added after filtration using a 0.45 mm pore size filter (Whatman).
  • MSC human bone marrow-derived mesenchymal stem cells, Lonza
  • each cell type-specific differentiation-inducing medium (Mesenchymal Stem Cell Adipogenic Difference Medium 2 (Ready-to-use) or Mesenchymal Stem Cell Neurogenic Diffelentiation Medium (Ready-to-use))
  • the medium was replaced with 300 ⁇ L, and the medium was replaced every 2-3 days after the replacement.
  • immunocytochemistry was performed and observed using a fluorescence microscope.
  • a medium containing a component for inducing differentiation from mesenchymal stem cells to nerve cells (Mesenchymal Stem Cell Neurogenic Differentiatio Medium (Ready-to-use), C-28015, PromoCell) was used. Nerve cells were detected based on Tuj-1 nerve marker-positive cells, axon-like protrusions being elongated, and nuclei being significantly reduced as compared with MSCs. The results are shown in FIGS. 1 and 2.
  • Example 3 The effect of adding an estrogen receptor antagonist was examined.
  • HEK293FT cells (Thermo Fisher Scientific) cultured in 10 mL of 10% FBS, 1% penicillin / streptomycin, and DMEM medium were added to 2 in a 60 mm culture dish (TPP).
  • TPP 60 mm culture dish
  • the cells were seeded with a number of 6 cells and cultured in 4 mL of antibiotic-free medium. 16 hours after seeding, each plasmid carrying the GLIS1 gene or the mutant GLIS1 gene (SEQ ID NO: 2) was introduced using Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher), and replaced with 3 mL of antibiotic-containing medium 24 hours after gene transfer, 48 hours. Later, the culture medium supernatant was collected.
  • a final concentration of 8 ug / mL Polybrene solution was added after filtration using a 0.45 mm pore size filter (Whatman).
  • MSC Mesenchymal stem cells, Lonza
  • TPP 24-well culture plate
  • the mixture was replaced with 300 ⁇ L of an estrogen receptor antagonist (tamoxifen) and a differentiation-inducing medium specific to each cell type (PromoCell), and the medium was replaced every 2-3 days after the replacement.
  • an estrogen receptor antagonist tamoxifen
  • a differentiation-inducing medium specific to each cell type PromoCell
  • a medium containing a component for inducing differentiation from mesenchymal stem cells to nerve cells (Mesenchymal Stem Cell Neurogenic Difference Medium (Ready-to-use), C-28015, PromoCell) was used. Nerve cells were detected based on Tuj-1 nerve marker-positive cells, axon-like protrusions being elongated, and nuclei being significantly reduced as compared with MSCs. The results are shown in FIGS. 1 and 2.
  • Example 4 (Direct transdifferentiation method from fibroblasts to adipocytes) MSC (human bone marrow-derived mesenchymal stem cells, Lonza) was cultured in 10 mL of 10% FBS, 1% penicillin / streptomycin, DMEM medium, and 1 ⁇ on a 24-well culture plate (TPP) 24 hours before Lentivirus infection. They were seeded at a cell number of 10 4 cells / well. After 24 hours after sowing, the culture supernatant was completely removed, 300 ⁇ L of the above-mentioned lentivirus solution was added, and the cells were cultured in a 5% CO 2 incubator at 37 ° C.
  • TPP 24-well culture plate
  • each cell type-specific differentiation-inducing medium (Mesenchymal Stem Cell Adipocyte Differentiation Medium 2 (Ready-to-use), C-28016, PromoCell) was added to 300 ⁇ L. The cells were replaced, and the medium was replaced every 2-3 days after the replacement. After fixing the sample 7, 14, and 21 days after the start of differentiation induction, immunocytochemistry was performed and observed using a fluorescence microscope. The results are shown in FIGS. 3 and 4.
  • Example 5 Direct transdifferentiation method to nerve cells, adipocytes, and osteoocytes using human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSC) (confirmation by quantitative PCR)
  • MSC human bone marrow-derived mesenchymal stem cells
  • each GLIS1 gene was introduced into human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) using a lentiviral vector, and each cell was introduced.
  • An experiment to induce differentiation into species was performed.
  • 10% FBS 10% FBS.
  • HEK293FT cells cultured in 1% penicillin / streptomycin and 10 mL of DMEM medium were seeded in a 60 mm culture dish (TPP) with a number of 2 ⁇ 10 6 cells and cultured in 4 mL of antibiotic-free medium. .. 16 hours after seeding, each plasmid carrying the full-length or N-terminal deficient GLIS1 gene was introduced using Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher), replaced with 7 mL of antibiotic-containing medium 24 hours after gene transfer, and the medium supernatant was collected 48 hours later. Was done.
  • a final concentration of 8 ug / mL Polybrene solution was added after filtration using a 0.45 mm poresis filter (Whatman).
  • MSC (Lonza) was cultured in 10 mL of 10% FBS, 1% penicillin / streptomycin, DMEM medium, and 1 ⁇ 10 4 cells / well cell count on a 24-well culture plate (TPP) 24 hours before lentivirus infection. Sown in. After 24 hours after sowing, the culture supernatant was completely removed, 300 uL of the above-mentioned lentivirus solution was added, and the cells were cultured in a 5% CO 2 incubator at 37 ° C.
  • the cells were replaced with 300 uL of each cell type-specific differentiation-inducing medium (PromoCell), and the medium was replaced every 2-3 days after the replacement.
  • Cells were collected 7, 14, and 21 days after the start of differentiation induction, and changes in gene expression of markers specific to each cell were examined using a quantitative PCR method.
  • Table 1 shows the primers (differentiation-inducing components and markers of target somatic cells) used for the quantitative PCR of the above test.
  • the direct transdifferentiation effect on nerve cells using GLIS1 is shown in FIG.
  • the expression levels of the nerve cell marker (TUBB3) and the differentiation-inducing component (Brn2) after the GLIS1 gene was introduced into the human bone marrow-derived MSC and then cultured in the nerve cell differentiation-inducing medium (AscI1, Brn2, Myt1I) for 2 weeks. It was significantly increased.
  • the direct transdifferentiation effect on adipocytes using GLIS1 is shown in FIG.
  • Example 6 (Direct transdifferentiation method from fibroblasts to cardiomyocytes by introducing GLIS1 gene and transcription factor)
  • a myocardial cell transcription factor was used for mouse embryonic fibroblasts (MEF) using a lentiviral vector and a retroviral vector.
  • the full-length or N-terminal deficient GLIS1 gene was introduced, and an experiment to induce differentiation into myocardial cells was performed.
  • 10% FBS 10% FBS.
  • TPP 100 mm culture dish
  • each plasmid carrying a cardiomyocyte transcription factor and a full-length or N-terminal deficient GLIS1 gene was introduced using Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher), and replaced with 7 mL of antibiotic-containing medium 24 hours after gene transfer, 48 hours. Later, the culture medium supernatant was collected.
  • the supernatant was recovered after centrifugation at 400 xg for 10 minutes, and after filtration using a 45 mm poresis filter (Whatman), a final concentration of 8 ug / mL Polybrene solution was added.
  • MEF was cultured in 10 mL of 10% FBS, 1% penicillin / streptomycin, and DMEM medium, and the number of cells was 5 ⁇ 104 cells / well on a 24-well culture plate (TPP) coated with fibronectin 24 hours before virus infection. Sown in.
  • the culture supernatant was completely removed, 500 uL of each of the above-mentioned virus solutions was added, and the cells were cultured in a 5% CO 2 incubator at 37 ° C. Twenty-four hours after the addition of the virus solution, the medium was replaced with 500 uL of cardiomyocyte differentiation-inducing medium, and the medium was replaced every 2-3 days after the replacement. Cells were collected 0,1,4,7,14,21,28 days after the start of differentiation induction, microscopically observed over time, and gene expression of markers specific to each cell was expressed using a quantitative PCR method. We examined the changes.
  • Table 2 shows the plasmids used in Examples 6-8.
  • Table 3 shows the primers (transcription factors and markers of target somatic cells) used for quantitative PCR in Examples 6 to 8.
  • the growth factor-containing medium used in Example 6 is as follows.
  • Basic medium StemPro-34 SF medium (Gibco, 10639-011)
  • Additive Reagents / Cytokines Gluta MAX (10 ⁇ L / mL, Gibco, 35050-061) Ascorbic acid (50 ⁇ g / mL, Sigma Aldrich, A-4544)
  • Recombinant human VEGF 165 (5 ng / mL, BioLegend)
  • Recombinant human FGF 10 50 ng / mL, BioLegend
  • FIG. 8 shows the direct transdifferentiation effect on cardiomyocytes using GLIS1 and cardiomyocyte transcription factors (Tbx5, Mef2c, GATA4).
  • Expression of transcription factor (Tbx5) after introducing the GLIS1 gene and cardiomyocyte transcription factors (Tbx5, Mef2c, GATA4) into mouse embryo-derived fibroblasts (P2-3) and then culturing in a medium containing cardiomyocyte growth factor for 10 days. was confirmed, and the expression level of the cardiomyocyte marker (Sall1) was significantly increased.
  • the direct transdifferentiation effect on cardiomyocytes using GLIS1 and cardiomyocyte transcription factors (Tbx5, Mef2c, GATA4, Hand2) is shown in FIG.
  • the GLIS1 gene and cardiomyocyte transcription factors (Tbx5, Mef2c, GATA4, Hand2) were introduced into mouse embryo-derived fibroblasts (P2-3), and then cultured in a medium containing cardiomyocyte growth factor for 2 weeks, followed by cardiomyocyte transcription factors (Tbx5, Mef2c, GATA4, Hand2).
  • Tbx5 was confirmed, and the expression level of the cardiomyocyte marker (cTnT) was significantly increased.
  • Example 7 Direct transdifferentiation method from fibroblasts to hepatocytes by introducing GLIS1 gene and transcription factor
  • hepatocyte transcription factors were used for mouse embryonic fibroblasts (MEF) using lentiviral vectors and retroviral vectors.
  • the full-length or N-terminal deficient GLIS1 gene was introduced, and an experiment to induce differentiation into hepatocytes was performed.
  • 10% FBS 10% FBS.
  • HEK293FT cells or Plat-E cells cultured in 1% penicillin / streptomycin, DMEM medium 10 mL were seeded in a 100 mm culture dish (TPP) with a cell number of 2 ⁇ 10 6 and an antibiotic-free medium.
  • TPP 100 mm culture dish
  • GATA4 hepatocellular transcription factor
  • N-terminal deficient GLIS1 gene gene was introduced into a 7 mL antibiotic-containing medium 24 hours after gene transfer using Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher). After 48 hours of replacement, the culture medium supernatant was collected.
  • the supernatant was recovered after centrifugation at 400 xg for 10 minutes, and after filtration using a 45 mm poresis filter (Whatman), a final concentration of 8 ug / mL Polybrene solution was added.
  • MEF was cultured in 10 mL of 10% FBS, 1% penicillin / streptomycin, DMEM medium, and 4.5 ⁇ 104 cells / well cells were placed on a 24-well culture plate (TPP) coated with gelatin 24 hours before virus infection. Sown by number.
  • the culture supernatant was completely removed, 500 uL of each of the above-mentioned virus solutions was added, and the cells were cultured in a 5% CO 2 incubator at 37 ° C. Twenty-four hours after the addition of the virus solution, the medium for hepatocytes (1) was replaced with 500 uL.
  • the cells were re-seeded on a 12-well culture plate coated with collagen I, and the culture was continued using the hepatocyte medium (2).
  • medium exchange is performed every 2-3 days, cells are collected 0, 1, 4, 7, 14, 21, 28 days after the start of differentiation induction, microscopic observation is performed over time, and quantitative PCR is performed. The method was used to examine changes in gene expression of markers specific to each cell.
  • FIG. 10 shows the direct transdifferentiation effect on hepatocytes using GLIS1 (full-length and N-terminal deficient GLIS1 gene) and hepatocyte transcription factor (GATA4).
  • GLIS1 full-length and N-terminal deficient GLIS1 gene
  • GATA4 hepatocyte transcription factor
  • Example 8 (Direct transdifferentiation method from fibroblasts to astrocytes by introducing GLIS1 gene and transcription factor)
  • GLIS1 gene and transcription factor mouse embryonic fibroblasts
  • astrocyte transcription factor and full-length or N were used for mouse embryonic fibroblasts (MEF) using a retrovirus vector.
  • the terminal deficient GLIS1 gene was introduced and an experiment to induce differentiation into astrocytes was performed.
  • 10% FBS 10% FBS.
  • Plat-E cells cultured in 10 mL of 1% penicillin / streptomycin and DMEM medium were seeded in a 100 mm culture dish (TPP) in a number of 2 ⁇ 10 6 cells, and in 7 mL of antibiotic-free medium. It was cultured. 16 hours after seeding, each plasmid carrying the full-length or N-terminal deficient GLIS1 gene and astrocyte transcription factor (NFIA) was introduced using Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher), and 24 hours after gene transfer into 7 mL of antibiotic-containing medium. After 48 hours of replacement, the culture medium supernatant was collected.
  • TPP 100 mm culture dish
  • NFIA astrocyte transcription factor
  • the supernatant was collected after centrifuging at 400 xg for 10 minutes, and after filtration using a 45 mm poresis filter (Whatman), a solution for Polybrene having a final concentration of 8 ug / mL was added.
  • MEF was cultured in 10% FBS, 1% penicillin / streptomycin, DMEM medium xmL, and the number of cells was 5 ⁇ 10 4 cells / well on a 24-well culture plate (TPP) coated with gelatin 24 hours before virus infection. was sown in.
  • the culture supernatant was completely removed, 500 uL of each of the above-mentioned virus solutions was added, and the cells were cultured in a 5% CO 2 incubator at 37 ° C. Twenty-four hours after the addition of the virus solution, the medium was replaced with 500 uL of astrocyte medium, and the medium was replaced every 2-3 days after the replacement. Cells were collected 0, 1, 4, 7, 14, and 21 days after the start of differentiation induction, and microscopic observation was performed over time, and changes in gene expression of markers specific to each cell were observed using a quantitative PCR method. investigated.
  • FIG. 11 shows the direct transdifferentiation effect to astrocytes using GLIS1 (full-length and N-terminal deficient GLIS1 gene) and astrocyte transcription factor (NFIA).
  • GLIS1 full-length and N-terminal deficient GLIS1 gene
  • NFIA astrocyte transcription factor
  • the GLIS1 gene and astrocyte transcription factor (NFIA) were introduced into mouse embryo-derived fibroblasts (P2-3), and then the expression of astrocyte transcription factor (NFIA) was confirmed after culturing in an astrocyte growth factor-containing medium for 2 weeks. At the same time, the expression level of the astrocyte marker (GFAP) was significantly increased.
  • GFAP astrocyte marker

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Abstract

簡便で再現性がよく、生産効率に優れ、かつ短期間に、体細胞から他の体細胞への直接分化転換による製造方法を提供すること。 （ａ）ＧＬＩＳファミリー遺伝子、変異ＧＬＩＳファミリー遺伝子又はそれらの遺伝子産物を体細胞に導入する工程、並びに （ｂ）当該遺伝子導入体細胞を、当該体細胞又は当該体細胞の前駆細胞から他の体細胞への分化誘導成分を含有する培地で培養する工程 を含むことを特徴とする、当該体細胞から他の体細胞への直接分化転換による製造方法。

Description

体細胞の直接分化転換方法
　本発明は、体細胞から他の体細胞への直接分化転換による製造方法に関する。
　脂肪細胞、神経細胞、心筋細胞、肝細胞などの体細胞は、再生医療の材料として、またこれらの細胞が関与する疾患のスクリーニングに用いる材料などとして用いることが期待されている。そのため、これらの体細胞を、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで大量に調製する方法の開発が強く求められている。
　これらの体細胞は、胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ、以下、「ＥＳ細胞」と称することがある）、又は人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ、以下、「ｉＰＳ細胞」と称することがある）を用いて製造する方法が提案されている。しかしながら、前記方法では、細胞培養用の培地に様々な発生分化に関わる阻害剤を加えるなど培養環境を整える必要があり、煩雑であるという問題があり、また、再現性が得られない場合があるという問題もある。また、前記方法では、目的とする体細胞以外の細胞も製造されることから、効率面での問題もある。更に、目的の体細胞を得るまでに、最低でも２１日～３０日を要し、短期間で製造することができないという問題もある。
　また、これらの体細胞のうち、例えば脂肪細胞などは、線維芽細胞、間葉系幹細胞又はこれらの体細胞の前駆細胞を、転写因子に関与する成分を含有する培地中で培養することにより分化誘導する方法も報告されている。しかしながら、これらの分化誘導方法における分化誘導効率は低く、効率面で問題があり、体細胞の大量調製手段として採用されるに至っていないのが現状である。
　なお、ＧＬＩＳファミリーであるＧＬＩＳ１（ＧＬＩＳ　ｆａｍｉｌｙ　ｚｉｎｃ　ｆｉｎｇｅｒ　１）は、ｉＰＳ細胞の樹立効率を改善することが知られている（例えば、特許文献１参照）。また、ＧＬＩＳ３（ＧＬＩＳ　ｆａｍｉｌｙ　ｚｉｎｃ　ｆｉｎｇｅｒ　３）は、ヒト多分化性または多能性細胞を、インスリンを産生する機能的膵β細胞へ分化誘導するために用いることができることが知られている（例えば、特許文献２参照）。
　また、本発明者らは、ＧＬＩＳファミリー遺伝子とＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３遺伝子とを体細胞に導入するか、又はＧＬＩＳファミリー遺伝子とＮｅｕｒｏｇｅｎｉｎ３遺伝子とＰｄｘ１遺伝子とを体細胞に導入すれば、体細胞を直接膵分泌細胞に分化転換できることを見出し、特許出願した（特許文献３、４）。
　しかしながら、ＧＬＩＳ１などのＧＬＩＳファミリー遺伝子が、単独で、幹細胞を経ずに、体細胞を、膵分泌細胞以外の他の体細胞に直接変換することに関与することは、全く知られていない。
特表２０１３－５１９３７１号公報 特表２００９－５３３０４７号公報 国際公開第２０１６/００２９３７号パンフレット 国際公開第２０１７/０７３７４０号パンフレット
　本発明の課題は、簡便で再現性がよく、生産効率に優れ、かつ短期間に、体細胞から他の体細胞への直接分化転換による製造方法を提供することにある。
　そこで本発明者は、ＧＬＩＳファミリー遺伝子が単独で体細胞の分化転換にどのような作用を及ぼすのかについて種々検討したところ、全く意外にも、ＧＬＩＳファミリー遺伝子を導入した体細胞を、その体細胞の分化誘導成分を含有する培地で培養すれば、その体細胞の他の体細胞への分化転換効率が飛躍的に向上することを見出した。また、ＧＬＩＳファミリー遺伝子及び転写因子を導入した体細胞を、その体細胞の増殖因子を含有する培地で培養すれば、その体細胞の他の体細胞への分化転換効率が飛躍的に向上することを見出し、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は、次の［１］～［１４］を提供するものである。
［１］（ａ）ＧＬＩＳファミリー遺伝子、変異ＧＬＩＳファミリー遺伝子又はそれらの遺伝子産物を体細胞に導入する工程、並びに
（ｂ）当該遺伝子導入体細胞を、当該体細胞又は当該体細胞の前駆細胞から他の体細胞への分化誘導成分を含有する培地で培養する工程
を含むことを特徴とする、当該体細胞から他の体細胞への直接分化転換による製造方法。
［２］（ｃ）ＧＬＩＳファミリー遺伝子、変異ＧＬＩＳファミリー遺伝子又はそれらの遺伝子産物と転写因子とを体細胞に導入する工程、並びに
（ｄ）当該遺伝子導入体細胞を、他の体細胞の増殖因子を含有する培地で培養する工程
を含むことを特徴とする、当該体細胞から他の体細胞への直接分化転換による製造方法。
［３］ＧＬＩＳファミリー遺伝子が、ＧＬＩＳ１遺伝子である［１］又は［２］記載の製造方法。
［４］変異ＧＬＩＳファミリー遺伝子が、ＧＬＩＳ１タンパク質のＮ末端側の一部のアミノ酸残基が欠失したタンパク質をコードする遺伝子である［１］～［３］のいずれかに記載の製造方法。
［５］変異ＧＬＩＳファミリー遺伝子が、ＧＬＩＳ１タンパク質のＮ末端側の１００～３６０アミノ酸残基が欠失したタンパク質をコードする遺伝子である［１］～［４］のいずれかに記載の製造方法。
［６］前記体細胞が、線維芽細胞又は間葉系幹細胞である［１］～［５］のいずれかに記載の製造方法。
［７］前記他の体細胞が、脂肪細胞、神経細胞、心筋細胞、肝細胞、骨細胞及び血球細胞から選ばれる［１］～［６］のいずれかに記載の製造方法。
［８］［１］～［７］のいずれかに記載の製造方法により製造された体細胞。
［９］体細胞が、脂肪細胞、神経細胞、心筋細胞、肝細胞、骨細胞及び血球細胞から選ばれる細胞である［８］記載の体細胞。
［１０］ＧＬＩＳファミリー遺伝子、変異ＧＬＩＳファミリー遺伝子又はそれらの遺伝子産物を含有する、体細胞から他の体細胞への直接分化転換促進剤。
［１１］体細胞が、線維芽細胞又は間葉系幹細胞であり、他の体細胞が、脂肪細胞、神経細胞、心筋細胞、肝細胞、骨細胞及び血球細胞から選ばれる細胞である、［１０］記載の体細胞から他の体細胞への直接分化転換促進剤。
［１２］ＧＬＩＳファミリー遺伝子、変異ＧＬＩＳファミリー遺伝子又はそれらの遺伝子産物と、体細胞から他の体細胞への分化誘導成分とを含有する、体細胞から他の体細胞への直接分化転換剤。
［１３］ＧＬＩＳファミリー遺伝子、変異ＧＬＩＳファミリー遺伝子又はそれらの遺伝子産物と、転写因子と、他の体細胞の増殖因子とを含有する、体細胞から他の体細胞への直接分化転換剤。
［１４］体細胞が、線維芽細胞又は間葉系幹細胞であり、他の体細胞が、脂肪細胞、神経細胞、心筋細胞、肝細胞、骨細胞及び血球細胞から選ばれる細胞である、［１３］記載の体細胞から他の体細胞への直接分化転換剤。
　本発明によれば、簡便で再現性がよく、生産効率に優れ、かつ短期間に、体細胞から他の体細胞へ直接分化転換できる。したがって、再生医療の材料としての体細胞の供給や種々の疾患の研究材料としての体細胞の供給が可能となる。
分化誘導開始１週間から３週間までの神経細胞分化の経時的変化を神経マーカー（Ｔｕｊ－１）免疫染色像で示したものである。ＧＦＰは、コントロールを示す。Ｋ１♯１４は、ＧＬＩＳ１遺伝子導入後、分化誘導成分含有培地で培養した結果を示す。Ｋ２♯９（４－ＯＨ（－））は、変異ＧＬＩＳ１遺伝子導入後、分化誘導成分含有培地で培養した結果を示す。Ｋ２（Ｅｒｔ）♯９（４－ＯＨ（＋））は、変異ＧＬＩＳ１遺伝子導入後、分化誘導成分及びエストロゲン受容体拮抗剤含有培地で培養した結果を示す。 培養２週間後の神経細胞への誘導効率を示す図である。ＧＦＰは、コントロールを示す。１♯１４は、ＧＬＩＳ１遺伝子導入後、分化誘導成分含有培地で培養した結果を示す。Ｋ２♯９（４－ＯＨ（－））は、変異ＧＬＩＳ１遺伝子導入後、分化誘導成分含有培地で培養した結果を示す。Ｋ２（Ｅｒｔ）♯９（４－ＯＨ（＋））は、変異ＧＬＩＳ１遺伝子導入後、分化誘導成分及びエストロゲン受容体拮抗剤含有培地で培養した結果を示す。 培養２週間後の脂肪細胞のＬｉｐｉ　Ｄｙｅ染色像を示す。緑色、及び水色（明るい青色）の部分がＬｉｐｉ　Ｄｙｅにより染色された脂肪細胞内の油滴の染色部である。ＧＦＰは、コントロールを示す。Ｋ１♯１４は、ＧＬＩＳ１遺伝子導入後、分化誘導成分含有培地で培養した結果を示す。Ｋ２♯９（４－ＯＨ（－））は、変異ＧＬＩＳ１遺伝子導入後、分化誘導成分含有培地で培養した結果を示す。Ｋ２（Ｅｒｔ）♯９（４－ＯＨ（＋））は、変異ＧＬＩＳ１遺伝子導入後、分化誘導成分及びエストロゲン受容体拮抗剤含有培地で培養した結果を示す。 培養２週間後の脂肪細胞への誘導効率を示す図である。ＧＦＰは、コントロールを示す。Ｋ１♯１４は、ＧＬＩＳ１遺伝子導入後、分化誘導成分含有培地で培養した結果を示す。Ｋ２♯９（４－ＯＨ（－））は、変異ＧＬＩＳ１遺伝子導入後、分化誘導成分含有培地で培養した結果を示す。Ｋ２（Ｅｒｔ）♯９（４－ＯＨ（＋））は、変異ＧＬＩＳ１遺伝子導入後、分化誘導成分及びエストロゲン受容体拮抗剤含有培地で培養した結果を示す。 培養２週間後の神経細胞への誘導効率を示す図である。左の図は、神経細胞マーカー（ＴＵＢＢ３）の発現量の変化を示す。右の図は、神経細胞分化誘導成分（Ｂｒｎ２）の発現量の変化を示す。 培養２週間後の脂肪細胞への誘導効率を示す図である。左の図は、脂肪細胞マーカー（ＦＡＢＰ４）の発現量の変化を示す。右の図は、脂肪細胞分化誘導成分（ＰＰＡＲγ）の発現量の変化を示す。 培養２週間後の骨細胞への誘導効率を示す図である。左の図は、初期骨細胞マーカー（ＡＬＰ）の発現量の変化を示す。右の図は、骨細胞分化誘導成分（ＢＧＬＡＰ）の発現量の変化を示す。 培養１０日後の心筋細胞への誘導効率を示す図である。左の図は、未成熟心筋細胞マーカー（Ｓａｌｌ１）の発現量の変化を示す。右の図は、心筋細胞転写因子（Ｔｂｘ５）の発現量の変化を示す。 培養２週間後の心筋細胞への誘導効率を示す図である。左の図は、心筋細胞マーカー（ｃＴｎＴ）の発現量の変化を示す。右の図は、心筋細胞転写因子（Ｔｂｘ５）の発現量の変化を示す。 培養２週間後の肝細胞への誘導効率を示す図である。左の図は、肝細胞マーカー（ＭＡＯＡ）の発現量の変化を示す。右の図は、肝細胞転写因子（ＧＡＴＡ４）の発現量の変化を示す。 培養２週間後のアストロサイトへの誘導効率を示す図である。左の図は、アストロサイトマーカー（ＧＦＡＰ）の発現量の変化を示す。右の図は、アストロサイト転写因子（ＮＦＩＡ）の発現量の変化を示す。
　本発明の体細胞から他の体細胞への直接分化転換方法の第一の態様は、次の工程（ａ）並びに（ｂ）を含むことを特徴とする。
（ａ）ＧＬＩＳファミリー遺伝子、変異ＧＬＩＳファミリー遺伝子又はそれらの遺伝子産物を体細胞に導入する工程、
（ｂ）当該遺伝子導入体細胞を、当該体細胞又は当該体細胞の前駆細胞から他の体細胞への分化誘導成分を含有する培地で培養する工程。
　工程（ａ）に用いられるＧＬＩＳファミリー遺伝子としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＧＬＩＳ１、ＧＬＩＳ２、ＧＬＩＳ３などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。前記ＧＬＩＳファミリーの中でも、体細胞から他の体細胞への直接分化転換効率向上効果に優れる点で、ＧＬＩＳ１、ＧＬＩＳ３が好ましく、ＧＬＩＳ１がより好ましい。
　前記ＧＬＩＳファミリー遺伝子の由来としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、マウスなどが挙げられる。
　前記ＧＬＩＳファミリー遺伝子の配列情報は、公知のデータベースから得ることができ、例えば、ＮＣＢＩでは、アクセッション番号が、ＮＭ＿１４７１９３（ヒトＧＬＩＳ１）、ＮＭ＿１４７２２１（マウスＧＬＩＳ１）、ＮＭ＿０３２５７５（ヒトＧＬＩＳ２）、ＮＭ＿０３１１８４（マウスＧＬＩＳ２）、ＮＭ＿１５２６２９（ヒトＧＬＩＳ３）、ＮＭ＿１７５４５９、及びＮＭ＿１７２６３６（マウスＧＬＩＳ３）で入手することができる。
　工程（ａ）に用いられる変異ＧＬＩＳファミリー遺伝子としては、前記ＧＬＩＳファミリー遺伝子の変異体であって、ＧＬＩＳ１遺伝子の変異体が好ましく、前記ＧＬＩＳ１タンパク質のＮ末端側の一部のアミノ酸残基が欠失したタンパク質をコードする遺伝子がより好ましく、前記ＧＬＩＳ１タンパク質のＮ末端側の１００～３６０アミノ酸残基が欠失したタンパク質をコードする遺伝子がさらに好ましい。具体的には、配列番号：１及び２のいずれかで表される塩基配列と８５％以上の配列同一性を有する遺伝子が挙げられる。
　前記配列番号：１で表される塩基配列は、マウスＧＬＩＳ１タンパク質のＮ末端の３６０アミノ酸残基が欠失したタンパク質をコードする遺伝子の配列である。
　前記配列番号：２で表される塩基配列は、ヒトＧＬＩＳ１タンパク質のＮ末端の１９０アミノ酸残基が欠失したタンパク質をコードする遺伝子の配列である。
　前記配列番号：１及び２のいずれかで表される塩基配列との配列同一性としては、８５％以上であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、９０％以上が好ましく、９５％以上がより好ましく、９８％以上が更に好ましく、９９％以上が特に好ましい。
　前記配列同一性の決定方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、ＫａｒｌｉｎとＡｌｔｓｃｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．＆Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：２２６４－２２６８、Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．＆Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９０：５８７３）を用いて決定することができる。
　遺伝子産物とは、遺伝子から転写されるｍＲＮＡ、当該ｍＲＮＡから翻訳されるタンパク質をいう。本発明で用いられる遺伝子産物としては、前記ＧＬＩＳファミリー遺伝子から転写されるｍＲＮＡ、当該ｍＲＮＡから翻訳されるタンパク質、前記変異ＧＬＩＳファミリー遺伝子から転写されるｍＲＮＡ、当該ｍＲＮＡから翻訳されるタンパク質が挙げられる。
　前記ＧＬＩＳファミリー遺伝子、変異ＧＬＩＳファミリー遺伝子又はその遺伝子産物の配列は、前記各遺伝子の配列のうち、タンパク質に翻訳される部分のみからなる態様であってもよいし、タンパク質に翻訳される部分以外の部分を含む態様であってもよい。
　工程（ａ）において、前記遺伝子又は遺伝子産物が導入される細胞は、体細胞である。当該体細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。前記体細胞は未分化な前駆細胞であってもよいし、最終分化した成熟細胞であってもよい。前記体細胞は、ＥＳ細胞由来、又はｉＰＳ細胞由来のものであってもよいが、体細胞由来の成熟細胞又は目的体細胞の前駆細胞が好ましい。
　前記体細胞の具体例としては、脂肪組織由来間質（幹）細胞、間葉系幹細胞、線維芽細胞などが挙げられる。これらの中でも、線維芽細胞、間葉系幹細胞がより好ましい。
　前記体細胞を採取する個体の種としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、マウスなどが挙げられる。
　前記体細胞を採取する個体としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、目的とする他の体細胞を再生医療用途に用いる場合には、拒絶反応の観点から、個体自身、又はＭＨＣの型が同一若しくは実質的に同一の他の個体が好ましい。ここで、前記ＭＨＣの型が実質的に同一とは、免疫抑制剤などの使用により、前記体細胞由来の他の体細胞を個体に移植した場合に移植細胞が生着可能な程度にＭＨＣの型が一致していることをいう。前記体細胞を採取する個体の時期としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
　前記体細胞の培養条件としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、培養温度は約３７℃、ＣＯ２濃度は約２％～５％などが挙げられる。前記体細胞の培養に用いる培地としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、５質量％～２０質量％の血清を含む、最小必須培地（以下、「ＭＥＭ」と称することがある）、ダルベッコ変法イーグル培地（以下、「ＤＭＥＭ」と称することがある）、ＲＰＭＩ１６４０培地、１９９培地、Ｆ１２培地などが挙げられる。
　工程（ａ）における体細胞への前記各遺伝子又はその遺伝子産物の導入方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ベクターを用いる方法、合成したｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）を用いる方法、組換えタンパク質を用いる方法などが挙げられる。
　前記ベクターとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ウイルスベクター、非ウイルスベクターなどが挙げられる。
　前記ウイルスベクターの具体例としては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどが挙げられる。前記非ウイルスベクターの具体例としては、プラスミドベクター、エピゾーマルベクターなどが挙げられる。
　前記ベクターを前記体細胞に導入する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて公知の方法を適宜選択することができる。例えば、前記レトロウイルスベクターを用いる場合の方法は、国際公開第２００７／６９６６６号、Ｃｅｌｌ，１２６，６６３－６７６（２００６）、Ｃｅｌｌ，１３１，８６１－８７２（２００７）などに記載の方法を用いることができ、前記レンチウイルスベクターを用いる場合の方法は、Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１８，１９１７－１９２０（２００７）などに記載の方法を用いることができる。また、前記プラスミドベクターを用いる場合の方法は、Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２２，９４９－９５３（２００８）などに記載の方法を用いることができ、前記エピゾーマルベクターを用いる場合の方法は、Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２４：７９７－８０１（２００９）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，４２６：１４１－１４７（２０１２）などに記載の方法を用いることができる。
　前記ウイルスベクターを用いる場合には、パッケージング細胞を用いて得られたウイルス粒子を用いてもよい。前記パッケージング細胞は、ウイルスの構造タンパク質をコードする遺伝子を導入した細胞であり、該細胞に目的遺伝子を組み込んだ組換えウイルスベクターを導入すると、該目的遺伝子を組み込んだ組換えウイルス粒子を産生する。
　前記パッケージング細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト腎臓由来のＨＥＫ２９３細胞やマウス線維芽細胞由来のＮＩＨ３Ｔ３細胞をベースとしたパッケージング細胞、長期にわたって高力価のウイルスを産生できるウイルス構造タンパク質ｇａｇ－ｐｏｌ及びｅｎｖをＭｏＭｕＬＶ（Ｍｏｌｏｎｅｙ　Ｍｕｒｉｎｅ　Ｌｅｕｋｅｍｉａ　Ｖｉｒｕｓ）ＬＴＲ（ｌｏｎｇ　ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｒｅｐｅａｔｓ）のコントロール下で発現させているパッケージング細胞Ｐｌａｔｉｎｕｍ－Ｅ（以下、「Ｐｌａｔ－Ｅ細胞」と称することがある）、Ａｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ　ｖｉｒｕｓ由来エンベロープ糖タンパク質を発現するよう設計されているＰＬＡＴ－Ａ細胞、水疱性口内炎ウイルス由来エンベロープ糖タンパク質を発現するよう設計されているＰＬＡＴ－ＧＰ細胞などが挙げられる。
　前記パッケージング細胞へのウイルスベクターの導入方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法などが挙げられる。前記得られたウイルス粒子を前記体細胞へ感染させる方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ポリブレン法が挙げられる。
　前記ベクターは、前記各遺伝子の導入を確認するためのマーカー遺伝子を含んでいてもよい。前記マーカー遺伝子とは、該マーカー遺伝子を細胞に導入することにより、細胞の選別や選択を可能とするような遺伝子をいう。前記マーカー遺伝子の具体例としては、薬剤耐性遺伝子、蛍光タンパク質遺伝子、発光酵素遺伝子、発色酵素遺伝子などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
　前記薬剤耐性遺伝子の具体例としては、ネオマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子などが挙げられる。
　前記蛍光タンパク質遺伝子の具体例としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）遺伝子、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）遺伝子などが挙げられる。
　前記発光酵素遺伝子の具体例としては、ルシフェラーゼ遺伝子などが挙げられる。
　前記発色酵素遺伝子の具体例としては、βガラクトシターゼ遺伝子、βグルクロニダーゼ遺伝子、アルカリフォスファターゼ遺伝子などが挙げられる。
　前記ｍＲＮＡを前記体細胞に導入する方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択して用いることができる。
　前記組換えタンパク質を前記体細胞に導入する方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択して用いることができる。
　前記各遺伝子又はその遺伝子産物の体細胞への導入回数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、１回であってもよいし、２回以上であってもよい。
　前記各遺伝子又はその遺伝子産物の体細胞への導入時期としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、前記各遺伝子又はその遺伝子産物の全てを同時期に導入してもよいし、異なる時期に導入してもよい。
　前記各遺伝子又はその遺伝子産物の体細胞への導入量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、全ての遺伝子又はその遺伝子産物を等量導入してもよいし、異なる量導入してもよい。
　前記遺伝子乃至その遺伝子産物は、同一の遺伝子又はその遺伝子産物について、遺伝子のみを用いる態様であってもよいし、遺伝子産物のみを用いる態様であってもよいし、両者を用いる態様であってもよい。異なる遺伝子又はその遺伝子産物との組合せとしても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、各遺伝子乃至その遺伝子産物について、同じものを使用してもよいし、異なるものを使用してもよい。前記遺伝子又はその遺伝子産物導入工程では、本発明の効果を損なわない限り、前記遺伝子又はその遺伝子産物以外の物を導入してもよい。
　次に、工程（ｂ）について説明する。工程（ｂ）は、前記の遺伝子導入体細胞を、当該体細胞又は当該体細胞の前駆細胞から他の体細胞（目的体細胞ともいう）への分化誘導成分を含有する培地で培養する工程である。
　工程（ｂ）における原料体細胞と目的体細胞の組み合わせは、特に制限されないが、原料体細胞としては、前記の線維芽細胞、間葉系幹細胞が好ましい。ここで、間葉系幹細胞としては、骨髄由来幹細胞が好ましい。
　目的体細胞としては、脂肪細胞、神経細胞、心筋細胞、肝細胞、骨細胞及び血球細胞が挙げられる。血球細胞としては、白血球、赤血球が特に好ましい。
　工程（ｂ）に用いられる培地に含まれる成分は、前記体細胞又は当該体細胞の前駆細胞から他の体細胞（目的体細胞ともいう）への分化誘導成分である。このような分化誘導成分は、目的体細胞毎に知られている成分を用いることができる。
　線維芽細胞又は間葉系幹細胞からから脂肪細胞への分化誘導成分としては、３－イソブチル－１－メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、デキサメタゾン（ＤＥＸ）、インスリンなどが知られており、これらの１種又は２種以上を組み合わせて用いることができる。これらの成分のうち、３－イソブチル－１－メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、デキサメタゾン（ＤＥＸ）及びインスリンを用いるのが特に好ましい。
　線維芽細胞または間葉系幹細胞から神経細胞への分化誘導成分としては、ＥＧＦ（上皮増殖因子）、ＦＧＦ－２（線維芽細胞増殖因子－２）などが知られており、これらの１種又は２種以上を組み合わせて用いることができる。これらの成分のうち、ＥＧＦ、ＦＧＦ－２を用いるのが特に好ましい。
　線維芽細胞又は間葉系幹細胞から心筋細胞への分化誘導成分としては、ＶＥＧＦ、Ｗｎｔ/β－カテニン阻害剤（ＩＷＰ２など）などが知られており、これらの１種又は２種以上を組み合わせて用いることができる。これらの成分のうち、ＶＥＧＦ、Ｗｎｔ/β－カテニン阻害剤（ＩＷＰ２などを用いるのが特に好ましい。
　線維芽細胞又は間葉系幹細胞から肝細胞への分化誘導成分としては、オンコスタチンＭ（ＯｓＭ）、ＤＥＸ、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）などが知られており、これらの１種又は２種以上を組み合わせて用いることができる。これらの成分のうち、ＯｓＭ、ＤＥＸ、ＨＧＦを用いるのが特に好ましい。
　線維芽細胞又は間葉系幹細胞から血球細胞への分化誘導成分としては、目的とする血球によって異なるが、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ１、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、ＦＩｔ３－Ｌ、ＴＰＯ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－１５、Ｇ－ＣＳＦ、ＩＬ－３，ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＴＮＦ－α、ＥＰＯ、ＩＧＦ－ＩＩなどが知られており、これらの１種又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
　線維芽細胞又は間葉系幹細胞から骨細胞への分化誘導成分としては、Ｒｕｎｘ２、Ｒｕｎｘ３、Ｄｌｘ５、ＡＴＦ４、Ｏｓｘ、Ｓｍａｄ１、Ｗｎｔ、Ｆｇｆ、Ｈｅｄｇｅｈｏｇ、Ｍｓｘ２、Ｔｗｉｓｔ、ＡＰ－１、Ｔｎｃ、Ｎｃａｍ１、Ｐｔｈ１ｈなどが挙げられ、これらの１種又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
　また、前記の目的体細胞に関する分化誘導成分以外に、分化誘導成分として、エストロゲン受容体拮抗剤を培地中に含有させるのが、本発明の直接分化転換効率を向上させる点で好ましい。エストロゲン受容体拮抗剤としては、タモキシフェン、フルベストラント、メピチオスタンなどが挙げられる。このエストロゲン受容体拮抗剤の添加は、導入遺伝子が変異ＧＬＩＳ１遺伝子の場合に特に好ましい。
　前記分化誘導成分の培地中の含有量は、それぞれの成分において知られている量であればよく、特に限定されないが、通常培地中にそれぞれ０．００１μＭ～５０μＭが好ましい。
　前記分化誘導成分を添加できる基本培地としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、５質量％～２０質量％の血清を含む、最小必須培地（以下、「ＭＥＭ」と称することがある）、ダルベッコ変法イーグル培地（以下、「ＤＭＥＭ」と称することがある）、ＲＰＭＩ１６４０培地、１９９培地、Ｆ１２培地などが挙げられる。
　また、前記分化誘導成分を含有する培地は、すでに市販されているものもあり、当該市販の培地を使用することもできる。
　工程（ｂ）の培養条件としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、培養温度は約３７℃、ＣＯ２濃度は約２％～５％などが挙げられる。
　工程（ｂ）の培養により、目的体細胞が得られているか否かは、それぞれの目的体細胞の既知のマーカーなどを検出することにより確認することができる。
　これらのマーカーのうち、タンパク質の発現を確認する方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、免疫染色により確認することができる。
　また、遺伝子の発現を確認する方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、定量ＰＣＲにより確認することができる。
　本発明の体細胞から他の体細胞への直接分化転換方法の第二の態様は、次の工程（ｃ）並びに（ｄ）を含むことを特徴とする。
（ｃ）ＧＬＩＳファミリー遺伝子、変異ＧＬＩＳファミリー遺伝子又はそれらの遺伝子産物と、転写因子とを体細胞に導入する工程、
（ｄ）当該遺伝子導入体細胞を、他の体細胞の増殖因子を含有する培地で培養する工程。
　第二の態様の工程（ｃ）は、ＧＬＩＳファミリー遺伝子等に加えて、転写因子を体細胞に導入する以外は、前記の工程（ａ）と同様である。
　用いられる転写因子は、目的体細胞の分化誘導に関与することが知られている転写因子が好ましい。そのような転写因子としては、例えば心筋細胞であれば、Ｔｂｘ４、ＧＡＴＡ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｈａｎｄ２などを用いることができる。肝細胞であれば、ＨＮＦ４ａ、ＦＯＸＡ３、ＨＮＦ１ａ、ＧＡＴＡ４、ＴＣＦ-１、ＳＡＬＬ４、ＴＧＩＦ１、ＭＡＢ２１Ｌ３、ＺＩＣ１、ＥＧＦＬＡＭ、ＰＩＴＸ２、ＮＲＦ１、ＺＮＦ２８１、ＣＴＣＦＬ、ＴＰ７３、ＴＦＥ３、ＤＬＸ６、ＴＣＦ４などを用いることができる。神経細胞であれば、ＮＥＵＲＯＧ１、ＮＥＵＲＯＧ２、ＮＥＵＲＯＧ３、ＮＥＵＲＯＤ１、ＮＥＵＲＯＤ２などを用いることができる。アストロサイトであれば、Ｎｆｉａ、Ｎｆｉｂ、Ｓｏｘ９などを用いることができる。
　これらの転写因子の体細胞への導入方法は、前記ＧＬＩＳ遺伝子の導入方法と同様である。
　第二の態様の工程（ｄ）に用いる増殖因子は、他の体細胞の増殖因子であり、公知のものを使用することができる。例えば、心筋細胞の増殖因子としては、ＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＢＭＰ、ＥＧＦ、Ｎｒｇ、ＴＧＦ、ＰＧＦ、ＰＤＧＦ等が挙げられる。肝細胞の増殖因子としては、ＨＧＦ、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＩＧＦ等が挙げられる。神経細胞およびグリア細胞の増殖因子としては、ＮＧＦ、ＥＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ、ＨＧＦ、ＧＤＮＦ、ＦＧＦ、ＬＩＦ、ＨＩＦ、ＰＤＧＦ、Ｍ－ＣＳＦ、ＩＧＦ、ＶＥＧＦ、ＢＭＰ等が挙げられる。骨細胞の増殖因子としては、Ｍ－ＣＳＦ、ＢＭＰ、ＴＧＦβ、ＲＡＮＫＬ、ＦＧＦなどが挙げられる。これらの増殖因子は、１種又は２種以上を組み合わせて使用することができる。
　第二の態様の工程（ｄ）の培養は、前記前記第一の態様の工程（ｂ）と同様にして行うことができる。
　本発明の体細胞から他の体細胞への直接分化転換による製造方法によれば、分化転換により、体細胞から他の体細胞を直接製造することができるため、腫瘍形成のリスクを有するｉＰＳ細胞を経ずに所望の体細胞を製造することができる点で、有利である。 
　なお、前記直接分化転換とは、ある体細胞から他の体細胞へ、幹細胞を経ずに直接変換することをいう。
　また、本発明の体細胞から他の体細胞への直接分化転換による製造方法は、体細胞に遺伝子又はその遺伝子産物を導入し、その遺伝子導入細胞を増殖因子又は分化誘導成分含有培地で培養するという簡便で、且つ再現が容易な方法でありながら、所望の体細胞を短期間で、効率良く生産することができる。
　本発明の他の態様としては、ＧＬＩＳファミリー遺伝子、変異ＧＬＩＳファミリー遺伝子又はそれらの遺伝子産物を含有する、体細胞から他の体細胞への直接分化転換促進剤を挙げることができる。
　すなわち、前記のように、ＧＬＩＳファミリー遺伝子、変異ＧＬＩＳファミリー遺伝子又はそれらの遺伝子産物が、単独で、体細胞から他の体細胞への直接分化転換を促進させる機能を有することは全く知られていなかったことである。
　ＧＬＩＳファミリー遺伝子、変異ＧＬＩＳファミリー遺伝子又はそれらの遺伝子産物としては、前記と同様のものが用いられ、前記と同様のものが好ましい。
　本発明の直接分化転換促進剤は、体細胞が、線維芽細胞又は間葉系幹細胞であり、他の体細胞が、脂肪細胞、神経細胞、心筋細胞、肝細胞、骨細胞及び血球細胞から選ばれる細胞である場合に特に有用である。また、本発明の直接分化転換剤の使用方法も、前記と同様である。
　本発明の直接分化転換剤は、前記のように体細胞又は体細胞前駆細胞から他の体細胞への分化誘導成分と併用して用いられるから、体細胞他の態様としては、ＧＬＩＳファミリー遺伝子、変異ＧＬＩＳファミリー遺伝子又はそれらの遺伝子産物と、体細胞から他の体細胞への分化誘導成分とを含有する、体細胞から他の体細胞への直接分化転換剤が挙げられる。また、ＧＬＩＳファミリー遺伝子、変異ＧＬＩＳファミリー遺伝子又はそれらの遺伝子産物と、転写因子と、他の体細胞の増殖因子とを含有する、体細胞から他の体細胞への直接分化転換剤も挙げることができる。
　ここで、ＧＬＩＳファミリー遺伝子、変異ＧＬＩＳファミリー遺伝子又はそれらの遺伝子産物としては、前記と同様のものが用いられ、前記と同様のものが好ましい。
　本発明の直接分化転換促進剤は、体細胞が、線維芽細胞又は間葉系幹細胞であり、他の体細胞が、脂肪細胞、神経細胞、心筋細胞、肝細胞、骨細胞及び血球細胞から選ばれる細胞である場合に特に有用である。また、本発明の直接分化転換剤の使用方法も、前記と同様である。
　本発明の直接分化転換剤は、前記各遺伝子又はその遺伝子産物が、個別の容器に分けられている態様であってもよいし、１つの容器にまとめられている態様であってもよいし、任意の数ごとに容器にまとめられている態様であってもよい。この直接分化転換剤は、体細胞製造用キットとして、好適に用いることができる。この体細胞製造用キットは、前記直接分化転換剤を少なくとも含み、更に必要に応じてその他の成分を含んでいてもよい。
　次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
実施例１
　ＧＬＩＳファミリー遺伝子が様々な細胞への分化誘導効率に及ぼす影響を検証するために、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ＭＳＣ）にレンチウイルスベクターを用いてＧＬＩＳ１遺伝子を導入し、各細胞種への分化誘導実験を行った。
（１）レンチウイルスを作成するために、１０％　ＦＢＳ、１％　ペニシリン／ストレプトマイシン、ＤＭＥＭ培地１０ｍＬ中で培養していたＨＥＫ２９３ＦＴ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を６０ｍｍ培養皿（ＴＰＰ社）に対して２×１０６個の細胞数で播種し、抗生物質不含有培地４ｍＬ中で培養した。播種１６時間後にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ社）を用いてＧＬＩＳ１遺伝子を搭載した各プラスミドを導入し、遺伝子導入２４時間後に３ｍＬの抗生物質含有培地に置換、４８時間後に培地上清の回収を行った。ウイルス液回収時には０．４５ｍｍ　ｐｏｒｅ　ｓｉｚｅ　ｆｉｌｔｅｒ（Ｗｈａｔｍａｎ社）を用いてろ過後に最終濃度８μｇ／ｍＬ　Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ溶液を添加した。
（２）ＭＳＣ（ヒト骨髄由来間葉系幹細胞、Ｌｏｎｚａ社）は、１０％　ＦＢＳ，１％　ペニシリン／ストレプトマイシン、ＤＭＥＭ培地１０ｍＬ中で培養し、レンチウイルス感染２４時間前に２４ｗｅｌｌ培養プレート（ＴＰＰ社）に１×１０４個／ｗｅｌｌの細胞数で播種した。播種２４時間後に培養上清を完全に除去後、前述のレンチウイルス液３００μＬを添加し、３７℃、５％　ＣＯ２インキュベーター内で培養した。ウイルス液添加２４時間後に各細胞種特異的な分化誘導培地（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社）３００μＬに置換し、置換後は２－３日毎に培地交換を行った。分化誘導開始７、１４、２１日後にサンプルを固定後に免疫細胞化学法を行い、蛍光顕微鏡を用いて観察した。
（３）分化誘導培地として、間葉系幹細胞から神経細胞への分化誘導成分（ＥＧＦ及びＦＧＦ－２）含有する培地を用いた。神経細胞の検出は、Ｔｕｊ－１神経マーカー陽性細胞、軸索様の突起を伸長していること、ＭＳＣと比較して核が顕著に縮小していることを基準に行った。結果を図１及び図２に示す。
実施例２
　変異ＧＬＩＳファミリー遺伝子が様々な細胞への分化誘導効率に及ぼす影響を検証するために、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ＭＳＣ）にレンチウイルスベクターを用いて変異ＧＬＩＳ１遺伝子を導入し、各細胞種への分化誘導実験を行った。
（１）レンチウイルスを作成するために、１０％　ＦＢＳ、１％　ペニシリン／ストレプトマイシン、ＤＭＥＭ培地１０ｍＬ中で培養していたＨＥＫ２９３ＦＴ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を６０ｍｍ培養皿（ＴＰＰ社）に対して２×１０６個の細胞数で播種し、抗生物質不含有培地４ｍＬ中で培養した。播種１６時間後にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ社）を用いて変異ＧＬＩＳ１遺伝子（配列番号：２）を搭載した各プラスミドを導入し、遺伝子導入２４時間後に３ｍＬの抗生物質含有培地に置換、４８時間後に培地上清の回収を行った。ウイルス液回収時には０．４５ｍｍ　ｐｏｒｅ　ｓｉｚｅ　ｆｉｌｔｅｒ（Ｗｈａｔｍａｎ社）を用いてろ過後に最終濃度８ｕｇ／ｍＬ　Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ溶液を添加した。
（２）ＭＳＣ（ヒト骨髄由来間葉系幹細胞、Ｌｏｎｚａ社）は、１０％　ＦＢＳ，１％　ペニシリン／ストレプトマイシン、ＤＭＥＭ培地１０ｍＬ中で培養し、レンチウイルス感染２４時間前に２４ｗｅｌｌ培養プレート（ＴＰＰ社）に１×１０４個／ｗｅｌｌの細胞数で播種した。播種２４時間後に培養上清を完全に除去後、前述のレンチウイルス液３００μＬを添加し、３７℃、５％　ＣＯ２インキュベーター内で培養した。ウイルス液添加２４時間後に各細胞種特異的な分化誘導培地（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ａｄｉｐｏｇｅｎｉｃ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　Ｍｅｄｉｕｍ　２（Ｒｅａｄｙ－ｔｏ－ｕｓｅ）もしくはＭｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｃ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｒｅａｄｙ－ｔｏ－ｕｓｅ），Ｃ－２８０１６，ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社）３００μＬに置換し、置換後は２－３日毎に培地交換を行った。分化誘導開始７、１４、２１日後にサンプルを固定後に免疫細胞化学法を行い、蛍光顕微鏡を用いて観察した。
（３）分化誘導培地として、間葉系幹細胞から神経細胞への分化誘導成分を含有する培地（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｃ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏ　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｒｅａｄｙ－ｔｏ－ｕｓｅ），Ｃ－２８０１５，ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社）を用いた。神経細胞の検出は、Ｔｕｊ－１神経マーカー陽性細胞、軸索様の突起を伸長していること、ＭＳＣと比較して核が顕著に縮小していることを基準に行った。結果を図１及び図２に示す。
実施例３
　エストロゲン受容体拮抗剤の添加効果を検討した。
（１）レンチウイルスを作成するために、１０％　ＦＢＳ、１％　ペニシリン／ストレプトマイシン、ＤＭＥＭ培地１０ｍＬ中で培養していたＨＥＫ２９３ＦＴ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を６０ｍｍ培養皿（ＴＰＰ社）に対して２×１０６個の細胞数で播種し、抗生物質不含有培地４ｍＬ中で培養した。播種１６時間後にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ社）を用いてＧＬＩＳ１遺伝子又は変異ＧＬＩＳ１遺伝子（配列番号：２）を搭載した各プラスミドを導入し、遺伝子導入２４時間後に３ｍＬの抗生物質含有培地に置換、４８時間後に培地上清の回収を行った。ウイルス液回収時には０．４５ｍｍ　ｐｏｒｅ　ｓｉｚｅ　ｆｉｌｔｅｒ（Ｗｈａｔｍａｎ社）を用いてろ過後に最終濃度８ｕｇ／ｍＬ　Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ溶液を添加した。
（２）ＭＳＣ（間葉系幹細胞、Ｌｏｎｚａ社）は、１０％　ＦＢＳ，１％　ペニシリン／ストレプトマイシン、ＤＭＥＭ培地１０ｍＬ中で培養し、レンチウイルス感染２４時間前に２４ｗｅｌｌ培養プレート（ＴＰＰ社）に１×１０４個／ｗｅｌｌの細胞数で播種した。播種２４時間後に培養上清を完全に除去後、前述のレンチウイルス液３００μＬを添加し、３７℃　５％　ＣＯ２インキュベーター内で培養した。ウイルス液添加２４時間後に、エストロゲン受容体拮抗剤（タモキシフェン）及び各細胞種特異的な分化誘導培地（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社）３００μＬに置換し、置換後は２－３日毎に培地交換を行った。分化誘導開始７、１４、２１日後にサンプルを固定後に免疫細胞化学法を行い、蛍光顕微鏡を用いて観察した。
（３）分化誘導培地として、間葉系幹細胞から神経細胞への分化誘導成分を含有する培地（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｃ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｒｅａｄｙ－ｔｏ－ｕｓｅ），Ｃ－２８０１５，ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社）を用いた。神経細胞の検出は、Ｔｕｊ－１神経マーカー陽性細胞、軸索様の突起を伸長していること、ＭＳＣと比較して核が顕著に縮小していることを基準に行った。結果を図１及び図２に示す。
実施例４
（線維芽細胞から脂肪細胞への直接分化転換方法）
　ＭＳＣ（ヒト骨髄由来間葉系幹細胞、Ｌｏｎｚａ社）は、１０％　ＦＢＳ，１％　ペニシリン／ストレプトマイシン、ＤＭＥＭ培地１０ｍＬ中で培養し、レンチウイルス感染２４時間前に２４ｗｅｌｌ培養プレート（ＴＰＰ社）に１×１０４個／ｗｅｌｌの細胞数で播種した。播種２４時間後に培養上清を完全に除去後、前述のレンチウイルス液３００μＬを添加し、３７℃　５％　ＣＯ２　インキュベーター内で培養した。ウイルス液添加２４時間後に各細胞種特異的な分化誘導培地（間葉系幹細胞脂肪細胞分化培地２：Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ａｄｉｐｏｇｅｎｉｃ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　Ｍｅｄｉｕｍ　２（Ｒｅａｄｙ－ｔｏ－ｕｓｅ），Ｃ－２８０１６，ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社）３００μＬに置換し、置換後は２－３日毎に培地交換を行った。分化誘導開始７、１４、２１日後にサンプルを固定後に免疫細胞化学法を行い、蛍光顕微鏡を用いて観察した。結果を図３及び図４に示す。
実施例５
　（ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を用いた神経細胞、脂肪細胞、骨細胞への直接分化転換方法（定量的ＰＣＲによる確認）
　全長及びＮ末欠損ＧＬＩＳ１遺伝子が様々な細胞への分化効率に及ぼす影響を検証するために、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ＭＳＣ)にレンチウイルスベクターを用いて各ＧＬＩＳ１遺伝子を導入し、各細胞種への分化誘導実験を行った。
　レンチウイルスを作成するにあたり、１０％　ＦＢＳ．１％　ペニシリン／ストレプトマイシン、ＤＭＥＭ培地１０ｍＬ中で培養していたＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を６０ｍｍ培養皿（ＴＰＰ社）に対して２×１０６個の細胞数で播種し、抗生物質不含有培地４ｍＬ中で培養した。播種１６時間後にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）を用いて全長又はＮ末欠損ＧＬＩＳ１遺伝子を搭載した各プラスミドを導入し、遺伝子導入２４時間後に７ｍＬの抗生物質含有培地に置換、４８時間後に培地上清の回収を行った。ウイルス液回収時には０．４５ｍｍ　ｐｏｒｅｓｉｚｅｆｉｌｔｅｒ（Ｗｈａｔｍａｎ社）を用いてろ過後に最終濃度８ｕｇ／ｍＬ　Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ溶液を添加した。
　ＭＳＣ（Ｌｏｎｚａ社）は、１０％　ＦＢＳ，１％　ペニシリン／ストレプトマイシン，ＤＭＥＭ培地１０ｍＬ中で培養し、レンチウイルス感染２４時間前に２４ｗｅｌｌ培養プレート（ＴＰＰ社）に１×１０４個／ｗｅｌｌの細胞数で播種した。播種２４時間後に培養上清を完全に除去後、前述のレンチウイルス液３００ｕＬを添加し、３７℃　５％　ＣＯ２インキュベーター内で培養した。ウイルス液添加２４時間後に各細胞種特異的な分化誘導培地（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社）３００ｕＬに置換し、置換後は２－３日毎に培地交換を行った。分化誘導開始７、１４、２１日後に細胞を回収し、定量的ＰＣＲ法を用いて各細胞に特異的なマーカーの遺伝子発現の変化を検討した。
　前記の試験の定量的ＰＣＲに用いたプライマー（分化誘導成分と目的体細胞のマーカー）を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　ＧＬＩＳ１を用いた神経細胞への直接分化転換効果を図５に示す。ヒト骨髄由来ＭＳＣにＧＬＩＳ１遺伝子を導入し、次いで神経細胞分化誘導培地（ＡｓｃＩ１、Ｂｒｎ２、Ｍｙｔ１Ｉ）を用いて２週間培養した後の神経細胞マーカー（ＴＵＢＢ３）及び分化誘導成分（Ｂｒｎ２）の発現量が有意に増加していた。
　ＧＬＩＳ１を用いた脂肪細胞への直接分化転換効果を図６に示す。ヒト骨髄由来ＭＳＣにＧＬＩＳ１遺伝子を導入し、次いで脂肪細胞分化誘導培地（ＰＰＡＲγ）を用いて２週間培養した後の脂肪細胞マーカー（ＦＡＢＰ４）及び分化誘導成分（ＰＰＡＲγ）の発現量が有意に増加していた。
　ＧＬＩＳ１を用いた骨細胞への直接分化転換効果を図７に示す。ヒト骨髄由来ＭＳＣにＧＬＩＳ１遺伝子を導入し、次いで骨細胞分化誘導培地（ＡＬＰ）を用いて２週間培養した後の骨細胞マーカー（ＢＧＬＡＰ）及び分化誘導成分（ＡＬＰ）の発現量が有意に増加していた。
実施例６
（ＧＬＩＳ１遺伝子及び転写因子導入による線維芽細胞から心筋細胞への直接分化転換方法）
　全長及びＮ末欠損ＧＬＩＳ１遺伝子が様々な細胞への分化効率に及ぼす影響を検証するために、マウス胎児由来線維芽細胞（ＭＥＦ）に対してレンチウイルスベクター、レトロウイルスベクターを用いて心筋細胞転写因子と全長又はＮ末欠損ＧＬＩＳ１遺伝子を導入し、心筋細胞への分化誘導実験を行った。
　各遺伝子導入用ウイルスを作成するにあたり、１０％　ＦＢＳ．１％　ペニシリン／ストレプトマイシン，ＤＭＥＭ培地１０ｍＬ中で培養していたＨＥＫ２９３ＦＴ細胞もしくはＰｌａｔ－Ｅ細胞を１００ｍｍ培養皿（ＴＰＰ社）に対して２×１０６個の細胞数で播種し、抗生物質不含有培地７ｍＬ中で培養した。播種１６時間後にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）を用いて、心筋細胞転写因子及び全長又はＮ末欠損ＧＬＩＳ１遺伝子を搭載した各プラスミドを導入し、遺伝子導入２４時間後に７ｍＬの抗生物質含有培地に置換、４８時間後に培地上清の回収を行った。ウイルス液回収時には、４００ｘｇ　１０ｍｉｎの遠心後に上清を回収し、４５ｍｍ　ｐｏｒｅｓｉｚｅｆｉｌｔｅｒ（Ｗｈａｔｍａｎ社）を用いてろ過後に最終濃度８ｕｇ／ｍＬ　Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ溶液を添加した。
　ＭＥＦは、１０％　ＦＢＳ，１％　ペニシリン／ストレプトマイシン，ＤＭＥＭ培地１０ｍＬ中で培養し、ウイルス感染２４時間前にファイブロネクチンコートを施した２４ｗｅｌｌ培養プレート（ＴＰＰ社）に５×１０４個／ｗｅｌｌの細胞数で播種した。播種２４時間後に培養上清を完全に除去後、前述の各ウイルス液５００ｕＬを添加し、３７℃　５％　ＣＯ２インキュベーター内で培養した。ウイルス液添加２４時間後、心筋細胞分化誘導培地５００ｕＬに置換し、置換後は２－３日毎に培地交換を行った。分化誘導開始０，１，４，７，１４，２１，２８日後に細胞を回収し、経時的な顕微鏡観察を行うと共に、定量的ＰＣＲ法を用いて各細胞に特異的なマーカーの遺伝子発現の変化を検討した。
　実施例６～８に使用したプラスミドを表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　実施例６～８で定量的ＰＣＲに使用したプライマー（転写因子と目的体細胞のマーカー）を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　実施例６で使用した増殖因子含有培地は、以下のとおりである。
基本培地：ＳｔｅｍＰｒｏ－３４　ＳＦ　ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ，１０６３９－０１１）
添加試薬・サイトカイン：Ｇｌｕｔａ　ＭＡＸ（１０μＬ／ｍＬ，Ｇｉｂｃｏ，３５０５０－０６１）
Ａｓｃｏｒｂｉｃ　ａｃｉｄ（５０μｇ／ｍＬ，Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ，Ａ－４５４４）
Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｈｕｍａｎ　ＶＥＧＦ　１６５（５ｎｇ／ｍＬ，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）
Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｈｕｍａｎ　ＦＧＦ　ｂａｓｉｃ　１４６　ａａ（１０ｎｇ／ｍＬ，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）
Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｈｕｍａｎ　ＦＧＦ　１０（５０ｎｇ／ｍＬ，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）
　ＧＬＩＳ１及び心筋細胞転写因子（Ｔｂｘ５、Ｍｅｆ２ｃ、ＧＡＴＡ４）を用いた心筋細胞への直接分化転換効果を図８に示す。マウス胎児由来線維芽細胞（Ｐ２－３）にＧＬＩＳ１遺伝子及び心筋細胞転写因子（Ｔｂｘ５、Ｍｅｆ２ｃ、ＧＡＴＡ４）を導入し、ついで心筋細胞増殖因子含有培地で１０日間培養した後に転写因子（Ｔｂｘ５）の発現が確認されると共に、心筋細胞マーカー（Ｓａｌｌ１）の発現量は有意に増加していた。
　ＧＬＩＳ１及び心筋細胞転写因子（Ｔｂｘ５、Ｍｅｆ２ｃ、ＧＡＴＡ４、Ｈａｎｄ２）を用いた心筋細胞への直接分化転換効果を図９に示す。マウス胎児由来線維芽細胞（Ｐ２－３）にＧＬＩＳ１遺伝子及び心筋細胞転写因子（Ｔｂｘ５、Ｍｅｆ２ｃ、ＧＡＴＡ４、Ｈａｎｄ２）を導入し、ついで心筋細胞増殖因子含有培地で２週間培養した後に心筋細胞転写因子（Ｔｂｘ５）の発現が確認されると共に、心筋細胞マーカー（ｃＴｎＴ）の発現量は有意に増加していた。
実施例７
（ＧＬＩＳ１遺伝子及び転写因子導入による線維芽細胞から肝細胞への直接分化転換方法）
　全長及びＮ末欠損ＧＬＩＳ１が様々な細胞への分化効率に及ぼす影響を検証するために、マウス胎児由来線維芽細胞(MEF)に対してレンチウイルスベクター、レトロウイルスベクターを用いて、肝細胞転写因子と全長又はＮ末欠損ＧＬＩＳ１遺伝子を導入し、肝細胞への分化誘導実験を行った。
　各遺伝子導入用ウイルスを作成するにあたり、１０％　ＦＢＳ．１％　ペニシリン／ストレプトマイシン，ＤＭＥＭ培地１０ｍＬ中で培養していたＨＥＫ２９３ＦＴ細胞もしくはＰｌａｔ－Ｅ細胞を１００ｍｍ培養皿（ＴＰＰ社）に対して２×１０６個の細胞数で播種し、抗生物質不含有培地７ｍＬ中で培養した。播種１６時間後にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）を用いて、肝細胞転写因子（ＧＡＴＡ４）又は全長もしくはＮ末欠損ＧＬＩＳ１遺伝子遺伝子を搭載した各プラスミドを導入し、遺伝子導入２４時間後に７ｍＬの抗生物質含有培地に置換、４８時間後に培地上清の回収を行った。ウイルス液回収時には、４００ｘｇ　１０ｍｉｎの遠心後に上清を回収し、４５ｍｍ　ｐｏｒｅｓｉｚｅｆｉｌｔｅｒ（Ｗｈａｔｍａｎ社）を用いてろ過後に最終濃度８ｕｇ／ｍＬ　Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ溶液を添加した。
　ＭＥＦは、１０％　ＦＢＳ，１％　ペニシリン／ストレプトマイシン，ＤＭＥＭ培地１０ｍＬ中で培養し、ウイルス感染２４時間前にゼラチンコートを施した２４ｗｅｌｌ培養プレート（ＴＰＰ社）に４．５×１０４個／ｗｅｌｌの細胞数で播種した。播種２４時間後に培養上清を完全に除去後、前述の各ウイルス液５００ｕＬを添加し、３７℃　５％　ＣＯ２インキュベーター内で培養した。ウイルス液添加２４時間後、肝細胞用培地（１）５００ｕＬに置換した。分化誘導７日目にコラーゲンＩコートを施した１２ｗｅｌｌ培養プレートに再播種し、肝細胞用培地（２）を用いて培養を続けた。分化誘導中は、２－３日毎に培地交換を行い、分化誘導開始０、１、４、７、１４、２１、２８日後に細胞を回収し、経時的な顕微鏡観察を行うと共に、定量的ＰＣＲ法を用いて各細胞に特異的なマーカーの遺伝子発現の変化を検討した。
肝細胞用培地（１）（分化誘導１－７日）
　　基本培地：ＤＭＥＭ／Ｆ１２　ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ社）
　　添加試薬・サイトカイン：ＦＢＳ（８％，Ｇｉｂｃｏ）
　　Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（１％，ＮａｃａｌａｉＴｅｓｑｕｅ）
　　ＧｌｕｔａＭＡＸ（１０μＬ／ｍＬ，Ｇｉｂｃｏ，３５０５０－０６１）
　　Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ（１０ｍＭ，Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ）
　　Ｉｎｓｕｌｉｎ（１ｕｇ／ｍＬ，Ｗａｋｏ）
　　β－ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ（５０μＭ，　Ｎａｃａｌａｉ　Ｔｅｓｑｕｅ）
　　Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ（０．１ｕＭ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）肝細胞用培地（２）（分化誘導７日以降）
　　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｈｕｍａｎ　ＨＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）
　　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｈｕｍａｎ　ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）
　ＧＬＩＳ１（全長及びＮ末欠損ＧＬＩＳ１遺伝子）及び肝細胞転写因子（ＧＡＴＡ４）を用いた肝細胞への直接分化転換効果を図１０に示す。マウス胎児由来線維芽細胞（Ｐ２－３）にＧＬＩＳ１遺伝子及び肝細胞転写因子（ＧＡＴＡ４）を導入し、ついで肝細胞増殖因子含有培地で２週間培養した後に肝細胞転写因子（ＧＡＴＡ４）の発現が確認されると共に、肝細胞マーカー（ＭＡＯＡ）の発現量は有意に増加していた。
実施例８
　（ＧＬＩＳ１遺伝子及び転写因子導入による線維芽細胞からアストロサイトへの直接分化転換方法）
　全長及びＮ末欠損ＧＬＩＳ１遺伝子が様々な細胞への分化効率に及ぼす影響を検証するために、マウス胎児由来線維芽細胞（ＭＥＦ）に対してレトロウイルスベクターを用いてアストロサイト転写因子と全長又はＮ末欠損ＧＬＩＳ１遺伝子を導入し、アストロサイトへの分化誘導実験を行った。
　各遺伝子導入用ウイルスを作成するにあたり、１０％　ＦＢＳ．１％　ペニシリン／ストレプトマイシン、ＤＭＥＭ培地１０ｍＬ中で培養していたＰｌａｔ－Ｅ細胞を１００ｍｍ培養皿（ＴＰＰ社）に対して２×１０６個の細胞数で播種し、抗生物質不含有培地７ｍＬ中で培養した。播種１６時間後にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ社）を用いて、全長又はＮ末欠損ＧＬＩＳ１遺伝子とアストロサイト転写因子（ＮＦＩＡ）を搭載した各プラスミドを導入し、遺伝子導入２４時間後に７ｍＬの抗生物質含有培地に置換、４８時間後に培地上清の回収を行った。ウイルス液回収時には、４００ｘｇ　１０ｍｉｎの遠心後に上清を回収し、４５ｍｍ　ｐｏｒｅｓｉｚｅｆｉｌｔｅｒ（Ｗｈａｔｍａｎ社）を用いてろ過後に最終濃度８ｕｇ／ｍＬ　Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ用液を添加した。
　ＭＥＦは、１０％　ＦＢＳ，１％　ペニシリン／ストレプトマイシン，ＤＭＥＭ培地ｘｍＬ中で培養し、ウイルス感染２４時間前にゼラチンコートを施した２４ｗｅｌｌ培養プレート（ＴＰＰ社）に５×１０４個／ｗｅｌｌの細胞数で播種した。播種２４時間後に培養上清を完全に除去後、前述の各ウイルス液５００ｕＬを添加し、３７℃　５％　ＣＯ２インキュベーター内で培養した。ウイルス液添加２４時間後、アストロサイト用培地５００ｕＬに置換し、置換後は２－３日毎に培地交換を行った。分化誘導開始０，１，４，７，１４，２１日後に細胞を回収し、経時的な顕微鏡観察を行うと共に、定量的ＰＣＲ法を用いて各細胞に特異的なマーカーの遺伝子発現の変化を検討した。
アストロサイト用培地
　　基本培地：ＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ社）
　　添加試薬・サイトカイン：ＦＢＳ（１０％，Ｇｉｂｃｏ）
　　Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ１％，Ｎａｃａｌａｉ　Ｔｅｓｑｕｅ）
　　β－ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ（１００μＭ，Ｎａｃａｌａｉ　Ｔｅｓｑｕｅ）
　ＧＬＩＳ１（全長及びＮ末欠損ＧＬＩＳ１遺伝子）及びアストロサイト転写因子（ＮＦＩＡ）を用いたアストロサイトへの直接分化転換効果を図１１に示す。マウス胎児由来線維芽細胞（Ｐ２－３）にＧＬＩＳ１遺伝子及びアストロサイト転写因子（ＮＦＩＡ）を導入し、ついでアストロサイト増殖因子含有培地で２週間培養した後にアストロサイト転写因子（ＮＦＩＡ）の発現が確認されると共に、アストロサイトマーカー（ＧＦＡＰ）の発現量は有意に増加していた。

Claims (14)

  1. （ａ）ＧＬＩＳファミリー遺伝子、変異ＧＬＩＳファミリー遺伝子又はそれらの遺伝子産物を体細胞に導入する工程、並びに
    （ｂ）当該遺伝子導入体細胞を、当該体細胞又は当該体細胞の前駆細胞から他の体細胞への分化誘導成分を含有する培地で培養する工程
    を含むことを特徴とする、当該体細胞から他の体細胞への直接分化転換による製造方法。
  2. （ａ）ＧＬＩＳファミリー遺伝子、変異ＧＬＩＳファミリー遺伝子又はそれらの遺伝子産物と転写因子とを体細胞に導入する工程、並びに
    （ｂ）当該遺伝子導入体細胞を、他の体細胞の増殖因子を含有する培地で培養する工程
    を含むことを特徴とする、当該体細胞から他の体細胞への直接分化転換による製造方法。
  3. 　ＧＬＩＳファミリー遺伝子が、ＧＬＩＳ１遺伝子である請求項１又は２記載の製造方法。
  4. 　変異ＧＬＩＳファミリー遺伝子が、ＧＬＩＳ１タンパク質のＮ末端側の一部のアミノ酸残基が欠失したタンパク質をコードする遺伝子である請求項１又は２記載の製造方法。
  5. 　変異ＧＬＩＳファミリー遺伝子が、ＧＬＩＳ１遺伝子のＮ末端側の１００～３６０アミノ酸残基が欠失したタンパク質をコードする遺伝子である請求項１～４のいずれか１項記載の製造方法。
  6. 　前記体細胞が、線維芽細胞又は間葉系幹細胞である請求項１～５のいずれか１項記載の製造方法。
  7. 　前記他の体細胞が、脂肪細胞、神経細胞、心筋細胞、肝細胞、骨細胞及び血球細胞から選ばれる請求項１～６のいずれか１項記載の製造方法。
  8. 　請求項１～７のいずれか１項記載の製造方法により製造された体細胞。
  9. 　体細胞が、脂肪細胞、神経細胞、心筋細胞、肝細胞、骨細胞及び血球細胞から選ばれる細胞である請求項８記載の体細胞。
  10. 　ＧＬＩＳファミリー遺伝子、変異ＧＬＩＳファミリー遺伝子又はそれらの遺伝子産物を含有する、体細胞から他の体細胞への直接分化転換促進剤。
  11. 　体細胞が、線維芽細胞又は間葉系幹細胞であり、他の体細胞が、脂肪細胞、神経細胞、心筋細胞、肝細胞、骨細胞及び血球細胞から選ばれる細胞である、請求項１０記載の体細胞から他の体細胞への直接分化転換促進剤。
  12. 　ＧＬＩＳファミリー遺伝子、変異ＧＬＩＳファミリー遺伝子又はそれらの遺伝子産物と、体細胞から他の体細胞への分化誘導成分とを含有する、体細胞から他の体細胞への直接分化転換剤。
  13. 　ＧＬＩＳファミリー遺伝子、変異ＧＬＩＳファミリー遺伝子又はそれらの遺伝子産物と、転写因子と、他の体細胞の増殖因子とを含有する、体細胞から他の体細胞への直接分化転換剤。
  14. 　体細胞が、線維芽細胞又は間葉系幹細胞であり、他の体細胞が、脂肪細胞、神経細胞、心筋細胞、肝細胞、骨細胞及び血球細胞から選ばれる細胞である、請求項１２又は１３記載の体細胞から他の体細胞への直接分化転換剤。
     
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