JP2018104424A

JP2018104424A - 認知機能改善剤

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Publication number: JP2018104424A
Application number: JP2017248669A
Authority: JP
Inventors: 史明岡原; Fumiaki Okahara; 義隆古賀; Yoshitaka Koga; 卓也森; Takuya Mori
Original assignee: Kao Corp
Current assignee: Kao Corp
Priority date: 2016-12-26
Filing date: 2017-12-26
Publication date: 2018-07-05
Anticipated expiration: 2037-12-26
Also published as: US20190330333A1; JP7165496B2; WO2018124010A1; US11555069B2; CN110087686A; EP3569248A1; EP3569248B1; EP3569248A4

Abstract

【課題】記憶、学習能力等の認知機能の改善に有効な認知機能改善剤、当該認知機能改善剤の評価又は選択方法の提供。
【解決手段】ＧＩＰ機能阻害剤を有効成分とする認知機能改善剤。
【選択図】なし

Description

本発明は、認知機能改善剤に関する。

近年、総人口に対する高齢者の比率が上昇し、加齢に伴う記憶、学習能力の低下や、さらには疾病としての認知症の増加が問題になっている。認知症の原因疾患としては、アルツハイマー病に代表される脳変性疾患、脳梗塞や脳出血等による脳血管障害、脳腫瘍、頭部外傷、感染症、代謝性疾患等が挙げられる。特に、高齢化の進展に伴って患者数が著しく増加しているのはアルツハイマー病である。アルツハイマー病は、急激な短期の記銘力、記憶力の低下、人格障害等を引き起こすことから、介護の面から社会問題になっている。

アルツハイマー病は、脳組織の萎縮や脱落などを伴い、神経伝達物質であるアセチルコリンの減少が起こる。その発症メカニズムは未だ解明されていないが、大脳皮質や海馬に出現する老人斑や神経原繊維変化があり、老人斑の中心に存在するアミロイドβ蛋白質と神経原繊維変化の構成蛋白質であるタウ蛋白質の両面から研究が進められている。
従来、認知症、アルツハイマー型の認知症の治療には、アセチルコリンエステラーゼ阻害薬が使用されているが、認知症を根本的に治療するものではなく、十分な効果を上げているとは未だ言い難い。

一方、ＧＩＰ(gastric inhibitory polypeptide又はglucose-dependent insulinotropic polypeptide）は、グルカゴン・セクレチンファミリーに属する消化管ホルモンの１つである。ＧＩＰはＧＬＰ−１（グルカゴン様ペプチド１）と共にインクレチンと称され、脂質や糖質の摂食時に小腸に存在するＫ細胞より分泌される。
ＧＩＰは、膵β細胞からのインスリン分泌を促進し、インスリン存在下でのグルコースの脂肪細胞への取り込みを亢進することが知られている。そのため、ＧＩＰの作用が肥満の一要因になっているとも考えられ、実際、ＧＩＰの機能を阻害すると、肥満が抑制されるとの報告がある（非特許文献１）。

さらに、ＧＩＰはインスリン抵抗性の一因となることが報告されている（非特許文献１）。インスリン抵抗性を発症すると、インスリンによる糖の吸収作用が低下し、その結果、高インスリン血症を引き起こす。高インスリン血症は、肥満をはじめとする様々な生活習慣病の発症につながる根本的な原因であるとも言われており、インスリン抵抗性の予防・改善は生活習慣病のリスク軽減の面からも重要である。

しかしながら、ＧＩＰと認知機能が関係するという報告なく、血中ＧＩＰ濃度を減少させることにより、認知機能が改善できることは全く知られていない。

Miyawaki Kら、Nat Med．8(7)：738-42，2002

本発明は、記憶、学習能力等の認知機能の改善に有効な認知機能改善剤、及び当該認知機能改善剤の評価又は選択方法を提供することに関する。

本発明者らは、ＧＩＰと認知機能との関係について検討したところ、ＧＩＰを投与した場合に短期及び長期の記憶能力又は学習能力が低下すること、そしてＧＩＰ機能を抑制することによって、認知機能が改善できること、またＧＩＰ機能阻害活性を評価することにより認知機能改善剤をスクリーニングできることを見出した。

すなわち、本発明は、以下の１）〜２）に係るものである。
１）ＧＩＰ機能阻害剤を有効成分とする認知機能改善剤。
２）下記工程を含む認知機能改善剤の評価又は選択方法。
（Ｉ）被験物質のＧＩＰ機能阻害活性を測定する工程
（ＩＩ)（Ｉ）の結果に基づいて被験物質のＧＩＰ機能阻害活性を評価する工程
（ＩＩＩ）ＧＩＰ機能阻害活性を増加又は増強させる被験物質を認知機能改善剤として評価又は選択する工程

本発明の認知機能改善剤は、脳の記憶、学習能力等の認知機能の低下を伴う障害を効果的に改善することができる。

抗活性型ＧＩＰ抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡによる検量線。ＧＩＰ又はＧＩＰ結合型抗ＧＩＰ抗体継続投与による短期の記憶・学習機能変化を示すグラフ。ＧＩＰ又はＧＩＰ結合型抗ＧＩＰ抗体継続投与による長期の記憶・学習機能変化を示すグラフ。血中ＧＩＰ量の加齢性変化を示すグラフ。老齢マウスに対する抗ＧＩＰ抗体継続投与による短期の記憶・学習機能変化を示すグラフ。老齢マウスに対する抗ＧＩＰ抗体継続投与による長期の記憶・学習機能変化を示すグラフ。老齢マウスに対するＧＩＰ分泌抑制剤継続摂取による短期の記憶・学習機能変化を示すグラフ。老齢マウスに対するＧＩＰ分泌抑制剤継続摂取による長期の記憶・学習機能変化を示すグラフ。

本発明において、ＧＩＰ(gastric inhibitory polypeptide又はglucose-dependent insulinotropic polypeptide）は、４２個のアミノ酸からなるポリペプチドである。ＧＩＰ（１−４２）は生理活性を有するが（活性型ＧＩＰ）、生体内に存在するｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌｐｅｐｔｉｄａｓｅ−４（ＤＰＰ−４）によってＮ末端の２アミノ酸が切断されて不活性型のＧＩＰ（３−４２）となる。

本発明において、「ＧＩＰ機能阻害剤」とは、ＧＩＰが有する消化管ホルモンとしての機能を阻害又は抑制する物質、すなわちＧＩＰ遺伝子又はＧＩＰ受容体遺伝子レベルで、あるいはＧＩＰ自体又はＧＩＰ受容体レベルで機能を阻害する物質を意味し、具体的には抗ＧＩＰ抗体、ＧＩＰ受容体拮抗剤、ＧＩＰ分泌又は上昇抑制剤が挙げられる。

本発明において「抗ＧＩＰ抗体」とは、少なくとも活性型ＧＩＰの機能を阻害する抗体であればよく、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであっても良いが、国際公開第２０１６／１０４４３９号、特開２０１３−１３８６３８号公報に記載の、非活性型ＧＩＰとは実質的に結合しない抗体（「抗活性型ＧＩＰ抗体」と称する）であるのが好ましい。また、活性型ＧＩＰとの結合定数（Ｋａ）が１０^７Ｍ^−１以上であるのが好ましく、より好ましくは１０^８Ｍ^−１以上であり、より好ましくは１０^９Ｍ^−１以上である。
抗活性型ＧＩＰ抗体としては、被験抗体の非活性型ＧＩＰに対する結合量が、活性型ＧＩＰに対する結合量を１００％とした場合、多くとも１０％以下、好ましくは５％以下、更に好ましくは１％以下、更により好ましくは０．１％であるものが挙げられる。非活性型ＧＩＰとの結合量は、被験抗体と非活性型ＧＩＰとの結合を、ウエスタンブロッティング、免疫沈降、免疫組織化学染色、及びＥＬＩＳＡ等の方法を用いて測定することにより判断することができる。

抗活性型ＧＩＰ抗体としては、例えば、活性型ＧＩＰ（配列番号５）のＮ末端から８番目以降のアミノ酸を認識する抗体であり、少なくも８〜１０番目（ＳＤＹ）から選ばれる１以上のアミノ酸を認識する抗体が好適に挙げられる。
当該抗活性型ＧＩＰ抗体としては、更に、Ｈ鎖に、下記（１）で表されるアミノ酸配列又はその保存的配列改変からなる領域を含むものが好適である。
ＥＭＮＰＳＤＧＲＴＨＦＮＥ（１）
（１）中のアルファベット文字は、アミノ酸の一文字表記を意味し、配列はＮ末からＣ末方向の順に記載している。ここで、Ｆはフェニルアラニン、Ｔはスレオニン、Ｄはアスパラギン酸、Ｅはグルタミン酸、Ｍはメチオニン、Ｎはアスパラギン、Ｐはプロリン、Ｓはセリン、Ｇはグリシン、Ｒはアルギニン、Ｈはヒスチジンを示す。

本明細書において、「保存的配列改変」とは、抗原決定に関与する相補性決定領域（ＣＤＲ）以外のアミノ酸改変であって、改変前のアミノ酸配列からなる抗体の反応性に有意な影響を及ぼさない又は変化させないアミノ酸改変を意味する。そのような保存的配列改変には、１〜数個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１個のアミノ酸の置換、付加及び欠失が含まれる。当該保存的配列改変がなされたアミノ酸配列としては、改変前のアミノ酸配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、更に好ましくは９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。当該改変は、部位特異的変異誘発及びＰＣＲ媒介変異誘発のような、当技術分野において公知の標準的な技術によって本発明の抗体に導入することができる。保存的アミノ酸置換としては、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基（アミノ酸残基のファミリー）に置換されることが挙げられる。斯かるアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において定義されており、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β−分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が含まれる。

上記（１）で表されるアミノ酸配列は、Ｈ鎖可変領域を示す配列番号２で示されるアミノ酸配列の５０〜６２番目の１３アミノ酸残基からなる領域をコードするものである。
したがって、上記抗活性型ＧＩＰ抗体としては、Ｈ鎖可変領域として配列番号２で示されるアミノ酸配列又はその保存的配列改変からなる領域を含むものであるのがより好ましい。また更に、Ｈ鎖可変領域として配列番号２で示されるアミノ酸配列又はその保存的配列改変からなる領域を含み、且つＬ鎖可変領域として配列番号４で示されるアミノ酸配列又はその保存的配列改変からなる領域を含むものがより好ましい。
Ｈ鎖可変領域として配列番号２で示されるアミノ酸配列からなる領域を含み、且つＬ鎖可変領域として配列番号４で示されるアミノ酸配列からなる領域を含む抗活性型ＧＩＰ抗体としては、後記製造例１に示すハイブリドーマ９Ｂ９Ｈ５−Ｂ９株から産生されるモノクローナル抗体が挙げられる。

本発明の抗ＧＩＰ抗体は、上記反応性を有する限り、当該抗体のフラグメント、例えば、Ｆ（ａｂ'）_２、Ｆ（ａｂ'）、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ＶＨ及びＶＬ中のシステイン残基に置換されたアミノ酸残基がジスルフィド結合を介して結合しているジスルフィド結合Ｆｖ（ｄｓＦｖ）若しくはこれらの重合体、又はｓｃＦｖが二量体化した二量体化Ｖ領域（Ｄｉａｂｏｄｙ）であっても良い。更に、上記反応性を有する限り、抗活性型ＧＩＰ抗体の一部を含むペプチド、すなわち抗体を構成するアミノ酸配列の一部を備えるペプチドであって上記反応性を有するものも当該抗体のフラグメントに含まれる。

また、本発明の抗ＧＩＰ抗体のイムノグロブリンクラスは特に限定されるものではなく、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＹのいずれのイムノグロブリンクラスであってもよく、好ましくはＩｇＧである。また、本発明の抗体はいずれのアイソタイプの抗体をも包含するものである。

また本発明の抗ＧＩＰ抗体は、非ヒト動物の抗体、ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体の何れであっても良い。非ヒト動物の抗体としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等の抗体を挙げることができ、好ましくはマウスの抗体である。
ここで、「ヒト型キメラ抗体」とは、非ヒト動物由来であってＧＩＰと特異的に結合する抗体の定常領域をヒトの抗体と同じ定常領域を有するように遺伝子工学的に改変した抗体のことであり、好ましくは、ヒト・マウス・キメラ抗体である。また、「ヒト化抗体」とは、非ヒト動物由来であってＧＩＰと特異的に結合する抗体のＨ鎖とＬ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）以外の一次構造をヒトの抗体に対応する一次構造に遺伝子工学的に改変した抗体のことである。また、「ヒト抗体」とは、完全にヒト由来の抗体遺伝子の発現産物であるヒト抗体を意味する。

抗ＧＩＰ抗体は、市販のポリクローナル抗体（Bioss社）の他、公知の手段を用いて作製されたモノクローナル抗体を使用することができる。哺乳動物由来のモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマから産生されるもの、及び抗体遺伝子又は抗体フラグメント遺伝子を設計し周知の遺伝子工学的手法を用いて生産されるものが包含される。
例えば、上述した抗活性型ＧＩＰ抗体は、Ｈ鎖可変領域をコードするＤＮＡ（例えば、配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡ）と、Ｌ鎖可変領域をコードするＤＮＡ（例えば、配列番号３で示される塩基配列からなるＤＮＡ）を、それぞれ適当なベクターのプロモーター下流に挿入した組換え体ベクターを造成し、それを宿主細胞に導入した形質転換体からＨ鎖及びＬ鎖を製造し、これらを可能性のあるペプチドで連結させる、或いはＨ鎖可変領域をコードするＤＮＡ（例えば、配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡ）とＬ鎖可変領域をコードするＤＮＡ（例えば、配列番号３で示される塩基配列からなるＤＮＡ）を、公知のリンカーをコードするＤＮＡで繋いで適当なベクターのプロモーター下流に挿入した組換え体ベクターを造成し、それを宿主細胞内で発現させる、等により抗原結合能を持った一本鎖の組換え抗体タンパク質(scFv)を生産することが挙げられる。（MacCfferty, J. et al., Nature, 348, 552-554, 1990、Tim Clackson et al, Nature,
352, 642-628, 1991等参照）。また、更に、可変領域をコードするＤＮＡと定常領域をコードするＤＮＡとを結合させて発現させたものを生産することであってもよい。この場合、定常領域は、可変領域の由来する抗体と同一のものであっても、あるいは異なる抗体に由来するものであってもよい。
上記の如く機能的に同等なポリペプチドを調製するためのアミノ酸変異の導入は、例えば、部位特異的変異誘発法などを用いて行うことができる。

抗活性型ＧＩＰ抗体産生ハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。
例えば、活性型ＧＩＰ又はそのＮ末端のアミノ酸配列を有するペプチド（配列番号５の１〜１５番目のアミノ酸配列からなるペプチド）を、必要に応じて、適当なキャリアー蛋白質、例えばキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）やウシ血清アルブミンなどと結合することによって、より免疫原性を高め、非ヒト哺乳動物に免疫することにより作製することができる。尚、感作抗原（免疫源）として用いられる活性型ＧＩＰ又は上記ペプチドは、遺伝子工学的手法又は化学合成により作製することができる。

感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞である哺乳動物のミエローマ細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的にはげっ歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター等が使用される。

感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法に従って行われる。例えば、感作抗原を哺乳動物の腹腔内又は、皮下に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原をＰＢＳ（Phosphate-Buffered Saline）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものを所望により通常のアジュバント、例えば、フロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、動物の皮下、皮内、腹腔などに投与して一時刺激後、必要に応じて同様の操作を繰り返し行う。抗原の投与量は投与経路、動物種に応じて適宣決定されるが、通常の投与量は１回当たり１０μｇ〜１ｍｇ程度が好ましい。このように免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、抗体レベルが上昇した哺乳動物から免疫細胞を取り出し、細胞融合を行う。細胞融合を行う際の好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。
前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としての哺乳動物のミエローマ細胞は、すでに、公知の種々の細胞株、例えばＰ３Ｘ６３、ＮＳ−１、ＭＰＣ−１１、ＳＰ２／０等が適宜使用される。

前記免疫細胞とミエローマ細胞の細胞融合は公知の方法、たとえば、ケラーらの方法（Kohler et al., Nature, vol, 256, p495-497(1975)）等に準じて行うことができる。すなわち、ポリエチレングリコール（平均分子量１０００〜６０００のＰＥＧ、３０〜６０％濃度）、センダイウィルス（ＨＶＪ）等の細胞融合促進剤の存在下、所望によりジメチルスルホキシド等の補助剤を添加し、ＲＰＭＩ１６４０培養液、ＭＥＭ培養液等の栄養培養液中で、免疫細胞とミエローマ細胞を混合することによって、融合細胞（ハイブリドーマ）の形成が行われる。

融合により形成されたハイブリドーマをヒポキサンチン、チミジン及びアミノプテリンを含む培地（ＨＡＴ培地）等の選択培地で１日〜７日間培養し、未融合細胞と分離する。得られたハイブリドーマをその産生する抗体（活性型ＧＩＰに結合し、且つ非活性型ＧＩＰとは実質的に結合しない抗体）により更に選択する。
選択したハイブリドーマを公知の限界希釈法に従って単一クローン化し、単一クローン性抗体産生ハイブリドーマとして樹立する。
ハイブリドーマが産生する抗体の活性を検出する方法は、公知の方法を使用することができる。例えばＥＬＩＳＡ法、凝集反応法、ラジオイムノアッセイ法が挙げられる。

得られたハイブリドーマからモノクローナル抗体を取得するには、当該ハイブリドーマを通常の方法に従って培養し、その培養上清として得る方法、あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法などが採用される。

抗体の精製は、塩析法、ゲル濾過法、イオン交換クロマト法又はアフィニティークロマト法等の公知の精製手段を用いて行なうことができる。

本発明において、「ＧＩＰ受容体拮抗剤」としては、例えば、国際公開第２００３／０９７０３１号に記載のメチリデンヒドラジド化合物、具体的には、４−ヒドロキシ安息香酸（２−ブロモベンジリデン）ヒドラジド、３−シアノ−４−ヒドロキシ安息香酸［１−（２，３，５，６−テトラメチルベンジル）インドール−４−イル］メチリデンヒドラジド、３−クロロ−４−ヒドロキシ安息香酸（４−メトキシナフタレン−１−イル）メチリデンヒドラジド、３−クロロ−４−ヒドロキシ安息香酸［１−（５−クロロチオフェン−２−イルメチル）−１Ｈ−インドール−５−イル］メチリデンヒドラジド等が挙げられる。

本発明において、「ＧＩＰ分泌又は上昇抑制剤」としては、例えば、ＢＭＰＰ（３−ブロモ−５−メチル−２−フェニルピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−オール）（国際公開第２００１／８７３４１号）、アルギン酸（特開２０１３−１６６７４１号公報）、フォスファチジルエタノールアミン（特開２０１０−２２２２８４号公報）、ポリグルタミン酸（特開２０１２−１４４４８６号公報）、キラヤ（特開２０１２−１７１９１４号公報）、リゾフォスファチジルイノシトール（特開２０１２−１７１９１５号公報）、セルロースナノファイバ（特開２００９-１２６８３７号公報）、β−キチンナノファイバー（特開２０１０−２４１７１３号公報）、ジアシルグリセロール（特開２００６−３４２０８４号公報）、ヒドロキシプロピル化澱粉（特開２００６−３４２０８５号公報）、モノアシルグリセロール（特開２００７−２９０９８９号公報）、炭素数２０以上の超長鎖脂肪酸（例えば、アラキジン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、セロチン酸、モンタン酸、メリシン酸、ラクセル酸、ガドレイン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、エルカ酸、ドコサペンタエン酸、ネルボン酸、ヘキサコセン酸、オクタコセン酸等；特開２０１１−２２５４５８号公報）、長鎖不飽脂肪酸エタノールアミド（例えば、オレイルエタノールアミド、リノレイルエタノールアミド、リノレニルエタノールアミド、homo-γ-リノレニルエタノールアミド、アラキドニルエタノールアミド、7,10,13,16-ドコサテトラエニルエタノールアミド；特開２０１０−１８０２０３号公報）、米糠抽出物（特表２０１２−５１５１３９号公報）、カテキン類（特開２０１０−２６０８５６号公報）、構成脂肪酸の１０質量％以上がα−リノレン酸であるトリアシルグリセロール（特開２０１３−０７５８８７号公報）、グリセロール骨格の２位にＣ１４〜Ｃ１８飽和脂肪酸が結合したアシルグリセロール（例えば、ラウリン酸（１２：０）、ミリスチン酸（１４：０）、パルミチン酸（１６：０）、リノール酸（１８：２）、オレイン酸（１８：１）、ステアリン酸（１８：０）、又はアラキドン酸（２０：４）が２位に結合した２−アシルモノグリセロール；特開２０１６−０４７８０５号公報））、ツクリタケの圧搾物又は抽出物（ＰＣＴ／ＪＰ２０１７／０４３１０１）等が挙げられる。

後記実施例に示すように、抗ＧＩＰ抗体は、マウスにおいてＧＩＰの投与により生じる短期及び長期の記憶・学習能力の低下を抑制し、老齢マウスにおける短期及び長期の記憶・学習能力を改善する作用を有する。
したがって、抗ＧＩＰ抗体のようなＧＩＰ機能阻害剤は、認知機能改善剤となり得、またこれらを製造するために使用できる。
また、ＧＩＰ機能阻害剤は、認知機能改善剤のために使用することができる。ここで、当該使用は、ヒト若しくは非ヒト動物、又はそれらに由来する検体における使用であり得、また治療的使用であっても非治療的使用であってもよい。尚、「非治療的」とは、医療行為を含まない概念、すなわち人間を手術、治療又は診断する方法を含まない概念、より具体的には医師又は医師の指示を受けた者が人間に対して手術、治療又は診断を実施する方法を含まない概念である。

本発明において、「認知機能」とは、判断、計算、理解、学習、思考、言語及び記憶（短期記憶、長期記憶））などを含む脳の高次の機能を意味し、「認知機能の改善」とは、当該認知機能の維持・向上、認知機能の低下に伴う各種症状の緩和・治癒を意味する。
したがって、本発明の認知機能改善剤は、当該認知機能の障害を呈する疾患又は状態の予防又は治療用として有用である。斯かる認知障害を呈する疾患又は状態としては、例えば、認知症（例、老人性認知症、アルツハイマー型認知症、脳血管性認知症、外傷後認知症、脳腫瘍により生じる認知症、慢性硬膜下血腫により生じる認知症、正常圧脳水腫により生じる認知症、髄膜炎後認知症及びパーキンソン型認知症などの種々の疾患により生じる認知症）、非認知症性の認知障害（例、軽度認知障害（ＭＣＩ））、記憶又は学習障害（例、脳発達障害に伴う記憶及び学習障害）等が挙げられる。

本発明の認知機能改善剤は、認知機能改善効果を発揮する、ヒト若しくは動物用の医薬品となり、また医薬品に配合して使用される素材又は製剤となり得る。

本発明の認知機能改善剤を医薬品として用いる場合、当該医薬品は任意の投与形態で投与され得る。投与形態としては、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経口投与又は注射剤、坐剤、吸入薬、経皮吸収剤、外用剤等による非経口投与が挙げられるが、好ましい形態は非経口投与である。
このような種々の剤型の医薬製剤は、本発明のＧＩＰ機能阻害剤を単独で、又は他の薬学的に許容される賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、嬌味剤、香料、被膜剤、担体、希釈剤等を適宜組み合わせて調製することができる。

本発明の認知機能改善剤におけるＧＩＰ機能阻害剤の含有量は、好ましくは０．００１質量％以上、より好ましくは０．０１質量％以上、且つ好ましくは１０質量％以下、より好ましくは５質量％以下、より好ましくは１質量％以下、より好ましく０．１質量％以下であり、また好ましくは０．００１〜１０質量％、好ましくは０．００１〜５質量％、好ましくは０．００１〜１質量％、より好ましくは０．０１〜０．１質量％である。

本発明の認知機能改善剤の投与量又は摂取量は、対象者の状態、体重、性別、年齢又はその他の要因に従って変動し得るが、経口投与又は摂取の場合成人１人当たり、ＧＩＰ機能阻害剤として、１日あたり好ましくは１ｍｇ以上、より好ましくは５ｍｇ以上であり、且つ好ましくは５００ｍｇ以下、より好ましくは１００ｍｇ以下、より好ましくは２０ｍｇ以下である。

また、本発明の認知機能改善剤の投与対象者としては、記憶・学習の能力が低下したヒト、認知機能の維持・向上を望むヒトが好ましい。

本発明の認知機能改善剤の評価又は選択方法は、（Ｉ）被験物質のＧＩＰ機能阻害活性を測定する工程と、（ＩＩ）（Ｉ）の結果に基づいて被験物質のＧＩＰ機能阻害活性を評価する工程、（ＩＩＩ）ＧＩＰ機能阻害活性を増加又は増強させる被験物質を認知機能改善剤として評価又は選択する工程、を含むものである。
ここで、ＧＩＰ機能阻害活性を測定する方法としては、例えば以下の方法が挙げられる。
１）ＧＩＰ受容体ｃＤＮＡを細胞に導入したＧＩＰ受容体発現細胞を用い、被験物質存在下で、ＧＩＰによりｃＡＭＰを産生させる。その後、ｃＡＭＰを抽出し、イムノアッセイによりｃＡＭＰを測定する。
２）ＧＩＰ受容体ｃＤＮＡを細胞に導入したＧＩＰ受容体発現細胞に、ｃＡＭＰ依存性プロモーターにバクテリア由来ｌａｃＺｇｅｎｅを結合させた遺伝子を導入する。この細胞を、被験物質存在下でＧＩＰと反応させる。ＧＩＰ活性により産生されたｃＡＭＰに応じて細胞中に蓄積したβ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ活性を測定する。
３）ＧＩＰ受容体ｃＤＮＡを細胞に導入したＧＩＰ受容体発現細胞に、被験物質及び放射ラベルしたＧＩＰを細胞に加え、インキュベーションの後、放射活性を測定する。
４）ＧＩＰを産生する腸管由来細胞、又は神経由来細胞等を用いて、被験物質による刺激後、細胞中もしくは培養上清中に産生されるＧＩＰを定量する。
５）被験物質存在下で、脂質や糖質等の栄養素によるＧＩＰ分泌量をＥＬＩＳＡ法により測定する。

被験物質のＧＩＰ機能阻害活性の評価は、ＧＩＰ機能阻害活性を増加又は増強する被験物質を同定することにより行われる。
例えば、異なる濃度の被験物質を添加した場合に測定されるＧＩＰ機能阻害活性を比較することによって行うことができる。より具体的な例としては、より高濃度の被験物質添加群とより低濃度の被験物質添加群との間；被験物質添加群とプラセボ添加群との間；又は被験物質添加前後で、ＧＩＰ機能阻害活性を比較する。被験物質の添加により、又はより高濃度の被験物質の添加によりＧＩＰ機能阻害活性が増加又は増強される場合、当該被験物質を、当該ＧＩＰ機能阻害活性を増加又は増強させる物質として同定することができる。
そして、ＧＩＰ機能阻害活性を増加又は増強させるものとして同定された被験物質が、認知機能改善剤として評価又は選択される。
尚、被験物質としては、認知機能改善に使用することを所望する物質であれば、特に制限されず、天然に存在する物質であっても、化学的又は生物学的方法等で人工的に合成した物質であってもよく、また化合物であっても、組成物若しくは混合物であってもよい。

上述した実施形態に関し、本発明においてはさらに以下の態様が開示される。
＜１＞ＧＩＰ機能阻害剤を有効成分とする認知機能改善剤。
＜２＞認知機能改善剤を製造するための、ＧＩＰ機能阻害剤の使用。
＜３＞認知機能改善に使用するためのＧＩＰ機能阻害剤。
＜４＞認知機能を改善するためのＧＩＰ機能阻害剤の（非治療的）使用。
＜５＞ＧＩＰ機能阻害剤を対象に投与することを含む、認知機能改善方法。

＜６＞＜１＞〜＜５＞において、ＧＩＰ機能阻害剤は、抗ＧＩＰ抗体、ＧＩＰ受容体拮抗剤又はＧＩＰ分泌又は上昇抑制剤である。
＜７＞＜６＞において、抗ＧＩＰ抗体は好ましくは抗活性型ＧＩＰ抗体である。
＜８＞＜６＞において、ＧＩＰ受容体拮抗剤は好ましくは４−ヒドロキシ安息香酸（２−ブロモベンジリデン）ヒドラジド、３−シアノ−４−ヒドロキシ安息香酸［１−（２，３，５，６−テトラメチルベンジル）インドール−４−イル］メチリデンヒドラジド、３−クロロ−４−ヒドロキシ安息香酸（４−メトキシナフタレン−１−イル）メチリデンヒドラジド、又は３−クロロ−４−ヒドロキシ安息香酸［１−（５−クロロチオフェン−２−イルメチル）−１Ｈ−インドール−５−イル］メチリデンヒドラジドである。
＜９＞＜６＞において、ＧＩＰ分泌又は上昇抑制剤は、好ましくはツクリタケの圧搾物又は抽出物、３−ブロモ−５−メチル−２−フェニルピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−オール、アルギン酸、フォスファチジルエタノールアミン、ポリグルタミン酸、キラヤ、リゾフォスファチジルイノシトール、セルロースナノファイバ、β-キチンナノファイバー、ジアシルグリセロール、ヒドロキシプロピル化澱粉、モノアシルグリセロール、炭素数２０以上の超長鎖脂肪酸、長鎖不飽脂肪酸エタノールアミド、米糠抽出物、構成脂肪酸の１０質量％以上がα−リノレン酸であるトリアシルグリセロール、又はグリセロール骨格の２位にＣ１４〜Ｃ１８飽和脂肪酸が結合したアシルグリセロールである。
＜１０＞＜７＞において、抗活性型ＧＩＰ抗体は、好ましくは、活性型ＧＩＰに結合し、且つ非活性型ＧＩＰとは実質的に結合しない抗活性型ＧＩＰ抗体であって、配列番号５で示されるアミノ酸配列の８〜１０番目のアミノ酸から選ばれる１以上を少なくとも認識し、且つＨ鎖に、下記（１）で表されるアミノ酸配列又はその保存的配列改変からなる領域を含む抗体である。
ＥＭＮＰＳＤＧＲＴＨＦＮＥ（１）
＜１１＞＜１０＞において、抗活性型ＧＩＰ抗体は、好ましくは、Ｈ鎖可変領域として配列番号２で示されるアミノ酸配列又はその保存的配列改変からなる領域を含む抗体である。
＜１２＞＜１１＞において、抗活性型ＧＩＰ抗体は、好ましくは、保存的配列改変されたアミノ酸配列が、配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するものである。
＜１３＞＜１０＞において、抗活性型ＧＩＰ抗体は、好ましくは、Ｈ鎖可変領域として配列番号２で示されるアミノ酸配列又はその保存的配列改変からなる領域を含み、且つＬ鎖可変領域として配列番号４で示されるアミノ酸配列又はその保存的配列改変からなる領域を含む抗体である。
＜１４＞＜１３＞において、抗活性型ＧＩＰ抗体は、好ましくは、配列番号２で示されるアミノ酸配列に対する保存的配列改変されたアミノ酸配列が、配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するものであり、配列番号４で示されるアミノ酸配列に対する保存的配列改変されたアミノ酸配列が、配列番号４で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するものである。
＜１５＞下記工程を含む認知機能改善剤の評価又は選択方法。
（Ｉ）被験物質のＧＩＰ機能阻害活性を測定する工程
（ＩＩ）（Ｉ）の結果に基づいて被験物質のＧＩＰ機能阻害活性を評価する工程
（ＩＩＩ）ＧＩＰ機能阻害活性を増加又は増強させる被験物質を認知機能改善剤として評価又は選択する工程
＜１６＞ＧＩＰ機能阻害活性の測定が、ＧＩＰ受容体ｃＤＮＡを細胞に導入したＧＩＰ受容体発現細胞を用い、被験物質存在下で、ＧＩＰによりｃＡＭＰを産生させ、その後、ｃＡＭＰを抽出し、イムノアッセイによりｃＡＭＰを測定する、＜１５＞記載の方法。

製造例１抗活性型ＧＩＰ抗体の作成
（１）免疫用ペプチドの合成
活性型ＧＩＰのＮ末端１５アミノ酸（ＧＩＰ（１−１５））にポリエチレングリコールを付加（ＰＥＧ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）化）後、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ；ｋｅｙｈｏｌｅｌｉｍｐｅｔｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）を化学的に結合させて、ＫＬＨ結合ＰＥＧ化ＧＩＰ（１−１５）を作製し、免疫抗原とした。活性型ＧＩＰのＮ末端１５アミノ酸（ＧＩＰ（１−１５））をＰＥＧ化したものを測定用抗原（１）、非活性型ＧＩＰのＮ末端１３アミノ酸（ＧＩＰ（３−１５））をＰＥＧ化したものを測定用抗原（２）とした。

（２）免疫
ＢＡＬＢ／ｃマウス（オリエンタル酵母工業（株））を用い、背部皮下に免疫した。初回の免疫では、上記で作成した抗原と完全フロイントアジュバンドとを混合したエマルジョンを投与した。初回免疫から２週間毎に抗原と不完全フロイントアジュバンドを混合したエマルジョンを用いて追加免疫を実施した。一度に免疫する抗原量は０．１〜０．２ｍｇの範囲で行った。初回免疫実施７週後、マウスより採取した血清を用いて抗体価測定を実施し、抗体価の上昇を確認した。

（３）細胞融合
抗体価の上昇したマウスから脾臓を摘出し、脾細胞を得た。得られた脾細胞とマウスミエローマ細胞株Ｐ３Ｕ１をＰＥＧ法により融合した。その後、９６ウェルプレート２０枚へ播種（１×１０^５ｃｅｌｌｓ／ウェル）した。

（４）スクリーニング
測定用抗原（１）及び（２）を固相化したＥＬＩＳＡ法でハイブリドーマ培養上清と抗原（１）及び（２）との反応を評価し、抗原（１）に陽性かつ抗原（２）に陰性を示したハイブリドーマを抗活性型ＧＩＰモノクローナル抗体産生ハイブリドーマとして選択した。

（５）クローニング
上記で得られたハイブリドーマを限界希釈法によって単一のコロニーが得られるように培養することにより、抗体産生ハイブリドーマのクローニングを行い、シングルコロニー形成ウェルを再びＥＬＩＳＡ測定し、抗原（１）に陽性かつ抗原（２）に陰性を示す抗体を産生する９Ｂ９Ｈ５−Ｂ９株を樹立した（国際公開第２０１６／１０４４３９号）。
得られた抗体産生ハイブリドーマの保存は、当該ハイブリドーマを培養し、対数増殖期に回収した後、ＦＢＳ（ＦｅｔａｌＢｏｖｉｎｅＳｅｒｕｍ）含有細胞凍結液にて細胞濃度が１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように調製した後、１×１０^６ｃｅｌｌｓ／チューブとなるように凍結チューブに分注し、バイセル中にて−８０℃で保存した。

（６）抗体生産
得られた抗体産生ハイブリドーマの凍結バイアルを起眠し、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ（Ｓｅｒｕｍ−ＦｒｅｅＭｅｄｉｕｍ）へ無血清馴化した。拡大培養後、ローラーボトル２本（５００ｍＬ×２本、１Ｌ）で培養し、培養上清を回収した。回収した培養上清を、ＰｒｏｔｅｉｎＡを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより、モノクローナル抗体として精製した。

試験例１ＥＬＩＳＡ法による活性型ＧＩＰとの反応性
製造例１で得られたモノクローナル抗体と活性型ＧＩＰとの反応性をＥＬＩＳＡ法により確認した。ＮＨ２基ビオチン化キット（Ｄｏｊｉｎｄｏ社製）にて抗活性型ＧＩＰモノクローナル抗体のアミノ基のビオチン化を行った。Ｈｕｍａｎ（ｔｏｔａｌ）ＧＩＰＥＬＩＳＡキット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に付属の検出抗体’ＧＩＰｄｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｔｉｂｏｄｙ（ビオチン化抗ｔｏｔａｌＧＩＰモノクローナル抗体）の代替として、作製したビオチン化抗活性型ＧＩＰモノクローナル抗体１μｇ／ｍＬを用いてＥＬＩＳＡを行った。ＧＩＰ（１−４２）あるいはＧＩＰ（３−４２）の２０００ｐｇ／ｍＬ溶液を最高濃度とした４倍希釈系列を６段階（８．２〜２０００ｐｇ／ｍＬ）まで作製し、捕捉抗体として抗ｔｏｔａｌＧＩＰモノクローナル抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製
ＨｕｍａｎＧＩＰ（ｔｏｔａｌ）ＥＬＩＳＡキットに付属）、検出抗体としてビオチン化抗活性型ＧＩＰモノクローナル抗体、検出にペルオキシダーゼ‐ストレプトアビジン結合物を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ系により、ＧＩＰ濃度をＸ軸、吸光度４５０ｎｍ−５９０ｎｍをＹ軸とした検量線を作製した（図１）。
図１のように、ＧＩＰ（３−４２）では高濃度域においても吸光度が上昇せず、ＧＩＰ（１−４２）にのみ濃度依存的に吸光度が上昇したことから、製造例１で得られたモノクローナル抗体はＧＩＰ（３−４２）には交差性がなく、ＧＩＰ（１−４２）を特異的に検出できる抗体であることを確認した。

実施例１ＧＩＰによる記憶・学習機能低下作用と抗ＧＩＰ抗体による記憶・学習機能低下抑制作用
（１）動物および飼育方法
Ｃ５７ＢＬＫＳ／Ｊ系統の雄性、レプチン受容体異常マウス（ｄｂ／ｄｂマウス，オリエンタル酵母（株））を６週齢で搬入後（室温２３℃，湿度５５±１０％，明期；７：００〜１９：００）、自由摂餌、自由飲水下で飼育した。餌はＣＥ−２（日本クレア）を用い、上記環境下で２週間馴化を行った後、試験に供した。

（２）ＧＩＰ溶液および抗体抗原反応によるＧＩＰ結合型抗ＧＩＰ抗体溶液の作製
生理食塩水にマウス由来ＧＩＰ（Ａｎａｓｐｅｃ社製）を５００ｎＭの濃度で溶解し、ＧＩＰ溶液とした。生理食塩水にマウス由来ＧＩＰ（Ａｎａｓｐｅｃ社製）および製造例１で作製した抗活性型ＧＩＰ抗体をそれぞれ５００ｎＭおよび０．１ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解し、１〜２時間室温でインキュベートした溶液をＧＩＰ結合型抗ＧＩＰ抗体溶液とした。

（３）投与量および投与方法
マウス（３０週齢）に生理食塩水（対照群）、ＧＩＰ溶液（５ｎｍｏｌ／ｋｇ体重）（ＧＩＰ投与群）、又はＧＩＰ結合型抗ＧＩＰ抗体溶液（ＧＩＰ；５ｎｍｏｌ／ｋｇ体重，抗ＧＩＰ抗体；１ｍｇ／ｋｇ体重）（ＧＩＰ＋抗ＧＩＰ抗体投与群）を週に２回（ＡＭ９：００〜１０：００）、合計８回腹腔内投与した。投与日は、投与開始日（投与１回目）を１日目とし、それぞれ投与２回目（２日目）、投与３回目（７日目）、投与４回目（８日目）、投与５回目（１４日目）、投与６回目（１５日目）、投与７回目（２０日目）、投与８回目（２１日目）とし、記憶試験（Ｙ字迷路試験および新奇物体探索試験）は投与２〜３時間後に行った。

（４）Ｙ字迷路（短期記憶）試験
試験は投与開始１０日前、および投与開始２０日後（７回投与後）に行い、短期の記憶・学習能力（作業記憶）を測定した。各アームの長さ４０ｃｍ、高さ１２ｃｍ、角度１２０°のプラスチック製Ｙ字迷路（Ｎｏｌｄｕｓ社製）の端にマウスを入れ、１０分間の行動をビデオ撮影により記録し、アームへの進入順序および進入回数を計測した。短期記憶・学習能力のスコアは、自発的交替行動変化率（下記算出式参照）により評価した。自発的交替行動変化率（％）＝自発的交替行動数／（総進入回数−２）×１００（自発的交替行動数：それぞれのアームを重複することなく進入した回数）

（５）新奇物体探索（長期記憶）試験
試験は投与開始５日前、および投与開始１５日後（６回投与後）に行い、長期の記憶・学習能力（参照記憶）を測定した。縦３０ｃｍ、横３０ｃｍ、高さ４０ｃｍのボックス（Ｎｏｌｄｕｓ社製）内にマウスを入れ、１日５分間の馴化を３日連続で行った（投与開始１１〜１３日目）。翌日、２つの同一物体（ゴム製の物体に青色のゴムテームを巻いたもの；直径４ｃｍ，高さ３．５ｃｍの円柱）をボックス内（壁面から縦１０ｃｍ，横１０ｃｍの間隔を空けた場所）に置き、５分間のマウスの行動をビデオ撮影により記録することで、探索回数（マウスが各物体に対して１ｃｍ以内に接近した回数）を計測した（訓練試行，投与開始１４日目）。さらに翌日（２４時間後）、２つの物体のうち１つを新しい形状の新奇物体（ガラス製の物体に赤色のゴムテームを巻いたもの；一辺が６ｃｍの正三角錐）に置き換えたボックス内にマウスを入れ、５分間の行動をビデオ撮影により記録することで、探索回数を計測した（保持試行，投与開始１５日目）。長期記憶・学習能力のスコアは、保持試行における新奇物体への探索比率（下記算出式参照）で評価した。
新奇物体探索比率（％）＝新奇物体探索回数／総探索回数×１００

（６）統計解析
解析結果は平均値（Ａｖｅ．）±標準誤差（ＳＥ）で示した。統計解析にはＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ’ｓｐｏｓｔｈｏｃ検定およびＳｔｕｄｅｎｔ’ｓｔ検定を用い、Ｐ値が０．０５以下の場合においては統計学的に有意差ありと判定した。

（７）結果
Ｙ字迷路試験において、投与前と比較して、ＧＩＰ投与群で自発的交替行動変化率（短期記憶・学習能力）の低下が認められた。ＧＩＰ＋抗ＧＩＰ抗体投与群では、ＧＩＰ投与群で認められた短期記憶・学習能力の低下は認められず、対照群と同程度のスコアであった（図２）。新奇物体探索試験においても同様に、投与前と比較して、ＧＩＰ投与群で新奇物体探索比率（長期記憶・学習能力）の低下が認められた。ＧＩＰ＋抗ＧＩＰ抗体投与群では、ＧＩＰ投与群で認められた長期記憶・学習能力の低下は認められず、対照群と同程度のスコアであった（図３）。

実施例２血中ＧＩＰ量の加齢性変化
（１）動物および飼育方法
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄性マウス（日本クレア（株））を４週齢で搬入後（室温２３℃，湿度５５±１０％，明期；７：００〜１９：００）、自由摂餌、自由飲水下で飼育した。餌はＣＥ−２（日本クレア（株））で１週間馴化を行った後、通常食（Ｄ１２４５０Ｋ，ＲｅｓｅａｒｃｈＤｉｅｔｓ，Ｉｎｃ）、又は高脂肪食（Ｄ１２４５１，ＲｅｓｅａｒｃｈＤｉｅｔｓ，Ｉｎｃ）で９５週間飼育した。

（２）採血
各週齢（５，１０，１５，２０，３０，４０，５０，６５，８０，１００週齢）のマウスに対して、イソフルラン麻酔下にて腹部大静脈より全血を採取した。

（３）血中ＧＩＰ量の測定
血中ＧＩＰの濃度は、採取した血液を遠心分離により血漿画分を調製後、ＧＩＰＥＬＩＳＡキット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いて定法に従い、トータルＧＩＰを測定した。

（４）統計解析
解析結果は平均値（Ａｖｅ．）±標準誤差（ＳＥ）で示した。統計解析には２−ｗａｙ
ＡＮＯＶＡｆｏｌｌｏｗｅｄｂｙＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ’ｓｐｏｓｔｈｏｃ検定を用い、Ｐ値が０．０５以下の場合においては統計学的に有意差ありと判定した。

（５）結果
加齢に伴って血中ＧＩＰ濃度の上昇が観察され、特に高脂肪食摂取群では通常食群と比較して、有意な血中ＧＩＰ量の上昇が認められた（図４）。トータルＧＩＰと活性型ＧＩＰ量は連動して変化することが知られているため（国際公開２０１２−１２１３０２号）、活性型ＧＩＰ量も上昇していると考えられる。

実施例３老齢マウスに対する抗ＧＩＰ抗体の記憶・学習機能改善作用
（１）動物および飼育方法
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄性マウス（日本クレア（株））を４週齢で搬入後（室温２３℃，湿度５５±１０％，明期；７：００〜１９：００）、自由摂餌（Ｄ１２４５０Ｋ，ＲｅｓｅａｒｃｈＤｉｅｔｓ，Ｉｎｃ）、自由飲水下で１１１週間飼育した。

（２）抗ＧＩＰ抗体溶液の作製
生理食塩水に製造例１で作製した抗活性型ＧＩＰ抗体を０．０５ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解し、抗ＧＩＰ抗体溶液とした。

（３）投与量および投与方法
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（１０７週齢）に生理食塩水（対照群）又は抗ＧＩＰ抗体溶液（０．５ｍｇ／ｋｇ体重）（抗ＧＩＰ抗体投与群）を１週間に１回（ＡＭ９：００〜１０：００）、合計６回腹腔内投与した。

（４）Ｙ字迷路（短期記憶）試験
試験は投与開始１週間前、および投与開始１週間後（２回投与後），３週間後（４回投与後），５週間（６回投与後）後に行い、短期の記憶・学習能力（作業記憶）を測定した。各アームの長さ４０ｃｍ、高さ１２ｃｍ、角度１２０°のプラスチック製Ｙ字迷路（Ｎｏｌｄｕｓ社製）の端にマウスを入れ、１０分間の行動をビデオ撮影により記録し、アームへの進入順序および進入回数を計測した。短期記憶・学習能力のスコアは、自発的交替行動変化率（下記算出式参照）により評価した。自発的交替行動変化率（％）＝自発的交替行動数／（総進入回数−２）×１００（自発的交替行動数：それぞれのアームを重複することなく進入した回数）

（５）新奇物体探索（長期記憶）試験
試験は投与開始５週間後に行い、長期の記憶・学習能力（参照記憶）を測定した。縦３０ｃｍ、横３０ｃｍ、高さ４０ｃｍのボックス（Ｎｏｌｄｕｓ社製）内にマウスを入れ、１日５分間の馴化を３日連続で行った。翌日、２つの同一物体（ゴム製の物体に青色のゴムテームを巻いたもの；直径４ｃｍ，高さ３．５ｃｍの円柱）をボックス内（壁面から縦１０ｃｍ，横１０ｃｍの間隔を空けた場所）に置き、５分間のマウスの行動をビデオ撮影により記録することで、探索回数（マウスが各物体に対して１ｃｍ以内に接近した回数）を計測した（訓練試行）。さらに翌日（２４時間後）、２つの物体のうち１つを新しい形状の新奇物体（ガラス製の物体に赤色のゴムテームを巻いたもの；一辺が６ｃｍの正三角錐）に置き換えたボックス内にマウスを入れ、５分間の行動をビデオ撮影により記録することで、探索回数を計測した（保持試行）。長期記憶・学習能力のスコアは、保持試行における新奇物体への探索比率（下記算出式参照）で評価した。
新奇物体探索比率（％）＝新奇物体探索回数／総探索回数×１００

（６）統計解析
解析結果は平均値（Ａｖｅ．）±標準誤差（ＳＥ）で示した。統計解析には２−ｗａｙ
ＡＮＯＶＡｆｏｌｌｏｗｅｄｂｙＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ’ｓｐｏｓｔｈｏｃ検定およびＳｔｕｄｅｎｔ’ｓｔ検定を用い、Ｐ値が０．０５以下の場合においては統計学的に有意差ありと判定した。

（７）結果
Ｙ字迷路試験において、非投与群および対照群と比較して、抗ＧＩＰ抗体投与群で自発的交替行動変化率（短期記憶・学習能力）の上昇が認められた（図５）。新奇物体探索試験においても同様に、対照群と比較して、抗ＧＩＰ抗体投与群で新奇物体探索比率（長期記憶・学習能力）の上昇が認められた（図６）。

実施例４老齢マウスに対するＧＩＰ分泌又は上昇抑制剤の記憶・学習機能改善作用
（１）動物および飼育方法
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄性マウス（日本クレア（株））を４週齢で搬入後（室温２３℃，湿度５５±１０％，明期；７：００〜１９：００）、自由摂餌、自由飲水下で飼育した。餌は高脂肪食（Ｄ１２４５１，ＲｅｓｅａｒｃｈＤｉｅｔｓ，Ｉｎｃ）で５７週間（６１週齢まで）飼育を行った後、各群の体重、および記憶・学習機能が同等になるように群分けした。試験食として、３０％の脂質を含む高脂肪食（高脂肪食群）、又は２０％ツクリタケ圧搾物を含む３０％高脂肪食（ツクリタケ摂取群）をそれぞれ１５週間（７６週齢）給餌した。飼育期間中、体重は週１回、摂食量は週３回測定した。なお、飼育期間中は自由摂食、自由摂水とした。試験開始１ヶ月後（６５〜６６週齢）、および３ヶ月後（７５〜７６週齢）に記憶・学習機能を評価した。

（２）飼料の調製および組成比
ツクリタケ（Agaricus bisporus）の子実体（１１．３ｋｇ）を、室温条件下でスロージューサー（ＨＵＲＯＭ（株））にて圧搾した後、凍結乾燥し、ツクリタケ圧搾物の粉末（３０８．２ｇ）を調製した。ツクリタケ圧搾物の成分組成を食品成分分析センターにて測定した。ツクリタケ圧搾物の組成比を下記表１に示す。また、試験に供した食餌の組成比を下記表２に示す。なおツクリタケ圧搾物を配合した餌は、各成分組成を考慮し、対照となる高脂肪食と同等の栄養組成・カロリーとなるように成分を置き換える形で混合した。

（３）Ｙ字迷路（短期記憶）試験
試験は試験食摂取前、摂取開始１ヶ月後、および３ヶ月後に行い、短期の記憶・学習能力（作業記憶）を測定した。各アームの長さ４０ｃｍ、高さ１２ｃｍ、角度１２０°のプラスチック製Ｙ字迷路（Ｎｏｌｄｕｓ社製）の端にマウスを入れ、１０分間の行動をビデオ撮影により記録し、アームへの進入順序および進入回数を計測した。短期記憶・学習能力のスコアは、自発的交替行動変化率（下記算出式参照）により評価した。
自発的交替行動変化率（％）＝自発的交替行動数／（総進入回数−２）×１００
（自発的交替行動数：それぞれのアームを重複することなく進入した回数）

（４）新奇物体探索（長期記憶）試験
試験は試験食摂取前、摂取開始１ヶ月後、および３ヶ月後に行い、長期の記憶・学習能力（参照記憶）を測定した。縦３０ｃｍ、横３０ｃｍ、高さ４０ｃｍのボックス（Ｎｏｌｄｕｓ社製）内にマウスを入れ、１日５分間の馴化を３日連続で行った。翌日、２つの同一物体（ゴム製の物体に青色のゴムテームを巻いたもの；直径４ｃｍ，高さ３．５ｃｍの円柱）をボックス内（壁面から縦１０ｃｍ，横１０ｃｍの間隔を空けた場所）に置き、５分間のマウスの行動をビデオ撮影により記録することで、探索回数（マウスが各物体に対して１ｃｍ以内に接近した回数）を計測した（訓練試行）。さらに翌日（２４時間後）、２つの物体のうち１つを新しい形状の新奇物体（ガラス製の物体に赤色のゴムテームを巻いたもの；一辺が６ｃｍの正三角錐）に置き換えたボックス内にマウスを入れ、５分間の行動をビデオ撮影により記録することで、探索回数を計測した（保持試行）。長期記憶・学習能力のスコアは、保持試行における新奇物体への探索比率（下記算出式参照）で評価した。
新奇物体探索比率（％）＝新奇物体探索回数／総探索回数×１００

（５）統計解析
解析結果は平均値（Ａｖｅ．）±標準誤差（ＳＥ）で示した。統計解析には２−ｗａｙＡＮＯＶＡｆｏｌｌｏｗｅｄｂｙＤｕｎｎｅｔｔ’ｓｐｏｓｔｈｏｃ検定を用い、Ｐ値が０．０５以下の場合においては統計学的に有意差ありと判定した。

（６）結果
Ｙ字迷路試験において、対照群と比較して、ツクリタケ（ＧＩＰ分泌又は上昇抑制剤）摂取群で自発的交替行動変化率（短期記憶・学習能力）の上昇が認められた（図７）。新奇物体探索試験においても同様に、対照群と比較して、ツクリタケ（ＧＩＰ分泌又は上昇抑制剤）摂取群で新奇物体探索比率（長期記憶・学習能力）の上昇が認められた（図８）。

Claims

ＧＩＰ機能阻害剤を有効成分とする認知機能改善剤。
ＧＩＰ機能阻害剤が、抗ＧＩＰ抗体、ＧＩＰ受容体拮抗剤又はＧＩＰ分泌抑制剤である請求項１記載の認知機能改善剤。
抗ＧＩＰ抗体が、抗活性型ＧＩＰ抗体である請求項２記載の認知機能改善剤。
ＧＩＰ受容体拮抗剤が、４−ヒドロキシ安息香酸（２−ブロモベンジリデン）ヒドラジド、又は３−シアノ−４−ヒドロキシ安息香酸〔１−（２，３，５，６−テトラメチルベンジル）−インドール−４−イル〕メチリデンヒドラジド、３−クロロ−４−ヒドロキシ安息香酸（４−メトキシナフタレン−１−イル）メチリデンヒドラジド、又は３−クロロ−４−ヒドロキシ安息香酸［１−（５−クロロチオフェン−２−イルメチル）−１Ｈ−インドール−５−イル］メチリデンヒドラジドである請求項２記載の認知機能改善剤。
ＧＩＰ分泌又は上昇抑制剤が、ツクリタケの圧搾物又は抽出物、３−ブロモ−５−メチル−２−フェニルピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−７−オール、アルギン酸、フォスファチジルエタノールアミン、ポリグルタミン酸、キラヤ、リゾフォスファチジルイノシトール、セルロースナノファイバ、β-キチンナノファイバー、ジアシルグリセロール、ヒドロキシプロピル化澱粉、モノアシルグリセロール、炭素数２０以上の超長鎖脂肪酸、長鎖不飽脂肪酸エタノールアミド、米糠抽出物、構成脂肪酸の１０質量％以上がα−リノレン酸であるトリアシルグリセロール、又はグリセロール骨格の２位にＣ１４〜Ｃ１８飽和脂肪酸が結合したアシルグリセロールである請求項２記載の認知機能改善剤。
下記工程を含む認知機能改善剤の評価又は選択方法。
（Ｉ）被験物質のＧＩＰ機能阻害活性を測定する工程
（ＩＩ)（Ｉ）の結果に基づいて被験物質のＧＩＰ機能阻害活性を評価する工程
（ＩＩＩ）ＧＩＰ機能阻害活性を増加又は増強させる被験物質を認知機能改善剤として評価又は選択する工程