JP2018099141A - 混合fret検出を用いたナノポアに基づく核酸の分析 - Google Patents
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Abstract
Description
この出願は、2013年5月24日に出願された米国仮特許出願第61/827,519号(この内容は、その全体が本明細書に援用される)への優先権の利益を主張する。
of Genomics and Human Genetics、10巻:263〜284頁、2009年にあるような、取り組まねばならない難題が依然として山積している。ナノポアを使用した単分子の配列決定は、これらの難題のいくつかに対して、例えばMaitraら、Electrophoresis、33巻:3418〜3428頁、2012年、Venkatesanら、Nature Nanotechnology、6巻:615〜624頁、2011年のように対処しうるものの、このアプローチには、信頼性のあるナノポアの作製、DNAトランスロケーション速度の制御、ヌクレオチドの分別、ナノポアセンサーの大型アレイからの電気信号の検出など、例えばBrantonら、Nature Biotechnology、26巻(10号):1146〜1153頁、2008年、Venkatesanら(上記に引用済み)などにあるように、それ自体の持つ一連の技術的な困難性がある。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
(項目1)
ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定する方法であって、
ポリヌクレオチドのヌクレオチドがナノポアに隣接して位置づけられるFRET対の第1のメンバーの傍を順番に通過するように、前記ポリヌクレオチドを、前記ナノポアを通ってトランスロケーションさせるステップであって、前記ヌクレオチドが前記ナノポアを出るときに、複数の前記ヌクレオチドが、前記FRET対の前記第1のメンバーのFRET距離内にあり、かつ前記ヌクレオチドの少なくとも一部分が、前記FRET対の第2のメンバーで標識されている、ステップと、
前記FRET距離内にある前記FRET対の前記第1のメンバーと複数の第2のメンバーとの間でFRETが発生して、混合FRETシグナルを生成するように、前記ナノポアに隣接する前記FRET対を光線に曝露するステップと、
前記ポリヌクレオチドが前記ナノポアを通ってトランスロケーションするときに、混合FRETシグナルを測定するステップと、
前記混合FRETシグナルから前記ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するステップと
を含む、方法。
(項目2)
前記ナノポアが、固相膜に配置され、前記FRET対の前記第1のメンバーが、前記ナノポアに隣接する前記固相膜に付着している、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記ナノポアが、タンパク質ナノポアであり、前記FRET対の前記第1のメンバーが、前記タンパク質ナノポアに付着している、項目1に記載の方法。
(項目4)
前記ポリヌクレオチドが、一本鎖または二本鎖のポリヌクレオチドである、項目1に記載の方法。
(項目5)
ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定する方法であって、
ポリヌクレオチドのヌクレオチドが、ナノポアを出るときに、順番にFRETゾーンを通って通過するように、前記ポリヌクレオチドを、出口を有する前記ナノポアを通ってトランスロケーションさせるステップであって、前記FRETゾーンは、そのような通過の間に複数の前記ヌクレオチドを包囲し、かつ前記ヌクレオチドの少なくとも一部分が、FRET対の少なくとも1つの第2のメンバーで標識され、かつ前記FRET対の少なくとも1つの第1のメンバーが、前記FRETゾーン内にある、ステップと、
前記FRET対の第1のメンバーと第2のメンバーとの間でFRETが発生して、混合FRETシグナルを生成するように、前記FRETゾーン内にある前記FRET対の前記第1のメンバーおよび前記第2のメンバーを光線に曝露するステップと、
前記ポリヌクレオチドが前記FRETゾーンを通って動くときに、混合FRETシグナルを測定するステップと、
前記混合FRETシグナルから前記ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するステップと
を含む、方法。
(項目6)
前記ナノポアが、固相膜に配置され、前記FRET対の前記第1のメンバーが、前記ナノポアに隣接する前記固相膜に付着している、項目5に記載の方法。
(項目7)
前記ナノポアが、タンパク質ナノポアであり、前記FRET対の前記第1のメンバーが、前記タンパク質ナノポアに付着している、項目5に記載の方法。
(項目8)
前記ポリヌクレオチドが、一本鎖または二本鎖のポリヌクレオチドである、項目5に記載の方法。
(項目9)
ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定する方法であって、
標識されたヌクレオチドを有するポリヌクレオチドを、特定の寸法に作られたナノポアを通ってトランスロケーションさせ、その結果、FRET対の第2のメンバーである前記ヌクレオチド上の標識が、FRET反応を抑制するように拘束され、かつ前記ポリヌクレオチドのヌクレオチドが、前記ナノポアを出るときに、順番にFRETゾーンを通って通過するステップであって、前記FRETゾーンが、そのような通過の間に複数の前記ヌクレオチドを包囲し、かつ前記FRET対の少なくとも1つの第1のメンバーが、前記FRETゾーン内にある、ステップと、
前記第1のメンバーと前記第2のメンバーとの間でFRETが発生して、混合FRETシグナルを生成するように、前記FRETゾーン内にある前記FRET対の前記第1のメンバーおよび前記第2のメンバーを光線に曝露するステップと、
前記ポリヌクレオチドが前記FRETゾーンを通って動くときに、混合FRETシグナルを測定するステップと、
前記混合FRETシグナルから前記ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するステップと
を含む、方法。
(項目10)
前記ナノポアが、固相膜に配置され、前記FRET対の前記第1のメンバーが、前記ナノポアに隣接する前記固相膜に付着している、項目9に記載の方法。
(項目11)
前記ナノポアが、タンパク質ナノポアであり、前記FRET対の前記第1のメンバーが、前記タンパク質ナノポアに付着している、項目9に記載の方法。
(項目12)
前記ポリヌクレオチドが、一本鎖または二本鎖のポリヌクレオチドである、項目9に記載の方法。
(項目13)
前記FRET対の前記第1のメンバーが、ドナーであり、前記FRET対の前記第2のメンバーが、アクセプターである、項目1〜12のいずれか1項に記載の方法。
(項目14)
前記アクセプターの少なくとも1つが、有機蛍光色素である、項目13に記載の方法。
(項目15)
前記ドナーの少なくとも1つが、量子ドットである、項目13に記載の方法。
(項目16)
ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するためのシステムであって、
第1のチャンバーと第2のチャンバーとの間に流体連通を提供し、かつポリヌクレオチドが通ってトランスロケーションすることができるナノポアであって、前記ナノポアは、前記ポリヌクレオチドのヌクレオチドが、順番に前記ナノポアの出口を通って通過するように、特定の寸法に作られており、そして前記ポリヌクレオチドのヌクレオチドが、FRET対のメンバーで標識されている場合はいつでも、前記ナノポアの内部のそのようなメンバーと、前記ナノポアの外部のメンバーとの間でFRETが抑制されている、ナノポアと、
前記ナノポアの前記出口のFRET距離内に配置された前記FRET対のメンバーであって、ここで前記ナノポアの前記出口のFRET距離内に配置された前記FRET対のメンバーは、前記ポリヌクレオチドを標識するメンバーとは異なるメンバーであり、複数のヌクレオチドが、前記ナノポアの前記出口から現れるときに、配置された前記メンバーのFRET距離内を通過する、メンバーと
を含む、システム。
(項目17)
前記ナノポアが、固相膜に配置され、前記FRET対の前記第1のメンバーが、前記ナノポアに隣接する前記固相膜に付着している、項目16に記載のシステム。
(項目18)
前記ナノポアが、タンパク質ナノポアであり、前記FRET対の前記第1のメンバーが、前記タンパク質ナノポアに付着している、項目16に記載のシステム。
(項目19)
前記ポリヌクレオチドが、一本鎖または二本鎖のポリヌクレオチドである、項目16に記載のシステム。
(項目20)
前記FRET対の配置された前記メンバーが、ドナーであり、前記ポリヌクレオチドを標識している前記メンバーが、アクセプターである、項目16から19のいずれか一項に記載のシステム。
(項目21)
前記アクセプターが、有機蛍光色素である、項目20に記載のシステム。
(項目22)
前記ドナーが、量子ドットである、項目20に記載のシステム。
本明細書に記載の様々な方法、システムおよびデバイスを使用したナノポアは、固体状態のナノポア、タンパク質ナノポア、または固体状態の膜もしくは類似のフレームワークに構成されたタンパク質ナノポアを含むハイブリッドナノポアである。ナノポアの重要な特長は、(i)検体、特にポリマー検体を、順番に検出ゾーンを通って通過するように拘束する点、(ii)トランスロケーション手段との適合性、すなわち、ナノポアを通って検体を駆動するためのどんな方法も使用される点、および(iii)ナノポアの管腔または孔内で、FRET対のメンバーに対しFRETを抑制する点である。
Microeng.、16巻:1530〜1539頁、2006年、Nakaneら、J. Phys. Condens. Matter、15巻、R1365〜R1393、2003年、DeBloisら、Rev. Sci. Instruments、41巻(7号):909〜916頁、1970年、Clarke ら、Nature Nanotechnology、4巻(4号):265〜270頁、2009年、Bayleyら、米国特許出願公開第2003/0215881号などに開示されている。簡潔に述べると、一態様では、担体、通常は膜を通って、1〜50nmのチャネルを形成し、それを通ってトランスロケーションするよう、DNAなどの検体を誘導する。ナノポアを生成する固体状態のアプローチは、堅牢性および耐久性、ならびに、ナノポアのサイズおよび形状を調整する能力、ウエハスケールにナノポアの高密度なアレイを作製する能力、脂質ベースの系に比べて優れた機械的、化学的および熱的な特徴、ならびに電気的または光学的読み取り技法に組み込まれる可能性をもたらす。一方、生物学的なナノポアは、再現性のある狭い孔または管腔を、特に1〜10ナノメートルの範囲で提供し、また、既存のタンパク質工学の方法によって、ナノポアの物理的および/または化学的特性を調整するための、およびFRETドナーやアクセプターなどの基または構成要素を直接的にまたは間接的に付着するための技法を提供する。タンパク質ナノポアは、典型的には、機械的支持について精巧な脂質二重層に頼っており、精密な寸法を有する固体状態のナノポアの作製は、依然として難題である。固体状態のナノポアを生物学的なナノポアと組み合わせることによって、これらの欠点のいくつかは克服される(特に、生物学的なポアタンパク質の精度と固体状態のナノポアの安定性)。光学的な読み取り技法のために、ハイブリッドナノポアは、データ取得を大幅に簡便にする、正確なナノポアの場所を提供する。脂質二重層に挿入されたナノポアタンパク質の横方向の拡散によって、光学検出は難題となる。ハイブリッドナノポアの生物学的な部分は、脂質二重層内の挿入に頼っていないことから、そのようなタンパク質に為される改変の自由度は大幅に増加する。例えば、脂質二重層に自発的に挿入されない、遺伝子工学的に改変されたナノポアタンパク質を、ハイブリッドナノポアのタンパク質構成成分として未だに使用してもよい。量子ドットなどの二重層不安定化剤を、ハイブリッドナノポアのタンパク質構成成分を標識するために使用してもよい。
一部の実施形態では、微小電気機械システム(MEMS)材料の固相膜を、低エネルギーのイオンビームを用いて処理して、その自家蛍光をブリーチする。典型的には、そのような処理は、表面または表面の近くでMEMS材料の物理的な変化を引き起こして、自家蛍光に寄与する構造を破壊または不活化するのに十分な高いエネルギーで、しかし、融解、蒸発、著しい変形およびスパッタリングが起こるような高いエネルギーを用いずに、MEMS材料の表面領域にイオンビームを向けることによって行われる。必要とされる最小のエネルギーは、ビームエネルギーをゼロから始めて次第に増加させてゆき、ビームエネルギーの増加に伴う自家蛍光の減少を測定することによって、材料ごとで容易に決定されうる。本明細書に使用される場合の「自家蛍光」という用語は、「バックグラウンド蛍光」と同義に使用され、MEMS材料の一部分ではない蛍光標識を励起するために選択された光源を用いて励起されると、MEMS材料の表面またはその近くの供給源から発する蛍光を意味する。そのため、MEMS材料の自家蛍光は、光源の周波数に依存する。一態様では、本方法が、可視光領域の周波数ならびに近赤外線から近紫外線の周波数の自家蛍光を低減するように、有機蛍光色素を励起するべく光源の周波数を選択する。MEMS材料は、微小作製が可能な広範な種類の固体を含み、光学検出を使用した分析技法において使用される。例示的なMEMS材料は、窒化ケイ素や二酸化ケイ素などのシリコンベースの担体または酸化アルミニウムなどの金属ベースの担体である。一態様では、MEMS材料は、加工されて膜の形態で使用される。一実施形態では、MEMS材料は窒化ケイ素である。広範な種類の集束イオンビームを、そのようなブリーチに利用してもよく、様々なエネルギーでのそのようなビームの産生および適用についてのガイドラインは、Natasiら、Ion Solid Interactions: Fundamentals and Applications(Cambridge University Press、1996年)などの文献および他の文献に見られる。例示的な集束イオンビームとしては、ヘリウムイオンビーム、ネオンイオンビームおよびガリウムイオンビームが挙げられる。一実施形態では、ヘリウムイオンビームを本方法に使用する。ヘリウムイオンビームは、市販のイオンビーム顕微鏡(HIM)(例えばZeiss Orion Nanofab)を用いて産生することができる。窒化ケイ素などのMEMS材料の表面に送達されるエネルギー量または用量は、自己蛍光を減らすために、2e−10から8e−10nC/nm2の範囲にあってもよい。
一部の実施形態では、ナノポアを、1種または複数の量子ドットを用いて標識してもよい。具体的には、一部の実施形態では、1種または複数の量子ドットを、ナノポアへ付着するか、隣接する(およびナノポアの入口または出口のFRET距離内の)固相支持体に付着して、検体上のアクセプターとのFRET反応におけるドナーとして利用してもよい。そのような量子ドットの使用は、周知されており、参照により本明細書に組み入れられている米国特許第6,252,303号、第6,855,551号、第7,235,361号などの科学文献および特許文献に広く記載されている。
Press、1996年、ISBN978−0−12−342336−8)。
ナノポアベースの配列決定アプローチに関連する主な障壁は、核酸がナノポアを通って高速でトランスロケーションすることであり(〜500.000〜1.000.000ヌクレオチド/秒)、記録機器の帯域幅が制限されているために、この高速は、直接的な配列読み取りを可能とはしない。2種の異なるナノポアタンパク質を使用して、核酸のトランスロケーションを遅延させる手法は、最近Cherfら[Nat Biotechnol、2014年2月14日、30巻(4号):344〜8頁]およびManraoら[Nat Biotechnol、2012年3月25日; 30巻(4号):349〜53頁]によって示されており、参照により本明細書に組み入れられている。どちらのグループも、標的の鋳型から相補的な鎖を合成するためにDNAポリメラーゼを使用し、その結果、鋳型DNAは、ナノポアを通って段階的にトランスロケーションした。それゆえ、核酸ポリメラーゼの合成速度(10〜500ヌクレオチド/秒)は、DNAのトランスロケーション速度を決定し、その速さは直接的な核酸のトランスロケーションよりも大まかには3〜4桁低いことから、単一ヌクレオチドの分析が実現可能になった。しかし、ポリメラーゼに補助されたトランスロケーションは、ポリメラーゼのための結合部位を生成するために著しい試料の調製を要し、核酸合成は、大量にまとめて遮断されざるを得ず、核酸−ポリメラーゼ複合体がナノポアタンパク質によって捕捉される時にのみ開始することができる。このことは、商業的な環境における実施を阻みかねない、相当に複雑な設定をもたらす。さらに、失速した重合などのポリメラーゼ合成反応の変動ならびに核酸からのポリメラーゼの解離が、配列読み取りを妨げ、その結果、高いエラー率と読み取り長の低減とをそれぞれもたらすことがある。本願に記載された光学的ナノポア配列は、DNAトランスロケーションを遅延させることについて異なる手法を使用する。標的の核酸は、蛍光修飾されたヌクレオチドを組み入れることによって、酵素により複製される。結果として生じる標識された核酸は、名目直径が増えており、そのため、ナノポアを通して引き込む際に、トランスロケーション速度が減少する。光学配列決定のための好適なトランスロケーション速度は、毎秒1〜1000ヌクレオチドの範囲にあり、さらに好ましい範囲は、毎秒200〜800ヌクレオチドであり、最も好ましいトランスロケーション速度は、毎秒200〜600ヌクレオチドである。
標識されたポリヌクレオチドを、3’側が最初になった配向にてハイブリッドナノポアを通ってトランスロケーションさせて、標識されたシトシン由来の混合FRETシグナルを収集した。生データを図1Bに示す。ハイブリッドナノポアを通ってトランスロケーションするときに、DNAのシトシンの数に対応する複数のピークが観察された。驚くことに、3’末端のホモポリマーは完全に分解された。
標識されたポリヌクレオチドを、3’側が最初になった配向にてハイブリッドナノポアを通ってトランスロケーションさせて、標識されたシトシンおよびチミジン由来の混合FRETシグナルを収集した。生データを図1Dに示す。この生データトレース中のピークは、鋳型鎖中の標識されたヌクレオチドの位置に類似したパターンを示す。
「ナノポア」とは、所定のまたは認識されうる順番で検体が担体を通って通過すること、およびポリマー検体の場合、所定のまたは認識されうる順番でそのモノマーユニットが担体を通って通過することを可能にする、担体に位置づけられる任意の開口を意味する。後者の場合には、所定のまたは認識されうる順番は、ポリマー中のモノマーユニットの一次配列であってもよい。ナノポアの例としては、タンパク質性のまたはタンパク質ベースのナノポア、合成または固体状態のナノポア、およびタンパク質ナノポアが中に包埋されている固体状態のナノポアを含むハイブリッドナノポアが挙げられる。ナノポアは、例えば1〜10nm、もしくは1〜5nm、もしくは1〜3nm、または他の様々なサイズの内径を持ちうる。タンパク質ナノポアの例としては、以下に限定されないが、アルファ−ヘモリシン、電位依存性ミトコンドリアポリン(VDAC)、OmpF、OmpC、MspAおよびLamB(マルトポリン)が挙げられ、これらは例えばRhee, Mら、Trends in Biotechnology、25巻(4号)(2007年):174−181頁、Bayleyら(上記に引用)、Gundlachら、米国特許出願公開第2012/0055792号などに開示され、参照により本明細書に組み入れられている。単一の核酸分子のトランスロケーションを可能にする任意のタンパク質ポアが利用されうる。ナノポアタンパク質は、ポアの外部の特異的な部位、またはポア形成タンパク質を構成する1種または複数のモノマーユニットの外部の特異的な部位で、標識されていてもよい。ポアタンパク質は、以下に限定されないが、アルファ−ヘモリシン、MspA、電位依存性ミトコンドリアポリン(VDAC)、炭疽菌ポリン、OmpF、OmpCやLamB(マルトポリン)などのタンパク質の群から選ばれる。ポアタンパク質の固体状態の穴への組み込みは、荷電しているポリマーがポアタンパク質に付着することによって達成される。電場を印加した後、荷電している複合体は、電気泳動によって固体状態の穴の中へ引き込まれる。合成ナノポアまたは固体状態のナノポアは、様々な形態の固体担体中に作られていてもよく、そのような例としては、以下に限定されないが、シリコーン(例えばSi3N4、SiO2)、金属、酸化金属(例えばAl2O3)、プラスチック、ガラス、半導体材料、またはそれらの組合せが挙げられる。合成ナノポアは、脂質二層膜中に位置づけられた生物学的なタンパク質ポアよりも安定であってもよい。合成ナノポアはまた、以下に限定されないが、重合したエポキシなどの、適当な担体中に包埋されたカーボンナノチューブを使用することによって作られていてもよい。カーボンナノチューブは、均一でありかつ明確に定義された化学的または構造的な特性を有しうる。様々なサイズのカーボンナノチューブを入手することができ、1nmから数百nmに及ぶ。カーボンナノチューブの表面電荷は、約ゼロであることが公知であり、その結果、ナノポアを通る核酸の電気泳動による輸送が、簡単かつ予測可能になる(Ito, T.ら、Chem. Commun.、12巻(2003年):1482〜83頁)。合成ナノポアの担体表面は、化学的に修飾されて、タンパク質ポアの共有結合での付着を可能とするか、または表面の特性を光学ナノポア配列決定に適したものとしてもよい。そのような表面修飾は、共有結合的であるか非共有結合的でありうる。大半の共有結合性修飾は、有機シランの沈着を含み、そのための最も一般的なプロトコールは、以下のように記載される:1)水性アルコールからの沈着。これは、シリル化された表面を調製するための最も簡易的な方法である。95%エタノール−5%水溶液を、酢酸を用いてpH4.5〜5.5に調整する。撹拌しながらシランを添加し、終濃度2%を生じる。加水分解およびシラノール基の形成の後、担体を2〜5分間加える。すすいだ後、エタノール中に少しの間浸漬することによって、過剰の遊離の材料を除く。シラン層の硬化は、摂氏110度で5〜10分間とした。2)蒸気相沈着。乾燥した非プロトン性の条件で化学蒸着によって、シランを担体に適用することができる。これらの方法は、単層の沈着に向く。閉鎖されたチャンバーの設計では、担体が、5mmの蒸気圧を達成するのに十分な温度に加熱される。あるいは、シランの蒸発が観察されるまで、真空を適用することができる。3)スピンオン沈着。スピンオンの適用は、最大限の機能付与と多層の沈着とに向く加水分解条件下、または単層の沈着に向く乾燥条件下で、行うことができる。
Claims (1)
- 本明細書に記載の発明。
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