JP2018095618A - 皮膚外用剤及び飲食品 - Google Patents
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本発明は、米、米糠又はサンショウの抽出物若しくはその加水分解物或いは発酵物を有効成分とする糖化蛋白質除去用組成物である。
また、本発明は、上記酸化蛋白質除去用組成物を含む皮膚外用剤又は飲食品である。
また、本発明は、上記糖化蛋白質除去用組成物を含む皮膚外用剤又は飲食品である。
米の種類としては、粳米、もち米等のいずれを使用してもよい。また、加工米としては、抗アレルギー米、低蛋白米(例えば低グリテリン米)、強化米(例えばγ−アミノ酪酸米)などが挙げられる。
アスペルギルス ニガー(Aspergillus niger)等の黒麹菌、モナスカス アンカ(Monascus anka)、モナスカス ピロサス(Monascus pilosus)等の紅麹菌などが挙げられる。
米糠500gに0.1M乳酸水溶液1500gを加え、撹拌して米糠と乳酸水溶液を十分混合した後、室温に1日静置した。次に不溶物を濾過で除き、濾液をフィチン酸でpH6.5として淡黄色透明の米糠抽出物を得た824g(固形分濃度3.20%)
米糠500gに0.1M乳酸水溶液1500gを加え、撹拌して米糠と乳酸水溶液を十分混合した後、室温に1日静置した。次に不溶物を濾過で除き、濾液をパパインで処理した。酵素処理は酵素を1.2mg使用し、酵素の至適pHに於いて、80℃1時間保持することによって行った。処理により生じた不溶物を濾別し、濾液をフィチン酸でpH6.5として淡黄色透明の米糠抽出物加水分解溶液731gを得た(固形分濃度3.66%)。
玄米175gを、0.25N水酸化ナトリウム水溶液700gに、室温で18時間浸漬した。不溶物を濾過で除き、濾液に対して蛋白分解酵素であるアクチナーゼ及びパパインをそれぞれ130mg添加して酵素分解処理を行った。酵素処理は各酵素の至適pHにて、40℃2時間保持することによって行った。ここに得られた酵素処理液を濾過して、淡黄色透明の米抽出物加水分解物溶液1370gを得た(固形分濃度1.16%)。
粉砕した精白米50gに精製水500gを加えて米粉砕物懸濁液を調製した。この米粉砕物懸濁液を1日1回、80〜90℃で1時間保持を3日間繰り返す間断殺菌法にて殺菌処理を行った。次いで、そこに予め前培養しておいた、ラクトバシルス プランタラム(Lactobacillus plantarum)の培養液を108個/mLとなるように接種し、37℃、5日間静置して発酵させた。発酵終了後、この米発酵物溶液を90℃で1時間、加熱殺菌処理した後、室温に戻し、濾過をして淡黄色透明の米発酵物溶液420gを得た(固形分濃度2.10%)。
ミカン科サンショウ属のサンショウの種子を乾燥、粉砕し、粉砕物60gに精製水600gを混合した後、ニューラーゼF3G(天野エンザイム株式会社製品)0.6gを添加し、40℃で4時間抽出を行った後ろ過し、次いで、80℃で1時間加熱して酵素を失活させた後ろ過し、褐色透明の酵素加水分解物溶液431gを得た(固形分濃度0.72%)。
ミカン科サンショウ属のサンショウの種子を乾燥、粉砕し、粉砕物60gに精製水600gを混合した後、パパイン0.3g及びリパーゼ0.3gを添加し、40℃で4時間抽出を行った後ろ過し、次いで、80℃で1時間加熱して酵素を失活させた後ろ過し、褐色透明の酵素加水分解物420gを得た(固形分濃度0.70%)。
本試験例においては、酸化蛋白質を分解する酸化蛋白分解酵素(Oxidized Protein Hydrolase:OPH)「アシルアミノ酸遊離酵素」の活性促進効果を評価した。
ヒト真皮由来線維芽細胞NB1RGBを、0.5%NCS含有イーグル最少必須培地を入れた96穴マイクロプレートに1×104個/ウェル播種し、37℃,5.0%CO2の条件下に1日間プレ培養した後、製造例2〜6の抽出物、加水分解物及び発酵物を試料溶液として培地に添加し、同条件でさらに3日間培養した。ここで、試料溶液は培地量に対して溶液としてその終濃度が2%となるように添加した。次に、培地を除去し、0.5% Triton X-100溶液を100μL/ウェル添加し、5分間静置して細胞を破砕した。その後、3mMとなるようにPBS(−)で希釈したAc-Ala-pNA(BACHEM L-1640)を基質として50μL/ウェル添加し、37℃で3時間インキュベートした。その後マイクロプレートリーダー(Model 680、バイオラッド社製)を用いて405nmにおける吸光度(ABS405nm)を測定した。また、細胞を播種していないウェルに対しても上記と同様の操作を行い、各試験区のABS405nmの値から細胞を播種していないウェルのABS405nmの値を差し引いた値(ΔABS405nm)を、各試験区のOPH活性とした。また、上記と同じ操作を行った別プレートの細胞に対して、培養終了後、PBS(−)で1回洗浄してからPBS(−)で100倍希釈したhoechst33342試薬を100μL/ウェル添加し、37℃で1時間インキュベートし、DNAを蛍光染色した。その後、蛍光強度(励起:355nm、放射:460nm:蛍光マイクロプレートリーダー(フルオロスキャンアセント、Thermo Fisher Scientific社製)を測定し、DNA量を求めた。ここで得られた各試料添加区のOPH活性の値(ΔABS405nm)をDNA量(励起:355nm、放射:460nm)で割ることで、細胞当たりのOPH活性を算出した。各試料添加区の細胞当たりのOPH活性は、試料溶液の代わりにPBS(−)を添加したコントロール区の細胞当たりのOPH活性の値を100とした相対値で表した。
[表1]
本試験例2においては、糖化蛋白質分解酵素であるフルクトサミン−3−キナーゼ(FN3K)遺伝子発現亢進効果を評価した。
正常ヒト由来線維芽細胞を0.5%NCS含有イーグル最少培地にて3×105個/mLに調製し、φ6cmシャーレに1mLを播種して、5%CO2、飽和水蒸気下、37℃で培養した。24時間培養後、さらに、製造例1〜6の抽出物、加水分解物及び発酵物を試料溶液として含む培養液(培養液全量に対して溶液として終濃度が2.0%となるように各試料溶液を添加したもの)を添加して培養した。また、比較対照として、試料溶液に代えて、PBS(−)溶液のみを含んだ培養液(培養液全量に対するPBS(−)の終濃度を2.0%に調整したもの)を添加した試験区(コントロール区)を設定した。24時間培養後、それぞれの試験区の細胞をTrizol試薬(Invitrogen社製)1mLで回収した。回収した細胞に対してクロロホルム(和光純薬工業社製)200μL添加して撹拌混合し遠心分離機(TOMY社製/MX-160)で15,000rpm、4℃の条件下で15分間遠心分離した後、水層のみを400μL分取した。回収した水層にイソプロパノール(和光純薬工業社製)500μLを添加して撹拌混合し、15,000rpm、4℃の条件下で15分間遠心分離してtotalRNAの沈殿物を得た。totalRNAに75%エタノールを1mL添加して撹拌して洗浄し、15,000rpm、4℃条件下で15分間遠心分離して沈殿を回収した。回収したtotal RNAを所定のキット(PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)(タカラバイオ社製)を用いて逆転写反応し、cDNAを合成した。合成したcDNAをサンプルとして、Thermal Cycler Dice(登録商標)Real Time System Single(タカラバイオ社製)、及びSYBR(登録商標)Premix Ex TaqTM II(Perfect Real Time)[タカラバイオ社製]を用いて、FN3K種遺伝子の発現と、内部標準物質G3PDH遺伝子の発現の検出を行った。ここで、G3PDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)は、ハウスキーピング遺伝子(多くの組織や細胞中に共通して一定量発現する遺伝子であって、常に発現され,細胞の維持,増殖に不可欠な遺伝子である)の一つであり、発現量が常に一定とされていることから、PCRの実験では内部標準として用いられるものである。試験結果は、G3PDH遺伝子の発現量を一定とした場合の、それぞれの試験区でのFN3K遺伝子の発現量を比較した。本試験系においては、コントロール区のそれぞれの遺伝子の発現量を100としたときの他の試験区でのその遺伝子の発現量の相対値を求めた。
[表2]
20mg/mLウシ血清アルブミン(BSA)溶液250μLと試料溶液100μLの混液に、36.5mM過酸化水素液50μLと2.1mM硫酸第一鉄溶液100μLを加え、37℃で1時間インキュベートし、フェントン反応によるBSAのカルボニル化を誘導した。このとき、各試験区について過酸化水素液と硫酸第一鉄溶液のかわりに精製水を添加してフェントン反応を行わないリファレンス区を設定した。ここで、試料溶液としては、製造例2,5,6を溶液としての終濃度が10%,20%となるように調製したものを使用した。次に、0.44mM BHTを50μL添加して反応終了後、それぞれ別チューブに100μLずつ分取し、そこに2mg/mL 2,4−ジニトロフェニルヒドラジン(DNPH)400μL添加して室温暗所にて60分間静置することによりカルボニル化タンパク質をラベル化した。その溶液に20%トリクロロ酢酸溶液500μL添加して撹拌後、5分間水冷した後4℃、15,000rpm、10分間遠心分離し、上清を捨てた。さらに10%トリクロロ酢酸溶液1mL添加して撹拌後、5分間水冷した後4℃、15,000rpm、10分間遠心分離し、上清を捨てた。次ぎにエタノール/酢酸エチル(1:1)混液1mL添加して撹拌後、5分間水冷した後4℃、15,000rpm、10分間遠心分離し、上清を捨てた。上清が黄色くなくなるまでエタノール/酢酸エチル(1:1)混液による洗浄を繰り返した。得られたタンパク質ペレットを6M グアニジン塩酸塩500μLに再溶解し、その溶液の405nmにおける吸光度及び溶液のタンパク質濃度を測定した。各試験区の吸光度よりリファレンス区の吸光度を差し引き、これをタンパク質濃度で除した値をカルボニル化度合いとした。結果はcontrolを100としたときの割合で示した。
処方例1.化粧水
[成分] 部
オリーブ油 1.0
ポリオキシエチレン(5.5)セチルアルコール 5.0
ブチルパラベン 0.1
製造例1の抽出物 3.0
エタノール 5.0
グリセリン 5.0
1,3−ブチレングリコール 5.0
水酸化カリウム 適量
精製水 全量が100部となる量
香料 適量
処方例1に含まれる製造例1の抽出物に代えて、製造例2〜6のいずれかの加水分解物又は発酵物3.0部を用いるほかは、処方例1と同様にして化粧水を得た。
[成分] 部
流動パラフィン 6.0
ヘキサラン 4.0
ホホバ油 1.0
ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノステアレート 1.0
親油型ステアリン酸グリセリル 1.0
大豆レシチン 1.5
製造例2の加水分解物 3.0
L−アスコルビン酸−2−グルコシド 2.0
水酸化カリウム 0.5
グリセリン 3.0
1、3−ブチレングリコール 2.0
カルボキシメチルセルロース 0.3
ヒアルロン酸ナトリウム 0.01
精製水 全量が100部となる量
香料 適量
処方例7の成分中、製造例2の加水分解物3.0に代えて、製造例4の発酵物3.0部を用いるほかは処方例7と同様にして乳液を得た。
処方例7の成分中、製造例2の加水分解物3.0に代えて、製造例5の加水分解物3.0部を用いるほかは処方例7と同様にして乳液を得た。
処方例7の成分中、L−アスコルビン酸−2−グルコシド2.0部及び水酸化カリウム0.5部に代えてアルブチン3.0部を用いるほかは処方例7と同様にして乳液を得た。
処方例7の成分中、L−アスコルビン酸−2−グルコシド2.0部及び水酸化カリウム0.5部に代えてトラネキサム酸2.0部を用いるほかは処方例7と同様にして乳液を得た。
処方例7の成分中、L−アスコルビン酸−2−グルコシド2.0部及び水酸化カリウム0.5部に代えてニコチン酸アミド3.0部を用いるほかは処方例7と同様にして乳液を得た。
[成分] 部
製造例2の加水分解物 10.0
エタノール 10.0
グリセリン 3.0
1、3−ブチレングリコール 2.0
メチルパラベン 0.2
クエン酸 0.1
クエン酸ナトリウム 0.3
カルボキシビニルポリマー 0.1
キサンタンガム 0.1
香料 適量
水酸化カリウム 適量
精製水 全量が100部となる量
処方例13の成分中、製造例2の加水分解物10.0部に代えて、製造例6の加水分解物10.0部を用いるほかは処方例13と同様にして乳液を得た。
[成分] 部
エタノール 2.0
グリセリン 5.0
1、3−ブチレングリコール 5.0
メチルパラベン 0.1
ヒアルロン酸 0.1
製造例1の抽出物 5.0
クエン酸 0.3
クエン酸ナトリウム 0.6
精製水 全量が100部となる量
処方例14の成分中、製造例1の抽出物に代えて製造例4の発酵物5.0部を用いるほかは処方例14と同様にしてエッセンスを得た。
[成分] 部
ステアリン酸 2.4
モノステアリン酸プロピレングリコール 2.0
セトステアリルアルコール 0.2
液状ラノリン 2.0
流動パラフィン 3.0
ミリスチン酸イソプロピル 8.5
プロピルパラベン 0.05
製造例4の加水分解物 5.0
カルボキシメチルセルロースナトリウム 0.2
ベントナイト 0.5
プロピレングリコール 4.0
トリエタノールアミン 1.1
メチルパラベン 0.1
精製水 全量が100部となる量
酸化チタン 8.0
タルク 4.0
着色顔料 適量
[成分] 部
N−ラウロイルメチルアラニンナトリウム 25.0
ヤシ油脂肪酸カリウム液(40%) 26.0
ヤシ油脂肪酸ジエタノールアミド 3.0
メチルパラベン 0.1
製造例2の加水分解物 5.0
1,3−ブチレングリコール 2.0
精製水 全量が100部となる量
[成分] 部
グリチルリチン酸ジカリウム 0.1
モノニトログアヤコールナトリウム 0.02
塩酸ピリドキシン 0.03
l−メントール 0.8
タマサキツヅラフジ根エキス 0.3
褐藻エキス 0.3
オタネニンジンエキス 0.3
ゲンチアナエキス 2.0
製造例5の加水分解物 3.5
トリメチルグリシン 0.5
乳酸 0.2
1、3−ブチレングリコール 10.0
フェノキシエタノール 0.2
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油 0.4
L−アルギニン 適量
エタノール 20.0
精製水 全量が100部となる量
[成分] 部
N−ヤシ油脂肪酸メチルタウリンナトリウム 10.0
ポリオキシエチレン(3)アルキルエーテル硫酸ナトリウム 20.0
ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン 10.0
ヤシ油脂肪酸ジエタノールアミド 4.0
メチルパラベン 0.1
クエン酸 0.1
製造例6の加水分解物 2.0
1、3−ブチレングリコール 2.0
精製水 全量が100部となる量
[成分] 部
ポリオキシエチレン(10)硬化ヒマシ油 1.0
塩化ジステアリルジメチルアンモニウム 1.5
塩化ステアリルトリメチルアンモニウム 2.0
2−エチルヘキサン酸グリセリル 1.0
セタノール 3.2
ステアリルアルコール 1.0
メチルパラベン 0.1
実施例3の加水分解物 2.0
1,3−ブチレングリコール 5.0
精製水 全量が100部となる量
製造例2の加水分解物 10.0
コラーゲン 8.0
クエン酸 0.1
甘味料(スクロース) 0.01
酸化防止剤(ビタミンC) 0.01
精製水 全量が100部となる量
製造例5の加水分解物 20.0
ビタミンC 20.0
脂肪酸エステル 10.0
乳酸カルシウム 20.0
乳糖 30.0
上記重量部の各成分を混合した後、加圧成形し、錠剤とした。
Claims (4)
- 米、米糠又はサンショウの抽出物又はその加水分解物或いは発酵物を有効成分とする酸化蛋白質除去用組成物。
- 米、米糠又はサンショウの抽出物又はその加水分解物或いは発酵物を有効成分とする糖化蛋白質除去用組成物。
- 請求項1又は2に記載の組成物を含む皮膚外用剤。
- 請求項1又は2に記載の組成物を含む飲食品。
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