JP2018052932A - 膠芽腫のためのプロカスパーゼ併用療法 - Google Patents

Abstract

【課題】細胞死（例えば癌細胞死）を誘導するための組成物及び方法の提供。
【解決手段】癌細胞の成長又は増殖を抑制する式（Ｉ）で表される化合物と、式（ＰＡＣ−１）で表される化合物と薬学的に許容される希釈剤、賦形剤又は担体とを含む組成物。

【選択図】なし

Description

関連出願

本願は、２０１２年３月６日出願の米国特許仮出願第６１／６０７１０３号に基づいて３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）による優先権を主張するものである。この仮出願は、参照により本明細書に組み入れられる。

発明の背景

アポトーシス、すなわちプログラム細胞死は、すべての多細胞生物の発生及びホメオスタシスにおいて中心的役割を果たしている。癌の一般的な特徴は、天然のアポトーシスシグナルに対する耐性である。癌のタイプに応じて、この耐性は、通常、アポトーシスカスケードにおける主要タンパク質の上方若しくは下方制御によるか、又はこれらのタンパク質をコードする遺伝子の変異による。そのような変化は、ミトコンドリア及びカスパーゼ−９を介する内因性アポトーシス経路と、細胞死受容体及びカスパーゼ−８の作用を伴う外因性アポトーシス経路と、の両方で生じる。例えば、ｐ５３、Ｂｉｍ、Ｂａｘ、Ａｐａｆ−１、ＦＬＩＰ及びその他多くのタンパク質の適正レベルの変化が癌において観察されている。この変化は、不完全なアポトーシスカスケード、すなわち、上流のアポトーシス促進シグナルが十分に伝達されず、実行型カスパーゼであるカスパーゼ−３及びカスパーゼ−７が活性化されないカスケードをもたらす可能性がある。

ほとんどのアポトーシス経路が最終的にプロカスパーゼ−３の活性化を伴うので、上流の遺伝子異常は事実上アポトーシス回路における「遮断」であり、その結果、そのような細胞は異常に増殖する。癌におけるアポトーシスの中心的役割を考慮して、アポトーシスカスケードにおける特異的タンパク質を標的とする治療薬を開発する試みが行われてきた。例えば、カスケードメンバー（例えば、ｐ５３及びＢｃｌファミリーのタンパク質）に対する又はアポトーシス阻害タンパク質（ＩＡＰ）ファミリーのタンパク質に対するペプチド分子又は小分子の結合剤は、Ａｐａｆ−１のオリゴマー化を促進する化合物と同様のアポトーシス促進活性を有する。しかし、そのような化合物はアポトーシスカスケード上の早期（又は中位から高位）のポジションを標的とするので、それらのメンバーの下流のタンパク質に影響する変異のある癌は、それらの化合物のあり得る有益な効果に対して依然として耐性を有し得る。

アポトーシスカスケードの遠位の下流にあるアポトーシス促進タンパク質を直接活性化する小分子を同定することは治療上有益である。このアプローチはカスケード中の比較的低ポジションに関わり、それにより、上流アポトーシス機構に影響する変異のある細胞であっても死滅させることが可能となる。さらに、そのような治療戦略は、そのアポトーシス促進タンパク質が癌細胞において上方制御されるか又は高いレベルで存在する場合に成功の可能性がより高くなる。したがって、アポトーシスの下流エフェクタータンパク質であるプロカスパーゼ−３を標的とする小分子の同定は現在の癌治療を著しく促進することになる。

プロカスパーゼ−３がカスパーゼ−３に変換又は活性化されると、活性「実行型」カスパーゼ形態が生成され、これが続いて多数のタンパク質基質の加水分解を触媒する。活性カスパーゼ−３はヘテロダイマーのホモダイマーであり、プロカスパーゼ−３のタンパク質分解によって産生される。インビボにおいて、このタンパク質分解性活性化は、通常、カスパーゼ−８又はカスパーゼ−９の作用を介して生じる。酵素前駆体（プロ酵素）が時期尚早に活性化されないように、プロカスパーゼ−３は、タンパク質分解のＥＴＤ部位（アミノ酸配列：ｉｌｅ−ｇｌｕ−ｔｈｒ−ａｓｐ）へのアクセスを阻止する１２アミノ酸の「セーフティキャッチ」を有する。このセーフティキャッチは、プロカスパーゼ−３がカスパーゼ−９による自己触媒的活性化及びタンパク質分解に抵抗することを可能にする。変異原性試験では、連続する３個のアスパラギン酸残基がセーフティキャッチの重要成分であるように思われることが示されている。セーフティキャッチの部位はｐＨに感受性があるため、（アポトーシス中に生じる）細胞の酸性化の際に、セーフティキャッチはタンパク質分解の部位へのアクセスを可能とし、活性カスパーゼ−３は、カスパーゼ−９の作用によって又は自己活性化機構を介して産生されることができると考えられる。

特定の癌では、プロカスパーゼ−３のレベルは正常組織に比べて上昇する。２０名の結腸癌患者から得た一次単離物の研究では、平均して、プロカスパーゼ−３が、隣接した非癌性組織と比較してそのような単離物において６倍上方制御されたことが示されている。また、プロカスパーゼ−３は、特定の神経芽腫、リンパ腫及び肝癌において上方制御される。さらに、米国国立癌研究所（ＮＣＩ）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｐｒｏｇｒａｍによる癌スクリーニングで使用されている６０細胞株パネルにおけるプロカスパーゼ−３レベルの系統的評価が行われ、特定の肺癌、黒色腫、腎癌及び乳癌が非常に高レベルのプロカスパーゼ−３発現を示すことが明らかとなった。

アポトーシス達成における活性カスパーゼ−３の役割、特定の癌細胞型におけるプロカスパーゼ−３の比較的高いレベル、及びその自己活性化の興味深いセーフティキャッチ媒介性抑制によって、プロカスパーゼ−３を直接修飾する小分子は癌標的治療での大きな適用可能性を有する。

併用療法は癌患者の処置の標準となっている。併用療法の混合薬レジメンの目的は、化学療法薬間の相乗又は相加効果を実現し、それにより処置時間の短縮、毒性の低減、及び患者の生存の増加を促進することである。単一の生化学経路に作用する薬物は、「合成致死性」の遺伝子の組み合わせを模倣し得ることから、相乗又は増強作用に関する特に有力な候補である。例えば、ＤＮＡ損傷修復を促進する酵素であるポリ（ＡＤＰリボース）ポリメラーゼ−１（ＰＡＲＰ−１）の阻害剤は、細胞培養、動物モデル及びヒト治験において証明されているようにＤＮＡ損傷剤と共に強力な相乗作用を示す。しかし、依然として、多くの形態の癌を処置するためのより有効な治療法が必要とされており、抗癌薬の新たな相乗的な組み合わせがこの探求に有用であろう。したがって、癌細胞の死滅には有効であるが、正常な宿主組織を該薬物の好ましくない毒性から保護する、新規の細胞毒性薬を同定する必要性がある。

概要

本発明は、概して、化合物、組成物、及び治療的処置の方法を提供する。種々の実施形態において、本発明は、種々の癌性疾患及び癌細胞型、例えば、乳癌、リンパ腫、副腎癌、腎癌、黒色腫、白血病、神経芽腫、肺癌、脳癌、及び当技術分野で公知の他の癌に適用可能である。本明細書では、特に、細胞死を誘発することができる小分子を含む組成物及び方法が開示される。一部の実施形態において、組成物及び方法は、プログラム細胞死経路のメンバー（例えばプロカスパーゼ−３）と直接的又は間接的に相互作用し得る化合物を含む。特定の実施形態において、組成物及び方法は、プログラム細胞死経路のメンバー（例えばプロカスパーゼ−３）と直接的又は間接的に相互作用する他の化合物と比較して低減された神経毒性を有する。

併用抗癌療法は、異なる生化学経路を標的とする薬物、又は同一経路での異なる標的を攻撃し、「合成致死性」の遺伝子の組み合わせを模倣する薬物から構成され得る。プロカスパーゼ−３活性化薬ＰＡＣ−１及びアルキル化剤テモゾロミド（ＴＭＺ）の組み合わせは大きな相乗作用を示し、相加効果をはるかに上回る程度に癌細胞のアポトーシス死を誘導する。ＰＡＣ−１及びＴＭＺの組み合わせは、化合物単独では効果が僅かであるか効果がない腫瘍モデルの腫瘍量を効果的に低減させる。これらのデータは、癌の処置におけるＰＡＣ−１／ＴＭＺの組み合わせの有効性を示しており、より広く見れば、この相乗的な組み合わせが顕著に増強された治療上の利益をもたらし得ることを示している。

すなわち、本発明は、
（ａ）式（Ｉ）：

の化合物と、
（ｂ）化合物ＰＡＣ−１：

と、
（ｃ）薬学的に許容可能な希釈剤、賦形剤又は担体と、
を含む組成物を提供する。式（Ｉ）の化合物はテモゾロミド（ＴＭＺ）であり得る。他の実施形態において、式（Ｉ）の化合物の構造は、ＴＭＺの誘導体又はそのプロドラッグで置き換えることができる。担体は水を含み得、活性薬物を有利に送達するための任意選択の成分、例えば、緩衝液、糖、シクロデキストリン又はそれらの種々の組み合わせをさらに含み得る。一実施形態において、シクロデキストリンは２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンである。

式（Ｉ）の化合物の濃度は、約１００μＭ〜約１ｍＭ、通常、約２５０μＭ、約５００μＭ、又は約７５０μＭであり得る。ＰＡＣ−１の濃度は、約２μＭ〜約５０μＭ、通常、約２．５μＭ、約５μＭ、約７．５μＭ、約１０μＭ、約１２．５μＭ、約１５μＭ、約２０μＭ、約２５μＭ、約３０μＭ、約４０μＭ、又は約５０μＭであり得る。例えば、一実施形態において、式（Ｉ）の化合物の濃度は約２５０μＭ〜約７５０μＭであり得、ＰＡＣ−１の濃度は約５μＭ〜約３０μＭであり得る。

また、本発明は、癌細胞の成長又は増殖を抑制する方法を提供する。該方法は、癌細胞を有効量の本明細書に記載の組成物と接触させるステップを含み、組成物はＰＡＣ−１とＴＭＺの一方又は両方を含み得る。本組成物がＰＡＣ−１及びＴＭＺのうちの一方しか含まない場合、該方法は、引き続き癌細胞を他方と接触させるステップを含む。癌細胞をこれらの活性薬物（ＰＡＣ−１及びＴＭＺ）と接触させることによって、癌細胞の成長又は増殖が抑制される。

また、本発明は、癌細胞におけるアポトーシスを誘導する方法であって、癌細胞を、有効量の式（Ｉ）：

の化合物及び有効量の化合物ＰＡＣ−１：

と接触させるステップを含み、アポトーシスはそれにより癌細胞において誘導される、方法を提供する。接触はインビトロにおけるものであり得る。あるいは、接触はインビボにおけるものであり得る。一実施形態において、癌細胞は、式（Ｉ）の化合物及びＰＡＣ−１を同時に接触させることができる。他の実施形態では、癌細胞をＰＡＣ−１と接触させる前に癌細胞を式（Ｉ）の化合物と接触させることができる。さらなる実施形態では、癌細胞を式（Ｉ）の化合物と接触させる前に癌細胞をＰＡＣ−１と接触させることができる。

さらに、本発明は、処置の必要な患者における癌を処置する方法を提供する。該方法は、
治療有効量の式（Ｉ）：

の化合物及び有効量の化合物ＰＡＣ−１：

を患者に同時又は逐次に投与するステップを含み、癌はそれにより処置される。一実施形態において、式（Ｉ）の化合物及び化合物ＰＡＣ−１は同時に投与することができる。他の実施形態において、式（Ｉ）の化合物及び化合物ＰＡＣ−１は逐次に投与される。逐次に投与する場合、式（Ｉ）の化合物は化合物ＰＡＣ−１の前に投与することができ、また、式（Ｉ）の化合物は化合物ＰＡＣ−１の後に投与することができる。

種々の実施形態の癌細胞は、脳組織の癌細胞又は骨組織の癌細胞であり得る。例えば、癌細胞は、膠芽腫細胞又は希突起神経膠腫細胞であり得る。他の実施形態において、癌細胞は骨肉腫細胞であり得る。抑制可能な他のタイプの癌細胞及び処置可能な癌性状態についてさらに以下で説明される。

すなわち、本発明は、薬物療法で使用するための本明細書に記載の組成物の使用を提供する。薬物療法は、癌、例えば、乳癌、肺癌、膵癌、前立腺癌、結腸癌、及び本明細書に記載の他の癌を処置することであり得る。また、本発明は、哺乳動物の疾患（例えば、ヒトの癌）を処置するための医薬を製造するための本明細書に記載の組成物の使用を提供する。すなわち、本発明は、哺乳動物（例えばヒト）の癌の処置に有用な医薬を製造するための本明細書に記載の化合物の使用を提供する。医薬は、薬学的に許容可能な希釈剤、賦形剤又は担体を含み得る。

添付の図面は本明細書の一部を形成し、特定の実施形態又は本発明の種々の態様をさらに例示するために含まれる。いくつかの例では、本発明の実施形態は、本明細書中の詳細な説明と組み合わせて添付の図面を参照することによって最もよく理解され得る。本明細書中の説明及び添付の図面は、本発明のある特定の例又はある特定の態様を示したものであり得る。しかし、例又は態様の一部が本発明の他の例又は態様と組み合わせて使用され得ることは当業者には理解されよう。

Ｆｉｇｕｒｅ１： ＰＡＣ−１は、ＴＭＺと相乗的に作用して膠芽腫のラットモデルの生存を延長する。４群の９Ｌ頭蓋内同系ラットモデルの生存率グラフ。９Ｌ（ラット神経膠腫）細胞をラットの頭蓋内に移植した。ＰＡＣ−１（５０ｍｇ／ｋｇ（水中））を０〜４日目に強制経口投与し、ＴＭＺ（５０ｍｇ／ｋｇ（水中））を５〜９日目に強制経口投与した。１群につき８匹のラット。ｐ値はＴＭＺ単独に対するものである。生存期間中央値：対照：１４．５日；ＰＡＣ−１：１３．５日；ＴＭＺ：２０日；組み合わせ：２８日。併用曲線の全体のｐ値はｐ＝０．０００１である。組み合わせに対するＴＭＺ単独のｐ値は、ｐ＝０．０００７（ログランク検定）及びｐ＝０．００１（Ｇｅｈａｎ−Ｂｒｅｓｌｏｗ−Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定）。 Ｆｉｇｕｒｅ２： ＰＡＣ−１は、ＴＭＺと相乗的に作用して培養下の膠芽腫細胞の死を誘導する。Ａ）９Ｌ膠芽腫細胞を図に示した濃度のＰＡＣ−１＋ＴＭＺに暴露し、細胞死を４８時間で評価した（０μＭ ＰＡＣ−１の下の０μＭ ＴＭＺでは細胞死は検出不可能であった）。Ｂ）Ｄ−５４ヒト膠芽腫細胞を図に示した濃度のＰＡＣ−１＋ＴＭＺに暴露し、細胞死を２４時間で評価した（０μＭ ＰＡＣ−１の下の０μＭ ＴＭＺでは細胞死は検出不可能であった）。点線（横線）は、化合物の単なる相加効果から予想される細胞死のレベルを示す。凡例は棒グラフの棒に対応するものであり、ここで、最も上の凡例は一番左の棒に対応し、残りの凡例は残りの棒に対応（上〜下の凡例はそれぞれ左〜右の棒に対応）している。 Ｆｉｇｕｒｅ３： ＰＡＣ−１は、ＴＭＺと相乗的に作用して培養下の骨肉腫細胞の死を誘導する。Ａ）ＨＯＳ細胞を図に示した濃度のＰＡＣ−１＋ＴＭＺに暴露し、細胞死を２４時間で評価した（０μＭ ＰＡＣ−１の下の０μＭ ＴＭＺでは細胞死は検出不可能であった）。Ｂ）１４３Ｂ細胞を図に示した濃度のＰＡＣ−１＋ＴＭＺに暴露し、細胞死を２４時間で評価した（０μＭ ＰＡＣ−１の下の０μＭ ＴＭＺ又は２５０μＭ ＴＭＺでは細胞死は検出不可能であった）。凡例は棒グラフの棒に対応するものであり、ここで、最も上の凡例は一番左の棒に対応し、残りの凡例は残りの棒に対応（上〜下の凡例はそれぞれ左〜右の棒に対応）している。 Ｆｉｇｕｒｅ４： ＰＡＣ−１は、ＴＭＺと相乗的に作用して転移性骨肉腫マウスモデルの生存を延長する。Ｋ７Ｍ２細胞の注射から７日後、５日連続して毎日、マウスをＰＡＣ−１（１００ｍｇ／ｋｇ（ＨＰβＣＤ中））若しくはＴＭＺ（５０ｍｇ／ｋｇ経口甘味料）で経口的に処置するか又は各々での逐次処置を行った。１群当たりｎ＝マウス８匹。

詳細な説明

癌細胞において多くの場合不活性型で過剰発現されるか又は高いレベルで存在する酵素を活性化することができる化合物が見出されている。この化合物は、癌細胞（例えば、プロカスパーゼ−３が上方制御された細胞又はプロカスパーゼ−３のレベルが上昇する細胞）におけるプログラム細胞死（アポトーシス）を誘導することができる。多くの癌は標準的化学療法に耐性がある。本明細書に記載の併用療法は、ＴＭＺのＤＮＡアルキル化特性と相乗的に作用するＰＡＣ−１によるプロカスパーゼ−１活性化を利用するものであり、それにより、活性薬物のいずれか単独ではそれほど又は全く有効でない条件下においても有効性を示す。また、これらの化合物は癌標的療法において有効であり、ここでは、プロカスパーゼ−３のレベルが低い非癌性細胞に対する副作用が比較的低減されていて、癌細胞の死滅における選択性という利点がある。これらの副作用には、毒性、特に神経毒性が含まれ得る。

本明細書に記載の化合物の組み合わせ、組成物及び方法は、アポトーシス若しくはプログラム細胞死の調節及びＤＮＡアルキル化を介して作用して、癌細胞の処置に有効性を示す。一実施形態において、アポトーシスの調節はアポトーシスの誘導又は活性化によるものである。種々の実施形態において、化合物の投与は同時であっても逐次であってもよい。

すなわち、本発明は、例えば膠芽腫又は骨肉腫を処置するための、ＰＡＣ−１によるテモゾロミド（ＴＭＺ）の増強のための方法を提供する。アポトーシス中、酵素前駆体プロカスパーゼ−３がタンパク質分解によりカスパーゼ−３に活性化され、次いで、この活性カスパーゼ−３が多数の細胞基質を切断してアポトーシスプログラムを実行する。プロカスパーゼ−３タンパク質レベルは種々の腫瘍組織学的検査で上昇するので、プロカスパーゼ−３の薬物媒介性直接活性化は選択的抗癌戦略として非常に有効となり得る。

特定の化合物は、プロカスパーゼ−３の活性及び自己成熟（ａｕｔｏｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）を促進し、癌細胞におけるアポトーシスを誘導することができる。プロカスパーゼ活性化化合物−１（ＰＡＣ−１）は、抑制性亜鉛イオンのキレート化によってプロカスパーゼ−３の活性を促進し、培養下の癌細胞におけるアポトーシスを誘導し、複数のマウス腫瘍モデルで有効性を示す。ＰＡＣ−１及びＴＭＺという治療薬の新規の組み合わせは、癌細胞、特に膠芽腫細胞及び骨肉腫細胞の処置において相乗的に有効性を示すことが見出されている。

９Ｌラット膠芽腫細胞株におけるモデル実験は、上記薬物の組み合わせの相乗作用及び有効活性についての知見を支持する明確なデータを提供する。インビボのラット実験では、高浸潤性腫瘍モデルである９Ｌ細胞が使用された。これは、３つの処置群（ＰＡＣ−１単独、ＴＭＺ単独、及びＰＡＣ−１とＴＭＺとの組み合わせ）及び１つの対照群においてラット頭蓋内に移植された。

ＰＡＣ−１を水に懸濁し、５０ｍｇ／ｋｇ（比較的低用量）で５日間ラットに強制経口投与し、その後、５日間のＴＭＺ投与を行った。２００ｍｇ／ｋｇ以下の経口投与の場合、ＰＡＣ−１ではマウスにおいて神経毒性は確認されず、また、本実験において神経毒性は確認されなかった。上記組み合わせで処置されたラットの延命効果は顕著であり、劇的であった（Ｆｉｇｕｒｅ１）。

Ｆｉｇｕｒｅ１は、９Ｌ細胞をラット頭蓋内に移植した場合に得られたデータを概略的に示したものである。ＰＡＣ−１（５０ｍｇ／ｋｇ（水中））を０〜４日目に強制経口投与し、ＴＭＺ（５０ｍｇ／ｋｇ（Ｈ_２Ｏ中））を５〜９日目に強制経口投与した。１群当たりのラットは８匹であった。０．００１のｐ値はＴＭＺ単独に対して得られたものである（Ｇｅｈａｎ−Ｂｒｅｓｌｏｗ−Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定）。

９Ｌ細胞株でのＰＡＣ−１のＩＣ_５０の初期評価は約７μＭである（７２時間実験）。９Ｌ細胞株脳腫瘍は通常出血性であるが、ＰＡＣ−１／ＴＭＺ処置ラットでは、腫瘍は出血性ではなかった。これは抗血管新生作用を示している。

Ｆｉｇｕｒｅ２は、ＰＡＣ−１がＴＭＺと相乗的に作用して培養下の膠芽腫細胞の死を誘導する３つの例を示したものである。Ｆｉｇｕｒｅ３は、ＰＡＣ−１がＴＭＺと相乗的に作用して培養下の骨肉腫細胞の死を誘導する２つの例を示したものである。Ｆｉｇｕｒｅ４は、ＰＡＣ−１がＴＭＺと相乗的に作用して転移性骨肉腫のマウスモデルで生存を延長する例を示したものである。

ＰＡＣ−１／ＴＭＺの組み合わせのＭＴＤは確定されつつあり、また、長期の処置期間（各薬物を同時に１０日間）並びに逐次及び同時投与レジメンについての評価が行われているところである。延命効果は、処置前及び処置後のプロカスパーゼ３及びカスパーゼ３レベルの測定値として評価されている。また、この併用療法は、例えば異種移植モデル及び哺乳動物対象における、ホプキンスの膠芽腫患者に由来する神経球細胞株の処置にも有効であり得る。

治療薬及び活性：
ＰＡＣ−１（２−（４−ベンジルピペラジン−１−イル）−Ｎ−［（２−ヒドロキシ−３−プロパ−２−エニル−フェニル）メチリデンアミノ］アセトアミド）は、癌細胞におけるアポトーシスを選択的に誘導する。ＰＡＣ−１の調製方法は、米国特許出願公開第２０１２／００４０９９５号（Ｈｅｒｇｅｎｒｏｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．）に開示されている。

テモゾロミド（ＴＭＺ）は、アルキル化剤として分類される細胞傷害性化学療法薬である。ＴＭＺはイミダゾテトラジンの誘導体であって、ＭＴＩＣ（３−メチル−（トリアゼン−１−イル）イミダゾール−４−カルボキサミド）のプロドラッグである。ＴＭＺ及びその誘導体の調製については米国特許第５２６０２９１号（Ｌｕｎｔ ｅｔ ａｌ．）に記載されている。

テモゾロミドの治療上の利益は、ＤＮＡをアルキル化／メチル化させる（これは、グアニン残基のＮ−７位又はＯ−６位で生じ得る。）能力に由来する。このメチル化はＤＮＡを損傷させ、腫瘍細胞の死を引き起こす。一部の腫瘍細胞はこの種のＤＮＡ損傷を修復することができ、それためテモゾロミドの治療効力を低減させる。この耐性の機序は、タンパク質Ｏ−６−メチルグアニン−ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＭＧＭＴ）又はＯ−６−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ＡＧＴ又はＡＧＡＴ）の発現によるものであり得る。脳腫瘍内にＯ−６−メチルグアニン−ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＭＧＭＴ）タンパク質が存在すると、テモゾロミドに対する応答性の不良が予測され、これらの患者は、テモゾロミドによる化学療法からはほとんど利益を受けない。したがって、脳腫瘍及び関連する症状の処置において新規の治療法が必要とされている。

ＴＭＺは、グレードＩＶ星状細胞腫（多形性膠芽腫としても知られている）、浸潤性脳腫瘍、及び希突起神経膠腫の処置に使用されてきた。ＴＭＺは黒色腫の処置に使用されてきており、さらに、再発したグレードＩＩＩ未分化星状細胞腫にも適応である。

異なる標的に作用する薬物の組み合わせを利用する抗癌戦略には明らかな利益があるが、本明細書に記載の試験は、異なる機序を介して作用する化合物で劇的な相乗効果が認められることを実証している。酵素の活性化を求める場合、この多重標的化戦略は特別な利点を有し得る。

ＰＡＣ−１は哺乳動物において安全であり、ＰＡＣ−１誘導体はリンパ腫のペット用イヌの第Ｉ相臨床試験において有効であった（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ７０， ７２３２−７２４１（２０１０））。したがって、観察されたＴＭＺとの相乗作用は重要な臨床的影響を有するはずである。小分子による酵素の活性化に対する関心が急速に高まってきている。本明細書に記載のデータは、ＰＡＣ−１及びＴＭＺを用いる標的化戦略が目的の生物学的効果を劇的に促進する一般的なアプローチであり、その効果により重要な臨床的影響を及ぼすはずであることを示している。

本発明の方法：
本発明は、癌細胞におけるアポトーシスを選択的に誘導する方法であって、癌細胞のプロカスパーゼ−３分子を修飾可能な化合物の組み合わせを癌細胞に投与するステップを含み、化合物の組み合わせはＰＡＣ−１及びＴＭＺである、方法を提供する。また、癌細胞におけるアポトーシスを選択的に誘導する方法であって、癌細胞のプロカスパーゼ−３分子を修飾可能な化合物の組み合わせを癌細胞に投与するステップを含み、化合物の組み合わせはＰＡＣ−１及びＴＭＺであり、例えば、癌細胞は処置の必要な患者体内にある、方法を提供する。

本発明は、上記化合物の組み合わせがＰＡＣ−１及びＴＭＺであるさらなる方法を提供する。例えば、癌細胞を処置する方法であって、（ａ）プロカスパーゼ活性化化合物による癌細胞の処置に対する潜在的な感受性を同定するステップと、（ｂ）プロカスパーゼ活性化化合物及びＴＭＺの組み合わせの有効量に癌細胞を暴露するステップと、を含む方法を提供する。さらに、癌細胞を処置する方法であって、（ａ）プロカスパーゼ活性化化合物による癌細胞の処置に対する潜在的な感受性を同定するステップと、（ｂ）有効量のＰＡＣ−１及びＴＭＺに癌細胞を暴露するステップと、を含み、ＰＡＣ−１はプロカスパーゼ−３及びプロカスパーゼ−７の少なくとも１つを活性化することができる、方法を提供する。さらに、癌細胞における死を誘導する（例えば、癌細胞を死滅させる）方法であって、ＴＭＺと、癌細胞のプロカスパーゼ−３分子を活性化することができる化合物と、を癌細胞に投与するステップを含む方法を提供する。

さらに、本発明は、ＰＡＣ−１及びＴＭＺの組み合わせの有効量を含む医薬を提供する。そのような医薬は、細胞のアポトーシスを誘導する方法において使用することができる。一部の実施形態において、化合物の組み合わせは、感知可能な神経毒性作用を患者にもたらす程度に血液脳関門を通過するものではない。本発明の方法は、１種又は複数の細胞を、インビボ又はインビトロで本明細書に記載の化合物の組み合わせの有効量と接触させるステップを含む。また、本発明は、細胞を処置する方法であって、細胞を本明細書に記載の化合物の組み合わせの有効量と接触させるステップを含む方法を提供する。

定義：
本明細書において、記載された用語は以下の意味を有する。本明細書で使用されている他のすべての用語及びフレーズは、当業者が理解し得るそれらの通常の意味を有する。そのような通常の意味は、専門用語辞典（例えば、Ｈａｗｌｅｙ’ｓ Ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ １４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， ｂｙ Ｒ．Ｊ．Ｌｅｗｉｓ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，２００１）を参照することによって得ることができる。

明細書中で「一実施形態」、「実施形態」などに言及される場合、記載されている実施形態は特定の態様、特徴、構造、成分又は特性を含み得るが、すべての実施形態が必ずしもその態様、特徴、構造、成分又は特性を含むわけではないことを示す。また、そのようなフレーズは、明細書の他の部分で言及されている同じ実施形態を意味し得るが、必ずしもそれを意味するわけではない。さらに、特定の態様、特徴、構造、成分又は特性がある実施形態に関連して記載されている場合、そのような態様、特徴、構造、成分又は特性を他の実施形態に影響させ、関連付けることは、明示的に記載されているかどうかに関わらず当業者の知識の範囲内である。

文脈上明らかに他の意味に解すべき場合でない限り、単数形（“ａ”、“ａｎ”及び“ｔｈｅ”）には複数の意味が含まれる。したがって、例えば、「化合物」（“ａ ｃｏｍｐｏｕｎｄ”）と言う場合、複数のそのような化合物が含まれ、化合物Ｘには複数の化合物Ｘが含まれる。また、請求項は任意選択の要素を除外するように記載され得ることに留意されたい。この説明は、請求項の要素の記載又は「否定的」限定の使用に関連して、排他的な用語（例えば、「単独で」（“ｓｏｌｅｌｙ”）、「のみ」（“ｏｎｌｙ”））の使用の前提となることを意図したものである。

用語「及び／又は」は、該用語が関連している項目のいずれか１つ、項目の任意の組み合わせ、又は項目のすべてを意味する。「１つ又は複数の」というフレーズは、特にそれが使用される文脈で解釈する場合、当業者によって容易に理解される。例えば、フェニル環の１個又は複数の置換基とは、１〜５個、あるいは例えばフェニル環が二置換の場合は１〜４個を意味する。

用語「約」は、指定された値の±５％、±１０％、±２０％、又は±２５％の変動を意味し得る。例えば、「約５０」パーセントは、一部の実施形態では、４５〜５５パーセントの変動を生じ得る。整数の範囲に関して、「約」という用語は、記載された範囲の両端の整数よりも１つ若しくは２つ大きい整数及び／又は１つ若しくは２つ小さい整数を含み得る。特に断らない限り、本明細書において、用語「約」は、個々の成分、組成物又は実施形態の機能の点で同等である、記載された範囲に近い値（例えば重量パーセント）を含むものとする。

当業者によって理解されるように、成分の量、特性（例えば分子量）、反応条件などを表現するものを含むすべての数値は近似値であり、すべての場合に任意選択で用語「約」により修飾されるものとする。これらの値は、本明細書の教示を利用する当業者が得ようとする所望の特性に応じて変わり得る。また、そのような値は、それぞれの試験測定において見られる標準偏差から必然的に生じる変動を内在的に含むことも理解される。

（特に書面による説明を提供するという観点から）当業者によって理解されるように、本明細書に記載されているすべての範囲は、任意の及びすべての可能性のある部分範囲及びその部分範囲の組み合わせ、並びに範囲を構成する個別の値、特に整数値を包含する。記載されている範囲（例えば、重量パーセンテージ又は炭素基）には、該範囲内の各々の特定の値、整数、小数、又はアイデンティティが含まれる。記載されているいかなる範囲も、少なくとも該範囲が２分の１、３分の１、４分の１、５分の１、又は１０分の１まで分割されることが十分に記載されており、それが可能であることは容易に認識され得る。非限定的な例として、本明細書に記載の各範囲は、下位３分の１、中位３分の１、上位３分の１などに容易に分けることができる。また、当業者により理解されるように、「多くても」、「少なくとも」、「より大きい」、「以下」、「以上」などの表現はすべて、記載された数値を含み、そのような用語は、上述の部分範囲まで分割できる範囲を指す。同様に、本明細書に記載されているすべての比率は、当該より広い比率の範囲内にあるすべての部分比率を含む。したがって、ラジカル及び置換基に関する特定の値及び範囲は説明目的でのみ記載されており、それらは、ラジカル及び置換基に関して規定される他の値又は規定される範囲内の他の値を除外するものではない。

メンバーが一般的な方法で（例えばマーカッシュグループとして）一緒にグループ化されている場合、本発明は、記載されているグループの全体だけでなく、グループの各メンバーを個別に包含し、また、メイングループ中のすべての可能なサブグループも包含することは当業者であれば容易に理解するであろう。また、本発明は、メイングループを包含するだけでなく、メイングループにおいて１つ又は複数のグループメンバーが存在しない場合も包含する。すなわち、本発明は、記載されたグループのメンバーのうちのいずれか１つ又は複数の明確な除外も想定している。したがって、但し書きは、開示されたすべてのカテゴリー又は実施形態に適用することができ、それにより、（例えば、明示的な否定的限定で使用される場合のように、）記載された要素、種又は実施形態のいずれか１つ又は複数をそのようなカテゴリー及び実施形態から除外することができる。

用語「接触」は、例えば、溶液中、反応混合物中、インビトロ又はインビボで、例えば、生理的反応、化学的反応又は物理的変化をもたらすために、触れさせる、接触させる、又は極めて近接した位置に置くことを指す。

「同時に」とは、（１）時間的に同時に、あるいは（２）同一の処置スケジュール中の異なる時に、ということを意味する。

「逐次に」とは、引き続き他の活性薬物の投与が行われる方法で使用されるある活性薬物の投与を意味する。ある活性薬物の投与後、次の活性薬物は実質的に第１の薬物の直後に投与することができ、また、次の活性薬物は第１の活性薬物の薬効時間後に投与することができる。薬効時間は、第１の活性薬物の投与からの最大の利益を実現するために与えられた時間の量である。

「有効量」とは、疾患、障害及び／又は状態を処置するために有効な量、あるいは、記載された効果（例えば、活性化又は抑制）などをもたらすための有効な量を意味する。例えば、有効量とは、処置されている状態又は症状の進行又は重症度を低減するのに有効な量であり得る。治療有効量の決定は当業者の能力の範囲内にある。用語「有効量」は、例えば、宿主における疾患又は障害の処置又は防止に、あるいは疾患又は障害の症状の処置に有効である、本明細書に記載の化合物の量又は本明細書に記載の化合物の組み合わせの量を含むものとする。したがって、「有効量」とは、概して、所望の効果が得られる量を意味する。一実施形態において、有効量とは、細胞又は対象（例えば患者）に単回投与又は複数回投与を行う際、成長若しくは増殖の抑制、死滅の誘導、又は過剰増殖性細胞の成長の阻害において、単独で又は医薬担体との組み合わせで有効である、本明細書に記載の活性薬物の量を意味する。そのような成長抑制又は死滅は、そのような処置がない場合に予想される程度を超える対象（例えば患者）の生存の延長として、あるいはそのような処置がない場合と比較した対象の予後の改善として反映され得る。

用語「処置すること」（“ｔｒｅａｔｉｎｇ”）、「処置する」（“ｔｒｅａｔ”）及び「処置」（“ｔｒｅａｔｍｅｎｔ”）には、（ｉ）疾患、病態若しくは医学的状態の発症を防止すること（例えば予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ））；（ｉｉ）疾患、病態若しくは医学的状態を抑制すること又はその進行を抑止すること；（ｉｉｉ）疾患、病態若しくは医学的状態を軽減すること；及び／又は（ｉｖ）疾患、病態若しくは医学的状態に随伴する症状を減弱させることが含まれる。したがって、用語「処置する」（“ｔｒｅａｔ”）、「処置」（“ｔｒｅａｔｍｅｎｔ”）及び「処置すること」（“ｔｒｅａｔｉｎｇ”）は予防まで及び得るものであり、処置している状態又は症状の進行又は重症度を防止する、低下させる、中止させる又は逆転させることを含み得る。したがって、用語「処置」（“ｔｒｅａｔｍｅｎｔ”）は医学的、治療的及び／又は予防的投与を適宜含み得る。一部の実施形態において、用語「処置」（“ｔｒｅａｔｍｅｎｔ”）、「処置する」（“ｔｒｅａｔ”）又は「処置された」（“ｔｒｅａｔｅｄ”）とは、（ｉ）腫瘍の成長若しくは再成長の防止（予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ））、（ｉｉ）目的の症状若しくは疾患の低減若しくは除去（治療（ｔｈｅｒａｐｙ））、又は（ｉｉｉ）腫瘍の除去若しくは破壊（治癒（ｃｕｒｅ））を意味し得る。

用語「抑制する」（“ｉｎｈｉｂｉｔ”）、「抑制すること」（“ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ”）及び「抑制（“ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ”）とは、疾患、感染、症状又は細胞群の成長又は進行を、遅延、停止又は逆転させることを意味する。抑制は、例えば、処置又は接触がない場合の成長又は進行と比較して、約２０％以上、４０％以上、６０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、又は９９％以上であり得る。さらに、用語「誘導する」（“ｉｎｄｕｃｅ”）、「抑制する」（“ｉｎｈｉｂｉｔ”）、「増強する」（“ｐｏｔｅｎｔｉａｔｅ”）、「上昇させる」（“ｅｌｅｖａｔｅ”）、「増加する」（“ｉｎｃｒｅａｓｅ”）、「減少する」（“ｄｅｃｒｅａｓｅ”）などは、２つの状態間の定量的差異を示し、しかも、２つの状態間の少なくとも統計学的に有意な差を意味し得る。例えば、「過剰増殖性細胞の成長を抑制するのに有効な量」とは、細胞の成長率が、一部の実施形態において、無処置細胞と少なくとも統計学的に有意に異なり得ることを意味する。本明細書において、そのような用語は例えば増殖率に適用することができる。

過剰増殖性細胞（例えば腫瘍細胞）の「成長又は増殖を抑制する」というフレーズは、その成長及び転移を遅延、中断、抑止又は中止することを意味するが、必ずしも新生物の成長の完全な除去を示すものではない。

用語「癌」（“ｃａｎｃｅｒ”）とは、概して、異常細胞の制御されない成長によって発症する１００種以上の疾患の群のいずれかを意味する。癌は、固形腫瘍及びリンパ腫、並びに非固形癌（例えば白血病）の形態をとり得る。正常細胞（これは、成熟まで複製し、その後、必要な場合にのみ、損傷した細胞を交換する。）とは異なり、癌細胞は際限なく成長・分裂して近傍の細胞を押し出し、最終的に身体の他の部分にまで広がる。

本発明は、癌及び癌性状態を処置するための方法を提供する。用語「癌性状態」（“ｃａｎｃｅｒｏｕｓ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ”）とは、速い増殖又は新生物形成を特徴とする異常な状態に細胞がある任意の状態に関する。癌性状態は悪性又は非悪性（例えば前癌状態）であり得る。「癌性状態」をさらに説明するために、「過剰増殖性」（“ｈｙｐｅｒｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ”）、「過形成性」（“ｈｙｐｅｒｐｌａｓｔｉｃ”）、「過形成」（“ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ”）、「悪性」（“ｍａｌｉｇｎａｎｔ”）、「腫瘍性」（“ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ”）及び「新生物形成」（“ｎｅｏｐｌａｓｉａ”）という用語を使用することができる。これらの用語は互換的に使用することができ、病理組織学上のタイプ、浸潤性の段階、又は癌の決定（例えば、悪性及び非悪性）に関わらず、すべてのタイプの過剰増殖性成長、過形成性成長、癌性成長若しくは発癌プロセス、転移組織、又は悪性に形質転換した細胞、組織若しくは器官を含むものとする。

用語「新生物形成」は、正常な増殖制御に対する応答性の損失を生じる新たな細胞成長（例えば腫瘍性細胞成長）を意味する。「過形成」は、細胞が異常に高い速度で成長していることを意味する。しかし、これらの用語は、文脈上明らかなように、互換的に使用可能であり、概して、細胞が異常な細胞成長速度を示していることを指す。「新生物形成」及び「過形成」は腫瘍（これは、良性、前悪性、上皮内癌、悪性、固形、又は非固形であり得る。）を含む。

ＰＡＣ−１及びＴＭＺの組み合わせは脳の癌の処置に特に有効であることが見出されている。脳の癌としては、乏突起神経膠腫及び膠芽腫（多形性膠芽腫（ＧＢＭ）を含む。）が挙げられる（それらに限定されない）。癌性細胞に冒された組織は、脳それ自体（例えば、頭蓋又は脊柱管中心部）に、リンパ組織に、血管に、脳神経に、又は脳膜（髄膜）、頭蓋骨、下垂体若しくは松果体に存在し得る。処置可能な脳癌の具体的な形態としては、例えば、星細胞腫、軟骨腫、軟骨肉腫、脊索腫、ＣＮＳ（中枢神経系）リンパ腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、神経節膠腫、神経節腫（神経節細胞腫ともいう）、神経膠腫（例えば、星細胞腫、乏突起神経膠腫、上衣腫）、血管芽腫（血管腫瘍ともいう）、原始神経外胚葉性腫瘍（ＰＮＥＴ）（例えば髄芽腫）、髄膜腫、及び前庭神経鞘腫（以前は聴神経腫瘍／神経鞘腫として知られていた。）が挙げられる。

また、上記組み合わせは、身体の他の器官に由来する癌から頭蓋内に浸潤する転移性腫瘍の処置に使用することもできる。これらの状態は一般に二次脳腫瘍と呼ばれている。ＰＡＣ−１及びＴＭＺの組み合わせで処置することができる二次脳腫瘍には、肺癌、乳癌、悪性黒色腫、腎癌、結腸癌、及び他の癌腫に由来する脳の転移性腫瘍が含まれる。

本発明の範囲内にある癌性状態の他の例としては、神経芽細胞腫及び骨原性癌（例えば、骨の癌、骨の組織の腫瘍性成長）が挙げられる（それらに限定されない）。ＰＡＣ−１及びＴＭＺの組み合わせで処置することができる悪性原発性骨腫瘍の例には、骨肉腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、線維肉腫などが含まれ、また、二次骨腫瘍（例えば、他の器官（例えば、乳、肺、前立腺）の癌から広がった転移性病変）が含まれる。

医薬製剤：
本明細書に記載の化合物を使用して、例えば、該化合物を薬学的に許容可能な希釈剤、賦形剤又は担体と組み合わせることによって、治療用医薬組成物を製造することができる。化合物は、塩又は溶媒和物の形態で担体に添加することができる。例えば、化合物が安定な非毒性の酸又は塩基の塩を形成するのに十分に塩基性又は酸性である場合、塩としての化合物の投与は適切であり得る。薬学的に許容可能な塩の例は、生理学的に許容可能な陰イオンを形成する酸と共に形成される有機酸付加塩であり、例えば、トシル酸塩、メタンスルホン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、マロン酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩、安息香酸塩、アスコルビン酸塩、α−ケトグルタル酸塩、及びβ−グリセロリン酸塩である。さらに、適切な無機塩、例えば、塩酸塩、ハロゲン化物、硫酸塩、硝酸塩、重炭酸塩、及び炭酸塩の塩も形成され得る。

薬学的に許容可能な塩は、当技術分野で周知の標準的な手順を使用して、例えば、十分に塩基性の化合物（例えばアミン）を適切な酸と反応させて生理学的に許容可能なイオン化合物を提供することによって得ることができる。カルボン酸のアルカリ金属（例えば、ナトリウム、カリウム、リチウム）塩又はアルカリ土類金属（例えばカルシウム）塩も類似の方法により調製することができる。

本明細書に記載の化合物は、医薬組成物として製剤化し、種々の形態で哺乳動物宿主、例えばヒト患者に投与することができる。形態は、選択した投与経路、例えば、静脈内、筋肉内、局所又は皮下経路による経口又は非経口投与に特に適合させることができる。

本明細書に記載の化合物は、薬学的に許容可能なビヒクル（例えば、不活性希釈剤又は同化可能な食用担体）と組み合わせて全身投与され得る。活性薬物の溶解性は、シクロデキストリン、例えば２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンを使用することによって増大させることができる。経口投与の場合、化合物は、ハード又はソフトシェルゼラチンカプセルに封入するか、又は錠剤に圧縮するか、又は患者の食餌に直接組み入れることができる。また、化合物は、１つ又は複数の賦形剤と組み合わせることが可能であり、摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁液剤、シロップ、ウエハースなどの形態で使用することができる。このような組成物及び調製物は、通常、少なくとも０．１％の活性化合物を含有する。組成物及び調製物の割合は変動し得、好都合なことに所定の単位剤形の重量の約１％〜約６０％、又は約２％〜約２５％であり得る。そのような治療上有用な組成物中の活性化合物の量は、有効用量レベルが得られるような量である。

錠剤、トローチ剤、丸剤、カプセル剤などは次の１つ又は複数を含み得る：結合剤、例えば、トラガカントゴム、アラビアゴム、トウモロコシデンプン又はゼラチン；賦形剤、例えばリン酸二カルシウム；崩壊剤、例えば、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、アルギン酸；及び潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム。甘味料（例えば、スクロース、フルクトース、ラクトース、アスパルテーム）又は着香料（例えば、ペパーミント、ウインターグリーン油、チェリーフレーバー）を添加してもよい。単位剤形がカプセルである場合、上記のような材料の他に、液体担体（例えば、植物油、ポリエチレングリコール）を含有し得る。コーティング剤として、あるいは固体単位剤形の物理的形態を変えるように、他の種々の材料が存在していてもよい。例えば、錠剤、丸剤又はカプセル剤はゼラチン、ワックス、セラック又は糖でコーティングすることができる。シロップ剤又はエリキシル剤は、活性化合物、甘味料としてのスクロース又はフルクトース、保存剤としてのメチル及びプロピルパラベン、色素、並びに香料（例えば、チェリー又はオレンジフレーバー）を含有し得る。任意の単位剤形の調製に使用されるすべての材料は、使用量において、薬学的に許容可能で実質的に非毒性であるものとする。さらに、活性化合物は徐放性製剤及びデバイスに組み入れることができる。

活性化合物は、点滴又は注射によって静脈内又は腹腔内に投与することができる。活性化合物又はその塩の溶液は、必要に応じて非毒性界面活性剤と混合して、水中で調製することができる。分散液は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、トリアセチン、又はその混合物中で、あるいは薬学的に許容可能な油中で調製することができる。通常の保存及び使用の条件下で、製剤は、微生物の成長を防止するための防腐剤を含有し得る。

注射又は点滴に適した医薬剤形は、滅菌水溶液、分散液、又は注射若しくは点滴用滅菌溶液若しくは分散液の即時調製に適合していて、任意選択でリポソームに封入された活性成分を含む滅菌粉末を含み得る。最終的な剤形は、滅菌済み、液体で、製造及び保存の条件下で安定しているものとすべきである。液体担体又はビヒクルは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール）、植物油、非毒性グリセリルエステル、又はそれらの適切な混合物を含む溶媒又は液体分散媒体であり得る。適切な流動度は、例えば、リポソームの形成によって、又は（分散液の場合には）必要とされる粒子サイズの維持によって、又は界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物作用の防止は、種々の抗菌剤及び抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チオメルサール）によって実現することができる。多くの場合、等張剤（例えば、糖、緩衝液、塩化ナトリウム）を含めるのが好ましい。注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及び／又はゼラチンによって実現することができる。

注射用滅菌溶液は、必要に応じて上記の種々の他の成分と共に適切な溶媒に必要量の活性化合物を添加する（そして、任意選択で引き続き濾過滅菌を行う）ことによって調製することができる。注射用滅菌溶液を調製するための滅菌粉末の場合、調製方法は真空乾燥及び凍結乾燥（これによって、活性成分及び予め滅菌濾過した溶液に存在する所望のさらなる成分の粉末が得られる。）を含み得る。

本明細書に記載の化合物の有用な用量は、それらのインビトロ活性及び動物モデルにおけるインビボ活性を比較することによって決定することができる。マウス及び他の動物における有効用量からヒトの有効用量を推定する方法は当技術分野で公知である。例えば、米国特許第４９３８９４９号（Ｂｏｒｃｈ ｅｔ ａｌ．）を参照されたい。処置における使用のために必要とされる化合物又はその活性塩若しくは誘導体の量は、選択される特定の化合物又はその塩だけでなく、投与経路、処置されている状態の性質、並びに患者の年齢及び症状によっても変動し、最終的には担当の医師又は臨床医の判断で決定される。

化合物の組み合わせは、好都合なことに単位剤形で投与することができ、例えば、単位剤形当たり１００〜５０００ｍｇ／ｍ^２、３００〜４０００ｍｇ／ｍ^２、３７０〜３７００ｍｇ／ｍ^２、５０〜７５０ｍｇ／ｍ^２、又は７５０〜４０００ｍｇ／ｍ^２の活性成分を含有する。また、各化合物は、個別に又は組み合わせで、約１ｍｇ／ｋｇ〜約２５０ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、又は約１０ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ、約７５ｍｇ／ｋｇ、約１００ｍｇ／ｋｇ、若しくは約１５０ｍｇ／ｋｇ、あるいは上記の値のいずれか１つから上記の値の他のいずれか１つまでの範囲で投与することができる。また、化合物は、単独で又は組み合わせで、約１μｍｏｌ／Ｌ〜約２５μｍｏｌ／Ｌ、又は約１０μｍｏｌ／Ｌ、又は約１５μｍｏｌ／Ｌの定常状態血漿薬物濃度をもたらすように対象に投与することもできる。

一部の実施形態において、本発明は、約１０ｎＭ〜約１００μＭの有効濃度での化合物を提供する。他の実施形態において、有効濃度は、約２００ｎＭ〜約５０μＭ、約５００ｎＭ〜約４０μＭ、約７５０ｎＭ〜約２５μＭ、約１μＭ〜約２０μＭ、又は約１μＭ〜約１０μＭである。他の実施形態において、有効濃度は、例えば、直接プロカスパーゼ活性化アッセイ、細胞アポトーシス誘導アッセイ又は動物臨床治療評価における５０％活性濃度のような値とみなされる。一実施形態において、そのような値は約２００μＭ以下である。他の実施形態において、そのような値は約１０ｎＭ以上かつ約１０μＭ以下である。好都合なことに、所望の用量は、単回用量又は適切な間隔で投与される分割用量（例えば、１日当たり２回、３回、４回又はそれ以上の部分用量）の形をとり得る。部分用量自体も、例えば不連続な緩く間隔をあけた複数の投与回数にさらに分割され得る。

本明細書に記載の化合物は有効な抗腫瘍剤であり得、単一薬物の投与と比較して高い効力及び／又は低減された毒性を有し得る。本発明は、哺乳動物の癌を処置する治療的方法であって、癌に罹患した哺乳動物に有効量の本明細書に記載の化合物又は組成物を投与するステップを含む方法を提供する。哺乳動物としては、霊長類、ヒト、げっ歯類、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ウマ、ブタ、ヤギなどが挙げられる。癌は、任意の種々のタイプの悪性新生物、とりわけ、例えば、結腸癌、乳癌、黒色腫及び白血病を意味し、概して、望ましくない細胞増殖、例えば、制御されない増殖、分化の欠如、局所組織浸潤、及び転移を特徴とする。

癌を処置する本発明の化合物の能力は、当技術分野で公知のアッセイを用いて判定することができる。例えば、処置プロトコールの設計、毒性評価、データ解析、腫瘍細胞死滅の定量化、及び移植腫瘍スクリーンの使用の生物学的意義が知られている。さらに、癌を処置する化合物の能力は、上記アッセイ並びに本明細書で引用された引用文献及び特許文献に記載のアッセイを用いて判定することができる。

また、本発明は化合物のプロドラッグ形態を提供する。インビボで変換されてＰＡＣ−１又はＴＭＺが得られるすべての化合物がプロドラッグである。プロドラッグを形成する多く方法が当技術分野で周知である。プロドラッグ及びそれを調製する方法の例は、とりわけ、Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｐｒｏｄｒｕｇｓ， ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｈ．Ｂｕｎｄｇａａｒｄ （Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， １９８５）； Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ．４２， ａｔ ｐｐ．３０９−３９６， ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｋ．Ｗｉｄｄｅｒ，ｅｔ．ａｌ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９８５）； Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｋｒｏｓｇａａｒｄ−Ｌａｒｓｅｎ ａｎｄ Ｈ．Ｂｕｎｄｇａａｒｄ， Ｃｈａｐｔｅｒ ５， “Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｄｒｕｇｓ”， ｂｙ Ｈ．Ｂｕｎｄｇａａｒｄ， ａｔ ｐｐ．１１３−１９１， １９９１； Ｈ．Ｂｕｎｄｇａａｒｄ， Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ， Ｖｏｌ．８， ｐ．１−３８ （１９９２）； Ｈ．Ｂｕｎｄｇａａｒｄ，ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｖｏｌ．７７， ｐ．２８５ （１９８８）；及び Ｎｏｇｒａｄｙ（１９８５） Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐａｇｅｓ ３８８−３９２）に見出される。

さらに、一部の実施形態において、ＰＡＣ−１は、ＰＡＣ−１誘導体又は他の阻害剤、例えば、米国特許第７６３２９７２号（Ｈｅｒｇｅｎｒｏｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．）、米国特許出願公開第２０１２／００４０９９５号（Ｈｅｒｇｅｎｒｏｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．）及び同２００７／００４９６０２号（Ｈｅｒｇｅｎｒｏｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．）、及び米国特許出願第１２／５９７２８７号（Ｈｅｒｇｅｎｒｏｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．）に記載の化合物に交換可能である。本明細書の開示と組み合わせて使用可能である、癌治療に有用な化合物、方法及び技術は、前述の文献、並びに米国特許第６３０３３２９号（Ｈｅｉｎｒｉｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．）、同第６４０３７６５号（Ａｌｎｅｍｒｉ）、同第６８７８７４３号（Ｃｈｏｏｎｇ ｅｔ ａｌ．）及び同第７０４１７８４号（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．）、及び米国特許出願公開第２００４／０１８０８２８号（Ｓｈｉ）に記載されている。試験を行い、癌細胞株を評価する方法は、Ｐｕｔｔ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２００６， ２（１０）， ５４３−５５０；Ｐｅｔｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ２００９， ３８８， １４４〜１５８；及び Ｐｅｔｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２０１０， ７０（１８）， ７２３２−７２４１に記載のようにして実施することができる。

以下の実施例は、本発明の説明を意図したものであり、その範囲を限定するように解釈されるべきではない。当業者は、本発明を実施することができる他の多くの方法を実施例が示唆していることを容易に理解するであろう。本発明の範囲内で多くの変更及び修正がなされ得ることは理解されるべきである。

実施例１（９Ｌラット神経膠腫におけるテモゾロミド（ＴＭＺ）と組み合わせたＰＡＣ−１のインビボでの有効性）：
９Ｌ膠肉腫は、Ｆ３４４ラットの側腹部の固形皮下腫瘤として維持されていた。頭蓋内移植のため、９Ｌ膠肉腫の腫瘍を保有動物から外科的に切除し、移植時に１ｍｍ^３片にスライスした。これらの１ｍｍ^３腫瘍片は、文献（Ｊｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ ｔｈｅｒａｐｙ． ＰＬｏＳ Ｏｎｅ （２０１２） ７： ｅ４４３７２； Ｇａｌｌｉａ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ａｋｔ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ ａｎｄ ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ ｓｔｅｍ−ｌｉｋｅ ｃｅｌｌｓ． Ｍｏｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ． （２００９） ８： ３８６−３９３）に記載のようにして、３２匹のＦ３４４ラットの頭蓋内に移植した。

動物を、１群当たり８匹の次の４つの実験群に分けた：（１）対照、（２）ＰＡＣ−１単独、（３）ＴＭＺ単独、及び（４）ＰＡＣ−１＋ＴＭＺ。対照動物には水のみを摂取させた。ＰＡＣ−１単独及びＰＡＣ−１＋ＴＭＺの２つの動物群には、０日目（移植後６時間）から開始して、水に懸濁したＰＡＣ−１の強制経口投与を行った。ＰＡＣ−１は０〜４日目の５日間だけ投与した。ＴＭＺ単独群及びＰＡＣ−１＋ＴＭＺ群の動物には、５〜９日目に、水に溶解したＴＭＺを経口投与で５回摂取させた。実験動物にはその後の処置を行わず、生存期間を評価した。ＰＡＣ−１＋ＴＭＺの組み合わせで処置された動物の生存期間（生存期間中央値＝２８日）は、ＴＭＺ単独で処置された動物（生存期間中央値＝２０日）又は無処置の対照動物（生存期間中央値＝２０日）と比較して顕著に増加した（Ｆｉｇｕｒｅ１）。

実施例２（医薬剤形）：
以下の製剤は、本明細書に記載の組み合わせ化合物（例えば、ＰＡＣ−１及びＴＭＺ）又はその薬学的に許容可能な塩若しくは溶媒和物（以下「化合物Ｘ」という。）を治療的又は予防的に投与するために使用され得る代表的な医薬剤形を示す。

（ｉ）錠剤１ ｍｇ／錠剤
化合物Ｘ ２００．０
ラクトース ７７．５
ポビドン １５．０
クロスカルメロースナトリウム １２．０
微結晶性セルロース ９２．５
ステアリン酸マグネシウム ３．０
４００．０

（ｉｉ）錠剤２ ｍｇ／錠剤
化合物Ｘ １２０．０
微結晶性セルロース ４１０．０
デンプン ５０．０
デンプングリコール酸ナトリウム １５．０
ステアリン酸マグネシウム ５．０
６００．０

（ｉｉｉ）カプセル剤 ｍｇ／カプセル剤
化合物Ｘ １１０．０
コロイド状二酸化ケイ素 １．５
ラクトース ４６５．５
α化デンプン １２０．０
ステアリン酸マグネシウム ３．０
７００．０

（ｉｖ）注射剤１（１ｍｇ／ｍＬ） ｍｇ／ｍＬ
化合物Ｘ １．０
二塩基性リン酸水素ナトリウム １２．０
一塩基性リン酸ナトリウム ０．７
塩化ナトリウム ４．５
１．０Ｎ水酸化ナトリウム溶液 ｑ．ｓ．（７．０〜７．５にｐＨ調整）
注射用蒸留水 ｑ．ｓ．ａｄ １ｍＬ

（ｖ）注射剤２（１０ｍｇ／ｍＬ） ｍｇ／ｍＬ
化合物Ｘ １０．０
一塩基性リン酸ナトリウム ０．３
二塩基性リン酸ナトリウム １．１
ポリエチレングリコール４００ ２００．０
０．１Ｎ水酸化ナトリウム溶液 ｑ．ｓ．（７．０〜７．５にｐＨ調整）
注射用蒸留水 ｑ．ｓ．ａｄ １ｍＬ

（ｖｉ）エアロゾル剤 ｍｇ／缶
化合物Ｘ ２０
オレイン酸 １０
トリクロロモノフルオロメタン ５０００
ジクロロジフルオロメタン １００００
ジクロロテトラフルオロエタン ５０００

これらの製剤は、薬学分野で周知の従来の手順によって調製することができる。異なる量及びタイプの活性成分（「化合物Ｘ」）に適合するように周知の製薬技術に従って上記医薬組成物が変更可能であることは理解されよう。エアロゾル製剤（ｖｉ）は、標準的な定量エアゾールディスペンサーと組み合わせて使用され得る。また、特定の成分及び割合は説明目的で示されているものである。成分は適切な同等物に変更され得、割合は、当該剤形の所望の特性に応じて変更され得る。

特定の実施形態について上記の実施形態及び実施例を参照して説明したが、そのような実施形態は例示的なものにすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。変更及び修正は、添付の特許請求の範囲で規定されているより広範な態様の発明から逸脱することなく、当技術分野における通常の技術に従って行うことができる。

すべての刊行物、特許、及び特許文献は、参照により個別に組み入れられるように、参照により本明細書に組み入れられる。本開示と整合しない限定はそれらから理解されるべきではない。本発明は、種々の具体的な好ましい実施形態及び技術に関連して記載されている。しかし、本発明の精神及び範囲内で多くの変更及び修正がなされ得ることは理解されるべきである。

Claims (22)

1. （ａ）式（Ｉ）：
   

   

   
   の化合物と、
   （ｂ）化合物ＰＡＣ−１：
   

   

   
   と、
   （ｃ）薬学的に許容可能な希釈剤、賦形剤又は担体と、
   を含む組成物。
2. 担体は水を含み、任意選択で、緩衝液、シクロデキストリン又はそれらの組み合わせをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
3. シクロデキストリンは２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンである、請求項２に記載の組成物。
4. 式（Ｉ）の化合物の濃度が約１００μＭ〜約１ｍＭである、請求項１に記載の組成物。
5. ＰＡＣ−１の濃度が約２μＭ〜約５０μＭである、請求項１に記載の組成物。
6. 式（Ｉ）の化合物の濃度が約２５０μＭ〜約７５０μＭであり、ＰＡＣ−１の濃度が約５μＭ〜約３０μＭである、請求項１に記載の組成物。
7. 癌細胞の成長又は増殖を抑制する方法であって、癌細胞を有効量の請求項１に記載の組成物と接触させ、それにより癌細胞の成長又は増殖を抑制するステップを含む方法。
8. 癌細胞は膠芽腫細胞又は乏突起神経膠腫細胞である、請求項７に記載の方法。
9. 癌細胞は骨肉腫細胞である、請求項７に記載の方法。
10. 癌細胞におけるアポトーシスを誘導する方法であって、
    癌細胞を、有効量の式（Ｉ）：
    

    

    
    の化合物及び有効量の化合物ＰＡＣ−１：
    

    

    
    と接触させるステップを含み、
    アポトーシスはそれにより癌細胞において誘導される、
    方法。
11. 前記接触はインビトロでの接触である、請求項１０に記載の方法。
12. 前記接触はインビボでの接触である、請求項１０に記載の方法。
13. 癌細胞を式（Ｉ）の化合物及びＰＡＣ−１と同時に接触させる、請求項１０に記載の方法。
14. 癌細胞をＰＡＣ−１と接触させる前に癌細胞を式（Ｉ）の化合物と接触させる、請求項１０に記載の方法。
15. 癌細胞を式（Ｉ）の化合物と接触させる前に癌細胞をＰＡＣ−１と接触させる、請求項１０に記載の方法。
16. 処置の必要な患者における癌を処置する方法であって、
    患者に、治療有効量の式（Ｉ）：
    

    

    
    の化合物及び有効量の化合物ＰＡＣ−１：
    

    

    
    を同時又は逐次に投与するステップを含み、
    癌はそれにより処置される、
    方法。
17. 式（Ｉ）の化合物及び化合物ＰＡＣ−１は同時に投与される、請求項１６に記載の方法。
18. 式（Ｉ）の化合物及び化合物ＰＡＣ−１は逐次に投与される、請求項１６に記載の方法。
19. 式（Ｉ）の化合物は化合物ＰＡＣ−１の前に投与される、請求項１８に記載の方法。
20. 式（Ｉ）の化合物は化合物ＰＡＣ−１の後に投与される、請求項１８に記載の方法。
21. 癌の処置のための医薬を調製するための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物の使用。
22. 癌は膠芽腫、乏突起神経膠腫又は骨肉腫である、請求項２１に記載の使用。

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