JP2018038417A5 - - Google Patents
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Claims (16)
- 対象のゲノム中の遺伝的変異を検出する方法であって、下記を含む前記方法:
(a)ポリヌクレオチドの複数のクラスタを提供することであって、(i)それぞれのクラスタが、支持体に結合した核酸二本鎖の複数コピーを含み、(ii)クラスタ中のそれぞれの二本鎖が、配列A−B−G′−D′−C′を5′から3′に含む第1の分子と、配列C−D−G−B′−A′を5′から3′に含む第2の分子と、を含み、(iii)配列A′が、配列Aに相補性であり、配列B′が、配列Bに相補性であり、配列C′が、配列Cに相補性であり、配列D′が、配列Dに相補性であり、配列G′が、配列Gに相補性であり、(iv)配列Gが、対象からの標的ポリヌクレオチド配列の一部分であり、複数のクラスタのそれぞれに対して異なり、(v)配列B′が、対応する標的ポリヌクレオチド配列中の配列Gに関して3′に位置し、および(vi)それぞれの第1の分子がバーコード配列を含む;
(b) 第1のプライマーを前記第1の分子の配列にハイブリダイズさせること、ここで前記第1のプライマーは前記バーコード配列の3′または5′のいずれかに位置する配列にハイブリダイズするものであり;および、
(1)前記第1のプライマーが前記バーコード配列の3′に位置する配列にハイブリダイズする場合、R1配列を生成し、かつそれぞれのクラスタのバーコード配列を特定するように、前記第1のプライマーの伸長により前記第1の分子を配列決定すること;または、
(2)前記第1のプライマーが前記バーコード配列の5′に位置する配列にハイブリダイズする場合、それぞれのクラスタのR1配列を生成するように、前記第1のプライマーの伸長により前記第1の分子を配列決定すること;
(c)第2のプライマーを前記第2の分子の配列にハイブリダイズさせること、ここで前記第2のプライマーは前記バーコード配列に相補的な配列の3′または5′のいずれかに位置する配列にハイブリダイズするものであり;ならびに、
R2配列を生成するように、および、場合により、前記第2のプライマーが前記第1の分子のバーコード配列に相補的な配列の3′に位置する配列にハイブリダイズする場合、それぞれのクラスタのバーコード配列を特定するように、前記第2のプライマーの伸長により前記第の分子を配列決定すること;
(d)バーコード配列が前記ステップ(b)または(c)のいずれかで特定されないときは、
(i)それぞれのクラスタのバーコード配列を生成するように、第3のプライマーを前記第1の分子にハイブリダイズすること;または、
(i)それぞれのクラスタのバーコード配列に相補的な配列を生成するように、第3のプライマーを前記第2の分子にハイブリダイズすること;
(e)全てのR1およびR2配列を参照配列に整列させるように、アルゴリズムを使用してアラインメントを行うこと、ならびに、
(f)下記ステップ(i)〜(ii)の少なくとも一つを実行すること:
(i)ステップ(e)により特定された配列変異の有無を特定すること、および/または、
(ii)前記対象のR1配列に基づいて複数の確率を計算すること、および前記確率をレポートに含めること、ここで、前記それぞれの確率は、前記対象または対象の子孫が疾患または形質を有するか、または発症する確率である、
ここで、ステップ(b)及び(c)はいずれの順序で行ってもよい。 - さらにレポートを受信者に送信することを含み、ここで、前記レポートがステップ(f)(i)で特定された配列変異、および/または(f)(ii)で計算された確率を含む、請求項1に記載の方法。
- R1およびR2配列が、同一の参照配列に整列されるものである、請求項1に記載の方法。
- R1およびR2配列が、同一のアルゴリズムを用いて整列されるものである、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 同じクラスタの前記R2配列が整列する前記第1の参照配列中の第2の位置から10,000塩基対を超えて離れた、前記第1の参照配列中の第1の位置に整列するR1配列を破棄することをさらに含み、および/または、
欠失されるR1配列の一部分が、あるクラスタの配列B′の少なくとも一部分と同一であり、配列Gが、そのクラスタの前記R1配列より短いとき、そのクラスタのR1配列の一部分を欠失させることをさらに含み、および/または、
欠失されるR1配列の一部分が、任意の配列B′の少なくとも一部分と同一であり、前記部分が、R1の前記5′もしくは3′ヌクレオチドのいずれかを含み、(i)いかなるR2配列も、前記クラスタに対して生成されなかったか、または(ii)生成されたR2配列が、任意の配列Bと同一でないかのいずれかであるとき、クラスタのR1配列の一部分を欠失させることをさらに含む、
請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。 - R1およびR2配列は、少なくとも100個の異なる標的ポリヌクレオチドに対して生成される、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- R1配列が、単一反応において少なくとも約108個のクラスタに対して生成される、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- それぞれのバーコードが、並行して分析された複数の異なるバーコード中のバーコードと1つおきに異なるものであり、および/または、
前記バーコード配列が、単一反応における試料配列のプール中の単一試料と関連付けられるものであり、および/または、
複数のバーコード配列のそれぞれが、単一反応において配列決定された試料のプール中の単一試料と一意に関連付けられる、
請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。 - 前記バーコード配列に基づいて、前記クラスタから配列を分類することをさらに含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- バーコード配列分類内で同じ配列およびアラインメントを有する複数のR1配列を、そのうちの1つを除いて全てを破棄することをさらに含む、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 配列A、B、C、およびDは、少なくとも5個のヌクレオチド長であり、および/または、あらゆるクラスタの配列Gは、1〜1000ヌクレオチド長である、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 複数のクラスタのそれぞれのプローブ配列Bが、原因となる遺伝的変異体を含む配列、または原因となる遺伝的変異体の200ヌクレオチド以内にある配列に相補性である、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
- クラスタのうちの1つ以上の配列Bは、配列番号22〜121からなる群から選択される配列を含む、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 1つ以上の原因となる遺伝的変異体の存在、非存在、または対立遺伝子比が、少なくとも約90%の精度で決定され、および/または、
コンセンサス配列が、標的ポリヌクレオチド中の挿入、欠失、または挿入および欠失を少なくとも約90%の精度で特定するものである、
請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。 - 複数のクラスタのそれぞれのプローブ配列Bが、非対象配列を含む配列、または非対象配列の200ヌクレオチド以内にある配列に相補性である、請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法。
- 1つ以上の非対象配列の存在または非存在が決定され、場合により1つ以上の非対象配列の存在または非存在が少なくとも約90%の精度で決定される、請求項15に記載の方法。
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