JP2018019700A

JP2018019700A - キメラ主要組織適合複合体（ｍｈｃ）ｉｉ分子を発現する遺伝子改変されたマウス

Info

Publication number: JP2018019700A
Application number: JP2017157497A
Authority: JP
Inventors: マクドナルドリン; Macdonald Lynn; ジェイ．マーフィーアンドリュー; Anteneh Kebbede; ツーナクシン; Naxin Tu; ギュラーケイガン; Gurer Cagan; ボロニナベラ; Voronina Vera; スティーブンズショーン; Stevens Sean
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2011-10-28
Filing date: 2017-08-17
Publication date: 2018-02-08
Anticipated expiration: 2032-10-26
Also published as: ES2640241T3; RU2014116577A; RS63220B1; CN108401986A; DK3272214T3; LT3272214T; MX2014004896A; RS59997B1; CY1119283T1; EP2770822B9; PL2770822T3; RU2018115251A; IN2014CN03892A; US20170135329A1; US20210195878A1; SI3272214T1; CY1122700T1; HRP20171327T1; MX379060B; EP4052572B1

Abstract

【課題】キメラ主要組織適合複合体（ＭＨＣ）ＩＩ分子を発現する遺伝子改変されたマウスの提供。【解決手段】ヒト化ＭＨＣＩＩタンパク質（ヒト化ＭＨＣＩＩαポリペプチド及びβポリペプチド）を発現する遺伝子改変された非ヒト動物、並びにそれを含む胚、細胞、および組織。前記遺伝子改変された動物を作製するための構築物及びこれを作製する方法。ヒト免疫系の種々の態様を研究するために、遺伝子改変された動物を使用する方法。【選択図】なし

Description

関連出願の引用
本願は、２０１１年１０月２８日に出願された米国仮出願第６１／５５２，５８４号の優先権の利益を主張する。この出願は、その全体が本明細書に参考として援用される。

発明の分野
本発明は、ヒト化主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩタンパク質を発現するように遺伝子操作された非ヒト動物、例えば、げっ歯動物（例えば、マウスもしくはラット）、ならびにこれを発現する胚、組織、および細胞に関する。本発明は、さらに、ヒト化ＭＨＣＩＩタンパク質を発現する遺伝子改変された非ヒト動物を作製するための方法に関する。また、リンパ球を活性化しそしてＴ細胞に会合するペプチドを同定するため、そしてヒトワクチンおよび他の治療剤を開発するための、ヒト化ＭＨＣクラスＩＩタンパク質を発現する非ヒト動物、細胞、および組織を用いる方法も、提供する。

発明の背景
獲得免疫応答において、外来性抗原が、Ｂリンパ球（例えば、免疫グロブリン）およびＴリンパ球（例えば、Ｔ細胞受容体すなわちＴＣＲ）上の受容体分子によって認識される。これらの外来性抗原は、特殊文化したタンパク質、一般に主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子と呼ばれるタンパク質によって、細胞の表面にペプチド断片として提示される。ＭＨＣ分子は、約４Ｍｂに及ぶ遺伝子の連結したクラスターとして見出される複数の遺伝子座によってコードされる。マウスにおいて、ＭＨＣ遺伝子は、第１７番染色体上に見出され、歴史的な理由から、組織適合性２（Ｈ−２）遺伝子と呼ばれる。ヒトにおいて、上記遺伝子は、第６染色体上に見出され、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子と呼ばれる。マウスおよびヒトにおける遺伝子座は、多遺伝子性である；これらは、ヒトゲノムとマウスゲノムとにおいて類似の構成（ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）を示すＭＨＣ遺伝子の３つの高度多形性クラス（クラスＩ、ＩＩおよびＩＩＩ）を含む（それぞれ、図２および図３を参照されたい）。

ＭＨＣ遺伝子座は、ゲノムにおいて最も高度の多形性を示す；いくつかの遺伝子は、３００を超える対立遺伝子によって表される（例えば、ヒトＨＬＡ−ＤＲβおよびヒトＨＬＡ−Ｂ）。全てのクラスＩおよびＩＩＭＨＣ遺伝子は、ペプチド断片を提示し得るが、各々の遺伝子は、多形および対立遺伝子バリアントを反映して、異なる結合特性を有するタンパク質を発現する。任意の所定の個体は、免疫応答の過程においてＢ細胞およびＴ細胞に対する、細胞表面に提示され得る独特な範囲のペプチド断片を有する。

ヒトおよびマウスの両方が、ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子を有する（図２および３を参照されたい）。ヒトにおいて、古典的ＭＨＣＩＩ遺伝子はＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、およびＨＬＡ−ＤＲと呼ばれ、他方、マウスにおいて、これらは、Ｈ−２ＡおよびＨ−２Ｅ（しばしば、それぞれＩ−ＡおよびＩ−Ｅと略される）である。ＭＨＣＩＩ遺伝子座、ヒトにおけるＨＬＡ−ＤＭおよびＨＬＡ−ＤＯ、ならびにマウスにおけるＨ−２ＭおよびＨ−２Ｏにおいて遺伝子によってコードされるさらなるタンパク質は、細胞表面には見出されないが、エンドサイトーシス区画内に存在し、ＭＨＣＩＩ分子によるペプチドの正しいローディングを確実にする。クラスＩＩ分子は、２つのポリペプチド鎖：α鎖およびβ鎖から成る。α鎖の細胞外部分は、２つの細胞外ドメイン、α１およびα２を含み、β鎖の細胞外部分はまた、２つの細胞外ドメイン、β１およびβ２を含む（図１を参照されたい）。α鎖およびβ鎖は、互いに非共有結合する。

ＭＨＣクラスＩＩ分子は、炎症などの過程の間に、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、例えば、Ｂ細胞、マクロファージ、樹状細胞、内皮細胞の上に発現される。ＡＰＣの表面に発現されるＭＨＣＩＩ分子は、代表的に、細胞内小胞において生成される抗原を、ＣＤ４＋Ｔ細胞に対して提示する。ＣＤ４＋Ｔ細胞の会合（ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ）に関与するために、対象の抗原を有するＭＨＣクラスＩＩ複合体は、ＣＤ４＋Ｔ細胞に会合するために十分に長く生存できるよう、十分に安定的でなければならない。ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞は、ＡＰＣの表面の外来性ペプチド／ＭＨＣＩＩ複合体によって会合され、Ｔ細胞は、活性化されて、侵入者に対する免疫応答を補助するサイトカインを放出する。

耐性メカニズムに起因して、全ての抗原がＴ細胞活性化を惹起するわけではない。しかし、いくつかの疾患（例えば、がん、自己免疫疾患）において、自己タンパク質に由来するペプチドは免疫系の細胞構成要素の標的になり、その結果、このようなペプチドを提示する細胞の破壊がもたらされる。臨床的に重要な抗原（例えば、種々の型のがんに関連する抗原）の認識における重要な進歩がある。しかし、ヒトＴ細胞において好適な応答を惹起するペプチド、詳細には臨床的に重要な抗原のペプチドの、同定および選択を改善するために、ヒト免疫系の態様を模倣するｉｎｖｉｖｏおよびｉｎｖｉｔｒｏの系が依然として必要とされている。従って、ヒト免疫系の構成要素を表し得る生物学的系（例えば、遺伝子改変された非ヒト動物および細胞）が必要とされている。

発明の概要
ヒトＭＨＣクラスＩＩタンパク質およびそのキメラに関連し、ＣＤ４＋Ｔ細胞に結合するペプチドを生成するかまたは同定するための生物系が提供される。細胞性免疫応答において機能するヒト化分子を発現する非ヒト細胞を含む非ヒト動物が提供される。ヒト化ＭＨＣＩＩタンパク質をコードするヒト化げっ歯動物遺伝子座もまた提供される。ヒト化ＭＨＣ分子を発現するヒト化げっ歯動物細胞もまた提供される。１種または複数種のヒト化免疫系分子を発現するヒト化げっ歯動物細胞を含む、ｉｎｖｉｖｏ系およびｉｎｖｉｔｒｏ系が提供される。

ヒト化ＭＨＣＩＩ複合体をコードするヌクレオチド配列をそのゲノム内に含む非ヒト動物、例えば、げっ歯動物（例えば、マウスもしくはラット）が、本明細書で提供され、ここで、該ヒト化ＭＨＣＩＩ複合体のヒト部分が、ヒトＭＨＣＩＩ複合体の細胞外ドメイン、例えば、ヒト化ＭＨＣＩＩ α細胞外ドメインおよびヒト化ＭＨＣＩＩ β細胞外ドメインを含む。

１つの態様において、ヒト／非ヒトキメラＭＨＣＩＩ αポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を内在性ＭＨＣＩＩ α遺伝子の遺伝子座に含む、非ヒト動物が本明細書で提供される。１つの実施形態において、このようなヒト／非ヒトキメラＭＨＣＩＩ αポリペプチドのヒト部分は、ヒトＭＨＣＩＩ α細胞外ドメインを含む。１つの実施形態において、非ヒト動物は、該動物の細胞の表面に機能的なＭＨＣＩＩ複合体を発現する。１つの実施形態において、上記動物におけるヒトＭＨＣＩＩ α細胞外ドメインは、ヒトＭＨＣＩＩ α１およびα２ドメインを含む；１つの実施形態において、ヒト／非ヒトキメラＭＨＣＩＩ αポリペプチドの非ヒト部分は、内在性非ヒトＭＨＣＩＩ αポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む。１つの実施形態において、ヒト／非ヒトキメラＭＨＣＩＩ αポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、内在性非ヒトＭＨＣＩＩ αプロモーターおよび調節エレメントの調節制御下で発現される。１つの実施形態において、キメラポリペプチドのヒト部分は、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱ、およびＨＬＡ−ＤＰからなる群より選択されるヒトＨＬＡクラスＩＩタンパク質に由来し、例えば、ヒト部分は、ＨＬＡ−ＤＲ４タンパク質由来である。非ヒト動物は、げっ歯動物、例えば、マウスであってもよい。１つの態様において、内在性ＭＨＣＩＩ α遺伝子の遺伝子座にヒト／非ヒトキメラＭＨＣＩＩ αポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む非ヒト動物は、内在性ＭＨＣＩＩ β遺伝子の遺伝子座にヒト／非ヒトキメラＭＨＣＩＩ βポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、さらに含む。内在性ＭＨＣＩＩ α遺伝子の遺伝子座にヒト／非ヒトキメラＭＨＣＩＩ αポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、遺伝子改変された非ヒト動物を作製する方法もまた、本明細書で提供される。このような方法は、内在性ＭＨＣＩＩ α遺伝子の遺伝子座において、内在性非ヒトＭＨＣＩＩ αポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、ヒト／非ヒトキメラＭＨＣＩＩ αポリペプチドをコードするヌクレオチド配列で置き換える工程を含み得る。

内在性ＭＨＣＩＩ β遺伝子の遺伝子座にヒト／非ヒトキメラＭＨＣＩＩ βポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む非ヒト動物もまた、本明細書で提供される。１つの実施形態において、このようなヒト／非ヒトキメラＭＨＣＩＩ βポリペプチドのヒト部分は、ヒトＭＨＣＩＩ β細胞外ドメインを含む。１つの実施形態において、非ヒト動物は、該動物の細胞の表面に機能的なＭＨＣＩＩ複合体を発現する。１つの実施形態において、上記動物におけるヒトＭＨＣＩＩ β細胞外ドメインは、ヒトＭＨＣＩＩ β１およびβ２ドメインを含む；１つの実施形態において、ヒト／非ヒトキメラＭＨＣＩＩ βポリペプチドの非ヒト部分は、内在性非ヒトＭＨＣＩＩ βポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む。１つの実施形態において、ヒト／非ヒトキメラＭＨＣＩＩ βポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、内在性非ヒトＭＨＣＩＩ βプロモーターおよび調節エレメントの調節制御下で発現される。１つの実施形態において、キメラポリペプチドのヒト部分は、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱ、およびＨＬＡ−ＤＰからなる群より選択されるヒトＨＬＡクラスＩＩタンパク質に由来し、例えば、該ヒト部分は、ＨＬＡ−ＤＲ４タンパク質に由来する。非ヒト動物は、げっ歯動物、例えば、マウスであってもよい。１つの態様において、内在性ＭＨＣＩＩ β遺伝子の遺伝子座にヒト／非ヒトキメラＭＨＣＩＩ βポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む非ヒト動物は、内在性ＭＨＣＩＩ α遺伝子の遺伝子座にヒト／非ヒトキメラＭＨＣＩＩ αポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。内在性ＭＨＣＩＩ β遺伝子の遺伝子座にヒト／非ヒトキメラＭＨＣＩＩ βポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、遺伝子改変された非ヒト動物を作製する方法もまた、本明細書で提供される。このような方法は、内在性ＭＨＣＩＩ β遺伝子の遺伝子座において、内在性非ヒトＭＨＣＩＩ βポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、ヒト／非ヒトキメラＭＨＣＩＩ βポリペプチドをコードするヌクレオチド配列で置き換える工程を、含み得る。

１つの態様において、内在性ＭＨＣＩＩ遺伝子の遺伝子座にヒト／非ヒトキメラＭＨＣＩＩ αポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列およびヒト／非ヒトキメラＭＨＣＩＩ βポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列を含む非ヒト動物が提供され、ここで、ヒト／非ヒトキメラＭＨＣＩＩ αポリペプチドのヒト部分は、ヒトＭＨＣＩＩ α細胞外ドメインを含み、ヒト／非ヒトキメラＭＨＣＩＩ βポリペプチドのヒト部分は、ヒトＭＨＣＩＩ β細胞外ドメインを含む。１つの実施形態において、ヒト／非ヒトキメラＭＨＣＩＩ αポリペプチドおよびβポリペプチドは、細胞の表面に機能的なキメラＭＨＣＩＩ複合体（例えば、ヒト／非ヒトＭＨＣＩＩ複合体）を形成する。１つの実施形態において、ヒトＭＨＣＩＩ α細胞外ドメインは、ヒトＭＨＣＩＩのヒトα１およびα２ドメインを含む。１つの実施形態において、ヒトＭＨＣＩＩ β細胞外ドメインは、ヒトＭＨＣＩＩのヒトβ１およびβ２ドメインを含む。種々の態様において、上記第１のヌクレオチド配列は、内在性非ヒトＭＨＣＩＩ αプロモーターおよび調節エレメントの調節制御下で発現される。種々の態様において、上記第２のヌクレオチド配列は、内在性非ヒトＭＨＣＩＩ βプロモーターおよび調節エレメントの調節制御下で発現される。いくつかの実施形態において、ヒト／非ヒトキメラＭＨＣＩＩ αポリペプチドの非ヒト部分は、内在性非ヒトＭＨＣＩＩ αポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ヒト／非ヒトキメラＭＨＣＩＩ βポリペプチドの非ヒト部分は、内在性非ヒトＭＨＣＩＩ βポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む。

種々の実施形態において、非ヒト動物はげっ歯動物であり、そしてヒト／げっ歯動物キメラＭＨＣＩＩ αポリペプチドおよびβポリペプチドのヒト部分は、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱ、およびＨＬＡ−ＤＰからなる群より選択されるＨＬＡクラスＩＩタンパク質に由来するヒト配列を含む。本発明のいくつかの実施形態において、ヒト／げっ歯動物キメラＭＨＣＩＩ α配列およびβ配列のヒト部分は、ヒトＨＬＡ−ＤＲ４配列に由来する；従って、ＭＨＣＩＩ α細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列は、ＨＬＡ−ＤＲα^＊０１遺伝子の配列に由来し、そしてＭＨＣＩＩ β細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列は、ＨＬＡ−ＤＲβ１^＊０４遺伝子をコードする配列に由来する。

本発明の種々の実施形態において、上記第１のヌクレオチド配列および上記第２のヌクレオチド配列は、同じ染色体上に位置する。いくつかの態様において、上記動物は、上記第１のヌクレオチド配列および上記第２のヌクレオチド配列を含む２コピーのＭＨＣＩＩ遺伝子座を含み、一方他の態様において、該動物は、該第１のヌクレオチド配列および該第２のヌクレオチド配列を含む１コピーのＭＨＣＩＩ遺伝子座を含む。従って、上記動物は、上記第１のヌクレオチド配列および上記第２のヌクレオチド配列を含むＭＨＣＩＩ遺伝子座について、ホモ接合型またはヘテロ接合型であり得る。

いくつかの態様において、キメラＭＨＣＩＩ αポリペプチドおよび／またはキメラＭＨＣＩＩ βポリペプチドは、非ヒトリーダー配列に作動可能に連結する。

１つの態様において、遺伝子操作された非ヒト動物は、げっ歯動物である。１つの実施形態において、げっ歯動物は、マウスおよびラットからなる群より選択される。従って、いくつかの実施形態において、キメラＭＨＣＩＩ α遺伝子およびβ遺伝子の非ヒト配列は、マウスＭＨＣＩＩタンパク質、例えば、マウスＨ−２Ｅタンパク質をコードするヌクレオチド配列に由来する。１つの実施形態において、本発明のげっ歯動物（例えば、マウスまたはラット）は、それらの内在性遺伝子座から機能的な内在性ＭＨＣＩＩポリペプチドを発現しない。げっ歯動物がマウスである１つの実施形態において、該マウスは、それらの内在性遺伝子座から、機能的な内在性Ｈ−２ＥおよびＨ−２Ａポリペプチドを発現しない。

従って、いくつかの実施形態において、内在性マウスＭＨＣＩＩ遺伝子座にヒト／マウスキメラＭＨＣＩＩ αポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列およびヒト／マウスキメラＭＨＣＩＩ βポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列を含むマウスが提供され、ここで、キメラＭＨＣＩＩ αポリペプチドのヒト部分は、ヒトＨＬＡ−ＤＲ４タンパク質のαポリペプチドに由来する細胞外ドメインを含み、ヒト／マウスキメラＭＨＣＩＩ βポリペプチドのヒト部分は、ヒトＨＬＡ−ＤＲ４タンパク質のβポリペプチドに由来する細胞外ドメインを含み、キメラＭＨＣＩＩ αポリペプチドのマウス部分は、マウスＨ−２Ｅ α鎖の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含み、キメラＭＨＣＩＩ βポリペプチドのマウス部分は、マウスＨ−２Ｅ β鎖の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含み、該マウスは、機能的なキメラＨＬＡ−ＤＲ４／Ｈ−２ＥＭＨＣＩＩ複合体を発現する。いくつかの態様において、キメラＭＨＣＩＩ αポリペプチドの細胞外ドメインは、ヒトα１およびα２ドメインを含む；いくつかの態様において、キメラＭＨＣＩＩ βポリペプチドの細胞外ドメインは、ヒトβ１およびβ２ドメインを含む。いくつかの実施形態において、上記第１のヌクレオチド配列は、内在性マウスＭＨＣＩＩ αプロモーターおよび調節エレメントの調節制御下で発現され、そして上記第２のヌクレオチド配列は、内在性マウスＭＨＣＩＩ βプロモーターおよび調節エレメントの調節制御下で発現される。種々の実施形態において、マウスは、それらの内在性遺伝子座から、機能的な内在性ＭＨＣＩＩポリペプチド、例えば、Ｈ−２ＥおよびＨ−２Ａポリペプチドを発現しない。いくつかの態様において、マウスは、上記第１のヌクレオチド配列および上記第２のヌクレオチド配列を含む２コピーのＭＨＣＩＩ遺伝子座を含み、一方他の態様において、マウスは、該第１のヌクレオチド配列および該第２のヌクレオチド配列を含む１コピーのＭＨＣＩＩ遺伝子座を含む。

本明細書で記載される遺伝子操作された非ヒト動物（例えば、げっ歯動物、例えば、マウスもしくはラット）を作製する方法もまた、提供される。種々の実施形態において、本発明の非ヒト動物（例えば、げっ歯動物、例えば、マウスもしくはラット）は、内在性ＭＨＣＩＩ配列を、ヒト／非ヒトキメラ（例えば、ヒト／マウス）ＭＨＣＩＩ αポリペプチドおよびβポリペプチドをコードするヌクレオチド配列で置き換えることによって、作製される。１つの実施形態において、本発明は、げっ歯動物（例えば、マウスもしくはラット）のＭＨＣＩＩ遺伝子座を、ヒト／げっ歯動物キメラＭＨＣＩＩ複合体を発現するように改変する方法であって、内在性マウスＭＨＣＩＩ遺伝子座において、げっ歯動物ＭＨＣＩＩ複合体をコードするヌクレオチド配列を、ヒト／げっ歯動物キメラＭＨＣＩＩ複合体をコードするヌクレオチド配列で置き換える工程を含む方法を提供する。上記方法の１つの態様において、ヒト／げっ歯動物キメラＭＨＣＩＩ複合体をコードするヌクレオチド配列は、ヒトＭＨＣＩＩ α鎖の細胞外ドメインならびにげっ歯動物ＭＨＣＩＩ α鎖の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインをコードする第１のヌクレオチド配列と、ヒトＭＨＣＩＩ β鎖の細胞外ドメインならびにげっ歯動物ＭＨＣＩＩ β鎖の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインをコードする第２のヌクレオチド配列とを含む。いくつかの態様において、キメラＭＨＣＩＩ複合体のげっ歯動物部分は、マウスＨ−２Ｅタンパク質に由来し、ヒト部分は、ヒトＨＬＡ−ＤＲ４タンパク質に由来する。いくつかの実施形態において、本明細書で記載される内在性ＭＨＣＩＩ遺伝子座の置き換えは、単一のＥＳ細胞において行われ、該単一のＥＳ細胞を、げっ歯動物（例えば、マウスもしくはラット）胚に導入して、遺伝子改変されたげっ歯動物（例えば、マウスもしくはラット）を作製する。

本明細書中で記載される非ヒト動物（例えば、げっ歯動物、例えば、マウスまたはラット）に由来する細胞（例えば、単離された抗原提示細胞）もまた、本明細書中で提供される。本明細書中で記載される非ヒト動物に由来する組織および胚もまた提供される。

本明細書中で記載される実施形態および態様のいずれもが、他に指示がない限り、文脈から別段明らかでない限り、互いに共同して使用され得る。他の実施形態は、続く詳細な記載を精査して当業者に明らかになる。以下の詳細な記載は、特許請求される本発明を制限しない、本発明の種々の実施形態の代表例を含む。添付の図面は、本明細書の一部を構成し、記載と一緒に、実施形態を例証するためのみに働き、本発明を制限しない。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
内在性主要組織適合複合体ＩＩ（ＭＨＣＩＩ）α遺伝子の遺伝子座にヒト／非ヒトキメラＭＨＣＩＩ αポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む非ヒト動物であって、
該ヒト／非ヒトキメラＭＨＣＩＩ αポリペプチドのヒト部分が、ヒトＭＨＣＩＩ α細胞外ドメインを含み、
該動物が、該動物の細胞の表面に機能的なＭＨＣＩＩ複合体を発現する、
非ヒト動物。
（項目２）
前記ヒトＭＨＣＩＩ α細胞外ドメインが、ヒトα１ドメインおよびα２ドメインを含む、項目１に記載の動物。
（項目３）
前記ヌクレオチド配列が、内在性非ヒトＭＨＣＩＩ αプロモーターおよび調節エレメントの調節制御下で発現される、項目１に記載の動物。
（項目４）
前記ヒト／非ヒトキメラＭＨＣＩＩ αポリペプチドの非ヒト部分が、内在性非ヒトＭＨＣＩＩ αポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む、項目１に記載の動物。
（項目５）
前記ヒト／非ヒトキメラＭＨＣＩＩ αポリペプチドの前記ヒト部分が、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱ、およびＨＬＡ−ＤＰからなる群より選択されるヒトＨＬＡクラスＩＩタンパク質に由来する、項目１に記載の動物。
（項目６）
前記ヒト／非ヒトキメラＭＨＣＩＩ αポリペプチドの前記ヒト部分が、ヒトＨＬＡ−ＤＲ４タンパク質に由来する、項目５に記載の動物。
（項目７）
げっ歯動物である、項目１に記載の動物。
（項目８）
マウスである、項目７に記載のげっ歯動物。
（項目９）
内在性ＭＨＣＩＩ β遺伝子の遺伝子座にヒト／非ヒトキメラＭＨＣＩＩ βポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、項目１に記載の動物。
（項目１０）
内在性ＭＨＣＩＩ β遺伝子の遺伝子座にヒト／非ヒトキメラＭＨＣＩＩ βポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む非ヒト動物であって、該ヒト／非ヒトキメラＭＨＣＩＩ βポリペプチドのヒト部分が、ヒトＭＨＣＩＩ β細胞外ドメインを含み、かつ該動物は、該動物の細胞の表面に機能的なＭＨＣＩＩ複合体を発現する、非ヒト動物。
（項目１１）
前記ヒトＭＨＣＩＩ β細胞外ドメインが、ヒトβ１ドメインおよびβ２ドメインを含む、項目１０に記載の動物。
（項目１２）
前記ヌクレオチド配列が、内在性非ヒトＭＨＣＩＩ βプロモーターおよび調節エレメントの調節制御下で発現される、項目１０に記載の動物。
（項目１３）
前記ヒト／非ヒトキメラＭＨＣＩＩ βポリペプチドの非ヒト部分が、内在性非ヒトＭＨＣＩＩ βポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む、項目１０に記載の動物。
（項目１４）
前記ヒト／非ヒトキメラＭＨＣＩＩ βポリペプチドの前記ヒト部分が、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱ、およびＨＬＡ−ＤＰからなる群より選択されるヒトＨＬＡクラスＩＩタンパク質に由来する、項目１０に記載の動物。
（項目１５）
前記ヒト／非ヒトキメラＭＨＣＩＩ βポリペプチドの前記ヒト部分が、ヒトＨＬＡ−ＤＲ４タンパク質に由来する、項目１４に記載の動物。
（項目１６）
げっ歯動物である、項目１０に記載の動物。
（項目１７）
マウスである、項目１６に記載のげっ歯動物。
（項目１８）
内在性ＭＨＣＩＩ α遺伝子の遺伝子座にヒト／非ヒトキメラＭＨＣＩＩ αポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、項目１０に記載の動物。
（項目１９）
内在性ＭＨＣＩＩ遺伝子の遺伝子座にヒト／げっ歯動物キメラＭＨＣＩＩ αポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列およびヒト／げっ歯動物キメラＭＨＣＩＩ βポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列を含むげっ歯動物であって、
該ヒト／げっ歯動物キメラＭＨＣＩＩ αポリペプチドのヒト部分が、ヒトＭＨＣＩＩ α細胞外ドメインを含み、該ヒト／げっ歯動物キメラＭＨＣＩＩ βポリペプチドのヒト部分が、ヒトＭＨＣＩＩ β細胞外ドメインを含み、
該ヒト／げっ歯動物キメラＭＨＣＩＩ αポリペプチドおよびＭＨＣＩＩ βポリペプチドが、該げっ歯動物の細胞の表面に機能的なＭＨＣＩＩ複合体を形成する、
げっ歯動物。
（項目２０）
前記ヒトＭＨＣＩＩ α細胞外ドメインが、ヒトα１ドメインおよびα２ドメインを含む、項目１９に記載のげっ歯動物。
（項目２１）
前記ヒトＭＨＣＩＩ β細胞外ドメインが、ヒトβ１ドメインおよびβ２ドメインを含む、項目１９に記載のげっ歯動物。
（項目２２）
前記第１のヌクレオチド配列が、内在性げっ歯動物ＭＨＣＩＩ αプロモーターおよび調節エレメントの調節制御下で発現され、前記第２のヌクレオチド配列が、内在性げっ歯動物ＭＨＣＩＩ βプロモーターおよび調節エレメントの調節制御下で発現される、項目１９に記載のげっ歯動物。
（項目２３）
前記ヒト／げっ歯動物キメラＭＨＣＩＩ αポリペプチドのげっ歯動物部分が、内在性げっ歯動物ＭＨＣＩＩ αポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む、項目１９に記載のげっ歯動物。
（項目２４）
前記ヒト／げっ歯動物キメラＭＨＣＩＩ βポリペプチドのげっ歯動物部分が、内在性げっ歯動物ＭＨＣＩＩ βポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む、項目１９に記載のげっ歯動物。
（項目２５）
前記ヒト／げっ歯動物キメラＭＨＣＩＩ αポリペプチドおよびβポリペプチドの前記ヒト部分が、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱ、およびＨＬＡ−ＤＰからなる群より選択されるヒトＨＬＡクラスＩＩタンパク質に由来する、項目１９に記載のげっ歯動物。
（項目２６）
前記ヒト／げっ歯動物キメラＭＨＣＩＩ αポリペプチドおよびβポリペプチドの前記ヒト部分が、ヒトＨＬＡ−ＤＲ４タンパク質に由来する、項目２５に記載のげっ歯動物。
（項目２７）
マウスである、項目１９に記載のげっ歯動物。
（項目２８）
前記キメラＭＨＣＩＩ αポリペプチドおよびβポリペプチドのげっ歯動物部分が、マウスＨ−２Ｅタンパク質に由来する、項目２７に記載のマウス。
（項目２９）
項目１９に記載のげっ歯動物であって、それらの内在性げっ歯動物ＭＨＣＩＩ遺伝子座から、機能的な内在性ＭＨＣＩＩポリペプチドを発現しない、げっ歯動物。
（項目３０）
内在性マウスＭＨＣＩＩ遺伝子座にヒト／マウスキメラＭＨＣＩＩ αポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列およびヒト／マウスキメラＭＨＣＩＩ βポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列を含むマウスであって、
該キメラＭＨＣＩＩ αポリペプチドのヒト部分が、ヒトＨＬＡ−ＤＲ４タンパク質のαポリペプチドに由来する細胞外ドメインを含み、該キメラＭＨＣＩＩ βポリペプチドのヒト部分が、ヒトＨＬＡ−ＤＲ４タンパク質のβポリペプチドに由来する細胞外ドメインを含み、
該キメラＭＨＣＩＩ αポリペプチドのマウス部分が、マウスＨ−２Ｅ α鎖の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含み、該キメラＭＨＣＩＩ βポリペプチドのマウス部分が、マウスＨ−２Ｅ β鎖の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含み、
該マウスが、該マウスの細胞の表面に機能的なキメラＨＬＡ−ＤＲ４／Ｈ−２ＥＭＨＣ
ＩＩ複合体を発現する、
マウス。
（項目３１）
前記αポリペプチドの前記細胞外ドメインが、ヒトα１ドメインおよびα２ドメインを含む、項目３０に記載のマウス。
（項目３２）
前記βポリペプチドの前記細胞外ドメインが、ヒトβ１ドメインおよびβ２ドメインを含む、項目３０に記載のマウス。
（項目３３）
前記第１のヌクレオチド配列が、内在性マウスＭＨＣＩＩ αプロモーターおよび調節エレメントの調節制御下で発現され、前記第２のヌクレオチド配列が、内在性マウスＭＨＣＩＩ βプロモーターおよび調節エレメントの調節制御下で発現される、項目３０に記載のマウス。
（項目３４）
項目３０に記載のマウスであって、それらの内在性マウス遺伝子座から、機能的な内在性ＭＨＣＩＩポリペプチドを発現しない、マウス。
（項目３５）
ヒト／マウスキメラＭＨＣＩＩ複合体を発現するようにマウスのＭＨＣＩＩ遺伝子座を改変する方法であって、該内在性マウスＭＨＣＩＩ遺伝子座において、マウスＭＨＣＩＩ複合体をコードするヌクレオチド配列を、ヒト／マウスキメラＭＨＣＩＩ複合体をコードするヌクレオチド配列で置き換える工程を含む、方法。
（項目３６）
前記ヒト／マウスキメラＭＨＣＩＩ複合体をコードする前記ヌクレオチド配列が、ヒトＭＨＣＩＩ αポリペプチドの細胞外ドメインおよびマウスＭＨＣＩＩ αポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインをコードする第１のヌクレオチド配列と、ヒトＭＨＣＩＩ βポリペプチドの細胞外ドメインおよびマウスＭＨＣＩＩ βポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインをコードする第２のヌクレオチド配列とを含む、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
前記キメラＭＨＣＩＩ複合体のヒト部分が、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱ、およびＨＬＡ−ＤＰからなる群より選択されるヒトＨＬＡクラスＩＩタンパク質に由来する、項目３５に記載の方法。
（項目３８）
前記キメラＭＨＣＩＩ複合体のマウス部分が、マウスＨ−２Ｅタンパク質に由来し、該キメラＭＨＣＩＩ複合体のヒト部分が、ヒトＨＬＡ−ＤＲ４タンパク質に由来する、項目３５に記載の方法。
（項目３９）
キメラＭＨＣＩＩ αポリペプチドおよびβポリペプチドのヒト部分が、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱ、およびＨＬＡ−ＤＰからなる群より選択されるヒトＨＬＡクラスＩＩタンパク質に由来する、項目３６に記載の方法。
（項目４０）
キメラＭＨＣＩＩ αポリペプチドおよびβポリペプチドのマウス部分が、マウスＨ−２Ｅタンパク質に由来し、キメラＭＨＣＩＩ αポリペプチドおよびβポリペプチドのヒト部分が、ヒトＨＬＡ−ＤＲ４タンパク質に由来する、項目３６に記載の方法。
（項目４１）
前記置き換えが、単一のＥＳ細胞において行われ、該単一のＥＳ細胞が、マウス胚に導入されて、マウスを作製する、項目３５に記載の方法。

図１は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面に発現される、４つのドメイン：α１、α２、β１、およびβ２を含む、ＭＨＣクラスＩＩの分子の概略図である。灰色の円は、ペプチド結合溝（ｃｌｅｆｔ）において結合されたペプチドを表す。図２は、ヒトＨＬＡの関連のゲノム構造の概略描写（原寸に比例しない）であり、クラスＩ、ＩＩおよびＩＩＩ遺伝子を示す。図３は、マウスＭＨＣの関連のゲノム構造の概略描写（原寸に比例しない）であり、クラスＩ、ＩＩおよびＩＩＩ遺伝子を示す。図４（Ａ〜Ｄ）は、ヒト化Ｉ−Ｅ βおよびＩ−Ｅ α（すなわち、それぞれＨ−２Ｅβ／ＨＬＡ−ＤＲβ１^＊０４およびＨ−２Ｅα／ＨＬＡ−ＤＲα^＊０１キメラ）を含むターゲッティングベクターを生成するための戦略の概略図（原寸に比例しない）である。図４Ｃにおいて、図４Ｂからの最終ヒト化ＭＨＣＩＩ配列は、図４Ａからの最終構築物のＰＩ−ＳｃｅＩ制限部位とＩ−ＣｅｕＩ制限部位との間をライゲーションして、ヒト化ＭＨＣＩＩおよびＢＡＬＢ／ｃ由来のＩ−Ｅαのエクソン１を含む構築物を生成する。Ｐｇ＝偽遺伝子；ＢＨＲ＝細菌性相同組換え；ＣＭ＝クロラムフェニコール；ｓｐｅｃ＝スペクチノマイシン；ｈｙｇ＝ハイグロマイシン；ｎｅｏ＝ネオマイシン；ＥＰ＝エレクトロポレーション。三角はエクソンを表し、黒三角はＣ５７ＢＬ／６マウス由来のマウスエクソンを表し（ＢＡＬＢ／ｃマウス由来のＩ−Ｅαのエクソン１を表す縞の三角を除く）、そして白三角は、ヒトエクソンを表す。図４（Ａ〜Ｄ）は、ヒト化Ｉ−Ｅ βおよびＩ−Ｅ α（すなわち、それぞれＨ−２Ｅβ／ＨＬＡ−ＤＲβ１^＊０４およびＨ−２Ｅα／ＨＬＡ−ＤＲα^＊０１キメラ）を含むターゲッティングベクターを生成するための戦略の概略図（原寸に比例しない）である。図４Ｃにおいて、図４Ｂからの最終ヒト化ＭＨＣＩＩ配列は、図４Ａからの最終構築物のＰＩ−ＳｃｅＩ制限部位とＩ−ＣｅｕＩ制限部位との間をライゲーションして、ヒト化ＭＨＣＩＩおよびＢＡＬＢ／ｃ由来のＩ−Ｅαのエクソン１を含む構築物を生成する。Ｐｇ＝偽遺伝子；ＢＨＲ＝細菌性相同組換え；ＣＭ＝クロラムフェニコール；ｓｐｅｃ＝スペクチノマイシン；ｈｙｇ＝ハイグロマイシン；ｎｅｏ＝ネオマイシン；ＥＰ＝エレクトロポレーション。三角はエクソンを表し、黒三角はＣ５７ＢＬ／６マウス由来のマウスエクソンを表し（ＢＡＬＢ／ｃマウス由来のＩ−Ｅαのエクソン１を表す縞の三角を除く）、そして白三角は、ヒトエクソンを表す。図４（Ａ〜Ｄ）は、ヒト化Ｉ−Ｅ βおよびＩ−Ｅ α（すなわち、それぞれＨ−２Ｅβ／ＨＬＡ−ＤＲβ１^＊０４およびＨ−２Ｅα／ＨＬＡ−ＤＲα^＊０１キメラ）を含むターゲッティングベクターを生成するための戦略の概略図（原寸に比例しない）である。図４Ｃにおいて、図４Ｂからの最終ヒト化ＭＨＣＩＩ配列は、図４Ａからの最終構築物のＰＩ−ＳｃｅＩ制限部位とＩ−ＣｅｕＩ制限部位との間をライゲーションして、ヒト化ＭＨＣＩＩおよびＢＡＬＢ／ｃ由来のＩ−Ｅαのエクソン１を含む構築物を生成する。Ｐｇ＝偽遺伝子；ＢＨＲ＝細菌性相同組換え；ＣＭ＝クロラムフェニコール；ｓｐｅｃ＝スペクチノマイシン；ｈｙｇ＝ハイグロマイシン；ｎｅｏ＝ネオマイシン；ＥＰ＝エレクトロポレーション。三角はエクソンを表し、黒三角はＣ５７ＢＬ／６マウス由来のマウスエクソンを表し（ＢＡＬＢ／ｃマウス由来のＩ−Ｅαのエクソン１を表す縞の三角を除く）、そして白三角は、ヒトエクソンを表す。図４（Ａ〜Ｄ）は、ヒト化Ｉ−Ｅ βおよびＩ−Ｅ α（すなわち、それぞれＨ−２Ｅβ／ＨＬＡ−ＤＲβ１^＊０４およびＨ−２Ｅα／ＨＬＡ−ＤＲα^＊０１キメラ）を含むターゲッティングベクターを生成するための戦略の概略図（原寸に比例しない）である。図４Ｃにおいて、図４Ｂからの最終ヒト化ＭＨＣＩＩ配列は、図４Ａからの最終構築物のＰＩ−ＳｃｅＩ制限部位とＩ−ＣｅｕＩ制限部位との間をライゲーションして、ヒト化ＭＨＣＩＩおよびＢＡＬＢ／ｃ由来のＩ−Ｅαのエクソン１を含む構築物を生成する。Ｐｇ＝偽遺伝子；ＢＨＲ＝細菌性相同組換え；ＣＭ＝クロラムフェニコール；ｓｐｅｃ＝スペクチノマイシン；ｈｙｇ＝ハイグロマイシン；ｎｅｏ＝ネオマイシン；ＥＰ＝エレクトロポレーション。三角はエクソンを表し、黒三角はＣ５７ＢＬ／６マウス由来のマウスエクソンを表し（ＢＡＬＢ／ｃマウス由来のＩ−Ｅαのエクソン１を表す縞の三角を除く）、そして白三角は、ヒトエクソンを表す。図５は、ＭＨＣクラスＩＩＩ−ＥおよびＩ−Ａの遺伝子の概略図を（原寸に比例しない）示す。本概略図は、ハイグロマイシンカセットを用い、その後、ヒト化Ｉ−Ｅ βおよびＩ−Ｅ α（すなわち、それぞれＨ−２Ｅβ／ＨＬＡ−ＤＲβ１^＊０４およびＨ−２Ｅα／ＨＬＡ−ＤＲα^＊０１キメラ）を含むベクターの導入を行う、マウス遺伝子座のノックアウトを示す。白三角は、ヒトエクソンを表す；黒三角は、マウスエクソンを表す。ゲノタイピングのために使用されるプローブは、丸で囲まれる。図６は、図５のネオマイシンカセットのＣｒｅ媒介型除去の、概略図（原寸に比例しない）を示す。白三角は、ヒトエクソンを表す；黒三角は、マウスエクソンを表す。上部の２本の鎖は、ネオマイシン選択カセットを有するヒト化ＭＨＣＩＩヘテロ接合型マウスにおけるＭＨＣＩＩ遺伝子座を表し、そして下部の２本の鎖は、ネオマイシンカセットが除去されたヒト化ＭＨＣＩＩヘテロ接合型マウスにおけるＭＨＣＩＩ遺伝子座を表す。図７は、マウスおよびヒトクラスＩＩ遺伝子座の比較概略図（原寸に比例しない）を示す。クラスＩＩ遺伝子は、ボックスで表され、空のボックスは、偽遺伝子を表す。種々の核酸断片の相対サイズ（ｋｂ）が、含まれる。図８は、左のパネルが、ＭＨＣＩＩ α鎖についてのヒト化戦略の概略図（原寸に比例しない）である；詳細には、この図は、ＭＨＣＩＩ α遺伝子のエクソン２および３によってコードされる、α１ドメインおよびα２ドメインの置き換えを示す一方で、マウス膜貫通配列および細胞質尾部配列を保持している。ヒト化遺伝子座において、ＭＨＣＩＩ αリーダー配列は、マウスＢＡＬＢ／ｃ系統に由来する。右のパネルは、ＭＨＣＩＩ β鎖のヒト化を図示する；詳細には、この図は、ＭＨＣＩＩ β遺伝子のエクソン２および３によってコードされたβ１ドメインおよびβ２ドメインの置き換えを示す一方で、マウスリーダー配列およびマウス膜貫通配列および細胞質尾部配列を保持している。上段の列は、全てヒト配列である；中段の列は、全てマウス配列である；下段の列は全て、エクソン２および３がヒトＨＬＡ−ＤＲ遺伝子に由来する、ヒト化配列である。図９は、ポリ（Ｉ：Ｃ）の存在下（１６８１ＨＥＴ＋ポリ（Ｉ：Ｃ）またはポリ（Ｉ：Ｃ）の非存在下（１６８１ＨＥＴ）での、キメラＨＬＡ−ＤＲ４（ｎｅｏカセットが除去された）に関してヘテロ接合型であるマウス由来のＢ細胞、および野生型マウス（ＷＴマウス）由来のＢ細胞の、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体によるＦＡＣＳ分析を示す。

発明の詳細な説明
定義
本発明は、ヒトまたはヒト化ＭＨＣＩＩポリペプチドを発現する遺伝子改変された非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、ウサギなど）；これらを含む胚、細胞および組織；これらを作製する方法；ならびにこれらを使用する方法を提供する。他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての用語および語句は、反対のことが明らかに示されない限り、またはこの用語もしくは語句が使用される文脈から別段明らかにされない限り、この用語および語句が当該分野で果たしている意味を含む。

用語「保存的」は、保存的アミノ酸置換を記載するために使用される場合、類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する側鎖Ｒ基を有する別のアミノ酸残基によるアミノ酸残基の置換を含む。保存的アミノ酸置換は、保存的置換をコードするヌクレオチド変化を導入するようにヌクレオチド配列を改変することによって達成され得る。一般に、保存的アミノ酸置換は、対象のタンパク質の機能的特性、例えば、ＭＨＣＩＩが対象のペプチドを提示する能力を、実質的に変えない。類似の化学的特性を有する側鎖を有するアミノ酸の基の例としては、脂肪族側鎖、例えばグリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン；脂肪族−ヒドロキシル側鎖、例えばセリンおよびトレオニン；アミド含有側鎖、例えばアスパラギンおよびグルタミン；芳香族側鎖、例えばフェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン；塩基性側鎖、例えばリジン、アルギニン、およびヒスチジン；酸性側鎖、例えばアスパラギン酸およびグルタミン酸；ならびに、硫黄含有側鎖、例えばシステインおよびメチオニンが挙げられる。保存的アミノ酸置換基としては、例えば、バリン／ロイシン／イソロイシン、フェニルアラニン／チロシン、リジン／アルギニン、アラニン／バリン、グルタミン酸／アスパラギン酸、およびアスパラギン／グルタミンが挙げられる。いくつかの実施形態では、保存的アミノ酸置換は、例えば、アラニンスキャニング変異誘発において使用されるように、タンパク質における任意の天然の残基のアラニンによる置換であってもよい。いくつかの実施形態では、保存的置換は、本明細書により参考として組み込まれる、Gonnetら（（１９９２年）Exhaustive Matching of the Entire Protein Sequence Database、Science ２５６巻：１４４３〜４５頁）において開示されるＰＡＭ２５０対数尤度行列において正の値を有するように行われる。いくつかの実施形態において、上記置換は、中程度に保存的な置換であり、ここで、該置換は、ＰＡＭ２５０対数尤度行列において負でない値を有する。

従って、そのゲノムがヒトまたはヒト化ＭＨＣＩＩポリペプチド（これらのポリペプチドは、本明細書中で記載されるアミノ酸配列における保存的アミノ酸置換を含む）をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子改変された非ヒト動物もまた、本発明によって包含される。

当業者は、本明細書中で記載されるヒトまたはヒト化ＭＨＣＩＩポリペプチドをコードする核酸残基に加えて、遺伝コードの縮重に起因して、他の核酸が本発明のポリペプチドをコードし得ることを理解する。従って、保存的アミノ酸置換を有するＭＨＣＩＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をそのゲノムに含む遺伝子改変された非ヒト動物に加えて、そのゲノムが上記遺伝コードの縮重に起因して本明細書中で記載されるものとは異なるヌクレオチド配列を含む非ヒト動物もまた、提供される。

用語「同一性」は、配列に関して使用される場合、ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸の配列同一性を測定するために使用され得る当該分野で公知の多くの異なるアルゴリズムによって決定される同一性を含む。本明細書中で記載されるいくつかの実施形態では、同一性は、１０．０のオープンギャップペナルティー、０．１の伸長ギャップペナルティーを用いたＣｌｕｓｔａｌＷｖ．１．８３（ｓｌｏｗ）アラインメントを使用し、かつＧｏｎｎｅｔ類似性行列（ＭａｃＶｅｃｔｏｒ（商標）１０．０．２、ＭａｃＶｅｃｔｏｒＩｎｃ．、２００８年）を使用して決定される。配列の同一性に関して比較される配列の長さは、特定の配列に依存する。種々の実施形態では、同一性は、成熟タンパク質の配列を、そのＮ−末端からそのＣ−末端まで比較することによって決定される。種々の実施形態では、キメラヒト／非ヒト配列をヒト配列と比較する場合、ヒト配列とキメラヒト／非ヒト配列のヒト部分との間のレベルの同一性の確認を目的とした比較を行う（例えば、キメラヒト／マウスタンパク質のヒトエクトドメイン対ヒトタンパク質のヒトエクトドメインを比較する）ことにおいて、該キメラヒト／非ヒト配列のヒト部分を使用する（しかし、非ヒト部分を使用しない）。

配列、例えば、ヌクレオチド配列またはアミノ酸に関して、用語「相同性」または「相同な」は、最適アラインメントおよび比較における２つの配列は、少なくとも約７５％のヌクレオチドまたはアミノ酸、少なくとも約８０％のヌクレオチドまたはアミノ酸、少なくとも約９０〜９５％のヌクレオチドまたはアミノ酸、例えば、９７％を超えるヌクレオチドまたはアミノ酸において、同一であることを意味する。最適な遺伝子ターゲティングのために、標的化構築物（ｔａｒｇｅｔｉｎｇｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）は、内在性ＤＮＡ配列に対して相同なアーム（すなわち、「ホモロジーアーム」）を含むべきであることを、当業者は理解する；従って、相同組換えは、標的化構築物と標的にされた内在性配列との間に起こり得る。

用語「作動可能に連結している」は、記載された構成要素が、該要素の意図する様式で機能することを可能にする関係にある近位をいう。このように、タンパク質をコードする核酸配列は、正しい転写調節を有するように調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー配列など）に作動可能に連結し得る。さらに、本発明のキメラタンパク質またはヒト化タンパク質の種々の部分は、細胞内で、タンパク質の正しい折り畳み、プロセシング、標的、発現および他の機能的特性を保持するように作動可能に連結し得る。他に言及されない限り、本発明のキメラタンパク質またはヒト化タンパク質の種々のドメインは、互いに作動可能に連結している。

本明細書で使用される用語「ＭＨＣＩＩ複合体」、または「ＭＨＣＩＩタンパク質」などは、ＭＨＣＩＩ αポリペプチドとＭＨＣＩＩ βポリペプチドとの間の複合体を含む。本明細書で使用される用語「ＭＨＣＩＩ αポリペプチド」または「ＭＨＣＩＩ βポリペプチド」（など）は、それぞれ、ＭＨＣＩ αポリペプチド単独またはＭＨＣＩＩ βポリペプチド単独を含む。同様に、用語「ＨＬＡ−ＤＲ４複合体」、「ＨＬＡ−ＤＲ４タンパク質」、「Ｈ−２Ｅ複合体」、または「Ｈ−２Ｅタンパク質」（”Ｈ−２Ｅ” ｐｒｏｔｅｉｎ”）などは、αポリペプチドとβポリペプチドとの間の複合体を指す。代表的に、用語「ヒトＭＨＣ」および「ＨＬＡ」は、相互交換可能に使用される。

遺伝子置き換えに関して用語「置き換え」は、内在性遺伝子の遺伝子座に外来性遺伝物質を置き、それによって、オルソロガスなまたは相同な核酸配列で内在性遺伝子の全てまたは一部を置き換えることをいう。以下の実施例において実証されるように、内在性ＭＨＣＩＩ遺伝子座の核酸配列を、ヒトＭＨＣＩＩのαポリペプチドおよびβポリペプチドの部分をコードする（特に、ＭＨＣＩＩのαポリペプチドおよびβポリペプチドの細胞外部分をコードする）配列を含むヌクレオチド配列によって置き換えた。

「機能的」は、例えば、機能的ポリペプチドについて本明細書中で使用される場合、通常天然のタンパク質に関連する少なくとも１つの生物学的活性を有するポリペプチドをいう。例えば、本発明のいくつかの実施形態では、内在性遺伝子座における置き換え（例えば、内在性非ヒトＭＨＣＩＩ遺伝子座における置き換え）は、機能的内在性ポリペプチドを発現しない遺伝子座を生じる。

遺伝子改変されたＭＨＣＩＩ動物
種々の態様では、本発明は、一般に、そのゲノムにヒトまたはヒト化ＭＨＣＩＩ複合体をコードするヌクレオチド配列を含む、遺伝子改変された非ヒト動物を提供する；従って、該動物は、ヒトまたはヒト化ＭＨＣＩＩ複合体（例えば、ＭＨＣＩＩのαポリペプチドおよびβポリペプチド）を発現する。

ＭＨＣ遺伝子は、３つのクラス：クラスＩ、クラスＩＩ、およびクラスＩＩＩに分類され、これらの全ては、ヒト第６番染色体上またはマウス第１７番染色体上のいずれかにコードされる。ヒトおよびマウスのＭＨＣクラスの相対的構成の概略は、それぞれ図２および３に示される。ＭＨＣ遺伝子の大部分は、多形性であり、実際、これらは、マウスおよびヒトのゲノムの最も多形な遺伝子である。ＭＨＣ多形性は、進化的利点を提供する上で重要であると推定される；配列における変化はペプチド結合における差異をもたらし得、よりよい抗原提示を可能にする。１つの例外は、単形性であるヒトＨＬＡ−ＤＲα鎖およびそのマウスホモログ、Ｅα（すなわち、Ｈ−２Ｅａ）である。

ＭＨＣクラスＩＩ複合体は、２つの非共有結合するドメイン：α鎖およびβ鎖を含み、本明細書でαポリペプチドおよびβポリペプチドとも呼ばれる（図１）。該タンパク質は、細胞膜を貫く；従って、これは、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインを含む。α鎖の細胞外部分は、α１ドメインおよびα２ドメインを含み、β鎖の細胞外部分は、β１ドメインおよびβ２ドメインを含む。α１ドメインおよびβ１ドメインは、細胞表面にペプチド結合溝を形成する。ＭＨＣＩＩ複合体のペプチド結合溝の三次元の確認に起因して、理論的には、結合抗原の長さに上限はないが、ＭＨＣＩＩによって提示されるペプチドは、代表的に、１３と１７との間のアミノ酸長である。

抗原性ペプチドとのその相互作用に加えて、ＭＨＣＩＩ分子のペプチド結合溝は、ＭＨＣＩＩ複合体形成およびペプチド獲得のプロセスの間に、インバリアント鎖（Ｉｉ）と相互作用する。α／β ＭＨＣＩＩダイマーは、小胞体内で集合して、Ｉｉ鎖と会合する。Ｉｉ鎖は、ペプチド結合およびＭＨＣＩＩのエンドサイトーシス経路へのターゲッティングの制御を担う。エンドソームにおいて、Ｉｉは、タンパク分解を受け、そしてＩｉの小断片、クラスＩＩ関連インバリアント鎖ペプチド（ＣＬＩＰ）が、ペプチド結合溝に残る。エンドソームにおいて、ＨＬＡ−ＤＭ（ヒトにおいて）の制御下で、ＣＬＩＰは、抗原性ペプチドに変換される。

ＭＨＣＩＩは、α２ドメインとβ２ドメインとの間の接合部における疎水性クレバスにおいてＴ細胞共受容体ＣＤ４と相互作用する。WangおよびReinherz（２００２年）Structural Basis of T Cell Recognition of Peptides Bound to MHC Molecules、Molecular Immunology、３８巻：１０３９〜４９頁。ＣＤ４およびＴ細胞受容体がペプチドと複合体化した同じＭＨＣＩＩ分子に結合する場合、Ｔ細胞の抗原に対する感度は、増大し、これは、活性化のために１００分の１未満（１００−ｆｏｌｄｌｅｓｓ）の抗原しか必要としない。Janeway’s Immunobiology、第７版、Ｍｕｒｐｈｙら編、Garland Science、２００８年（本明細書に参考として組み込まれる）を参照されたい。

ＭＨＣＩＩの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインについて、多くの機能が提唱されている。細胞質ドメインの場合、細胞内シグナル伝達、細胞膜への輸送、そして最終的には、抗原提示のために重要であることが示されている。例えば、Ｔ細胞ハイブリドーマは、細胞質ドメインにおいて短縮されたＭＨＣＩＩ β鎖をトランスフェクトされた抗原提示細胞（ＡＰＣ）に対して僅かにしか応答をせず、そしてＢ細胞分化の誘導は、妨げられることが示された。例えば、Smileyら（１９９６年）Truncation of the class II β-chain cytoplasmic domain influences the level of class II/invariant chain-derived peptide complexes、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、９３巻：２４１〜４４頁を参照されたい。クラスＩＩ分子の短縮は、ｃＡＭＰ生成を損なうとみられる。ＭＨＣＩＩの細胞質尾部の欠失は、細胞内輸送に影響を及ぼし、従って、複合体が、エンドサイトーシス経路において関連の抗原とぶつかることを防ぐと仮定されている。Smileyら（上掲）は、細胞質ドメインにおけるクラスＩＩ分子の短縮が、ＣＬＩＰ／クラスＩＩ複合体の数を減らすことを実証し、これにより、ＣＬＩＰが効果的に抗原提示を調節する能力に影響を及ぼすと仮定された。

ＭＨＣＩＩクラスタリングはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）誘発に重要であるが、細胞質ドメインにおいて短縮されたＭＨＣＩＩ分子が細胞骨格に結合し、従って凝集することを妨害される場合、Ｔ細胞への抗原提示が影響を受けると仮説づけられている。Ostrand-Rosenbergら（１９９１年）Abrogation of Tumorigenicity by MHC Class II Antigen Expression Requires the Cytoplasmic Domain of the Class II Molecule, J. Immunol. １４７巻：２４１９〜２２頁。実際に、細胞質ドメインにおいて短縮されたＨＬＡ−ＤＲが、オリゴマー化の後に細胞骨格に会合できないことが、近年示された。El Fakhyら（２００４年）Delineation of the HLA-DR Region and the Residues Involved in the Association with the Cytoskeleton、J. Biol. Chem. ２７９巻：１８４７２〜８０頁。重要なことには、アクチン細胞骨格は、局在化シグナル伝達活性の部位であり、これは、抗原提示に影響を与え得る。細胞骨格との会合に加えて、近年の研究は、全てのＨＬＡ−ＤＲ分子の２０％までが、コレステロールおよびグリコスフィンゴリピドが豊富なマイクロドメインであるＡＰＣの脂質ラフトに構成的に存在すること、ならびにこのような局在化は、抗原提示、免疫シナプス形成、およびＭＨＣＩＩ媒介型シグナル伝達に重要であることも、示している。例えば、Dolanら（２００４年）Invariant Chain and the MHC II Cytoplasmic Domains Regulate Localization of MHC Class II Molecules to Lipid Rafts in Tumor Cell-Based Vaccines、J. Immunol. １７２巻：９０７〜１４頁を参照されたい。Dolan らは、ＭＨＣＩＩの細胞質ドメインの短縮は、ＭＨＣＩＩの脂質ラフトへの構成的局在化を低減することを示唆した。

加えて、ＭＨＣＩＩの細胞質ドメイン、詳細にはβ鎖は、ＭＨＣＩＩのエンドサイトーシス輸送、内部移行、および分解を制御するユビキチンリガーゼである膜結合型ＲＩＮＧ−ＣＨＩ（ＭＡＲＣＨＩ）によるユビキチン化に供されるロイシン残基を含む；そして、ＭＡＲＣＨ媒介型ユビキチン化は、樹状細胞成熟を止め、細胞膜におけるＭＨＣＩＩのレベルの上昇をもたらすことが示されている。Shinら（２００６年）Surface expression of MHC class II in dendritic cells is controlled by regulated ubiquitination、Nature ４４４巻：１１５〜１８頁；De Gassart ら（２００８年）MHC class II stabilization at the surface of human dendritic cells is the result of maturation-dependent MARCH I down-regulation、Proc. Natl. Acad. Sci. USA １０５巻：３４９１〜９６頁。

ＭＨＣＩＩのα鎖およびβ鎖の膜貫通ドメインは、互いに相互作用し、この相互作用は、ＭＨＣクラスＩＩ複合体の正しい集合のために重要である。CossonおよびBonifacino（１９９２年）Role of Transmembrane Domain Interactions in the Assembly of Class II MHC Molecules, Nature ２５８巻：６５９〜６２頁。実際に、α鎖およびβ鎖の膜貫通ドメインがＩＬ−２受容体のα鎖によって置き換えられたＭＨＣＩＩ分子が、ＥＲに保持され、細胞表面においてほとんど検出可能ではなかった。同上文献。変異誘発研究を通して、α膜貫通ドメインおよびβ膜貫通ドメインにおける保存的Ｇｌｙ残基が、細胞表面におけるＭＨＣＩＩ集合を担うことが見出された。同上文献。従って、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインの両方が、ＭＨＣＩＩ複合体の正しい機能のために極めて重要である。

種々の実施形態において、本発明は、そのゲノムに、ヒトもしくはヒト化ＭＨＣＩＩ複合体、例えば、ヒトもしくはヒト化ＭＨＣＩＩ αおよび／またはβポリペプチド（複数可）をコードするヌクレオチド配列を含む、遺伝子改変された非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、など）を提供する。非ヒト動物、例えば、ヒト／非ヒトキメラＭＨＣＩＩ複合体を発現する非ヒト動物（例えば、ヒト／非ヒトキメラＭＨＣＩＩ αポリペプチドおよびβポリペプチドを発現する非ヒト動物）は、そのゲノムに、部分的にヒトおよび部分的に非ヒトであるＭＨＣＩＩ複合体をコードするヌクレオチド配列を含み得る。１つの態様において、非ヒト動物は、ヒトもしくはヒト化ＭＨＣＩＩ複合体、例えば、ヒト／非ヒトキメラＭＨＣＩＩ複合体のみを発現し、内在性ＭＨＣＩＩ遺伝子座から内在性非ヒトＭＨＣＩＩ複合体を発現しない。いくつかの実施形態において、上記動物は、内在性ＭＨＣＩＩ遺伝子座から任意の内在性非ヒトＭＨＣＩＩ複合体を発現不能であるが、ヒトもしくはヒト化ＭＨＣＩＩ複合体のみを発現する。種々の実施形態において、遺伝子改変された非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、ウサギなど）は、その生殖細胞系に、ヒトもしくはヒト化ＭＨＣＩＩ複合体、例えば、ヒトもしくはヒト化ＭＨＣＩＩ αおよび／またはβポリペプチド（複数可）をコードするヌクレオチド配列を含む。

１つの態様において、ヒト／非ヒトキメラＭＨＣＩＩ複合体が提供される。１つの実施形態において、ヒト／非ヒトキメラＭＨＣＩＩ複合体は、ヒト／非ヒトキメラＭＨＣＩＩ αポリペプチドおよびヒト／非ヒトキメラＭＨＣＩＩ βポリペプチドを含む。１つの態様において、キメラＭＨＣＩＩ αポリペプチドのヒト部分および／またはキメラＭＨＣＩＩ βポリペプチドのヒト部分は、それぞれヒトＭＨＣＩＩ αポリペプチドおよび／またはヒトＭＨＣＩＩ βポリペプチドのペプチド結合ドメインを含む。１つの態様において、キメラＭＨＣＩＩ αおよび／またはβポリペプチドのヒト部分は、それぞれヒトＭＨＣＩＩ αおよび／またはβポリペプチドの細胞外ドメインを含む。１つの実施形態において、キメラＭＨＣＩＩ αポリペプチドのヒト部分は、ヒトＭＨＣＩＩ αポリペプチドのα１ドメインを含む；別の実施形態において、キメラＭＨＣＩＩ αポリペプチドのヒト部分は、ヒトＭＨＣＩＩ αポリペプチドのα１ドメインおよびα２ドメインを含む。さらなる実施形態において、キメラＭＨＣＩＩ βポリペプチドのヒト部分は、ヒトＭＨＣＩＩ βポリペプチドのβ１ドメインを含む；別の実施形態において、キメラＭＨＣＩＩ βポリペプチドのヒト部分は、ヒトＭＨＣＩＩ βポリペプチドのβ１ドメインおよびβ２ドメインを含む。

本明細書中に記載されるＭＨＣＩＩのαポリペプチドおよびβポリペプチドのヒト部分は、ＨＬＡ−ＤＰ遺伝子座、ＨＬＡ−ＤＱ遺伝子座およびＨＬＡ−ＤＲ遺伝子座のいずれかによってコードされ得る。一般に使用されるＨＬＡ抗原のリストは、Shankarkumarら（（２００４年）The Human Leukocyte Antigen (HLA) System、Int. J. Hum. Genet.４巻（２号）：９１〜１０３頁）（本明細書中に参考によって組み込まれる）に記載される。Shankarkumarらはまた、当該分野で使用されるＨＬＡ命名法の簡潔な説明も提示する。ＨＬＡ命名法および種々のＨＬＡ対立遺伝子に関するさらなる情報は、Holdsworthら（２００９年）The HLA dictionary 2008: a summary of HLA-A, -B, -C, -DRB1/3/4/5, and DQB1 alleles and their association with serologically defined HLA-A, -B, -C, -DR, and -DQ antigens、Tissue Antigens ７３巻：９５〜１７０頁において、ならびにMarshらによる最新の更新（２０１０年）Nomenclature for factors of the HLA system、２０１０年、Tissue Antigens ７５巻：２９１〜４５５頁によって見出され得る（両方とも、本明細書中で参考として組み込まれる）。従って、ヒトまたはヒト化ＭＨＣＩＩポリペプチドは、ここで記載される任意の機能的ヒトＨＬＡ分子に由来し得る。

１つの特定の態様において、本明細書で記載されるヒト化ＭＨＣＩＩ複合体のヒト部分は、ヒトＨＬＡ−ＤＲ、例えば、ＨＬＡ−ＤＲ４に由来する。代表的に、ＨＬＡ−ＤＲ α鎖は、単形性であり、例えば、ＨＬＡ−ＤＲ複合体のα鎖は、ＨＬＡ−ＤＲＡ遺伝子（例えば、ＨＬＡ−ＤＲα^＊０１遺伝子）によってコードされる。他方で、ＨＬＡ−ＤＲ β鎖は、多形性である。従って、ＨＬＡ−ＤＲ４は、ＨＬＡ−ＤＲＡ遺伝子によってコードされるα鎖およびＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子（例えば、ＨＬＡ−ＤＲβ１^＊０４遺伝子）によってコードされるβ鎖を含む。本明細書で以下に記載されるように、ＨＬＡ−ＤＲ４は、多くの自己免疫疾患、例えば、関節リウマチ、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症などの発症に関連することが公知である。本発明の１つの実施形態において、ＨＬＡ−ＤＲＡ対立遺伝子は、ＨＬＡ−ＤＲα^＊０１対立遺伝子、例えば、ＨＬＡ−ＤＲα^＊０１：０１：０１：０１である。別の実施形態において、ＨＬＡ−ＤＲＢ対立遺伝子は、ＨＬＡ−ＤＲβ１^＊０４、例えば、ＨＬＡ−ＤＲβ１^＊０４：０１：０１である。本実施例は、これらの特定のＨＬＡ配列を記載するが、任意の好適なＨＬＡ−ＤＲ配列、例えば、ヒト集団において示される多形性バリアント、１つまたは複数の保存的または非保存的アミノ酸置換を有する配列、遺伝コードの縮重に起因して本明細書で記載される配列とは異なる核酸配列などが、本明細書に包含される。

ヒト化ＭＨＣＩＩ複合体のヒト部分は、一般的なヒト疾患に関連することが公知のＨＬＡ対立遺伝子のヌクレオチド配列によってコードされ得る。このようなＨＬＡ対立遺伝子としては、これらに限定されないが、ＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４０１、−ＤＲＢ１^＊０３０１、−ＤＱＡ１^＊０５０１、−ＤＱＢ１^＊０２０１、−ＤＲＢ１^＊１５０１、−ＤＲＢ１^＊１５０２、−ＤＱＢ１^＊０６０２、−ＤＱＡ１^＊０１０２、−ＤＱＡ１^＊０２０１、−ＤＱＢ１^＊０２０２、−ＤＱＡ１^＊０５０１、およびこれらの組み合わせが挙げられる。ＨＬＡ対立遺伝子／疾患関連性の概要については、Bakkerら（２００６年）A high-resolution HLA and SNP haplotype map for disease association studies in the extended human MHC、Nature Genetics ３８巻：１１６６〜７２頁および補遺情報（本明細書に参考として組み込まれる）を参照されたい。

１つの態様において、ヒト／非ヒトキメラＭＨＣＩＩ複合体の非ヒト部分は、内在性非ヒト（例えば、げっ歯動物、例えば、マウス、ラットなど）ＭＨＣＩＩ複合体の膜貫通ドメインおよび／または細胞質ドメインを含む。従って、ヒト／非ヒトキメラＭＨＣＩＩ αポリペプチドの非ヒト部分は、内在性非ヒトＭＨＣＩＩ αポリペプチドの膜貫通ドメインおよび／または細胞質ドメインを含み得る。ヒト／非ヒトキメラＭＨＣＩＩ βポリペプチドの非ヒト部分は、内在性非ヒトＭＨＣＩＩ βポリペプチドの膜貫通ドメインおよび／または細胞質ドメインを含み得る。１つの態様において、上記動物はマウスであり、そしてキメラαポリペプチドおよびβポリペプチドの非ヒト部分は、マウスＨ−２Ｅタンパク質に由来する。従って、キメラαポリペプチドおよびβポリペプチドの非ヒト部分は、マウスＨ−２Ｅタンパク質に由来する膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含み得る。特定のＨ−２Ｅ配列が実施例において企図されるが、任意の好適な配列、例えば、多形性バリアント、保存的／非保存的アミノ酸置換などが、本明細書に包含される。

本発明の種々の態様において、ヒト／非ヒトキメラＭＨＣＩＩ複合体をコードする配列（複数可）は、内在性非ヒトＭＨＣＩＩ遺伝子座（例えば、マウスＨ−２Ａおよび／またはＨ−２Ｅ遺伝子座）に位置する。１つの実施形態において、このことは、内在性ＭＨＣＩＩ遺伝子（複数可）またはその部分の、ヒトもしくはヒト化ＭＨＣＩＩタンパク質をコードするヌクレオチド配列（複数可）での置き換え、例えば、本明細書で記載されるヒト／非ヒトキメラＭＨＣＩＩタンパク質をコードするキメラ遺伝子をもたらす。ＭＨＣＩＩ αポリペプチドおよびβポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、互いに染色体上の近くに位置するので、置き換えは、２つの遺伝子を独立して標的とするか、または一緒に標的とするように設計可能である；これらの両方の可能性が、本明細書に包含される。１つの実施形態において、置き換えは、ＭＨＣＩＩ αポリペプチドおよびβポリペプチドをコードする内在性ヌクレオチド配列の、ヒト／非ヒトキメラＭＨＣ αポリペプチドおよびヒト／非ヒトキメラＭＨＣ βポリペプチドをコードするヌクレオチド配列での置き換えを含む。１つの態様において、置き換えは、１つまたは複数の（例えば、２つの）内在性ＭＨＣＩＩ遺伝子を表すヌクレオチド配列を置き換える工程を含む。従って、非ヒト動物は、内在性ＭＨＣＩＩ遺伝子座におけるヒト／非ヒトキメラヌクレオチド配列を含み、そして内在性非ヒト遺伝子座から、ヒト／非ヒトキメラＭＨＣＩＩタンパク質を発現する。

従って、内在性ＭＨＣＩＩ遺伝子の遺伝子座にヒト／非ヒトキメラＭＨＣＩＩ αポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列およびヒト／非ヒトキメラＭＨＣＩＩ βポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列を含む非ヒト動物が本明細書で提供され、ここで、ヒト／非ヒトキメラＭＨＣＩＩ αポリペプチドのヒト部分は、ヒトＭＨＣＩＩ α細胞外ドメインを含み、ヒト／非ヒトキメラＭＨＣＩＩ βポリペプチドのヒト部分は、ヒトＭＨＣＩＩ β細胞外ドメインを含み、ヒト／非ヒトキメラＭＨＣＩＩ αポリペプチドおよびＭＨＣＩＩ βポリペプチドは、細胞の表面に機能的なＭＨＣＩＩ複合体を形成する。

ヒト／非ヒトキメラポリペプチドは、ヒトまたは非ヒトリーダー（シグナル）配列を含むものであってもよい。１つの実施形態において、キメラＭＨＣＩＩ αポリペプチドは、内在性ＭＨＣＩＩ αポリペプチドの非ヒトリーダー配列を含む。１つの実施形態において、キメラＭＨＣＩＩ βポリペプチドは、内在性ＭＨＣＩＩ βポリペプチドの非ヒトリーダー配列を含む。代替の実施形態において、キメラＭＨＣＩＩ αおよび／またはＭＨＣＩＩ βポリペプチドは、それぞれ、別の非ヒト動物、例えば、別のげっ歯動物もしくは別のマウス系統由来のＭＨＣＩＩ αおよび／またはＭＨＣＩＩ βポリペプチドの非ヒトリーダー配列を含む。従って、キメラＭＨＣＩＩ αおよび／またはＭＨＣＩＩ βポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、それぞれ、非ヒトＭＨＣＩＩ αおよび／またはＭＨＣＩＩ βリーダー配列をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結し得る。なお別の実施形態において、キメラＭＨＣＩＩ αおよび／またはＭＨＣＩＩ βポリペプチドは、それぞれヒトＭＨＣＩＩ αおよび／またはヒトＭＨＣＩＩ βポリペプチドのヒトリーダー配列（例えば、それぞれ、ヒトＨＬＡ−ＤＲＡおよび／またはヒトＨＬＡ−ＤＲβ１^＊０４のリーダー配列）を含む。

ヒト／非ヒトキメラＭＨＣＩＩ αおよび／またはＭＨＣＩＩ βポリペプチドは、そのヒト部分内に、それぞれ、完全なまたは実質的に完全な、ヒトＭＨＣＩＩ αおよび／またはヒトＭＨＣＩＩ βポリペプチドの細胞外ドメインを含み得る。従って、ヒト部分は、ヒトＭＨＣＩＩ αおよび／またはヒトＭＨＣＩＩ βポリペプチド（例えば、ヒトＨＬＡ−ＤＲＡおよび／またはヒトＨＬＡ−ＤＲβ１^＊０４）の細胞外ドメインをコードするアミノ酸の少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、例えば、９５％以上を含み得る。１つの例において、ヒトＭＨＣＩＩ αおよび／またはヒトＭＨＣＩＩ βポリペプチドの実質的に完全な細胞外ドメインは、ヒトリーダー配列を欠く。別の例において、ヒト／非ヒトキメラＭＨＣＩＩ αおよび／またはヒト／非ヒトキメラＭＨＣＩＩ βポリペプチドは、ヒトリーダー配列を含む。

さらに、キメラＭＨＣＩＩ αおよび／またはＭＨＣＩＩ βポリペプチドは、内在性非ヒトプロモーターおよび調節エレメント、例えば、それぞれ、マウスＭＨＣＩＩ αおよび／またはＭＨＣＩＩ β調節エレメントの制御下で発現され得る。このような配置は、非ヒト動物においてキメラＭＨＣＩＩポリペプチドの、例えば、非ヒト動物における免疫応答の間の、正しい発現を促進する。

遺伝子改変される非ヒト動物は、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ウシ（例えば、雌ウシ、雄ウシ、バッファロー）、シカ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ネコ、イヌ、フェレット、霊長類（例えば、マーモセット、アカゲザル）からなる群より選択され得る。非ヒト動物について、好適な遺伝子改変可能なＥＳ細胞が容易に入手できない場合、他の方法が、遺伝子改変を含む非ヒト動物を作製するために使用される。このような方法は、例えば、非ＥＳ細胞ゲノム（例えば、線維芽細胞または人工多能性細胞）を改変する工程、および核移入を使用して好適な細胞、例えば、卵母細胞へ改変したゲノムを移植する工程、および胚を形成するために好適な条件下で、非ヒト動物において該改変細胞（例えば、改変卵母細胞）を懐胎させる工程を含む。

１つの態様では、非ヒト動物は、哺乳動物である。１つの態様では、非ヒト動物は、小型の哺乳動物、例えば、トビネズミ上科（Dipodoidea）またはネズミ上科（Muroidea）の小哺乳動物である。１つの実施形態では、遺伝子改変された動物は、げっ歯動物である。１つの実施形態では、げっ歯動物は、マウス、ラット、およびハムスターから選択される。１つの実施形態では、げっ歯動物は、上科ネズミ上科（ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙＭｕｒｏｉｄｅａ）から選択される。１つの実施形態では、遺伝子改変された動物は、カンガルーハムスター科（Calomyscidae）（例えば、マウス様ハムスター）、キヌゲネズミ科（Cricetidae）（例えば、ハムスター、新世界ラットおよび新世界マウス、ハタネズミ）、ネズミ科（Muridae）（真のマウスおよびラット（true mice and rats）、アレチネズミ、トゲマウス、タテガミネズミ（crested rats））、アシナガマウス科（Nesomyidae）（キノボリマウス（climbing mice）、イワマウス（rock mice）、尾のあるラット（with-tailed rats）、マダガスカルラットおよびマウス（Malagasy rats and mice））、トゲヤマネ科（Platacanthomyidae）（例えば、トゲヤマネ（spiny dormice））、ならびにメクラネズミ科（Spalacidae）（例えば、デバネズミ（mole rates）、タケネズミ（bamboo rats）、およびモグラネズミ（zokors））から選択される科に由来する。特定の実施形態では、上記遺伝子改変されたげっ歯動物は、真のマウスまたはラット（ネズミ科）、アレチネズミ、トゲマウス、およびタテガミネズミから選択される。１つの実施形態では、遺伝子改変されたマウスは、ネズミ科のメンバー由来である。１つの実施形態では、上記動物は、げっ歯動物である。特定の実施形態では、上記げっ歯動物は、マウスおよびラットから選択される。１つの実施形態では、上記非ヒト動物は、マウスである。

特定の実施形態では、非ヒト動物は、Ｃ５７ＢＬ／Ａ、Ｃ５７ＢＬ／Ａｎ、Ｃ５７ＢＬ／ＧｒＦａ、Ｃ５７ＢＬ／ＫａＬｗＮ、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６ＢｙＪ、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ、Ｃ５７ＢＬ／１０、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ、Ｃ５７ＢＬ／１０Ｃｒ、およびＣ５７ＢＬ／Ｏｌａから選択されるＣ５７ＢＬ系統のマウスである、げっ歯動物である。別の実施形態では、マウスは、１２９Ｐ１、１２９Ｐ２、１２９Ｐ３、１２９Ｘ１、１２９Ｓ１（例えば、１２９Ｓ１／ＳＶ、１２９Ｓ１／ＳｖＩｍ）、１２９Ｓ２、１２９Ｓ４、１２９Ｓ５、１２９Ｓ９／ＳｖＥｖＨ、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）、１２９Ｓ７、１２９Ｓ８、１２９Ｔ１、１２９Ｔ２である系統からなる群より選択される１２９系統である（例えば、Festingら（１９９９年）Revised nomenclature for strain 129 mice、Mammalian Genome １０巻：８３６頁を参照されたい、また、Auerbachら（２０００年）Establishment and Chimera Analysis of 129/SvEv- and C57BL/6-Derived Mouse Embryonic Stem Cell Linesも参照されたい）。特定の実施形態では、遺伝子改変されたマウスは、上記の１２９系統と上記のＣ５７ＢＬ／６系統との混血である。別の特定の実施形態では、マウスは、上記の１２９系統の混血であるか、または上記のＢＬ／６系統の混血である。特定の実施形態では、混血の１２９系統は、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）系統である。別の実施形態では、マウスは、ＢＡＬＢ系統、例えば、ＢＡＬＢ／ｃ系統である。なお別の実施形態では、マウスは、ＢＡＬＢ系統と別の上記の系統との混血である。

１つの実施形態では、非ヒト動物は、ラットである。１つの実施形態では、ラットは、Ｗｉｓｔａｒラット、ＬＥＡ系統、ＳｐｒａｇｕｅＤａｗｌｅｙ系統、Ｆｉｓｃｈｅｒ系統、Ｆ３４４、Ｆ６、およびＤａｒｋＡｇｏｕｔｉから選択される。１つの実施形態では、ラット系統は、Ｗｉｓｔａｒ、ＬＥＡ、ＳｐｒａｇｕｅＤａｗｌｅｙ、Ｆｉｓｃｈｅｒ、Ｆ３４４、Ｆ６、およびＤａｒｋＡｇｏｕｔｉからなる群より選択される２以上の系統の混血である。

従って、１つの実施形態において、本発明は、そのゲノムに、ヒト／マウスキメラＭＨＣＩＩ複合体、例えば、ヒト／マウスキメラＭＨＣＩＩ αポリペプチドおよびβポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、遺伝子改変されたマウスに関する。１つの実施形態において、ヒト／マウスキメラＭＨＣＩＩ αポリペプチドのヒト部分は、ヒトＭＨＣＩＩ αペプチド結合ドメインもしくは細胞外ドメインを含み、ヒト／マウスキメラＭＨＣＩＩ βポリペプチドのヒト部分は、ヒトＭＨＣＩＩ βペプチド結合ドメインもしくは細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態において、マウスは、内在性マウス遺伝子座（例えば、Ｈ−２Ａおよび／またはＨ−２Ｅ遺伝子座）から、内在性マウスαおよび／またはβポリペプチドのペプチド結合ドメインもしくは細胞外ドメインを発現しない。いくつかの実施形態において、マウスは、機能的なＭＨＣクラスＩＩ分子（Ｈ−２Ａｂ１、Ｈ−２Ａａ、Ｈ−２Ｅｂ１、Ｈ−２Ｅｂ２、Ｈ−２Ｅａ、およびこれらの組み合わせを含む）をコードする遺伝子を欠くゲノムを含む。ヒトＭＨＣＩＩ αポリペプチドのペプチド結合ドメインは、α１ドメインを含み得、ヒトＭＨＣＩＩ βポリペプチドのペプチド結合ドメインは、β１ドメインを含み得る；従って、キメラＭＨＣＩＩ複合体のペプチド結合ドメインは、ヒトα１およびβ１ドメインを含み得る。ヒトＭＨＣＩＩ αポリペプチドの細胞外ドメインは、α１およびα２ドメインを含み得、ヒトＭＨＣＩＩ βポリペプチドの細胞外ドメインは、β１およびβ２ドメインを含み得る；従って、キメラＭＨＣＩＩ複合体の細胞外ドメインは、ヒトα１、α２、β１およびβ２ドメインを含み得る。１つの実施形態において、キメラＭＨＣＩＩ複合体のマウス部分は、マウスＭＨＣＩＩの膜貫通ドメインおよび細胞質ゾルドメイン、例えばマウスＨ−２Ｅ（例えば、マウスＨ−２Ｅ α鎖およびβ鎖の膜貫通ドメインおよび細胞質ゾルドメイン）を含む。

従って、１つの実施形態において、遺伝子改変されたマウスが提供され、ここで、該マウスは、内在性マウスＭＨＣＩＩ遺伝子座にヒト／マウスキメラＭＨＣＩＩ αポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列およびヒト／マウスキメラＭＨＣＩＩ βポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列を含み、ここで、キメラＭＨＣＩＩ αポリペプチドのヒト部分は、ヒトＨＬＡ−ＤＲ４タンパク質のαポリペプチドに由来する細胞外ドメインを含み、キメラＭＨＣＩＩ βポリペプチドのヒト部分は、ヒトＨＬＡ−ＤＲ４タンパク質のβポリペプチドに由来する細胞外ドメインを含み、キメラＭＨＣＩＩ αポリペプチドのマウス部分は、マウスＨ−２Ｅ α鎖の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含み、キメラＭＨＣＩＩ βポリペプチドのマウス部分は、マウスＨ−２Ｅ β鎖の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含み、ここで、該マウスは、機能的なキメラＨＬＡ−ＤＲ４／Ｈ−２ＥＭＨＣＩＩ複合体を発現する。１つの実施形態において、キメラＨＬＡ−ＤＲ４／Ｈ−２ＥＭＨＣＩＩ複合体は、ＨＬＡ−ＤＲ４タンパク質（ＨＬＡ−ＤＲＡ α１およびα２ドメイン）に由来する細胞外ドメイン（例えば、α１およびα２ドメイン）およびマウスＨ−２Ｅ α鎖由来の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含むＭＨＣＩＩ α鎖、ならびにＨＬＡ−ＤＲ４（ＨＬＡ−ＤＲβ１^＊０４ β１およびβ２ドメイン）に由来する細胞外ドメイン（例えば、β１およびβ２ドメイン）およびマウスＨ−２Ｅ β鎖由来の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含むＭＨＣＩＩ β鎖を含む。１つの態様において、マウスは、それらの内在性マウス遺伝子座から、機能的な内在性Ｈ−２ＡおよびＨ−２Ｅポリペプチドを発現しない（例えば、マウスは、Ｈ−２Ａｂ１、Ｈ−２Ａａ、Ｈ−２Ｅｂ１、Ｈ−２Ｅｂ２、およびＨ−２Ｅａポリペプチドを発現しない）。種々の実施形態において、第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列の発現は、それぞれの内在性マウスプロモーターおよび調節エレメントの制御下にある。本発明の種々の実施形態において、上記第１のヌクレオチド配列および上記第２のヌクレオチド配列は、同じ染色体上に位置する。いくつかの態様において、マウスは、上記第１のヌクレオチド配列および上記第２のヌクレオチド配列を含む２コピーのキメラＭＨＣＩＩ遺伝子座を含み、一方他の態様において、マウスは、該第１のヌクレオチド配列および該第２のヌクレオチド配列を含む１コピーのＭＨＣＩＩ遺伝子座を含む。従って、マウスは、上記第１のヌクレオチド配列および上記第２のヌクレオチド配列を含むキメラＭＨＣＩＩ遺伝子座についてホモ接合型であっても、またはヘテロ接合型であってもよい。種々の実施形態において、上記第１のヌクレオチド配列および上記第２のヌクレオチド配列は、マウスの生殖細胞系に含まれる。

本明細書で記載されるいくつかの実施形態において、内在性マウスＭＨＣＩＩ遺伝子座において、例えば、内在性マウスＨ−２ＡおよびＨ−２Ｅ遺伝子の置き換えを介して、キメラＭＨＣＩＩ遺伝子座を含むマウスが提供される。いくつかの態様において、キメラ遺伝子座は、ヒトＨＬＡ−ＤＲＡの細胞外ドメインおよびマウスＨ−２Ｅ α鎖の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメイン、ならびにヒトＨＬＡ−ＤＲβ１^＊０４の細胞外ドメインおよびマウスＨ−２Ｅ β鎖の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む。キメラ遺伝子座の種々のドメインは、該遺伝子座が機能的なヒト／マウスキメラＭＨＣＩＩ複合体を発現するような様式で連結する。

種々の実施形態では、本明細書中で記載されるようにキメラＭＨＣＩＩ遺伝子座から機能的なキメラＭＨＣＩＩタンパク質を発現する非ヒト動物（例えば、げっ歯動物、例えば、マウスまたはラット）は、細胞表面にキメラタンパク質を表す。１つの実施形態では、非ヒト動物は、ヒトにおいて観察されるのと同様に、細胞分布において、細胞表面にキメラＭＨＣＩＩタンパク質を発現する。１つの態様では、上記細胞は、キメラＭＨＣＩＩタンパク質の細胞外部分（例えば、ヒトＨＬＡ−ＤＲ４細胞外部分）に結合したペプチド断片（抗原断片）を表面に表す。

種々の実施形態において、キメラＭＨＣＩＩタンパク質、例えば、ＨＬＡ−ＤＲ４／Ｈ−２Ｅタンパク質を表面に表す細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、例えば、マクロファージ、樹状細胞、またはＢ細胞である。いくつかの実施形態では、該キメラタンパク質によって提示されるペプチド断片は、腫瘍に由来する。他の実施形態では、キメラＭＨＣＩＩタンパク質によって提示されるペプチド断片は、病原体、例えば、細菌、ウイルスまたは寄生生物に由来する。

本明細書中で記載されるキメラＭＨＣＩＩタンパク質は、同じ細胞または第２の細胞の表面上の他のタンパク質と相互作用し得る。いくつかの実施形態では、キメラＭＨＣＩＩタンパク質は、上記細胞の表面上の内在性非ヒトタンパク質と相互作用する。キメラＭＨＣＩＩタンパク質もまた、同じ細胞または第２の細胞の表面上のヒトまたはヒト化タンパク質と相互作用し得る。いくつかの実施形態において、第２の細胞は、Ｔ細胞であり、キメラＭＨＣＩＩタンパク質は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）およびその共受容体ＣＤ４と相互作用する。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、内在性マウスＴ細胞である。他の実施形態において、Ｔ細胞は、ヒトＴ細胞である。いくつかの実施形態において、ＴＣＲは、ヒトもしくはヒト化ＴＣＲである。さらなる実施形態において、ＣＤ４は、ヒトもしくはヒト化ＣＤ４である。他の実施形態において、ＴＣＲおよびＣＤ４のいずれか１つもしくは両方は、非ヒト、例えば、マウスもしくはラットである。

１つの実施形態において、本明細書で記載されるとおり、キメラＭＨＣＩＩ遺伝子を欠く野生型動物よりも高い割合で、腫瘍を発症しない遺伝子改変された非ヒト動物が提供される。いくつかの実施形態において、上記動物は、野生型動物よりも高い割合で、血液系悪性腫瘍、例えば、種々のＴおよびＢ細胞リンパ腫、白血病、複合リンパ腫（例えば、ホジキンリンパ腫）を発症しない。

遺伝子操作された非ヒト動物に加え、非ヒト胚（例えば、げっ歯動物、例えば、マウスまたはラットの胚）であって、本明細書中で記載されるように非ヒト動物（例えば、げっ歯動物、例えば、マウスまたはラット）由来のドナーＥＳ細胞を含む胚もまた提供される。１つの態様では、胚は、キメラＭＨＣＩＩ遺伝子を含むＥＳドナー細胞、および宿主胚細胞を含む。

また、組織であって、本明細書中で記載されるように非ヒト動物（例えば、げっ歯動物、例えば、マウスまたはラット）に由来し、キメラＭＨＣＩＩタンパク質（例えば、ＨＬＡ−ＤＲ４／Ｈ−２Ｅタンパク質）を発現する組織もまた提供される。

さらに、本明細書中で記載されるように非ヒト動物から単離された非ヒト細胞が提供される。１つの実施形態では、上記細胞はＥＳ細胞である。１つの実施形態では、上記細胞は、抗原提示細胞、例えば、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞である。１つの実施形態では、上記細胞は免疫細胞である。１つの実施形態では、免疫細胞はリンパ球である。

また、本明細書中で記載されるように非ヒト動物の染色体またはその断片を含む非ヒト細胞も提供される。１つの実施形態では、非ヒト細胞は、本明細書中で記載されるように非ヒト動物の核を含む。１つの実施形態では、非ヒト細胞は、核移入の結果として、染色体またはその断片を含む。

１つの態様では、本明細書中で記載されるようにキメラＭＨＣＩＩタンパク質（例えば、ＨＬＡ−ＤＲ４／Ｈ−２Ｅタンパク質）をコードする遺伝子を含む非ヒト人工多能性細胞が提供される。１つの実施形態では、人工多能性細胞は、本明細書中で記載されるように非ヒト動物に由来する。

１つの態様では、本明細書中で記載されるように非ヒト動物の細胞に由来するハイブリドーマまたはクアドローマが提供される。１つの実施形態では、非ヒト動物は、マウスまたはラットである。

１つの態様において、ヒト／げっ歯動物キメラＭＨＣＩＩ／ペプチド複合体を形成するための結合ペプチドを含むヒト／げっ歯動物キメラＭＨＣＩＩ表面タンパク質を持つ第１の細胞、ならびにヒト／げっ歯動物キメラＭＨＣＩＩ／ペプチド複合体に結合する第２の細胞を含むｉｎｖｉｔｒｏ調製物が提供される。１つの実施形態において、第２の細胞は、ヒトもしくはヒト化Ｔ細胞受容体を含み、そして１つの実施形態において、ヒトもしくはヒト化ＣＤ４をさらに含む。１つの実施形態において、第２の細胞は、ヒトもしくはヒト化Ｔ細胞受容体およびヒトもしくはヒト化ＣＤ４タンパク質を含むげっ歯動物（例えば、マウスもしくはラット）細胞である。１つの実施形態において、第２の細胞は、ヒト細胞である。

本明細書中で記載される遺伝子操作された非ヒト動物（例えば、遺伝子操作されたげっ歯動物、例えば、マウスまたはラット）を作製するための方法もまた提供される。遺伝子操作された非ヒト動物を作製するための方法は、そのゲノムがキメラＭＨＣＩＩタンパク質（例えば、キメラＭＨＣＩＩのαポリペプチドおよびβポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列を含む動物を生じる。１つの実施形態では、上記方法は、そのゲノムが、内在性ＭＨＣＩＩ遺伝子座において、キメラヒト／マウスＭＨＣＩＩタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、遺伝子操作されたマウスを生じ、ここで、該キメラＭＨＣＩＩタンパク質のヒト部分は、ヒトＨＬＡ−ＤＲ４の細胞外ドメインを含み、マウス部分は、マウスＨ−２Ｅの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む。いくつかの実施形態では、上記方法は、実施例において記載される通り、ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）技術を用いて作製された構築物の標的化を利用して該構築物をＥＳ細胞へと導入する工程、および、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を用いて標的化したＥＳ細胞クローンをマウス胚へと導入する工程を含む。１つの実施形態では、ＥＳ細胞は、１２９マウス系統とＣ５７ＢＬ／６マウス系統との混血である；１つの実施形態では、ＥＳ細胞は、ＢＡＬＢ／ｃマウス系統と１２９マウス系統との混血である。

本明細書中で記載される遺伝子操作された非ヒト動物を作製するために使用されるヌクレオチド構築物も提供される。１つの態様では、上記ヌクレオチド構築物は以下を含む：５’および３’の非ヒトホモロジーアーム、ヒトＨＬＡ−ＤＲのα鎖およびβ鎖の配列を含むＤＮＡ断片、および組換え部位が隣接する（ｆｌａｎｋｅｄ）選択カセット。１つの実施形態では、ヒトＨＬＡ−ＤＲのα鎖およびβ鎖の配列は、ヒトＨＬＡ−ＤＲのα鎖およびβ鎖の遺伝子のイントロンおよびエクソンの両方を含むゲノム配列である。１つの実施形態では、非ヒトホモロジーアームは、非ヒトＭＨＣクラスＩＩゲノム配列に対して相同である。

１つの実施形態において、ヒトＨＬＡ−ＤＲα鎖配列は、α１およびα２ドメインコード配列を含む。特定の実施形態において、これは、５’から３’へ：α１エクソン（エクソン２）、α１／α２イントロン（イントロン２）、およびα２エクソン（エクソン３）を含む。１つの実施形態において、ヒトＨＬＡ−ＤＲ β鎖配列は、β１およびβ２ドメインコード配列を含む。特定の実施形態において、これは、５’から３’へ：β１エクソン（エクソン２）、β１／β２イントロン（イントロン２）、およびβ２エクソン（エクソン３）を含む。

選択カセットは、対象の構築物を組み込んだ細胞（例えば、ＥＳ細胞）の選択を容易にするため、標的化構築物へと挿入されたヌクレオチド配列である。いくつかの好適な選択カセットが、当該分野で公知である。通常、選択カセットは、特定の抗生物質（例えば、Ｎｅｏ、Ｈｙｇ、Ｐｕｒ、ＣＭ、ＳＰＥＣ、など）の存在下でのポジティブ選択を可能にする。さらに、選択カセットは、組換え部位が隣接していてもよく、それにより、リコンビナーゼ酵素による処理の際に選択カセットの切除を可能にする。一般に使用される組換え部位は、Ｃｒｅ酵素およびＦｌｐ酵素によってそれぞれ認識されるｌｏｘＰおよびＦｒｔであるが、他のものは当該分野で公知である。選択カセットは、コード領域の外側で構築物の任意の場所に位置し得る。１つの実施形態において、選択カセットは、β鎖イントロン、例えば、β２／膜貫通ドメインイントロン（イントロン３）に位置する。

１つの実施形態において、５’および３’ホモロジーアームは、内在性非ヒトＭＨＣＩＩ遺伝子座の５’および３’位置にゲノム配列を含む。１つの実施形態において、５’ホモロジーアームは、マウスＨ−２Ａｂ１遺伝子の上流のゲノム配列を含み、３’ホモロジーアームは、マウスＨ−２Ｅａ遺伝子の下流のゲノム配列を含む。この実施形態において、構築物は、マウスＨ−２ＥおよびＨ−２Ａ遺伝子の両方の置き換えを可能にする。

従って、１つの態様において、５’から３’へ：マウスＨ−２Ａｂ１遺伝子の上流のマウスゲノム配列を含む５’ホモロジーアーム、ヒト／マウスキメラＭＨＣＩＩ β鎖をコードする配列を含む第１のヌクレオチド配列、ヒト／マウスキメラＭＨＣＩＩ α鎖をコードする配列を含む第２のヌクレオチド配列、およびマウスＨ−２Ｅａ遺伝子の下流のマウスゲノム配列を含む３’ホモロジーアームを含むヌクレオチド構築物が提供される。特定の実施形態において、ヒト／マウスキメラＭＨＣＩＩ β鎖をコードする配列を含む第１のヌクレオチド配列は、ヒトβ１エクソン、β１／β２イントロン、β２エクソン、ヒトβ２エクソン配列とマウス膜貫通ドメインエクソンの配列との間のイントロン領域に挿入された組換え部位に隣接した選択カセットを含む。特定の実施形態において、ヒト／マウスキメラＭＨＣＩＩ α鎖をコードする配列を含む第２のヌクレオチド配列は、ヒトα１エクソン、α１／α２イントロン、およびヒトα２エクソンを含む。本発明の例示的な構築物は、図５に図示される（ＭＡＩＤ１６８０）。

遺伝子ターゲティングの完了の際、ＥＳ細胞または遺伝子改変された非ヒト動物をスクリーニングして、対象の外来性ヌクレオチド配列の成功裏の組み込みまたは外来性ポリペプチドの発現を確認する。多くの技術が当業者に公知であり、それらとしては、サザンブロッティング、長ＰＣＲ、定量的ＰＣＴ（例えば、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）を用いたリアルタイムＰＣＲ）、蛍光ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ノーザンブロッティング、フローサイトメトリー、ウェスタン分析、免疫細胞化学、免疫組織化学などが挙げられる（しかし、これらに限定されない）。１つの例では、対象の遺伝子改変を有する非ヒト動物（例えば、マウス）が、マウス対立遺伝子の欠失および／またはヒト対立遺伝子の獲得についての、対立遺伝子アッセイ（Valenzuelaら（２００３年）High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech.２１巻（６号）：６５２〜６５９頁に記載される）の変形を用いるスクリーニングによって、同定され得る。遺伝子改変された動物において特定のヌクレオチドまたはアミノ酸配列を同定する他のアッセイは、当業者に公知である。

本開示はまた、非ヒト動物のＭＨＣＩＩ遺伝子座を、本明細書で記載されるヒト／非ヒトキメラＭＨＣＩＩ複合体を発現するように改変する方法も提供する。１つの実施形態において、本発明は、マウスのＭＨＣＩＩ遺伝子座を、ヒト／マウスキメラＭＨＣＩＩ複合体を発現するように改変する方法であって、内在性マウスＭＨＣＩＩ遺伝子座において、マウスＭＨＣＩＩ複合体をコードするヌクレオチド配列を、ヒト／マウスキメラＭＨＣＩＩ複合体をコードするヌクレオチド配列で置き換える工程を含む方法を提供する。特定の態様において、ヒト／マウスキメラＭＨＣＩＩ複合体をコードするヌクレオチド配列は、ヒトＭＨＣＩＩ α鎖（例えば、ＨＬＡ−ＤＲ４ α鎖）の細胞外ドメインならびにマウスＭＨＣＩＩ α鎖（例えば、Ｈ−２Ｅ α鎖）の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインをコードする第１のヌクレオチド配列と、ヒトＭＨＣＩＩ β鎖（例えば、ＨＬＡ−ＤＲ４ β鎖）の細胞外ドメインならびにマウスＭＨＣＩＩ β鎖（例えば、Ｈ−２Ｅ β鎖、例えば、Ｈ−２Ｅｂ１鎖）の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインをコードする第２のヌクレオチド配列とを含む。いくつかの実施形態において、改変されたマウスＭＨＣＩＩ遺伝子座は、キメラＨＬＡ−ＤＲ４／Ｈ−２Ｅタンパク質を発現する。

１つの態様において、キメラヒトＨＬＡクラスＩＩ／非ヒトＭＨＣクラスＩＩ分子を作製するための方法であって、単一の細胞内で、本明細書で記載されるヌクレオチド構築物からキメラＨＬＡ−ＤＲ４／Ｈ−２Ｅタンパク質を発現する工程を含む方法が提供される。１つの実施形態において、ヌクレオチド構築物はウイルスベクターである；特定の実施形態において、ウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。１つの実施形態において、細胞は、ＣＨＯ、ＣＯＳ、２９３、ＨｅＬａ、およびウイルス核酸配列を発現する網膜細胞（例えば、ＰＥＲＣ．６（商標）細胞）から選択される。

１つの態様において、キメラＨＬＡ−ＤＲ４／Ｈ−２Ｅタンパク質を発現する細胞が提供される。１つの実施形態において、細胞は、本明細書で記載されるキメラＭＨＣクラスＩＩ配列を含む発現ベクターを含む。１つの実施形態において、細胞は、ＣＨＯ、ＣＯＳ、２９３、ＨｅＬａ、およびウイルス核酸配列を発現する網膜細胞（例えば、ＰＥＲＣ．６（商標）細胞）から選択される。

本明細書で記載される非ヒト動物によって作製されるキメラＭＨＣクラスＩＩ分子もまた提供され、ここで、該キメラＭＨＣクラスＩＩ分子は、ヒトＭＨＣＩＩタンパク質、例えば、ＨＬＡ−ＤＲ４タンパク質由来のα１、α２、β１、およびβ２ドメイン、ならびに非ヒトＭＨＣＩＩタンパク質、例えば、マウスＨ−２Ｅタンパク質由来の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む。本明細書で記載されるＨＬＡ−ＤＲ４の細胞外ドメインを含むキメラＭＨＣＩＩ複合体は、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体によって検出され得る。従って、ヒト／非ヒトキメラＭＨＣＩＩポリペプチドを表面に表す細胞は、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体を用いて検出され得、かつ／または選択され得る。

以下の実施例は、遺伝子操作された動物であって、該動物のゲノムがヒト／マウスキメラＨＬＡ−ＤＲ４／Ｈ−２Ｅタンパク質をコードするヌクレオチド配列によるマウスＨ−２ＡおよびＨ−２Ｅタンパク質をコードするヌクレオチド配列の置き換えを含む、遺伝子操作された動物を記載するが、当業者は、類似の戦略が、他のヒトＭＨＣＩＩ遺伝子（ＨＬＡ−ＤＰおよびＨＬＡ−ＤＱ）を含むキメラを導入するために使用され得ることを、理解するであろう。従って、本発明のさらなる実施形態は、遺伝子操作された動物であって、該動物のゲノムがキメラＨＬＡ−ＤＱ／Ｈ−２Ａタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、遺伝子操作された動物を指向する。１つの実施形態において、ヌクレオチド配列は、キメラＨＬＡ−ＤＱ２．５／Ｈ−２Ａタンパク質をコードする。別の実施形態において、ヌクレオチド配列は、キメラＨＬＡ−ＤＱ８／Ｈ−２Ａタンパク質をコードする。さらに、複数のヒト化ＭＨＣＩＩ分子（例えば、キメラＨＬＡ−ＤＲ／Ｈ−２ＥおよびＨＬＡ−ＤＱ／Ｈ−２Ａ）の導入もまた企図される。

遺伝子改変された動物の使用
種々の実施形態では、本明細書中で記載される遺伝子改変された非ヒト動物は、その細胞表面にヒトまたはヒト化ＭＨＣＩＩを有するＡＰＣを作製し、結果として、サイトゾルタンパク質に由来するペプチドを、Ｔ細胞に対するエピトープとしてヒト様の様式で提示する（何故なら、その複合体の構成要素の実質的に全てが、ヒトまたはヒト化であるからである）。本発明の遺伝子改変された非ヒト動物は、ヒト化動物においてヒト免疫系の機能を研究するため；免疫応答を惹起する抗原および抗原エピトープ（例えば、Ｔ細胞エピトープ、例えば、独特なヒトがんエピトープ）を同定するため、例えば、ワクチン開発に使用するため；ワクチン候補の評価および他のワクチン戦略のため；ヒト自己免疫を研究するため；ヒト感染症を研究するため；および別の方法で、ヒトＭＨＣ発現に基づくより良い治療戦略を案出するために、使用され得る。

ＭＨＣＩＩ複合体は、細胞外タンパク質（例えば、細胞外細菌、隣接細胞またはＢ細胞受容体によって結合されてＢ細胞内に内部移行されるポリペプチド）に由来するペプチドに結合する。一旦細胞外タンパク質が細胞内経路に入ると、それらは分解されてペプチドとなり、ペプチドはＭＨＣＩＩによって結合され、提示される。ＭＨＣＩＩによって提示されるペプチドがＣＤ４＋Ｔ細胞によって一旦認識されると、Ｔ細胞が活性化され、増殖し、分化して種々のＴヘルパーサブタイプ（例えば、Ｔ_Ｈ１、Ｔ_Ｈ２）となり、マクロファージ媒介性の病原体死滅の活性化、Ｂ細胞増殖および抗体産生を含む多数の事象がもたらされる。免疫応答におけるＭＨＣＩＩの役割ゆえに、ＭＨＣＩＩペプチド提示の理解は、ヒト病変に対する処置の開発において重要である。しかし、ヒトおよびマウスのＭＨＣ複合体は、抗原を異なって認識する（例えば、マウスＭＨＣＩＩは、ヒトＭＨＣＩＩと同じ抗原を認識しない場合があるか、または、ヒトＭＨＣＩＩとは異なるエピトープを提示し得る）ので、マウスＭＨＣＩＩとの関連で、抗原の提示は、ヒト疾患にいくぶん関係があるだけである。従って、ヒト病変について最も関係するデータは、ヒトＭＨＣＩＩによる抗原エピトープの提示の研究を通して得られる。

従って、種々の実施形態では、本発明の遺伝子操作された動物は、ヒトにおいて免疫応答を開始する抗原の能力を評価するため、および、多様な抗原を生成し、ヒトワクチン開発において使用され得る特定の抗原を同定するために、とりわけ有用である。

１つの態様では、ペプチド配列のヒトにおける抗原性を決定するための方法であって、本明細書中で記載されるように遺伝子改変された非ヒト動物を、該ペプチド配列を含む分子に曝露する工程、該非ヒト動物に免疫応答を惹起させる工程、および、該非ヒト動物において、本明細書中で記載されるヒト化ＭＨＣＩＩ複合体によって提示されるペプチドの配列に結合する細胞を検出する工程を含む方法が提供される。

１つの態様では、ペプチドが、ヒトにおいて免疫応答を引き起こすかどうかを決定するための方法であって、本明細書中で記載されるように遺伝子改変された非ヒト動物を該ペプチドに曝露する工程、該非ヒト動物に免疫応答を惹起させる工程、および、該非ヒト動物において、本明細書中で記載されるようにキメラヒト／非ヒトＭＨＣクラスＩＩ分子によって該ペプチドの配列に結合する細胞を検出する工程を含む方法が提供される。１つの実施形態では、曝露後の上記非ヒト動物は、上記ペプチドに結合する、ＭＨＣクラスＩＩ拘束ＣＤ４＋Ｔ細胞を含む。

１つの態様では、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを同定するための方法であって、本明細書中で記載されるように非ヒト動物を、推定Ｔ細胞エピトープを含む抗原に曝露する工程、該非ヒト動物に免疫応答を惹起させる工程、および、該ＭＨＣクラスＩＩ拘束ＣＤ４＋Ｔ細胞によって結合された該エピトープを同定する工程を含む方法が提供される。

１つの態様では、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答をヒトにおいて起こす抗原を同定するための方法であって、本明細書中で記載されるように、マウスに対して推定抗原を曝露する工程、該マウスに免疫応答を起こさせる工程、ヒトＭＨＣＩＩ分子（例えば、ＨＬＡ−ＤＲ分子）との関連で該抗原に特異的であるＣＤ４＋Ｔ細胞応答を検出する工程、および、ヒトＭＨＣＩＩ拘束分子（例えば、ヒトＨＬＡ−ＤＲ拘束分子）により結合した抗原を同定する工程を含む方法が提供される。

１つの実施形態では、抗原は、細菌タンパク質を含む。１つの実施形態では、抗原は、ヒト腫瘍細胞抗原を含む。１つの実施形態では、抗原は、ヒトにおける使用のための推定ワクチン、または別の生物医薬（biopharmaceutical）を含む。１つの実施形態では、抗原は、ヒトにおいて抗体を生み出すヒトエピトープを含む。なお別の実施形態では、抗原は、酵母または真菌細胞の抗原を含む。なお別の実施形態では、抗原は、ヒト寄生生物に由来する。

１つの態様では、推定抗原が、ヒト免疫系に対する曝露の際に、ＨＬＡ−ＤＲ拘束免疫応答（例えば、ＨＬＡ−ＤＲ４拘束応答）を起こすエピトープを含有するかどうかを決定するための方法であって、本明細書中で記載されるように、マウスを推定抗原に曝露する工程、および、該マウスにおける抗原特異的ＨＬＡ−ＤＲ拘束（例えば、ＨＬＡ−ＤＲ４拘束）免疫応答を測定する工程を含む方法が提供される。別の態様において、ヒト免疫系への曝露によりＨＬＡ−ＤＱ制限応答を起こすエピトープを含む推定抗原を決定するための方法が提供される。

ヒトＭＨＣＩＩ複合体に関連して提示される抗原、例えば、細菌、寄生生物などに由来する抗原に対する抗体を生成する方法であって、本明細書で記載されるマウスを抗原に曝露する工程、抗体産生を含む免疫応答をマウスに開始させる工程、および、ヒトＭＨＣＩＩ複合体に関連して提示された抗原を認識する抗体を単離する工程を含む方法もまた提供される。１つの実施形態において、ペプチド−ＭＨＣＩＩに対する抗体を生成するため、ＭＨＣＩＩヒト化マウスは、ペプチド−ＭＨＣＩＩ免疫原によって免疫される。

１つの態様において、ＭＨＣＩＩに関連して提示される抗原（例えば、ヒト腫瘍抗原、ワクチンなど）を認識するＴ細胞受容体可変ドメインを同定するための方法であって、本明細書で記載されるヒト化ＭＨＣＩＩ複合体を含むマウスを該抗原に対して曝露する工程、該マウスに免疫応答を起こさせる工程、およびＭＨＣＩＩ拘束抗原に結合するＴ細胞受容体可変ドメインをコードする核酸配列を該マウスから単離する工程を含む方法が提供される。１つの実施形態において、抗原は、ヒト化ＭＨＣＩＩ（例えば、ヒトＨＬＡＩＩエクトドメイン／マウスＭＨＣＩＩ膜貫通ドメインおよび／または細胞質ドメイン）に関連して提示される。

Ｔ細胞とＭＨＣＩＩに関連するペプチド（例えば、ヒトＨＬＡＩＩエクトドメイン／マウスＨＬＡＩＩ膜貫通ドメインおよび／または細胞質ドメイン）を表面に表すＡＰＣとの間の相互作用の結果は、当該分野で公知のいくつかの技術、例えば、Ｔ細胞増殖アッセイ、サイトカイン放出アッセイなどによって測定され得る。

抗原およびそれらのＴ細胞エピトープを病原体または新生物から同定する能力に加えて、本発明の遺伝子改変された動物は、ヒト自己免疫疾患に関連する自己抗原を同定するため、および別の方法でヒト自己免疫疾患進行を研究するために使用され得る。ＨＬＡ遺伝子座における多形がヒト自己免疫疾患に対する素因において役割を果たすことは公知である。実際に、ＨＬＡ−ＤＲおよびＨＬＡ−ＤＱ遺伝子座における特定の多形が、関節リウマチ、Ｉ型糖尿病、橋本甲状腺炎、多発性硬化症、重症筋無力症、グレーヴス病、全身性エリテマトーデス、セリアック病、クローン病、潰瘍性大腸炎および他の自己免疫障害の発症に関連することが同定されている。例えば、WongおよびWen（２００４年）What can the HLA transgenic mouse tell us about autoimmune diabetes?、Diabetologia ４７巻：１４７６〜８７頁；TanejaおよびDavid（１９９８年）HLA Transgenic Mice as Humanized Mouse Models of Disease and Immunity、J. Clin. Invest. １０１巻：９２１〜２６頁；Bakkerら（２００６年）、上掲；およびInternational MHC and Autoimmunity Genetics Network（２００９年）Mapping of multiple susceptibility variants within the MHC region for 7 immune-mediated diseases、Proc. Natl. Acad. Sci. USA １０６巻：１８６８０〜８５頁を参照されたい。

従って、本明細書で記載されるヒト化ＭＨＣＩＩ複合体動物を作製する方法が、特定のヒト自己免疫疾患に関連すると考えられるＭＨＣＩＩ分子を導入するために使用され得、そしてヒト自己免疫疾患の進行が、研究され得る。さらに、本明細書で記載される非ヒト動物は、ヒト自己免疫疾患の動物モデルを開発するために使用され得る。本明細書で記載されるヒト化ＭＨＣＩＩタンパク質を担持する、本発明によるマウスは、潜在的自己抗原を同定するため、疾患進行に関与するエピトープをマッピングするため、および自己免疫疾患調整のための戦略を設計するために使用され得る。

加えて、本明細書で記載される遺伝子改変された動物は、ヒトアレルギー応答の研究においても使用され得る。アレルギー応答は、ＭＨＣＩＩ対立遺伝子に関連するとみられるので、本明細書で記載される遺伝子改変された動物は、アレルゲン特異的Ｔ細胞応答のＨＬＡ拘束を決定するため、およびアレルギー応答を殲滅するための戦略を開発するために、使用され得る。

本発明は、以下の非限定の実施例によって、さらに例証される。これらの実施例は、本発明の理解を助けるために示されるが、本発明の範囲を制限することを何ら企図せず、また何らそのように解釈されるべきではない。本実施例は、当業者に周知の慣用的方法（分子クローニング技術など）の詳細な記載を含まない。そうでないと示されない限り、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度はセ氏（Ｃｅｌｓｉｕｓ）で示され、圧力は大気圧付近である。

（実施例１）
内在性ＭＨＣクラスＩＩＨ−２ＡおよびＨ−２Ｅ遺伝子座の欠失
内在性ＭＨＣクラスＩＩＨ−２Ａｂ１、Ｈ−２Ａａ、Ｈ−２Ｅｂ１、Ｈ−２Ｅｂ２、およびＨ−２Ｅａ遺伝子の欠失を導入するためのターゲッティングベクターを、ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）遺伝子操作技術を用いて作製した（例えば、米国特許第６，５８６，２５１号およびValenzuelaら、上掲を参照されたい）。細菌人工染色体（ＢＡＣ）ＲＰ２３−４５８ｉ２２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ＤＮＡを、内在性ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子Ｈ−２Ａｂ１、Ｈ−２Ａａ、Ｈ−２Ｅｂ１、Ｈ−２Ｅｂ２、およびＨ−２Ｅａを欠失させるために改変した。

簡潔には、ホモロジーアームの上流および下流は、マウスＢＡＣＤＮＡのＰＣＲによって、それぞれ５’位置のＨ−２Ａｂ１遺伝子および３’位置のＨ−２Ｅａ遺伝子から誘導した。図５に図示する通り、これらのホモロジーアームを使用し、ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子座の遺伝子Ｈ−２Ａｂ１、Ｈ−２Ａａ、Ｈ−２Ｅｂ１、Ｈ−２Ｅｂ２、およびＨ−２Ｅａを含む約７９ｋｂのＲＰ２３−４５８ｉ２２を欠失したカセットを、細菌性相同組換え（ＢＨＲ）によって作製した。この領域を、ｌｏｘ６６部位とｌｏｘ７１部位に隣接したハイグロマイシンカセットで置き換えた。最終ターゲッティングベクターは、５’から３’へ、マウスゲノム配列５’から内在性ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子座のＨ−２Ａｂ１遺伝子までを含む３４ｋｂホモロジーアーム、５’ｌｏｘ６６部位、ハイグロマイシンカセット、３’ｌｏｘ７１部位、ならびにマウスゲノム配列３’から内在性ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子座のＨ−２Ｅａ遺伝子までを含む６３ｋｂホモロジーアーム（ＭＡＩＤ５１１１、図５を参照されたい）を含んだ。

ＢＡＣＤＮＡターゲッティングベクター（上記）を使用し、マウスＥＳ細胞を電気穿孔して、内在性ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子座の欠失を含む改変ＥＳ細胞を創製した。欠失内在性ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子座を含む陽性ＥＳ細胞を、ＴＡＱＭＡＮ（商標）プローブを用いた定量的ＰＣＲアッセイによって同定した（LieおよびPetropoulos（１９９８年）Curr. Opin. Biotechnology ９巻：４３〜４８頁）。欠失遺伝子座の上流領域を、プライマー５１１１ＵＦ（ＣＡＧＡＡＣＧＣＣＡＧＧＣＴＧＴＡＡＣ；配列番号１）および５１１１ＵＲ（ＧＧＡＧＡＧＣＡＧＧＧＴＣＡＧＴＣＡＡＣ；配列番号２）およびプローブ５１１１ＵＰ（ＣＡＣＣＧＣＣＡＣＴＣＡＣＡＧＣＴＣＣＴＴＡＣＡ；配列番号３）を用いたＰＣＲによって確認し、他方で、欠失遺伝子座の下流領域を、プライマー５１１１ＤＦ（ＧＴＧＧＧＣＡＣＣＡＴＣＴＴＣＡＴＣＡＴＴＣ；配列番号４）および５１１１ＤＲ（ＣＴＴＣＣＴＴＴＣＣＡＧＧＧＴＧＴＧＡＣＴＣ；配列番号５）およびプローブ５１１１ＤＰ（ＡＧＧＣＣＴＧＣＧＡＴＣＡＧＧＴＧＧＣＡＣＣＴ；配列番号６）を用いて確認した。ターゲッティングベクター由来のハイグロマイシンカセットの存在を、プライマーＨＹＧＦ（ＴＧＣＧＧＣＣＧＡＴＣＴＴＡＧＣＣ；配列番号７）およびＨＹＧＲ（ＴＴＧＡＣＣＧＡＴＴＣＣＴＴＧＣＧＧ；配列番号８）およびプローブＨＹＧＰ（ＡＣＧＡＧＣＧＧＧＴＴＣＧＧＣＣＣＡＴＴＣ；配列番号９）を用いて確認した。上流欠失点にわたるヌクレオチド配列（配列番号１０）は、以下に含まれ、これは、欠失点に存在するカセット配列に近接して連結する、該欠失点の上流の内在性マウス配列（下の括弧内に含まれる）を示す：（ＴＴＴＧＴＡＡＡＣＡＡＡＧＴＣＴＡＣＣＣＡＧＡＧＡＣＡＧＡＴＧＡＣＡＧＡＣＴＴＣＡＧＣＴＣＣＡＡＴＧＣＴＧＡＴＴＧＧＴＴＣＣＴＣＡＣＴＴＧＧＧＡＣＣＡＡＣＣＣＴ）ＣＴＣＧＡＧＴＡＣＣＧＴＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＡＴＧＣＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴＡＴＧＣＡＴＣＣＧＧＧＴＡＧＧＧＧＡＧＧ。下流欠失点にわたるヌクレオチド配列は（配列番号１１）、以下に含まれ、これは、欠失点の下流の内在性マウス配列と近接するカセット配列を示す（下の括弧内に含まれる）：ＣＣＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＣＣＣＴＡＧＧＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＡＴＧＣＴＡＴＡＣＧＡＡＣＧＧＴＡＧＡＧＣＴＣ（ＣＡＣＡＧＧＣＡＴＴＴＧＧＧＴＧＧＧＣＡＧＧＧＡＴＧＧＡＣＧＧＴＧＡＣＴＧＧＧＡＣＡＡＴＣＧＧＧＡＴＧＧＡＡＧＡＧＣＡＴＡＧＡＡＴＧＧＧＡＧＴＴＡＧＧＧＡＡＧＡ）。次いで、陽性ＥＳ細胞クローンを使用して、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）方法（以下に記載する）を用いて雌マウスに移植し、内在性ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子座の欠失を含む同腹仔を誕生させた。

標的とした上記のＥＳ細胞を、ドナーＥＳ細胞として用い、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）方法によって、８細胞段階のマウス胚へと導入した（例えば、米国特許第７，２９４，７５４号およびPoueymirouら（２００７年）F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses Nature Biotech.２５巻（１号）：９１〜９９頁を参照されたい）。内在性ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子座においてＨ−２Ａｂ１、Ｈ−２Ａａ、Ｈ−２Ｅｂ１、Ｈ−２Ｅｂ２、およびＨ−２Ｅａ遺伝子の欠失を持つマウスを、対立遺伝子アッセイの改変を用いたゲノタイピング（Valenzuelaら、上掲）によって同定し、これは、ハイグロマイシンカセットの存在を検出して、内在性ＭＨＣクラスＩＩ配列の非存在を確認した。

内在性ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子座においてＨ−２Ａｂ１、Ｈ−２Ａａ、Ｈ−２Ｅｂ１、Ｈ−２Ｅｂ２、およびＨ−２Ｅａ遺伝子の欠失を持つマウスを、ターゲッティングベクター（除去されない）によって導入された任意のｌｏｘ処理されたハイグロマイシンカセットを除去するために、例えば、ＥＳ細胞段階でまたは胚において、Ｃｒｅデリーターマウス系統（例えば、国際特許出願公開第ＷＯ２００９／１１４４００号を参照されたい）に交配してもよい。必要に応じて、ハイグロマイシンカセットは、マウス内に保持される。

（実施例２）
ヒト化Ｈ−２Ｅｂ１およびＨ−２Ｅａ遺伝子を含む大型ターゲッティングベクター（ＬＴＶＥＣ）の生成
ヒト化ＭＨＣＩＩ配列を導入するためのターゲッティングベクターを、図４に図示するように設計した。ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）遺伝子操作技術を用い、細菌人工染色体（ＢＡＣ）ＲＰ２３−４５８ｉ２２ＤＮＡを、種々のステップにおいて改変して：（１）ＢＡＬＢ／ｃＨ−２Ｅａ遺伝子由来の機能的なＩ−Ｅ αエクソン１を含むベクターを創製し（図４Ａ）；（２）マウスＩ−Ｅ β遺伝子のエクソン２および３の、ヒトＤＲβ１^＊０４のエクソン２および３での置き換えならびにマウスＩ−Ｅ αのエクソン２および３の、ヒトＤＲα１^＊０１のエクソン２および３での置き換えを含むベクターを創製し（図４Ｂ）；（３）残りのマウスＩ−Ｅ βエクソンの中でヒトＤＲβ１^＊０４のエクソン２および３、ならびに残りのマウスＩ−Ｅ αエクソンの中でヒトＤＲα１^＊０１のエクソン２および３を担持し、ＢＡＬＢ／ｃマウス由来の機能的なＩ−Ｅ αエクソン１を含むベクターを創製し（ステップ（１）（図４Ｃ）；かつ（４）（３）で生成したベクターの潜在スプライス部位を除去した（図４Ｄ）。

具体的には、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおいて、Ｉ−Ｅ α遺伝子が非機能的なエクソン１の存在に起因する偽遺伝子であるので、第１に、ＢＡＬＢ／ｃＨ−２Ｅａ遺伝子由来の機能的なＩ−Ｅ αエクソン１を含むベクターを創製した（図４Ａ）。ＲＰ２３−４５８ｉ２２ＢＡＣを、細菌性相同組換え（１．ＢＨＲ）によって改変し、クロラムフェニコール抵抗性遺伝子を、スペクトロマイシンの抵抗性遺伝子で置き換えた。得られたベクターを、ＢＨＲによってさらに改変し、Ｉ−ＡおよびＩ−Ｅコード領域の全体を、組換え部位が隣接するネオマイシンカセットで置き換えた（２．ＢＨＲ）。ＢＡＬＢ／ｃＩ−Ｅ αリーダー（エクソン１）をコードするエクソンおよびＰＩ−ＳｃｅＩ制限部位とＩ−ＣｅｕＩ制限部位が隣接するクロラムフェニコール遺伝子を含む構築物によるＢＨＲの別の回（３．ＢＨＲ）は、機能的なＢＡＬＢ／ｃＨ−２Ｅａエクソン１を含むベクターを生じた。

独立して、マウスＩ−Ｅ β遺伝子のエクソン２および３の、ヒトＤＲβ１^＊０４のエクソン２および３での置き換えならびにマウスＩ−Ｅ αのエクソン２および３の、ヒトＤＲα１^＊０１のエクソン２および３での置き換えを含むベクターを生成するために、ＲＰ２３−４５８ｉ２２ＢＡＣを、いくつかの相同組換えステップ、４．ＢＨＲ〜８．ＢＨＲ（図４Ｂ）を介して改変した。得られた核酸配列を、ＰＩ−ＳｃｅＩ／Ｉ−ＣｅｕＩ制限部位によって隣接させ、上記のＢＡＬＢ／ｃＩ−Ｅαエクソン１を有する構築物へとライゲーションさせた（図４Ｃ）。

図４Ｃに図示される最終構築物の配列は、ＢＡＬＢ／ｃイントロンの３’末端において潜在スプライス部位を含んだ。いくつかのＢＨＲステップ（１１．ＢＨＲ〜１２．ＢＨＲ）およびその後の欠失ステップを実施し、最終ターゲッティングベクター（ＭＡＩＤ１６８０）を得、これを用いてＥＳ細胞に電気穿孔した（図４Ｄ）。

詳細には、最終ターゲッティングベクター（ＭＡＩＤ１６８０）は、５’から３’へ、内在性ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子座のＨ−２Ａｂ１遺伝子のすぐ上流で終わる約２６ｋｂのマウスゲノム配列から成る５’マウスホモロジーアーム；ヒト化ＭＨＣＩＩ β鎖遺伝子（ヒト化Ｈ−２Ｅｂ１遺伝子）およびヒト化ＭＨＣＩＩ α鎖遺伝子（ヒト化Ｈ−２Ｅａ遺伝子）およびｌｏｘＰが隣接した（ｆｌｏｘｅｄ）ネオマイシンカセットを含む約５９ｋｂの挿入物；ならびに内在性ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子座のＨ−２Ｅａ遺伝子のすぐ下流から始まる約５７ｋｂのマウスゲノム配列から成る３’マウスホモロジーアームから成った。５’アームと挿入物との間の接合部にわたるヌクレオチド配列（配列番号１２）は、以下を含んだ：（ＴＧＣＴＧＡＴＴＧＧＴＴＣＣＴＣＡＣＴＴＧＧＧＡＣＣＡＡＣＣＣ）ＴＡＡＧＣＴＴＴＡＴＣＴＡＴＧＴＣＧＧＧＴＧＣＧＧＡＧＡＡＡＧＡＧＧＴＡＡＴＧＡＡＡＴＧＧＣＡＣＡＡＧＧＡＧＡＴＣＡＣＡＣＡＣＣＣＡＡＡＣＣＡＡＡＣＴＣＧＣＣ、ここで、斜体で示された配列は、独自のＰＩ−ＳｃｅＩ部位であり、そして５’ホモロジーアームにおけるマウスゲノム配列は、括弧内である。挿入物と３’アームとの間の接合部にわたるヌクレオチド配列（配列番号１３）は、以下を含んだ：ＣＡＣＡＴＣＡＧＴＧＡＧＧＣＴＡＧＡＡＴＡＡＡＴＴＡＡＡＡＴＣＧＣＴＡＡＴＡＴＧＡＡＡＡＴＧＧＧＧ（ＡＴＴＴＧＴＡＣＣＴＣＴＧＡＧＴＧＴＧＡＡＧＧＣＴＧＧＧＡＡＧＡＣＴＧＣＴＴＴＣＡＡＧＧＧＡＣ）、ここで、３’ホモロジーアームにおけるマウスゲノム配列は、括弧内である。

約５９ｋｂ挿入物内で、Ｈ−２Ｅｂ１遺伝子を、以下のように改変した：イントロン１の最後の１５３ｂｐ、エクソン２、イントロン２、エクソン３、およびイントロン３の最初の１２２ｂｐを含む５１３６ｂｐのＨ−２Ｅｂ１の領域を、イントロン１の最後の１４８ｂｐ、エクソン２、イントロン２、エクソン３、およびイントロン３の最初の１３２ｂｐを含むヒトＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４の３１１１ｂｐの相同領域で置き換えた。イントロン３のヒト配列とマウス配列との間の接合部において、５’ ｌｏｘ２３７２部位、ＵｂＣプロモーター、ネオマイシン抵抗性遺伝子、および３’ｌｏｘ２３７２部位から成るカセットを挿入した。得られた遺伝子は、マウスＨ−２Ｅｂ１リーダー、ＤＲＢ１^＊０４由来のヒトβ１およびβ２ドメイン、およびマウス膜貫通ドメインおよび細胞質尾部から成るキメラＨＬＡ−ＤＲＢ１^＊０４／Ｈ−２Ｅｂ１タンパク質をコードした。イントロン１においてマウス／ヒト接合部にわたるヌクレオチド配列（配列番号１４）は、以下を含んだ：（ＴＣＣＡＴＣＡＣＴＴＣＡＣＴＧＧＧＴＡＧＣＡＣＡＧＣＴＧＴＡＡＣＴＧＴＣＣＡＧＣＣＴＧ）ＧＧＴＡＣＣＧＡＧＣＴＣＧＧＡＴＣＣＡＣＴＡＧＴＡＡＣＧＧＣＣＧＣＣＡＧＴＧＴＧＣＴＧＧＡＡＴＴＣＧＣＣＣＴＴＧＡＴＣＧＡＧＣＴＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＡＧＧＴＧＧＴＧＧＧＣＧＴＴＧＣＧＧＧＴＧＧＧＧＣＣＧＧＴＴＡＡ、ここで、斜体で示された配列は、クローニングステップの間に導入される多重クローニング部位であり、マウスイントロン１配列は、括弧内である。ヒトイントロン３とネオマイシンカセットとの間の接合部にわたるヌクレオチド配列（配列番号１５）は、以下を含んだ：（ＡＴＣＴＣＣＡＴＣＡＧＡＡＧＧＧＣＡＣＣＧＧＴ）ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＡＧＧＴＡＴＣＣＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴＡＴＧＣＡＴＧＧＣＣＴＣＣＧＣＧＣＣＧＧＧＴＴ、ここで、５’ｌｏｘ２３７２部位が斜体で示され、そしてヒトイントロン３配列は、括弧内である。ネオマイシンカセットとマウスイントロン３との間の接合部にわたるヌクレオチド配列（配列番号１６）は、以下を含んだ：ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＡＧＧＴＡＴＣＣＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴＣＴＣＧＡＧ（ＴＧＧＣＴＴＡＣＡＧＧＴＡＧＧＴＧＣＧＴＧＡＡＧＣＴＴＣＴＡＣＡＡＧＣＡＣＡＧＴＴＧＣＣＣＣＣＴＧＧ）、ここで、３’ｌｏｘ２３７２部位が斜体で示され、そしてマウスイントロン３配列は、括弧内である。

また、約５９ｋｂ挿入物内で、Ｈ−２Ｅａ遺伝子を、以下のように改変した：イントロン１の最後の１０１ｂｐ、エクソン２、イントロン２、エクソン３、およびイントロン３の最初の６６ｂｐを含むＨ−２Ｅａの１１８５ｂｐの領域を、イントロン１の最後の１０４ｂｐ、エクソン２、イントロン２、エクソン３、およびイントロン３の最初の６６ｂｐを含むヒトＨＬＡ−ＤＲＡ１^＊０１の１１８９ｂｐの相同領域で置き換えた。上記のように、Ｈ−２ＥａのＣ５７ＢＬ／６対立遺伝子のエクソン１は、この遺伝子を非機能的にする欠失を含むので、Ｈ−２Ｅａエクソン１およびイントロン１の残りを、機能的であるＨ−２ＥａのＢＡＬＢ／ｃ対立遺伝子由来の同等の２６１６ｂｐ領域で置き換えた。得られた遺伝子は、ＢＡＬＢ／ｃ由来のマウスＨ−２Ｅａリーダー、ＤＲＡ１^＊０１由来のヒトα１およびα２ドメイン、およびマウス膜貫通ドメインおよび細胞質尾部から成るキメラＨ−２Ｅａ／ＨＬＡ−ＤＲＡ１^＊０１タンパク質をコードした。イントロン１においてマウス／ヒト接合部にわたるヌクレオチド配列（配列番号１７）は、以下を含んだ：（ＣＴＧＴＴＴＣＴＴＣＣＣＴＡＡＣＴＣＣＣＡＴＴＣＴＡＴＧＣＴＣＴＴＣＣＡＴＣＣＣＧＡ）ＣＣＧＣＧＧＣＣＣＡＡＴＣＴＣＴＣＴＣＣＡＣＴＡＣＴＴＣＣＴＧＣＣＴＡＣＡＴＧＴＡＴＧＴＡＧＧＴ、ここで、斜体で示された配列は、クローニングステップの間に導入された制限酵素部位であり、ＢＡＬＢ／ｃイントロン１配列は，括弧内である。イントロン３におけるヒト／マウス接合部にわたるヌクレオチド配列（配列番号１８）は、以下を含んだ：ＣＡＡＧＧＴＴＴＣＣＴＣＣＴＡＴＧＡＴＧＣＴＴＧＴＧＴＧＡＡＡＣＴＣＧＧＧＧＣＣＧＧＣＣ（ＡＧＣＡＴＴＴＡＡＣＡＧＴＡＣＡＧＧＧＡＴＧＧＧＡＧＣＡＣＡＧＣＴＣＡＣ）、ここで、斜体で示された配列は、クローニングステップの間に導入された制限酵素部位であり、そしてマウスイントロン３配列は、括弧内である。エクソン１の５’のＣ５７ＢＬ／６−ＢＡＬＢ／ｃ接合部にわたるヌクレオチド配列（配列番号１９）は、以下を含んだ：（ＧＡＡＡＧＣＡＧＴＣＴＴＣＣＣＡＧＣＣＴＴＣＡＣＡＣＴＣＡＧＡＧＧＴＡＣＡＡＡＴ）ＣＣＣＣＡＴＴＴＴＣＡＴＡＴＴＡＧＣＧＡＴＴＴＴＡＡＴＴＴＡＴＴＣＴＡＧＣＣＴＣ、ここで、Ｃ５７ＢＬ／６特異的配列は、括弧内である。エクソン１の３’であるＢＡＬＢ／ｃ−Ｃ５７ＢＬ／６接合部にわたるヌクレオチド配列（配列番号２０）は、以下を含んだ：ＴＣＴＴＣＣＣＴＡＡＣＴＣＣＣＡＴＴＣＴＡＴＧＣＴＣＴＴＣＣＡＴＣＣＣＧＡＣＣＧＣＧＧ（ＣＣＣＡＡＴＣＴＣＴＣＴＣＣＡＣＴＡＣＴＴＣＣＴＧＣＣＴＡＣＡＴＧＴＡＴＧ）、ここで、ＳａｃＩＩ制限部位は斜体で示され、そしてＣ５７ＢＬ／６配列は、括弧内である。

（実施例３）
ヒト化ＭＨＣＩＩマウスの作製
実施例２のベクターを用いてヒト化ＭＨＣＩＩマウスを作製するための戦略の簡略図を、図５および８に提示する。

具体的には、ＭＡＩＤ１６８０ＢＡＣＤＮＡ（上記）を使用してＭＡＩＤ５１１１ＥＳ細胞を電気穿孔し、内在性マウスＩ−ＡおよびＩ−Ｅ遺伝子座の、キメラヒトＤＲ４／マウスＩ−Ｅ遺伝子座を含むゲノム断片での置き換えを含む改変ＥＳ細胞を創製した。キメラヒトＤＲ４／マウスＩ−Ｅ遺伝子座を含むゲノム断片によって置き換えられた欠失内在性Ｉ−ＡおよびＩ−Ｅ遺伝子座を含む陽性ＥＳ細胞を、ＴＡＱＭＡＮ（商標）プローブを用いた定量的ＰＣＲアッセイ（LieおよびPetropoulos、上掲）によって同定した。ヒトＤＲα配列の挿入を、プライマーｈＤＲＡ１Ｆ（ＣＴＧＧＣＧＧＣＴＴＧＡＡＧＡＡＴＴＴＧＧ；配列番号２１）、ｈＤＲＡ１Ｒ（ＣＡＴＧＡＴＴＴＣＣＡＧＧＴＴＧＧＣＴＴＴＧＴＣ；配列番号２２）、およびプローブｈＤＲＡ１Ｐ（ＣＧＡＴＴＴＧＣＣＡＧＣＴＴＴＧＡＧＧＣＴＣＡＡＧＧ；配列番号２３）を用いるＰＣＲによって確認した。ヒトＤＲβ配列の挿入を、プライマーｈＤＲＢ１Ｆ（ＡＧＧＣＴＴＧＧＧＴＧＣＴＣＣＡＣＴＴＧ；配列番号２４）、ｈＤＲＢ１Ｒ（ＧＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡＴＧＣＴＧＧＡＡＡＣ；配列番号２５）、およびプローブｈＤＲＢ１Ｐ（ＣＡＧＧＴＧＴＡＡＡＣＣＴＣＴＣＣＡＣＴＣＣＧＡＧＧＡ；配列番号２６）を用いるＰＣＲによって確認した。ターゲッティングベクターからのハイグロマイシンカセットの欠失を、プライマーＨＹＧＦ（ＴＧＣＧＧＣＣＧＡＴＣＴＴＡＧＣＣ；配列番号７）およびＨＹＧＲ（ＴＴＧＡＣＣＧＡＴＴＣＣＴＴＧＣＧＧ；配列番号８）およびプローブＨＹＧＰ（ＡＣＧＡＧＣＧＧＧＴＴＣＧＧＣＣＣＡＴＴＣ；配列番号９）によって確認した。

次いで、陽性ＥＳ細胞クローンを用い、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）方法（上掲）を用いて雌マウスに移植し、内在性Ｉ−ＡおよびＩ−Ｅ遺伝子座の、キメラヒトＤＲ４／マウスＩ−Ｅ遺伝子座での置き換えを含む同腹仔を誕生させた。上記のターゲッティングされたＥＳ細胞をドナーＥＳ細胞として使用し、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）方法によって８細胞段階のマウス胚に導入した。キメラヒトＤＲ４／マウスＩ−Ｅ遺伝子座を持つマウスを、対立遺伝子アッセイ（Valenzuelaら、上掲）の改変を用いるゲノタイピングによって同定し、キメラヒトＤＲ４／マウスＩ−Ｅ遺伝子座の存在を検出した。

キメラヒトＤＲ４／マウスＩ−Ｅ遺伝子座を持つマウスを、ターゲッティングベクター（除去されない）によって導入された任意のｌｏｘが隣接した（ｌｏｘｅｄ）ネオマイシンカセットを除去するために、例えば、ＥＳ細胞段階でまたは胚において（図６を参照されたい）、Ｃｒｅデリーターマウス系統（例えば、国際特許出願公開第ＷＯ２００９／１１４４００号を参照されたい）と交配してもよい。

（実施例４）
遺伝子改変されたマウスにおけるキメラＨＬＡ−ＤＲ４の発現
ＷＴマウスまたはヘテロ接合型ヒト化ＨＬＡ−ＤＲ４マウス（「１６８１ＨＥＴ」）由来の脾臓を、コラゲナーゼＤ（ＲｏｃｈｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で灌流させ、ＡＣＫ溶解緩衝液で赤血球を溶解させた。脾細胞を、２日間にわたって、２５マイクログラム／ｍＬのポリ（Ｉ：Ｃ）と共に培養し、ＭＨＣ−ＩＩ遺伝子の発現を刺激した。ヒトＨＬＡ−ＤＲ４の細胞表面発現を、蛍光色素コンジュゲートした抗ＣＤ３（１７Ａ２）、抗ＣＤ１９（１Ｄ３）、抗ＣＤ１１ｃ（Ｎ４１８）、抗Ｆ４８０（ＢＭ８）、抗Ｉ−Ａ／Ｉ−Ｅ（Ｍ１５）および抗ＨＬＡＤＲ（Ｌ２４３）を用い、ＦＡＣＳによって分析した。ＢＤ−ＬＳＲＩＩを用いてフローサイトメトリーを行った。ヒトＨＬＡ−ＤＲ４の発現は、ＣＤ１９＋Ｂ細胞の表面で明らかに検出可能であり、ｔｏｌｌ様受容体アゴニストのポリ（Ｉ：Ｃ）による刺激によって有意に上方制御された（図９を参照されたい）。

均等物
当業者は、慣用的実験以上のものを用いることなく、本明細書中で記載される本発明の特定の実施形態の多くの均等物を認識するか、または確かめることができる。このような均等物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることが企図される。

本出願を通して挙げられた全ての非特許文献、特許出願および特許の全内容は、その全体が、本明細書中で参考として組み込まれる。

Claims

本願明細書に記載の発明。