JP2017527275A - がん免疫療法のためのｒｏｒ１（ｎｔｒｋｒ１）特異的キメラ抗原レセプター - Google Patents

Abstract

本発明は、免疫細胞の特異性および反応性を選択された膜抗原に対して再方向付けできる組換えキメラタンパク質であるキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）、なかでも、細胞外リガンド結合が、ＲＯＲ１陽性細胞に対する特異的免疫性を与える、ＲＯＲ１モノクローナル抗体に由来するｓｃＦＶである、キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）に関する。このようなＣＡＲを有する遺伝子操作された免疫細胞は、リンパ腫および白血病の治療、ならびに乳房、結腸、肺、および腎臓腫瘍などの充実性腫瘍の治療に特に適している。

Description

本発明は、免疫細胞の特異性および反応性をＲＯＲ１に対して再方向付けできる組換えキメラタンパク質である、キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）に関する。ＲＯＲ１は、ほとんどの骨髄性細胞上に見られる細胞表面糖タンパク質であり、患者の慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、または乳房、結腸、肺、および腎臓腫瘍などの充実性腫瘍の診断に用いられる。本発明によるＣＡＲは、Ｔ細胞またはＮＫ細胞で発現している場合、ＲＯＲ１抗原を保持する悪性細胞の治療に特に有用である。得られる遺伝子操作された免疫細胞は、悪性細胞に対して高レベルの特異性を示し、免疫療法に安全性と有効性をもたらす。

養子免疫療法は、ウイルス感染およびがんの治療のための有望な方策であり、ｅｘ ｖｉｖｏで産生された自己抗原特異的Ｔ細胞の移植を含む。養子免疫療法に用いられるＴ細胞は、遺伝子操作を用いて、抗原特異的Ｔ細胞の増殖、またはＴ細胞の再方向付けのいずれかによって産生させることができる（Ｐａｒｋ、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら．２０１１）。ウイルス抗原特異的Ｔ細胞の移植は、移植に関連するウイルス感染、およびまれなウイルスに関連する悪性腫瘍を治療するために使用される、十分に確立した手順である。同様に、腫瘍特異的Ｔ細胞の単離および移植は、メラノーマの治療において奏功することが示されている。

Ｔ細胞の新規な特異性を、トランスジェニックＴ細胞レセプター、またはキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）の遺伝的伝達によって生み出すことに成功している（Ｊｅｎａ、Ｄｏｔｔｉら．２０１０）。３世代のＣＡＲについての概略図を図１に示す。ＣＡＲは、１つまたは複数のシグナリングドメインと結合して１つの融合分子になっている標的化部分からなる合成レセプターである。一般に、ＣＡＲの結合部分は、一本鎖抗体（ｓｃＦＶ）の抗原結合ドメインからなり、可動性リンカーによって接合したモノクローナル抗体の軽鎖可変フラグメントを含む。レセプターまたはリガンドドメインに基づく結合部分も首尾よく使用されている。第１世代ＣＡＲのシグナリングドメインは、ＣＤ３ζまたはＦｃレセプターγ鎖の細胞質領域に由来している。第１世代ＣＡＲは、Ｔ細胞の細胞毒性の再方向付けに成功していることも示されている。しかしながら、第１世代ＣＡＲは、ｉｎ ｖｉｖｏで長期的な増殖および抗腫瘍活性を生じさせることはできない。共刺激分子由来のシグナリングドメイン、ならびに膜貫通およびヒンジドメインを追加して第２および第３世代のＣＡＲが作出されており、ＣＤ１９を発現している悪性細胞に対してＴ細胞を再方向付けできる場合について、ヒトのいくつかの治療試験で成功に至っている（Ｊｕｎｅら、２０１１）。しかしながら、ＣＤ１９ ＳｃＦｖに対して使用されるシグナリングドメイン、膜貫通および共刺激ドメインの特定の組み合わせは、かなり抗原特異的であり、いかなる抗原マーカーにも拡張することはできない。

慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）は、血液学者が扱う、最も一般的に診断される白血病の１つである。長年の間、ＣＬＬを患っている患者は、長い自然史を持ち、有効性がわずかで著効を示すことがほとんどない治療法しかない、同類の患者だと見られていた。近時、Ｖ_Ｈ変異状態およびそれに伴うＺＡＰ−７０の過剰発現、ｐ５３機能不全、および染色体異常の生物学的な意義に関するいくつかの重要な知見により、早期の病状悪化および低い生存率のリスクが高い患者を特定することが可能となった。これらの研究と同時に、ヌクレオシドアナログ、ならびにモノクローナル抗体であるリツキシマブおよびアレムツズマブを含むいくつかの治療が導入された。臨床試験において、これらの療法の組み合わせにより、症候性ＣＬＬの初期治療に適用された場合の著効率および全奏効率が高くなった。よって、ＣＬＬおよび治療に関する初期のリスク層別化の複雑性が著しく増大した。さらに、これらの初期療法が効果を示さない場合、フルダラビン不応性疾患を伴うＣＬＬ患者への取り組みは、著しく困難なものになり得る（Ｂｙｒｄ Ｊ．Ｃら、２０１４）。

慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）に対する免疫療法の候補となる抗原の１つは、チロシンタンパク質キナーゼ膜貫通レセプターＲＯＲ１（ＮＴＲＫＲ１、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／ＴｒＥＭＢＬとも呼ばれる）登録番号：Ｑ０１９７３）である。ＲＯＲ１（レセプターチロシンキナーゼ様オーファンレセプター１）は、細胞外免疫グロブリン（Ｉｇ）様、Ｋｒｉｎｇｌｅ、およびＦｒｉｚｚｌｅｄ様システインリッチドメインを含む、１２０ｋＤａの糖タンパク質である（図２）。この遺伝子によってコードされるタンパク質は、中枢神経系の神経突起伸長を調節するレセプター型チロシンキナーゼである。これはＩ型膜タンパク質であり、細胞表面レセプターのＲＯＲサブファミリーに属する（Ｒｅｄｄｙら、１９９７）。しかしながら、ＣＬＬを患っている患者における正常白血球に関するＲＯＲ１タンパク質の発現、およびＣＬＬの病理生物学におけるその役割は、さらに研究する価値がある。ＲＯＲ１は、がん免疫療法の適切な標的であり得る（Ｄａｎｅｓｈｍａｎｅｓｈら；２００８）。ＲＯＲ１は、種々のＢ細胞悪性腫瘍上に発現していることは確かであるが、乳房、結腸、肺、および腎臓腫瘍を含む、いくつかの充実性腫瘍のサブセット上にも発現している。ＲＯＲ１は、上皮性腫瘍中の腫瘍細胞の生存を促進するがん化シグナリングにおいて機能すると考えられる。重要なのは、ＲＯＲ１は、脂肪および膵臓組織を除く重要臓器上には発現せず、そのことが正常細胞を死滅させる潜在的な毒性を減少させるということである（Ｈｕｄｅｃｅｋら、２０１３）。ＲＯＲ１は、胚発生中に発現するが、未成熟Ｂ細胞前駆体のサブセットを除く正常成体組織には存在せず、脂肪細胞上には低レベルで発現する（Ｈｕｄｅｃｅｋら、２０１０；Ｍａｔｓｕｄａら、２００１）。ＲＯＲ１は、最初にＢ細胞慢性リンパ性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）で発現していることが転写プロファイリングによって示され（Ｋｌｅｉｎら、２００１；Ｒｏｓｅｎｗａｌｄら、２００１）、次いでマントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、ｔ（１；１９）染色体転座を伴う急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、ならびに肺、乳房、結腸、膵臓、腎臓、および卵巣がんのサブセットを含む多くのがんの表面上で確認された（Ｂａｓｋａｒら、２００８；Ｂｉｃｏｃｃａら、２０１２；Ｄａｎｅｓｈｍａｎｅｓｈら、２００８；Ｄａｖｅら、２０１２；Ｆｕｋｕｄａら、２００８；Ｙａｍａｇｕｃｈｉら、２０１２；Ｚｈａｎｇら、２０１２ａ、２０１２ｂ）。肺腺がんとｔ（１；１９）ＡＬＬいずれにおいても、ＲＯＲ１はがん化シグナリングにおいて協働し、ｓｉＲＮＡによるＲＯＲ１のノックダウンによって、腫瘍細胞の生存の維持におけるＲＯＲ１分子の決定的な役割が明らかになった（Ｂｉｃｏｃｃａら、２０１２；Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙら、２０１０；Ｇｅｎｔｉｌｅら、２０１１；Ｙａｍａｇｕｃｈｉら、２０１２）。よって、腫瘍がＲＯＲ１の喪失に耐えることは容易ではなく、そのことによってＲＯＲ１は、幅広く適用され得る、ＣＡＲ指向性Ｔ細胞療法の魅力的な候補となっている。このようにして、本発明者らは、ＲＯＲ１が、ＣＬＬならびに乳房、結腸、肺、卵巣、および腎臓腫瘍などの充実性腫瘍の、ＣＡＲ発現Ｔ細胞を用いた治療のための有用な標的抗原になり得ると考えた。

以前に、Ｓｔａｎｌｅｙ Ｒｉｄｄｅｌｌ博士の研究室とＬａｕｒｅｎｃｅ Ｃｏｏｐｅｒ博士の研究室では、それぞれ４Ａ５を含む抗ＲＯＲ１ｓｃＣＡＲと２Ａ２ｓｃＦｖを含む抗ＲＯＲ１ｓｃＣＡＲを遺伝子操作し、検証した（Ｃｏｏｐｅｒら、２０１０；Ｈｕｄｅｃｅｋら、２０１３）。特に、Ｈｕｄｅｃｅｋらは、種々の長さのＩｇＧ４ヒンジおよびＣＤ２８膜貫通ドメインを含む抗ＲＯＲ１ｓｃＣＡＲを開示している。

ＣＡＲ構造を設計し、適切な構成部分を用いてＣＡＲの機能性を改善する必要性が依然として存在する。なぜなら、これらのパラメーターは、重要な役割を果たし、繊細な調整を必要とするからである。

したがって、以前の方策の代わりとして、本発明は、ＲＯＲ１特異的ＣＡＲを提供し、このＲＯＲ１特異的ＣＡＲは免疫細胞内で発現し、ＲＯＲ１悪性細胞を標的にすることができ、臨床的に著しい利点がある。本発明者らは、ＣＡＲ構造を適切な構成部分の選択肢と組み合わせることによって、がん性標的細胞に対して高い細胞毒性を有するＲＯＲ１特異的単鎖ＣＡＲを得ることができることを見出した。

発明の概要
本発明者らは、種々の構造を有し、種々のＲＯＲ１特異的抗体に由来する種々のｓｃＦＶを含む、ＲＯＲ１特異的ＣＡＲを作成した。

本発明によるＲＯＲ１（ＮＴＲＫＲ１）特異的キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）は、図４に記載のＶ１〜Ｖ６から選択されるポリペプチド構造の１つを有していてもよく、前記構造は、抗ＲＯＲ１モノクローナル抗体由来のＶＨおよびＶＬを含む細胞外リガンド結合ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメイン、ならびに４−１ＢＢ由来のＣＤ３ζシグナリングドメインおよび共刺激ドメインを含む細胞質ドメイン、を含む。

とりわけ、本発明によるＲＯＲ１（ＮＴＲＫＲ１）特異的キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）は、図４に記載のＶ３、Ｖ５、およびＶ１から選択されるポリペプチド構造の１つ（ｏｎｅ ｏｆ ｔｈｅ ｏｎｅ ｏｆ）を有していてもよく、前記構造は、モノクローナル抗ＲＯＲ１抗体由来のＶＨおよびＶＬを含む細胞外リガンド結合ドメイン、ヒンジ、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ならびに４−１ＢＢ由来のＣＤ３ζシグナリングドメインおよび共刺激ドメインを含む細胞質ドメイン、を含む。このようなＲＯＲ１（ＮＴＲＫＲ１）特異的抗原レセプターは、細胞毒性に関し、予期せぬ優れた効果を有することが見出された。

１つの実施形態において、ＲＯＲ１特異的ＣＡＲは、ＦｃγＲＩＩＩαヒンジおよびＣＤ８α膜貫通ドメインを含む構造Ｖ１を有する。

好ましい実施形態において、ＲＯＲ１特異的ＣＡＲは、ＣＤ８αヒンジおよびＣＤ８α膜貫通ドメインを含む構造Ｖ３を有する。

別の好ましい実施形態において、ＲＯＲ１特異的ＣＡＲは、ＩｇＧ１ヒンジおよびＣＤ８α膜貫通ドメインを含む構造Ｖ５を有する。

特に、Ｈ１０抗ＲＯＲ１抗体およびＤ１０抗ＲＯＲ１抗体由来の前記抗原結合ドメイン（ｓｃＦｖ）は、優れた抗がん特性を示す。

さらに、マウスＨ１０抗ＲＯＲ１抗体およびマウスＤ１０抗ＲＯＲ１抗体から、ヒト化ｓｃＦｖを作成した。

本発明の好ましいＣＡＲポリペプチドは、配列番号７９〜１３８から選択されるアミノ酸配列を含む。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの（例えば、抗ＣＤ３／ＣＤ２８コーティングビーズおよび組換えＩＬ２を用いた）非特異的活性化に続いて、これらのＣＡＲを発現するポリヌクレオチドを用いて、ウイルス形質導入によってドナー由来のＴ細胞を形質転換した。ある特定の場合において、Ｔ細胞をさらに遺伝子操作して非アロ反応性Ｔ細胞を作製し、とりわけＴＣＲ（αβ−Ｔ細胞レセプター）の構成部分を破壊して移植片対宿主反応を防止する。本発明のＣＡＲは、同種異系のＴ細胞との関連において、特に効果的であることが見出された。

得られた遺伝子操作Ｔ細胞は、ｉｎ−ｖｉｔｒｏで、ＲＯＲ１陽性細胞に対して種々の程度で反応性を示し、本発明のＣＡＲがＴ細胞の抗原依存的活性化に寄与し、また増殖にも寄与することが示され、このことから本発明のＣＡＲが免疫療法に有用になる。

本発明のＣＡＲをコードするポリペプチドおよびポリヌクレオチド配列は、本明細書に詳細に説明されている。

本発明の遺伝子操作された免疫細胞は、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、ｔ（１；１９）染色体転座を伴う急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）の治療などの治療への適用に特に有用である。本発明の遺伝子操作された免疫細胞は、乳房、結腸、肺、および腎臓腫瘍などの充実性腫瘍の治療にも使用し得る。

単鎖キメラ抗原レセプター（ｓｃＣＡＲ）は、最も一般的には、特異的抗原に結合するモノクローナル抗体（図１Ａ）の重鎖および軽鎖可変領域を、Ｔ細胞シグナル分子の細胞内ポーション（ＴＣＲ関連ＣＤ３複合体の構成部分（ζ鎖）（図１Ｂ）など）に接合することによって作製される。第１世代のｓＣＡＲｓは、活性化シグナルを伝達するＴ細胞シグナリングドメインのみを含む（図１Ｃ左側）。第２世代のｓｃＣＡＲには、加えて、ｉｎ ｖｉｖｏでＴ細胞残存率および抗腫瘍機能を高める単一の共刺激分子内部ドメイン（ＣＤ２８または４１ＢＢの内部ドメイン（図１Ｃ中）など）が組み入れられている。第３世代のｓｃＣＡＲには、少なくとも２つの共刺激分子内部ドメイン（ＣＤ２８および４１ＢＢの内部ドメイン（図１Ｃ右）など）が組み入れられている。 細胞外部位、膜貫通部位、および細胞内ドメインから構成されるＲＯＲ１タンパク質の構造であり、上記細胞外部位および細胞内ドメインは、上に説明したように、複数の部位を含む。 （Ｉ）Ｄ１０ＶＨマウス配列と、免疫グロブリンの可変領域をコードするＶおよびＪ遺伝子によってコードされるヒト生殖系列配列との配列アライメントであり、これらの配列は、マウス配列との高い相同性を共有する。安定性の目的（特にＣＤＲについて）に関し、上側の行に「最も重要な」ＡＡの位置を矢印で示し（これはマウス起源であるべきＡＡに対応する）、下側の行の「あまり重要でない」ＡＡは、ヒトまたはマウス起源のいずれかであり得るＡＡである。（ＩＩ）ＭＧＴ／ＤｏｍａｉｎＧａｐＡｌｉｇｎ（Ｌｅｆｒａｎｃら、Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２９、１８５〜２０３（２００５））によって、Ｄ１０ＶＨマウス配列の「ＩＭＧＴ−ｇａｐ」ドメインアミノ酸配列をアラインすることが可能になる。入力配列が表示され、ＩＭＧＴドメインディレクトリの最も類似した生殖系列Ｖ領域または最も類似したＣドメインとアラインされ、ならびにＶ領域、Ｃドメイン、およびＣ様ドメインについて固有のナンバリングをしたＩＭＧＴに基づくギャップとアラインされる。 （Ｉ）Ｄ１０ＶＬマウス配列と、免疫グロブリンの可変領域をコードするＶおよびＪ遺伝子によってコードされるヒト生殖系列配列との配列アライメントであり、これらの配列は、マウス配列との高い相同性を共有する。安定性の目的（特にＣＤＲについて）に関し、上側の行に「最も重要な」ＡＡの位置を矢印で示し（これはマウス起源であるべきＡＡに対応する）、下側の行の「あまり重要でない」ＡＡは、ヒトまたはマウス起源のいずれかであり得るＡＡである。（ＩＩ）ＭＧＴ／ＤｏｍａｉｎＧａｐＡｌｉｇｎ（Ｌｅｆｒａｎｃら、Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２９、１８５〜２０３（２００５））によって、Ｄ１０ＶＬマウス配列の「ＩＭＧＴ−ｇａｐ」ドメインアミノ酸配列をアラインすることが可能になる。入力配列が表示され、ＩＭＧＴドメインディレクトリの最も類似した生殖系列Ｖ領域または最も類似したＣドメインとアラインされ、ならびにＶ領域、Ｃドメイン、およびＣ様ドメインについて固有のナンバリングをしたＩＭＧＴに基づくギャップとアラインされる。 （Ｉ）Ｈ１０ＶＨマウス配列と、免疫グロブリンの可変領域をコードするＶおよびＪ遺伝子によってコードされるヒト生殖系列配列との配列アライメントであり、これらの配列は、マウス配列との高い相同性を共有する。安定性の目的（特にＣＤＲについて）に関し、上側の行に「最も重要な」ＡＡの位置を矢印で示し（これはマウス起源であるべきＡＡに対応する）、下側の行の「あまり重要でない」ＡＡは、ヒトまたはマウス起源のいずれかであり得るＡＡである。（ＩＩ）ＭＧＴ／ＤｏｍａｉｎＧａｐＡｌｉｇｎ（Ｌｅｆｒａｎｃら、Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２９、１８５〜２０３（２００５））によって、Ｈ１０ＶＨマウス配列の「ＩＭＧＴ−ｇａｐ」ドメインアミノ酸配列をアラインすることが可能になる。入力配列が表示され、ＩＭＧＴドメインディレクトリの最も類似した生殖系列Ｖ領域または最も類似したＣドメインとアラインされ、ならびにＶ領域、Ｃドメイン、およびＣ様ドメインについて固有のナンバリングをしたＩＭＧＴに基づくギャップとアラインされる。 （Ｉ）Ｈ１０ＶＬマウス配列と、免疫グロブリンの可変領域をコードするＶおよびＪ遺伝子によってコードされるヒト生殖系列配列との配列アライメントであり、これらの配列は、マウス配列との高い相同性を共有する。安定性の目的（特にＣＤＲについて）に関し、上側の行に「最も重要な」ＡＡの位置を矢印で示し（これはマウス起源であるべきＡＡに対応する）、下側の行の「あまり重要でない」ＡＡは、ヒトまたはマウス起源のいずれかであり得るＡＡである。（ＩＩ）ＭＧＴ／ＤｏｍａｉｎＧａｐＡｌｉｇｎ（Ｌｅｆｒａｎｃら、Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２９、１８５〜２０３（２００５））によって、Ｈ１０ＶＬマウス配列の「ＩＭＧＴ−ｇａｐ」ドメインアミノ酸配列をアラインすることが可能になる。入力配列が表示され、ＩＭＧＴドメインディレクトリの最も類似した生殖系列Ｖ領域または最も類似したＣドメインとアラインされ、ならびにＶ領域、Ｃドメイン、およびＣ様ドメインについて固有のナンバリングをしたＩＭＧＴに基づくギャップとアラインされる。 種々のＣＡＲ構造（Ｖ１〜Ｖ６）の概略図。 種々のヒト細胞系上のＲＯＲ１表面分子数。 ｓｃＣＡＲスクリーニング手順。 ヒトＴ細胞におけるｓｃＣＡＲの総発現量。（Ａ）実験１。 ヒトＴ細胞におけるｓｃＣＡＲの総発現量。（Ｂ）実験２。 ヒトＴ細胞上のｓｃＣＡＲの細胞表面発現。（Ａ）実験１。 ヒトＴ細胞上のｓｃＣＡＲの細胞表面発現。（Ｂ）実験２。 標的細胞と共培養した際の、ｓｃＣＡＲ改変Ｔ細胞の脱顆粒。実験１。 実験２（細胞系および／または治療（左から右の順）：ＭＤＡ−ＭＢ−２３０１、ＰＣ−３、ＭＣＦ−７、活性化なし、ＰＭＡ＋イオノマイシン）。 ヒトＴ細胞上のｓｃＣＡＲの細胞表面発現。データを、４つの独立した実験の平均±ＳＤとして示す。 標的細胞と共培養した際の、ｓｃＣＡＲ改変Ｔ細胞の脱顆粒。データを、４つの独立した実験の平均±ＳＤとして示す。 標的細胞と共培養した際の、ｓｃＣＡＲ改変Ｔ細胞によるＩＦＮγ産生。データを、４つの独立した実験の平均±ＳＤとして示す（細胞系および／または治療（左から右の順）：Ｊｅｋｏ−１、Ｋ５６２、ＭＤＡ−ＭＢ−２３０１、ＰＣ−３、ＭＣＦ−７、活性化なし）。 付着性の標的細胞と共培養した際の、ｓｃＣＡＲ改変Ｔ細胞の細胞毒性活性。データを、４つの独立した実験の平均±ＳＤとして示す。 浮遊性の標的細胞と共培養した際の、ｓｃＣＡＲ改変Ｔ細胞の細胞毒性活性。データを、４つの独立した実験の平均±ＳＤとして示す。 本発明による遺伝子操作された免疫細胞の概略図。この図に示されている遺伝子操作された免疫細胞は、ＣＡＲをコードするレトロウイルスポリペプチドで形質導入したＴ細胞である。このＴ細胞をさらに遺伝子操作することによって、患者への生着をより良好かつ安全にすることが可能になるが、この遺伝子操作は、本発明の範囲内において任意である。Ｘ遺伝子は、例えばＴＣＲ（ＴＣＲαまたはＴＣＲβ）の構成部分を発現する遺伝子であってもよく、Ｙ遺伝子は、免疫抑制剤（ＣＤ５２（アレムツズマブについて）またはＨＰＲＴ（６−チオグアニンについて）など）に対するＴ細胞の感受性に関係する遺伝子であってもよい。

本明細書において特に定義のない限り、用いられた全ての技術用語および科学用語は、遺伝子療法、生化学、遺伝学、および分子生物学分野の当業者が一般に理解している通りの意味を有する。

本明細書において説明されているものと類似する、または同等の全ての方法および材料は、本発明の実施またはテストに使用することができ、適切な方法および材料は本明細書において説明されている。本明細書で言及した全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、参照によりその全体が組み込まれる。不一致がある場合、定義を含めて本明細書が優先する。さらに、材料、方法、および実施例は例示に過ぎず、別段の定めがない限り、限定を意図するものではない。

本発明の実施には、別段の指定がない限り、本技術分野の技術の範囲である細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の従来の手法が利用される。このような手法については、文献に十分に説明されている。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ．ＡＵＳＵＢＥＬ、２０００、Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ ｓｏｎ Ｉｎｃ、Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ、ＵＳＡ）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ｍｕｌｌｉｓら、米国特許第４，６８３，１９５号明細書；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｒｒｉｅｓ、Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ共編、１９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ、Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ共編、１９８４）；Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、１９８７）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ、Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ（Ｊ．Ａｂｅｌｓｏｎ、Ｍ．Ｓｉｍｏｎ主幹、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、特に、Ｖｏｌ．１５４および１５５（Ｗｕら、共編）、ならびにＶｏｌ．１８５、「Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」（Ｄ．Ｇｏｅｄｄｅｌ、編）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ、Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ共編、１９８７、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｍａｙｅｒ、Ｗａｌｋｅｒ共編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、１９８７）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ−ＩＶ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ、Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ共編、１９８６）；ならびにＭａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ、（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８６）を参照のこと。

ＲＯＲ１特異的キメラ抗原レセプター
本発明は、細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、およびシグナル伝達ドメインを含む抗ＲＯＲ１キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）の新しい設計に関する。

用語「細胞外リガンド結合ドメイン」は、本明細書で使用する場合、リガンドを結合できるオリゴペプチドまたはポリペプチドと定義される。好ましくは、上記ドメインは、細胞表面分子と相互作用できるであろう。例えば、細胞外リガンド結合ドメインは、特定の病状と関連する標的細胞上の細胞表面マーカーの働きをするリガンドを認識するように選択してもよい。好ましい実施形態において、前記細胞外リガンド結合ドメインは、可動性リンカーによって接合した標的抗原特異的モノクローナル抗ＣＤ−１２３抗体の軽鎖（Ｖ_Ｌ）可変フラグメントおよび重鎖（Ｖ_Ｈ）可変フラグメントを含む、単鎖抗体フラグメント（ｓｃＦＶ）を含む。前記Ｖ_ＬおよびＶ_Ｈは、好ましくは、表２に示すように、２Ａ２、４Ａ５、およびＤ１０と呼ばれる抗体から選択される。

さらに、表２は、Ｇ６、Ｇ３、Ｈ１０、２Ａ４および１Ｃ１１のＶ_ＬおよびＶ_Ｈも記載し、それらの各々の配列である配列番号３７、４１、４５、４９、５３、５８、６３、６７、７１、および７５、ならびにヒト化Ｄ１０およびＨ１０のＶ_ＬおよびＶ_Ｈに関して各々の配列である配列番号３１、３６、５７および６２を開示している。

図４は、本発明による６つのバージョンのＣＡＲの構造を示す。表１は、例として、さらなる実験において使用される構成部分を示す。

本発明によるＲＯＲ１（ＮＴＲＫＲ１）特異的キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）は、図４に記載のＶ１〜Ｖ６から選択されるポリペプチド構造の１つを有していてもよく、前記構造は、抗ＲＯＲ１モノクローナル抗体由来のＶＨおよびＶＬを含む細胞外リガンド結合ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメイン、ならびに４−１ＢＢ由来のＣＤ３ζシグナリングドメインおよび共刺激ドメインを含む細胞質ドメイン、を含む。

より具体的には、本発明は、図４に記載のＶ３、Ｖ５、およびＶ１から選択されるポリペプチド構造の１つを有するＲＯＲ１（ＮＴＲＫＲ１）特異的キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）に関し、前記構造は、抗ＲＯＲ１モノクローナル抗体由来のＶＨおよびＶＬを含む細胞外リガンド結合ドメイン、ヒンジ、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ならびに４−１ＢＢ由来のＣＤ３ζシグナリングドメインおよび共刺激ドメインを含む細胞質ドメイン、を含む。

抗原結合ドメイン
本発明のＲＯＲ１ＣＡＲの抗原結合ドメインは、組織外（ｏｆｆ−ｔｉｓｓｕｅ）抗原に結合するいずれのドメインであってもよく、モノクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、およびそれらの機能フラグメントが含まれるが、これらに限定されない。

好ましい実施形態において、前記細胞外リガンド結合ドメインは、可動性リンカーによって接合した標的抗原特異的モノクローナルＲＯＲ１抗体の軽鎖（Ｖ_Ｌ）可変フラグメントおよび重鎖（Ｖ_Ｈ）可変フラグメントを含む、単鎖抗体フラグメント（ｓｃＦＶ）を含む。前記Ｖ_ＬおよびＶ_Ｈは、好ましくは、表２に示すように、Ｈ１０、Ｄ１０、４Ａ５、Ｇ６、Ｇ３、２Ａ２、２Ａ４、および１Ｃ１１と呼ばれる抗体から選択される。これらは、好ましくは、例えば配列番号１０の配列を含む可動性リンカーによって互いに結合されている。言い換えれば、前記ＣＡＲは、優先的には、バージョンＶ１〜Ｖ６についての表３から表８に示すように、ＶＨ鎖とＶＬ鎖との組み合わせと、その間のリンカーとに由来する配列に対して、少なくとも９０％、９５％、９７％、または９９％の同一性を示すポリペプチド配列を含む、細胞外リガンド結合ドメインを含む。

特に好ましい実施形態において、前記Ｖ_ＬおよびＶ_Ｈは、抗体Ｈ１０に由来する。
他の特定の実施形態において、前記Ｖ_ＬおよびＶ_Ｈは、抗体Ｄ１０に由来する。

本明細書で使用する場合、用語「組換え抗体」は、組換えＤＮＡ技術を用いて作成した抗体または抗体フラグメント、例えば、バクテリオファージ、酵母発現系、または哺乳動物細胞発現系で発現させた抗体または抗体フラグメント、なかでも抗体のＣＤＲ領域をコードする核酸配列を含むウイルスベクターで形質導入したＴ細胞で発現させた抗体または抗体フラグメントを意味する。上記用語は、抗体または抗体フラグメントをコードするＤＮＡ分子の合成によって生成された抗体または抗体フラグメントを意味するものとも解釈されるべきであり、ＤＮＡ分子は、抗体または抗体フラグメントタンパク質、または抗体もしくは抗体フラグメントを特定するアミノ酸配列を発現し、ＤＮＡまたはアミノ酸配列は、本技術分野で利用可能であり、よく知られている組換えもしくは合成ＤＮＡ配列技術またはアミノ酸配列技術を用いて得られたものである。

本明細書で使用する場合、用語「ヒト化抗体」は、ヒト化重鎖可変領域およびヒト化軽鎖可変領域を含むポリペプチドを意味する。例えば、ポリペプチドには、ヒト抗体の軽鎖可変領域および重鎖可変領域のフレームワーク（ＦＲ）領域が含まれ得るが、ポリペプチドは、実質的に親モノクローナル抗体の抗原結合特性を保持している。ヒト化重鎖可変領域および／またはヒト化軽鎖可変領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）を除き、少なくとも約８７％ヒト化、少なくとも約９０％ヒト化、少なくとも約９５％ヒト化、少なくとも約９８％ヒト化、または少なくとも約１００％ヒト化されている。抗原結合ポリペプチド分子は、モノクローナル抗体ドナー（例えば、マウスモノクローナル抗体ドナー）に由来していてもよく、抗原結合ポリペプチド分子にはモノクローナル抗体由来のＣＤＲ（例えば、マウスモノクローナルＣＤＲ）が含まれ得る。場合（Ｗｈｅｎ）

本明細書で使用する場合、用語「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマかウイルス形質転換リンパ球かどちらかの、実験室で成長させた細胞クローンによって産生された抗体を意味し、モノクローナル抗体は、自然抗体よりも豊富で均一性が高く、かつＲＯＲ１抗原上の単一のサイトに特異的に結合することができる。単一特異性抗体は、全てが特有の親細胞のクローンである同一の免疫細胞によって作られ、種々の異なる免疫細胞で作られるポリクローナル抗体とは対照的である。モノクローナル抗体は、同じエピトープに結合するという点で、単価の親和性を有する。

本発明は、上記のようなＲＯＲ１特異的キメラ抗原レセプター（ＲＯＲ１ＣＡＲ）を開示し、前記細胞外リガンド結合ドメインは、ヒト化されたＶＨ鎖およびＶＬ鎖を含む。

表２は、Ｄ１０抗ＲＯＲ１抗体およびＨ１０抗ＲＯＲ１抗体に対応する、ヒト化ｓｃＦＶ（ＶＨ鎖およびＶＬ鎖）の配列を示す。

図３Ａ〜３Ｄは、マウスのＤ１０ｓｃＦｖおよびＨ１０ｓｃＦｖの、Ｌｅｆｒａｎｃ ＭＰら（Ｌｅｆｒａｎｃ、ＭＰ、Ｅｈｒｅｎｍａｎｎ Ｆ、Ｇｉｎｅｓｔｏｕｘ Ｃ、Ｇｉｕｄｉｃｅｌｌｉ Ｖ、Ｄｕｒｏｕｘ Ｐ“Ｕｓｅ ｏｆ ＩＭＧＴ（登録商標） ｄａｔａｂａｓｅｓ ａｎｄ ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ”、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１２、９０７：３〜３７）による方法を適用した後のＤ１０ｓｃＦｖおよびＨ１０ｓｃＦｖのヒト化形態に対するアライメントを示す。これらの４つのアライメントは、以下のように示されている。

− ＣＤＲ、
− アミノ酸（ＡＡ）がマウス起源のものとして保存されていることを意味する上向き矢印がついた、「最も重要な」ＡＡ；
− アミノ酸が、マウス起源またはヒト起源であってもよいことを意味する上向き矢印がついた「あまり重要でない」ＡＡ；本発明のヒト化配列は、実際に、ヒト起源またはマウス起源の、このような「あまり重要でない」ＡＡの全ての組み合わせから作られ得る、全ての異なる配列のセットであることが理解され；そのような配列は、すぐ上に示したように、ＣＤＲおよび「最も重要な」ＡＡを含む。

ヒト化抗体は、以下のものを含むが、これらに限定されない、本技術分野で知られている種々の手法を用いて作成することができ、以下の文献の各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。上記手法は、ＣＤＲグラフティング（例えば、欧州特許第２３９，４００号明細書；国際公開第９１／０９９６７号パンフレット；ならびに米国特許第５，２２５，５３９号明細書、米国特許第５，５３０，１０１号明細書、および米国特許第５，５８５，０８９号明細書を参照のこと。これらの文献の各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。）、ベニアリングまたはリサーフェシング（例えば、欧州特許第５９２，１０６号明細書および欧州特許第５１９，５９６号明細書；Ｐａｄｌａｎ、１９９１、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２８（４／５）：４８９−４９８；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、１９９４、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、７（６）：８０５−８１４；ならびにＲｏｇｕｓｋａら、１９９４、ＰＮＡＳ、９１：９６９〜９７３を参照のこと。これらの文献の各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。）、チェインシャッフリング（例えば、米国特許第５，５６５，３３２号明細書を参照のこと。この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。）、および、例えば、米国特許出願公開第２００５／００４２６６４号明細書、米国特許出願公開第２００５／００４８６１７号明細書、米国特許第６，４０７，２１３号明細書、米国特許第５，７６６，８８６号明細書、国際公開第９３１７１０５号パンフレット、Ｔａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６９：１１１９〜２５（２００２）、Ｃａｌｄａｓら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．、１３（５）：３５３〜６０（２０００）、Ｍｏｒｅａら、Ｍｅｔｈｏｄｓ、２０（３）：２６７〜７９（２０００）、Ｂａｃａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７２（１６）：１０６７８〜８４（１９９７）、Ｒｏｇｕｓｋａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．、９（１０）：８９５〜９０４（１９９６）、Ｃｏｕｔｏら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５５（２３Ｓｕｐｐ）：５９７３ｓ〜５９７７ｓ（１９９５）、Ｃｏｕｔｏら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５５（８）：１７１７〜２２（１９９５）、Ｓａｎｄｈｕ Ｊ Ｓ、Ｇｅｎｅ、１５０（２）：４０９〜１０（１９９４）、およびＰｅｄｅｒｓｅｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２３５（３）：９５９〜７３（１９９４）に開示された手法である。多くの場合、フレームワーク領域中のフレームワーク残基は、ＣＤＲドナー抗体由来の対応する残基で置換され、抗原結合を変化（例えば、改善）させるであろう。これらのフレームワーク置換は、本技術分野でよく知られた方法によって（例えば、ＣＤＲおよびフレームワーク残基の相互作用のモデリングによって）同定され、抗原結合および配列比較のために重要なフレームワーク残基を同定し、特定の位置の通常でないフレームワーク残基を同定する。（例えば、Ｑｕｅｅｎら、米国特許第５，５８５，０８９号明細書；およびＲｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３を参照のこと。これらの文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。）。

本発明の一態様は、特に、図４に記載のＶ３、Ｖ５、およびＶ１から選択されるポリペプチド構造の１つを有するＲＯＲ１（ＮＴＲＫＲ１）特異的キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）に関し、前記構造は、抗ＲＯＲ１モノクローナル抗体由来のＶＨおよびＶＬを含む細胞外リガンド結合ドメイン、ヒンジ、ＣＤ８α膜貫通ドメイン（ＣＤ８α ＴＭ）、ならびに４−１ＢＢ由来のＣＤ３ζシグナリングドメインおよび共刺激ドメインを含む細胞質ドメイン、を含む。

好ましい実施形態によれば、前記膜貫通ドメインは、配列番号６（ＣＤ８α ＴＭ）と、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を共有するポリペプチドによってコードされる。

別の好ましい実施形態によれば、前記ヒンジは、それぞれ構造Ｖ３、Ｖ５、およびＶ１に関する配列番号４（ＣＤ８α）、配列番号５（ＩｇＧ１）、および配列番号３（ＦｃγＲＩＩＩα）と、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を共有するポリペプチドによってコードされる。

より好ましい実施形態によれば、本発明のＲＯＲ１特異的ＣＡＲは、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するＣＤ８αヒンジと、配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するＣＤ８α膜貫通ドメインとを含む、ポリペプチド構造Ｖ３を有する。

別のより好ましい実施形態によれば、本発明のＲＯＲ１特異的ＣＡＲは、配列番号５に記載のアミノ酸配列を有するＩｇＧ１ヒンジと、番号６に記載のアミノ酸配列を有するＣＤ８α膜貫通ドメインとを含む、ポリペプチド構造Ｖ５を有する。

一実施形態によれば、前記ＲＯＲ１（ＮＴＲＫＲ１）特異的キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）は、図４に記載のＶ３、Ｖ５、およびＶ１から選択されるポリペプチド構造の１つを有し、細胞外リガンド結合ドメインは、
− 配列番号５４（ＣＤＲ−Ｈ１）、配列番号５５（ＣＤＲ−Ｈ２）、および配列番号５６（ＣＤＲ−Ｈ３）のマウスモノクローナル抗体Ｈ１０由来のＣＤＲを含む可変重鎖ＶＨ、ならびに
− 配列番号５９（ＣＤＲ−Ｌ１）、配列番号６０（ＣＤＲ−Ｌ２）、および配列番号６１（ＣＤＲ−Ｌ３）のマウスモノクローナル抗体Ｈ１０由来のＣＤＲを含む可変軽鎖ＶＬ、
または、
− 配列番号２８（ＣＤＲ−Ｈ１）、配列番号２９（ＣＤＲ−Ｈ２）、および配列番号３０（ＣＤＲ−Ｈ３）のマウスモノクローナル抗体Ｄ１０由来のＣＤＲを含む可変重鎖ＶＨ、ならびに
− 配列番号３３（ＣＤＲ−Ｌ１）、配列番号３４（ＣＤＲ−Ｌ２）、および配列番号３５（ＣＤＲ−Ｌ３）のマウスモノクローナル抗体Ｄ１０由来のＣＤＲを含む可変軽鎖ＶＬ、を含む。

好ましい実施形態において、前記ＲＯＲ１（ＮＴＲＫＲ１）特異的キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）は、図４に記載のＶ３、Ｖ５、およびＶ１から選択されるポリペプチド構造の１つを有し、前記細胞外リガンド結合ドメインは、ＶＨ鎖およびＶＬ鎖を含み、該ＶＨ鎖およびＶＬ鎖は、それぞれ
− 配列番号５３（Ｈ１０−ＶＨ）および配列番号５８（Ｈ１０−ＶＬ）または
− 配列番号２７（Ｄ１０−ＶＨ）および配列番号３２（Ｄ１０−ＶＬ）または；
と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する。

別の実施形態において、前記ＲＯＲ１（ＮＴＲＫＲ１）特異的キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）は、図４に記載のＶ３、Ｖ５、およびＶ１から選択されるポリペプチド構造の１つを有し、前記細胞外リガンド結合ドメインは、ヒト化されたＨ１０またはＤ１０抗体由来のＶＨ鎖およびＶＬ鎖を含む。

特に、前記細胞リガンド結合ドメインは、ヒト化ＶＨ鎖およびＶＬ鎖を含み、
− 可変重鎖ＨｕＨ１０ＶＨは、配列番号５７でコードされるポリペプチドを有し、
− 可変軽鎖ＨｕＨ１０ＶＨは、配列番号６２でコードされるポリペプチドを有し、
または、
− 可変重鎖ＨｕＤ１０ＶＨは、配列番号３１でコードされるポリペプチドを有し、
− 可変軽鎖ＨｕＤ１０は、配列番号３６でコードされるポリペプチドを有する。

別の実施形態によれば、前記ＲＯＲ１（ＮＴＲＫＲ１）特異的キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）は、図４に記載のＶ３、Ｖ５、およびＶ１から選択されるポリペプチド構造の１つを有し、前記ＣＡＲポリペプチドは、配列番号１１７（Ｈ１０ｖ３−ＣＡＲ配列）と、または配列番号９３（Ｄ１０ｖ３−ＣＡＲ配列）と、または配列番号９５（Ｄ１０ｖ５−ＣＡＲ配列）と、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を共有する。

ＣＡＲ構造
本発明によるＣＡＲのシグナル伝達ドメインまたは細胞内シグナリングドメインは、細胞外リガンド結合ドメインの標的への結合に続き、免疫細胞の活性化および免疫応答をもたらす細胞内シグナリングの要因である。言い換えれば、シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲを発現している免疫細胞における通常のエフェクター機能のうち、少なくとも１つの活性化の要因である。例えば、Ｔ細胞のエフェクター機能は、サイトカインの分泌を含む、細胞溶解活性またはヘルパー活性であり得る。次に、用語「シグナル伝達ドメイン」は、エフェクター信号を伝達し、細胞が特化した機能を果たすように方向付けるタンパク質の部分を指す。

ＣＡＲで用いられるシグナル伝達ドメインの好ましい例は、協調して働き、抗原レセプター連結に続くシグナル伝達を起こさせるＴ細胞レセプターおよびコレセプターの細胞質配列、ならびにこの配列のあらゆる派生物またはバリアント、および同じ機能的能力を有するあらゆる合成配列であり得る。シグナル伝達ドメインは、細胞質シグナル配列の２つの別個のクラス、すなわち抗原依存性の一次活性化を起こさせるもの、および抗原非依存的な様式で作用して二次刺激シグナルまたは共刺激シグナルを生じさせるもの、を含む。一次細胞質シグナル配列は、免疫レセプターチロシン活性化モチーフ、すなわちＩＴＡＭとして知られるシグナリングモチーフを含んでもよい。ＩＴＡＭは、ｓｙｋ／ｚａｐ７０クラスチロシンキナーゼの結合サイトとして働く種々のレセプターの細胞質内末端中に見出される、明確に画定されたシグナリングモチーフである。本発明で用いられるＩＴＡＭの例としては、非限定的な例として、ＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＦｃＲε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、およびＣＤ６６ｄ由来のものがあげられ得る。好ましい実施形態において、ＣＡＲのシグナル伝達ドメインは、アミノ酸配列（配列番号９）と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、または９９％の配列同一性を示すアミノ酸配列を有するＣＤ３ζシグナリングドメインを含み得る。

特定の実施形態において、本発明のＣＡＲのシグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル分子またはその一部を含む。共刺激分子は、効果的な免疫応答に必要とされる、抗原レセプターまたはそのリガンド以外の、細胞表面分子である。「共刺激リガンド」は、Ｔ細胞上の同族の共刺激分子と特異的に結合し、それによって、例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体とペプチドが結合したＭＨＣ分子との結合によって生じる一次シグナルに加えて、Ｔ細胞応答（増殖活性化、分化などを含むが、これらに限定されない）を媒介するシグナルを生じさせる、抗原提示細胞上の分子を指す。共刺激リガンドとしては、ＣＤ７、Ｂ７−１（ＣＤ８０）、Ｂ７−２（ＣＤ８６）、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、誘導性共刺激リガンド（ｉｇａｎｄ）（ＩＣＯＳ−Ｌ）、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ８３、ＨＬＡ−Ｇ、ＭＩＣＡ、Ｍ１ＣＢ、ＨＶＥＭ、リンホトキシンβレセプター、３／ＴＲ６、ＩＬＴ３、ＩＬＴ４、Ｔｏｌｌリガンドレセプターに結合するアゴニストまたは抗体、およびＢ７−Ｈ３と特異的に結合するリガンド、があげられ得るが、これらに限定されない。共刺激リガンドは、なかでも、Ｔ細胞上に存在する共刺激分子と特異的に結合する抗体、例えば、限定されないが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、白血球機能関連抗原１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＴＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、も包含する。

「共刺激分子」は、共刺激リガンドと特異的に結合し、それによって細胞による共刺激反応、例えば、限定されないが、増殖、を媒介するＴ細胞上の同族の結合パートナーを指す。共刺激分子としては、ＭＨＣクラスＩ分子、ＢＴＬＡ、およびＴｏｌｌリガンドレセプターがあげられるが、これらに限定されない。共刺激分子の例としては、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、白血球機能関連抗原１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、およびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドなどがあげられる。

好ましい実施形態において、本発明のＣＡＲのシグナル伝達ドメインには、４−１ＢＢ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ５３１３３．）およびＣＤ２８（ＮＰ＿００６１３０．１）のフラグメントからなる群から選択される共刺激シグナル分子またはその一部が含まれる。特に、本発明のＣＡＲのシグナル伝達ドメインは、配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

本発明によるＣＡＲは、細胞の表面膜上に発現する。よって、このようなＣＡＲは、さらに膜貫通ドメインを含む。適切な膜貫通ドメインの著しい特徴としては、細胞表面に、本発明において好ましくは免疫細胞表面に、特にリンパ球またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞表面に発現する能力、および免疫細胞の細胞応答を既定の標的細胞に対して方向付けるために互いに相互作用する能力があげられる。膜貫通ドメインは、天然起源または合成起源のいずれに由来してもよい。膜貫通ドメインは、いかなる膜結合または膜貫通タンパク質に由来してもよい。非限定的な例として、膜貫通ポリペプチドは、α、β、γ、もしくは□などのＴ細胞レセプターのサブユニット、ＣＤ３複合体を構成するポリペプチド、ＩＬ２レセプターｐ５５（α鎖）、ｐ７５（β鎖）、もしくはγ鎖、またはＦｃレセプターのサブユニット鎖であってもよく、特にＦｃγレセプターＩＩＩまたはＣＤタンパク質であってもよい。あるいは、膜貫通ドメインは、合成物であってもよく、ロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を主として含んでいてもよい。好ましい実施形態において、前記膜貫通ドメインは、ヒトＣＤ８α鎖（例えば、ＮＰ＿００１１３９３４５．１）由来である。膜貫通ドメインは、前記細胞外リガンド結合ドメインと前記膜貫通ドメインとの間にヒンジ領域をさらに含んでいてもよい。本明細書で用いられる用語「ヒンジ領域」は、一般に、膜貫通ドメインを細胞外リガンド結合ドメインに結合させる機能を果たすあらゆるオリゴペプチドまたはポリペプチドを意味する。特に、ヒンジ領域は、細胞外リガンド結合ドメインにさらなる柔軟性と接近性を与えるために用いられる。ヒンジ領域は、アミノ酸を、３００アミノ酸まで、好ましくは１０〜１００アミノ酸、最も好ましくは２５〜５０アミノ酸含んでいてもよい。ヒンジ領域は、天然型分子の全体もしくは一部、例えば、ＣＤ８、ＣＤ４もしくはＣＤ２８の細胞外領域の全体もしくは一部、または抗体の定常領域の全体もしくは一部に由来していてもよい。あるいは、ヒンジ領域は、天然型ヒンジ配列に対応する合成配列であってもよく、完全な合成ヒンジ配列であってもよい。好ましい実施形態において、前記ヒンジドメインには、本明細書において、それぞれ配列番号３、配列番号４、および配列番号５、またはこれらのポリペプチドと好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、もしくは９９％の配列同一性を示すヒンジポリペプチドと呼ばれる、ヒトＣＤ８α鎖、ＦｃγＲＩＩＩαレセプター、またはＩｇＧ１の部分が含まれる。

本発明によるＣＡＲには、一般に、膜貫通ドメイン（ＴＭ）、とりわけ配列番号６または７のポリペプチドに対して同一性を示す、ＣＤ８αおよび４−１ＢＢから選択される膜貫通ドメイン（ＴＭ）がさらに含まれる。配列番号６のＣＤ８αＴＭが好ましい。

好ましい実施形態によれば、ＲＯＲ１特異的ＣＡＲは、図４に記載のＶ３、Ｖ５、およびＶ１から選択されるポリペプチド構造を有し、前記構造は、モノクローナル抗ＲＯＲ１抗体由来のＶＨおよびＶＬを含む細胞外リガンド結合ドメイン、ＣＤ８αヒンジ、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ならびに４−１ＢＢ由来のＣＤ３ζシグナリングドメインおよび共刺激ドメインを含む細胞質ドメイン、を含む。

別の好ましい実施形態によれば、ＲＯＲ１特異的ＣＡＲは、図４に記載のＶ３、Ｖ５、およびＶ１から選択されるポリペプチド構造を有し、前記構造は、モノクローナル抗ＲＯＲ１抗体由来のＶＨおよびＶＬを含む細胞外リガンド結合ドメイン、ＩｇＧ１ヒンジ、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ならびに４−１ＢＢ由来のＣＤ３ζシグナリングドメインおよび共刺激ドメインを含む細胞質ドメイン、を含む。

好ましい実施形態によれば、ＲＯＲ１特異的ＣＡＲは、図４に記載のＶ３、Ｖ５、およびＶ１から選択されるポリペプチド構造を有し、前記構造は、モノクローナル抗ＲＯＲ１抗体由来のＶＨおよびＶＬを含む細胞外リガンド結合ドメイン、ＦｃγＲＩＩＩαヒンジ、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ならびに４−１ＢＢ由来のＣＤ３ζシグナリングドメインおよび共刺激ドメインを含む細胞質ドメイン、を含む。

表３〜８に、６つのバージョンであるＶ１〜Ｖ６の全てのＣＡＲ構造を示す。
標的抗原のダウンレギュレーションまたは変異は、がん細胞で一般的に観察され、抗原喪失エスケープバリアントを生じさせる。よって、腫瘍エスケープを相殺し、免疫細胞を標的に対してより特異的にさせるために、本発明によるＲＯＲ１特異的ＣＡＲは、別の細胞外リガンド結合ドメインを含み、標的中の異なる要素を同時に結合することによって、免疫細胞の活性および機能を増強してもよい。一実施形態において、細胞外リガンド結合ドメインは、同じ膜貫通ポリペプチドにタンデムに配置されていてもよく、場合により、リンカーで隔てられていてもよい。別の実施形態において、種々の前記細胞外リガンド結合ドメインは、ＣＡＲを構成する種々の膜貫通ポリペプチドに配置されていてもよい。別の実施形態において、本発明は、それぞれが異なる細胞外リガンド結合ドメインを含むＣＡＲ集団に関する。特に、本発明は、免疫細胞を準備することと、前記細胞の表面に、それぞれが異なる細胞外リガンド結合ドメインを含むＣＡＲ集団を発現させることとを含む免疫細胞の遺伝子操作方法に関する。別の特定の実施形態において、本発明は、免疫細胞を準備することと、前記細胞内に、それぞれが異なる細胞外リガンド結合ドメインを含むＣＡＲ集団を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入することと含む、免疫細胞の遺伝子操作方法に関する。ＣＡＲ集団とは、それぞれが異なる細胞外リガンド結合ドメインを含む、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、または６超のＣＡＲを指す。本発明による異なる細胞外リガンド結合ドメインは、好ましくは標的中の異なる要素を同時に結合することによって、免疫細胞の活性および機能を増強してもよい。本発明は、それぞれが異なる細胞外リガンド結合ドメインを含むＣＡＲ集団を含む、単離された免疫細胞にも関する。

ポリヌクレオチドおよびベクター
本発明は、上記の本発明によるＣＡＲをコードするポリヌクレオチドおよびベクターにも関する。

ポリヌクレオチドは、発現カセットまたは発現ベクター（例えば、バクテリア宿主細胞への導入のためのプラスミド、または昆虫宿主細胞のトランスフェクションのためのバキュロウイルスベクターなどのウイルスベクター、またはプラスミドもしくは哺乳動物宿主細胞のトランスフェクションのためのレンチウイルスなどのウイルスベクター）中に存在してもよい。

特定の実施形態において、種々の核酸配列は、２Ａペプチドをコードする配列などのリボソームスキップ配列をコードする核酸配列を含む、１つのポリヌクレオチドまたはベクター中に含まれてもよい。ピコルナウイルスのサブグループであるアフトウイルスで同定された２Ａペプチドは、あるコドンから次のコドンへのリボソーム「スキップ」を、それらのコドンによってコードされる２つのアミノ酸の間にペプチド結合を形成させることなく起こさせる（（ＤｏｎｎｅｌｌｙおよびＥｌｌｉｏｔｔ、２００１；Ａｔｋｉｎｓ，Ｗｉｌｌｓら、２００７；Ｄｏｒｏｎｉｎａ，Ｗｕら、２００８）を参照のこと）。「コドン」とは、リボソームによって１つのアミノ酸残基に翻訳されるｍＲＮＡ上の（またはＤＮＡ分子のセンス鎖上の）３個のヌクレオチドを指す。よって、２つのポリペプチドは、それらのポリペプチドがインフレームの２Ａオリゴペプチド配列によって分けられている場合、ｍＲＮＡ内にある単一の、連続したオープンリーディングフレームから合成され得る。このようなリボソームスキップのメカニズムは、本技術分野でよく知られており、単一のメッセンジャーＲＮＡによってコードされるいくつかのタンパク質を発現させるためのいくつかのベクターで用いられることが知られている。

膜貫通ポリペプチドを宿主細胞の分泌経路に方向付けるために、分泌シグナル配列（リーダー配列、プレプロ配列、またはプレ配列としても知られる）が、ポリヌクレオチド配列またはベクター配列中に設けられる。分泌シグナル配列は、膜貫通核酸配列に作動可能に連結され、すなわち、２つの配列は、正しいリーディングフレーム中に接合され、新たに合成されたポリペプチドを宿主細胞の分泌経路に方向付けるように配置される。分泌シグナル配列は、一般的に、対象となるポリペプチドをコードする核酸配列に対して５’側に位置するが、ある特定の分泌シグナル配列は、対象となる核酸配列中の他の場所に位置し得る（例えば、Ｗｅｌｃｈら、米国特許第５，０３７，７４３号明細書；Ｈｏｌｌａｎｄら、米国特許第５，１４３，８３０号明細書を参照のこと）。好ましい実施形態において、シグナルペプチドは、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列を含む。

当業者は、遺伝暗号の縮重の観点から、これらのポリヌクレオチド分子間でかなりの配列変動が起こり得ることを認識するであろう。好ましくは、本発明の核酸配列は、哺乳動物細胞での発現に、好ましくはヒト細胞での発現にコドン最適化される。コドン最適化は、対象の配列において、所定の種で高発現している遺伝子において通常低頻度なコドンを、そのような種で高発現している遺伝子において通常高頻度なコドンと交換することを指し、そのようなコドンは、交換されるコドンと同じアミノ酸をコードしている。

ＣＡＲを有する免疫細胞の遺伝子操作方法
本発明は、免疫療法のための免疫細胞の調製方法であって、前記免疫細胞に、上記で説明したＲＯＲ１ＣＡＲの１つをコードするポリヌクレオチドまたはベクターをｅｘ−ｖｉｖｏで導入することを含む、方法を包含する。

好ましい実施形態において、免疫細胞における安定的発現という観点から、前記ポリヌクレオチドはレンチウイルスベクター中に含まれる。

さらなる実施形態によれば、前記方法は、前記細胞を遺伝子改変し、同種異系の移植により適切なものにするステップをさらに含む。

第１の態様によれば、免疫細胞を、例えば、国際公開第２０１３／１７６９１５号パンフレットに記載されているように、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）の１つまたは複数の構成部分を発現する、少なくとも１つの遺伝子を不活性化することによって、同種異系とすることができ、これをＨＬＡもしくはβ２ｍタンパク質をコードするまたはＨＬＡもしくはβ２ｍタンパク質の発現を調節する遺伝子の不活性化と組み合わせてもよい。これにより、移植片対宿主症候群および移植片拒絶反応のリスクは著しく減少する。

別の態様によれば、免疫細胞は、ＲＯＲ１陽性悪性細胞を治療するための標準ケアとして用いられる免疫抑制薬または化学療法治療に対する耐性を向上させるために、さらに遺伝子操作してもよい。例えば、Ｃａｍｐａｔｈ（アレムツズマブ）および糖質コルチコイド治療の薬物標的であるＣＤ５２および糖質コルチコイドレセプター（ＧＲ）を不活性化し、細胞をこれらの治療に対して耐性にし、特異的ＲＯＲ１ＣＡＲを有さない患者自身のＴ細胞に対する競争優位性を与えてもよい。ＣＤ３遺伝子の発現を抑制または減少させ、別の免疫抑制薬であるＴｅｐｌｉｚｕｍａｂに対する耐性を付与してもよい。ＨＰＲＴの発現を本発明によって抑制または減少させ、特に急性リンパ芽球性（ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｉｃ）白血病の治療のための化学療法に一般的に用いられる細胞分裂阻害剤である、６−チオグアニンに対する耐性を付与してもよい。

本発明のさらなる態様によれば、免疫細胞をさらに操作し、Ｔ細胞活性化の調節因子として働く「免疫チェックポイント」として機能するタンパク質、例えばＰＤＣＤ１またはＣＴＬＡ−４、をコードする遺伝子を不活性化することによって、免疫細胞をさらに活性化し、または疲弊を限定することができる。発現が減少し、または抑制され得る遺伝子の例を表９に示す。

好ましい実施形態において、免疫細胞をさらに遺伝子操作する前記方法は、前記Ｔ細胞内に、特異的レアカットエンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド（特にｍＲＮＡ）を導入して、ＤＮＡ切断によって、上記したような遺伝子を選択的に不活性化することを含む。より好ましい実施形態において、前記レアカットエンドヌクレアーゼは、ＴＡＬＥヌクレアーゼまたはＣａｓ９エンドヌクレアーゼである。ＴＡＬヌクレアーゼは、特異性および切断効率が、他の種類のレアカットエンドヌクレアーゼと比べてより高いことがこれまでに立証されており、よってＴＡＬヌクレアーゼは、ターンオーバーが一定なラージスケールでの、遺伝子操作された免疫細胞の産生のための一般的に好まれるエンドヌクレアーゼである。

送達方法
上記の種々の方法は、細胞内へのＣＡＲの導入を含む。非限定的な例として、前記ＣＡＲは、１個のプラスミドベクターにコードされた導入遺伝子として導入することができる。前記プラスミドベクターは、前記ベクターが導入された細胞の同定および／または選択を実現する選択マーカーも含み得る。

ポリペプチドは、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを細胞内に導入した結果として、細胞内でｉｎ ｓｉｔｕで合成し得る。あるいは、前記ポリペプチドは、細胞外で産生させ、細胞内に導入することができる。ポリヌクレオチド構築物を細胞内に導入する方法は本技術分野で知られており、非限定的な例として、ポリヌクレオチド構築物が細胞ゲノム中に組み込まれる安定的な形質転換方法、ポリヌクレオチド構築物が細胞ゲノム中に組み込まれない一過性の形質転換方法、およびウイルス媒介方法があげられる。前記ポリヌクレオチドは、例えば、組換えウイルスベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス）、リポソームなどによって細胞内に導入してもよい。例えば、一過性の形質転換方法としては、例えば、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、またはパーティクル・ガン法があげられる。前記ポリヌクレオチドは、細胞内発現の観点から、ベクター、なかでも、プラスミドまたはウイルスに含まれてもよい。

遺伝子操作された免疫細胞
本発明は、細胞の遺伝子操作方法によって得ることができる単離細胞または細胞系にも関する。特に、前記単離細胞は、上記で説明した少なくとも１つのＣＡＲを含む。別の実施形態において、前記単離細胞は、それぞれが異なる細胞外リガンド結合ドメインを含むＣＡＲ集団を含む。特に前記単離細胞は、ＣＡＲをコードする外来性のポリヌクレオチド配列を含む。本発明の遺伝子改変免疫細胞は、抗原結合メカニズムとは無関係に、活性化され、増殖する。

本発明の範囲には、単離された免疫細胞、好ましくは上記で説明した方法のいずれか１つによって得たＴ細胞も含まれる。前記免疫細胞は、機能として自然免疫応答および／または適応免疫応答の開始および／または実行にかかわる造血細胞起源の細胞を指す。本発明による前記免疫細胞は、幹細胞由来であってもよい。幹細胞は、成体幹細胞、非ヒト胚性幹細胞、なかでも、非ヒト幹細胞、臍帯血幹細胞、前駆細胞、骨髄幹細胞、誘導多能性幹細胞、全能性幹細胞または造血幹細胞であり得る。代表的なヒト細胞は、ＣＤ３４＋細胞である。前記単離細胞は、樹状細胞、キラー樹状細胞、マスト細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、または炎症性Ｔリンパ球、細胞障害性Ｔリンパ球、調節性Ｔリンパ球、もしくはヘルパーＴリンパ球からなる群から選択されるＴ細胞でもあり得る。別の実施形態において、前記細胞は、ＣＤ４＋Ｔリンパ球およびＣＤ８＋Ｔリンパ球からなる群に由来してもよい。本発明の細胞の増殖および遺伝子改変に先立って、細胞の起源は、種々の非限定的な方法によって対象から得ることができる。細胞は、末梢血単核球、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位の組織、腹水、胸膜滲出液、脾臓組織、および腫瘍を含む多くの非限定的な起源から得ることができる。本発明のある特定の実施形態において、利用可能でかつ当業者に知られている多くのＴ細胞系を使用することができる。別の実施形態において、前記細胞は、健康なドナー由来、がんと診断された患者由来、または感染症と診断された患者由来であり得る。別の実施形態において、前記細胞は、種々の表現型上の特徴を示す細胞の混合集団の一部である。本発明の範囲には、上記で説明した方法によって形質転換したＴ細胞から得た細胞系も含まれる。免疫抑制治療に耐性があり、上記の方法で得ることができる改変細胞は、本発明の範囲に含まれる。

好ましい実施形態として、本発明は、患者への同種異系の移植のための、上記で説明したＲＯＲ１ＣＡＲを有するＴ細胞またはＴ細胞集団を提供し、該Ｔ細胞またはＴ細胞集団は、機能性ＴＣＲを発現せず、ＲＯＲ１陽性細胞に対して反応性である。

Ｔ細胞の活性化および増殖
Ｔ細胞の遺伝子改変の前または後のいずれかにおいて、本発明の遺伝子改変免疫細胞が抗原結合メカニズムとは無関係に活性化され、増殖するにしても、免疫細胞、特に本発明のＴ細胞は、一般に、例えば、米国特許第６，３５２，６９４号明細書；米国特許第６，５３４，０５５号明細書；米国特許６，９０５，６８０号明細書；米国特許６，６９２，９６４号明細書；米国特許５，８５８，３５８号明細書；米国特許６，８８７，４６６号明細書；米国特許６，９０５，６８１号明細書；米国特許７，１４４，５７５号明細書；米国特許７，０６７，３１８号明細書；米国特許７，１７２，８６９号明細書；米国特許７，２３２，５６６号明細書；米国特許７，１７５，８４３号明細書；米国特許５，８８３，２２３号明細書；米国特許６，９０５，８７４号明細書；米国特許６，７９７，５１４号明細書；米国特許６，８６７，０４１号明細書；および米国特許出願公開第２００６０１２１００５号明細書、に記載された方法によって、さらに活性化され、増殖し得る。Ｔ細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで増殖し得る。

一般に、本発明のＴ細胞は、Ｔ細胞表面のＣＤ３ＴＣＲ複合体および共刺激分子を刺激し、Ｔ細胞活性化シグナルを生じさせる薬剤との接触によって増殖する。例えば、カルシウムイオノフォアＡ２３１８７、ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）、またはフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）のようなマイトジェンレクチンなどの化学物質を、Ｔ細胞活性化シグナルを生じさせるために使用し得る。

非限定的な例として、Ｔ細胞集団は、例えば、抗ＣＤ３抗体、もしくはその抗原結合フラグメント、または表面に固定化された抗ＣＤ２抗体との接触により、またはカルシウムイオノフォアならびにプロテインキナーゼＣ活性化因子（例えば、ブリオスタチン）との接触により、ｉｎ ｖｉｔｒｏで刺激され得る。Ｔ細胞表面上の補助分子の同時刺激ために、補助分子を結合するリガンドが用いられる。例えば、Ｔ細胞増殖を刺激するのに適切な条件下で、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体と、Ｔ細胞集団とを接触させてもよい。Ｔ細胞の培養に適切な条件には、増殖および生存能に必要な因子を含有し得る適切な培地（例えば、最小必須培地またはＲＰＭＩ１６４０培地もしくはＸ−ｖｉｖｏ５（Ｌｏｎｚａ社））が含まれ、該因子としては、血清（例えば、ウシ胎仔血清またはヒト血清）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インシュリン、ＩＦＮ−ｇ、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＴＧＦｐ、およびＴＮＦ−、または当業者に知られている細胞成長のための他のあらゆる添加物があげられる。細胞成長のための他の添加物としては、界面活性剤、プラスマネート、ならびにＮ−アセチルシステインおよび２−メルカプトエタノール（ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｉ）などの還元剤があげられるが、これらに限定されない。培地としては、ＲＰＭＩ１６４０、Ａ１Ｍ−Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ａ−ＭＥＭ、Ｆ−１２、Ｘ−Ｖｉｖｏ１、およびＸ−Ｖｉｖｏ２０があげられ、オプティマイザー、添加したアミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、およびビタミンを含み、無血清であるか、または適切な量の血清（または血漿）、もしくは定められたホルモン群、ならびに／またはＴ細胞の成長および増殖に十分な量のサイトカイン（単数または複数）が添加されているか、のいずれかであり得る。抗生物質、例えばペニシリンおよびストレプトマイシンは、実験における培養物のみに含まれ、対象に注入する細胞の培養物には含まれない。標的細胞は、成長に必要な条件、例えば適切な温度（例えば３７℃）および雰囲気（例えば空気＋５％ＣＯ_２）に保持する。刺激にさらされた時間が異なるＴ細胞は、異なる特徴を示し得る。

別の特定の実施形態において、前記細胞は、組織または細胞との共培養によって増殖させてもよい。前記細胞は、また、ｉｎ ｖｉｖｏで、例えば前記細胞を対象に投与した後に対象の血液中で増殖させてもよい。

治療への適用
別の実施形態において、種々の方法によって得られた単離細胞、または上記で説明した前記単離細胞に由来する細胞系を、医薬として使用することができる。別の実施形態において、前記医薬は、治療を必要とする患者のがんの治療、特にＢ細胞リンパ腫および白血病の治療に使用することができる。別の実施形態において、本発明による前記単離細胞または前記単離細胞由来の細胞系は、治療を必要とする患者のがんの治療ための医薬の製造に使用することができる。

別の態様において、本発明は、治療を必要とする患者の治療方法に基づき、前記方法は、下記ステップの少なくとも１つを含む：
（ａ）上記で説明した方法のいずれか１つによって得ることができる免疫細胞を準備するステップ、
（ｂ）前記患者に形質転換した前記免疫細胞を投与するステップ。

一実施形態によれば、本発明の前記Ｔ細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで盛んなＴ細胞増殖を起こし得、長時間にわたって生き続け得る。

前記治療は、寛解的であり得、治癒的であり得、または予防的であり得る。前記治療は、自己免疫療法治療の一部、または同種異系免疫療法治療の一部のいずれかであり得る。自己とは、患者を治療するために使用される細胞、細胞系、または細胞集団が、前記患者またはヒト白血球抗原（ＨＬＡ）適合ドナー由来であることを指す。同種異系とは、患者を治療するために使用される細胞、または細胞集団が、前記患者由来ではなく、ドナー由来であることを指す。

開示された方法で使用し得る細胞については、上記のセクションで説明されている。前記治療は、ＲＯＲ１発現細胞、特にＲＯＲ１発現細胞が過剰であることによって特徴づけられる前悪性または悪性のがん状態と診断された患者を治療するために使用し得る。このような状態は、白血病または悪性リンパ増殖性障害などの血液がんで見られる。

白血病は、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成（ｍｅｌｏｄｙｓｐｌａｓｔｉｃ）症候群、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、および骨髄異形成症候群であり得る。

リンパ増殖性障害は、リンパ腫、特に慢性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、および濾胞性リンパ腫（小細胞性および大細胞性）であり得る。

好ましい一実施形態によれば、前記遺伝子操作Ｔ細胞は、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、または小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）の治療のために提供される。

別の好ましい実施形態によれば、ＣＬＬまたはＳＬＬの前記治療は、ＲＯＲ１−ＣＡＲ−Ｔ細胞注入の前にリンパ球枯渇にされた患者に施される。前記リンパ球枯渇は、通常、化学療法によって、好ましくはフルダラビン（Ｆ）、シクロホスファミド（Ｃ）、ベンダムスチン（Ｂ）、もしくはリツキシマブ（Ｒ）、またはこれらの組み合わせなどの薬物を使用して実施される。典型的には、εＲまたはＦＢＲの組み合わせを、ＣＡＲ−Ｔ細胞投与前のリンパ球枯渇のために使用し得る。

別の好ましい実施形態によれば、前記遺伝子操作Ｔ細胞は、ｔ（１；１９）染色体転座を伴うマントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）の治療のために提供される。

治療され得るがんには、非充実性腫瘍が含まれ得る（例えば、血液系腫瘍であり、プレＢ ＡＬＬ（ｐｒｅ−Ｂ ＡＬＬ）（小児（ｐｅｄｒｉａｔｉｃ）適応症）、成人ＡＬＬ、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫などがあげられるが、これらに限定されない。本発明のＣＡＲで治療されるがんの種類としては、白血病またはリンパ性悪性腫瘍があげられるが、これらに限定されない。成人腫瘍／がんおよび小児腫瘍／がんも含まれる）。

また、乳房、結腸、肺、および腎臓腫瘍などの充実性腫瘍も、本発明のＣＡＲで治療できる。また、本発明の遺伝子操作Ｔ細胞も、膵臓、腎臓、または卵巣がんの治療剤として使用できる。

本発明による遺伝子操作された免疫細胞を用いた治療剤は、抗体療法、化学療法、サイトカイン療法、樹状細胞療法、遺伝子療法、ホルモン療法、レーザー光線療法、放射線療法からなる群から選択される１種または複数のがん療法と組み合わせてもよい。

本発明の好ましい実施形態によれば、前記治療剤は、免疫抑制治療中の患者に投与してもよい。実際に、好ましくは本発明は、免疫抑制剤の少なくとも１つに対する耐性を、該免疫抑制剤のレセプターをコードする遺伝子を不活性化することによって獲得した細胞または細胞集団に依存している。この態様において、免疫抑制治療は、患者の体内における本発明によるＴ細胞の選択および増殖を促進すべきである。

本発明による細胞または細胞集団は、エアゾール吸入、注射、摂取、輸液、インプラント、または移植を含む、あらゆる便宜な様式で投与し得る。本明細書に記載の組成物は、患者に、皮下経路、皮内経路、腫瘍内経路、リンパ節内経路、髄内経路、筋肉内経路、静脈内もしくはリンパ管内注射、または腹腔内経路で投与し得る。一実施形態において、本発明の細胞組成物は、好ましくは静脈注射で投与する。

細胞または細胞集団の投与は、１０^４〜１０^９細胞／ｋｇ体重の投与、好ましくは１０^５〜１０^６細胞／ｋｇ体重の投与、この範囲に含まれるあらゆる整数値の細胞数を含む投与からなり得る。細胞または細胞集団は、単回投薬または複数回投薬で投与し得る。別の実施形態において、前記有効量の細胞は、単回投薬として投与する。別の実施形態において、前記有効量の細胞は、ある期間にわたって、複数回投薬として投与する。投与のタイミングは、管理する医師の判断内であり、かつ患者の臨床状態に依存する。細胞または細胞集団は、血液バンクまたはドナーなどのあらゆる供給源から得ることができる。個々に必要なものは異なるが、特定の疾患または状態のための、所定の細胞のタイプに関する有効量の最適範囲の決定は、本技術分野の技術の範囲である。有効量とは、治療的または予防的な利益を生じさせる量を意味する。投与する用量は、レシピエントの年齢、健康状態、および体重、もしあれば併用療法の種類、治療の頻度ならびに所望とされる効果の性質に依存するであろう。

別の実施形態において、有効量の前記細胞またはその細胞を含む組成物は、非経口的に投与する。前記投与は、静脈内投与であってもよい。腫瘍中に注射することによって直接投与してもよい。

本発明のある特定の実施形態において、細胞は、多くの関連する治療方法と組み合わせて（例えば、事前に、同時に、または事後に）患者に投与され、該関連する治療方法には、抗ウイルス療法、すなわちシドフォビルおよびインターロイキン−２、シタラビン（ＡＲＡ−Ｃとしても知られている）、ＭＳ患者に対するナタリズマブ（ｎａｔａｌｉｚｉｉｍａｂ）治療、乾癬患者に対するエファリズマブ（ｅｆａｌｉｚｔｉｍａｂ）治療、またはＰＭＬ患者に対するその他の治療などの薬剤を用いた治療が含まれるが、これらに限定されない。さらなる実施形態において、本発明のＴ細胞は、化学療法、放射線照射、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸、およびＦＫ５０６などの免疫抑制剤、抗体、またはＣＡＭＰＡＴＨなどの免疫除去剤、抗ＣＤ３抗体もしくはその他の抗体療法、サイトキシン（Ｃｙｔｏｘｉｎ）、フルダラビン（ｆｌｕｄａｒｉｂｉｎｅ）、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール（ｍｙｃｏｐｌｉｅｎｏｌｉｃ）酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、サイトカインならびに照射と組み合わせて使用し得る。これらの薬物は、カルシウム依存性ホスファターゼであるカルシニューリン（シクロスポリンおよびＦＫ５０６）、または成長因子誘発シグナル伝達に重要なｐ７０Ｓ６キナーゼ（ラパマイシン）のいずれかを阻害する（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，Ｎａｙａら、１９９１；Ｌｉｕ，Ａｌｂｅｒｓら、１９９２；Ｂｉｅｒｅｒ，Ｈｏｌｌａｎｄｅｒら、１９９３）。さらなる実施形態において、本発明の細胞組成物は、骨髄移植か、またはフルダラビンなどの化学療法剤、体外照射放射線療法（ＸＲＴ）、シクロホスファミド、またはＯＫＴ３もしくはＣＡＭＰＡＴＨなどの抗体を用いたＴ細胞除去療法か、いずれかと組み合わせて（例えば、事前に、同時に、または事後に）患者に投与される。別の実施形態において、本発明の細胞組成物は、ＣＤ２０と反応する薬剤、例えばリツキサンなどのＢ細胞除去療法に続いて投与される。例えば、一実施形態において、対象は、高用量化学療法による標準治療を受け、続いて末梢血幹細胞移植を受けてもよい。ある特定の実施形態において、移植に続いて、対象は、増殖させた本発明の免疫細胞を注入される。追加の実施形態において、増殖させた細胞は、手術の前、または後に投与される。

その他の定義
− 別段の定めがない限り、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、「その（ｔｈｅ）」、および「少なくとも１つ」は、互換的に用いられ、１または１超を意味する。ポリペプチド配列中のアミノ酸残基は、本明細書において１文字コードによって指定され、この１文字コードにおいて、例えば、Ｑは、Ｇｌｎまたはグルタミン残基を意味し、Ｒは、Ａｒｇまたはアルギニン残基を意味し、そしてＤは、Ａｓｐまたはアスパラギン酸残基を意味する。

− アミノ酸置換は、１アミノ酸残基の別のアミノ酸残基との交換を意味し、例えば、ペプチド配列中のアルギニン残基のグルタミン残基との交換は、アミノ酸置換である。

− ヌクレオチドは、以下のように指定される。１文字コードが、ヌクレオチドの塩基を指定するために用いられる：ａはアデニン、ｔはチミン、ｃはシトシン、およびｇはグアニンである。縮重ヌクレオチドに関し、ｒは、ｇまたはａ（プリンヌクレオチド）を表し、ｋは、ｇまたはｔを表し、ｓは、ｇまたはｃを表し、ｗは、ａまたはｔを表し、ｍは、ａまたはｃを表し、ｙは、ｔまたはｃ（ピリミジンヌクレオチド）を表し、ｄは、ｇ、ａ、またはｔを表し、ｖは、ｇ、ａ、またはｃを表し、ｂは、ｇ、ｔ、またはｃを表し、ｈは、ａ、ｔ、またはｃを表し、そしてｎは、ｇ、ａ、ｔ、またはｃを表す。

− 本明細書で使用する場合、「核酸」または「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチドおよび／またはポリヌクレオチドを指し、例えばデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって生じた断片、ならびにライゲーション、切断、エンドヌクレアーゼの作用、およびエキソヌクレアーゼの作用のいずれかによって生じた断片などである。核酸分子は、天然型ヌクレオチド（ＤＮＡおよびＲＮＡなど）、もしくは天然型ヌクレオチドのアナログ（例えば、天然型ヌクレオチドのエナンチオマー形態）、または両者の組み合わせであるモノマーから構成され得る。改変ヌクレオチドは、糖部分に、および／またはピリミジンまたはプリン塩基部分に変化を有していてもよい。糖の改変としては、例えば、１つまたは複数のヒドロキシル基の、ハロゲン、アルキル基、アミンおよびアジド基による置換があげられ、または、糖は、エーテルもしくはエステルとして官能化されていてもよい。さらに、糖部分全体が、立体的および電気的に類似した構造、例えばアザ糖および炭素環式糖アナログで置換されていてもよい。塩基部分の改変の例としては、アルキル化されたプリンおよびピリミジン、アシル化されたプリンまたはピリミジン、またはその他のよく知られた複素環式置換基があげられる。核酸モノマーは、ホスホジエステル結合、またはホスホジエステル結合のアナログによって連結され得る。核酸は、一本鎖または二本鎖のいずれであってもよい。

− キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）とは、特異的抗標的細胞免疫活性を示すキメラタンパク質を生成させるための、標的細胞上に存在する構成部分に対する（例えば、所望の抗原（例えば、腫瘍抗原）に対する抗体由来の特異性）結合ドメインと、Ｔ細胞レセプター活性化細胞内ドメインとを合わせ持つ分子を指す。一般に、ＣＡＲは、Ｔ細胞抗原レセプター複合体ζ鎖の細胞内シグナリングドメインと融合した細胞外一本鎖抗体（ｓｃＦｖＦｃ）からなり（ｓｃＦｖＦｃ：ζ）、Ｔ細胞内で発現させた場合、モノクローナル抗体の特異性に基づく抗原認識を再方向付けする能力を有する。本発明で用いられるＣＡＲの一例は、ＲＯＲ１抗原に対するＣＡＲであり、非限定的な例として、配列番号７９〜１３８のアミノ酸配列を含み得る。

− 用語「エンドヌクレアーゼ」は、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子、好ましくはＤＮＡ分子内の核酸と核酸の間の結合の加水分解（切断）を触媒できる、あらゆる野生型酵素またはバリアント酵素を指す。エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子を、その配列と無関係には切断しないが、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子を特異的なポリヌクレオチド配列で認識かつ切断し、該特異的なポリヌクレオチド配列を「標的配列」または「標的サイト」とも呼ぶ。エンドヌクレアーゼは、典型的には、ポリヌクレオチド認識サイトの長さが１２塩基対（ｂｐ）超、より好ましくは１４〜５５ｂｐである場合、レアカットエンドヌクレアーゼとして分類される。レアカットエンドヌクレアーゼは、所定の位置におけるＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘発することにより、ＨＲを著しく増大させる（Ｐｅｒｒｉｎ，Ｂｕｃｋｌｅら、１９９３；Ｒｏｕｅｔ，Ｓｍｉｈら、１９９４；Ｃｈｏｕｌｉｋａ，Ｐｅｒｒｉｎら、１９９５；ＰｉｎｇｏｕｄおよびＳｉｌｖａ、２００７）。レアカットエンドヌクレアーゼは、例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼ（ＰａｑｕｅｓおよびＤｕｃｈａｔｅａｕ、２００７）、遺伝子操作ジンクフィンガードメインと、ＦｏｋＩなどの制限酵素の触媒ドメインとの融合により得られるキメラジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）（ＰｏｒｔｅｕｓおよびＣａｒｒｏｌｌ、２００５）、ＣＲＩＳＰＲシステム由来のＣａｓ９エンドヌクレアーゼ（Ｇａｓｉｕｎａｓ，Ｂａｒｒａｎｇｏｕら、２０１２；Ｊｉｎｅｋ，Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉら、２０１２；Ｃｏｎｇ，Ｒａｎら、２０１３；Ｍａｌｉ，Ｙａｎｇら、２０１３）、または化学的エンドヌクレアーゼ（Ｅｉｓｅｎｓｃｈｍｉｄｔ，Ｌａｎｉｏら、２００５；Ａｒｉｍｏｎｄｏ，Ｔｈｏｍａｓら、２００６）であり得る。化学的エンドヌクレアーゼにおいて、化学的またはペプチド性切断因子が、特異的な標的配列を認識する核酸のポリマーまたは別のＤＮＡのいずれかに連結され、それによって切断活性が特異的な配列に標的化される。化学的エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ切断分子であるｏ−フェナントロリンと、特異的なＤＮＡ配列と結合することが知られている三重鎖形成性オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）とのコンジュゲートのような、合成ヌクレアーゼも包含する（ＫａｌｉｓｈおよびＧｌａｚｅｒ、２００５）。このような化学的エンドヌクレアーゼは、本発明による用語「エンドヌクレアーゼ」に含まれる。

− 「ＴＡＬＥヌクレアーゼ」（ＴＡＬＥＮ）とは、典型的には転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）に由来する核酸結合ドメインと、核酸の標的配列を切断する１つのヌクレアーゼ触媒ドメインとからなる融合タンパク質を意図する。触媒ドメインは、好ましくはヌクレアーゼドメイン、より好ましくは、例えばＩ−ＴｅｖＩ、ＣｏｌＥ７、ＮｕｃＡおよびＦｏｋ−Ｉのようなエンドヌクレアーゼ活性を有するドメインである。特定の実施形態において、ＴＡＬＥドメインは、例えばＩ−ＣｒｅＩおよびＩ−ＯｎｕＩ、またはその機能性バリアントのようなメガヌクレアーゼに融合していてもよい。より好ましい実施形態において、前記ヌクレアーゼは、単量体ＴＡＬＥヌクレアーゼである。単量体ＴＡＬＥヌクレアーゼは、特異的な認識および切断のために二量体形成が不要なＴＡＬＥヌクレアーゼであり、例えば国際公開第２０１２１３８９２７号パンフレットに記載の、遺伝子操作ＴＡＬリピートとＩ−ＴｅｖＩの触媒ドメインとの融合物などである。転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）は、バクテリア種であるＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓに由来する、複数の反復配列を含むタンパク質であり、各反復配列は、核酸の標的配列の各ヌクレオチド塩基に特異的な、１２位および１３位の２残基（ＲＶＤ）を含む。類似のモジュラー塩基対塩基核酸結合（ＭＢＢＢＤ）特性を有する結合ドメインもまた、本出願人によって異なるバクテリア種で先頃発見された、新たなモジュラータンパク質から得ることができる。この新たなモジュラータンパク質は、ＴＡＬリピートよりも多くの配列多様性を示すという利点を有する。好ましくは、種々のヌクレオチドの認識に関連するＲＶＤは、Ｃの認識にはＨＤ、Ｔの認識にはＮＧ、Ａの認識にはＮＩ、Ｇ、またはＡの認識にはＮＮ、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴの認識にはＮＳ、Ｔの認識にはＨＧ、Ｔの認識にはＩＧ、Ｇの認識にはＮＫ、Ｃの認識にはＨＡ、Ｃの認識にはＮＤ、Ｃの認識にはＨＩ、Ｇの認識にはＨＮ、Ｇの認識にはＮＡ、Ｇ、またはＡの認識にはＳＮ、Ｔの認識にはＹＧ、Ａの認識にはＴＬ、ＡまたはＧの認識にはＶＴ、およびＡの認識にはＳＷである。別の実施形態において、決定的なアミノ酸１２および１３を、ヌクレオチドＡ、Ｔ、Ｃ、およびＧに対する特異性を調節するために、特にこの特異性を高めるために、他のアミノ酸残基に変異させてもよい。ＴＡＬＥヌクレアーゼは、遺伝子ターゲティングおよび遺伝子改変を促進するために、既に記載され、使用されている（Ｂｏｃｈ，Ｓｃｈｏｌｚｅら、２００９；ＭｏｓｃｏｕおよびＢｏｇｄａｎｏｖｅ、２００９；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ，Ｃｅｒｍａｋら、２０１０；Ｌｉ，Ｈｕａｎｇら、２０１１）。特注のＴＡＬヌクレアーゼが、商品名ＴＡＬＥＮ（商標）で市販されている（Ｃｅｌｌｅｃｔｉｓ，８ ｒｕｅ ｄｅ ｌａ Ｃｒｏｉｘ Ｊａｒｒｙ，７５０１３、パリ、フランス）。

本発明によるレアカットエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼでもあり得る。近時、タイプＩＩ原核生物ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化等間隔短鎖回分リピート（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ））適応免疫系に由来する、ＲＮＡにガイドされたＣａｓ９ヌクレアーゼに基づいて、新たなゲノム工学ツールが開発された（Ｇａｓｉｕｎａｓ，Ｂａｒｒａｎｇｏｕ、２０１２、Ｊｉｎｅｋ，Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ、２０１２、Ｃｏｎｇ，Ｒａｎ、２０１３、Ｍａｌｉ，Ｙａｎｇ、２０１３）（総説（Ｓｏｒｅｋ，Ｌａｗｒｅｎｃｅ、２０１３）を参照のこと）。ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）システムは、バクテリアで最初に発見され、外来ＤＮＡ（ウイルス性またはプラスミドのいずれも）に対する防御として機能する。ＣＲＩＳＰＲ介在ゲノム工学は、まず、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と呼ばれる短い配列モチーフによって多くの場合隣接する、標的配列を選択することによって進行する。標的配列の選択に続いて、この標的配列に相補的な特異的ｃｒＲＮＡを遺伝子操作する。ＣＲＩＳＰＲタイプＩＩシステムに必要なトランス活性型ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）をｃｒＲＮＡとペアにし、準備したＣａｓ９タンパク質に結合させる。Ｃａｓ９は、ｔｒａｃＲＮＡとｃＲＮＡとの塩基対形成を促進する分子アンカーとして働く（Ｄｅｌｔｃｈｅｖａ，Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉら、２０１１）。この三者複合体において、２成分のｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ構造は、エンドヌクレアーゼＣａｓ９を同族の標的配列に方向付けるガイドＲＮＡとして働く。Ｃａｓ９−ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ複合体による標的の認識は、標的配列を、標的配列とｃｒＲＮＡとの間の相同性についてスキャニングすることによって開始される。標的配列−ｃｒＲＮＡ間の相補性に加えて、ＤＮＡターゲティングには、プロトスペーサーに隣接する短いモチーフ（プロトスペーサー隣接モチーフ、ＰＡＭ）の存在が必要である。２成分ＲＮＡと標的配列との間の対形成に続いて、Ｃａｓ９は、次いでＰＡＭモチーフの３塩基上流に二本鎖平滑末端断面を生じさせる（Ｇａｒｎｅａｕ，Ｄｕｐｕｉｓら、２０１０）。

レアカットエンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼという名称でも知られているホーミングエンドヌクレアーゼであってもよい。このようなホーミングエンドヌクレアーゼは、本技術分野でよく知られている（Ｓｔｏｄｄａｒｄ、２００５）。ホーミングエンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ標的配列を認識し、一本鎖、または二本鎖切断を生じさせる。ホーミングエンドヌクレアーゼは特異性が高く、１２〜４５塩基対（ｂｐ）の範囲の長さ、通常１４〜４０ｂｐの範囲の長さのＤＮＡ標的サイトを認識する。本発明によるホーミングエンドヌクレアーゼは、例えば、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧエンドヌクレアーゼに相当し、ＨＮＨエンドヌクレアーゼに相当し、またはＧＩＹ−ＹＩＧエンドヌクレアーゼに相当し得る。好ましくは、本発明によるホーミングエンドヌクレアーゼは、Ｉ−ＣｒｅＩバリアントであり得る。

− 「送達ベクター」または「送達ベクター（複数）」とは、本発明において必要とされる薬剤／化学物質および分子（タンパク質または核酸）と、細胞とを接触させる（すなわち「接触」）ために、または細胞もしくは細胞内コンパートメント内に送達する（すなわち「導入」）ために、本発明において使用し得るあらゆる送達ベクターを意図する。送達ベクターとしては、リポソーム送達ベクター、ウイルス送達ベクター、薬物送達ベクター、化学的担体、高分子担体、リポプレックス、ポリプレックス、デンドリマー、マイクロバブル（超音波造影剤）、ナノ粒子、エマルジョン、または他の適切な移送ベクターがあげられるが、これらに限定されない。これらの送達ベクターは、分子、化学物質、巨大分子（遺伝子、タンパク質）、またはＤｉａｔｏｓ社によって開発されたプラスミド、ペプチドなどの他のベクターの送達を可能にする。これらの場合、送達ベクターは分子担体である。「送達ベクター」または「送達ベクター（複数）」は、トランスフェクションを行うための送達方法も意図する。

− 用語「ベクター」または「ベクター（複数）」は、連結している別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。本発明の「ベクター」としては、ウイルスベクター、プラスミド、ＲＮＡベクター、または染色体の核酸、非染色体の核酸、半合成の核酸もしくは合成の核酸からなってもよい直鎖もしくは環状のＤＮＡ分子もしくはＲＮＡ分子があげられるが、これらに限定されない。好ましいベクターは、自律複製できるベクター（エピソームベクター）、および／または連結している核酸を発現させることができるベクター（発現ベクター）である。多数の適切なベクターが当業者に知られており、市販されている。

ウイルスベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス（例えば、アデノ関連ウイルス）、コロナウイルス、マイナス鎖ＲＮＡウイルス、例えばオルソミクソウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）、ラブドウイルス（例えば、狂犬病ウイルスおよび水疱性口内炎ウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、麻疹ウイルスおよびセンダイウイルス）など、プラス鎖ＲＮＡウイルス、例えばピコルナウイルスおよびアルファウイルスなど、ならびに二本鎖ＤＮＡウイルス、例えばアデノウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス１型および２型、エプスタイン−バーウイルス、サイトメガロウイルス）、およびポックスウイルス（例えば、ワクシニアウイルス、鶏痘ウイルスおよびカナリア痘瘡ウイルス）などがあげられる。他のウイルスとしては、例えば、ノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポーバウイルス、ヘパドナウイルス、および肝炎ウイルスがあげられる。レトロウイルスの例としては、トリ白血病肉腫、哺乳動物Ｃ型ウイルス、Ｂ型ウイルス、Ｄ型ウイルス、ＨＴＬＶ−ＢＬＶグループ、レンチウイルス、スプーマウイルスがあげられる（Ｃｏｆｆｉｎ，Ｊ．Ｍ．，Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ：Ｔｈｅ ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｉｎ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓら共編、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、１９９６）。

− 「レンチウイルスベクター」とは、ＨＩＶベースレンチウイルスベクターを意味し、これは、相対的にパッケージング容量が大きく、免疫原性が低減されており、広範囲の異なる細胞タイプに対して高効率で安定的に形質導入する能力があるため、遺伝子送達のために有望である。レンチウイルスベクターは、一般に、プロデューサー細胞内への、以下の３種（パッケージングプラスミド、エンベローププラスミド、およびトランスファープラスミド）またはそれ以上のプラスミドの一過性トランスフェクションによって作成される。ＨＩＶと同様に、レンチウイルスベクターは、ウイルス表面糖タンパク質と細胞表面上のレセプターとの相互作用によって標的細胞に侵入する。侵入の際に、ウイルスＲＮＡは逆転写され、逆転写はウイルス逆転写酵素複合体によって媒介される。逆転写産物は、二本鎖の直鎖ウイルスＤＮＡであり、これは、感染細胞のＤＮＡ中へのウイルス組み込みの基質である。「組み込みレンチウイルスベクター（すなわち、ＬＶ）」とは、非限定的例として、標的細胞ゲノムへの組み込みを起こし得るベクターを意味する。逆に、「非組み込みレンチウイルスベクター（すなわち、ＮＩＬＶ）」とは、ウイルスインテグラーゼの作用による標的細胞ゲノムへの組み込みを起こさない、効率的な遺伝子送達ベクターを意味する。

− 送達ベクターおよびベクターは、任意の細胞透過処理手法、例えばソノポレーションもしくはエレクトロポレーション、またはその派生的な手法と、結びつけてもよく、または組み合わせてもよい。

− 細胞または細胞（複数）とは、これら微生物に由来する、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養のための、任意の真核生物生細胞、初代細胞、および細胞系を意図する。

− 「初代細胞」または「初代細胞（複数）」とは、生組織から直接採取し（すなわちバイオプシー材料）、かつ集団倍加数が非常に少なく、したがって起源となる組織の主要な機能的構成部分および特徴を、連続継代性（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃ）細胞系または人工的に不死化した細胞系と比較して、より典型的に示す、ｉｎ ｖｉｔｒｏ成長のために樹立した細胞を意味する。

非限定的な例として、細胞系は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞；ＨＥＫ２９３細胞；Ｃａｃｏ２細胞；Ｕ２−ＯＳ細胞；ＮＩＨ３Ｔ３細胞；ＮＳＯ細胞；ＳＰ２細胞；ＣＨＯ−Ｓ細胞；ＤＧ４４細胞；Ｋ−５６２細胞、Ｕ−９３７細胞；ＭＲＣ５細胞；ＩＭＲ９０細胞；Ｊｕｒｋａｔ細胞；ＨｅｐＧ２細胞；ＨｅＬａ細胞；ＨＴ−１０８０細胞；ＨＣＴ−１１６細胞；Ｈｕ−ｈ７細胞；Ｈｕｖｅｃ細胞；およびＭｏｌｔ４細胞からなる群から選択することができる。

非限定的な例として、これらの全ての細胞系を本発明の方法によって改変することによって、目的とする遺伝子またはタンパク質を産生、発現、定量、検出、研究するための細胞系モデルを提供することができ、これらの細胞系モデルは、研究、生産、ならびに化学、バイオ燃料、治療学、および農学などの種々の分野において、目的とする生物学的に活性な分子をスクリーニングするために使用することもできる。

− 「変異」とは、ポリヌクレオチド（ｃＤＮＡ、遺伝子）またはポリペプチド配列における、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、４０、５０、または５０超までのヌクレオチド／アミノ酸の置換、欠失、挿入を意図する。変異は、遺伝子のコード配列または遺伝子の制御配列に影響を及ぼし得る。変異は、ゲノム配列の構造、またはコードされるｍＲＮＡの構造／安定性にも影響を及ぼし得る。

− 「バリアント（単数および複数）」とは、親分子のアミノ酸配列中の少なくとも１つの残基の変異または交換によって得られる、反復配列のバリアント、バリアント、ＤＮＡ結合バリアント、ＴＡＬＥヌクレアーゼバリアント、ポリペプチドバリアントを意図する。

− 「機能性バリアント」とは、タンパク質またはタンパク質ドメインの触媒的に活性な変異体を意図し、そのような変異体は、その親タンパク質またはタンパク質ドメインと比較して同じ活性を有するか、追加の特性を有するか、またはより高いもしくはより低い活性を有する。

− 「同一性」とは、２つの核酸分子間、または，ポリペプチド間の配列同一性を指す。同一性は、各配列における位置を比較することによって決定することができ、各配列は、比較するためにアラインしてもよい。比較対象の位置を同じ塩基が占めている場合、その位置について、それらの分子は同一である。核酸配列間またはアミノ酸配列間の類似性または同一性の程度は、それらの核酸配列が共有する位置における、同一のヌクレオチドまたは適合するヌクレオチドの数と相関関係にある。種々のアライメントアルゴリズムおよび／またはプログラム、例えば、ＦＡＳＴＡまたはＢＬＡＳＴを、２配列間の同一性を計算するために使用することができ、ＦＡＳＴＡまたはＢＬＡＳＴはＧＣＧ配列解析パッケージ（ウィスコンシン大学、マディソン、ウィスコンシン州）の一部として利用することができ、例えば、初期設定で使用することができる。例えば、本明細書で説明した特定のポリペプチドと、少なくとも７０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の同一性を有し、好ましくは実質的に同じ機能を示すポリペプチド、ならびにそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが意図される。別段の指定がない限り、類似性スコアは、ＢＬＯＳＵＭ６２を使用に基づくものであろう。ＢＬＡＳＴＰを使用する場合、類似性のパーセントはＢＬＡＳＴＰポジティブスコアに基づき、配列同一性のパーセントはＢＬＡＳＴＰ同一性スコアに基づく。ＢＬＡＳＴＰ「同一性」は、ハイスコア配列ペアにおける、同一である残基全体の数および割合を示し、ＢＬＡＳＴＰ「ポジティブ」は、アライメントスコアがポジティブな値であり、互いに類似する残基の数および割合を示す。これらの程度の同一性もしくは類似性を有するアミノ酸配列、または本明細書に開示されたアミノ酸配列に対して中程度の類似性の同一性を有するアミノ酸配列は、本開示によって意図され、本開示の範囲に含まれる。類似するポリペプチドのポリヌクレオチド配列は、遺伝暗号を用いて推定され、通常の手段によって、特に遺伝暗号を用いたアミノ酸配列の逆翻訳によって得ることができる。

− 「シグナル伝達ドメイン」、または「共刺激リガンド」は、Ｔ細胞上の同族の共刺激分子と特異的に結合し、それによって、例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体とペプチドが結合したＭＨＣ分子との結合によって生じる一次シグナルに加えて、Ｔ細胞応答（増殖活性化、分化などを含むが、これらに限定されない）を媒介するシグナルを生じさせる、抗原提示細胞上の分子を指す。共刺激リガンドとしては、ＣＤ７、Ｂ７−１（ＣＤ８０）、Ｂ７−２（ＣＤ８６）、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、誘導性共刺激イガンド（ＩＣＯＳ−Ｌ）、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ８３、ＨＬＡ−Ｇ、ＭＩＣＡ、Ｍ１ＣＢ、ＨＶＥＭ、リンホトキシンβレセプター、３／ＴＲ６、ＩＬＴ３、ＩＬＴ４、Ｔｏｌｌリガンドレセプターに結合するアゴニストまたは抗体、およびＢ７−Ｈ３と特異的に結合するリガンド、があげられ得るが、これらに限定されない。共刺激リガンドは、なかでも、Ｔ細胞上に存在する共刺激分子と特異的に結合する抗体、例えば、限定されないが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−ＩＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、白血球機能関連抗原１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＴＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、も包含する。

「共刺激分子」は、共刺激リガンドと特異的に結合し、それによって細胞による共刺激反応、例えば、限定されないが、増殖、を媒介するＴ細胞上の同族の結合パートナーを指す。共刺激分子としては、ＭＨＣクラスＩ分子、ＢＴＬＡ、およびＴｏｌｌリガンドレセプターがあげられるが、これらに限定されない。

本明細書で使用する場合、「共刺激シグナル」は、ＴＣＲ／ＣＤ３ライゲーションなどの一次シグナルと共に、Ｔ細胞増殖および／またはキー分子のアップレギュレーションもしくはダウンレギュレーションをもたらすシグナルを指す。

用語「細胞外リガンド結合ドメイン」は、本明細書で使用する場合、リガンドを結合できるオリゴペプチドまたはポリペプチドと定義される。好ましくは、該ドメインは、細胞表面分子と相互作用できるであろう。例えば、細胞外リガンド結合ドメインは、特定の病状と関連する標的細胞上の細胞表面マーカーの働きをするリガンドを認識するように選択してもよい。よって、リガンドとして働き得る細胞表面マーカーの例としては、ウイルス感染、バクテリア感染、および寄生虫感染、自己免疫疾患、ならびにがん細胞に関連するリガンドがあげられる。

用語「対象」または「患者」には、非ヒト霊長目およびヒトを含む動物界の全てのメンバーが含まれる。

本発明の上記に記載した説明は、あらゆる当業者による本発明の実施および使用が可能になるように、本発明を製造および使用する様式およびプロセスを提供し、この実施可能性は、特に添付の特許請求の範囲の主題のために提供され、これは本来の本説明の一部を構成する。

本明細書において、数値限定または数値範囲が記載されている場合、端点が含まれる。また、数値限定または数値範囲内の全ての値およびサブレンジは、あたかも明示的に記載されているように、具体的に含まれる。

上記の説明は、当業者による本発明の実施および使用を可能にするために示されており、特定の適用と、その必要性との関係で提供されている。好ましい実施形態に対する種々の改変が当業者にはきわめて明白であろうし、本明細書に規定された一般的な原理は、本発明の趣旨および範囲を逸脱することなく、他の実施形態および用途に適用可能である。よって、本発明は、示された実施形態に限定されることを意図するものではなく、本明細書に開示された原理および特徴と矛盾しない最も広い範囲を認められるべきである。

本発明は一般的に説明されているため、ある特定の実施例を参照することによってさらなる理解を得ることができるが、この実施例は、本明細書において例示だけの目的で示されており、別段の定めがない限り限定することを意図しない。

一般的方法
初代細胞
末梢血単核球を、健康なボランティアのドナーに由来するバフィーコート（フランス血液機構）から、密度勾配遠心法によって単離した。次いで、Ｔリンパ球をＥａｓｙＳｅｐヒトＴ細胞分離キット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて精製し、２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）および５％のヒト血清ＡＢ型（Ｓｅｒａｌａｂ社）を添加したＸ−ｖｉｖｏ１５培地（Ｌｏｎｚａ社）中で、ＤｙｎａｂｅａｄｓヒトＴ細胞アクチベーターＣＤ３／ＣＤ２８（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）によって活性化した。

細胞系
Ｋ５６２、Ｊｅｋｏ−１、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＰＣ−３、およびＭＣＦ−７細胞系は、アメリカ培養細胞系統保存機関から入手した。Ｋ５６２細胞は、１０％の熱不活性化ＦＣＳ、２ｍｍｏｌ／ＬのＬ−グルタミン、ならびに１００単位／ｍＬのペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを添加したＩＭＤＭ中で培養した。Ｊｅｋｏ−１細胞は、２０％の熱不活性化ＦＣＳ、２ｍｍｏｌ／ＬのＬ−グルタミン、ならびに１００単位／ｍＬのペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ１６４０中で培養した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、１０％の熱不活性化ＦＣＳ、２ｍｍｏｌ／ＬのＬ−グルタミン、ならびに１００単位／ｍＬのペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ中で培養した。ＰＣ−３細胞は、１０％の熱不活性化ＦＣＳ、２ｍｍｏｌ／ＬのＬ−グルタミン、ならびに１００単位／ｍＬのペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを添加したＦ−１２Ｋ中で培養した。ＭＣＦ−７細胞は、１０％の熱不活性化ＦＣＳ、２ｍｍｏｌ／ＬのＬ−グルタミン、１００単位／ｍＬのペニシリン、および１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、ならびに０．０１ｍｇ／ｍｌのヒトインシュリンを添加したＤＭＥＭ中で培養した。

ＲＯＲ１細胞表面発現の定量
種々のヒト細胞系上のＲＯＲ１表面分子数は、モノクローナル抗ＲＯＲ１抗体クローン２Ａ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）およびＤａｋｏ社のＱｉＦＩＫＩＴを用い、メーカーの指示書に従って、飽和結合によって決定した。

ｓｃＣＡＲをコードするＤＮＡの合成
ｓｃＣＡＲをコードするＤＮＡを、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔによって合成した。

ｓｃＣＡＲをｉｎ ｖｉｔｒｏでｍＲＮＡに転写するベクターの構築
ｓｃＣＡＲをコードするＤＮＡを、プラスミドｐＣＬＳ９６３２中のＴ７プロモーターとＢＧＨポリＡとの間にクローニングした。

ＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写
ｓｃＣＡＲをコードするｍＲＮＡを、ｍＭｅｓｓａｇｅ ｍＭａｃｈｉｎｅ Ｔ７ Ｕｌｔｒａキット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて、メーカーの指示書に従って、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写し、ポリアデニル化した。ＲＮＡをＲＮｅａｓｙカラム（Ｑｉａｇｅｎ社）で精製し、Ｃｙｔｏｐｏｒａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ Ｔ （Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ社）中に溶出させて、Ｎａｎｏｄｒｏｐ ＮＤ−１０００分光光度計を用いて２６０ｎｍにおける吸光度測定によって定量した。ＲＮＡの品質は、ホルムアルデヒド／ＭＯＰＳ変性アガロースゲルで確認した。

Ｔ細胞のＲＮＡエレクトロポレーション
活性化させてから４〜５日または１１〜１２日後、ＡｇｉｌｅＰｕｌｓｅ ＭＡＸシステム（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ社）用いて、エレクトロトランスファーによって、メッセンジャーＲＮＡをＴリンパ球にトランスフェクトした。ｌ．５（ｌ．５）×１０^６の細胞を、１５μｇのｓｃＣＡＲをコードするｍＲＮＡと混合し、０．４ｃｍのキュベットに入れた。エレクトロポレーションは、国際公開第２０１３１７６９１５号パンフレットに記載されたプロトコルに従って実施した。エレクトロポレーションに続き、細胞を培養液中に希釈して、３７°Ｃ／５％ＣＯ_２でインキュベートした。

ｓｃＣＡＲの検出
フローサイトメトリー法による検出：Ｔ細胞をＰＥ標識ポリクローナルヤギ抗マウス（Ｆａｂ）_２；抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ社）またはビオチン標識プロテインＬ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社）、次いでフィコエリトリン標識ストレプトアビジン（ＢＤ ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で染色し、最後にＭＡＣＳＱｕａｎｔフローサイトメーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）を用いて分析した。

ウェスタンブロッティング法による検出：１×１０^６のＴ細胞を、１ｍＭのオルトバナジン酸塩、３μｇ／ｍｌのプロテアーゼ阻害剤、および２ｍＭのＰＭＳＦを含む、５０μｌのＲＩＰＡバッファーで溶解した。細胞溶解物を、Ａｎｙ ｋＤ（商標）アクリルアミドゲル（ＢｉｏＲａｄ社）上でＳＤＳ−ＰＡＧＥ法によって分離した。ニトロセルロース膜に転写した後、マウス抗ヒトＣＤ３ｚ（ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）とインキュベートし、次いでヤギ抗マウスＩｇＧホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲート化抗体（Ｓｉｇｍａ）とインキュベートした。抗体の結合を、ＥＣＬキット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて明らかにした。

脱顆粒アッセイ
５×１０^４のＴ細胞を、５×１０^４のＲＯＲ１陽性細胞またはＲＯＲ１陰性細胞と共に、９６ウェルプレートで１ウェルあたり０．１ｍｌで共培養した。１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ４９ｄ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）、およびＭｏｎｅｎｓｉｎ溶液（１×）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）に加えて、共培養の初めにＡＰＣ標識抗ＣＤ１０７ａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を添加した。６時間インキュベーションした後、細胞をＦｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）およびＶｉｏＢｌｕｅ標識抗ＣＤ８（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）で染色し、ＭＡＣＳＱｕａｎｔフローサイトメーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）を用いて分析した。脱顆粒細胞障害性Ｔ細胞は、ＣＤ８＋ＣＤ１０７ａ＋細胞に相当する。

サイトカイン放出アッセイ
５×１０^４のＴ細胞を、５×１０^４のＲＯＲ１陽性細胞またはＲＯＲ１陰性細胞と、９６ウェルプレートで１ウェルあたり０．１ｍｌで共培養した。２４時間インキュベーションした後、培養上清を収集し、ＩＦＮγＲＯＲ１陽性細胞であるか、ＲＯＲ１陰性細胞であるかについて分析した。

細胞毒性アッセイ
付着性の標的細胞を用いたアッセイ：２×１０^４のＲＯＲ１陽性細胞またはＲＯＲ１陰性細胞を、９６ウェルプレートに１ウェルあたり０．１ｍｌで播種した。播種の翌日、ＲＯＲ１陽性細胞およびＲＯＲ１陰性細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｅ ＣＦＳＥで標識し、４×１０^５のＴ細胞と４時間共培養した。細胞を採取し、Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）で染色してＭＡＣＳＱｕａｎｔフローサイトメーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）を用いて分析した。

特異的な溶解のパーセンテージは、以下の式を用いて算出した。

浮遊性の標的細胞を用いたアッセイ：ＲＯＲ１陽性細胞およびＲＯＲ１陰性細胞を、それぞれＣｅｌｌＴｒａｃｅ ＣＦＳＥおよびＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔで標識した。約２×１０^４のＲＯＲ１陽性細胞を、２×１０^４のＲＯＲ１陰性細胞と、４×１０^５のＴ細胞と共に、９６ウェルプレートで１ウェルあたり０．１ｍｌで共培養した。４時間インキュベーションした後、細胞を採取し、Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）で染色してＭＡＣＳＱｕａｎｔフローサイトメーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）を用いて分析した。

特異的な溶解のパーセンテージは、上記の式を用いて算出した。
実施例
ＣＡＲポリペプチド配列の例：
以下に、６０種のＲＯＲ１ｓｃＣＡＲの配列である配列番号７９〜１３８（シグナルペプチドを含む）を示す。これらは、Ｖ１〜Ｖ６というＣＡＲ構造、ならびに８種の異なる抗体である２Ａ２、４Ａ５、Ｄ１０、Ｇ６、Ｇ３、Ｈ１０、２Ａ４、および１Ｃ１１に由来するｓｃＦｖを有する。

バージョンＶ１、Ｖ３、およびＶ５（ＣＤ８α膜貫通ドメインを含むｓｃＣＡＲ）を、２Ａ２ｓｃＦｖを含むｓｃＣＡＲを除き、以下の実験でアッセイし、２Ａ２ｓｃＦｖを含むｓｃＣＡＲについてはＶ１バージョンのみ（比較の基準として）試験し、この２Ａ２ｓｃＦｖを含むｓｃＣＡＲは、Ｈｕｄｅｃｅｋら（２０１３）によって記載された通りの構造を有していた。

枠で囲んだ配列は、好ましいＶＨ配列およびＶＬ配列に相当する。しかしながら、ＶＨおよびＶＬは、本発明によるＣＡＲの有効性を改善するために交換され得る。

実施例１：ＲＯＲ１陽性細胞系および陰性細胞系の選択
異なるＲＯＲ１細胞表面発現レベルを示す細胞系を同定するために、１２種のヒト細胞系を、Ｑｉｆｉｋｉｔ（Ｄａｋｏ）および抗ヒトＲＯＲ１ｍＡｂクローン２Ａ２を用いて、フローサイトメトリー法で分析した（材料および方法を参照のこと）。これらの細胞系のうち９種については、ｍＲＮＡまたはタンパク質レベルでＲＯＲ１がポジティブであることが既に文献に記載されている（表１０）。

フローサイトメトリー結果は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ−２６）、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ．１３２）、Ｈｓ７４６Ｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ−１３５）、およびＨＴ−２９（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ−３８）細胞が、最も高いＲＯＲ１細胞表面発現レベルを示したことを表している。ＰＣ−３（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１４３５）、ＮＣＩ−Ｈ１９９３（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ５９０９）、Ａ５４９（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１８５）、およびＪｅｋｏ−１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−３００６）細胞において、より低いレベルのＲＯＲ１細胞表面発現、すなわち高発現する細胞系のおよそ半分の発現が検出された（図５）。

結果から、細胞表面に、ＭＣＦ−７、Ｋ５６２、およびＴ細胞はＲＯＲ１を発現しないこと、およびＣａｌ５１は非常に低いレベルのＲＯＲ１を発現しているにすぎないことが認められる。

これらの細胞系から、３種の接着性の細胞系、すなわちＲＯＲ１発現レベルが異なるＰＣ−３細胞およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞と、ＲＯＲ１陰性のＭＣＦ−７細胞とを、抗ＲＯＲ１ｓｃＣＡＲ活性をスクリーニングするために選択した。

また、２種の浮遊性の細胞系、すなわちＲＯＲ１陽性のＪｅｋｏ−１細胞と、ＲＯＲ１陰性のＫ５６２細胞とを、抗ＲＯＲ１ｓｃＣＡＲ活性をスクリーニングするために選択した。

実施例２：抗ＲＯＲ１ｓｃＣＡＲの世代
第２世代のＲＯＲ１特異的ｓｃＣＡＲを１８種１セット（図１Ｃ）作製し、以下の実験で試験した。

これらは、以下の表１〜２の構成単位を融合させることによって得られる。
− Ｄ１０、Ｇ６、Ｇ３、Ｈ１０、２Ａ４、または１Ｃ１１からのマウス起源またはヒト化形態に由来するｓｃＦｖ、
− １つのスペーサーである、ヒトＦｃγＲＩＩＩα、ＣＤ８α、またはＩｇＧ１ヒンジ、
− ヒトＣＤ８αの膜貫通ドメイン、およびヒト４１ＢＢの共刺激ドメイン、
− ヒトＣＤ３ζの活性化ドメイン
種々のｓｃＦＶを、ｓｃＣＡＲに用いて、種々の結合親和性および種々のエピトープ特異性を有するレセプターが作成された。

ｍＡｂ Ｄ１０およびＧ６は、３’Ｉｇ様領域、およびＩｇ様ドメインとＲＯＲ１のＣＲＤドメインとの間のリンカー領域（図２）を標的とする。

ｍＡｂ Ｇ３、Ｈ１０、および２Ａ４は、ＲＯＲ１のＩｇＧ様領域（図２）を標的とする。

ｍＡｂ １Ｃ１１は、ＲＯＲ１のＣＲＤドメイン（図２）を標的とする。
ＲＯＲ１の近位エピトープと遠位エピトープの両方によるｓｃＣＡＲ連結の最適化を試みるために、長さが異なる３種のスペーサー（１６ＡＡ、４５ＡＡ、および２３１ＡＡ）をｓｃＣＡＲに使用した（Ｇｕｅｓｔら、２００５）。

実施例３：抗ＲＯＲ１ｓｃＣＡＲのｉｎ ｖｉｔｒｏ試験
上記のように設計された抗ＲＯＲ１ｓｃＣＡＲを、図６に示す２ステップスクリーニング方法を用いて、ヒト初代（ｐｒｉｍａｙ）Ｔ細胞で試験した。

スクリーニングプロセスの第１ステップにおいて、抗ＣＤ２８／ＣＤ３ビーズおよびＩＬ−２で予め４〜５日間活性化した初代ヒトＴ細胞に、上述した１８種の抗ＲＯＲ１ｓｃＣＡＲをコードするｍＲＮＡをエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションの１日後、ｓｃＣＡＲ発現をフローサイトメトリー法およびウエスタンブロット法で評価し、ｓｃＣＡＲ改変Ｔ細胞の活性をＴ細胞の脱顆粒を測定することによって評価した。ウエスタンブロット法で検出され、かつ少なくとも１つのＲＯＲ１陽性細胞系と共培養した際にＴ細胞の特異的な脱顆粒を著しく誘発（≧２０％）したｓｃＣＡＲを選択し、スクリーニングプロセスの第２ステップを行った。

スクリーニングプロセスの第２ステップにおいて、抗ＣＤ２８／ＣＤ３ビーズおよびＩＬ−２で予め１１〜１２日間活性化した初代ヒトＴ細胞に、第１のスクリーニングステップ後に選択した抗ＲＯＲ１ｓｃＣＡＲをコードするｍＲＮＡをエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションの１〜２日後、フローサイトメトリー法によってｓｃＣＡＲ発現を評価し、ｓｃＣＡＲ改変Ｔ細胞の活性をＴ細胞のエフェクター機能（脱顆粒、ＩＦＮｇ産生、および細胞毒性（ｃｙｔｏｔｏｌｙｔｉｃ）活性）を測定することによって評価した。少なくとも１つのＲＯＲ１陽性細胞系と共培養した際に、Ｔ細胞の特異的な脱顆粒を著しく誘発（≧２０％）し、Ｔ細胞の特異的な細胞毒性を著しく誘発（≧２０％の標的細胞溶解）し、かつＴ細胞によるＩＦＮｇの産生を著しく誘発（≧１５００ｐｇ／ｍｌ）したｓｃＣＡＲを、可能性のあるｓｃＣＡＲの候補として選択した。

上記ｓｃＣＡＲを、短いヒンジと融合した２Ａ２ｓｃＦＶを含む、基準となるｓｃＣＡＲ（配列番号７９）と統一的に比較したが、このｓｃＣＡＲが、Ｈｕｄｅｃｅｋら（２０１３）によって機能的であることが既に示されているからである。

ａ）ｓｃＣＡＲの１次スクリーニング：
ｓｃＣＡＲ発現
まず、抗ＲＯＲ１ｓｃＣＡＲの総発現量を、Ｔ細胞で、抗ヒトＣＤ３ζｍＡｂを用いたウエスタンブロット法によって評価した。中程度の長さのスペーサー（ＣＤ８αヒンジ）、または長いスペーサー（ＩｇＧ１ヒンジ）を含むｓｃＣＡＲは、どのようなｓｃＦＶを含んでいる場合でも、Ｔ細胞溶解物中に強く検出されることが観察された。しかしながら、短いスペーサー（ＦｃγＲＩＩＩα）を含むｓｃＣＡＲについては、Ｇ６、Ｇ３、およびＨ１０のｓｃＦｖを含むものは良好に検出されたが、Ｄ１０、２Ａ４、および１Ｃ１１のｓｃＦｖを含むものは、弱く検出されるか、または検出されなかった（図７Ａおよび７Ｂ）。

次いで、抗ＲＯＲ１ｓｃＣＡＲの、Ｔ細胞表面上の発現を、抗ＦａｂまたはプロテインＬを用いて、フローサイトメトリー法で評価した（図８Ａおよび８Ｂ）。

以下のことが観察された。
− Ｔ細胞溶解物中に、ウエスタンブロット法によって良好に検出されたｓｃＣＡＲであるＤ１０−ｖ３、Ｄ１０−ｖ５、Ｇ６−ｖ３、Ｇ６−ｖ５、Ｇ３−ｖ３、Ｇ３−ｖ５、Ｈ１０−ｖ３、Ｈ１０−ｖ５、２Ａ４−ｖ３、および２Ａ４−ｖ５は、Ｔ細胞表面上にも、フローサイトメトリー法によって良好に検出された。

− Ｔ細胞溶解物中に、ウエスタンブロット法によって検出されなかったか、またはほとんど検出されなかったｓｃＣＡＲであるＤ１０−ｖ１、２Ａ４−ｖ１、および１Ｃ１１−ｖ１は、Ｔ細胞表面上にも、フローサイトメトリー法によって検出されなかった。

ｓｃＣＡＲ活性
ｓｃＣＡＲ活性を評価するために、ＲＯＲ１陽性（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＰＣ−３）細胞またはＲＯＲ１陰性（ＭＣＦ−７）細胞と共培養した際の、ｓｃＣＡＲ改変Ｔ細胞の脱顆粒を分析した。

ｓｃＣＡＲであるＤ１０−ｖ１、Ｄ１０−ｖ３、Ｄ１０−ｖ５、Ｈ１０−ｖ１、Ｈ１０−ｖ３、およびＨ１０−ｖ５で改変したＴ細胞は、ＭＣＦ−７細胞と共培養した際よりも、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞およびＰＣ−３細胞と共培養した際の方が、脱顆粒が著しく多い（≧２０％）ことが観察された（図９Ａおよび９Ｂ）。

図９Ａおよび図９Ｂは、非改変Ｔ細胞ならびにｓｃＣＡＲであるＨ１０およびＤ１０で改変したＴ細胞は、ｓｃＣＡＲであるＧ６、Ｇ３、２Ａ４、および１Ｃ１１で改変した場合よりも、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、ＰＣ−３細胞、およびＭＣＦ−７細胞と共培養した際の脱顆粒が、全てにおいてはるかに良好であることを示す。

１次スクリーニングの結論：
これらの結果は全体として、本発明の範囲内で設計された１８種の抗ＲＯＲ１ｓｃＣＡＲのうち、６種（Ｄ１０−ｖ１、Ｄ１０−ｖ３、Ｄ１０−ｖ５、Ｈ１０−ｖ１、Ｈ１０−ｖ３、およびＨ１０−ｖ５）が、スクリーニングプロセスの第２ステップを行うための選択基準を満たしたことを実証した。

ｂ）ｓｃＣＡＲの２次スクリーニング
ｓｃＣＡＲ発現
抗ＲＯＲ１ｓｃＣＡＲの、Ｔ細胞表面上の発現を、プロテインＬを用いて、フローサイトメトリー法で評価した。

活性化させてから４〜５日後にエレクトロポレーションしたＴ細胞上に良好に検出されるｓｃＣＡＲであるＤ１０−ｖ３、Ｄ１０−ｖ５、Ｈ１０−ｖ３、およびＨ１０−ｖ５（図８Ａおよび８Ｂ）は、活性化させてから１１〜１２日後にエレクトロポレーションしたＴ細胞上には検出されないか、または弱く検出されるだけであることが観察された（図１０）。

ｓｃＣＡＲ活性
まず、ｓｃＣＡＲ活性を評価するために、ＲＯＲ１陽性（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＰＣ−３、およびＪｅｋｏ−１）細胞、またはＲＯＲ１陰性（ＭＣＦ−７およびＫ５６２）細胞と共培養した際の、ｓｃＣＡＲ改変Ｔ細胞の脱顆粒を分析した。

ｓｃＣＡＲであるＤ１０−ｖ１、Ｈ１０−ｖ１、およびＨ１０−ｖ５で改変したＴ細胞とは逆に、ｓｃＣＡＲであるＤ１０−ｖ３、Ｄ１０−ｖ５、およびＨ１０−ｖ３で改変したＴ細胞は、ＭＣＦ−７細胞と共培養した際、または培地のみの場合よりも、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞およびＰＣ−３細胞と共培養した際の方が、脱顆粒が著しく多い（≧２０％）ことが観察された（図１１）。

次いで、ＲＯＲ１陽性（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＰＣ−３、およびＪｅｋｏ−１）細胞、またはＲＯＲ１陰性（ＭＣＦ−７およびＫ５６２）細胞と共培養した際の、ｓｃＣＡＲ−改変（ｍｏｄｉｆｉｉｅｄ）Ｔ細胞によるＩＦＮγ産生を分析した。

ｓｃＣＡＲであるＤ１０−ｖ１、Ｈ１０−ｖ１、およびＨ１０−ｖ５で改変したＴ細胞とは逆に、ｓｃＣＡＲであるＤ１０−ｖ３、Ｄ１０−ｖ５、およびＨ１０−ｖ３で改変したＴ細胞は、ＭＣＦ−７細胞、Ｋ５６２細胞と共培養した際、または培地のみの場合よりも、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、ＰＣ−３細胞、およびＪｅｋｏ−１細胞と共培養した際の方が、ＩＦＮγ産生が著しく多い（≧１５００ｐｇ／ｍｌ）ことが観察された（図１２）。

最後に、ＲＯＲ−１陰性（ＭＣＦ−７およびＫ５６２）細胞、またはＲＯＲ１陽性（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＰＣ−３、およびＪｅｋｏ−１）細胞と共培養した際の、ｓｃＣＡＲ改変Ｔ細胞の細胞毒性活性を分析した。

ｓｃＣＡＲであるＤ１０−ｖ１、Ｈ１０−ｖ１、およびＨ１０−ｖ５で改変したＴ細胞とは逆に、ｓｃＣＡＲであるＤ１０−ｖ３、Ｄ１０−ｖ５、およびＨ１０−ｖ３で改変したＴ細胞は、共培養中のＰＣ−３細胞の２０％超を特異的に死滅させたことが観察された（図１３）。ｓｃＣＡＲであるＤ１０−ｖ３およびＨ１０−ｖ３で改変したＴ細胞も、共培養中のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞およびＪｅｋｏ−１細胞の２０％超を死滅させたが、ｓｃＣＡＲであるＤ１０−ｖ５で改変したＴ細胞については、これとは異なる結果となった（図１３および図１４）。

２次スクリーニングの結論：
これらの結果は全体として、全てのｓｃＣＡＲ試験から、Ｄ１０−ｖ３、Ｄ１０−ｖ５、およびＨ１０−ｖ３が最も有益なｓｃＣＡＲを表すことを実証した。

バージョンＶ２の２種のＣＡＲは、細胞毒性の誘発に関してわずかに優位であることを指摘することができる（試験した種々のＲＯＲ１陽性細胞系に対して、より反応性が高かった）。

実施例４：ＲＯＲ１ＣＡＲを発現するＴＣＲα不活性化細胞の増殖
図１５は、レアカットエンドヌクレアーゼ用いたＴＣＲα不活性化の概略図を示す。Ｔ細胞レセプターα定常鎖領域（ＴＲＡＣ）遺伝子内の、１５ｂｐのスペーサーで隔てられた、長さが１７ｂｐである２つの配列（半標的と呼ぶ）を標的とするヘテロダイマーのＴＡＬＥヌクレアーゼを設計して、産生させた。各半標的は、表１１に列挙した半ＴＡＬＥヌクレアーゼの反復配列によって認識される。

各ＴＡＬＥヌクレアーゼ構築物を、制限酵素消化を用いて、Ｔ７プロモーターの制御下にある哺乳動物発現ベクターにサブクローニングした。ＴＲＡＣゲノム配列を切断するＴＡＬＥヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを、Ｔ７プロモーターの下流にコード配列を保持するプラスミドによって合成した。

抗ＣＤ３／ＣＤ２８コーティングビーズによって７２時間にわたって前もって活性化した精製Ｔ細胞を、半ＴＲＡＣ＿Ｔ０１ＴＡＬＥヌクレアーゼの双方をコードする２種のｍＲＮＡのそれぞれでトランスフェクトした。トランスフェクションしてから４８時間後、同じドナー由来の異なるＴ細胞グループに、上記で説明したＲＯＲ１ＣＡＲ（配列番号７９〜１３８）の１つをコードするレンチウイルスベクターを用いて形質導入した。形質導入してから２日後に抗ＣＤ３磁気ビーズを用いてＣＤ３_ＮＥＧ細胞を精製し、形質導入してから５日後に可溶性抗ＣＤ２８（５μｇ／ｍｌ）を用いて細胞を再活性化した。

続いて、１週間に２回、細胞数をカウントすることによって、再活性化後３０日まで細胞を増殖させた。ＲＯＲ１ＣＡＲを発現するＴＣＲα不活性化細胞の増殖が、特に抗ＣＤ２８で再活性化した場合に、非形質導入細胞と比べて増大することが観察された。

ＲＯＲ１ＣＡＲを発現するヒトＴ細胞が活性化状態を示すかどうかを研究するために、形質導入してから７日後に、活性化マーカーＣＤ２５の発現をＦＡＣＳによって分析した。ＲＯＲ１ＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターで形質導入した精製細胞について、非形質導入細胞と比較して活性化しているかを評価するために、細胞表面におけるＣＤ２５発現をアッセイした。ＣＤ２５発現の増大によって、抗ＣＤ２８再活性化、または非再活性化状態が示された。

参考文献

Claims (54)

1. 図４に記載のＶ３、Ｖ５、およびＶ１から選択されるポリペプチド構造の１つを有するＲＯＲ１（ＮＴＲＫＲ１）特異的キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）であって、前記構造は、モノクローナル抗ＲＯＲ１抗体由来のＶＨおよびＶＬを含む細胞外リガンド結合ドメイン、ヒンジ、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ならびに４−１ＢＢ由来のＣＤ３ζシグナリングドメインおよび共刺激ドメインを含む細胞質ドメイン、を含む、ＲＯＲ１（ＮＴＲＫＲ１）特異的キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）。
2. ＣＤ８α膜貫通ドメインが、配列番号６と、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を共有する、請求項１に記載のＲＯＲ１（ＮＴＲＫＲ１）特異的キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）。
3. ヒンジが、ＣＤ８αヒンジ、ＩｇＧ１ヒンジ、およびＦｃγＲＩＩＩαヒンジから選択される、請求項１または２に記載のＲＯＲ１（ＮＴＲＫＲ１）特異的キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）。
4. ヒンジが、それぞれ構造Ｖ３、Ｖ５、およびＶ１に関する配列番号４（ＣＤ８α）、配列番号５（ＩｇＧ１）、および配列番号３（ＦｃγＲＩＩＩα）と、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を共有する、請求項１または２に記載のＲＯＲ１（ＮＴＲＫＲ１）特異的キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）。
5. 前記ヒンジが、配列番号４と少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＤ８αヒンジである、請求項１〜４のいずれか１項に記載のＲＯＲ１特異的ＣＡＲ。
6. 配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するＣＤ８αヒンジと、配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するＣＤ８α膜貫通ドメインとを含むポリペプチド構造Ｖ３を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載のＲＯＲ１特異的ＣＡＲ。
7. 前記ヒンジが、配列番号５と少なくとも８０％の同一性を有するＩｇＧ１ヒンジである、請求項１〜４のいずれか１項に記載のＲＯＲ１特異的ＣＡＲ。
8. 配列番号５に記載のアミノ酸配列を有するＩｇＧ１ヒンジと、配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するＣＤ８α膜貫通ドメインとを含むポリペプチド構造Ｖ５を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載のＲＯＲ１特異的ＣＡＲ。
9. 前記ヒンジが、配列番号３と少なくとも８０％の配列同一性を有するＦｃγＲＩＩＩαヒンジである、請求項１〜４のいずれか１項に記載のＲＯＲ１特異的ＣＡＲ。
10. 配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するＦｃγＲＩＩＩαヒンジと、配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するＣＤ８α膜貫通ドメインとを含むポリペプチド構造Ｖ１を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載のＲＯＲ１特異的ＣＡＲ。
11. 前記細胞外リガンド結合ドメインが、
    − 配列番号５４（ＣＤＲ−Ｈ１）、配列番号５５（ＣＤＲ−Ｈ２）、および配列番号５６（ＣＤＲ−Ｈ３）のマウスモノクローナル抗体Ｈ１０由来のＣＤＲを含む可変重鎖ＶＨと、
    − 配列番号５９（ＣＤＲ−Ｌ１）、配列番号６０（ＣＤＲ−Ｌ２）、および配列番号６１（ＣＤＲ−Ｌ３）のマウスモノクローナル抗体Ｈ１０由来のＣＤＲを含む可変軽鎖ＶＬとを含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＲＯＲ１特異的キメラ抗原レセプター。
12. 前記細胞外リガンド結合ドメインが、
    − 配列番号２８（ＣＤＲ−Ｈ１）、配列番号２９（ＣＤＲ−Ｈ２）、および配列番号３０（ＣＤＲ−Ｈ３）のマウスモノクローナル抗体Ｄ１０由来のＣＤＲを含む可変重鎖ＶＨと、
    − 配列番号３３（ＣＤＲ−Ｌ１）、配列番号３４（ＣＤＲ−Ｌ２）、および配列番号３５（ＣＤＲ−Ｌ３）のマウスモノクローナル抗体Ｄ１０由来のＣＤＲを含む可変軽鎖ＶＬとを含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＲＯＲ１特異的キメラ抗原レセプター。
13. 前記細胞外リガンド結合ドメインが、ＶＨ鎖およびＶＬ鎖を含み、これらの鎖が、それぞれ配列番号５３（Ｈ１０−ＶＨ）および配列番号５８（Ｈ１０−ＶＬ）と、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＲＯＲ１特異的キメラ抗原レセプター。
14. 前記細胞外リガンド結合ドメインが、ＶＨ鎖およびＶＬ鎖を含み、これらの鎖が、それぞれ配列番号２７（Ｄ１０−ＶＨ）および配列番号３２（Ｄ１０−ＶＬ）と、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＲＯＲ１特異的キメラ抗原レセプター。
15. 前記細胞外リガンド結合ドメインが、ヒト化されたＨ１０抗体またはＤ１０抗体由来のＶＨ鎖およびＶＬ鎖を含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のＲＯＲ１特異的キメラ抗原レセプター。
16. 前記細胞外リガンド結合ドメインが、ＶＨ鎖およびＶＬ鎖を含み、
    − ＶＨ鎖が、配列番号５７でコードされるポリペプチドを有し、
    − ＶＬ鎖が、配列番号６２でコードされるポリペプチドを有する、請求項１５に記載のＲＯＲ１特異的キメラ抗原レセプター。
17. 前記細胞外リガンド結合ドメインが、
    − 配列番号３１でコードされるポリペプチドを有するＶＨ鎖、および
    − 配列番号３６でコードされるポリペプチドを有するＶＬ鎖を含む、請求項１５に記載のＲＯＲ１特異的キメラ抗原レセプター。
18. 前記ＣＡＲポリペプチドが、配列番号１１７（Ｈ１０ｖ３−ＣＡＲ配列）と、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を共有する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＲＯＲ１特異的キメラ抗原レセプター。
19. 前記ＣＡＲポリペプチドが、配列番号９３（Ｄ１０ｖ３−ＣＡＲ配列）と、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を共有する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＲＯＲ１特異的キメラ抗原レセプター。
20. 前記ＣＡＲポリペプチドが、それぞれ配列番号９５（Ｄ１０ｖ５−ＣＡＲ配列）と、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を共有する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＲＯＲ１特異的キメラ抗原レセプター。
21. ４−１ＢＢ由来の共刺激ドメインが、配列番号８と、少なくとも８０％の同一性を有する、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のＲＯＲ１特異的ＣＡＲ。
22. 前記ＣＤ３ζシグナリングドメインが、配列番号９と、少なくとも８０％の同一性を有する、請求項１〜２１のいずれか１項に記載のＲＯＲ１特異的ＣＡＲ。
23. ＲＯＲ１に特異的でない、別の細胞外リガンド結合ドメインをさらに含む、請求項１〜２２のいずれか１項に記載のＲＯＲ１特異的ＣＡＲ。
24. シグナルペプチドをさらに含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のＲＯＲ１特異的ＣＡＲ。
25. 前記シグナルペプチドが、配列番号１または配列番号２と少なくとも８０％の配列同一性を有する、請求項２４に記載のＲＯＲ１特異的ＣＡＲ。
26. 請求項１〜２５のいずれか１項に記載のキメラ抗原レセプターをコードする、ポリヌクレオチド。
27. 請求項２６の核酸を含む、発現ベクター。
28. 請求項１〜２５のいずれか１項に記載のＲＯＲ１特異的キメラ抗原レセプターを、細胞の表面膜に発現する、遺伝子操作された免疫細胞。
29. 炎症性Ｔリンパ球、細胞障害性Ｔリンパ球、調節性Ｔリンパ球、またはヘルパーＴリンパ球に由来する、請求項２８に記載の遺伝子操作された免疫細胞。
30. ＮＫ細胞に由来する、請求項２８に記載の遺伝子操作された免疫細胞。
31. 治療に用いるための、請求項２８〜３０のいずれか１項に記載の遺伝子操作された免疫細胞。
32. ヒト治療に用いるための、請求項２８〜３１のいずれか１項に記載の遺伝子操作された免疫細胞。
33. 状態が、ＲＯＲ１発現細胞によって特徴づけられる前悪性または悪性のがん状態である、治療に用いるための、請求項２８〜３２のいずれか１項に記載の遺伝子操作された免疫細胞。
34. 状態が、過剰なＲＯＲ１発現細胞によって特徴づけられる状態である、治療に用いるための、請求項２８〜３３のいずれか１項に記載の遺伝子操作された免疫細胞。
35. 状態が、血液がんの状態である、治療に用いるための、請求項２８〜３４のいずれか１項に記載の遺伝子操作された免疫細胞。
36. 血液がんの状態が、白血病である、治療に用いるための、請求項２８〜３５のいずれか１項に記載の遺伝子操作された免疫細胞。
37. 血液がんの状態が、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、または小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）である、治療に用いるための、請求項２８〜３６のいずれか１項に記載の遺伝子操作された免疫細胞。
38. 前記白血病が、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、および骨髄異形成症候群からなる群から選択される、治療に用いるための、請求項２８〜３６のいずれか１項に記載の遺伝子操作された免疫細胞。
39. 前記白血病が、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、ｔ（１；１９）染色体転座を伴う急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）である、治療に用いるための、請求項２８〜３６のいずれか１項に記載の遺伝子操作された免疫細胞。
40. 状態が、充実性腫瘍である、治療に用いるための、請求項２８〜３４のいずれか１項に記載の遺伝子操作された免疫細胞。
41. 腫瘍が、乳房、結腸、肺、または腎臓腫瘍である、治療に用いるための、請求項４０に記載の遺伝子操作された免疫細胞。
42. 腫瘍が、腎臓、膵臓、または卵巣腫瘍である、治療に用いるための、請求項４０に記載の遺伝子操作された免疫細胞。
43. 前記免疫細胞において、ＴＣＲの発現が抑制されている、請求項２８〜４２のいずれか１項に記載の遺伝子操作された免疫細胞。
44. 前記免疫細胞において、少なくとも１つのＭＨＣタンパク質、好ましくはβ２ｍまたはＨＬＡの発現が抑制されている、請求項２８〜４３のいずれか１項に記載の遺伝子操作された免疫細胞。
45. 前記細胞を変異させ、少なくとも１つの免疫抑制薬または化学療法薬に対する耐性を付与した、請求項２８〜４４のいずれか１項に記載の遺伝子操作された免疫細胞。
46. 血液がん細胞を障害する方法であって、前記がん細胞を障害する有効量の請求項２８〜４５のいずれか１項に記載の遺伝子操作された免疫細胞と、前記細胞とを接触させることを含む、方法。
47. 免疫細胞の遺伝子操作方法であって、
    （ａ）免疫細胞を準備することと、
    （ｂ）前記細胞の表面に、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の少なくとも１つのＲＯＲ１特異的キメラ抗原レセプターを発現させることとを含む、方法。
48. （ａ）免疫細胞を準備することと、
    （ｂ）前記細胞内に、前記ＲＯＲ１特異的キメラ抗原レセプターをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを導入することと、
    （ｃ）前記細胞内で、前記ポリヌクレオチドを発現させることとを含む、請求項４７に記載の免疫細胞の遺伝子操作方法。
49. （ａ）免疫細胞を準備することと、
    （ｂ）前記細胞内に、前記ＲＯＲ１特異的キメラ抗原レセプターをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを導入することと、
    （ｃ）ＲＯＲ１に特異的でない、少なくとも１つの他のキメラ抗原レセプターを導入することとを含む、請求項４７に記載の免疫細胞の遺伝子操作方法。
50. 治療を必要とする対象の治療方法であって、
    （ａ）請求項１〜２５のいずれか１項に記載のＲＯＲ１特異的キメラ抗原レセプターを表面に発現する免疫細胞を準備することと、
    （ｂ）前記免疫細胞を前記患者に投与することとを含む、方法。
51. 前記患者が、ステップ（ｂ）の投与前にリンパ球枯渇にされ、前記免疫細胞が、請求項２８〜４５に記載のいずれか１つである、請求項５０に記載の治療を必要とする対象の治療方法。
52. 前記リンパ球枯渇が、フルダラビン（Ｆ）、シクロホスファミド（Ｃ）、ベンダムスチン（Ｂ）、もしくはリツキシマブ（Ｒ）、またはこれらの組み合わせなどの薬物の投与によって実施される、請求項５１に記載の治療を必要とする対象の治療方法。
53. 前記免疫細胞が、ドナーから提供される、請求項５０〜５２のいずれか１項に記載の方法。
54. 前記免疫細胞が、患者自身から提供される、請求項５０〜５２のいずれか１項に記載の方法。