ES2715413T3 - Receptores de antígeno quiméricos específicos para ROR1 (NTRKR1) para inmunoterapia contra el cáncer - Google Patents

Abstract

Receptor de antígeno quimérico (CAR) específico para ROR1 (NTRKR1) que tiene una de la estructura de polipéptido seleccionada de V3, V5 y V1 tal como se ilustra en la figura 4, comprendiendo dicha estructura un dominio de unión a ligando extracelular que comprende VH y VL de un anticuerpo anti-ROR1 monoclonal, una bisagra, un dominio transmembrana de CD8α y un dominio citoplasmático que incluye un dominio de señalización de CD3 zeta y un dominio coestimulador de 4-1BB; en el que dicho dominio de unión a ligando extracelular comprende: - una cadena VH pesada variable que comprende las CDR del anticuerpo monoclonal de ratón H10 de SEQ ID NO: 54 (CDR-H1), SEQ ID NO: 55 (CDR-H2) y SEQ ID NO: 56 (CDR-H3), y - una cadena VL ligera variable que comprende las CDR del anticuerpo monoclonal de ratón H10 de SEQ ID NO: 59 (CDR-L1), SEQ ID NO: 60 (CDR-L2) y SEQ ID NO: 61 (CDR-L3); o - una cadena VH pesada variable que comprende las CDR del anticuerpo monoclonal de ratón D10 de SEQ ID NO: 28 (CDR-H1), SEQ ID NO: 29 (CDR-H2) y SEQ ID NO: 30 (CDR-H3), y - una cadena VL ligera variable que comprende las CDR del anticuerpo monoclonal de ratón D10 de SEQ ID NO: 33 (CDR-L1), SEQ ID NO: 34 (CDR-L2) y SEQ ID NO: 35 (CDR-L3).

Description

DESCRIPCIÓN

Receptores de antígeno quiméricos específicos para ROR1 (NTRKR1) para inmunoterapia contra el cáncer Campo de la invención

La presente invención se refiere a receptores de antígeno quiméricos (CAR) que son proteínas quiméricas recombinantes que pueden redirigir la especificidad y reactividad de células inmunitarias frente a ROR1, una glicoproteína de superficie celular encontrada en la mayoría de las células mieloides y usada para diagnosticar leucemia linfocítica crónica (CLL) o tumores sólidos tales como tumores de mama, colon, pulmón y riñón en pacientes. Los CAR según la invención son particularmente útiles para tratar células malignas que portan el antígeno ROR1, cuando se expresan en células T o células NK. Las células inmunitarias modificadas por ingeniería resultantes presentan un alto nivel de especificidad frente a células malignas, confiriendo seguridad y eficacia para inmunoterapia.

Antecedentes de la invención

La inmunoterapia adoptiva, que implica la transferencia de células T específicas para antígeno autólogas generadas ex vivo, es una estrategia prometedora para tratar infecciones virales y cáncer. Las células T usadas para la inmunoterapia adoptiva pueden generarse o bien mediante expansión de células T específicas para antígeno o bien mediante redirección de células T mediante ingeniería genética (Park, Rosenberg et al. 2011). La transferencia de células T específicas para antígeno viral es un procedimiento bien establecido usado para el tratamiento de infecciones virales asociadas con trasplante y neoplasias malignas relacionadas con virus poco frecuentes. De manera similar, se ha mostrado que el aislamiento y la transferencia de células T específicas de tumor son satisfactorios en el tratamiento de melanoma.

Se han generado satisfactoriamente especificidades novedosas en células T mediante la transferencia genética de receptores de células T transgénicos o receptores de antígeno quiméricos (CAR) (Jena, Dotti et al. 2010). En la figura 1 se presenta una representación esquemática para las 3 generaciones de CAR. Los CAR son receptores sintéticos que consisten en un resto de direccionamiento que está asociado con uno o más dominios de señalización en una única molécula de fusión. En general, el resto de unión de un CAR consiste en un dominio de unión a antígeno de un anticuerpo de cadena sencilla (scFv), que comprende los fragmentos ligero y variable de un anticuerpo monoclonal unidos mediante un ligador flexible. También se han usado satisfactoriamente restos de unión basados en dominios de receptor o ligando. Los dominios de señalización para CAR de primera generación se derivan de la región citoplasmática de las cadenas gamma de receptor de Fc o CD3zeta. Se ha mostrado que los CAR de primera generación redirigen satisfactoriamente la citotoxicidad de células T. Sin embargo, no lograron proporcionar expansión y actividad antitumoral prolongadas in vivo. Se han añadido dominios de señalización de moléculas coestimuladoras, así como dominios transmembrana y de bisagra, para formar CAR de segunda y tercera generaciones, conduciendo a algunos ensayos terapéuticos satisfactorios en seres humanos, en los que pudieron redirigirse células T contra células malignas que expresaban CD19 (June et al., 2011). Sin embargo, la combinación particular de dominios de señalización, dominios transmembrana y coestimuladores usada con respecto a ScFv frente a CD19, fue más bien específica de antígeno y no puede expandirse a cualquier marcador antigénico.

La leucemia linfocítica crónica (CLL) es una de las leucemias más habitualmente diagnosticadas tratada por hematólogos en ejercicio. Durante muchos años, los pacientes con CLL se han considerado similares, con una larga historia natural y terapias tan sólo marginalmente eficaces que pocas veces producían respuestas completas. Recientemente, varias observaciones importantes relacionadas con la importancia biológica del estado de mutación de Vh y la sobreexpresión de ZAP-70 asociada, función de p53 alterada y aberraciones cromosómicas, han conducido a poder identificar a pacientes con un alto riesgo de progresión temprana de la enfermedad y supervivencia inferior. De manera concurrente con estas investigaciones, se han introducido varios tratamientos incluyendo los análogos de nucleósidos, anticuerpos monoclonales rituximab y alemtuzumab. La combinación de estas terapias en ensayos clínicos ha conducido a altas tasas de respuesta completa y global cuando se aplican como terapia inicial para CLL sintomática. Por tanto, la complejidad de la estratificación de riesgo inicial de CLL y el tratamiento ha aumentado significativamente. Además, cuando estas terapias iniciales no funcionan, el enfoque del paciente con CLL con enfermedad que no responde al tratamiento con fludarabina puede ser bastante difícil (Byrd J.C et al, 2014).

Un antígeno candidato de inmunoterapias para leucemia linfocítica crónica (CLL) es el receptor transmembrana de tirosina-proteína cinasa ROR1 (también denominado NTRKR1; entradas de UniProtKB/TrEMBL: Q01973). ROR1 (el receptor huérfano de tipo tirosina cinasa receptora 1) es una glicoproteína de 120 kDa que contiene un dominio rico en cisteína de tipo inmunoglobulina extracelular (Ig), de tipo Kringle y Frizzled (figura 2). La proteína codificada por este gen es una tirosina cinasa receptora que modula el crecimiento de neuritas en el sistema nervioso central. Es una proteína de membrana tipo I y pertenece a la subfamilia de ROR de receptores de superficie celular (Reddy et al, 1997). Aunque la expresión de proteína ROR1 en pacientes con CLL con respecto a leucocitos normales y su papel en la biopatología de CLL merece estudios adicionales. ROR1 puede ser una diana apropiada para inmunoterapia contra el cáncer (Daneshmanesh et al; 2008). ROR1 se expresa de hecho en una variedad de neoplasias malignas de células B, pero también en subconjuntos de algunos tumores sólidos, incluyendo tumores de mama, colon, pulmón y riñón. Se cree que ROR1 funciona en la señalización oncogénica para fomentar la supervivencia de células tumorales en tumores epiteliales. De manera importante, ROR1 no se expresa en órganos vitales, excepto tejido adiposo y pancreático, lo cual reduce posibles toxicidades debidas a la destrucción de células normales (Hudecek et al, 2013). ROR1 se expresa durante la embriogénesis pero está ausente de tejidos adultos normales, aparte de un subconjunto de precursores de células B inmaduros y la expresión de bajo nivel en adipocitos (Hudecek et al., 2010; Matsuda et al., 2001). Se mostró por primera vez que ROR1 se expresaba en leucemia linfocítica crónica de células B (B-CLL) mediante determinación de perfil de transcripción (Klein et al., 2001; Rosenwald et al., 2001) y posteriormente se identificó en la superficie de muchos cánceres incluyendo linfoma de células del manto (MCL), leucemia linfoblástica aguda (ALL) con una translocación cromosómica t(1;19) y un subconjunto de cánceres de pulmón, mama, colon, páncreas, renal y de ovarios (Baskar et al., 2008; Bicocca et al., 2012; Daneshmanesh et al., 2008; Dave et al., 2012; Fukuda et al., 2008; Yamaguchi et al., 2012; Zhang et al., 2012a, 2012b). Tanto en adenocarcinoma de pulmón como en ALL con t(1;19), ROR1 actúa conjuntamente en la señalización oncogénica y el silenciamiento de ROR1 con ARNip expuso un papel crítico para esta molécula en el mantenimiento de la supervivencia de células tumorales (Bicocca et al., 2012; Choudhury et al., 2010; Gentile et al., 2011; Yamaguchi et al., 2012). Por tanto, la pérdida de ROR1 no puede tolerarse fácilmente por tumores, haciendo que sea un candidato atractivo para terapia de células T dirigidas por CAR que puede aplicarse ampliamente. Por tanto, los presentes inventores han considerado que ROR1 puede ser un antígeno diana valioso para tratar CLL así como tumores sólidos tales como tumores de mama, colon, pulmón, ovarios y riñón, usando células T que expresan CAR.

Los laboratorios del Dr. Stanley Riddell y del Dr. Laurence Cooper han modificado anteriormente por ingeniería y validado scCAR anti-ROR1 que contienen los scFv 4A5 y 2A2, respectivamente (Cooper et al 2010; Hudecek et al., 2013) . En particular, Hudecek et al da a conocer scCAR anti-ROR1 que contienen una bisagra de IgG4 de diversa longitud y un dominio transmembrana de CD28.

La solicitud de patente estadounidense US 2013/287748 da a conocer un receptor de antígeno quimérico específico para ROR1 que comprende un dominio de unión a ligando extracelular que comprende Vh y Vl de un anticuerpo anti-ROR1 monoclonal, una bisagra de CD8-alfa, un dominio transmembrana de CD8-alfa y un dominio citoplasmático que incluye un dominio de señalización de CD3-zeta y un dominio coestimulador de 4-1BB.

Todavía existe la necesidad de mejora de la funcionalidad de CAR diseñando arquitectura de CAR y usando componentes adecuados, dado que estos parámetros desempeñan un papel importante y un ajuste fino si es necesario.

Por tanto, como alternativa a las estrategias anteriores, la presente invención proporciona CAR específicos para ROR1, que pueden expresarse en células inmunitarias para seleccionar como diana células malignas con ROR1 con ventaja clínica significativa. Los inventores han encontrado que, combinando la arquitectura de CAR con la elección de componentes adecuados, pueden obtener CAR de cadena sencilla específicos para ROR1 con alta citotoxicidad frente a células diana cancerosas.

Sumario de la invención

Los inventores han generado un CAR específico para ROR1 que tiene una estructura diferente y que comprende un scFV diferente derivado de diferentes anticuerpos específicos para ROR1.

El alcance de la invención se define por el juego de reivindicaciones adjunto.

Un receptor de antígeno quimérico (CAR) específico para ROR1 (NTRKR1) según la presente invención tiene una de la estructura de polipéptido seleccionada de V1 a V6 tal como se ilustra en la figura 4, comprendiendo dicha estructura un dominio de unión a ligando extracelular que comprende V^h y V^l de un anticuerpo anti-ROR1 monoclonal, una bisagra, un dominio transmembrana y un dominio citoplasmático que incluye un dominio de señalización de CD3 zeta y un dominio coestimulador de 4-1BB.

Más particularmente, un receptor de antígeno quimérico (CAR) específico para ROR1 (NTRKR1) según la presente invención puede tener una de la estructura de polipéptido seleccionada de V3, V5 y V1 tal como se ilustra en la figura 4, comprendiendo dicha estructura un dominio de unión a ligando extracelular que comprende V^h y V^l de un anticuerpo anti-ROR1 monoclonal, una bisagra, un dominio transmembrana de CD8a, un dominio citoplasmático que incluye un dominio de señalización de CD3 zeta y un dominio coestimulador de 4-1BB. Se ha encontrado que tales receptores de antígeno específicos para ROR1 (NTRKR1) tienen efectos superiores inesperados en cuanto a la citotoxicidad.

En una realización, un CAR específico para ROR1 tiene una estructura V1 y comprende una bisagra de FcyRIIIa y dominio transmembrana de CD8a.

En una realización preferida, un CAR específico para ROR1 tiene una estructura V3 y comprende una bisagra de CD8a y un dominio transmembrana de CD8a.

En otra realización preferida, un CAR específico para ROR1 tiene una estructura V5 y comprende una bisagra de IgG1 y un dominio transmembrana de CD8a.

En particular, dichos dominios de unión a antígeno (scFv) derivados de los anticuerpos anti-ROR1 H10 y D10 han mostrado propiedades anticancerosas notables.

Además, se han generado scFv humanizados a partir de los anticuerpos anti-ROR1 H10 y D10 murinos.

Los polipéptidos de CAR preferidos de la invención comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 79 a 138. Tras la activación no específica in vitro (por ejemplo con perlas recubiertas con anticuerpo anti-CD3/CD28 e IL2 recombinante), se han transformado células T de donantes con polinucleótidos que expresan estos CAR usando transducción viral. En determinados casos, se modificaron adicionalmente por ingeniería las células T para crear células T no alorreactivas, más especialmente mediante alteración de un componente de TCR (ap - receptores de células T) para prevenir la reacción de injerto contra huésped. Se ha encontrado que los CAR de la presente invención son particularmente eficaces en el contexto de células T alogénicas.

Las células T modificadas por ingeniería resultantes presentaron reactividad in vitro contra células positivas para ROR1 hasta diversos grados, mostrando que los CAR de la presente invención contribuyen a la activación dependiente de antígeno, y también a la proliferación, de las células T, haciendo que sean útiles para inmunoterapia. Los polipéptidos y las secuencias de polinucleótido que codifican para los CAR de la presente invención se detallan en la presente memoria descriptiva.

Las células inmunitarias modificadas por ingeniería de la presente invención son particularmente útiles para aplicaciones terapéuticas, tales como para tratar leucemia linfocítica crónica (CLL), el linfoma linfocítico de células pequeñas (SLL), el linfoma de células del manto (MCL), leucemia linfoblástica aguda (ALL) con una translocación cromosómica t(1;19). También pueden usarse para tratar tumores sólidos tales como tumores de mama, colon, pulmón y riñón.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: los receptores de antígeno quiméricos de cadena sencilla (scCAR) se crean lo más habitualmente uniendo las regiones variables de cadena pesada y ligera de un anticuerpo monoclonal (figura 1A) que se une a un antígeno específico en la parte intracelular de una molécula de señalización de células T, tales como componentes del complejo de CD3 asociado con TCR (cadena ÉJE') (figura 1B). La primera generación de scCAR sólo contienen un dominio de señalización de células T que transmite la señal de activación (figura 1C, izquierda). Los scCAR de segunda generación incorporan además un único endodominio de molécula coestimuladora, tal como el endodominio de CD28 ó 41BB (figura 1C, centro), que potencia la persistencia de células T y la función antitumoral in vivo. Los scCAR de tercera generación incorporan al menos dos endodominios de molécula coestimuladora, tales como el endodominio de CD28 y 41BB (figura 1C, derecha).

Figura 2: estructura de la proteína ROR1 que está compuesta por una parte extracelular, parte transmembrana y dominios intracelulares; conteniendo los extra e intracelulares múltiples partes tal como se explicó anteriormente. Figuras 3A, 3B, 3C y 3D: (I) Alineación de secuencias de secuencias murinas de Vh y Vl de D10 y H10 con secuencias humanas de línea germinal codificadas por genes V y J que codifican para la región variable de inmunoglobulinas, compartiendo esas secuencias una alta homología con las secuencias murinas. Con fines de estabilidad (en particular de CDR), las posiciones “más críticas” de AA se muestran mediante flechas en la línea superior y corresponden a AA que deben ser de origen murino, y las “menos críticas” en la línea inferior son las que pueden ser de origen o bien humano o bien murino. (II) MGT/DomainGapAlign (Lefranc et al. Dev. Comp. Immunol., 29, 185-203 (2005)) permite alinear y aplicar “huecos mediante IMGT” en la secuencia de aminoácidos de dominio de secuencias murinas de V^h y V^l de D10 y H10. Se presentan las secuencias de entrada, alineadas con la región V de línea germinal más cercana o el dominio C más cercano del directorio de dominios de IMGT y con huecos según la numeración única de IMGT para región V, dominio C y dominio de tipo C.

Figura 4: representación esquemática de la diferente arquitectura de CAR (V1 a V6).

Figura 5: número de moléculas de superficie de ROR1 en diferentes líneas celulares humanas.

Figura 6: procedimiento de examen de scCAR

Figura 7: expresión total de scCAR en células T humanas. (A) Experimento 1. (B) Experimento 2.

Figura 8: expresión en superficie celular de scCAR en células T humanas. (A) Experimento 1. (B) Experimento 2. Figura 9: desgranulación de células T modificadas por scCAR tras cultivo conjunto con células diana. Experimento 1. (B) Experimento 2 (líneas celulares y/o tratamiento de izquierda a derecha: MDA-MB-2301, PC-3, MCF-7, sin activación, PMA ionomicina).

Figura 10: expresión en superficie celular de scCAR en células T humanas. Los datos se presentan como media +/DE de cuatro experimentos independientes.

Figura 11: desgranulación de células T modificadas por scCAR tras el cultivo conjunto con células diana. Los datos se presentan como media /- DE de cuatro experimentos independientes.

Figura 12: producción de IFNy mediante células T modificadas por scCAR tras el cultivo conjunto con células diana. Los datos se presentan como media /- DE de cuatro experimentos independientes (líneas celulares y/o tratamiento de izquierda a derecha: Jeko-1, K562, MDA-MB-2301, pC-3, MCF-7, sin activación).

Figura 13: actividad citotóxica de células T modificadas por scCAR tras el cultivo conjunto con células diana adherentes. Los datos se presentan como media /- DE de cuatro experimentos independientes.

Figura 14: actividad citotóxica de células T modificadas por scCAR tras el cultivo conjunto con células diana en suspensión. Los datos se presentan como media /- DE de cuatro experimentos independientes.

Figura 15: representación esquemática de una célula inmunitaria modificada por ingeniería según la invención. La célula inmunitaria modificada por ingeniería presentada en esta figura es una célula T transducida con un polipéptido retroviral que codifica para CAR. Esta célula T se modifica adicionalmente por ingeniería para permitir un injerto mejor y más seguro en el paciente, lo cual es opcional dentro del contexto de la presente invención. El gen X puede ser, por ejemplo, un gen que expresa un componente de TCR (TCRalfa o TCRbeta), Y puede ser un gen implicado en la sensibilidad de células T frente a fármacos inmunosupresores tales como CD52 (con respecto a alemtuzumab) o HPRT (con respecto a 6-tioguanina).

Tabla 1: Secuencia de los diferentes componentes de CAR distintos de scFv

Tabla 2: Secuencia de los scFv de origen murino, sus CDR de scFv y scFv humanizados a partir de D10 y H10

Tabla 3: CAR de estructura V-1

Tabla 4: CAR de estructura V-2

Tabla 5: CAR de estructura V-3

Tabla 6: CAR de estructura V-4

Tabla 7: CAR de estructura V-5

Tabla 8: CAR de estructura V-6

Descripción detallada de la invención

A menos que se definan específicamente en el presente documento, todos los términos técnicos y científicos usados tienen el mismo significado que el que entiende habitualmente un experto en la técnica en los campos de la terapia génica, bioquímica, genética y biología molecular.

Todos los métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento pueden usarse en la puesta en práctica o pruebas de la presente invención, describiéndose métodos y materiales adecuados en el presente documento. En caso de conflicto, prevalecerá la presente memoria descriptiva, incluyendo las definiciones. Además, los materiales, métodos y ejemplos son sólo ilustrativos y no se pretende que sean limitativos, a menos que se especifique lo contrario.

La puesta en práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología celular, cultivo celular, biología molecular, biología transgénica, microbiología, ADN recombinante e inmunología, que se encuentran dentro de las habilidades de la técnica. Tales técnicas se explican completamente en la bibliografía. Véanse, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, EE.UU.); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, tercera edición, (Sambrook et al, 2001, Cold Spring Harbor, Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984); Mullís et al. patente estadounidense n.° 4.683.195; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Harries & S. J. Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); la serie, Methods In ENZYMOLOGY (J. Abelson and M. Simon, eds.-in-chief, Academic Press, Inc., Nueva York), específicamente, los volúmenes 154 y 155 (Wu et al. eds.) y el volumen 185, “Gene Expression Technology” (D. Goeddel, ed.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller y M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, Londres, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, volúmenes I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986); y Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986).

Receptores de antígeno quiméricos específicos para ROR1

La presente invención se refiere a nuevos diseños de receptor de antígeno quimérico (CAR) anti-ROR1 que comprenden un dominio de unión a ligando extracelular, un dominio transmembrana y un dominio de transducción de la señalización.

El término “dominio de unión a ligando extracelular” tal como se usa en el presente documento se define como un oligo o polipéptido que puede unirse a un ligando. Preferiblemente, el dominio podrá interaccionar con una molécula de superficie celular. Por ejemplo, el dominio de unión a ligando extracelular puede elegirse para reconocer un ligando que actúa como marcador de superficie celular en células diana asociado con un estado patológico particular. En una realización preferida, dicho dominio de unión a ligando extracelular comprende un fragmento de anticuerpo de cadena sencilla (scFv) que comprende el fragmento variable ligero (V^l) y pesado (V^h) de un anticuerpo anti-CD-123 monoclonal específico de antígeno diana unido a un ligador flexible. Dichos V^l y V^h se seleccionan preferiblemente de los anticuerpos denominados 2A2, 4A5 y D10 tal como se indica en la tabla 2.

Además, la tabla 2 que también hace referencia a V^l y V^h de G6, G3, H10, 2A4 y 1C11, da a conocer sus secuencias respectivas SEQ ID NO: 37, 41, 45, 49, 53, 58, 63, 67, 71 y 75, así como V^l y V^h humanizados de D10 y H10 de secuencia respectiva SEQ ID NO: 31, 36, 57 y 62.

La figura 4 muestra la arquitectura de las 6 versiones de CAR según la presente invención. La tabla 1 muestra, como ejemplos, los componentes usados en los experimentos adicionales.

Un receptor de antígeno quimérico (CAR) específico para ROR1 (NTRKR1) según la presente invención puede tener una de la estructura de polipéptido seleccionada de V1 a V6 tal como se ilustra en la figura 4, comprendiendo dicha estructura un dominio de unión a ligando extracelular que comprende V^h y V^l de un anticuerpo anti-ROR1 monoclonal, una bisagra, un dominio transmembrana y un dominio citoplasmático que incluye un dominio de señalización de CD3 zeta y un dominio coestimulador de 4-1BB.

Más específicamente, la presente invención se refiere a receptores de antígeno quiméricos (CAR) específicos para ROR1 (NTRKR1) que tienen una de la estructura de polipéptido seleccionada de V3, V5 y V1 tal como se ilustra en la figura 4, comprendiendo dicha estructura un dominio de unión a ligando extracelular que comprende Vh y Vl de un anticuerpo anti-ROR1 monoclonal, una bisagra, un dominio transmembrana de CD8a y un dominio citoplasmático que incluye un dominio de señalización de CD3 zeta y un dominio coestimulador de 4-1BB.

Dominio de unión a antígeno

El dominio de unión a antígeno de los CAR de ROR1 de la invención puede ser cualquier dominio que se une al antígeno de tejido desactivado incluyendo, pero sin limitarse a, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo recombinante, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado y un fragmento funcional de los mismos.

En una realización preferida, dicho dominio de unión a ligando extracelular comprende un fragmento de anticuerpo de cadena sencilla (scFv) que comprende el fragmento variable ligero (Vl) y pesado (Vh) de un anticuerpo contra ROR1 monoclonal específico de antígeno diana unido a un ligador flexible. Dichos Vl y Vh se seleccionan preferiblemente de los anticuerpos denominados H10, D10, 4A5, G6, G3, 2A2, 2A4 y 1C11 tal como se indica en la tabla 2. Preferiblemente están unidos entre sí mediante un ligador flexible que comprende por ejemplo la secuencia SEQ ID NO: 10. Dicho de otro modo, dichos CAR comprenden preferiblemente un dominio de unión a ligando extracelular que comprende una secuencia de polipéptido que presenta al menos el 90%, el 95% el 97% o el 99% de identidad con secuencias procedentes de combinaciones de cadenas Vh y Vl (con un ligador entre las mismas) tal como se representa en la tabla 3 a la tabla 8 para las versiones V1 a V6.

En realizaciones particulares preferidas, dichos V^l y V^h se derivan del anticuerpo H10.

En otras realizaciones particulares, dichos V^l y V^h se derivan del anticuerpo D10.

Por el término “anticuerpo recombinante” tal como se usa en el presente documento quiere decirse un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se genera usando tecnología de ADN recombinante, tal como, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo expresado por un bacteriófago, un sistema de expresión en levadura o un sistema de expresión en células de mamífero, y más especialmente por una célula T transducida con un vector viral que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para regiones CDR de un anticuerpo. También debe interpretarse que el término significa un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se ha generado mediante la síntesis de una molécula de ADN que codifica para el anticuerpo o fragmento de anticuerpo y molécula de ADN que expresa una proteína de anticuerpo o fragmento de anticuerpo, o una secuencia de aminoácidos que especifica el anticuerpo o fragmento de anticuerpo, en el que el ADN o la secuencia de aminoácidos se ha obtenido usando tecnología de secuencia de aminoácidos o ADN sintético o recombinante que está disponible y se conoce bien en la técnica.

Por el término “anticuerpo humanizado” tal como se usa en el presente documento quiere decirse los polipéptidos que incluyen una región variable de cadena pesada humanizada y una región variable de cadena ligera humanizada. Por ejemplo, los polipéptidos pueden incluir las regiones de marco (FR) de las regiones variables de cadena ligera y pesada de un anticuerpo humano, al tiempo que conservan sustancialmente la especificidad de unión a antígeno de un anticuerpo monoclonal original. La región variable de cadena pesada humanizada y/o la región variable de cadena ligera humanizada están humanizadas en al menos aproximadamente el 87%, humanizadas en al menos aproximadamente el 90%, humanizadas en al menos aproximadamente el 95%, humanizadas en al menos aproximadamente el 98% o humanizadas en al menos aproximadamente el 100%, excluyendo las regiones determinantes de complementariedad (CDR). Las moléculas de polipéptidos de unión a antígeno pueden derivarse de donantes de anticuerpos monoclonales (por ejemplo, donantes de anticuerpos monoclonales de ratón) y pueden incluir CDR de los anticuerpos monoclonales (por ejemplo, CDR monoclonales de ratón). Cuando

Por el término “anticuerpo monoclonal” tal como se usa en el presente documento quiere decirse un anticuerpo producido mediante un clon celular que se hace crecer en laboratorio, o bien de un hibridoma o bien de un linfocito transformado por virus, que es más abundante y uniforme que un anticuerpo natural y que puede unirse específicamente a un único sitio en el antígeno ROR1. Son anticuerpos monoespecíficos que se producen por células inmunitarias idénticas que son todas ellas clones de una única célula madre, a diferencia de anticuerpos policlonales que se producen a partir de varias células inmunitarias diferentes. Los anticuerpos monoclonales tienen afinidad monovalente, en cuanto a que se unen al mismo epítopo.

La presente invención da a conocer un receptor de antígeno quimérico específico para ROR1 (CAR de ROR1) tal como anteriormente, en el que dicho dominio de unión a ligando extracelular comprende las cadenas V^h y V^l que están humanizadas.

La tabla 2 muestra las secuencias de scFv humanizado (cadenas Vh y Vl) correspondientes a los anticuerpos anti-ROR1 D10 y H10.

Las figuras 3A a 3D presentan las alineaciones de scFv de D10 y H10 de origen murino frente a su forma humanizada tras haberse aplicado la metodología según Lefranc MP et al (Lefranc, MP, Ehrenmann F , Ginestoux C, Giudicelli V, Duroux P “Use of IMGT (®) databases and tools for antibody engineering and humanization”, Methods Mol Biol. 2012; 907: 3-37). En estas cuatro alineaciones se indican:

- las CDR,

- los aminoácidos (AA) “más críticos” con una flecha superior que significa que esos AA se mantienen como origen murino;

- los aminoácidos “menos críticos” con una flecha superior que significa que esos AA pueden ser de origen murino o de origen humano; se entiende que las secuencias humanizadas de la invención son realmente un conjunto de todas las secuencias diferentes posibles realizadas mediante todas las combinaciones de tales AA “menos críticos” de origen humano o murino; las secuencias que contienen las CDR y los AA “más críticos” tal como acaban de presentarse anteriormente.

Un anticuerpo humanizado puede producirse usando una variedad de técnicas conocidas en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, injerto de CDR (véanse, por ejemplo, la patente europea n.° EP 239.400; la publicación internacional n.° WO 9l/09967; y las patentes estadounidenses n.os 5.225.539, 5.530.101 y 5.585.089), rebarnizado o rechapado (véanse, por ejemplo, las patentes europeas n.os EP 592.106 y EP 519.596; Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28(4/5):489-498; Studnicka et al., 1994, Protein Engineering, 7(6):805-814; y Roguska et al., 1994, PNAS, 91:969-973), intercambio de cadena (véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 5.565.332) y técnicas dadas a conocer, por ejemplo, en la publicación de solicitud de patente estadounidense n.° US2005/0042664, la publicación de solicitud de patente estadounidense n.° US2005/0048617, la patente estadounidense n.° 6.407.213, la patente estadounidense n.° 5.766.886, la publicación internacional n.° WO 9317105, Tan et al., J. Immunol., 169: 1119-25 (2002), Caldas et al., Protein Eng., 13(5):353-60 (2000), Morea et al., Methods, 20(3):267-79 (2000), Baca et al., J. Biol. Chem., 272(16): 10678-84 (1997), Roguska et al., Protein Eng., 9(10):895-904 (1996), Couto et al., Cancer Res., 55 (23 Sup.): 5973s-5977s (1995), Couto et al., Cancer Res., 55(8): 1717-22 (1995), Sandhu J S, Gene, 150(2):409-10 (1994), y Pedersen et al., J. Mol. Biol., 235(3):959-73 (1994). Con frecuencia, los residuos de marco en las regiones de marco se sustituirán por el residuo correspondiente del anticuerpo donador de CDR para alterar, por ejemplo mejorar, la unión a antígeno. Estas sustituciones de marco se identifican mediante métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante modelado de las interacciones de los residuos de marco y CDR para identificar residuos de marco importantes para la unión a antígeno y comparación de secuencias para identificar residuos de marco no habituales en posiciones particulares. (Véanse, por ejemplo, Queen et al., patente estadounidense n° 5.585.089; y Riechmann et al., 1988, Nature, 332:323).

Un aspecto de la presente invención se refiere particularmente a un receptor de antígeno quimérico (CAR) específico para ROR1 (NTRKR1) que tiene una de la estructura de polipéptido seleccionada de V3, V5 y V1 tal como se ilustra en la figura 4, comprendiendo dicha estructura un dominio de unión a ligando extracelular que comprende Vh y Vl de un anticuerpo anti-ROR1 monoclonal, una bisagra, un dominio transmembrana de CD8a (TM de CD8a) y un dominio citoplasmático que incluye un dominio de señalización de CD3 zeta y un dominio coestimulador de 4-1BB.

Según una realización preferida, dicho dominio transmembrana se codifica por un polipéptido que comparte al menos el 80%, preferiblemente al menos el 90%, más preferiblemente al menos el 95% e incluso más preferiblemente al menos el 99% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 6 (TM de CD8a).

Según otra realización preferida, dicha bisagra se codifica por un polipéptido que comparte al menos el 80%, preferiblemente al menos el 90%, más preferiblemente al menos el 95% e incluso más preferiblemente al menos el 99% de identidad de secuencia, respectivamente para las estructuras V3, V5 y V1, con SEQ ID NO: 4 (CD8a), SEQ ID NO: 5 (IgG1) y SEQ ID NO: 3 (FcyRIIIa).

Según una realización más preferida, el CAR específico para ROR1 de la invención tiene la estructura de polipéptido V3 que comprende una bisagra de CD8a que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 4 y un dominio transmembrana de CD8a que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 6.

Según otra realización más preferida, el CAR específico para ROR1 de la invención tiene la estructura de polipéptido V5 comprende bisagra de IgG1 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 5 y un dominio transmembrana de CD8a que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 6.

Según una realización, dicho receptor de antígeno quimérico (CAR) específico para ROR1 (NTRKR1) que tiene una de la estructura de polipéptido seleccionada de V3, V5 y V1 tal como se ilustra en la figura 4, en el que el dominio de unión a ligando extracelular comprende:

- una cadena pesada variable V^h que comprende las CDR del anticuerpo monoclonal de ratón H10 de SEQ ID NO: 54 (CDRH1), SEQ ID NO: 55 (CDR-H2) y SEQ ID NO: 56 (CDR-H3), y;

- una cadena ligera variable Vl que comprende las CDR del anticuerpo monoclonal de ratón H10 de SEQ ID NO: 59 (CDR-L1), SEQ ID NO: 60 (CDR-L2) y SEQ ID NO: 61 (CDR-L3);

o:

- una cadena pesada variable Vh que comprende las CDR del anticuerpo monoclonal de ratón D10 de SEQ ID NO: 28 (CDR-H1), SEQ ID NO: 29 (CDR-H2) y SEQ ID NO: 30 (CDR-H3), y;

- una cadena ligera variable V^l que comprende las CDR del anticuerpo monoclonal de ratón D10 de SEQ ID NO: 33 (CDR-L1), SEQ ID NO: 34 (CDR-L2) y SEQ ID NO: 35 (CDR-L3).

En una realización preferida, dicho receptor de antígeno quimérico (CAR) específico para ROR1 (NTRKR1) que tiene una de la estructura de polipéptido seleccionada de V3, V5 y V1 tal como se ilustra en la figura 4, en el que dicho dominio de unión a ligando extracelular que comprende cadenas V^H y V^L que tienen al menos el 80%, preferiblemente al menos el 90%, más preferiblemente al menos el 95% e incluso más preferiblemente al menos el 99% de identidad de secuencia respectivamente con

- SEQ ID NO: 53 (H10-VH) y SEQ ID NO: 58 (H10-VL), o

- SEQ ID NO: 27 (D10-VH) y SEQ ID NO: 32 (D10-VL), o;

En otra realización, dicho receptor de antígeno quimérico (CAR) específico para ROR1 (NTRKR1) que tiene una de la estructura de polipéptido seleccionada de V3, V5 y V1 tal como se ilustra en la figura 4, en el que dicho dominio de unión a ligando extracelular comprende cadenas Vh y Vl de anticuerpos H10 o D10 que se han humanizado. En particular, dicho dominio de unión a ligando celular comprende cadenas V^H y V^L humanizadas, en el que, - una cadena pesada variable Hu H10 VH tiene un polipéptido codificado por SEQ ID NO: 57, y

- una cadena ligera variable Hu H10 VH tiene un polipéptido codificado por SEQ ID NO: 62;

o:

- una cadena pesada variable Hu D10 VH tiene un polipéptido codificado por SEQ ID NO: 31, y

- una cadena ligera variable Hu D10 tiene un polipéptido codificado por SEQ ID NO: 36.

Según otra realización, dicho receptor de antígeno quimérico (CAR) específico para ROR1 (NTRKR1) que tiene una de la estructura de polipéptido seleccionada de V3, V5 y V1 tal como se ilustra en la figura 4, en el que dicho polipéptido de CAR comparte al menos el 80%, preferiblemente al menos el 90%, más preferiblemente al menos el 95% e incluso más preferiblemente al menos el 99% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 117 (secuencia de H10v3-CAR) o con SeQ ID NO: 93 (secuencia de D10v3-CAR) o con SEQ ID NO: 95 (secuencia de D10v5-CAR). Arquitecturas de CAR

El dominio de transducción de señales o dominio de señalización intracelular de un CAR según la presente invención es responsable de la señalización intracelular tras la unión de dominio de unión a ligando extracelular a la diana dando como resultado la activación de la célula inmunitaria y respuesta inmunitaria. Dicho de otro modo, el dominio de transducción de señales es responsable de la activación de al menos una de las funciones efectoras normales de la célula inmunitaria en la que se expresa el CAR. Por ejemplo, la función efectora de una célula T puede ser una actividad citolítica o actividad cooperadora incluyendo la secreción de citocinas. Por tanto, el término “dominio de transducción de señales” se refiere a la parte de una proteína que transduce la señal efectora y dirige la célula a realizar una función especializada.

Ejemplos preferidos de dominio de transducción de señales para su uso en un CAR pueden ser las secuencias citoplasmáticas del receptor y correceptores de células T que actúan de manera sincronizada para iniciar la transducción de señales tras la implicación del receptor de antígeno, así como cualquier derivado o variante de estas secuencias y cualquier secuencia sintética que tiene la misma capacidad funcional. El dominio de transducción de señales comprende dos clases diferenciadas de secuencia de señalización citoplasmática, las que inician la activación primaria dependiente de antígeno, y las que actúan de una manera independiente de antígeno para proporcionar una señal secundaria o coestimuladora. La secuencia de señalización citoplasmática primaria puede comprender motivos de señalización que se conocen como motivos de activación basados en tirosina de inmunorreceptor o ITAM. Los ITAM son motivos de señalización bien definidos encontrados en la cola intracitoplasmática de una variedad de receptores que sirven como sitios de unión para tirosina cinasas de la clase de syk/zap70. Los ejemplos de ITAM usados en la invención pueden incluir como ejemplos no limitativos los derivados de TCRzeta, FcRgamma, FcRbeta, FcRepsilon, CD3gamma, CD3delta, CD3epsilon, CD5, CD22, CD79a, CD79b y CD66d. En una realización preferida, el dominio de transducción de la señalización del CAR puede comprender el dominio de señalización de CD3zeta que tiene una secuencia de aminoácidos con al menos el 70%, preferiblemente al menos el 80%, más preferiblemente al menos el 90%, el 95% el 97% o el 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 9).

En una realización particular, el dominio de transducción de señales del CAR de la presente invención comprende una molécula de señal coestimuladora o una parte de la misma. Una molécula coestimuladora es una molécula de superficie celular distinta de un receptor de antígeno o sus ligandos que se requiere para una respuesta inmunitaria eficaz. “Ligando coestimulador” se refiere a una molécula en una célula presentadora de antígeno que se une específicamente a una molécula coestimuladora relacionada en una célula T, proporcionando así una señal que, además de la señal primaria proporcionada, por ejemplo, mediante la unión de un complejo TCR/CD3 con una molécula de MHC cargada con péptido, media en una respuesta de células T, incluyendo, pero sin limitarse a, activación de la proliferación, diferenciación y similares. Un ligando coestimulador puede incluir, pero no se limita a, CD7, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), PD-L1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, ligando coestimulador inducible (ICOS-L), molécula de adhesión intercelular (ICAM, CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, M1CB, HVEM, receptor de linfotoxina beta, 3/TR6, ILT3, ILT4, un agonista o anticuerpo que se une a receptor de ligando de tipo Toll y un ligando que se une específicamente a B7-H3). Un ligando coestimulador también abarca, entre otras cosas, un anticuerpo que se une específicamente a una molécula coestimuladora presente en una célula T, tal como, pero sin limitarse a, Cd27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, antígeno asociado a función de linfocito 1 (LFA-1), CD2, CD7, LTGHT, NKG2C, B7-H3, un ligando que se une específicamente a CD83.

Una “molécula coestimuladora” se refiere a la pareja de unión relacionada en una célula T que se une específicamente a un ligando coestimulador, mediando así en una respuesta coestimuladora por parte de la célula, tal como, pero sin limitarse a, proliferación. Las moléculas coestimuladoras incluyen, pero no se limitan a, una molécula de clase I de MHC, BTLA y receptor de ligando de tipo Toll. Los ejemplos de moléculas coestimuladoras incluyen CD27, CD28, CD8, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, antígeno asociado a función de linfocito 1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3 y un ligando que se une específicamente a CD83 y similares. En una realización preferida, el dominio de transducción de señales del CAR de la presente invención comprende una molécula de señal coestimuladora o una parte de la misma seleccionada del grupo que consiste en fragmento de 4-1BB (GenBank: AAA53133) y CD28 (NP_006130.1). En particular, el dominio de transducción de señales del CAR de la presente invención comprende una secuencia de aminoácidos que comprende al menos el 70%, preferiblemente al menos el 80%, más preferiblemente al menos el 90%, el 95% el 97% o el 99% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 8.

Un CAR según la presente invención se expresa en la membrana de superficie de la célula. Por tanto, un CAR de este tipo comprende además un dominio transmembrana. Las características distintivas de dominios transmembrana apropiados comprenden la capacidad de expresarse en la superficie de una célula, preferiblemente en la presente invención una célula inmunitaria, en particular linfocitos o linfocitos citolíticos naturales (NK), y para interaccionar en conjunto para dirigir la respuesta celular de una célula inmunitaria contra una célula diana predefinida. El dominio transmembrana puede derivarse de una fuente o bien natural o bien sintética. El dominio transmembrana puede derivarse de cualquier proteína unida a membrana o transmembrana. Como ejemplos no limitativos, el polipéptido transmembrana puede ser una subunidad del receptor de células T tal como a, (3, y o E, polipéptido que constituye el complejo CD3, receptor de IL2 p55 (cadena a), p75 (cadena p) o cadena y, cadena de subunidad de receptores de Fc, en particular receptor III de Fcy o proteínas CD. Alternativamente, el dominio transmembrana puede ser sintético y puede comprender residuos predominantemente hidrófobos tales como leucina y valina. En una realización preferida dicho dominio transmembrana se deriva de la cadena alfa de CD8 humano (por ejemplo NP_001139345.1). El dominio transmembrana puede comprender además una región de bisagra entre dicho dominio de unión a ligando extracelular y dicho dominio transmembrana. El término “región de bisagra” usado en el presente documento significa de manera general cualquier oligo o polipéptido que funciona para unir el dominio transmembrana al dominio de unión a ligando extracelular. En particular, la región de bisagra se usa para proporcionar más flexibilidad y accesibilidad para el dominio de unión a ligando extracelular. Una región de bisagra puede comprender hasta 300 aminoácidos, preferiblemente de 10 a 100 aminoácidos y lo más preferiblemente de 25 a 50 aminoácidos. La región de bisagra puede derivarse de la totalidad o parte de moléculas que se producen de manera natural, tal como de la totalidad o parte de la región extracelular de CD8, CD4 o CD28, o de la totalidad o parte de una región constante de anticuerpo. Alternativamente, la región de bisagra puede ser una secuencia sintética que corresponde a cualquier secuencia de bisagra que se produce de manera natural, o puede ser una secuencia de bisagra totalmente sintética. En una realización preferida dicho dominio de bisagra comprende una parte de cadena alfa de CD8 humano, receptor FcyRIIIa o IgG1 denominadas respectivamente en esta memoria descriptiva SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5, o polipéptidos de bisagra que presentan preferiblemente al menos el 80%, más preferiblemente al menos el 90%, el 95% el 97% o el 99% de identidad de secuencia con estos polipéptidos.

Un CAR según la invención generalmente comprende además un dominio transmembrana (TM) más particularmente seleccionado de CD8a y 4-1BB, que muestra identidad con los polipéptidos de SEQ ID NO: 6 ó 7. Se prefiere el TM de CD8a de SEQ ID NO: 6.

Según realizaciones preferidas, el CAR específico para ROR1 tiene una estructura de polipéptido seleccionada de V3, V5 y V1 tal como se ilustra en la figura 4, comprendiendo dicha estructura un dominio de unión a ligando extracelular que comprende V^h y V^l de un anticuerpo anti-ROR1 monoclonal, una bisagra de CD8a, un dominio transmembrana de CD8a y un dominio citoplasmático que incluye un dominio de señalización de CD3 zeta y un dominio coestimulador de 4-1BB.

Según otra realización preferida, el CAR específico para ROR1 tiene una estructura de polipéptido seleccionada de V3, V5 y V1 tal como se ilustra en la figura 4, comprendiendo dicha estructura un dominio de unión a ligando extracelular que comprende V^h y V^l de un anticuerpo anti-ROR1 monoclonal, una bisagra de IgG1, un dominio transmembrana de CD8a y un dominio citoplasmático que incluye un dominio de señalización de CD3 zeta y un dominio coestimulador de 4-1BB.

Según una realización preferida, el CAR específico para ROR1 tiene una estructura de polipéptido seleccionada de V3, V5 y V1 tal como se ilustra en la figura 4, comprendiendo dicha estructura un dominio de unión a ligando extracelular que comprende Vh y Vl de un anticuerpo anti-ROR1 monoclonal, una bisagra de FcyRIIIa, un dominio transmembrana de CD8a y un dominio citoplasmático que incluye un dominio de señalización de CD3 zeta y un dominio coestimulador de 4-1BB.

Las tablas 3-8 muestran las estructuras de CAR para las 6 versiones de V1 a V6.

Habitualmente se observa regulación por disminución o mutación de antígenos diana en células cancerosas, creando variantes resistentes de pérdida de antígeno. Por tanto, para compensar la resistencia tumoral y hacer que las células inmunitarias sean más específicas para la diana, el CAR específico para ROR1 según la invención puede comprender otros dominios de unión a ligando extracelulares, para unirse simultáneamente a diferentes elementos en la diana aumentando así la activación y función de células inmunitarias. En una realización, los dominios de unión a ligando extracelulares pueden colocarse en tándem en el mismo polipéptido transmembrana, y opcionalmente pueden estar separados por un ligador. En otra realización, dichos diferentes dominios de unión a ligando extracelulares pueden colocarse en diferentes polipéptidos transmembrana que componen el CAR. En otra realización, la presente invención se refiere a una población de CAR que comprenden cada uno diferentes dominios de unión a ligando extracelulares. En particular, la presente invención se refiere a un método de modificación por ingeniería de células inmunitarias que comprende proporcionar una célula inmunitaria y expresar en la superficie de dicha célula una población de CAR que comprenden cada uno diferentes dominios de unión a ligando extracelulares. En otra realización particular, la presente invención se refiere a un método de modificación por ingeniería de una célula inmunitaria que comprende proporcionar una célula inmunitaria e introducir en dicha célula polinucleótidos que codifican para polipéptidos que componen una población de CAR que comprenden cada uno diferentes dominios de unión a ligando extracelulares. Por población de CAR quiere decirse al menos dos, tres, cuatro, cinco, seis o más CAR que comprenden cada uno diferentes dominios de unión a ligando extracelulares. Los diferentes dominios de unión a ligando extracelulares según la presente invención pueden unirse preferiblemente de manera simultánea a diferentes elementos en la diana aumentando así la activación y función de células inmunitarias. La presente invención también se refiere a una célula inmunitaria aislada que comprende una población de CAR que comprenden cada uno diferentes dominios de unión a ligando extracelulares.

Polinucleótidos, vectores:

La presente invención también se refiere a polinucleótidos, vectores que codifican para el CAR anteriormente descrito CAR según la invención.

El polinucleótido puede consistir en un casete de expresión o vector de expresión (por ejemplo un plásmido para su introducción en una célula huésped bacteriana, o un vector viral tal como un vector de baculovirus para la transfección de una célula huésped de insecto, o un plásmido o vector viral tal como un lentivirus para la transfección de una célula huésped de mamífero).

En una realización particular, las diferentes secuencias de ácido nucleico pueden incluirse en un polinucleótido o vector que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para una secuencia de omisión ribosómica tal como una secuencia que codifica para un péptido 2A. Los péptidos 2A, que se identificaron en el subgrupo Aphthovirus de picornavirus, provocan una “omisión” ribosómica de un codón al siguiente sin la formación de un enlace peptídico entre los dos aminoácidos codificados por los codones (véanse Donnelly y Elliott 2001; Atkins, Wills et al. 2007; Doronina, Wu et al. 2008). Por “codón” quiere decirse tres nucleótidos en un ARNm (o en la cadena sentido de una molécula de ADN) que se traducen mediante un ribosoma para dar un residuo de aminoácido. Por tanto, dos polipéptidos pueden sintetizarse a partir de un único marco de lectura abierto contiguo dentro de un ARNm cuando los polipéptidos están separados por una secuencia de oligopéptido 2A que está en marco. Tales mecanismos de omisión ribosómica se conocen bien en la técnica y se sabe que los usan varios vectores para la expresión de varias proteínas codificadas por un único ARN mensajero.

Para dirigir el polipéptido transmembrana a la ruta secretora de una célula huésped, se proporciona una secuencia de señal secretora (también conocida como secuencia líder, prepro-secuencia o pre-secuencia) en la secuencia de polinucleótido o secuencia de vector. La secuencia de señal secretora está operativamente unida a la secuencia de ácido nucleico transmembrana, es decir, las dos secuencias están unidas en el marco de lectura correcto y colocadas para dirigir el polipéptido recién sintetizado a la ruta secretora de la célula huésped. Las secuencias de señales secretoras están habitualmente situadas en 5' con respecto a la secuencia de ácido nucleico que codifica para el polipéptido de interés, aunque determinadas secuencias de señales secretoras pueden estar situadas en otra parte en la secuencia de ácido nucleico de interés (véase, por ejemplo, Welch et al., patente estadounidense n.° 5.037.743; Holland et al., patente estadounidense n.° 5.143.830). En una realización preferida el péptido señal comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 ó 2.

Los expertos en la técnica reconocerán que, en vista de la degeneración del código genético, es posible una variación de secuencia considerable entre estas moléculas de polinucleótidos. Preferiblemente, las secuencias de ácido nucleico de la presente invención se someten a optimización de codones para la expresión en células de mamífero, preferiblemente para la expresión en células humanas. La optimización de codones se refiere al intercambio en una secuencia de interés de codones que son generalmente poco frecuentes en genes altamente expresados de una especie dada por codones que son generalmente frecuentes en genes altamente expresados de tal especie, codificando tales codones para los mismos aminoácidos que los codones que están intercambiándose. Métodos de modificación por ingeniería de células inmunitarias dotadas de CAR:

La presente invención abarca el método de preparación de células inmunitarias para inmunoterapia que comprende introducir ex vivo en dichas células inmunitarias los polinucleótidos o vectores que codifican para uno de los CAR de ROR1 tal como se describió anteriormente.

En una realización preferida, dichos polinucleótidos se incluyen en vectores lentivirales con vistas a expresarse de manera estable en las células inmunitarias.

Según realizaciones adicionales, dicho método comprende además la etapa de modificar genéticamente dicha célula para hacer que sea más adecuada para el trasplante alogénico.

Según un primer aspecto, la célula inmunitaria puede volverse alogénica, por ejemplo, inactivando al menos un gen que expresa uno o más componentes de receptor de células T (TCR) tal como se describe en el documento WO 2013/176915, lo cual puede combinarse con la inactivación de un gen que codifica para, o regula, la expresión de proteína HLA o p2m. Por consiguiente, se reduce significativamente el riesgo de síndrome de injerto contra huésped y rechazo de injerto.

Según otro aspecto, las células inmunitarias pueden modificarse adicionalmente por ingeniería genética para mejorar su resistencia a fármacos inmunosupresores o tratamientos de quimioterapia, que se usan como normas asistenciales para tratar células malignas positivas para ROR1. Por ejemplo, CD52 y receptores de glucocorticoides (GR), que son dianas farmacológicas de tratamientos con Campath (alemtuzumab) y glucocorticoides, pueden inactivarse para hacer que las células sean resistentes a esos tratamientos y darles una ventaja competitiva con respecto a las propias células T del paciente no dotadas de CAR de ROR1 específicos. También puede suprimirse o reducirse la expresión de gen de ^c D3 para conferir resistencia a Teplizumab, que es otro fármaco inmunosupresor. También puede suprimirse o reducirse la expresión de HPRT según la invención para conferir resistencia a 6-tioguanina, un agente citostático habitualmente usado en quimioterapia especialmente para el tratamiento de leucemia linfoblástica aguda.

Según un aspecto adicional de la invención, las células inmunitarias pueden manipularse adicionalmente para hacer que sean más activas o limitar el agotamiento, inactivando genes que codifican para proteínas que actúan como “puntos de control inmunitarios” que actúan como reguladores de la activación de células T, tales como PDCD1 o CTLA-4. En la tabla 9 se indican ejemplos de genes cuya expresión puede reducirse o suprimirse.

Tabla 9: Lista de genes que codifican para proteínas de punto de control inmunitario.

En una realización preferida dicho método de modificación adicional por ingeniería de las células inmunitarias implica introducir en dichas células T polinucleótidos, en particular ARNm, que codifican para endonucleasa de corte poco frecuente específica para inactivar selectivamente los genes, tales como los mencionados anteriormente, mediante escisión de ADN. En una realización más preferida dichas endonucleasas de corte poco frecuente son nucleasas TALE o endonucleasa Cas9. Las nucleasas TAL han demostrado hasta ahora una especificidad y eficacia de escisión superiores con respecto a otros tipos de endonucleasas de corte poco frecuente, haciendo que sean las endonucleasas de elección para la producción de las células inmunitarias modificadas por ingeniería a gran escala con una renovación constante.

Métodos de suministro

Los diferentes métodos descritos anteriormente implican introducir CAR en una célula. Como ejemplo no limitativo, dicho CAR puede introducirse como transgenes codificados por un vector de plásmido. Dicho vector de plásmido también puede contener un marcador de selección que proporciona identificación y/o selección de células que reciben dicho vector.

Pueden sintetizarse polipéptidos in situ en la célula como resultado de la introducción de polinucleótidos que codifican para dichos polipéptidos en la célula. Alternativamente, pueden producirse dichos polipéptidos fuera de la célula y después introducirse en la misma. En la técnica se conocen métodos para introducir un constructo de polinucleótido en células e incluyen, como ejemplos no limitativos, métodos de transformación estable en los que el constructo de polinucleótido se integra en el genoma de la célula, métodos de transformación transitoria en los que el constructo de polinucleótido no se integra en el genoma de la célula y métodos mediados por virus. Dichos polinucleótidos pueden introducirse en una célula, por ejemplo, mediante vectores virales recombinantes (por ejemplo retrovirus, adenovirus), liposoma y similares. Por ejemplo, los métodos de transformación transitoria incluyen, por ejemplo, microinyección, electroporación o bombardeo de partículas. Pueden incluirse dichos polinucleótidos en vectores, más particularmente plásmidos o virus, con vistas a expresarse en células.

Células inmunitarias modificadas por ingeniería

La presente invención también se refiere a células aisladas o líneas celulares susceptibles de obtenerse mediante dicho método para modificar células por ingeniería. En particular dicha célula aislada comprende al menos un CAR tal como se describió anteriormente. En otra realización, dicha célula aislada comprende una población de CAR que comprenden cada uno diferentes dominios de unión a ligando extracelulares. En particular, dicha célula aislada comprende una secuencia de polinucleótido exógena que codifica para cAr . Las células inmunitarias genéticamente modificadas de la presente invención se activan y proliferan independientemente de mecanismos de unión a antígeno.

En el alcance de la presente invención también queda abarcada una célula inmunitaria aislada, preferiblemente una célula T obtenida según uno cualquiera de los métodos anteriormente descritos. Dicha célula inmunitaria se refiere a una célula de origen hematopoyético funcionalmente implicada en la iniciación y/o ejecución de respuesta inmunitaria innata y/o adaptativa. Dicha célula inmunitaria según la presente invención puede derivarse de una célula madre. Las células madre pueden ser células madre adultas, células madre embrionarias no humanas, más particularmente células madre no humanas, células madre de sangre de cordón umbilical, células progenitoras, células madre de médula ósea, células madre pluripotentes inducidas, células madre totipotentes o células madre hematopoyéticas. Células humanas representativas son células CD34+. Dicha célula aislada también puede ser una célula dendrítica, célula dendrítica citotóxica, un mastocito, una célula NK, una célula B o una célula T seleccionada del grupo que consiste en linfocitos T inflamatorios, linfocitos T citotóxicos, linfocitos T reguladores o linfocitos T cooperadores. En otra realización, dicha célula puede derivarse del grupo que consiste en linfocitos T CD4+ y linfocitos T CD8+. Antes de la expansión y modificación genética de las células de la invención, puede obtenerse una fuente de células a partir de un sujeto mediante una variedad de métodos no limitativos. Pueden obtenerse células a partir de varias fuentes no limitativas, incluyendo células mononucleares de sangre periférica, médula ósea, tejido de ganglio linfático, sangre de cordón umbilical, tejido del timo, tejido de un sitio de infección, ascitis, derrame pleural, tejido del bazo y tumores. En determinadas realizaciones de la presente invención, puede usarse cualquiera de varias líneas de células T disponibles y conocidas por los expertos en la técnica. En otra realización, dicha célula puede derivarse de un donante sano, de un paciente con diagnóstico de cáncer o de un paciente con diagnóstico de una infección. En otra realización, dicha célula forma parte de una población mixta de células que presentan diferentes características fenotípicas. En el alcance de la presente invención también queda abarcada una línea celular obtenida a partir de una célula T transformada según el método anteriormente descrito. Las células modificadas resistentes a un tratamiento inmunosupresor y susceptibles de obtenerse mediante el método anterior quedan abarcadas en el alcance de la presente invención.

Como realización preferida, la presente invención proporciona células T o una población de células T dotadas de un CAR de ROR1 tal como se describió anteriormente, que no expresan TCR funcional y que son reactivas frente a células positivas para ROR1, para su trasplante alogénico en pacientes.

Activación y expansión de células T

Ya sea antes o después de la modificación genética de las células T, aunque las células inmunitarias genéticamente modificadas de la presente invención se activen y proliferen independientemente de mecanismos de unión a antígeno, las células inmunitarias, particularmente células T de la presente invención, pueden activarse adicionalmente y expandirse generalmente usando métodos tal como se describe, por ejemplo, en las patentes estadounidenses 6.352.694; 6.534.055; 6.905.680; 6.692.964; 5.858.358; 6.887.466; 6.905.681; 7.144.575; 7.067.318; 7.172.869; 7.232.566; 7.175.843; 5.883.223; 6.905.874; 6.797.514; 6.867.041; y la publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 20060121005. Las células T pueden expandirse in vitro o in vivo.

Generalmente, las células T de la invención se expanden mediante contacto con un agente que estimula un complejo CD3-TCR y una molécula coestimuladora en la superficie de las células T para crear una señal de activación para la célula T. Por ejemplo, pueden usarse productos químicos tales como ionóforo de calcio A23187, 12-miristato y 13-acetato de forbol (PMA) o lectinas mitogénicas tales como fitohemaglutinina (PHA) para crear una señal de activación para la célula T.

Como ejemplos no limitativos, pueden estimularse poblaciones de células T in vitro tal como mediante contacto con un anticuerpo anti-CD3, o fragmento de unión a antígeno del mismo, o un anticuerpo anti-CD2 inmovilizado sobre una superficie, o mediante contacto con un activador de proteína cinasa C (por ejemplo, briostatina) junto con un ionóforo de calcio. Para la coestimulación de una molécula auxiliar en la superficie de las células T, se usa un ligando que se une a la molécula auxiliar. Por ejemplo, puede ponerse una población de células T en contacto con un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD28, en condiciones apropiadas para estimular la proliferación de las células T. Las condiciones apropiadas para el cultivo de células T incluyen un medio apropiado (por ejemplo, medio esencial mínimo o medio RPMI 1640 o X-vivo 5, (Lonza)) que puede contener factores necesarios para la proliferación y viabilidad, incluyendo suero (por ejemplo, suero humano o bovino fetal), interleucina 2 (IL-2), insulina, IFN-g, 1L-4, 1L-7, GM-CSF, -10, -2, 1L-15, TGFp y TNF o cualquier otro aditivo para el crecimiento de células conocido por el experto en la técnica. Otros aditivos para el crecimiento de células incluyen, pero no se limitan a, tensioactivo, Plasmanate y agentes reductores tales como N-acetilcisteína y 2-mercaptoetanol. Los medios pueden incluir RPMI 1640, A1M-V, DMEM, MEM, a-MEM, F-12, X-Vivo 1 y X-Vivo 20, Optimizer, con aminoácidos añadidos, piruvato de sodio y vitaminas, o bien libres de suero o bien complementados con una cantidad apropiada de suero (o plasma) o un conjunto definido de hormonas y/o una cantidad de citocina(s) suficiente para el crecimiento y la expansión de células T. Se incluyen antibióticos, por ejemplo, penicilina y estreptomicina, únicamente en cultivos experimentales, no en cultivos de células que van a administrarse por infusión a un sujeto. Las células diana se mantienen en condiciones necesarias para soportar el crecimiento, por ejemplo, una temperatura (por ejemplo, 37°C) y atmósfera (por ejemplo, aire más CO2 al 5%) apropiadas. Las células T que se han expuesto a tiempos de estimulación variados pueden mostrar diferentes características.

En otra realización particular, dichas células pueden expandirse mediante cultivo conjunto con tejido o células. Dichas células también pueden expandirse in vivo, por ejemplo en la sangre del sujeto tras administrar dicha célula al sujeto.

Aplicaciones terapéuticas

En otra realización, una célula aislada obtenida mediante los diferentes métodos o línea celular derivada de dicha célula aislada tal como se describió anteriormente puede usarse como medicamento. En otra realización, dicho medicamento puede usarse para tratar cáncer, particularmente para el tratamiento de linfomas de células B y leucemia en una paciente que lo necesita. En otra realización, dicha célula aislada según la invención o línea celular derivada de dicha célula aislada puede usarse en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un cáncer en un paciente que lo necesita.

En otro aspecto, la presente invención se basa en métodos para tratar a pacientes que lo necesitan, comprendiendo dicho método al menos una de las siguientes etapas:

(a) proporcionar una célula inmunitaria que puede obtenerse mediante uno cualquiera de los métodos anteriormente descritos;

(b) administrar dichas células inmunitarias transformadas a dicho paciente.

En una realización, dichas células T de la invención pueden experimentar expansión de células T in vivo robusta y pueden persistir durante una cantidad de tiempo prolongada.

Dicho tratamiento puede ser de mejora, cura o profiláctico. Puede formar o bien parte de una inmunoterapia autóloga o bien parte de un tratamiento de inmunoterapia alogénica. Por autólogo quiere decirse que las células, línea celular o población de células usadas para tratar a pacientes se originan de dicho paciente o de un donante compatible en antígeno leucocitario humano (HLA). Por alogénico quiere decirse que las células o población de células usadas para tratar a pacientes no se originan de dicho paciente sino de un donante.

En la sección anterior se describieron células que pueden usarse con los métodos dados a conocer. Dicho tratamiento puede usarse para tratar a pacientes con diagnóstico de un estado de cáncer premaligno o maligno caracterizado por células que expresan ROR1, especialmente por un exceso de abundancia de células que expresan ROR1. Tales estados se encuentran en cánceres hematológicos, tales como leucemia o trastornos linfoproliferativos malignos.

La leucemia puede ser leucemia mielógena aguda, leucemia mielógena crónica, síndrome mielodisplásico, leucemia linfoide aguda, leucemia linfoide crónica y síndrome mielodisplásico.

El trastorno linfoproliferativo puede ser linfoma, en particular leucemia linfocítica crónica, linfoma no Hodgkin, linfoma de Burkitt y linfoma folicular (de células pequeñas y de células grandes).

Según una realización preferida, dichas células T modificadas por ingeniería se proporcionan para el tratamiento de la leucemia linfocítica crónica (CLL) o el linfoma linfocítico de células pequeñas (SLL).

Según otra realización preferida, dicho tratamiento de CLL o SLL se administra a pacientes que se han sometido a linfopenia antes de la infusión de células T con CAR de ROR1. Dicha linfopenia se realiza habitualmente mediante quimioterapia, y preferiblemente usando fármacos tales como fludarabina (F), ciclofosfamida (C), bendamustina (B) o rituximab (R) o una combinación de los mismos. Normalmente, puede usarse la combinación de gP o FBR para la linfopenia antes de la administración de células T con CAR.

Según otra realización preferida, dichas células T modificadas por ingeniería se proporcionan para el tratamiento de linfoma de células del manto (MCL), leucemia linfoblástica aguda (ALL) con una translocación cromosómica t(1;19). Los cánceres que pueden tratarse pueden comprender tumores no sólidos (tales como tumores hematológicos incluyendo, pero sin limitarse a, ALL pre-B (indicación pediátrica), ALL de adultos, linfoma de células del manto, linfoma de células B grandes difuso y similares). Los tipos de cánceres que van a tratarse con los CAR de la invención incluyen, pero no se limitan a, leucemia o neoplasias malignas linfoides. También se incluyen tumores/cánceres de adultos y tumores/cánceres pediátricos.

Además, tumores sólidos tales como tumores de mama, colon, pulmón y riñón pueden tratarse mediante los CAR de la invención. Además, las células T modificadas por ingeniería de la invención pueden usarse como tratamiento de cánceres de páncreas, renal o de ovarios.

El tratamiento con las células inmunitarias modificadas por ingeniería según la invención puede realizarse en combinación con una o más terapias contra el cáncer seleccionadas del grupo de terapia con anticuerpos, quimioterapia, terapia con citocinas, terapia con células dendríticas, terapia génica, terapia hormonal, terapia por luz láser y radioterapia.

Según una realización preferida de la invención, dicho tratamiento puede administrarse a pacientes que se someten a un tratamiento inmunosupresor. De hecho, la presente invención se basa preferiblemente en células o población de células, que se han vuelto resistentes a al menos un agente inmunosupresor debido a la inactivación de un gen que codifica para un receptor para tal agente inmunosupresor. En este aspecto, el tratamiento inmunosupresor debe ayudar a la selección y expansión de las células T según la invención dentro del paciente.

La administración de las células o población de células según la presente invención puede llevarse a cabo de cualquier manera conveniente, incluyendo mediante inhalación de aerosol, inyección, ingestión, transfusión, implantación o trasplante. Las composiciones descritas en el presente documento pueden administrarse a un paciente por vía subcutánea, intradérmica, intratumoral, intranodal, intramedular, intramuscular, mediante inyección intravenosa o intralinfática, o por vía intraperitoneal. En una realización, las composiciones de células de la presente invención se administran preferiblemente mediante inyección intravenosa.

La administración de las células o población de células puede consistir en la administración de 104-109 células por kg de peso corporal, preferiblemente de 105 a 106 células/kg de peso corporal, incluyendo todos los valores de números enteros de números de células dentro de esos intervalos. Las células o población de células pueden administrarse en una o más dosis. En otra realización, dicha cantidad eficaz de células se administran como una única dosis. En otra realización, dicha cantidad eficaz de células se administran como más de una dosis a lo largo de un periodo de tiempo. El momento de administración se encuentra dentro del criterio del médico encargado y depende del estado clínico del paciente. Las células o población de células pueden obtenerse de cualquier fuente, tal como un banco de sangre o un donante. Aunque las necesidades individuales varían, la determinación de intervalos óptimos de cantidades eficaces de un tipo de célula dado para una enfermedad o estados particulares se encuentra dentro de las habilidades de la técnica. Una cantidad eficaz significa una cantidad que proporciona un beneficio terapéutico o profiláctico. La dosificación administrada dependerá de la edad, salud y peso del receptor, clase de tratamiento simultáneo, si lo hay, frecuencia de tratamiento y la naturaleza del efecto deseado.

En otra realización, dicha cantidad eficaz de células o composición que comprende esas células se administra por vía parenteral. Dicha administración puede ser una administración intravenosa. Dicha administración puede realizarse directamente mediante inyección dentro de un tumor.

En determinadas realizaciones de la presente invención, se administran células a un paciente junto con (por ejemplo, antes de, simultáneamente con o tras) cualquiera de varias modalidades de tratamiento relevantes, incluyendo, pero sin limitarse a, tratamiento con agentes tales como terapia antiviral, cidofovir e interleucina 2, citarabina (también conocida como ARA-C) o tratamiento con nataliziimab para pacientes con MS o tratamiento con efaliztimab para pacientes con psoriasis u otros tratamientos para pacientes con PML. En realizaciones adicionales, las células T de la invención pueden usarse en combinación con quimioterapia, radiación, agentes inmunosupresores, tales como ciclosporina, azatioprina, metotrexato, micofenolato y FK506, anticuerpos u otros agentes de inmunoablación tales como CAMPATH, anticuerpos anti-CD3 u otras terapias con anticuerpos, citotoxina, fludaribina, ciclosporina, FK506, rapamicina, ácido micoplienólico, esteroides, FR901228, citocinas e irradiación. Estos fármacos inhiben o bien la fosfatasa dependiente de calcio calcineurina (ciclosporina y FK506) o inhiben la p70S6 cinasa que es importante para la señalización inducida por factor de crecimiento (rapamicina) (Henderson, Naya et al. 1991; Liu, Albers et al. 1992; Bierer, Hollander et al. 1993). En una realización adicional, las composiciones de células de la presente invención se administran a un paciente junto con (por ejemplo, antes de, simultáneamente con o tras) trasplante de médula ósea, terapia ablativa de células T usando agentes quimioterápicos tales como fludarabina, radioterapia de haz externo (XRT), ciclofosfamida o anticuerpos tales como OKT3 o CAMPATH. En otra realización, las composiciones de células de la presente invención se administran tras la terapia ablativa de células B tal como agentes que reaccionan con CD20, por ejemplo, Rituxan. Por ejemplo, en una realización, pueden someterse sujetos a un tratamiento convencional con quimioterapia de alta dosis seguida por trasplante de células madre de sangre periférica. En determinadas realizaciones, tras el trasplante, los sujetos reciben una infusión de las células inmunitarias expandidas de la presente invención. En una realización adicional, se administran células expandidas antes o después de la cirugía.

Otras definiciones

- A menos que se especifique lo contrario, “un”, “una”, “el/la” y “al menos un” se usan de manera intercambiable y significan uno o más de uno.

- Los residuos de aminoácido en una secuencia de polipéptido se designan en el presente documento según el código de una letra, en el que, por ejemplo, Q significa residuo de Gln o glutamina, R significa residuo de Arg o arginina y D significa residuo de Asp o ácido aspártico.

- Sustitución de aminoácido significa el remplazo de un residuo de aminoácido por otro, por ejemplo el remplazo de un residuo de arginina por un residuo de glutamina en una secuencia de péptido es una sustitución de aminoácido. - Los nucleótidos se designan de la siguiente manera: se usa el código de una letra para designar la base de un nucleósido: a es adenina, t es timina, c es citosina y g es guanina. Para los nucleótidos degenerados, r representa g o a (nucleótidos de purina), k representa g o t, s representa g o c, w representa a o t, m representa a o c, y representa t o c (nucleótidos de pirimidina), d representa g, a o t, v representa g, a o c, b representa g, t o c, h representa a, t o c, y n representa g, a, t o c.

-Tal como se usa en el presente documento, “ácido nucleico” o “polinucleótidos” se refieren a nucleótidos y/o polinucleótidos, tales como ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN), oligonucleótidos, fragmentos generados mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR), y fragmentos generados mediante cualquiera de ligación, escisión, acción de endonucleasa y acción de exonucleasa. Las moléculas de ácido nucleico pueden estar compuestas por monómeros que son nucleótidos que se producen de manera natural (tales como ADN y ARN), o análogos de nucleótidos que se producen de manera natural (por ejemplo, formas enantioméricas de nucleótidos que se producen de manera natural) o una combinación de ambos. Los nucleótidos modificados pueden tener alteraciones en restos de azúcar y/o en restos de base de pirimidina o purina. Las modificaciones de azúcares incluyen, por ejemplo, remplazo de uno o más grupos hidroxilo por halógenos, grupos alquilo, aminas y grupos azido, o los azúcares pueden funcionalizarse como éteres o ésteres. Además, el resto de azúcar completo puede remplazarse por estructuras estérica y electrónicamente similares, tales como aza-azúcares y análogos de azúcares carbocíclicos. Los ejemplos de modificaciones en un resto de base incluyen purinas y pirimidinas alquiladas, purinas o pirimidinas aciladas, u otros sustitutos heterocíclicos bien conocidos. Los monómeros de ácido nucleico pueden unirse mediante enlaces fosfodiéster o análogos de tales uniones. Los ácidos nucleicos pueden ser o bien de cadena sencilla o bien de cadena doble.

- Por receptor de antígeno quimérico (CAR) quiere decirse moléculas que combinan un dominio de unión frente a un componente presente en la célula diana, por ejemplo una especificidad basada en anticuerpo por un antígeno deseado (por ejemplo, antígeno tumoral) con un dominio intracelular de activación de receptor de células T para generar una proteína quimérica que muestra una actividad inmunitaria celular anti-diana específica. Generalmente, CAR consiste en anticuerpo de cadena sencilla extracelular (scFvFc) fusionado con el dominio de señalización intracelular de la cadena zeta de complejo de receptor de antígeno de células T (scFvFc:Q y tiene la capacidad, cuando se expresa en células T, de redirigir el reconocimiento de antígeno basándose en la especificidad del anticuerpo monoclonal. Un ejemplo de CAR usado en la presente invención es un CAR que dirige contra el antígeno ROR1 y puede comprender como ejemplo no limitativo las secuencias de aminoácidos: SEQ ID NO: 79 a 138.

- El término “endonucleasa” se refiere a cualquier enzima silvestre o variante que puede catalizar la hidrólisis (escisión) de enlaces entre ácidos nucleicos dentro de una molécula de ADN o ARN, preferiblemente una molécula de ADN. Las endonucleasas no escinden la molécula de ADN o ARN independientemente de su secuencia, sino que reconocen y escinden la molécula de ADN o ARN en secuencias de polinucleótido específicas, denominadas adicionalmente “secuencias diana” o “sitios diana”. Las endonucleasas pueden clasificarse como endonucleasas de corte poco frecuente cuando tienen normalmente un sitio de reconocimiento de polinucleótido de más de 12 pares de bases (pb) de longitud, más preferiblemente de 14-55 pb. Las endonucleasas de corte poco frecuente aumentan significativamente HR induciendo roturas de cadena doble de ADN (DSB) en un locus definido (Perrin, Buckle et al.

1993; Rouet, Smih et al. 1994; Choulika, Perrin et al. 1995; Pingoud y Silva 2007). Las endonucleasas de corte poco frecuente pueden ser por ejemplo una endonucleasa dirigida (Paques y Duchateau 2007), una nucleasa de dedos de cinc quimérica (ZFN) resultante de la fusión de dominios de dedos de cinc modificados por ingeniería con el dominio catalítico de una enzima de restricción tal como Fokl (Porteus y Carroll 2005), una endonucleasa Cas9 del sistema CRISPR (Gasiunas, Barrangou et al. 2012; Jinek, Chilinski et al. 2012; Cong, Ran et al. 2013; Mali, Yang et al. 2013) o una endonucleasa química (Eisenschmidt, Lanio et al. 2005; Arimondo, Thomas et al. 2006). En las endonucleasas químicas, un agente de escisión químico o peptídico se conjuga o bien con un polímero de ácidos nucleicos o bien con otro ADN que reconoce una secuencia diana específica, dirigiendo así la actividad de escisión a una secuencia específica. Las endonucleasas químicas también abarcan nucleasas sintéticas tales como conjugados de ortofenantrolina, una molécula de escisión de ADN, y oligonucleótidos de formación de tríplex (TFO), que se sabe que se unen a secuencias de ADN específicas (Kalish y Glazer 2005). Tales endonucleasas químicas están comprendidas en el término “endonucleasa” según la presente invención.

- Por “nucleasa TALE” (TALEN) quiere decirse una proteína de fusión que consiste en un dominio de unión a ácido nucleico normalmente derivado de un efector de tipo activador de la transcripción (TALE) y un dominio catalítico de nucleasa para escindir una secuencia diana de ácido nucleico. El dominio catalítico es preferiblemente un dominio de nucleasa y más preferiblemente un dominio que tiene actividad endonucleasa, tal como por ejemplo I-Tevl, ColE7, NucA y Fok-I. En una realización particular, el dominio TALE puede fusionarse a una meganucleasa tal como, por ejemplo, I-Crel y I-Onul o variante funcional de las mismas. En una realización más preferida, dicha nucleasa es una nucleasa TALE monomérica. Una nucleasa TALE monomérica es una nucleasa TALE que no requiere dimerización para el reconocimiento y escisión específicos, tales como las fusiones de repeticiones de TAL modificadas por ingeniería con el dominio catalítico de I-Tevl descritas en el documento WO2012138927. Los efectores de tipo activador de la transcripción (TALE) son proteínas de la especie bacteriana Xanthomonas que comprenden una pluralidad de secuencias repetidas, comprendiendo cada repetición diresiduos en la posición 12 y 13 (RVD) que son específicos para cada base de nucleótido de la secuencia seleccionada como diana de ácido nucleico. También pueden derivarse dominios de unión con propiedades de unión a ácido nucleico base a base modulares (MBBBD) similares a partir de nuevas proteínas modulares recientemente descubiertas por el solicitante en una especie bacteriana diferente. Las nuevas proteínas modulares tienen la ventaja de presentar más variabilidad de secuencia que las repeticiones de TAL. Preferiblemente, los RVD asociados con el reconocimiento de los diferentes nucleótidos son HD para reconocer C, NG para reconocer T, NI para reconocer A, NN para reconocer G o A, NS para reconocer A, C, G o T, HG para reconocer T, IG para reconocer T, NK para reconocer G, HA para reconocer C, ND para reconocer C, HI para reconocer C, HN para reconocer G, NA para reconocer G, SN para reconocer G o A e YG para reconocer T, TL para reconocer A, VT para reconocer A o G y SW para reconocer A. En otra realización, los aminoácidos críticos 12 y 13 pueden mutarse hacia otros residuos de aminoácido con el fin de modular su especificidad frente a los nucleótidos A, T, C y G y en particular para potenciar esta especificidad. Las nucleasas TALE ya se han descrito y usado para estimular el direccionamiento génico y modificaciones génicas (Boch, Scholze et al. 2009; Moscou y Bogdanove 2009; Christian, Cermak et al. 2010; Li, Huang et al. 2011). Hay nucleasas TAL personalizadas disponibles comercialmente con el nombre comercial TALEN™ (Cellectis, 8 rue de la Croix Jarry, 75013 París, Francia).

La endonucleasa de corte poco frecuente según la presente invención también puede ser una endonucleasa Cas9. Recientemente, se ha desarrollado una nueva herramienta de modificación por ingeniería del genoma basándose en la nucleasa Cas9 guiada por ARN (Gasiunas, Barrangou et al. 2012; Jinek, Chilinski et al. 2012; Cong, Ran et al.

2013; Mali, Yang et al. 2013) a partir del sistema inmunitario adaptativo de CRISPR (repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas) de procariotas de tipo II (para una revisión, véase (Sorek, Lawrence et al. 2013)). El sistema asociado a CRISPR (Cas) se descubrió por primera vez en bacterias y funciona como defensa contra ADN foráneo, ya sea viral o de plásmido. La modificación por ingeniería del genoma mediada por CRISPR procede en primer lugar mediante la selección de secuencia diana con frecuencia flanqueada por un motivo de secuencia corta, denominado motivo adyacente de protoespaciador (PAM). Tras la selección de secuencia diana, se modifica por ingeniería un ARNcr específico, complementario a esta secuencia diana. ARNcr de transactivación (ARNcrtra) requeridos en los sistemas de tipo II de CRISPR se emparejan con el ARNcr y se unen a la proteína Cas9 proporcionada. Cas9 actúa como anclaje molecular facilitando el apareamiento de bases de ARNctra con ARNc (Deltcheva, Chilinski et al. 2011). En este complejo ternario, la estructura doble de ARNcrtra:ARNcr actúa como ARN de guía que dirige la endonucleasa Cas9 a la secuencia diana relacionada. El reconocimiento de diana por parte del complejo Cas9-ARNcrtra:ARNcr se inicia examinando la secuencia diana para determinar homología entre la secuencia diana y el ARNcr. Además de la complementariedad de secuencia diana-ARNcr, la selección como diana de ADN requiere la presencia de un motivo corto adyacente al protoespaciador (motivo adyacente de protoespaciador, PAM). Tras el emparejamiento entre el ARN doble y la secuencia diana, posteriormente Cas9 introduce una rotura de cadena doble roma 3 bases en sentido 5' del motivo PAM (Garneau, Dupuis et al. 2010).

La endonucleasa de corte poco frecuente puede ser una endonucleasa dirigida, también conocida con el nombre de meganucleasa. Tales endonucleasas dirigidas se conocen bien en la técnica (Stoddard 2005). Las endonucleasas dirigidas reconocen una secuencia diana de ADN y generan una rotura de cadena sencilla o doble. Las endonucleasas dirigidas son altamente específicas, que reconocen sitios diana de ADN que oscilan entre 12 y 45 pares de bases (pb) de longitud, habitualmente que oscilan entre 14 y 40 pb de longitud. La endonucleasa dirigida según la invención puede corresponder por ejemplo a una endonucleasa LAGLIDADG, a una endonucleasa HNH o a una endonucleasa GIY-YIG. La endonucleasa dirigida preferida según la presente invención puede ser una variante de I-Crel.

- Por “vector de suministro” o “vectores de suministro” quiere decirse cualquier vector de suministro que puede usarse en la presente invención para poner en contacto con la célula (es decir “poner en contacto”) o suministrar al interior de células o compartimentos subcelulares (es decir, “introducir”) agentes/productos químicos y moléculas (proteínas o ácidos nucleicos) necesarios en la presente invención. Incluye, pero no se limita a, vectores de suministro liposomales, vectores de suministro virales, vectores de suministro farmacológicos, portadores químicos, portadores poliméricos, lipoplejos, poliplejos, dendrímeros, microburbujas (agentes de contraste para ecografía), nanopartículas, emulsiones u otros vectores de transferencia apropiados. Estos vectores de suministro permiten el suministro de moléculas, productos químicos, macromoléculas (genes, proteínas) u otros vectores tales como plásmidos, péptidos desarrollados por Diatos. En estos casos, los vectores de suministro son portadores moleculares. Por “vector de suministro” o “vectores de suministro” también quiere decirse métodos de suministro para realizar la transfección.

- Los términos “vector” o “vectores” se refieren a una molécula de ácido nucleico que puede transportar otro ácido nucleico al que se ha unido. Un “vector” en la presente invención incluye, pero no se limita a, un vector viral, un plásmido, un vector de ARN o una molécula de ADN o ARN lineal o circular que puede consistir en ácidos nucleicos cromosómicos, no cromosómicos, semisintéticos o sintéticos. Los vectores preferidos son los que pueden realizar replicación autónoma (vector episomal) y/o expresión de ácidos nucleicos a los que están unidos (vectores de expresión). Los expertos en la técnica conocen grandes cantidades de vectores adecuados y que están comercialmente disponibles.

Los vectores virales incluyen retrovirus, adenovirus, parvovirus (por ejemplo virus adenoasociados), coronavirus, virus de ARN de cadena negativa tales como ortomixovirus (por ejemplo, virus influenza), rabdovirus (por ejemplo, virus de la rabia y estomatitis vesicular), paramixovirus (por ejemplo, sarampión y Sendai), virus de ARN de cadena positiva tales como picornavirus y alfavirus, y virus de ADN de cadena doble incluyendo adenovirus, herpesvirus (por ejemplo, virus del herpes simple tipos 1 y 2, virus de Epstein-Barr, citomegalovirus) y poxvirus (por ejemplo, vaccinia, viruela aviar y viruela del canario). Otros virus incluyen virus de Norwalk, togavirus, flavivirus, reovirus, papovavirus, hepadnavirus y virus de la hepatitis, por ejemplo. Los ejemplos de retrovirus incluyen: leucosis-sarcoma aviar, tipo C de mamíferos, virus de tipo B, virus de tipo D, grupo HTLV-BLV, lentivirus, espumavirus (Coffin, J. M., Retroviridae: The viruses and their replication, In Fundamental Virology, tercera edición, B. N. Fields, et al., Eds., Lippincott-Raven Publishers, Filadelfia, 1996).

- Por “vector lentiviral” quiere decirse vectores lentivirales basados en VIH que son muy prometedores para el suministro génico debido a su capacidad de empaquetamiento relativamente grande, inmunogenicidad reducida y su capacidad para transducir de manera estable con alta eficacia una gran gama de tipos de células diferentes. Los vectores lentivirales se generan habitualmente tras la transfección transitoria de tres plásmidos (de empaquetamiento, envuelta y transferencia) o más en células productoras. Al igual que el VIH, los vectores lentivirales entran en la célula diana mediante la interacción de glicoproteínas de superficie viral con receptores en la superficie celular. Al entrar, el ARN viral experimenta transcripción inversa, que está mediada por el complejo de transcriptasa inversa viral. El producto de la transcripción inversa es un ADN viral lineal de cadena doble, que es el sustrato para la integración viral en el ADN de las células infectadas. Por “vectores lentivirales integrantes (o LV)” quiere decirse vectores tales que, como ejemplo no limitativo, pueden integrarse en el genoma de una célula diana. Por el contrario, por “vectores lentivirales no integrantes (o NILV)” quiere decirse vectores de suministro génico eficaces que no se integran en el genoma de una célula diana mediante la acción de la integrasa del virus.

- Los vectores de suministro y vectores pueden asociarse o combinarse con cualquier técnica de permeabilización celular tal como sonoporación o electroporación o derivados de estas técnicas.

- Por célula o células quiere decirse cualquier célula viva eucariota, célula primaria y línea celular derivadas de estos organismos para cultivos in vitro.

- Por “célula primaria” o “células primarias” quiere decirse células tomadas directamente de tejido vivo (es decir, material de biopsia) y establecidas para su crecimiento in vitro, que se han sometido a muy pocas duplicaciones de población y por tanto son más representativas de los componentes y características funcionales principales de tejidos de los que se derivan, en comparación con líneas celulares artificialmente inmortalizadas o tumorigénicas continuas.

Como ejemplos no limitativos, pueden seleccionarse líneas celulares del grupo que consiste en células CHO-K1; células HEK293; células Caco2; células U2-OS; células NIH 3T3; células NSO; células SP2; células CHO-S; células DG44; células K-562, células U-937; células MRC5; células IMR90; células Jurkat; células HepG2; células HeLa; células HT-1080; células HCT-116; células Hu-h7; células Huvec; células Molt 4.

Todas estas líneas celulares pueden modificarse mediante el método de la presente invención para proporcionar modelos de línea celular para producir, expresar, cuantificar, detectar, estudiar un gen o una proteína de interés; estos modelos también pueden usarse para examinar moléculas biológicamente activas de interés en la investigación y producción y diversos campos tales como química, biocombustibles, productos terapéuticos y agronomía, como ejemplos no limitativos.

- Por “mutación” quiere decirse la sustitución, deleción, inserción de hasta uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, veinte, veinticinco, treinta, cuarenta, cincuenta o más nucleótidos/aminoácidos en un polinucleótido (ADNc, gen) o una secuencia de polipéptido. La mutación puede afectar a la secuencia codificante de un gen o a su secuencia reguladora. También puede afectar a la estructura de la secuencia genómica o a la estructura/estabilidad del ARNm codificado.

- Por “variante(s)” quiere decirse una variante de repetición, una variante, una variante de unión a ADN, una variante de nucleasa TALE, una variante de polipéptido obtenida mediante mutación o remplazo de al menos un residuo en la secuencia de aminoácidos de la molécula original.

- Por “variante funcional” quiere decirse un mutante catalíticamente activo de una proteína o un dominio de proteína; tal mutante puede tener la misma actividad en comparación con su proteína o dominio de proteína original o propiedades adicionales, o actividad superior o inferior.

- “ Identidad” se refiere a la identidad de secuencia entre dos moléculas de ácido nucleico o polipéptidos. La identidad puede determinarse comparando una posición en cada secuencia que puede alinearse con fines de comparación. Cuando una posición en la secuencia comparada está ocupada por la misma base, entonces las moléculas son idénticas en esa posición. Un grado de similitud o identidad entre secuencias de ácido nucleico o de aminoácidos es una función del número de nucleótidos idénticos o coincidentes en posiciones compartidas por las secuencias de ácido nucleico. Pueden usarse diversos algoritmos y/o programas de alineación para calcular la identidad entre dos secuencias, incluyendo FASTA o BLAST, que están disponibles como parte del paquete de análisis de secuencias GCG (University of Wisconsin, Madison, Wis.), y pueden usarse, por ejemplo, con los parámetros por defecto. Por ejemplo, se contemplan polipéptidos que tienen al menos el 70%, el 85%, el 90%, el 95%, el 98% o el 99% de identidad con respecto a polipéptidos específicos descritos en el presente documento y preferiblemente que muestran sustancialmente las mismas funciones, así como polinucleótidos que codifican para tales polipéptidos. A menos que se indique lo contrario, una puntuación de similitud se basará en el uso de BLOSUM62. Cuando se usa BLASTP, la similitud en porcentaje se basa en la puntuación positiva de BLASTP y la identidad de secuencia en porcentaje se basa en la puntuación de identidad de BLASTP. Las “identidades” de BLASTP muestran el número y la fracción de residuos totales en los pares de secuencias de alta puntuación que son idénticos; y los “positivos” de BLASTP muestran el número y la fracción de residuos para los que las puntuaciones de alineación tienen valores positivos y que son similares entre sí. Secuencias de aminoácidos que tienen estos grados de identidad o similitud o cualquier grado intermedio de identidad de similitud con respecto a las secuencias de aminoácidos dadas a conocer en el presente documento se contemplan y quedan abarcadas por esta divulgación. Las secuencias de polinucleótido de polipéptidos similares se deducen usando el código genético y pueden obtenerse mediante medios convencionales, en particular mediante traducción inversa de su secuencia de aminoácidos usando el código genético.

- “Dominio de transducción de señales” o “ligando coestimulador” se refieren a una molécula en una célula presentadora de antígeno que se une específicamente a una molécula coestimuladora relacionada en una célula T, proporcionando así una señal que, además de la señal primaria proporcionada, por ejemplo, mediante la unión de un complejo TCR/CD3 con una molécula de MHC cargada con péptido, media en una respuesta de células T, incluyendo, pero sin limitarse a, activación de la proliferación, diferenciación y similares. Un ligando coestimulador puede incluir, pero no se limita a, CD7, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), PD-L1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, ligando coestimulador inducible (ICOS-L), molécula de adhesión intercelular (ICAM, CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, M1CB, HVEM, receptor de linfotoxina beta, 3/TR6, ILT3, ILT4, un agonista o anticuerpo que se une a receptor de ligando de tipo Toll y un ligando que se une específicamente a B7-H3. Un ligando coestimulador también abarca, entre otras cosas, un anticuerpo que se une específicamente a una molécula coestimuladora presente en una célula T, tal como, pero sin limitarse a, Cd27, CD28, 4-IBB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, antígeno asociado a función de linfocito 1 (LFA-1), CD2, CD7, LTGHT, NKG2C, B7-H3, un ligando que se une específicamente a CD83.

Una “molécula coestimuladora” se refiere a la pareja de unión relacionada en una célula T que se une específicamente a un ligando coestimulador, mediando así en una respuesta coestimuladora por parte de la célula, tal como, pero sin limitarse a, proliferación. Las moléculas coestimuladoras incluyen, pero no se limitan a, una molécula de clase I de MHC, BTLA y receptor de ligando de tipo Toll.

Una “señal coestimuladora” tal como se usa en el presente documento se refiere a una señal que, en combinación con una señal primaria, tal como ligación de TCR/CD3, conduce a proliferación de células T y/o regulación por incremento o regulación por disminución de moléculas clave.

El término “dominio de unión a ligando extracelular” tal como se usa en el presente documento se define como un oligo o polipéptido que puede unirse a un ligando. Preferiblemente, el dominio podrá interaccionar con una molécula de superficie celular. Por ejemplo, el dominio de unión a ligando extracelular puede elegirse para reconocer un ligando que actúa como marcador de superficie celular en células diana asociadas con un estado patológico particular. Por tanto, los ejemplos de marcadores de superficie celular que pueden actuar como ligandos incluyen los asociados con infecciones virales, bacterianas y parasitarias, enfermedad autoinmunitaria y células cancerosas. El término “sujeto” o “paciente” tal como se usa en el presente documento incluye todos los miembros del reino animal incluyendo primates no humanos y seres humanos.

La descripción anteriormente escrita de la invención proporciona una manera y procedimiento de realizarla y usarla de tal manera que se permite a cualquier experto en esta técnica realizar y usar la misma, proporcionándose esta capacitación en particular para el contenido de las reivindicaciones adjuntas, que constituyen una parte de la descripción original.

Cuando se menciona un límite o intervalo numérico en el presente documento, se incluyen los puntos de extremo. Además, todos los valores e intervalos secundarios dentro de un límite o intervalo numérico se incluyen específicamente como si se escribieran explícitamente.

La descripción anterior se presenta para permitir a un experto en la técnica realizar y usar la invención, y se proporciona en el contexto de una aplicación particular y sus requisitos.

Habiendo descrito esta invención de manera general, puede obtenerse una comprensión adicional mediante referencia a determinados ejemplos específicos, que se proporcionan en el presente documento únicamente con fines de ilustración, y no se pretende que sean limitativos a menos que se especifique lo contrario.

Método general

Células primarias

Se aislaron células mononucleares de sangre periférica mediante centrifugación por gradiente de densidad a partir de capas leucocíticas de donantes voluntarios sanos (Etablissement Frangais du Sang). Después se purificaron linfocitos T usando el kit de enriquecimiento de células T humanas EasySep (Stemcell Technologies) y se activaron con reactivo Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 (Life Technologies) en medio X-vivo 15 (Lonza) complementado con IL-220 ng/ml (Miltenyi) y suero AB humano al 5% (Seralab).

Líneas celulares

Se obtuvieron las líneas celulares K562, Jeko-1, MDA-MB-231, PC-3 y MCF-7 de la colección americana de cultivos tipo. Se cultivaron células K562 en IMDM complementado con fCs inactivado por calor al 10%, L-glutamina 2 mmol/l y penicilina 100 unidades/ml, y estreptomicina 100 |ig/ml. Se cultivaron células Jeko-1 en RPMI 1640 complementado con FCS inactivado por calor al 20% CS, L-glutamina 2 mmol/l y penicilina 100 unidades/ml, y estreptomicina 100 |ig/ml. Se cultivaron células MDA-MB-231 en DMEM complementado con FCS inactivado por calor al 10%, L-glutamina 2 mmol/l y penicilina 100 unidades/ml, y estreptomicina 100 |ig/ml. Se cultivaron células PC-3 en F-12K complementado con FCS inactivado por calor al 10%, L-glutamina 2 mmol/l y penicilina 100 unidades/ml, y estreptomicina 100 |ig/ml. Se cultivaron células MCF-7 en DMEM complementado con FCS inactivado por calor al 10%, L-glutamina 2 mmol/l y penicilina 100 unidades/ml, y estreptomicina 100 |ig/ml e insulina humana 0,01 mg/ml.

Cuantificación de expresión en superficie celular de ROR1

Se determinó el número de moléculas de superficie de ROR1 en diferentes líneas celulares humanas mediante unión de saturación usando el clon de anticuerpo anti-ROR1 monoclonal 2A (Miltenyi) y Dako QiFIKIT según las instrucciones del fabricante.

Síntesis de ADN que codifica para scCAR

Se sintetizó el ADN que codifica para los scCAR por parte de GenScript.

Construcción de vectores de ARNm de transcripción in vitro para scCAR

Se clonó el ADN que codifica para los scCAR en el plásmido pCLS9632 entre el promotor de T7 y la poli A de BGH. Transcripción in vitro de ARN

Se transcribió in vitro ARNm que codifica para el scCAR y se poliadeniló usando el kit mMessage mMachine T7 Ultra (Life technologies) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se purificaron los ARN con columnas RNeasy (Qiagen), se eluyeron en medio de citoporación T (Harvard Apparatus) y se cuantificaron midiendo la absorbancia a 260 nm usando un espectrofotómetro Nanodrop ND-1000. Se verificó la calidad del ARN en un gel de agarosa de formaldehído/MOPS desnaturalizante.

Electroporación de ARN de células T

4-5 días u 11-12 tras la activación, se transfectaron los linfocitos T mediante electrotransferencia de ARN mensajero usando un sistema AgilePulse MAX (Harvard Apparatus). Se mezclaron 5x106 células con 15 |ig del ARNm que codifica para el scCAR en una cubeta de 0,4 cm. Se realizó la electroporación según el protocolo expuesto en el documento WO2013176915. Tras la electroporación, se diluyeron las células en medio de cultivo y se incubaron a 37°C/CO2 al 5%.

Detección de scCAR

Mediante citometría de flujo: Se tiñeron las células T con anticuerpos de cabra anti-(Fab)2 de ratón policlonales marcados con PE (Jackson Immunoresearch) o proteína L marcada con biotina (GenScript) seguido por estreptavidina marcada con ficoeritrina (BD pharmingen) y finalmente se analizaron usando el citómetro de flujo MACSQuant (Miltenyi).

Mediante inmunotransferencia de tipo Western: se lisaron 1x106 células T en 50 pl de tampón RIPA que contenía ortovanadato 1 mM, 3 pg/ml de inhibidor de proteasa y 2 mM de PMSF. Se separaron los lisados celulares mediante SDS-PAGE en un gel de acrilamida Any kD™ (BioRad). Tras la transferencia a una membrana de nitrocelulosa, se incubó esto con un anticuerpo de ratón anti-CD3z humana (pharmingen) y después con un anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón conjugado con peroxidasa de rábano picante (Sigma). Se reveló la unión de anticuerpo usando el kit ECL (Pierce).

Ensayo de desgranulación

Se cultivaron 5 x 104 células T conjuntamente con 5 x 104 células positivas para ROR1 o negativas para ROR1 en 0,1 ml por pocillo en una placa de 96 pocillos. Se añadió anticuerpo anti-CD107a marcado con APC (BD Biosciences) al comienzo del cultivo conjunto además de 1 pg/ml de anticuerpo anti-CD49d (BD Biosciences), 1 pg/ml de anticuerpo anti-CD28 (Miltenyi) y 1x disolución de monensina (eBioscience). Tras una incubación de 6 h, se tiñeron las células con un tinte de viabilidad que puede fijarse (eBioscience) y anticuerpo anti-CD8 marcado con Vioblue (Miltenyi) y se analizaron usando el citómetro de flujo MACSQuant (Miltenyi). Las células T citotóxicas en desgranulación corresponden a células CD8+CD107a+.

Ensayo de liberación de atocinas

Se cultivaron 5 x 104 células T conjuntamente con 5 x 104 células positivas para ROR1 o negativas para ROR1 en 0,1 ml por pocillo en una placa de 96 pocillos. Tras una incubación de 24 horas, se recogieron los sobrenadantes de cultivo y se analizaron para determinar células positivas para IFNyROR1 o negativas para ROR1.

Ensayo de citotoxicidad

Con células diana adherentes: se sembraron 2 x 104 células positivas para ROR1 o negativas para ROR1 en 0,1 ml por pocillo en una placa de 96 pocillos. El día después de la siembra en placas, se marcaron las células positivas para ROR1 y negativas para ROR1 con CellTrace CFSE y se cultivaron conjuntamente con 4 x 105 células T durante 4 horas. Después se recogieron las células, se tiñeron con un tinte de viabilidad que puede fijarse (eBioscience) y se analizaron usando el citómetro de flujo MACSQuant (Miltenyi).

Se calculó el porcentaje de lisis específica usando la siguiente fórmula:

Con células diana en suspensión: se marcaron células positivas para ROR1 y negativas para ROR1 respectivamente con CellTrace CFSE y CellTrace Violet. Se cultivaron aproximadamente 2 x 104 células positivas para ROR1 conjuntamente con 2 x 104 células negativas para ROR1 con 4 x 105 células T en 0,1 ml por pocillo en una placa de 96 pocillos. Tras una incubación de 4 horas, se recogieron las células y se tiñeron con un tinte de viabilidad que puede fijarse (eBioscience) y se analizaron usando el citómetro de flujo MACSQuant (Miltenyi).

Se calculó el porcentaje de lisis específica usando la fórmula anterior.

Ejemplos

Ejemplos de secuencias de polipéptido de CAR:

A continuación en el presente documento se presentan las secuencias SEQ ID NO: 79 a 138 (con péptido señal) de 60 scCAR de ROR1. Estas tienen arquitectura de CAR de V1 a V6, y scFv de 8 anticuerpos diferentes: 2A2, 4A5, D10, G6, G3, H10, 2A4 y 1C11.

Las versiones V1, V3 y V5 (scCAR con el dominio transmembrana de CD8a) se sometieron a ensayo en los siguientes experimentos excepto por el scCAR con los scFv de 2A2, para el que sólo se sometió a prueba la versión V1 (como referencia para comparación), teniendo éste la misma estructura que la descrita por Hudecek et al (2013). Las secuencias dentro de un recuadro corresponden a secuencias de V^h y V^l preferidas. Sin embargo, V^h y V^l pueden conmutarse para mejorar la eficacia de CAR según la invención.

Ejemplo 1: Selección de líneas celulares positivas y negativas para ROR1

Para identificar líneas celulares que expresaban diferentes niveles de expresión en superficie celular de ROR1, se analizaron 12 líneas celulares humanas mediante citometría de flujo usando Qifikit (Dako) y el clon de AcM anti-ROR1 humano 2A2 (véase materiales y métodos). Anteriormente se había descrito en la bibliografía que nueve de esas líneas celulares eran positivas para ROR1 a nivel de ARNm o proteína (tabla 10).

Tabla 10: Líneas celulares que se notifica que son positivas para ROR1 en la bibliografía

Los resultados de citometría de flujo indican que las células MDA-MB-231 (ATCC® HTB-26), MDA-MB-468 (ATCC® HTB. 132), Hs746T (ATCC® HTB-135) y HT-29 (ATCC® HTB-38) expresaban los niveles más altos de expresión en superficie celular de ROR1. Se detectaron niveles inferiores de expresión en superficie celular de ROR1, aproximadamente la mitad de los de las líneas celulares de alta expresión, en células PC-3 (ATCC® CRL-1435), NCI-H1993 (ATCC® CRL 5909), A549 (ATCC CCL-185) y Jeko-1 (ATCC CRL-3006) (figura 5).

A partir de estos resultados, también se observa que las células MCF-7, K562 y T no expresaban ROR1 y que las Cal51 sólo expresaban niveles muy bajos de ROR1 en su superficie.

A partir de estas líneas celulares, se seleccionaron tres adherentes para examinar la actividad de scCAR anti-ROR1: células PC-3 y MDA-MB-231 que expresan diferentes niveles de ROR1, y células MCF-7 que son negativas para ROR1.

Además, se seleccionaron dos líneas celulares de suspensión para examinar la actividad de scCAR anti-ROR1: células Jeko-1 que son positivas para ROR1 y células K562 que son negativas para ROR1.

Ejemplo 2: Generación de scCAR anti-ROR1

Se creó un conjunto de 18 scCAR específicos para ROR1 de 2a generación (figura 1C) y se sometieron a prueba en los siguientes experimentos.

Resultan de la fusión de los siguientes elementos estructurales de las tablas 1-2:

- scFv de origen murino o forma humanizada a partir de D10, G6, G3, H10, 2A4 ó 1C11;

- un espaciador: FcyRMIa, CD8a o bisagra de IgG1 humanos;

- el dominio transmembrana de CD8a humano y el dominio coestimulador de 41BB humano;

- el dominio de activación de CD3^ humano

Se usaron diferentes scFv en los scCAR para generar receptores con diferentes afinidades de unión y diferentes especificidades de epítopos.

Los AcM D10 y G6 seleccionan como diana la región de tipo Ig en 3' y la región de ligador entre el dominio de tipo Ig y el dominio de CRD de ROR1 (figura 2).

Los AcM G3, H10 y 2A4 seleccionan como diana la región de tipo IgG de ROR1 (figura 2).

El AcM 1C11 selecciona como diana el dominio de CRD de ROR1 (figura 2).

Se usaron tres espaciadores de diferente longitud (16 AA, 45 AA y 231 AA) en los scCAR para intentar optimizar la implicación de scCAR con epítopos tanto proximales como distales de ROR1 (Guest et al., 2005).

Ejemplo 3: Pruebas in vitro de scCAR anti-ROR1

Se sometieron a prueba los scCAR anti-ROR1 diseñados tal como anteriormente en células T primarias humanas usando un método de examen de dos etapas presentado en la figura 6.

En la primera etapa del proceso de examen, se sometieron a electroporación células T humanas primarias, anteriormente activadas durante 4-5 días con perlas anti-CD28/CD3 e IL-2, con ARNm que codificaba para los 18 scCAR anti-ROR1 anteriormente presentados. Un día tras la electroporación, se evaluó la expresión de scCAR mediante citometría de flujo e inmunotransferencia de tipo Western, y se evaluó la actividad de células T modificadas por scCAR midiendo la desgranulación de células T. Los scCAR que se detectaron mediante inmunotransferencia de tipo Western y que indujeron desgranulación específica significativa de células T (>20%) tras el cultivo conjunto con al menos una línea celular positiva para ROR1 se seleccionaron para pasar a través de la segunda etapa del proceso de examen.

En la segunda etapa del proceso de examen, se sometieron a electroporación células T humanas primarias, anteriormente activadas durante 11-12 días con perlas anti-CD28/CD3 e IL-2, con ARNm que codificaba para los scCAR anti-ROR1 seleccionados tras la primera etapa de examen. Uno-dos días tras la electroporación, se evaluó la expresión de scCAR mediante citometría de flujo y se evaluó la actividad de células T modificadas por scCAR midiendo funciones efectoras de células T (desgranulación, producción de IFNg y actividad citolítica). Los scCAR que indujeron desgranulación específica significativa de células T (>20%), citotoxicidad específica significativa de células T (>20% de la lisis de células diana) y producción significativa de IFNg mediante células T (>1500 pg/ml) tras el cultivo conjunto con al menos una línea celular positiva para ROR1 se seleccionaron como posibles candidatos de scCAR.

Se compararon sistemáticamente los scCAR anteriores con un scCAR de referencia que contenía el scFv 2A2 fusionado a una bisagra corta (SEQ ID NO: 79) ya que anteriormente se mostró que este scCAR era funcional en Hudecek et al., 2013.

a) Examen primario de scCAR:

Expresión de scCAR

En primer lugar, se evaluó la expresión total de scCAR anti-ROR1 en células T mediante inmunotransferencia de tipo Western usando un AcM anti-CD3 zeta humana. Se observó que los scCAR que contenían el espaciador intermedio (bisagra de CD8a) o el largo (bisagra de IgG1) se detectaban fuertemente en lisados de células T independientemente de qué scFv albergaban. Sin embargo, para los scCAR que contenían el espaciador corto (FcyRIIIa), aquellos con los scFv G6, G3 y H10 se detectaron bien, mientras que aquellos con los scFv D10, 2A4 y 1C11 se detectaron débilmente o no se detectaron (figuras 7A y 7B).

Después, se evaluó la expresión en superficie de scCAR anti-ROR1 en células T mediante citometría de flujo usando anticuerpo anti-Fab o proteína L (figuras 8A y 8B).

Se observó que:

- los scCAR D10-v3, D10-v5, G6-v3, G6-v5, G3-v3, G3-v5, H10-v3, H10-v5, 2A4-v3 y 2A4-v5 que se detectaron bien en lisado de células T mediante inmunotransferencia de tipo Western también se detectaron bien en la superficie de células T mediante citometría de flujo;

- los scCAR D10-v1, 2A4-v1 y 1C11-v1 que no se detectaron o casi no se detectaron en lisado de células T mediante inmunotransferencia de tipo Western tampoco se detectaron en la superficie de células T mediante citometría de flujo.

Actividad de scCAR

Para evaluar la actividad de scCAR, se analizó la desgranulación de células T modificadas por scCAR tras el cultivo conjunto con células positivas para ROR1 (MDA-MB-231 y PC-3) o negativas para ROR1 (MCF-7).

Se observó que las células T modificadas con los scCAR D10-v1, D10-v3, D10-v5, H10-v1, H10-v3 y H10-v5 se desgranularon significativamente más (>20%) tras el cultivo conjunto con células MDA-MB-231 y PC-3 que tras el cultivo conjunto con células MCF-7 (figuras 9A y 9B).

La figura 9A y la figura 9B muestran que las células T no modificadas así como las células T modificadas con los scCAR H10 y D10 se desgranulan en absoluto tras el cultivo conjunto con células MDA-MB-231, PC-3 y MCF-7 mucho mejor que con el scCAR G6, G3, 2A4 y 1C11.

Conclusión de examen primario:

En conjunto, estos resultados demostraron que entre los 18 scCAR anti-ROR1 diseñados dentro de la presente invención, 6 (D10-v1, D10-v3, D10-v5, H10-v1, H10-v3 y H10-v5) cumplieron los criterios para seleccionarse para pasar a la segunda etapa del proceso de examen.

b) Examen secundario de scCAR

Expresión de scCAR

Se evaluó la expresión en superficie de scCAR anti-ROR1 en células T mediante citometría de flujo usando proteína L.

Se observó que los scCAR D10-v3, D10-v5, H10-v3 y H10-v5 que se detectaban bien en células T sometidas a electroporación 4-5 días tras la activación (figuras 8A y 8B) no se detectaban o sólo se detectaban débilmente en células T sometidas a electroporación 11-12 días tras la activación (figura 10).

Actividad de scCAR

En primer lugar, para evaluar la actividad de scCAR, se analizó la desgranulación de células T modificadas por scCAR tras el cultivo conjunto con células positivas para ROR1 (MDA-MB-231, PC-3 y Jeko-1) o negativas para ROR1 (MCF-7 y K562).

Se observó que, a diferencia de las células T modificadas con los scCAR D10-v1, H10-v1 y H10-v5, las células T modificadas con los scCAR D10-v3, D10-v5 y H10-v3 se desgranularon significativamente más (>20%) tras el cultivo conjunto con células MDA-MB-231 y PC-3 que tras el cultivo conjunto con células MCF-7 o en medios solos (figura 11).

Después se analizó la producción de IFNy mediante células T modificadas por scCAR tras el cultivo conjunto con células positivas para ROR1 (MDA-MB-231, PC-3 y Jeko-1) o negativas para ROR1 (MCF-7 y K562).

Se observó que, a diferencia de las células T modificadas con los scCAR D10-v1, H10-v1 y H10-v5, las células T modificadas con los scCAR D10-v3, D10-v5 y H10-v3 produjeron significativamente más IFNy (>1500 pg/ml) tras el cultivo conjunto con células MDA-MB-231, PC-3 y Jeko-1 que tras el cultivo conjunto con células MCF-7, K562 o medios solos (figura 12).

Finalmente, se analizó la actividad citotóxica de células T modificadas por scCAR tras el cultivo conjunto con células negativas para ROR-1 (MCF-7 y K562) o positivas para ROR1 (MDA-MB-231, PC-3 y Jeko-1).

Se observó que, a diferencia de las células T modificadas con los scCAR D10-v1, H10-v1 y H10-v5, las células T modificadas con los scCAR D10-v3, D10-v5 y H10-v3 destruyeron específicamente más del 20% de las células PC-3 en cultivo conjunto (figura 13). Aunque las células T modificadas con los scCAR D10-v3 y H10-v3 también destruyeron más del 20% de células MDA-MB-231 y Jeko-1 en cultivo conjunto, este no fue el caso para las células T modificadas con el scCAR D10-v5 (figura 13 y figura 14).

Conclusión del examen secundario:

En conjunto, estos resultados demostraron que, de todos los scCAR sometidos a prueba, D10-v3, D10-v5 y H10-v3 representan los scCAR más valiosos.

Puede observarse una ligera ventaja para los 2 CAR de versión V2 en cuanto a la inducción de citotoxicidad (mejores respuestas frente a las diferentes líneas celulares positivas para ROR1 sometidas a prueba).

Ejemplo 4: Proliferación de células inactivadas mediante TCRa que expresan un CAR de ROR1

La figura 15 muestra una representación esquemática de inactivación mediante TCRa usando endonucleasa de corte poco frecuente. Se diseñó y produjo una nucleasa TALE heterodimérica que seleccionaba como diana dos secuencias de 17 pb de longitud (denominadas medias dianas) separadas por un espaciador de 15 pb dentro del gen de región de cadena constante de receptor alfa de células T (TRAC). Cada media diana se reconoce por repeticiones de las medias nucleasas TALE indicadas en la tabla 11.

Tabla 11: Nucleasas TAL que seleccionan como diana el gen TCRalfa

Se subclonó cada constructo de nucleasa TALE usando digestión con enzimas de restricción en un vector de expresión de mamífero bajo el control del promotor de T7. Se sintetizó ARNm que codificaba para nucleasa TALE que escinde la secuencia genómica TRAC a partir de plásmido que portaba la secuencia codificante en sentido 3' del promotor de T7.

Se transfectaron células T purificadas, previamente activadas durante 72 horas con perlas recubiertas con anticuerpo anti-CD3/CD28, con cada uno de los 2 ARNm que codificaban para ambas medias nucleasas TALE de TRAC_T01. 48 horas tras la transfección, se transdujeron respectivamente diferentes grupos de células T del mismo donante con un vector lentiviral que codificaba para uno de los CAR de ROR1 anteriormente descritos (SEQ ID NO: 79 a 138). 2 días tras la transducción, se purificaron células CD3^neg usando perlas magnéticas anti-CD3 y 5 días tras la transducción se reactivaron las células con anticuerpo anti-CD28 soluble (5 |ig/ml).

Se realizó un seguimiento de la proliferación celular durante hasta 30 días tras la reactivación contando las células 2 veces por semana. Se observó proliferación aumentada en células inactivadas mediante TCR alfa que expresaban los CAR de ROR1, especialmente cuando se reactivaron con anticuerpo anti-CD28, en comparación con células no sometidas a transducción.

Para investigar si las células T humanas que expresaban el CAR de ROR1 presentan un estado activado, se analizó la expresión del marcador de activación CD25 mediante FACS 7 días tras la transducción. Las células purificadas transducidas con el vector lentiviral que codificaban para CAR de ROR1 se sometieron a ensayo para determinar la expresión de CD25 en su superficie con el fin de evaluar su activación en comparación con las células no sometidas a transducción. Una expresión de CD25 aumentada era indicativa de condiciones de reactivación con anticuerpo anti-CD28 o de no reactivación.

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Claims (31)

1. REIVINDICACIONES

   i . Receptor de antígeno quimérico (CAR) específico para ROR1 (NTRKR1) que tiene una de la estructura de polipéptido seleccionada de V3, V5 y V1 tal como se ilustra en la figura 4, comprendiendo dicha estructura un dominio de unión a ligando extracelular que comprende V^h y V^l de un anticuerpo anti-ROR1 monoclonal, una bisagra, un dominio transmembrana de CD8a y un dominio citoplasmático que incluye un dominio de señalización de CD3 zeta y un dominio coestimulador de 4-1BB; en el que dicho dominio de unión a ligando extracelular comprende:

   - una cadena Vh pesada variable que comprende las CDR del anticuerpo monoclonal de ratón H10 de SEQ ID NO: 54 (CDR-H1), SEQ ID NO: 55 (CDR-H2) y SEQ ID NO: 56 (CDR-H3), y

   - una cadena V^l ligera variable que comprende las CDR del anticuerpo monoclonal de ratón H10 de SEQ ID NO: 59 (CDR-L1), SEQ ID NO: 60 (CDR-L2) y SEQ ID NO: 61 (CDR-L3); o

   - una cadena Vh pesada variable que comprende las CDR del anticuerpo monoclonal de ratón D10 de SEQ ID NO: 28 (CDR-H1), SEQ ID NO: 29 (CDR-H2) y SEQ ID NO: 30 (CDR-H3), y

   - una cadena Vl ligera variable que comprende las CDR del anticuerpo monoclonal de ratón D10 de SEQ ID NO: 33 (CDR-L1), SEQ ID NO: 34 (CDR-L2) y SEQ ID NO: 35 (CDR-L3).
2. 2. Receptor de antígeno quimérico (CAR) específico para ROR1 (NTRKR1) según la reivindicación 1, en el que el dominio transmembrana de CD8a comparte al menos el 80%, preferiblemente al menos el 90%, más preferiblemente al menos el 95% e incluso más preferiblemente al menos el 99% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 6.
3. 3. Receptor de antígeno quimérico (CAR) específico para ROR1 (NTRKR1) según la reivindicación 1 ó 2, en el que la bisagra se selecciona de bisagra de CD8a, bisagra de IgG1 y bisagra de FcyRIIIa.
4. 4. Receptor de antígeno quimérico (CAR) específico para ROR1 (NTRKR1) según la reivindicación 1 ó 2, en el que la bisagra comparte al menos el 80%, preferiblemente al menos el 90%, más preferiblemente al menos el 95% e incluso más preferiblemente al menos el 99% de identidad de secuencia, para las estructuras V3, V5 y V1, respectivamente con SEQ ID NO: 4 (CD8a), SEQ ID NO: 5 (IgG1) y SEQ ID NO: 3 (FcyRIIIa).
5. 5. CAR específico para ROR1 según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que tiene la estructura de polipéptido V3 que comprende una bisagra de CD8a que tiene al menos el 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 4 y un dominio transmembrana de CD8a que tiene al menos el 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 6.
6. 6. CAR específico para ROR1 según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que tiene la estructura de polipéptido V5 que comprende una bisagra de IgG1 que tiene al menos el 80% de identidad con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 5 y un dominio transmembrana de CD8a que tiene al menos el 80% de identidad con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 6.
7. 7. CAR específico para ROR1 según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que tiene la estructura de polipéptido V1 que comprende una bisagra de FcyRIIIa que tiene al menos el 80% de identidad con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3 y un dominio transmembrana de CD8a que tiene al menos el 80% de identidad con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 6.
8. 8. Receptor de antígeno quimérico específico para ROR1 según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho dominio de unión a ligando extracelular que comprende cadenas VH y VL que tienen al menos el 80%, preferiblemente al menos el 90%, más preferiblemente al menos el 95% e incluso más preferiblemente al menos el 99% de identidad de secuencia respectivamente con SEQ ID NO: 53 (H10-VH) y SEQ ID NO: 58 (H10-VL).
9. 9. Receptor de antígeno quimérico específico para ROR1 según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho dominio de unión a ligando extracelular que comprende cadenas VH y VL que tienen al menos el 80%, preferiblemente al menos el 90%, más preferiblemente al menos el 95% e incluso más preferiblemente al menos el 99% de identidad de secuencia respectivamente con SEQ ID NO: 27 (D10-VH) y SEQ ID NO: 32 (D10-VL).
10. 10. Receptor de antígeno quimérico específico para ROR1 según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicho dominio de unión a ligando extracelular comprende cadenas VH y VL de anticuerpos H10 o D10 que se han humanizado.
11. 11. Receptor de antígeno quimérico específico para ROR1 según la reivindicación 10, en el que dicho dominio de unión a ligando extracelular comprende cadenas VH y VL, en el que

    - una cadena V^h tiene un polipéptido codificado por SEQ ID NO: 57, y

    - una cadena V^l tiene un polipéptido codificado por SEQ ID NO: 62.
12. 12. Receptor de antígeno quimérico específico para ROR1 según la reivindicación 10, en el que dicho dominio de unión a ligando extracelular comprende:

    - una cadena Vh que tiene un polipéptido codificado por SEQ ID NO: 31, y

    - una cadena Vl que tiene un polipéptido codificado por SEQ ID NO: 36.
13. 13. Receptor de antígeno quimérico específico para ROR1 según la reivindicación 1, en el que dicho polipéptido de CAR comparte al menos el 80%, preferiblemente al menos el 90%, más preferiblemente al menos el 95% e incluso más preferiblemente al menos el 99% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 117 (secuencia de H10v3-Ca R).
14. 14. Receptor de antígeno quimérico específico para ROR1 según la reivindicación 1, en el que dicho polipéptido de CAR comparte al menos el 80%, preferiblemente al menos el 90%, más preferiblemente al menos el 95% e incluso más preferiblemente al menos el 99% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 93 (secuencia de D10v3-CAR).
15. 15. Receptor de antígeno quimérico específico para ROR1 según la reivindicación 1, en el que dicho polipéptido de CAR comparte al menos el 80%, preferiblemente al menos el 90%, más preferiblemente al menos el 95% e incluso más preferiblemente al menos el 99% de identidad de secuencia respectivamente con SEQ ID NO: 95 (secuencia de D10v5-CAR).
16. 16. CAR específico para ROR1 según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que dicho dominio coestimulador de 4-1BB tiene al menos el 80% de identidad con SEQ ID NO: 8.
17. 17. CAR específico para ROR1 según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en el que dicho dominio de señalización de CD3 zeta tiene al menos el 80% de identidad con SEQ ID NO: 9.
18. 18. CAR específico para ROR1 según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, que comprende además un péptido señal.
19. 19. Receptor de antígeno quimérico específico para ROR1 según la reivindicación 1, en el que dicho CAR tiene la secuencia de aminoácidos de ^s E^q ID NO: 117 (secuencia de H10v3-CAR), SEQ ID NO: 93 (secuencia de D10v3-CAR) o SEQ ID NO: 95 (secuencia de D10v5-CAR).
20. 20. Polinucleótido que codifica para un receptor de antígeno quimérico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18.
21. 21. Vector de expresión que comprende un polinucleótido según la reivindicación 20.
22. 22. Célula inmunitaria modificada por ingeniería que expresa en la membrana de superficie celular un receptor de antígeno quimérico específico para ROR1 según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18.
23. 23. Célula inmunitaria modificada por ingeniería según la reivindicación 22, derivada de linfocitos T inflamatorios, linfocitos T citotóxicos, linfocitos T reguladores o linfocitos T cooperadores.
24. 24. Célula inmunitaria modificada por ingeniería según la reivindicación 22 ó 23, en la que la expresión de TCR está suprimida en dicha célula inmunitaria.
25. 25. Célula inmunitaria modificada por ingeniería según una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 24, en la que dicha célula está mutada para conferir resistencia a al menos un fármaco inmunosupresor o de quimioterapia.
26. 26. Célula inmunitaria modificada por ingeniería según las reivindicaciones 22 a 25, para su uso en terapia.
27. 27. Célula inmunitaria modificada por ingeniería según una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 25, para su uso como medicamento en el tratamiento de cáncer.
28. 28. Célula inmunitaria modificada por ingeniería según una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 26, para su uso en terapia de un estado de cáncer premaligno o maligno caracterizado por células que expresan ROR1.
29. 29. Célula inmunitaria modificada por ingeniería según una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 26, para su uso en terapia de un estado de cáncer hematológico, tal como leucemia.
30. 30. Célula inmunitaria modificada por ingeniería según una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 26, para su uso en terapia de un estado de cáncer hematológico, en la que el estado de cáncer hematológico se selecciona del grupo que consiste en: leucemia linfocítica crónica (CLL), el linfoma linfocítico de células pequeñas (SLL), leucemia mielógena aguda, leucemia mielógena crónica, síndrome mielodisplásico, linfoma de células del manto (MCL) y leucemia linfoblástica aguda (ALL) con una translocación cromosómica t(1;19).
31. 31. Célula inmunitaria modificada por ingeniería según una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 26, para su uso en terapia, en la que el estado es un tumor sólido.