JP2017523810A5

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Publication number: JP2017523810A5
Application number: JP2017526770A
Authority: JP
Filing date: 2015-07-28
Publication date: 2018-06-21
Anticipated expiration: 2035-07-28

Claims

ＤＮＡ試料中のＰＩＫ３ＣＡ突然変異アレルＤＮＡの存在を分析する方法であって、前記突然変異アレルＤＮＡの非対称およびアレル特異的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施するステップ、ならびに前記ＰＣＲにおいて産生されたＤＮＡの融解分析を実施するステップを含み、
前記ＰＣＲを、
− 増幅すべき前記突然変異アレルＤＮＡの第１鎖の３’（３プライム）末端に相補的な突然変異アレル特異的プライマーであって、突然変異部位および対応する野生型ＤＮＡに対するミスマッチを含む、突然変異アレル特異的プライマー、および
− 検出すべき突然変異が存在する対応位置における前記突然変異アレルＤＮＡの第１鎖に対応する野生型ＤＮＡの第１鎖の野生型配列に相補的なオリゴヌクレオチドである非標識ブロッキングプローブであって、前記突然変異部位の他に前記突然変異アレルＤＮＡの前記第１鎖に対する付加ミスマッチを含み、前記ＰＣＲ反応におけるＤＮＡ合成のためのプライマーとして作用するのをブロックされる、非標識ブロッキングプローブ、および
− 前記ＰＣＲにより増幅すべき前記突然変異アレルＤＮＡの第２鎖の３’末端に相補的な共通プライマー
の使用により実施し、
前記融解分析を、
− 前記野生型アレルＤＮＡに相補的であり、前記突然変異アレルＤＮＡの配列と重複する配列を含むオリゴヌクレオチドである非標識プローブである融解プローブ、および
− 増幅突然変異アレルＤＮＡ鎖または野生アレルＤＮＡ鎖に結合している前記融解プローブの二本鎖成分を少なくとも含む二本鎖ＤＮＡ成分の融解温度を計測するための検出可能な成分であって、前記融解温度は、前記増幅突然変異アレル鎖に結合している前記融解プローブおよび前記増幅野生アレル鎖に結合している前記融解プローブの前記二本鎖成分間で異なる、検出可能な成分
の使用により実施する方法。
前記ＰＣＲ反応において増幅すべき前記突然変異アレルＤＮＡが、ＰＩＫ３ＣＡのエクソン９（配列番号１）および／またはエクソン２０（配列番号２）を含むか、またはそれからなり、前記突然変異アレル特異的プライマー配列が、エクソン９（配列番号４）または２０（配列番号９）のＤＮＡ鎖に相補的である、請求項１に記載の方法。
前記突然変異がＰＩＫ３ＣＡのエクソン９中に存在し、前記突然変異アレル特異的プライマーが、配列５’−ＴＴＴＣＴＣＣＴＧＡＴＴ−３’（配列番号３）を含むか、もしくはそれからなり、または５’−ＡＣＴＣＣＡＴＡＧＡＡＡＡＴＣＴＴＴＣＴＣＣＴＧＡＴＴ−３’（配列番号４）（Ｔは、突然変異部位を示し、Ａは、付加ミスマッチを示す）である、請求項１または２に記載の方法。
前記非標識ブロッキングプローブが、配列５’−ＣＴＧＡＴＣＡＧＴＧＡ−３’（配列番号５）およびＰＣＲブロッキング成分を含むか、もしくはそれからなり、または配列５’−ＣＴＴＴＣＴＣＣＴＧＡＴＣＡＧＴＧＡＴＴＴＣＡＧＡＧ−Ｐ−３’（配列番号６）（Ｐは、リン酸であり、Ａは、付加ミスマッチである）を含むか、もしくはそれからなる、請求項３に記載の方法。
前記共通プライマーが、配列５’−ＧＣＴＣＡＡＡＧＣＡＡＴＴＴＣＴＡＣＡＣＧＡＧＡ−３’（配列番号７）に対して７５％から１００％の同一性を有する、請求項４に記載の方法。
前記突然変異が、ＰＩＫ３ＣＡのエクソン２０（配列番号２）中に存在し、前記突然変異アレル特異的プライマーが、配列５’−ＡＡＴＧＡＴＧＣＡＣＧ−３’（配列番号８）（Ｇは、突然変異部位を示す）を含むか、またはそれからなる、請求項１または２に記載の方法。
前記突然変異アレル特異的プライマーが、５’−ＡＴＧＡＡＡＣＡＡＡＴＧＡＡＴＧＡＴＧＣＡＣＧ−３’（配列番号９）（Ｇは、突然変異部位を示す）を含むか、またはそれである、請求項６に記載の方法。
前記非標識ブロッキングプローブが、５’−ＴＧＣＡＣＡＴＣＡＴＧ−３’（配列番号１０）の配列およびＰＣＲブロッキング成分または５’−ＧＡＡＴＧＡＴＧＣＡＣＡＴＣＡＴＧＧＴＧＧ−Ｐ−３’（配列番号１１）（Ｐは、リン酸である）の配列を含む、請求項６または７に記載の方法。
前記共通プライマーが、５’−ＴＣＴＣＡＧＴＴＡＴＣＴＴＴＴＣＡＧＴＴＣＡＡＴＧＣ−３’（配列番号１２）の配列に対して７５％から１００％の同一性を有する、請求項６〜８のいずれか一項に記載の方法。
前記融解プローブが、前記非標識ブロッキングプローブである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
前記非標識ブロッキングプローブが、増幅のためのＰＣＲプライマーと比較して付加リン酸基により修飾されている修飾３’末端を有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
前記検出可能な成分が、蛍光成分を含み、前記融解分析が、前記蛍光成分を検出することを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
前記蛍光成分が、前記試料中の二本鎖ＤＮＡの存在下でのみ蛍光を発光しているＬＣ−ＧｒｅｅｎＰｌｕｓまたはＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩからなる群のＤＮＡ結合蛍光色素である、請求項１２に記載の方法。
前記非標識ブロッキングプローブおよび前記共通プライマーが、前記突然変異アレル特異的プライマーよりも高濃度において存在する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
ｉ）対象における悪性新生物疾患を診断し、および／または
ｉｉ）対象における悪性新生物疾患の治療の効力を予測し、および／または
ｉｉｉ）対象における悪性新生物疾患の治療のアウトカムを評価し、および／または
ｉｖ）対象における悪性新生物疾患の再発を評価する
方法であって、
前記対象は、悪性新生物疾患を有する、または有すると疑われる哺乳動物であり、
請求項１〜１４に記載の方法により試料中のＰＩＫ３ＣＡ突然変異アレルＤＮＡの存在を分析することを含む方法。
前記悪性新生物疾患が、乳癌、結腸癌、肺癌、子宮頸癌、卵巣癌、食道癌、脳癌、皮膚癌、肝臓癌、膵臓癌、頭頸部癌、胃癌および甲状腺癌である、請求項１５に記載の方法。
ｉ）試料中のＰＩＫ３ＣＡ中の突然変異の存在を検出する、および／または
ｉｉ）対象における悪性新生物疾患を検出する；または
ｉｉｉ）対象における悪性新生物疾患を診断する；または
ｉｖ）対象における悪性新生物疾患の治療のアウトカムを予測する；または
ｖ）対象における悪性新生物疾患の治療の効力を評価する；または
ｖｉ）対象における悪性新生物疾患の再発を評価するため
のキットであって、
− 少なくとも配列５’−ＴＴＴＣＴＣＣＴＧＡＴＴ−３’（配列番号３）を含むか、もしくはそれからなり、または少なくとも配列５’−ＡＣＴＣＣＡＴＡＧＡＡＡＡＴＣＴＴＴＣＴＣＣＴＧＡＴＴ−３’（配列番号４）（Ｔは、突然変異部位を示し、Ａは、付加ミスマッチを示す）を含むか、もしくはそれからなる第１のポリヌクレオチド、ならびに／または
− 少なくとも配列５’−ＡＡＴＧＡＴＧＣＡＣＧ−３’（配列番号８）を含むか、もしくはそれからなり、または少なくとも配列５’−ＴＧＡＡＡＣＡＡＡＴＧＡＡＴＧＡＴＧＣＡＣＧ−３’（配列番号９）（Ｇは、突然変異部位を示す）を含むか、もしくはそれからなる第２のポリヌクレオチド、ならびに／または
− 少なくとも配列５’−ＣＴＧＡＴＣＡＧＴＧＡ−３’（配列番号５）およびＰＣＲブロッキング成分を含むか、もしくはそれからなり、または少なくとも配列５’−ＣＴＴＴＣＴＣＣＴＧＡＴＣＡＧＴＧＡＴＴＴＣＡＧＡＧ−Ｐ−３’（配列番号６）（Ｐは、リン酸であり、Ａは、付加ミスマッチである）を含むか、もしくはそれからなる第３のポリヌクレオチド、ならびに／または
− 少なくとも配列５’−ＴＧＣＡＣＡＴＣＡＴＧ−３’（配列番号１０）およびＰＣＲブロッキング成分を含むか、もしくはそれからなり、または少なくとも配列５’−ＧＡＡＴＧＡＴＧＣＡＣＡＴＣＡＴＧＧＴＧＧ−Ｐ−３’（配列番号１１）（Ｐは、リン酸である）を含むか、もしくはそれからなる第４のポリヌクレオチド、ならびに／または
− 配列５’−ＧＣＴＣＡＡＡＧＣＡＡＴＴＴＣＴＡＣＡＣＧＡＧＡ−３’（配列番号７）に対して７５％から１００％の同一性を有する第５のポリヌクレオチド、ならびに／または
− 配列５’−ＴＣＴＣＡＧＴＴＡＴＣＴＴＴＴＣＡＧＴＴＣＡＡＴＧＣ−３’（配列番号１２）に対して７５％から１００％の同一性を有する第６のポリヌクレオチド
を含むキット。