JP2017519983A - 気圧に基づいて標的を測定する定量測定方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は気圧測定に基づく定量分析方法を提供し、無機イオン、小分子、タンパク質やDNAを例とする生体高分子、ないしウイルス、細菌、細胞などの多種の標的の高感度定量分析に使われる。本発明は酵素又はナノ粒子などで、オキシドールが大量の気体を生成することを触媒し、測定標的分子の信号をガスの圧力信号に転換させることで、信号の増幅を実現し、最後は気圧計を通して圧力を電子信号に転換させて読み取り、高感度の定量測定を実現する。本発明では、気圧計を使用して三つの異なった測定体系、其々ELISA体系、DNAハイドロゲル、機能化DNAセンサーで、本発明の実行性、広い適用性及び信頼性を証明する。【代表図面】なし
Description
本発明は気圧に基づいて標的を測定する定量測定方法に関し、無機イオン、小分子、生体高分子、特にタンパク質、DNA、ないしウイルス、細菌、細胞などの多種の標的の高感度定量に使われる。
斬新、高感度、高選択性で、安価、便利な定量測定分析方法を開発することは常に科学研究活動の中で、最も人気のある課題である。従来の定量測定分析方法は通常、各種の大型精密設備、例えば、分光器、質量分析装置、クロマトグラフ装置、電気泳動などに依存している。これらの定量分析方法は長年の開発を経て、成熟した測定方法や技術を確立しており、生物、化学、医学、食品等の多分野のサンプル測定や分析、例えば、各種の有機小分子、生体高分子乃至細菌、ウイルス、細胞などに広く運用されている。しかし、質量分析、クロマトグラフや電気泳動であれ、分光器であれ、高感度の定量測定や分析を実現するためには、設備の精密程度や測定部品の感度に対する要求が高いので、測定装置や測定試験のコストを下げることは困難である。
光学に基づく定量分析装置を例にすると、よくみられるのは紫外−可視分光光度計、紫外線分光計、蛍光分析計等である。高感度の精確的な定量測定分析を実現するためには、これらの装置には複雑且つ精密な光路部品、例えば、ライトカーテン、フィルター、レンズ組が必要であることに加え、十分に訓練された操作員によって設備を精確に操作する必要もある。それ以外に、設備の感度を向上するために、高出力の光源を提供して光学信号を集中させ増加させる必要がある。同時に、光学に基づく測定方法は測定体系に対する要求が極めて高い。一方で、測定体系の成分をあまりにも複雑にすることはできない。標的以外の分子又は物質が測定標的分子と類似な光学特性を持っている時に、測定の正確性を深く影響するので、光学測定体系においては、複雑な前処理を実施してこの問題を避けることが一般的である。他方で、全ての分子には良好な光学特性があるわけではないので、通常は、分子識別技術を用いて分子の標識や信号増幅を行い、例えば、酵素結合免疫法は免疫学的方法を利用し、蛍光特性又は光学吸収特異性のある産生物を触媒・発生させ、標的抗原の測定を実現する(1、Engvall E、Perlmann P.Enzyme−linked immunosorbent assay(ELISA)quantitative assay of immunoglobulin G.Immunochemistry[J]、1971、8(9):871−874.)。前記の問題いずれによっても、光学定量測定方法のコストを下げることが一層難しくなる。そのため、安価で実行でき且つ感度の良い定量測定方法の開発が日々研究者の関心を引き起こしている。
同時に、技術の発展、及び科学や生命への意識が高くなるとともに、人間は実験室の費用と手間がかかる実験測定に満足できなくなり、技術を生活運用と結合し、「科学技術は生活を変える」を確実に実現する希望は差し迫っている。例えば、「即時診断」という概念は日々注目されている(2、R.J.Davies、S.S.E.、S.J.Carlisle、Handbook of Biosensors and Biochips、Wiley、Hoboken[M].2008.;3、Liu、H.、Xiang、Y.、Lu、Y.、Crooks、R.M.、Aptamer−based origami paper analytical device for electrochemical detection of adenosine、Angewandte Chemie−International Edition[J].2012、51.6925−8.;4、Liu、J.W.、Oligonucleotide−functionalized hydrogels as stimuli responsive materials and biosensors、Soft Matter[J].2011、7.6757−6767.)。いわゆる「即時診断」(Point of Care Test、POC Test)とは、発病又は事件が発生した場所で、即時に測定、診断し、それにより、迅速な監視制御や治療を実現する。現代のPOC測定方法は通常免疫分析技術を利用し、つまり、特異性抗体は抗原と結合して目標物を捕捉して分析する。病気特異性目標蛋白の標識物を測定の目標として、病気の診断を実現する。例として、妊娠測定試薬キットは妊娠ホルモンのヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG)を標的とする。しかし、精密装置のサポートを失うと、POC測定の感度は必ず影響される。現有のPOC測定は通常定性又は半定量測定しか実現できないので、病気又は身体状況の精確な診断が実現できない。そのため、POC測定は即時診断や緊急状況対応に対してある程度の情報を提供できるにもかかわらず、もっと高速に臨床治療にもっと精確な根拠を提供することはできない。小型、同時に高感度の高速・安価な測定方法の構築が目前に迫っている。
以上のようにして、将来の科学研究では、実験方法の高感度、高選択性、高正確性などのメリットを影響しないと同時に測定装置や実験コストを顕著に下げ、又は、実験室の高感度、高選択性、高正確性等の実験要求を実現し、小型、携帯、低エネルギー消耗などのメリットを有する、即時診断に応用できる定量測定分析方法の開発は急迫に解決すべき問題になる。
本発明は現有高感度定量測定分析方法及び装置の値段が高い、実験方法コストが高いなどの欠点に対し、気圧測定に基づく高感度、高選択性、高正確性と同時に、安価で携帯的な定量測定分析方法を提供し、この方法は実験室の高感度、高選択性の無機イオン、小分子、生体高分子のタンパク質、DNA、乃至ウイルス、細菌、細胞などの多種標的の高感度定量に使われる以外、高速な高感度POC定量測定分析にも使える。
本発明の技術案は以下である。
気圧に基づいて標的を測定する高感度、通用する定量測定方法は、密閉した体系の中に、分子識別で信号増幅分子、例えば酵素、又はナノ粒子を導入し、信号増幅分子又は粒子を通して基質から大量のガス分子を放出することを触媒し、体系の圧力を増強させ、体系の圧力変化を通して標的濃度の高感度定量測定を実現する。
気圧に基づいて標的を測定する高感度、通用する定量測定方法は、密閉した体系の中に、分子識別で信号増幅分子、例えば酵素、又はナノ粒子を導入し、信号増幅分子又は粒子を通して基質から大量のガス分子を放出することを触媒し、体系の圧力を増強させ、体系の圧力変化を通して標的濃度の高感度定量測定を実現する。
その中、前記分子識別技術は、抗体、核酸アプタマー、核酸プローブなど特異性識別機能を備える分子を利用し、標的を識別又はマークし、且つ前記識別分子で信号増幅分子又は粒子を測定体系に導入することである。
その中、分子識別技術を利用して標的を識別又はマークし、標的はタンパク質、核酸、ペプチド鎖、糖類、脂肪類、有機小分子、無機イオン、細胞、細菌、ウイルスを含むが、それらに限らない。
その中、信号増幅分子はカタラーゼ、金ナノ粒子、白金ナノ粒子、金−白金ナノ粒子、マンガン酸化物ナノ粒子又は基質を触媒してガスを発生する他の触媒又は酵素であり、触媒基質は触媒された後にガス分子を発生する物質(例えばH2O2)であり、ガス分子は基質が触媒された後の産物(例えばO2)である。
その中、密閉した体系の中に、その反応測定体系は酵素結合免疫吸着法(ELISA)体系、DNAハイドロゲル体系、機能化DNAセンサー体系の中の少なくとも一種である。
酵素結合免疫吸着法体系において、気圧に基づいて標的を測定する定量測定方法は好ましくは以下のステップを含み、
測定必要性のある抗原に基づき、対応の捕捉抗体及び測定抗体を選択し、
信号増幅分子を修飾して測定抗体分子とカップリング結合させ、又は測定抗体と特異的に結合させ、
多孔板(例えば96ウェルプレート)又は磁気ビーズ又はミクロスフェア等の酵素結合免疫吸着法に使われる固相の表面に包み、捕捉抗体を入れて包まれた固相の表面と結合させた後に、密閉液で密閉し、測定待ちの抗原を入れてから測定抗体を入れてサンドイッチ構造を形成し、余計な測定抗体を洗い除き、
信号増幅分子を導入し、
多孔板に基質を入れ、反応キャビティを密閉し、信号増幅分子で基質分子を触媒して大量のガス分子を生成させ、気圧計に読取れる圧力信号を発生させ、
気圧計に示す圧力変化値に基づき、標的分子の定量測定を実現する。
測定必要性のある抗原に基づき、対応の捕捉抗体及び測定抗体を選択し、
信号増幅分子を修飾して測定抗体分子とカップリング結合させ、又は測定抗体と特異的に結合させ、
多孔板(例えば96ウェルプレート)又は磁気ビーズ又はミクロスフェア等の酵素結合免疫吸着法に使われる固相の表面に包み、捕捉抗体を入れて包まれた固相の表面と結合させた後に、密閉液で密閉し、測定待ちの抗原を入れてから測定抗体を入れてサンドイッチ構造を形成し、余計な測定抗体を洗い除き、
信号増幅分子を導入し、
多孔板に基質を入れ、反応キャビティを密閉し、信号増幅分子で基質分子を触媒して大量のガス分子を生成させ、気圧計に読取れる圧力信号を発生させ、
気圧計に示す圧力変化値に基づき、標的分子の定量測定を実現する。
その中、多孔板の表面を捕捉抗体が吸着する固相表面として、標的分子の捕捉に使うことができる。磁気ビーズ又はミクロスフェアを捕捉抗体が吸着する固相の表面として、磁場又は遠心などの方法で、標的分子の捕捉を実現することもできる。
その中、信号増幅分子又はナノ粒子を導入する方法として、測定抗体を直接カップリング標記してもよい、又は、特異性識別測定抗体の分子を信号増幅分子又はナノ粒子の修飾に使うこともよい、測定抗体が標的分子と結合した後、信号増幅分子又はナノ粒子を測定抗体と結合させ、信号増幅分子又はナノ粒子にもっとよい通用性や適用性を備わらせる。
DNAハイドロゲル体系において、気圧測定に基づく多種の標的の即時可視化した定量測定方法は好ましくは以下の工程を含み、
二つのアクリルアミド/DNA高重合鎖、一つの核酸アプタマー分子を酵素分子又はナノ粒子と混合し、架橋ハイドロゲルを製造し、
異なる既知濃度の分析物を含む溶液を前記のハイドロゲルに入れて反応させ、酵素又はナノ粒子を放出し、
(3)反応が終わった後に、反応上澄み液を取って反応試験管に置き、信号増幅分子を基質と触媒反応させ、密閉した体系に発生した大量のガスで、体系中の圧力が高くなり、気圧計で読み取り、データを記録し、さらに標準曲線を作り、未知サンプル中の標的含有量を測定する。
二つのアクリルアミド/DNA高重合鎖、一つの核酸アプタマー分子を酵素分子又はナノ粒子と混合し、架橋ハイドロゲルを製造し、
異なる既知濃度の分析物を含む溶液を前記のハイドロゲルに入れて反応させ、酵素又はナノ粒子を放出し、
(3)反応が終わった後に、反応上澄み液を取って反応試験管に置き、信号増幅分子を基質と触媒反応させ、密閉した体系に発生した大量のガスで、体系中の圧力が高くなり、気圧計で読み取り、データを記録し、さらに標準曲線を作り、未知サンプル中の標的含有量を測定する。
その中、二つのアクリルアミド/DNA高重合鎖、一つの両端がそれぞれ二つの高重合鎖の上のDNA序列と相補・対合できる核酸アプタマーを利用し、DNAハイドロゲルを形成する。
その中、酵素分子又はナノイオンを形成したDNAハイドロゲル中のDNA三鎖構造で形成したキャビティの中に包み、分子間の立体障害を利用し、自由拡散できないように、酵素分子又はナノイオンを制限する。標的が存在している時に、核酸アプタマーに構造変化が発生し、DNAハイドロゲルが瓦解し、中の酵素分子又はナノ粒子を放出する。
機能化DNAセンサー体系において、気圧測定に基づく多種の標的の即時可視化した定量測定方法は好ましくは以下の工程を含み、
標的分子に対して適合する核酸アプタマーを選び、核酸アプタマーに捕捉プローブと相補する序列を添加し、
核酸アプタマーの序列に基づき、適合する検出プローブの序列を設計し、標的分子は存在していない時に、検出プローブを塩基同士間の相互作用で、核酸アプタマー鎖と結合させ、標的分子は存在する時に、検出プローブより競合性があり、
生物又は化学的カップリング方法、例えば、脱炭酸反応又はビオチン−親和素の相互作用を利用し、捕捉プローブを磁気ビーズの表面につけ、検出DNA及び核酸アプタマーを入れて磁気ビーズの表面に機能化DNAのサンドイッチ交雑構造を形成させ、
DNAのサンドイッチ交雑構造に標的を入れ、標的は核酸アプタマーと結合して三鎖構造上の検出プローブを置換し、
磁石で磁気ビーズを集め、且つ上澄みを取って反応試験管の中に入れ、同時に溶液相の基質を入れ、信号増幅分子は溶液相基質に作用して気圧計に読み取ることのできる信号分子を産生し、
(6)気圧計に示す数字に基づき、測定結果を記録する。
標的分子に対して適合する核酸アプタマーを選び、核酸アプタマーに捕捉プローブと相補する序列を添加し、
核酸アプタマーの序列に基づき、適合する検出プローブの序列を設計し、標的分子は存在していない時に、検出プローブを塩基同士間の相互作用で、核酸アプタマー鎖と結合させ、標的分子は存在する時に、検出プローブより競合性があり、
生物又は化学的カップリング方法、例えば、脱炭酸反応又はビオチン−親和素の相互作用を利用し、捕捉プローブを磁気ビーズの表面につけ、検出DNA及び核酸アプタマーを入れて磁気ビーズの表面に機能化DNAのサンドイッチ交雑構造を形成させ、
DNAのサンドイッチ交雑構造に標的を入れ、標的は核酸アプタマーと結合して三鎖構造上の検出プローブを置換し、
磁石で磁気ビーズを集め、且つ上澄みを取って反応試験管の中に入れ、同時に溶液相の基質を入れ、信号増幅分子は溶液相基質に作用して気圧計に読み取ることのできる信号分子を産生し、
(6)気圧計に示す数字に基づき、測定結果を記録する。
その中、検出プローブに、基質を触媒して大量のガスを放出する信号増幅分子がカップリングされて、例えば、酵素又はナノ粒子である。
その中、核酸アプタマーと標的分子との結合を利用し、標的分子は存在している時に、信号増幅分子がカップリングされている検出プローブより競合性があり、且つ後続の信号増幅を実現することができる。
その中、ステップ(3)に使われる磁気ビーズをミクロスフェア又は多孔板で取り替えることができ、それに対応して、とり替えられない検出プローブを除く方法として、遠心(ミクロスフェア)又は直接上澄みを吸い取る(多孔板)方法を使用してもよい。
その中、使用している検出プローブは化学又は生物のカップリング方法で、信号増幅分子(酵素又はナノ粒子)とカップリングし、検出プローブの特異性で酵素又はナノ粒子を導入する。
本発明のメリットは、まず、この方法は設計の面で、ASSURED(Martinez A.、Phillips S.、Whitesides G.、et.al.、Diagnostics for the Developing World:Microfluidic Paper−Based Analytical Devices、Analytical Chemistry[J].2010、82.3−10.)という国際標準に符合すると同時に、感度が高い、選択性がよい、測定結果が信頼できる。その中、Au@PtNPsには長時間触媒、保存しやすいなどのメリットがある。Au@PtNPsがH2O2との反応時間を延長することで、超低標的の測定が実現でき、発生したO2の体積量を圧力に転化させた上で、標的濃度と気圧計表現値の定量関係を築いた。また、SELEX技術の高速な発展により、現在にはたくさんの使用できる核酸アプタマーがある以外、SELEXを通してもっと広い標的の核酸アプタマーを選別することもでき、ハイドロゲル及び機能化DNAセンサー体系の中に、特異性核酸アプタマー序列を簡単に取替えて、我々の発展方法をもっと多い他の標的の高速、定量分析に使うことができる。その以外、ELISA体系においで、伝統のELISAは、標識したHRP酵素又は他の酵素の顕色反応を利用して抗体又は抗原の定量測定を実現するので、それは大型装置に依存する必要があることは、実験室又は病院に使用する必要があることを指し、即時診断が実現できない。本発明では、簡単な気圧計だけで、定量測定が実現でき、且つ、抗体抗原を簡単に交換するだけで、異なる抗原の測定が実現できる。コストが安価で、測定が速く、使用が便利、及び気圧計の広い運用で、気圧測定に基づく可視化した定量測定方法は公衆に広く使われる標的の定量測定工具に発展できる。
本発明の測定方法は感度が高く、且つ、操作が簡単で、値段が安く、反応が速く、サンプルへの複雑な前処理が要らないなどのメリットがあり、且つ、通用性が良いので、複雑体系にも使え、生体小分子、重金属イオン、タンパク質などを含む各種物質の高速、高感度の定量測定に使われる。
実施例1、アクリル酸ホスホラミダイト単体の合成
アクリル酸ホスホラミダイト単体の合成は三つのステップに分けられ、1)6−アミノ−1−ヘキサノール(1g、8.53mmol)、トリエチルアミン(2.36mL、17mmol)を100mLのジクロロメタンの中に入れて氷浴し、無水無酸素条件の下で、メタクリロイルクロリド(2.67g、2.55mmol)を一滴一滴に入れ、その後、体系全体を室温の条件で2時間攪拌反応させた。2)溶剤を回転して蒸発させ、産物に10mLのヘキサノールと15%NaOH(4mL)を入れ、産物を選択的にN−(6−hydroxyhexyl)methacrylamideに加水分解させた。N−(6−hydroxyhexyl)methacrylamideを酢酸エチルでシリカゲルコラムに分離した後、次の反応を行った。3)純化後のN−(6−hydroxyhexyl)methacrylamide(0.50g、2.70mmol)を10mLの無水ジクロロメタンの中に溶かし、0℃の条件で、N、N−ジイソプロピルエチルアミン(DIPEA、0.98g、7.5mmol)を一滴、一滴入れた後に、クロロ(ジイソプロピルアミノ)亜ホスフィン酸2−シアノエチル(0.87mL、3.25mmol)を一滴、一滴入れ、室温で2時間反応させた。溶剤を回転蒸発させた後に、酢酸エチル:石油エーテル:トリエチルアミンが40:60:3の溶離液でシリカゲルコラムに産物を溶離した。得た最終産物は無色の油状の液体であった。最終産物の核磁気分析のデータは、1H NMR(CDCl3):δ5.92(br、1H)、5.63(m、1H)、5.27(m.1H)、3.86−3.72(m、2H)、3.66−3.49(m、4H)、3.30−3.23(m、2H)、2.61(t、2H)、1.92(m、3H)、1.58−1.50(m、4H)1.37−1.32(m、4H)1.17−1.13(m、12H).13C NMR(CDCl3):δ168.6、140.4、119.3、118.0、63.8、63.6、58.6、58.3、43.2、43.1、39.8、31.3、29.7、26.8、25.8、24.9、24.8、24.7、19.0.31P(CDCl3):δ148である。
実施例2、メチルプロペングループ、biotinグループ及びスルフィドリルグループで修飾した核酸分子の合成と純化
通常のCPGを固相担体とし、DNA担体塩基を原料とし、DNA合成装置で、3′端から5′端に、鎖A、鎖B、linker核酸アプタマー、検出DNA、ELISA DNAを合成し、最後は鎖AとBの5′端で実施例1に合成したアクリル酸ホスホラミダイト単体を修飾(合成装置で修飾する)し、DNA上の修飾スルフィドリルを検出した。具体的な合成序列を表1、表2、表3に示す。biotinで修飾されるCPGを固相担体として、DNA単体塩基を原料として、DNA合成装置で3′端から5′端に捕捉DNAを合成し、具体的な合成序列を表2に示す。合成が終わった後に、前記CPGを2mL洗浄滅菌されたEppendorf管に移し、0.5mLメチルアミン:アンモニア=1:1の溶液を入れ、65℃で30分間加安分解し、DNAをCPGから切断した。加安分解の後に、上澄みを取り、少量の超純水でCPGを洗い、上澄みと合わせた。体系に体積が2.5倍の冷凍無水アルコールと体積が0.1倍の3mol/LのNaClを入れ、−20℃の冷蔵庫で30分間アルコールの沈積を行った。アルコール沈積終わった後に、14、000rpmの回転速度で10分間遠心処理して、上澄みを捨てた。得た粗産物をpH 8の0.1mol/Lの酢酸トリエチルアミン(TEAA)に溶かし、高速液体クロマトグラフィーHPLCで純化した。高速液体クロマトグラフィーHPLCで純化された製品を真空乾燥した。スルフィドリル修飾DNA以外、他のDNAを80%の酢酸に溶かしてDMTを脱し、30分間反応した後に、汲み上げて超純水に溶かし、ゲル濾過柱で脱塩処理した。紫外−可視分光光度計で260nmのところの核酸の光吸収度を測定し、DNAの消光係数に基づき、対応物質の量や濃度値を計算した。定量後真空濃縮した。5’スルフィドリル修飾DNAがHPLCで純化した後に、pH 6.5の0.1M TEAAを入れてDNAを溶かし、A260を測定し、A260=100まで希釈し、総体積はVであることを記録した。その後は0.15Vの1M AgNO3を入れ、均一に混合し、室温で30分間反応した。さらに、0.20Vの1M DTT(ジチオトレイトール)を入れて均一に混合し、室温で5分間反応した。遠心して上澄み(DTT配合物)を取り、沈積は1V 0.1M TEAAで洗浄し、洗浄液を合弁した。ゲル濾過柱で脱塩処理を行った。紫外−可視分光光度計で260nmところの核酸の光吸収度を測定し、DNAの消光係数に基づき、対応物質の量や濃度値を計算した。定量後真空濃縮した。
表1 実施例2に使用したDNA序列
表2 実施例2に使用したDNA序列
表3 実施例2に使用したDNA序列
実施例3、サンドイッチ構造の製造
H5N1鳥インフルエンザウイルスHA蛋白を例として、96ウェルプレートで捕捉抗体を包み、濃度は2.0μg/mLであり、体積は100μLであり、板を密閉し、4度で夜を過ごした。その後はWash Bufferで三回洗浄した。300μLの密閉液を入れて、室温で少なくとも1時間密閉した。100μLの違う濃度の測定待ち抗原を入れ、室温で2hrインキュベートし、三回洗浄した後に、100μL、1.5μg/mLの測定抗体を入れ、室温で1時間インキュベートしてサンドイッチ構造を形成した。
実施例4、通常ELISA蛋白体系の実行性検証
通常ELISAの反応過程はまず、capture抗体を包み、タンパク質とポリスチレン固相担体は疎水作用力を通して結合した。その後それぞれ抗原、biotin化のdetection抗体、SA−HRP複合物及び基質を入れ、基質の反応で、吸収の測定を通して標的を測定した。結果を図7、図10、図15に示す。
実施例5、Biotin化のカタラーゼ(Catalase)の製造
Biotin化に使用された緩衝液は、0.1Mの炭酸水素ナトリウムであり、pHが8.4であった。1mg/mlのBNHSをゆっくりと10mg/mlのカタラーゼ(Catalase)に滴落し、それの反応最終体比を8:1に制御した。均一に揺れて混合し、室温で4hr反応した。遠心式限外ろ過で遊離のBNHSを除き、Biotinのカタラーゼ(Catalase)を得た。
実施例6、ELISA体系測定−信号増幅分子はカタラーゼ(Catalase)である。
作りあがったサンドイッチ構造の96ウェルプレート微細キャビティの中に100μL、1μg/mLStreptavidinを入れ、室温で1時間インキュベートし、それを測定抗体上のbiotinと結合させた。100μL、20nM Catalase−biotinを入れ、室温で1時間インキュベートし、余計なカタラーゼ除いた。96ウェルプレートに溶液層基質をいれ、反応蓋を閉めて密閉させた。信号増幅分子カタラーゼ(は溶液相の基質に作用し、気圧計に読み取ることのできる信号を産生した。気圧計の表現値に基づき、測定結果を記録した。結果を図6に示す。
図6は室温で、ELISA体系においで、カタラーゼを使い、異なる濃度の標的蛋白、H5N1鳥インフルエンザウイルスHA蛋白を測定した。96ウェルプレートに捕捉抗体を包み、濃度は2μg/mL、体積は100μLであり、板を密閉して4度で夜を過ごした。その後はWash Bufferで三回洗浄した。300μL密閉液を入れて室温で少なくとも1時間密閉した。100μLの異なる濃度の測定抗原をいれ、室温で2hrインキュベートし、三回洗浄した後に、100μL、1.5μg/mLの測定抗体を入れ、室温で1時間インキュベートし、サンドイッチ構造を形成し、測定抗体を洗い除いた。100μL、1μg/mLStreptavidinを入れ、室温で1時間インキュベートし、それを測定抗体上のbiotin相と結合させた。100μL、20nM Catalase−biotinを入れ、室温で1時間インキュベートし、余計なカタラーゼを除いた。96ウェルプレートに溶液相基質(0.31M H2O2)を入れ、反応蓋を閉めて密閉した。信号増幅分子カタラーゼは溶液相基質に作用し、気圧計が読み取る信号分子を産生した。反応時間を1時間に制御した。気圧計に示す数字に基づき、測定結果を記録した。
実施例7、ELISA体系測定−信号増幅分子はAu@PtNPsであった。
サンドイッチ構造が作り上げた96ウェルプレートの微細キャビティに100μL、1μg/mLStreptavidinを入れ、且つ室温で1時間インキュベートし、測定抗体上のbiotinと結合させた。100μL、2.5nM Au@PtNPs−DNA−biotinを入れ、室温で1時間インキュベートし、余計なナノ粒子を洗い除いた。96ウェルプレートに溶液相基質を入れて反応蓋を閉めて密閉した。信号増幅分子Au@PtNPsは溶液相基質に作用して気圧計が読み取る信号分子を産生した。気圧計に示す表現値に基づき、測定結果を記録した。結果を図8、図9、図11、図12、図13、図14、図16、図17に示す。
図8は室温で、ELISA体系において、ナノ粒子を使い、異なる濃度の標的蛋白、人のPSA組替蛋白を測定した。96ウェルプレートに捕捉抗体を包み、その濃度は2.0μg/mLで、体積は100μLであり、板を密閉し、4度で夜を過ごした。その後はWash Bufferで三回洗浄した。300μLの密閉液を入れ、室温で少なくとも1時間を密閉した。100μLの異なる濃度の測定抗原を入れ、室温で2hrインキュベートし、三回洗浄した後に、100μL、0.2μg/mLの測定抗体を入れ、室温で1時間インキュベートし、サンドイッチ構造を形成し、測定抗体を洗い除いた。100μL、1μg/mLStreptavidinを入れ、室温で1時間インキュベートし、測定抗体上のbiotinと結合させた。100μL、0.625nM Au@PtNPs−DNA−biotinを入れ、室温で1時間インキュベートし、余計なナノ粒子を洗い除いた。96ウェルプレートに溶液相基質を入れ、反応蓋を閉めて密閉させた。信号増幅分子Au@PtNPsは溶液相基質に作用し、気圧を読み取る信号分子を産生した。反応時間を1時間に制御した。気圧計に示す表現値に基づき、測定結果を記録した。
図9は室温で、ELISA体系において、HSA、IgG、MMP、Thrをネガティブコントロールとして、前記体系PSAの選択性を考察し、図は120μM HSA、IgG、MMP、Thr、PSAに対する反応で、反応時間は1時間であった。
図11は室温で、ELISA体系において、ナノ粒子を使って異なる濃度の標的蛋白、H5N1鳥インフルエンザウイルスHA蛋白体系を測定した。96ウェルプレートに捕捉抗体を包み、その濃度は2.0μg/mLで、体積は100μLであり、板を密閉し、4度で夜を過ごした。その後はWash Bufferで三回洗浄した。300μLの密閉液を入れ、室温で少なくとも1時間密閉した。100μLの異なる濃度の測定抗原を入れ、室温で2hrインキュベートし、三回洗浄した後に、100μL、1.5μg/mLの測定抗体を入れ、室温で1時間インキュベートし、サンドイッチ構造を形成し、測定抗体を洗い除いた。100μL、1μg/mLStreptavidinを入れ、室温で1時間インキュベートし、測定抗体上のbiotinと結合させた。100μL、2.5nMAu@PtAuNPs−DNA−biotinを入れ、室温で1時間インキュベートし、余計なナノ粒子を洗い除いた。96ウェルプレートに溶液相基質を入れ、反応蓋を閉めて密閉させた。信号増幅分子Au@PtAuNPsは溶液相基質に作用し、気圧が読み取る信号分子を産生した。反応時間を1時間に制御した。気圧計に示す表現値に基づき、測定結果を記録した。
図12は室温で、ELISA体系において、IgG、HSA、H3N2、SARSをネガティブコントロールとして、この体系のH5N1鳥インフルエンザウイルスHA蛋白の選択性を考察し、図は120μM H5N1、IgG、HSA、H3N2、SARSへの反応で、反応時間は1時間であった。
図13は室温で、ELISA体系において、血清環境で、異なる濃度のH5N1鳥インフルエンザウイルスHAを入れ、ナノ粒子を信号増幅分子として、異なる濃度の標的蛋白、H5N1鳥インフルエンザウイルスHA蛋白を測定した。
図14は室温で、ELISA体系において、異なる濃度の標的蛋白、H5N1鳥インフルエンザウイルスHA蛋白を測定した。異なる濃度のH5N1鳥インフルエンザウイルスHA蛋白サンプルを一式二部に分け、一部を標準方法の通常ELISAで測定し、もう一部はナノ粒子を信号増幅方法として、異なる濃度の標的蛋白、H5N1鳥インフルエンザウイルスHA蛋白を測定し、本発明の前記方法の正確性を考察した。
図16は室温で、ELISA体系において、ナノ粒子を使って、異なる濃度の標的蛋白、人のMMP9組替蛋白を測定した。96ウェルプレートにおいて捕捉抗体を包み、その濃度は2.0μg/mLで、体積は100μLであり、板を密閉し、4度で夜を過ごした。その後はWash Bufferで三回洗浄した。300μLの密閉液(2%BSA)を入れ、室温で少なくとも1時間を密閉した。100μLの異なる濃度の測定抗原を入れ、室温で2hrインキュベートし、三回洗浄した後に、100μL、0.25μg/mLの測定抗体を入れ、室温で1時間インキュベートし、サンドイッチ構造を形成し、測定抗体を洗い除いた。(4)100μL、1μg/mLStreptavidinを入れ、室温で1時間インキュベートし、測定抗体上のbiotinと結合させた。(5)100μL、0.625nM Au@PtNPs−DNA−biotinを入れ、室温で1時間インキュベートし、余計なナノ粒子を洗い除いた。(6)96ウェルプレートに溶液相基質を入れ、反応蓋を閉めて密閉させた。信号増幅分子Au@PtNPsは溶液相基質に作用し、気圧が読み取る信号分子を産生した。反応時間を1時間に制御した。気圧計に示す表現値に基づき、測定結果を記録した。
図17は室温で、ELISA体系において、Thr、Lys、IgG、HSAをネガティブコントロールとして、前記体系MMPの選択性を考察し、図は120μM MMP、Thr、Lys、IgG、HSAに対する反応で、反応時間は1時間であった。
実施例8、ハイドロゲルの製造
鎖Aと鎖Bをそれぞれ超純水に溶かして高濃度DNA保存液を作った。10%の過硫酸アンモンと5%のTEMED(N、N、N’、N’−テトラメチルエチレンジアミン)をそれぞれ配合し、つまり、0.05gの過硫酸アンモンが0.5mLの超純水に、25μl TEMEDが0.5mLの超純水に溶けていた。DNAを最終濃度が4%のアクリルアミドと混合液に配合させ、真空乾燥器の中に入れて10分間真空引き、ガスを除いた。最終濃度が1.4%の作りあがった開始剤(過硫酸アンモン)と加速剤(TEMED)を入れて、均一に混合した後に反応体系を真空乾燥器の中に入れ、30℃で15分間真空引き、鎖Aと鎖Bの線状高分子重合物PS−A、PS−Bを得た。PS−AとPS−Bは1:1の比例で混合した後に、10×反応緩衝液を1μL入れ、(コカインはPB緩衝液を使い、77mM Na2HPO4、23mMNaH2PO4、50mM NaCl、5mM MgCl2、pH 7.3であり、アデノシンはTris−HCl緩衝液を使い、10mM Tris−HCl、100mM NaCl、10mM MgCl2、pH 8.0であり、Pb2+はTris−CH3COOH緩衝液を使い、10mM Tris−HCl、300mM NaCl、pH 8.0であり、オクラトキシンAはTris−HCl緩衝液を使い、10mM Tris−HCl、120mM NaCl、25mM KCl、20mM CaCl2、pH 8.5である)、その後23nM Au@PtNPs 2μLを入れ、振動して均一に混合したら、PS−A、PS−Bと濃度比が1:1:0.6のlinker aptamerを入れた。Au@PtNPsを包む三次元架橋ハイドロゲルを得るまで、振動、加熱のステップを繰り返して行った。前記反応は乾浴器の中で実施し、過熱ステップは65℃で5分間キープし、その後は室温まで自然冷却した。
実施例9、DNAハイドロゲル可視化定量測定ステップ
使用する前に、対応の1×Buffer緩衝液で製造されたハイドロゲルを三回洗浄し、遠心管の管壁及びハイドロゲルの表面に残した信号増幅分子を除き、且つ、純水を除いた。測定する時に、緩衝液を使って標的溶液を配合し、且つハイドロゲルが入れた遠心管に入れた。遠心管をシェーキングテーブルに移し、30℃、150rpmの回転速度で充分反応させた。反応が終わったら、反応上澄み液を収集し、200μLの自制反応試験管に、それぞれ50μL反応上澄み液と50μLH2O2を入れ、反応時間を制御し、気圧変化に基づき、データを読み取って記録した。結果を図18、図19、図20、図21、図22、図23、図24、図25、図26、図27、図28に示す。
図18は室温で、DNAハイドロゲル体系において、異なる濃度のコカイン(cocaine)の測定に使った。DNAハイドロゲルの除去実験はPB緩衝液(77mM Na2HPO4、23mM NaH2PO4、50mM NaCl、5mMMgCl2、pH 7.3である)の中で、30℃、150rpmで1時間反応した。反応上澄み液を収集し、200μLの自制反応試験管に、それぞれ50μL反応上澄み液と50μLH2O2を入れ、5分間反応した後に、圧力を測定し、データを記録した。0μM実験グループとの差値を求め、図を作った。
図19は室温で、DNAハイドロゲル体系において、異なる濃度のコカイン(cocaine)の測定である。DNAハイドロゲルの除去実験はPB緩衝液(77mM Na2HPO4、23mM NaH2PO4、50mM NaCl、5mMMgCl2、pH 7.3である)の中で、30℃、150rpmで1時間反応した。反応上澄み液を収集し、在200μLの自制反応試験管に、それぞれ50μL反応上澄み液と50μLH2O2を入れ、15分間反応した後に、圧力を測定し、データを記録した。0μM実験グループとの差値を求め、図を作った。反応時間を延長することで、体系の検出限界を一層低下した。
図20は室温で、DNAハイドロゲル体系において、実際のサンプル尿液体系の中に、異なる濃度のコカイン(cocaine)の測定である。DNAハイドロゲルの除去実験はPB緩衝液(77mM Na2HPO4、23mM NaH2PO4、50mM NaCl、5mM MgCl2、pH 7.3である)の中で、30℃、150rpmで1時間反応した。反応上澄み液を収集し、在200μLの自制反応試験管に、それぞれ50μL反応上澄み液と50μLH2O2を入れ、5分間反応した後に、圧力を測定し、データを記録した。0μM実験グループとの差値を求め、図を作った。
図21は室温で、DNAハイドロゲル体系において、コカインの代謝産物ベンゾイルエクゴニンとアンヒドロエクゴニンメチルをネガティブコントロールとして、この体系の選択性を考察し、図は250μMコカインと2.5mMベンゾイルエクゴニンとアンヒドロエクゴニンメチルへの反応で、DNAハイドロゲルの除去実験はPB緩衝液(77mM Na2HPO4、23mM NaH2PO4、50mM NaCl、5mM MgCl2、pH 7.3である)の中で、30℃、150rpmで1時間反応した。反応上澄み液を収集し、在200μLの自制反応試験管に、それぞれ50μL反応上澄み液と50μL H2O2を入れ、5分間反応した。
図22は室温で、DNAハイドロゲル体系において、実際のサンプル尿液体系の中に、異なる濃度のコカイン(cocaine)の測定である。サンプルを二部に分け、一部は標準方法のLC/MSで測定し、もう一部は本発明の前記方法を使い、気圧を輸出方式として、違う濃度の標的コカイン(cocaine)を測定し、前記方法の正確性を考察した。
図23は室温で、DNAハイドロゲル体系において、異なる濃度のアデノシン(Adenosine)測定であり、反応時間は5分間であった。標的に基づき、ハイドロゲル中のDNA序列を変わることを通し、対応標的の測定が実現できた。DNAハイドロゲルの除去実験はTris−HCl緩衝液(10mM Tris−HCl、100mM NaCl、10mM MgCl2、pH 8.0である)の中で、30℃、150rpmで2hr反応した。反応上澄み液を収集し、在200μLの自制反応試験管に、それぞれ50μL反応上澄み液と50μL H2O2を入れ、5分間反応した後に、圧力を測定し、データを記録した。0μM実験グループとの差値を求め、図を作った。
図24は室温で、DNAハイドロゲル体系において、シチジン(Cytidine)、ウリジン(Uridine)をネガティブコントロールとして、この体系の選択性を考察し、図は1mMアデノシン(Adenosine)と10mMシチジン(Cytidine)、ウリジン(Uridine)への反応で、反応時間は5分間であった。DNAハイドロゲルの除去実験はTris−HCl緩衝液(10mMTris−HCl、100mM NaCl、10mM MgCl2、pH 8.0である)の中で、30℃、150rpmで2hr反応した。反応上澄み液を収集し、在200μLの自制反応試験管に、それぞれ50μL反応上澄み液と50μL H2O2を入れ、5分反応した後に、圧力を測定し、データを記録した。0μM実験グループとの差値を求め、図を作った。
図25は室温で、DNAハイドロゲル体系において、異なる濃度のPb2+測定に使い、反応時間は5分間であった。DNAハイドロゲルの除去実験はTris−HCl緩衝液(10mM Tris−CH3COOH、10mM Tris−HCl、300mMNaCl、pH 8.0である)の中で、30℃、150rpmで2.5時間反応した。反応上澄み液を収集し、在200μLの自制反応試験管に、それぞれ50μL反応上澄み液と50μL H2O2を入れ、5分間反応した後に、圧力を測定し、データを記録する。0μM実験グループとの差値を求め、図を作った。
図26は室温で、DNAハイドロゲル体系において、Ni2+、Mn2+、Ca2+、Co2+、Hg2+、Fe3+、Cu2+、Zn2+、Cd2+をネガティブコントロールとして、この体系の選択性を考察し、図は1mM のNi2+、Mn2+、Ca2+、Co2+、Hg2+、Fe3+、Cu2+、Zn2+、Cd2と400nM Pb2+への反応で、反応時間は5分間であった。DNAハイドロゲルの除去実験はTris−HCl緩衝液(10mMTris−CH3COOH、10mM Tris−HCl、300mM NaCl、pH8.0である)の中で、30℃、150rpmで2.5時間反応した。反応上澄み液を収集し、在200μLの自制反応試験管に、それぞれ50μL反応上澄み液と50μLのH2O2を入れ、5分間反応した後に、圧力を測定し、データを記録した。0μM実験グループとの差値を求め、図を作った。
図27は室温で、DNAハイドロゲル体系において、異なる濃度のオクラトキシンA(OTA)測定に使い、反応時間は5分間であった。DNAハイドロゲルの除去実験はTris−HCl緩衝液(10mM Tris−HCl、120mM NaCl、25mM KCl、20mM CaCl2、pH 8.5である)の中で、30℃、150rpmで1.5時間反応した。反応上澄み液を収集し、在200μLの自制反応試験管に、それぞれ50μL反応上澄み液と50μL H2O2を入れ、5分間反応した後に、圧力を測定し、データを記録した。0μM実験グループとの差値を求め、図を作った。
図28は室温で、DNAハイドロゲル体系において、アフラトキシンM1(AFM1)、ゼアラレノン(zearalenone、ZEN)、T−2毒素(T−2)、パツリン(patulin、PAT)、シトリニン(citrinin、CIT)、オクラトキシンB(OTB)、ステリグマトシスチン(sterigmatocystin、STC)をネガティブコントロールとして、この体系の選択性を考察し、図は1mM AFM1、ZEN、T−2、PAT、CIT、OTB、STCと25μMオクラトキシンA(OTA)への反応で、反応時間は5分間であった。DNAハイドロゲルの除去実験はTris−HCl緩衝液(10mM Tris−HCl、120mM NaCl、25mM KCl、20mM CaCl2、pH 8.5である)の中で、30℃、150rpmで1.5時間反応した。反応上澄み液を収集し、在200μLの自制反応試験管に、それぞれ50μL反応上澄み液と50μLH2O2を入れ、5分間反応した後に、圧力を測定し、データを記録した。0μM実験グループとの差値を求め、図を作った。
実施例10、DNA製造の測定
1mL 13nM Au@Pt−Au溶液を取り、14000rpm遠心処理で上澄みを除き、1mL Bufferを入れて再懸濁させた。三回繰り返して行った。100μLの体積濃度が10%のF127を入れて、均一に混合した。8μLのDNA−SHを入れて、均一に混合した。50μLの0.2M H3PO4を入れて、均一に混合した。37℃回転で1h反応した。14000rpm遠心処理で上澄みを除き、1mL Bufferを入れて再懸濁させた。三回繰り返して行った。入れたDNA−SHの濃度を制御し、異なるDNA条数出修飾されているAu@PtNPsを製造することができ、結果を図29に示す。
図29は室温で、機能化DNAセンサー体系において、ナノ粒子上の異なるDNAの修飾条数が気圧計感度への影響実験であり、アデノシン体系を例として、反応時間は1.5時間であった。150μLの Streptavidinを取って磁気ビーズを修飾し、1mL PBS−T Bufferで一回洗浄した。950μL PBS−T Bufferに再懸濁し、25μL 4μM Biotin−DNAと25μL 4μM Ade−Aptを入れ、200rpm、25℃で30分間振動した。PBS−T Bufferで三回洗浄し、毎回1mLであった。Aptで修飾した磁気ビーズを含む懸濁液600μLを取り、200μLの異なるDNA条数の25nM Pt−DNAと300μL PBS−T Buffer(反応面積を増大すると、ビーズの均一混合に有利である)を入れ、25℃で30分間混合した。PBS−T Bufferで6回洗浄し、毎回1mLであった。300μL PBS−T Bufferの中に再懸濁し、それぞれ二つの遠心管に入れ、各遠心管50μLであり、上澄みを除き、各実験組に最終濃度が100nMのアデノシンを入れ、対照組にPBS−T Bufferを入れ、最終体系は50μLであり、25℃で30分間混合した。10μLの上澄み+40μLのPBS−T Buffer+50μLのH2O2を気圧計反応管に入れ、ピペットで十回吸い打ち、均一に混合し、反応蓋をきつく締めた。1.5時間反応した後に、体系中の圧力を測定した。各サンプルには4つの平行実験があった。実験組みの圧力差で対照組の圧力差を割ってSB比を得た。
実施例11、機能化DNAサンドイッチ構造の製造
15μL のStreptavidin(ストレプトアビジン)を取って磁気ビーズを修飾し、100μLのPBS−T Bufferで一回洗浄した。98μLのPBS−T Bufferに再懸濁し、2μL 4μMのBiotin−DNAを入れ、200rpmで25℃で30分間振動した。PBS−T Bufferで3回洗浄し、毎回100μLであった。80μLのPBS−T Bufferに再懸濁し、20μL 330nM Aptamerを入れ、200rpm、25℃で30分間振動した。PBS−T Bufferで3回洗浄し、毎回100μLであった。240μL 2.5nM DNA−Ptを入れ、200rpm、25℃で30分間振動すると、機能化DNAサンドイッチ構造を形成した。
実施例12、機能化DNA可視化定量測定
作りあがった機能化DNAサンドイッチ構造を100μL PBS−T Bufferの中に再懸濁し、異なる濃度の標的溶液を入れて、シェーキングテーブルに置き、200rpm、25℃で30分間振動した。反応終わった後に、反応上澄み液を取り、反応試験管の中に入れ、Au@PtNPsをH2O2と触媒反応させた。密閉した体系の中に発生したO2は圧力に転化され、気圧計で読み取り、データを記録した。結果を図30に示した。
図30は25℃で、機能化DNAセンサー体系において、異なる濃度のアデノシン(Adenosine)測定に使い、反応時間は1.5時間であった。150μL Streptavidinを取って磁気ビーズを修飾し、1mL PBS−T Bufferで一回洗浄した。950μL PBS−T Bufferに再懸濁し、25μL 4μM Biotin−DNAと25μL 4μM Ade−Aptを入れ、200rpmで25℃で30分間振動した。PBS−T Bufferで3回洗浄し、毎回1mLであった。Aptで修飾した磁気ビーズを含む懸濁液600μLを取り、200μL 25nM Pt−DNAと300μL PBS−T Buffer(反応面積を増大すると、ビーズの均一混合に有利である)を入れ、25℃で30分間混合する。PBS−T Bufferで6回洗浄し、毎回1mLであった。300μLPBS−T Bufferrの中に再懸濁し、それぞれ六つの遠心管に入れ、各遠心管50μLであり、上澄みを捨て、a、b、c、d、e、fの中にそれぞれPBS−T Buffer 50μL、49.5μL、47.5μL、49.5μL、49μL、48.5μLをいれ、a、b、cの中にそれぞれ0.1μM Adenosine 0μL、0.5μL、2.5μLを入れ、d、e、f管にそれぞれ1μM Adenosine0.5μL、1μL、1.5μLを入れて、最終体積を50μLにならせて、25℃で30分間混合した。10μL上澄み+40μLPBS−T Buffer+50μL H2O2を気圧計反応管に入れ、ピペットで十回吸い打ち、均一に混合し、反応蓋をきつく締めた。1.5時間反応した後に、体系中の圧力を測定した。各サンプルには4つの平行実験があった。
前記実施例は本発明の好ましい実施例であり、本発明は実施例に限定されるものではなく、当業者が、本発明の技術実質に基づき、前記実施例に対するいかなる簡単な修正、類似変化及び修飾も本発明技術案の保護範囲に属する。
本発明は酵素又はナノ粒子などで、オキシドールが大量の気体を生成することを触媒し、標的分子の信号をガスの圧力信号に転換させることで、信号の増幅を実現し、最後は気圧計を通して圧力を電子信号に転換させて読み取り、高感度の定量測定を実現する。
Claims (11)
- 気圧に基づいて標的を測定する定量測定方法であって、
密閉した体系の中に、分子識別で信号増幅分子又は粒子を導入し、信号増幅分子又は粒子を通して基質からガス分子を放出させることを触媒し、密閉した体系の圧力を増強させ、反応測定体系の圧力変化を測定することで標的の濃度を測定することを特徴とする気圧に基づいて標的を測定する定量測定方法。 - 前記分子識別は、特異性識別機能を備える分子を利用し、前記標的を識別又はマークし、且つ前記識別分子で信号増幅分子又は粒子を測定体系に導入することを含むことを特徴とする請求項1に記載の気圧に基づいて標的を測定する定量測定方法。
- 分子識別技術を利用して前記標的を識別又はマークし、前記標的はタンパク質、核酸、ペプチド鎖、糖類、脂肪類、有機小分子、無機イオン、細胞、細菌又はウイルスの中の少なくとも一種を含むことを特徴とする請求項2に記載の気圧に基づいて標的を測定する定量測定方法。
- 前記信号増幅分子は基質を触媒してガスを発生させる触媒又は酵素を含み、触媒基質は触媒された後にガス分子を発生する物質であり、ガス分子は基質が触媒された後の産物であることを特徴とする請求項1に記載の気圧に基づいて標的を測定する定量測定方法。
- 前記信号増幅分子はカタラーゼ、金ナノ粒子、白金ナノ粒子、金−白金ナノ粒子、マンガン酸化物ナノ粒子又は基質を触媒してガスを発生させる他の触媒又は酵素であることを特徴とする請求項4に記載の気圧に基づいて標的を測定する定量測定方法。
- 前記密閉した体系の中に、それの反応測定体系は酵素結合免疫吸着法(ELISA)体系、DNAハイドロゲル体系、機能化DNAセンサー体系の中の少なくとも一種であることを特徴とする請求項1に記載の気圧に基づいて標的を測定する定量測定方法。
- 前記酵素結合免疫吸着法体系において、気圧に基づいて標的を測定する定量測定方法は、
測定必要性のある抗原に基づき、対応する捕捉抗体及び測定抗体を選択し、
信号増幅分子を修飾し、測定抗体とカップリング結合させ、又は測定抗体と特異的に結合させ、
多孔板又は磁気ビーズ又はミクロスフェア又は他の酵素結合免疫吸着法に使われる固相の表面を包み、捕捉抗体を入れて包まれた固相の表面と結合させた後に、密閉液で密閉させ、測定待ち抗原を入れてから測定抗体を入れてサンドイッチ構造を形成し、余計な測定抗体を洗い除き、
信号増幅分子を導入し、
多孔板に基質を入れ、反応キャビティを密閉し、信号増幅分子で基質分子を触媒して大量のガス分子を生成させ、気圧計に読み取ることのできる圧力変化信号を発生し、
気圧計で示す圧力変化値に基づき、標的分子の定量測定を実現する、
というステップを含むことを特徴とする請求項6に記載の気圧に基づいて標的を測定する定量測定方法。 - 前記DNAハイドロゲル体系において、気圧に基づいて標的を測定する定量測定方法は、
二つのアクリルアミド/DNA高重合鎖、一つの核酸アプタマー分子を信号増幅分子と混合し、信号増幅分子を包む核酸アプタマーの架橋ハイドロゲルを製造し、
異なる既知濃度の分析物を含む溶液を前記のハイドロゲルに入れて反応させ、信号増幅分子を放出し、
反応が終わった後に、反応上澄み液を取って反応試験管に置き、信号増幅分子を基質と触媒反応させ、
密閉した体系に発生する大量のガスで体系中の圧力が高くなり、気圧計で読み取り、且つデータを記録し、それによって標準曲線を作り、未知サンプル中の標的含有量を測定する、
という工程を含むことを特徴とする請求項6に記載の気圧に基づいて標的を測定する定量測定方法。 - 前記機能化DNAセンサー体系において、気圧に基づいて標的を測定する定量測定方法は、
標的分子に対して適合する核酸アプタマーを選び、核酸アプタマーに捕捉プローブと相補する序列を添加し、
核酸アプタマーの序列に基づき、適合する検出プローブの序列を設計し、標的分子は存在していない時に、検出プローブを塩基同士間の相互作用で、核酸アプタマー鎖と結合させ、標的分子は存在する時に、検出プローブより競合性があり、
脱炭酸反応又はビオチン−親和素の相互作用を含む生物又は化学的カップリング方法を利用し、捕捉プローブを磁気ビーズの表面につけ、測定DNA及び核酸アプタマーを入れて磁気ビーズの表面に機能化DNAのサンドイッチ交雑構造を形成させ、
DNAのサンドイッチ交雑構造に標的を入れ、標的は核酸アプタマーと結合して三鎖構造上の検出プローブを置換し、
磁石で磁気ビーズを集め、上澄みを取って反応試験管の中に入れ、同時に溶液相の基質を入れ、信号増幅分子が溶液相基質に作用して気圧計に読み取られる信号分子を発生させ、
気圧計に示す数字に基づき、測定結果を記録する、
という工程を含むことを特徴とする請求項6に記載の気圧に基づいて標的を測定する定量測定方法。 - 前記検出プローブに、基質を触媒して大量のガスを放出させる信号増幅分子がカップリングされていることを特徴とする請求項7に記載の気圧に基づいて標的を測定する定量測定方法。
- 核酸アプタマーと標的分子との結合を利用し、標的分子は存在している時に、信号増幅分子がカップリングされている検出プローブより競合性があり、且つ後続の信号増幅を実現することを特徴とする請求項9に記載の気圧に基づいて標的を測定する定量測定方法。
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