CN107449927B - 一种3d集成纸芯片及可视化快速定量检测靶标方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种3D集成纸芯片及可视化快速定量检测靶标方法，本发明将信号识别、探针分离、信号转导与放大以及信号输出集成3D纸芯片上，可实现对靶标的快速可视化定量检测。本发明利用靶标和信号识别分子的特异性结合，引发信号放大探针的释放。同时，利用微球和滤纸孔径大小的差异，实现被释放的信号放大探针和固定在微球表面探针的分离。再通过折叠3D纸芯片装置，实现探针的转移，进而触发酶的级联反应，最终以距离最为信号输出方式。本发明具有检测快速，操作简单、价格低廉、高度集成化以及不需要对样品进行复杂前处理等优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种将信号识别、探针分离、信号转导与放大以及信号输出集成到一个纸基微流控装置的新方法，用于对小分子、金属离子等靶标的快速可视化定量检测，属于可视化定量分析方法技术领域。
背景技术
即时检测(Point of Care Testing，POCT)是指在采样现场即时进行检测分析，短时间内获取检测结果的一类新方法，在个体医疗、环境检测以及偏远地区原位检测上有重要意义(1.Yager P,Domingo G J,Gerdes J.Point-of-care diagnostics for globalhealth[J].Annual Review of Biomedical Engineering,2008,10,107-144)。该技术方便、快捷、步骤简单、不需要复杂的样品前处理、依靠简单的设备进行数字化信号读取或者通过简单的显色反应实现可视化信号输出。POCT平台的不断开发和普及显著削减了医疗综合成本，有利于缓解医疗资源短缺的困局，使疫情早期预警、个体保健防护以及现场环境监控成为了可能。
微流控纸芯片(Microfluidic Paper-based Analytical Devices，μPADs)简称纸芯片，是新兴的微流控分析领域，由Whitesides组在2007年首次提出(2.Martinez,A.W.,Phillips,S.T.,Butte,M.J.,Whitesides,G.M.,Patterned Paper as a Platform forInexpensive,Low-Volume,Portable Bioassays,Angewandte Chemie InternationalEdition[J],2007,46,1318-1320)。不同于传统的以玻璃、高聚物、硅以及石英等为材料的微流控芯片，纸芯片是以纸作为基底，并在其表面加工出特定结构的微流体通道而形成的微型分析器件。纸芯片凭着其独特的优势(耗样量少、成本低、可批量生产、生物兼容性强、便携可抛等)成为了强大有力的POCT工具，为个体医疗评估、疾病诊断、环境检测以及食品安全分析等领域的现场实时监测提供了一个广阔的平台(3.Yamada K,Shibata H,SuzukiK,et al.Toward practical application of paper-based microfluidics for medicaldiagnostics:state-of-the-art and challenges[J].Lab on a Chip,2017,17,1206-1249)。其中，3D纸芯片的发展解决了多数2D纸芯片存在的问题(如试剂储存不方便、功能单一以及局限于单通路简单反应等)，极大地增加了纸芯片的可塑性和多功能性，进一步扩展了纸芯片的应用范围(4.Martinez A W,Phillips S T,Whitesides G M.Three-dimensional microfluidic devices fabricated in layered paper and tape[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,2008,105,19606-19611；5.LiuH,Crooks R M.Three-dimensional paper microfluidic devices assembled using theprinciples of origami[J].Journal of the American Chemical Society,2011,133,17564-17566)。
为了最大程度降低用户的操作步骤，发展用户友好型装置，研究者们陆续开发了各式各样的集成纸芯片体系，即将所有的反应步骤都集成在纸芯片装置上，用户只需根据说明进行几步简单的操作，即可得到检测的结果。然而，目前常见的集成纸芯片大部分都需要借助外界电子设备(如血糖仪、手机等)实现信号输出，即在纸芯片上完成信号识别-信号转导，最后通过这些电子设备实现信号输出和结果分析(6.Wang C C,Hennek J W,AinlaA,et al.A Paper-Based“Pop-up”Electrochemical Device for Analysis of Beta-Hydroxybutyrate[J].Analytical chemistry,2016,88,6326-6333；7.Zhang J J,Shen Z,Xiang Y,et al.Integration of Solution-Based Assays onto Lateral Flow Devicefor One-Step Quantitative Point-of-Care Diagnostics Using Personal GlucoseMeter[J].ACS Sensors,2016,1,1091-1096；8.Lopez-Ruiz N,Curto V F,Erenas M M,etal.Smartphone-based simultaneous pH and nitrite colorimetric determinationfor paper microfluidic devices[J].Analytical chemistry,2014,86,9554-9562)。这些方法虽然灵敏度高，但是引入的外界设备一定程度上增加了检测的成本，容易引入额外的误差。因此，亟需发展一种既能够准确定量，又能够真正实现无需任何辅助仪器进行信号转化的检测方法。
发明内容
本发明的技术方案如下：
一种3D集成快速可视化定量检测纸芯片，包括：
一底板，底板上设有反应区，反应区加有底物和信号放大分子；检测区，其连接反应区，所述的检测区涂有显色底物，
位于上层的上下两面悬空的样品区，所述的样品区的滤纸孔径小于修饰有DNA-底物酶的微球的直径；所述的样品区在受压后底部能够和反应区接触；
利用微球和滤纸孔径大小的差异，实现被释放的信号放大探针和固定在微球表面探针的分离；再通过折叠3D纸芯片，实现探针的转移，进而触发酶的级联反应，最终通过显色底物以距离作为信号输出方式。
其中，样品区、反应区、检测区为亲水区，其余区域为疏水区。
其中，所述的底物包括蔗糖，所述的信号放大分子包括葡萄糖氧化酶、辣根过氧化物酶；所述的显色底物包括DAB。
本发明的又一技术方案为
一种3D集成快速可视化定量检测纸芯片，其中：所述的纸芯片，在平面状态，包括底板(1)，其一侧设延伸板(2)，一支撑板(3)设于底板(1)和延伸边(2)的交界处，一样品板(4)设于支撑板(3)朝向底板(1)的一侧；
在使用状态，延伸板(2)向上弯折，形成水平部(2-1)和竖直部(2-2)；支撑板(3)同样弯折形成水平部和竖直部，样品板(4)一端和支撑板(3)的竖直部连接，其余部分悬空；
样品板(4)设有样品区(5)，底板(1)上设有反应区(6)和检测区(7)，反应区(6)设于检测区(7)的一端，且样品区(5)受压后底部能够接触反应区(6)。
其中，检测区(7)的侧面设刻度(8)。
本发明的再一技术方案为：
一种基于3D集成微流控纸芯片的可视化快速定量检测新方法，包括如下步骤：
(1)根据靶标选择相应的核酸适体，并合成可以和核酸适体的前面部分序列互补的修饰有巯基的DNA链(SH-DNA)，以及和核酸适体的后面部分序列互补的修饰有生物素的DNA链(biotin-DNA)；
(2)将SH-DNA和特定酶偶联，形成DNA-酶复合物，并将DNA-酶复合物、biotin-DNA以及相应的核酸适体混合孵育，形成三链杂交结构；
(3)将DNA杂交结构通过生物素和链霉亲和素的相互作用固定到修饰有链霉亲和素的微球表面，形成DNA-酶功能化微球；
(4)检测前，向3D纸芯片的下层圆形反应区加入特定酶和底物，在矩形通道上涂抹产生条带的底物，向上层加样区加DNA-酶功能化微球，以及含靶标的样品溶液。
(5)加完样品后，将纸芯片倒扣以使靶标和核酸适体充分识别结合，然后正置纸芯片，含有从微球表面游离的探针溶液在重力的作用下渗透至加样区的背面，然后通过折叠3D纸芯片使上下层接触，将探针转移至下层检测区，从而触发酶的级联反应，最后产生条带。
(6)根据纸芯片检测区条带的长度，建立工作曲线，从而实现对靶标的可视化定量检测。
其中，为了提高纸芯片的硬度和通道以外区域的疏水性，除了石蜡勾勒的通道外，其余部分均打上石蜡。
其中，探针上偶联可以触发级联反应的酶，下层检测区加入可以发生级联反应的酶和底物。矩形通道上均匀分布参与级联反应并能够产生信号的底物。
本发明的优点在于：本发明针对现有检测方法操作复杂、过程耗时等问题，发展一种基于3D集成微流控纸芯片的可视化快速定量检测新方法。该方法以核酸适体作为信号识别分子，引入竞争反应机制，利用靶标和核酸适体的特异性结合，引发信号放大探针的释放。同时，利用微球和滤纸孔径大小的差异，实现被释放的信号放大探针和固定在微球表面探针的分离。通过折叠3D纸芯片装置，实现探针的转移，进而触发酶的级联反应，最终以距离作为信号输出方式。通过改变相应的核酸适体序列，本方法可实现对靶标的快速、集成一体化以及可视化定量检测。
本发明方法在设计上符合ASSURED(Martinez A.，Phillips S.，Whitesides G.，et.al.，Diagnostics for the Developing World:Microfluidic Paper-BasedAnalytical Devices,Analytical Chemistry[J].2010,82.3-10.)的国际标准，同时具有检测快速、操作简单、便携可抛、成本低廉、选择性好，检测结果可靠等优点；其次，巧妙利用微球尺寸和滤纸孔径的差异，实现游离探针和固定在微球表面探针的分离；另外，充分利用3D纸芯片的可调控结构，只需要加入样品，即可在半小时内于纸芯片上实现信号识别-探针分离-信号转导与放大-信号输出这一完整的流程，实现了真正意义上的集成一体化；此外由于本方法以核酸适体作为信号识别分子，可以通过选择现有的核酸适体或者通过SELEX体外筛选得到识别其他靶标的核酸适体，将本方法用于更广泛的靶标检测。鉴于成本低，检测快，用户友好以及高度集成化，该基于距离的一步法可视化定量检测方法有望发展成为有力的即时检测新工具。
本发明方法具有操作简单、价格低廉、检测快速、高度集成化、不需要对样品进行复杂前处理等优点，并且通用性好，可用于包括生物小分子、金属离子等物质的一步法快速可视化定量检测。
附图说明
图1为DNA-酶复合物的SDS-PAGE图。
图2为纸芯片平面图(左)和3D结构示意图(右)
图3为纸芯片用于可卡因的定量检测。
其中A为可卡因检测实物图，B为可卡因检测的工作曲线
(Cocaine concentration-可卡因浓度distance-距离)
图4为可卡因选择性考察。
其中A为选择性考察的实物图，B为选择性考察结果
图5为实际样品尿液中的可卡因定量检测。
其中A为实际样品中的可卡因检测实物图B为实际样品中的可卡因检测工作曲线
(Cocaine concentration-可卡因浓度distance-距离)
图6为以腺苷作为模型的通用性考察。
其中A为腺苷检测实物图，B为腺苷检测工作曲线
(Adenosine concentration-腺苷浓度)
具体实施方式
实施例1DNA-蔗糖酶(DNA-invertase)复合物的制备
DNA-invertase复合物的制备为以下几个步骤：1)将60μL SH-DNA(1mM)、4μLNaH2PO4溶液(1M，pH＝5.5)，4μL三(2-羧乙基)膦(TCEP)溶液(30mM)混合；同时，取800μL用0.1M KH2PO4溶液溶解的蔗糖酶(20mg/mL)与1mg 4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐(sulfo-SMCC)混合，分别于室温充分反应1小时。2)反应后，先通过离心(14000rpm,10min)除去多余的sulfo-SMCC。再分别用Amicon-3K和Amicon-30K超滤活化后的SH-DNA和蔗糖酶，并用1x PBS进行洗涤，重复超滤8次。将活化并纯化后的SH-DNA和蔗糖酶混合，并在室温下反应48小时便可得到DNA-invertase复合物。3)用Amicon-30K超滤产物8次以除去未反应的DNA分子，并通过SDS-PAGE验证偶联是否成功(图1)。
实施例2DNA-invertase功能化微球的准备
对于每个样品，取10pmol的可卡因核酸适体,10pmol生物素标记的DNA(biotin-DNA)和100pmol DNA-invertase在室温充分混合反应10分钟，完成三链杂交；然后加入1μL链霉亲和素修饰的微球(SA-beads)，置于室温孵育10分钟，从而通过链霉亲和素和生物素的相互作用将DNA三链杂交结构固定到微球表面。随后将所得修饰有DNA-invertase的微球用1x PBS洗三遍，除去未成功连接到微球上的DNA。最后，将修饰好的微球溶解于5μL蔗糖酶缓冲液(0.1M NaCl和0.1M Na2HPO4(PH 7.3))备用。
表1实施例1、2中所用DNA序列
实施例3 3D集成纸芯片的制作
使用Coreldraw软件设计出芯片的平面结构，并通过Xerox Colorqube 8580石蜡打印机将芯片打印在whatman No.1滤纸上。随后，将打印好的芯片放入120℃的烘箱内加热一分钟，保证石蜡均匀渗透到滤纸背面，这样便可得到双面均有石蜡疏水通道的纸芯片。
参见图2左图，在平面状态，所述的3D纸芯片包括长方形底板1，其一侧设延伸板2，一长方形支撑板3设于底板1和延伸边2的交界处，一样品板4设于支撑板3朝向底板1的一侧。样品板4设有样品区5。
参见图2右图，在使用状态，延伸板2向上弯折，形成水平部2-1和竖直部2-2；支撑板3同样弯折形成水平部和竖直部，样品板4一端和支撑板3的竖直部连接，其余部分悬空。
样品板4设有样品区5，底板1上设有圆形区(反应区)6和长方形区(检测区)7，圆形区6设于长方形区7的一端，且样品区5受压后底部恰好接触圆形区6。长方形区7的侧面设刻度8。
所设计3D纸芯片分为上层加样区和下层反应区。其中，将芯片沿着特定部分裁剪，并进行折叠，即可得到3D结构。样品区5、圆形区6和长方形7为亲水区域，其余部分为石蜡打印的疏水区域。上层加样区5为直径5.5mm的圆形，下层反应区由直径6mm的圆形区以及2mm×40mm的长方形区组成。同时，通过折叠多层纸芯片，再用激光切割机切割形成槽型结构，并分别粘贴在纸芯片的上层和下层圆形区域上形成一定厚度的反应槽。每次使用前，向下层圆形反应区加入1μL GOx/HRP(葡萄糖氧化酶/辣根过氧化物，714U/mL)和2.5μL sucrose(蔗糖，6M)，并在检测区(长方形区)均匀涂上DAB(显色底物，10mg/mL)。
实施例4靶标可视化定量检测步骤
以可卡因作为检测模型。首先，在上层加样区里加上5μL DNA-invertase功能化微球，然后分别加入20μL不同浓度的可卡因样品。加完样品后，将纸芯片倒扣5分钟以使可卡因与核酸适体结合，从而引起DNA三链杂交结构的变化，导致DNA-invertase复合物从微球表面释放。由于溶液的表面张力，倒扣后会溶液会形成半圆形液滴附在上层加样区上，不会掉落。孵育完成后，将纸芯片翻回。此时含有被竞争下的DNA-invertase的溶液将因重力作用渗透到上层加样区的背面，而由于微球的尺寸(30-50μm)大于滤纸孔径(11μm)，微球被保留在上层加样区的正面，从而利用微球和滤纸孔径尺寸的不同实现被竞争下的DNA-invertase和固定在微球表面的DNA-invertase的分离。此时，将3D纸芯片折叠，并用20g砝码施加外机械力，使上层加样区和下层圆形反应区接触，从而使渗透到上槽底部的反应液转移至下方的圆形反应槽中，引发酶的级联反应，最终实现信号放大和输出。当溶液完成从上至下的转移后，将纸芯片于37℃放置10分钟，然后在上层加样区加入20μL蔗糖酶缓冲液，洗脱首次转移时残留的DNA-invertase。随后再于37℃孵育10分钟，最后分析条带长度。如图3所示，由于靶标的浓度决定了被竞争下的DNA-invertase含量，进而决定了最终反应形成的条带长度。因此通过分析条带长度即可实现对靶标的可视化定量检测。
实施例5体系的选择性考察
选择单倍浓度可卡因50μM作为模型，选择十倍浓度(500μM)的可卡因的水解产物芽子碱甲酯和苯甲酰芽子碱作、以及空白样品作为阴性对照。如图4所示，500μM的水解产物产生的条带与空白对照相近，几乎可以忽略，而仅50μM的可卡因就产生明显可辨的条带，证明本方法保持了核酸适体的高特异性，具有良好的选择性。
实施例6尿样检测
向尿液样品加入不同浓度的可卡因，然后稀释一倍，形成含50％尿液的实际样品。然后分别加入20μL不同浓度的可卡因实际样品，并按例4的方法检测。如图5所示，随着实际样品中可卡因浓度的增加，条带的长度也逐渐增加。因此，本方法可以实现对实际样品中可卡因的可视化定量检测。
实施例7体系的通用性考察
由于本方法以核酸适体作为信号识别分子，因此理论上通过选择不同的核酸适体，即可实现对不同靶标的可视化定量检测。选择腺苷作为通用性靶标，并制备相应的功能化琼脂糖微球，重复可卡因的检测步骤。如图6所示，随着腺苷浓度的增加，条带的长度逐渐增加。该方法证明了通过改变不同的核酸适体序列，即可实现对相应靶标的可视化定量检测。
Claims (10)
1.一种3D集成快速可视化定量检测纸芯片，包括：
一底板，底板上设有反应区，反应区加有底物和信号放大分子；检测区，其连接反应区，所述的检测区涂有显色底物，
位于上层的上下两面悬空的样品区，所述的样品区的滤纸孔径小于修饰有DNA-底物酶的微球的直径；所述的样品区在受压后底部能够和反应区接触；
利用微球和滤纸孔径大小的差异，实现被释放的信号放大探针和固定在微球表面探针的分离；再通过折叠3D纸芯片，实现探针的转移，进而触发酶的级联反应，最终通过显色底物以距离作为信号输出方式。
2.如权利要求1所述的一种3D集成快速可视化定量检测纸芯片，其特征在于：样品区、反应区、检测区为亲水区，其余区域为疏水区。
3.如权利要求1所述的一种3D集成快速可视化定量检测纸芯片，其特征在于：所述的底物包括蔗糖，所述的信号放大分子包括葡萄糖氧化酶、辣根过氧化物酶；所述的显色底物包括DAB。
4.如权利要求1所述的一种3D集成快速可视化定量检测纸芯片，其特征在于：所述的纸芯片，在平面状态，包括底板(1)，其一侧设延伸板(2)，一支撑板(3)设于底板(1)和延伸边(2)的交界处，一样品板(4)设于支撑板(3)朝向底板(1)的一侧；
在使用状态，延伸板(2)向上弯折，形成水平部(2-1)和竖直部(2-2)；支撑板(3)同样弯折形成水平部和竖直部，样品板(4)一端和支撑板(3)的竖直部连接，其余部分悬空；
样品板(4)设有样品区(5)，底板(1)上设有反应区(6)和检测区(7)，反应区(6)设于检测区(7)的一端，且样品区(5)受压后底部能够接触反应区(6)。
5.如权利要求4所述的一种3D集成快速可视化定量检测纸芯片，其特征在于：检测区(7)的侧面设刻度(8)。
6.一种基于3D集成纸芯片的可视化快速定量检测方法，采用权利要求1或2或3或4所述的纸芯片，包括以下几个步骤：
(1)根据靶标选择相应的核酸适体，并合成可以和核酸适体的前面部分序列互补的修饰有巯基的DNA链(SH-DNA)，以及和核酸适体的后面部分序列互补的修饰有生物素的DNA链(biotin-DNA)；
(2)将SH-DNA和特定酶偶联，形成DNA-酶复合物，并将DNA-酶复合物、biotin-DNA以及相应的核酸适体混合孵育，形成三链杂交结构；
(3)将DNA杂交结构通过生物素和链霉亲和素的相互作用固定到修饰有链霉亲和素的微球表面，形成DNA-酶功能化微球；
(4)检测前，向3D纸芯片的下层反应区加入特定酶和底物，在距离指示区上涂抹产生条带的底物，向上层加样区加DNA-酶功能化微球，以及含靶标的样品溶液；
(5)加完样品后，将纸芯片倒扣以使靶标和核酸适体充分识别结合，然后正置纸芯片，含有从微球表面游离的探针溶液在重力的作用下渗透至加样区的背面，然后通过折叠3D纸芯片使上下层接触，将探针转移至下层检测区，从而触发酶的级联反应，最后产生条带；
(6)根据纸芯片检测区条带的长度，建立工作曲线，从而实现对靶标的可视化定量检测。
7.如权利要求6所述的一种基于3D集成纸芯片的可视化快速定量检测方法，其特征在于：所述的识别包括，利用具有特异性识别功能的分子对所述靶标进行识别或标记，并通过将该识别分子将信号放大分子或粒子引入检测体系中。
8.如权利要求6所述的一种基于3D集成纸芯片的可视化快速定量检测方法，其特征在于：利用微球和滤纸孔径大小的差异，实现被释放的信号放大探针和固定在微球表面探针的分离，并通过折叠3D纸芯片装置，实现探针的转移；其中，微球包括任何表面可修饰并且孔径大于纸的孔径的微球。
9.如权利要求6所述的一种基于3D集成纸芯片的可视化快速定量检测方法，其特征在于：所述探针上偶联有能够催化底物产生能作为底物参与多种酶的级联反应的信号放大分子。
10.如权利要求6所述的一种基于3D集成纸芯片的可视化快速定量检测方法，其特征在于：所述的距离信号，包括任何参与反应后产生能够用长度来度量的信号。
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| Title |
|---|
| 3D origami-based multifunction-intergrated immunodevice:low-cost and multiplexed sandwich chemiluminescence immunoassay on microfludic paper-based analytical device;Lei Ge.etc;《Lab Chip》;20121231(第12期);3150-3158 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN107449927A (zh) | 2017-12-08 |
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Legal Events
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