JP2017506907A - 循環セルフリー核酸のサンプルの富化 - Google Patents

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Abstract

胎児または腫瘍に由来するＤＮＡに対する循環セルフリーＤＮＡのサンプルを富化する方法であって、長いＤＮＡ分子の増幅が区別されるようにＤＮＡを増幅する方法である。これは胎児あるいは腫瘍ＤＮＡの選択的な増幅をもたし、たとえばアレイ比較ゲノムハイブリダイゼーションを使用して解析される。

Description

本発明は、第１のソースからの核酸についての循環セルフリー核酸のサンプルの富化に関する。特には、核酸は胎児の核酸あるいは腫瘍に由来してもよい。
核酸の分析は多くの分野の中で使用される；たとえば、伝染因子、およびトランスフォームされた癌細胞の同定、および特に発達障害の原因である人の染色体の異常の出生前診断において使用される。歴史的に、そのような分析は侵襲性の技術、たとえば疑わしい腫瘍の生検、および流産の比較的高い危険をもたらす羊水穿刺のような技術によってのみ可能だった。
血漿中での循環セルフリーＤＮＡ(circulating cell-free DNA)の発見は、前述の分析のために非侵襲性の技術の可能性を開いた。循環セルフリーＤＮＡは、典型的に患者の血流中で少量見つかる。それは、ソースの混合物からのシークエンスを含み、しばしば２つのサイズから構成される。小さいサイズのフラクションは主に細胞のアポトーシスに由来し、より大きなサイズのフラクションは壊死細胞に由来すると考えられている。
循環セルフリーＤＮＡは、少なくとも２つの領域において診断薬の可能性を持っている。第１は、腫瘍細胞に由来した循環セルフリーＤＮＡは、分子的に腫瘍ＤＮＡをプロファイルするために「リキッドバイオプシー(liquid biopsy)」として使用されることができる。
第２に、循環セルフリーＤＮＡは発達障害の原因である人の染色体の異常を発見するために使用されることができる。生まれていない胎児内の染色体異常の非侵襲性の検知についての増大する興味があり、これは胎児からのＤＮＡが母親の血流の中にあるという観察によって可能になった。よく知られている例はダウン症候群に関連した染色体２１トリソミーである。多くの方法がそのような染色体異常の同定および分析に利用可能である。出生後の欠失と増幅の検知のための最も広く用いられている方法は、マイクロアレイに基づいた比較ゲノムハイブリダイゼーション（ａＣＧＨ）である。近年、いくつかの方法が、高度なシーケンシング方法を使用して、妊娠している女性からの循環セルフリーＤＮＡの分析によって胎児の染色体異常を検知するために開発されている。
アレイＣＧＨは、ゲノムの異なる部分をハイブリダイズするために設計された個々のＤＮＡが多くのスポットで配置された固体表面を含むマイクロアレイを使用する。アレイＣＧＨは２つのＤＮＡプローブで標識を付ける。１番目は染色体異常の可能性のある対象のサンプルからのＤＮＡである。２番目は正常なＤＮＡであると考えられる参照ＤＮＡである。サンプルＤＮＡは１つの蛍光染料で標識付けされる。参照ＤＮＡはスペクトルが別個の染料で標識付けされる。ＤＮＡプローブは組み合わされ、次にＤＮＡマイクロアレイとコ−ハイブリダイズ（co-hybridise）される。未結合の物質を取り除くために洗った後に、マイクロアレイはＤＮＡの個々のスポットの各々に存在する蛍光染料の量を測定するために走査される。サンプルの蛍光シグナルと参照の間の信号の比率の変化は、染色体の利得またはロスを示す。従来では、ａＣＧＨの中で使用される参照ＤＮＡは異なる個体からのＤＮＡであることができた。しかしながら、これはコピー数変化を適切に考慮に入れないので、試験サンプルの測定をゆがませ、誤りの結果に結びつく場合がある。
血漿からの循環セルフリーＤＮＡを分析する際に、問題がある。第１に、血流中の循環セルフリーＤＮＡの量は、細胞ソース内のそれよりはるかに低い。第２に、出生前診断の場合、診断が可能になる時（つまり妊娠の初期段階で）には、母親自身のＤＮＡの量と比較して胎児のＤＮＡの量は少ない。同様に、正常な非腫瘍ＤＮＡと比較して、腫瘍ＤＮＡの量は少ない。第３に、胎児に由来した循環セルフリーＤＮＡは小さいフラグメントであり、典型的にはアポトーシスの細胞からのフラグメントであり、一方、母親のＤＮＡのほとんどは大きい。妊娠している女性では、例えば、胎児のＤＮＡはおよそ１４０−１８０ｂｐの寸法範囲内にあるが、フラグメントで見つかるほとんどの母親のＤＮＡは約１ｋｂ以上である （Ellinger et al. (2008) Int. J. Cancer 122, 138-143）。循環セルフリーＤＮＡのより小さなサイズは、より大きなサイズのＤＮＡフラクションに比較して、いくつかの癌（例えば前立腺癌）ではより多くの腫瘍ＤＮＡを含むという示唆がある（Ellinger et al. (2008) Int. J. Cancer 122, 138-143）。
上に示されるように、現在の技術では、標準オリゴヌクレオチドアレイＣＧＨはいくつかの理由で循環セルフリーＤＮＡを分析するために使用することができない。アレイＣＧＨはおよそ２００ナノグラムのＤＮＡの下限を有するが、５ｍｌの血液サンプル中の循環セルフリーＤＮＡの総量は、典型的には２５ナノグラムである。増幅方法はアレイＣＧＨと共に使用することができる。しかしながら、アレイＣＧＨのための現在の増幅方法（例えばシグマによって販売されるRubicon GenomicsからのGenomePlex（登録商標）ＤＮＡ増幅）は、循環セルフリーＤＮＡの分析に使用される場合には、対象のＤＮＡ（例えば腫瘍ＤＮＡあるいは胎児のＤＮＡ）ではなく、長い背景の母親の／非腫瘍のＤＮＡの増幅に好ましい。したがって、ターゲットとされていないフラクションの増幅が、ターゲットとされたフラクションの貢献を圧倒し、テストを敏感でなくしてしまう。
GenomePlex（登録商標）増幅は二段法である。第一段階は、ＰＣＲプライマー結合部位に融合（サンプルＤＮＡに拘束すること）したランダムシークエンスを有するプライマーを使用したサンプルＤＮＡのプライマーエクステンションである。プライマーエクステンションは鎖侵襲性のポリメラーゼを使用して実行される。増幅の第２段階は、ブライマー結合部位に相補的なプライマーを使用するＰＣＲ増幅から成る。
GenomePlex（登録商標）および同様の増幅方法は、アレイＣＧＨと共に長年成功裡に使用されていた。しかしながら、これらの方法は腫瘍ＤＮＡの検出または非侵襲性の出生前診断において対象の循環セルフリーＤＮＡを成功裡に増幅しない。したがって、最先端技術の増幅方法を使用するために、可能な限り物理的にサンプルから背景の母性ＤＮＡを取り除かなければならない。これは、たとえば、ゲル電気泳動法によって長いフラクションから短いフラクションを分離し、短いＤＮＡを含んでいるバンドを削除して、次いでゲルからＤＮＡを精製し、増幅することにより行うことができるかもしれない（Li et al. (2004)）。ＥＰ １５２４ ３２１は、ＤＮＡの短いフラクションが、増幅に先立ってサンプル中のより長い核酸シークエンスから物理的に分けられる方法を開示する。ＷＯ ２００９／０９７５１１は、母の血液サンプルから得られたＤＮＡのＤＮａｓｅ−処理により背景の母性ＤＮＡを取り除き、GenomePlex（登録商標）増幅を行う方法を開示する。
核酸の混合物内の特定の核酸の量を測定するための別法は、サンプルの組成物を分析するために塩基シークエンス決定を使用する。１つの方法では、サンプルは、循環セルフリーＤＮＡのマッシブリィ パラレル ショットガン シークエンス法(massively parallel shotgun sequencing:MPSS)を使用して、増幅されシークエンスが決定される。この方法の１つの例では、循環セルフリーＤＮＡは、高スループットショットガンシーケンシング技術を使用して、妊婦の血漿から直接シークエンスが決定された。１人の患者当たり平均で５００万のシークエンス・タグが得られた。「リード」とも呼ばれる各シークエンス・タグ（短いＤＮＡシークエンス断片）は、その元の染色体に対してマップされ、１つの染色体当たりのフラグメントが列挙される。各染色体についてマップされたシークエンス・タグの数を数えることによって、染色体の過剰または過小発現を検知することができる。ダウン症候群の場合には、各血漿サンプル中のＤＮＡリードの総量内の染色体２１リードのパーセンテージが計算される。胎児のＤＮＡ含量は通常血漿中のＤＮＡの合計の４〜２０％であるので、胎児によって寄与されたどんな増大も母体の貢献によって薄められる。この方法は、胎児のものと母体のＤＮＡの間の分化を要求しない(Fan et al. (2008), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105, 16266-71 )。しかしながら、この方法は、多数のサンプルのバッチ処理を要求し、高価で、遅く、感度が低い。
循環セルフリーＤＮＡで見い出されるように、小さな分子を含むサンプルを分析するために使用された時、フラグメントの端部へのアダプターをリゲートした後にＰＣＲによってＤＮＡを増幅することは標準的技法である。先行技術における、サンプルの少量のＤＮＡを発見する次世代シーケンシング方法では、生産物の量を最大限にするために６０〜９０秒程度のアニーリング／エクステンション時間を使用することが標準的技法である。(Ehrich et al. (2011 ) Am. J. Obs. Gyn. 204, 205 e1 -e11 ; Bianchi et al. (2012) Obs. Gyn. 119, 890-901 ; Fan et al. (2010) Clin. Chem. 56, 1279-86)。
少量の核酸を含むサンプル内の特定のフラクションの量の測定に適用されることができるＤＮＡ分析の多くの他の方法がある。
ＷＯ ９８／３９４７４は、妊娠している女性の血流内の循環胎児ＤＮＡを利用する、非侵襲性の出生前診断の方法を開示する。血流から得られたサンプル中の母体のＤＮＡおよび胎児のＤＮＡを識別するために、この方法は、父親から継承される（したがって母体のＤＮＡの中に存在しない）、胎児のＤＮＡの内の特異的シークエンスの分析に依存する。
多くの先行技術方法がサンプル中のＤＮＡの中の特定の前もって決定されたシークエンスを増幅することを含んでいる（たとえばＷＯ ０３／０６２４４１、米国公開特許２０11／０３１２５０３、米国公開特許２０１３／０１７８３７１、米国公開特許２０１３／０１４３２１３およびＷＯ ２００７／１４７０６３を参照）。したがって、これらの方法は、増幅されるシークエンスについての知識を要求する。
他の例は、新しいシーケンシング方法による分析を含む（Chiu et al. (2011 ) Brit. Med. J., c7401 ）か、あるいは量的ＰＣＲを使用してメチル化された胎児のＤＮＡを母親のメチル化されていないＤＮＡを識別し、母親と胎児の間の差別的にメチル化されたＤＮＡ領域をテストすること含んでいる(Papageorgiou et al. (2010) Nat. Med. 17, 510-13)。しかしながら、これらの既存の方法のすべてにおいて実用化の際には増幅することを必要とする。血流の中で循環するセルフリーの核酸の量は少なすぎるので増幅なしで分析することができないからである。ＷＯ２０１１／０８２３８６は、さらに胎児のＤＮＡと比較して、母体のＤＮＡのメチル化レベルの差に依存する方法を開示する。メチル化感受性の酵素が、提供メチル化の胎児のＤＮＡを消化し、その後、ＰＣＲプライマー結合部位を含むリンカーがリゲートされてもよい。その後、リンカー−メディエイテッドＰＣＲ(Linker-mediated PCR)は優先的にメチル化されていないＤＮＡ（つまり消化され、リンカーを含んでいるもの）を増幅する。その後、再増幅はアレイハイブリダイゼーションに十分な生産物を供給するように要求される。
本発明は、第１のソースからの核酸についての、循環セルフリー核酸のサンプルの富化方法を提供することを目的とする。本発明の態様によれば、第１のソースから誘導された核酸についての循環セルフリー核酸サンプルの豊化方法であって、該サンプルは第１のソースからの核酸と第２のソースからの核酸を含み、循環セルフリー核酸のサンプルはより短いサイズ範囲とより大きいサイズ範囲の２つのサイズ範囲内にある核酸を含み、最初のソースからの核酸はより短いサイズ範囲である方法であって、
ａ）少なくともより短いサイズ範囲の核酸から増幅用テンプレートを形成すること；
ｂ）テンプレートを増幅することにより、より短いサイズ範囲の核酸についてサンプルを豊化し、対象シークエンスを有する核酸のヌクレオチドシークエンスに無関係の方法で増幅生産物を形成することを含む方法が提供される。
この方法は、異なるサイズの核酸断片の異なる増幅を許可する。具体的には、増幅はサンプル中のより長いフラグメントの増幅を差別する。より短いサイズ範囲の核酸がより長いサイズ範囲にある核酸より効率的に（したがって優先的に）増幅される（したがって、その増幅は差別される）ように、ステップｂ）の増幅が実行される。その結果、より小さなフラグメントはより効率的に豊化され、分析の手段が何であっても、より長いフラグメントの背景に対するそれらの範囲内の特異的シークエンスを検知し測定することをより簡単にする。
対象シークエンスは、一般に分析されている（異常の部位）状態と異なると予想されるシークエンスである。コントロール・シークエンスは、一般に対象シークエンスの量が比較される試験サンプル中のシークエンスである。
理想的には、第１のソースからの核酸の本質的にすべてが増幅されるだろう。重要なことには、増幅は非特異的に行われる。したがって、増幅は、対象シークエンスを有する核酸のシークエンスに依存しない。増幅の効率は、ＤＮＡ塩基シークエンスに依存せず、最初のテンプレートのサイズ、あるいは増幅の第一ラウンドの後に形成されたテンプレートのサイズに依存する。したがって、増幅ステップのためにサンプル内の特定核酸シークエンスの予備的知識を持っていることは本発明の方法では必要ではない。
第２のソースからのいくつかの背景核酸も、いずれかが小分子として存在する場合には増幅されていてもよいし、サンプル中の長い核酸断片は一般に効率的に増幅されないだろう。したがって、本発明方法の増幅ステップは、対象の小さな核酸についてサンプルを豊化するが、サンプル中に元々多量に存在する背景核酸を薄める。有利には、増幅に先立って長い核酸から物理的に短い核酸を分けるステップは必要ではない。多くの実施態様では、長い核酸も短い核酸も、ステップｂ）の増幅の最初のサンプルの中に存在する。いくつかの実施態様では、少なくともより長いサイズの範囲内にある核酸のうちのいくつかは、ステップｂの増幅の最初のサンプルの中に存在する。本発明の方法で、より短いサイズの範囲内にある核酸だけが増幅されるように、ステップａ）で短い核酸分子から形成されたテンプレートが選択的に増幅される。
増幅のためのテンプレートおよび／または増幅生産物は、たとえばおよそ７５０ｂｐ未満あるいはおよそ２５０ｂｐ未満のサイズを有する。特別の実施態様の中では、増幅のためのテンプレートおよび／または増幅生産物は、およそ１４０−１８０ｂｐのサイズを有する。
いくつかの実施態様では、より短いサイズの範囲内にある最長の核酸は、より長いサイズの範囲内にある最短の核酸の１／２〜１／３である。好ましい実施態様では、ステップａ）はサンプル中の核酸の端部へのアダプター分子をリゲートすることを含み、該アダプター分子は特異性のプライマー結合部位を含む。ステップｂ）はアダプター・プライマー結合部位に相補的なプライマーをアニーリングし、ポリメラーゼ連鎖反応を使用してテンプレートを増幅することを含んでもよい。
アダプターＰＣＲの使用は、短いフラグメントの増幅に好適であり、増幅はサンプル中の核酸の特異的シークエンスに依存しない。
多くの実施態様では、増幅ステップの間にアニーリング／エクステンションに使用されたエクステンション時間は、当業者が通常使用しようとするものと比較して短くされる。組み合わされたアニーリング／エクステンション時間は３０秒以下、２０秒以下、１０秒以下、または５秒以下である場合がある。第１のソースに由来した核酸のパーセンテージが低い場合（例えば４％以下）では、短くされたエクステンション時間は特に有用である。例えば、胎児のＤＮＡの中の異常の検知の場合には、胎児のフラクションは変わる場合がある。これは、たとえば妊娠期間などの、母親の体質量指数に関連づけられることができる。胎児のフラクションは２０から４％未満までと異なることある。エクステンション時間の低減によって、より短いＤＮＡ分子と比較して長いＤＮＡ分子の低減した増幅が見られる。結果として、胎児ＤＮＡを含まないものの検出限界は低下する。また（相対的に）少量の胎児ＤＮＡを含まないものを検知することができる。
コントロール・シークエンスは、好ましくは対象の核酸シークエンスと異なる染色体である。好ましい実施態様では、対象シークエンスは多形性（polymorphic)の疑いがなく、および／またはコントロール・シークエンスは多形性の疑いがない。
本発明の別の態様によれば、循環セルフリー核酸サンプル内の第１のソースから誘導された対象シークエンスを有する核酸の増加または減少があるかどうかを決定する方法が提供され、該サンプルは第１のソースからの核酸と第２のソースからの核酸を含み、循環セルフリー核酸サンプルはより短いサイズ範囲およびより大きなサイズ範囲の２つのサイズ範囲にあり、
第1のソースからの核酸はより短いサイズ範囲にあり、以下を含む方法が提供される:
ａ）少なくともより短いサイズ範囲の核酸から増幅用テンプレートを形成すること;
ｂ）テンプレートを増幅することにより、短いサイズ範囲の核酸についてサンプルを豊化し、増幅生産物を形成すること；および
ｃ）サンプルに由来したコントロール増幅生産物の量と比較することにより、対象シークエンスを有する核酸の増幅生産物の相対量を決定すること、
ここでコントロール増幅生産物はコントロール・シーケンスを有し、
コントロール・シーケンスは対象シークエンスとは異なっている。
好ましい実施態様では、ステップｃ）は増幅生成物の量を、第２のソースからの核酸に対応する１セットの参照核酸から得られた増幅生成物と比較することを含んでおり、参照核酸は対象核酸シークエンスに対応するシークエンスを有する核酸を含む；
ここで参照核酸は、対応するシークエンスを有する核酸の増加したか減少した量を含んでいない。好ましくは、コントロール・シークエンスと比較した対象のシークエンスからの増幅生成物の量の比率が得られ、これが参照核酸のセットから得られた同等の比率（equivalent ratio）と比較される。参照核酸は、一般に同じサンプルから得られず、第１のソースからの核酸を含んでいないサンプルから得られる。「対応するシークエンス（corresponding sequence）」は、対象シークエンスと同一、または同一でないオルソロガスなシークエンス（orthologous sequence）をいう。好ましい実施態様では、参照核酸中の対応するシークエンスが対象シークエンスから成るプローブにストリンジェントな状態（stringent conditions）の下で結合することができるだろう。最も好ましい実施態様では、対象シークエンスは多形性ではない。したがって、対応するシークエンスが対象シークエンスと同一であると予想されるだろう。
実施態様では、ステップｃ）は以下を含んでいる：
ｉ） 増幅生産物を、対象核酸シークエンスに本質的に相補的なテスト・プローブと少なくとも１つのコントロールプローブとハイブリダイズすること、ここでコントロールプローブはコントロールシークエンスに本質的に相補的である；
ｉｉ） 参照核酸を、テスト・プローブおよびコントロールプローブとコ−ハイブリダイズすること；
ｉｉｉ） サンプル／参考試験ハイブリダイゼーション比率およびサンプル／参照コントロール・ハイブリダイゼーション比率を得るために、テスト・プローブおよびコントロール・プローブとの、増幅生生産物とのハイブリダイゼーションの量と参照核酸のハイブリダイゼーションの量とを比較すること；および
ｉｖ） 第１のソース内の対象の核酸シークエンスを有する核酸の量が増加したか減少したかを判断するために、テスト・ハイブリダイゼーション比率をコントロール・ハイブリダイゼーション比率と比較すること。
プローブは、たとえばチップあるいは複数のビーズのような固体担上に好ましくは提供される。固体担体が複数のビーズである場合、ビーズはそれぞれ単一のプローブ・シークエンスを含んでもよい。固体担体は多孔性表面を有することができる。
実施態様では、増幅生産物の量はマイクロアレイ・ハイブリダイゼーションを含んでいない方法を使用して比較される。例えば、本発明の方法は、ディジタルＰＣＲ方法を含む次世代シーケンシング方法あるいは定量ＰＣＲ法を使用して、対象の核酸シークエンスの増幅生産物の相対量を決定することを含むことができる。
本発明の別の態様によれば、被検者の異常の可能性を予測する方法であって、上記の方法を使用して対象シークエンスを有する核酸の量が増加したか減少したかを決定することを含み、対象シークエンスを有する核酸の量の増加または減少がある場合には、被検者は異常の増加した危険を持つと予測される。
この方法のステップｃ）は、増幅生産物の量を、第２のソースからの核酸に対応する１セットの参照核酸から得られた増幅生産物と比較することを含んでいてもよく、そこでは参照核酸は対象の核酸シークエンスに対応するシークエンスを有する核酸を含む；ここで、参照核酸は、対応するシークエンスを有する増加したか減少した量の核酸を含んでいない。
参照核酸は被検者から得られてもよい。好ましくは、参照核酸は、第１のソースからの核酸を含むとは予想されない被検者からの細胞から得られる。例えば、参照核酸は、被検者の白血球あるいは被検者の頬側細胞から得られてもよい。実施態様では、参照核酸はヌクレオソームのＤＮＡから抽出された。
方法の１つの実施においては、被検者は妊娠している女性である。また、異常はコピー数欠損のある胎児である。第１のソースからの核酸は胎児の核酸である。また、第２のソースからの核酸は母体の核酸である。
対象の核酸シークエンスは、例えば染色体１３、染色体１８、染色体２１および／または、Ｘ染色体であることができる。コントロール・シークエンスは、染色体１３、染色体１８あるいは染色体２１でない常染色体からであることができる。方法は、パトー症候群、エドワーズ症候群、ダウン症候群あるいはターナー症候群の出生前診断の非侵襲性の方法であることができる。
方法の別の実施において、被検者は腫瘍を持っている疑いがあり、第１のソースは腫瘍であり、第２のソースは非腫瘍細胞である。コントロール・シークエンスは好ましくは既知の良性のコピー数変化を含まないように選択される。実施態様では、ステップｃ）の中で得られたデータは、サンプル内の特異的プローブ・セットを、同じサンプルに由来したコントロールと比較するためにウィルコクソン検定を使用して分析される。
実施態様では、染色体用の単一のｐ値はストゥファー（Stouffer）法を使用して、ｐ値を組み合わすことにより得られる。
本発明の好ましい実施態様は、核酸サンプル中の微量成分の検知および分析のためのａＣＧＨの使用を可能にする。本発明の好ましい実施態様は、添付の図面を参照し、例示のみを目的として説明される。
図1は、本発明の一般的な概観および対象シークエンスを有する核酸の量の増加あるいは減少を検知するための使用を説明するフローチャートであるる。 図2は、本発明の方法の実施態様および対象シークエンスを有する核酸の量の増加あるいは減少を検知するための使用を説明するフローチャートである。 図3は、本発明の方法の実施態様および対象シークエンスを有する核酸の量の増加あるいは減少を検知するための使用を説明するフローチャートである。 図４は、トリソミー２１を検知するためにアダプター−ＰＣＲを使用する方法で得られた結果を説明する棒グラフである。 図５は、トリソミー２１を検知するためにアダプター−ＰＣＲを使用する方法で得られた結果を説明する棒グラフである。 図６は、トリソミー２１の検知のための異なるエクステンション時間を比較する棒グラフである。 図７は、ゲル電気泳動法によって分離され、より短いフラグメントの豊化を実証するＤＮＡ断片の写真である。 図８は、アダプターＰＣＲの中でダイソミーＤＮＡおよびトリソミー２１ ＤＮＡ生産物の産出を示すゲル・イメージである。 図９は図８の結果のグラフ表示である。 図１０は、異なるエクステンション時間でのダイソミーとトリソミーのサンプル用染色体２１にアラインした合計のリードのパーセンテージを示す棒グラフである。 図１１は、異なるエクステンション時間でのダイソミーとトリソミーのサンプル用染色体２１にアラインした合計のリードのパーセンテージを示す棒グラフである。 図１２は、トリソミー／ダイソミー・サンプルの比率を異なるエクステンション時間で示す棒グラフである。 図１３は、トリソミー／ダイソミー・サンプルの比率を異なるエクステンション時間で示す棒グラフである。 図１４は、常染色体のすべてにわたる、トリソミー／ダイソミー・サンプルおよびダイソミー／ダイソミー・サンプルの平均比率を示す棒グラフである。
図1は、本発明の好ましい実施態様に従う、循環セルフリーＤＮＡのサンプルを豊化するために使用されることができる例示の方法の概観を説明するフローチャートである。第１のステップでは、循環セルフリーＤＮＡが、被検者（例えば妊娠している女性あるいは腫瘍を持っている疑いのある人）の血流から得られたサンプルから抽出される。サンプルは対象のＤＮＡ（例えば胎児または腫瘍ＤＮＡ）およびさらに背景ＤＮＡ（母体または非腫瘍ＤＮＡ）を含んでいる。ＤＮＡはサンプルから抽出される。ＤＮＡは下記に述べられた方法に従って増幅される。その後、サンプルＤＮＡは分析されることができる。これはいくつかの方法で行われてもよい。例えば、ａＣＧＨ（背景ＤＮＡに対応する参照ＤＮＡを備えた）の中のマイクロアレイへのコ−ハイブリダイズすること、次世代シーケンシング方法を使用すること、あるいは定量ＰＣＲを使用すること。サンプル中の対象シークエンスに由来した増幅生産物の量は、コントロール・シークエンスに由来した増幅生産物と比較され、異常な量の対象ＤＮＡ塩基シークエンス（期待される量より多いか少ない）があるかどうか確認することができる。
本発明の試料調製方法の実施態様のステップは、図２を特に参照して詳細に以下に説明される。図２は、さらにaCGHを使用して調製したDNAを分析するための可能な方法のステップを述べる。
ＤＮＡ抽出
方法の第１の実施態様では、ＤＮＡサンプルは妊娠している女性の血流から得られる。また、方法はトリソミー２１の出生前診断の非侵襲性の方法であることができる。別の実施態様では、サンプルは、前立腺癌の疑いのある患者の血流から得ることができ、また方法は腫瘍ＤＮＡを検知する方法であることができる。方法は、トリソミー１３またはトリソミー１８のような、コピー数の変化によって引き起こされた他の先天異常の検知、あるいは他の腫瘍の検知に等しく適用可能である。どんな場合も、ＤＮＡは、任意の侵襲性のサンプリングの必要なしで、容易な方法で被検者の血液サンプルから簡単に得ることができる。ＤＮＡは、当該技術分野において有名な標準法（例えば、Qiagen QiAmp Circulating Nucleic Acid Kit）を使用して、血液サンプルから抽出される。サンプルから抽出されたＤＮＡは少量の対象のＤＮＡ（例えば胎児のＤＮＡあるいは腫瘍ＤＮＡ）を含んでいる。それは小断片の形態で、大量の背景ＤＮＡ（例えば母体のＤＮＡあるいは非腫瘍ＤＮＡ）と存在し、それらの大多数はより長いフラグメントの形をしている。
aCGHを使用してDNAが最終的に分析される場合には、参照DNAも調製される。ゲノム変化の規格化された個体群を表わすために、近年の公知の方法の中で使用される参照サンプルはしばしば多くの個体からのＤＮＡの混合物からできている。参照サンプルは、母体のDNA、好ましくは妊娠している女性自身のDNAとよくマッチするように選ばれることができる。
ソースの混合物を含む試験サンプル内の特定のフラクションの量を測定したい場合、問題がある。例えば、妊婦からの血液サンプルの血漿中のＤＮＡの量は、約２５ナノグラムである。また、典型的に、４−２０％は胎児に由来する。したがって、妊娠している母親のそれにできるだけ、シークエンスが近似しているＤＮＡを参照として使用することは望ましい。この理由は、コピー数変化として知られている、ある染色体領域における量の変化がすべての人間において存在するからである。同様の関係は循環腫瘍ＤＮＡ分析に当てはまる。参照におけるこれらの変化の存在は、もちろん、試験サンプルの測定をゆがめ、誤りの結果に結びつくだろう。比率（以下を参照）の最も正確な測定については、サンプルＤＮＡに参照ＤＮＡのサイズおよび質を一致させることが重要である。
さらに、参照として使用されたＤＮＡのサイズ範囲が、胎児または腫瘍に由来するものとマッチすることは重要である。胎児のフラクションは、アポトーシスによって発生するように見える；それは狭いサイズ範囲を有し、約１５０ｂｐである。循環セル−フリーＤＮＡを分析するための参照ＤＮＡのいくつかの潜在的なソースがある。
トリソミー２１の出生前診断の方法用の参照ＤＮＡは、トリソミー２１を含まないことが知られている母体のＤＮＡであることができる。例えば、非トリソミー２１胎児を妊娠している異なる女性からのＤＮＡを使用することができる。胎児が１つは父親からの染色体と他方は母親からの染色体との染色体対を持っているので、すべてではないが、ＣＮＶの潜在的な貢献を、参照として母親のＤＮＡを使用することにより幾分回避することができる。好ましくは、参照ＤＮＡは対象の妊娠している女性からのＤＮＡを含み、参照ＤＮＡの中に胎児のＤＮＡが存在する機会が最小限にされるように得られる。例えば、母体の白血球から参照ＤＮＡを得ることができる。妊娠している女性からの頬側スワブから参照ＤＮＡを得ることができる。このＤＮＡは胎児のＤＮＡを含んでいるべきでないが、母親のゲノムにおける任意のコピー数変化の存在が、データ分析ステップの間に緩和されることを可能にするだろう。したがって、これは胎児のＤＮＡのより正確な分析に帰着する。
方法が腫瘍ＤＮＡを識別する方法である場合、参照ＤＮＡは腫瘍ＤＮＡを含んでいる疑いをかけられないＤＮＡであることができる。再び、これは被検者からの頬側スワブから得られたＤＮＡかもしれない。ヌクレオソームからＤＮＡを抽出することにより、胎児のＤＮＡのサイズ範囲とマッチさせることは可能であり、好ましくは母親の循環する白血球、あるいは上に述べられるような頬側細胞ソースから得られる。特に好ましい実施態様では、参照ＤＮＡの前述のソースのすべてについて、参照ＤＮＡはヌクレオソーマルＤＮＡ（例えば細胞からＥＺヌクレオソームＤＮＡ準備キット（ZymoResearch）を使用して、ＤＮＡを抽出することによる）から抽出されてもよい。それがアポトーシスのＤＮＡに由来したＤＮＡとサイズにおいて等しいので、これは小さいＤＮＡフラクションとぴったりマッチするべきである。
同様に、循環腫瘍ＤＮＡのための参照として使用するのに適切なフラグメントは、患者の正常でトランスフォームされていない細胞から得ることができ、組織ソースから採取され、超音波処理あるいは他の手段によって適切なサイズ範囲のフラグメントに分解することができる。
好ましい実施態様では、参照ＤＮＡはサンプルＤＮＡと同じ方法で抽出され、並行して処理される。
増幅
上に示されるように、ＤＮＡサンプルの中にある対象のＤＮＡの量は少なすぎるので、従来のａＣＧＨで直接使用することができない。
１つの実施態様では、ＤＮＡはアダプター−ＰＣＲ法を使用して増幅される。ここでは特異性ＰＣＲプライマー結合部位を有するアダプターはサンプル中のＤＮＡフラクションの端部にリゲートされる。この方法のステップは図２に述べられる。アダプターは、ヒトゲノムの任意の部分への低いシークエンス相同性のＰＣＲプライマー結合部位を含ことを可能とする長さおよびＧＣ含量のダブルストランドオリゴであり、Ａ−テイルダブルストランドゲノムフラグメントへのリゲーションを助するＴ−オーバーハングを含む。プライマーの好ましい特徴は、それらのアニール温度がポリメラーゼの最適温度と同じであるということだろう。その結果、アニーリングと伸長は単一ステップとして実行されることができる。好ましいアダプター−ＰＣＲ方法では、フラグメントは、当業者に知られている方法に従って、ギャップリペア、燐酸化、アデニル化および次にＴ−テイルアダプターのリゲーションにさらされる。
その後、ＰＣＲ増幅が、短いエクステンション時間で好ましくは行なわれる。驚くべきことに、出願人は、開示した方法に最適な、当業者によって期待されるより短いエクステンション時間を決定した。好ましい方法では、アニーリングとエクステンションは同じ温度で単一ステップの中で実行されるだろう。出生前診断の方法では、好ましいアニーリングおよびエクステンション時間は循環胎児ＤＮＡについて１５０ｂｐ以上のフラグメントの増幅を達成するために必要とされるものを超過するべきでない。例えば、アニーリング／エクステンション・ステップの正確な長さは、たとえば使用されている増幅プロトコルおよびポリメラーゼの性質に依存する。当業者は、このゴールを達成するためにエクステンション条件を最適化する方法を容易に決定することができる。たとえば、典型的な条件の下で、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼのためのアニーリング／エクステンション時間は従来９０秒台である。しかし本発明においては、アニーリング／エクステンション時間はおよそ３０秒以下であることができる。３０秒で、アニーリング／エクステンションの組み合わされた時間の正確なコーリングが達成された。出願人は時間を３０秒未満にすると比率が改善され、したがって検知の感度が改善される。これは約７００塩基を超えるフラグメントが増幅されないからである（下記の例３〜５を参照）。
短くされたエクステンション時間は、長いフラグメントの端部に達する前にエクステンション反応が終了することを保証する。長いフラグメントの端のプライマー結合部位はこのようにコピーされない。また、長いフラグメントのコピーは、第２の増幅サイクルのテンプレートとして利用可能ではない。したがって、この増幅方法は、サンプル中の長いフラグメントの増幅に失敗し、結果として短いフラグメントのサンプルの富化をもたらし、それは対象のＤＮＡを含んでいる。
このアプローチは、大きなＤＮＡ断片が容易に増幅され、そのため短いフラクション内に見い出される対象のＤＮＡをさらに薄め、したがって出生前の診断または腫瘍同定に使用することができない、標準シークエンスオリゴヌクレオチドＣＧＨのためのサンプルを調製するために使用される先行技術の増幅方法の問題を解決する。次世代シーケンシング方法と共に使用された時、本発明の増幅方法は、胎児のフラクション中の低量のＤＮＡの検知を可能とする（以下を参照）。本発明の増幅方法は大きなフラグメントの増幅を差別するので、異なるサイズのフラクションが増幅に先立って物理的に差別的に分離される清浄化ステップの要求を回避する。
典型的に、ａＣＧＨおよびシークエンス分析の他の方法に関する当業者は、マイクロアレイ上で分析された時よい信号を与えるのに十分な大量の生産物を与える増幅の条件の最適化を求めている。本出願の増幅の好ましい方法は、より長いフラグメントの増幅の回避により増幅生産物の総量を低減するように設計されている。これは当業者の直観に反している。本発明の増幅方法の結果として、マイクロアレイ（以下を参照）上の信号はより低くなる。しかしながら、より小さな量の非目的信号に起因して、より低い背景ノイズレベル、および目的信号の改善された測定を提供する。上記の方法によって調製されたDNAは、以下のようにaCGHを使用して分析されることができる。
標識付け
増幅中または増幅後に、サンプルＤＮＡは蛍光染料分子で標識付けされることができ、その後励起により特定波長の蛍光を放射する。参照ＤＮＡも標識付けされるが、異なる染料で標識付けされ異なる波長を放射する。染料は例えばＣｙ３（緑）／Ｃｙ５（赤）であることができる。当業者は、他の適切な染料を使用することができることを認識するだろう。標準のアレイＣＧＨ標識付けは、標識が付けられたｄＮＴＰを組込むエキソヌクレアーゼを含まないクレノーＤＮＡポリメラーゼ(Klenow DNA polymerase)のような、鎖侵襲性のポリメラーゼを使用する、プライマーエクステンションから成る。それはより短いフラグメントより、より長いフラグメントに好適であるが、これはうまくいく。例えばKreatechによって商業化されたＵＬＳ標識付方法のような、サイズ・バイアスのより少ない化学リゲーションアプローチのような異なる標識付けアプローチを使用することができるかもしれない。
増幅中に標識を付けることができ、たとえばアダプターＰＣＲ工程中にＰＣＲプライマーを蛍光性に標識付けすることができる。あるいは、蛍光性に標識が付けられたｄＮＴＰを加えることにより、ＰＣＲの間に蛍光性のｄＮＴＰを組込むことができる。アミノ−アリル−ｄＮＴＰあるいはビオチン−ｄＮＴＰを加えることのような非直接的な標識付けと、引き続く蛍光性に標識が付けられたＮＨＳエステルまたは蛍光性に標識が付けられたストレプトアビジンによる標識付けを、それぞれ代替えとして使用することができる。
当業者に利用可能な他の多くの適切な標識付方法がある。
マイクロアレイへのコ−ハイブリダイゼーション(Co-hybridisation)
標識が付けられた増幅されたサンプルと参照ＤＮＡを、対象シークエンス（正常なソースと比較して増加したか減少した量で存在することが疑われるシークエンス）のプローブを含むマイクロアレイにコ−ハイブリダイゼーションし、プローブ（増加したか減少した量で存在するとは予想されない核酸シークエンスに相補的である）をコントロールすることができる。
核酸アレイは複数のハイブリダイゼーションプローブであり、目標ヌクレオチドシークエンスがハイブリダイズされる固体表面上で不動化された。これは、単一反応コンパートメント内で同時に複数のプローブとサンプルが接触されることを可能にする。核酸アレイの調製および使用は当該技術において標準のものである。
アレイＣＧＨは、ゲノムについて非常に低解像度レベルでコピー数変化を分析する高生産性方法である。コピー数における変化は位置特異的プローブ(locus-specific probes)を含むａＣＧＨマイクロアレイで試験ＤＮＡおよび参照サンプルＤＮＡをハイブリダイズすることによって測定される。例えば、胎児の染色体２１のトリソミーを発見するのにふさわしいマイクロアレイは、染色体２１上で見つかったシークエンスに特異的な少なくとも１つのプローブ（好ましくは少なくとも１０、少なくとも１００、または少なくとも１０００プローブ）、および正常な２つのコピーで胎児の中にあると予想されるシークエンスに特異的なさらに少なくとも１つのコントロールプローブ（好ましくは少なくとも１０、少なくとも１００、または少なくとも１０００プローブ）を含んでいるだろう。プローブは、一般に１４塩基から３５０ｋｂ（例えば１４塩基から５００塩基、５００塩基から１５０ｋｂ、あるいは１５０ｋｂから３５０ｋｂ）までの範囲にあるだろう。
プローブ用の好ましい長さは６０塩基であるかもしれない。
市販のマイクロアレイ（Oxford Gene TechnologyによるCytoSure ISCA v2(4x180k)アレイのような）は、先天異常（たとえば胎児のＤＮＡの中のトリソミー２１）の検知に、本発明の方法のために使用することができる。このマイクロアレイは、染色体２１に特異的なプローブ、またさらに胎児のＤＮＡの中の２つのコピー以外での存在を疑われないシークエンスに特異的なプローブを含む。CytoSure ISCA v2(4x180k)アレイは、単一のスライド上の４つの約１５４ｋプローブアレイを備えたスライドの形をしている。これらは、４つの別個の実験として個々にハイブリダイズすることができる。プローブの標的部位のうちのほとんどはゲノムに均一に存在し（平均のプローブの標的部位は２５ｋｂ離れている）、より高い密度で細胞遺伝学者に興味のある約２００のゲノム領域の小さい数の目標部位を有している。染色体２１上のプローブ標的部位の数は１９４５である；染色体１８においては３６２８である。また、染色体１３においては４９２２である。残りの常染色体については、１２５０２６のプローブ標的部位がある。
腫瘍ＤＮＡの分析については、対象の核酸シークエンスへのプローブは癌に関連した染色体異常に由来するだろう。コントロール・プローブは癌に関連しない染色体領域に由来するだろう。CytoSure ISCA v2(4x180k)アレイのようなゲノムアレイの全体を使用することができるかもしれない。しかしながら、特定の癌に対するより大きな解像度で分析されることが重要なゲノムの部位がある場合、当業者はこれらの対象領域でプローブ密度を増加させたアレイを設計することができる。
マイクロアレイ上のプローブは、異なる最適化パラメーターで設計することができる。比較がプローブの緑および赤のチャンネルの間だけでなく、１つの染色体上のプローブについての蛍光比率を、異なる染色体上の同様に作動するプローブと比較する必要がある（以下を参照）。「同様に作動するプローブ」を構成するものがなんであるのかが議論のポイントである。性能に影響を及ぼす要因の中には、融解温度（おおむねＧＣ含量に関連する）、染料バイアス（信号強度とともに変化してもよい）他がある。目標が理想的に等しい測定でゲノム領域を測定することであるので、設計はたとえば一塩基変異多型、コピー数変化、繰り返し領域、既知のブレークポイントおよび転座部位、高度の可変領域およびスプライス部位などの既知の領域を回避するために実行することができる。他方では、高度に保存された部位は、プローブ選択には有益である。
市販のアレイは本発明の方法により調製されたＤＮＡを解析するために適しているが、マイクロアレイ分析の騒音レベルを下げるさらなる改良をなすことができる。例えば、先天異常または癌を引き起こす形質転換をもたらす、ゲノムの領域をターゲットとするプローブの数は、それに適用可能なように増加されることができる。先天異常の場合には、ｃｈｒ ２１（ダウン症候群）、ｃｈｒ １３（パトー症候群）および／またはｃｈｒ １８（エドワーズ症候群）のプローブの数が多いことが好ましい。他の例では、４ｐ（ウォルフヒルシュボン（Wolf-Hirschhorn）症候群）、２２ｑ１１．２（ディ・ジョージ（diGeorge）症候群）および５ｐ（ネコナキ（Cri du Chat）症候群）では染色体中の高められたプローブカバレッジが好ましいかもしれない。多くのそのような症候群が知られている。プローブの数を多くすることによって、分析の統計的検出力は増加される。また、従って、母体のＤＮＡと共に血漿ＤＮＡの中にある胎児のＤＮＡの中のこれらの症候群の検知に対する信頼性は高められる。本出願人は、過剰の他のＤＮＡの内にあるターゲットＤＮＡの与えられたレベルを検知するために、アレイ上に好ましく含まれるプローブの数を求めるために、プローブの数、データ中のノイズレベルおよびテストの感度の数値的関係を分析した。使用される具体的な実験・分析手法のために、信頼できる結果を得るために必要なプローブの数は調査することができる。１つの特別の例において、およそ２８００のプローブはトリソミー２１の信頼できるコーリングのために十分だった。一方、同じプローブ（５分の１に低減）のランダムサンプルは偽陰性の結果に帰着する不十分な精度を示した。ノンパラメトリック検定法(Wilcoxon)が使用された場合には、一般化されたモデルは生産することができない。しかし、当業者は、与えられた用途にふさわしいプローブセットを設計するために本出願の開示を利用することができる。
極端な塩基組成（例えば、高いＧＣ含量、またはシークエンス繰り返し）、および貧弱なハイブリダイゼーション信号を備えたプローブの除去は、母体または非腫瘍ＤＮＡの背景の胎児または腫瘍ＤＮＡの検知に対する高められた信頼性に帰着する。これは、最適なプローブを選ぶことが分析（しばしばＤＬＲＳメトリックによってａＣＧＨの中で測定された）中のノイズを減らし、比率測定の正確さおよび精度を改善するからである（以下を参照）。さらなる改良は、コントロールＤＮＡ領域のプローブのＧＣ含量と目標ＤＮＡ領域でのプローブのＧＣ含量を合わせることにより達成され、これは比率の正確さおよび精度における増加に帰着する。
マイクロアレイのデザインは、既知の一塩基変異多型の領域およびコピー数変化を選択するのではなく、回避することにより、従来のａＣＧＨデザインと比較して改善されることができる。言いかえれば、アレイ上で好ましくは使用されるプローブは、すべての個体において同じ事が期待されるシークエンス（テスト・プローブおよびコントロール・プローブの両方）およびコピー数数（コントロール・プローブについて）むシークエンスを含んでいる。したがって、正確にマイクロアレイ上のプローブと一致するシークエンスだけが検知されるように、厳格なハイブリダイゼーション条件をこれによって使用することができる。一塩基変異多型およびコピー数変化のこの回避は、予想されるように単一性により近い信号の比率に結びつく（以下を参照）。従来のａＣＧＨでは、対照的に、サンプル内の染色体のインバランスを発見するために、信号の比率が単一性とは異なるゲノムの領域の検知がゴールである。ａＣＧＨの中の一塩基変異多型を回避する原理は、サンプル中のゲノムの異常の検知の目的で直観に反している。先行技術方法（ＷＯ ９８／３９４７４に開示したような）は、サンプル中の母体と胎児のＤＮＡを識別するために、胎児によって母方および父方から相続したシークエンスの違いを利用する。サンプルを調製する本発明のアプローチは、そのようなゲノム領域を回避し、胎児の中のより大規模な染色体のインバランスの検知のための新規で、改善された、非自明のプローブ選択を示す。
標識が付けられたサンプルＤＮＡおよび参照ＤＮＡは、対象のＤＮＡのためのプローブと複数のコントロールプローブを含むＣＧＨマイクロアレイにコ−ハイブリダイゼーションされる。その後、マイクロアレイは洗われる。
洗浄の厳格性はテストプローブとコントロールプローブとの間で許容されるべきミスマッチのレベル、およびサンプル内で期待されるシークエンスにより決定される。上に示されるように、理想的には、プローブはどんなミスマッチもないように設計されている。それには厳格なハイブリダイゼーションおよび洗浄条件が使用されるべきである。洗浄の後、マイクロアレイは市販の装置、たとえばAgilentマイクロアレイ・スキャナで走査される。その後、個々のスポット上の蛍光の量は特別なソフトウェア（例えばAgilentの特徴抽出ソフトウェア）を使用して計算される。
アレイ上の特徴の走査および計量の後、分析されるゲノムＤＮＡ領域（例えばダウン症候群中の染色体２１）についてサンプルＤＮＡと参照ＤＮＡの間の比率が測定され、コントロール領域（例えば染色体１４）で測定された比率と比較される。
比率のどんな差も、コピー数変化を含んでいるテストＤＮＡの中の領域を示す。
従来のａＣＧＨでは、コピー数の超過あるいは欠乏のいずれかを発見するために、各プローブ上の蛍光測定値は参照ＤＮＡのそれと比較される。
サンプルの蛍光の比率：
テスト・プローブ用の参照ＤＮＡの蛍光測定比率がこのようにして得られる。追加のステップが好ましくは行なわれ、試験サンプル：参照比率は、正常であると予想される染色体領域（つまりコントロール・プローブ）と同等の比率と比較され、テスト：コントロール比率が得られる。正常なサンプルについては、この比率の比率は単一性のものに近似しているべきである；単一性からのどんな有意の差も欠乏または超過を示す。
他の固体表面を使用することができる。固体表面は、ビーズの形であることができる。固体表面はその表面積を増加させるために多孔性であることができる。
データ分析
上に記述されるように、異なる色でテストサンプルと参照サンプルに標識を付けてこれらの信号の強度を測定することによって、参照サンプルと比較して、試験サンプルのＤＮＡの中の倍数性レベルを定量することができる。この定量化ステップはコピー数変化が０のまわりで対称となるように、マイクロアレイの各プローブについて参照とサンプルのｌｏｇ２比率を得ることを含む。理想的状態では、正常（コピー中立）のｌｏｇ２比率は、ｌｏｇ２（２／２）＝０である。単一のコピー・ロスでは、ｌｏｇ２（１／２）＝−１である、また、単一のコピーゲインでは、ｌｏｇ２（３／２）＝０．５８である。実際の用途では、測定誤差を計算した後でさえ、ｌｏｇ２比率は理論数値と相当に異なることがある。
ほとんどプラットフォームに依存するａＣＧＨデータの適切な規格化に続いて（例えばNeuvial et al. (2006) BMC Bioinformatics 7, 264 for spatial normalisationを参照）、行なわれた第一ステップは、システムの複雑な技術的なノイズを減らすためにデータを滑らかにすることである。異なる平滑法、たとえば四分位平滑法(quantile smoothing)およびウエーブレット（wavelets)を使用する異なる方法が提案されている (Eilers & de Menezes (2005) Bioinformatics 21, 1146-53; Hsu et al. (2005) Biostatistics 6, 211 -26)。分析の最も重要な部分は、異常なコピー数を示す領域（ゲノムのセグメント）を確実に検知する能力に依存する。主な目標は、ノイジーなシステムでの参照と比較して、サンプルの離散レベルによるコピー数変化を示す領域の境界を識別することである。ブレークポイント検出方法のセグメント化は、染色体のセクションのコピー数状態を検知し、異なるコピー数状態のセクション間の転移の位置を見つける。最も広く使用されたセグメント化方法は、循環的な二成分のセグメンテーションアルゴリズム（Olshen et al. (2004) Biostatistics 5, 557-72）である。一旦、セグメント化の結果が決定されたならば、各セグメントのコピー数の値または見込み、およびセグメントの重要なランが割り当てられる。
多くのアプローチがこの問題に取り組むために考案された。例えば、Hupe et al. (2004) (Bioinformatics 20, 3413-22) (2004)は、アダクティブウェイトスムージング方法(Adaptive Weights Smoothing procedure)に基づいた定数機能(piecewise constant function)をモデル化する、ガウスに基づいたアプローチ(Gaussian-based approach)を遂行する。コピー数が隠された状態にあるHidden Markovモデルを、ゲノムへの接近を考慮に入れて拡張される。Fridlyand et al. (2004) (Journal of Multivariate Analysis 90, 132-53)およびMarioni et al. (2006) (Bioinformatics 22, 1144-46)を参照。
上記のデータ解析方法は公知である。我々が本発明の中で取り組む問題は完全に異なるものである。最先端技術のデータ分析への変更は必要であり、それはここで詳述される。
ここに、染色体全体の多くの部分（恐らく全染色体でさえ）は、正常な参照サンプルに期待された値の若干上の緑−赤比率を持っていてもよい。しかし、この値は演繹的に知られておらず、本質的に過剰の対象ＤＮＡの濃度と関係のある連続的な変数である。ｌｏｇ２比率の変化はｌｏｇ２（１．０５）＝０．０７のオーダーである場合がある。それはａＣＧＨで典型的に考慮される値より（先の議論と比較して）相当に小さい。従って、多くのプローブからの結果を組み合わすことは、特定されていない実験に由来する信号中のノイズに結びつく実験の不確実性を克服するためにに有益である。値の分布に基づいた比率の真値の評価は、平均値、メジアン値、調整平均値およびＭ−エスティマー(M-estimators)のようなものと組み合わせてもよい。さらに、統計的手法は特別の個体群（たとえば母体の血液からの胎児のサンプルの染色体の異数性の検知の場合には、胎児がいるかどうか、前記異数性によって影響を受けないか）にサンプルが属するかどうかを判断するために使用されてもよい。これらの統計的手法は２つのクラスの方法を含むが、これらに制限されない。
統計分類および仮説検証
統計分類では、１つ以上のカテゴリーへのメンバーシップの問題は、多くの既知のサンプル（「トレーニング・セット」）の測定された特性を評価し、未知のサンプルのための分類関数を導き出すことにより解決される。回帰分析、クラスター分析、サポートベクターマシーンなどの当業者に公知の多くの方法があり、それら自身は指導されるかまたは指導されない学習方法を代表する。他方では、仮説検証は、仮定（帰無仮説）に対する利用可能なデータを評価し、データが、ランダム変化が観察と帰無仮説の期待値との間の差について説明することができないという仮説とデータが十分に異なるか否かの結論を求める。モデルに基づいた仮説検証方法（ステューデントｔ検定あるいはＺ検定）および非母数試験方法（ウィルコクソン（Wilcoxon）ランク・テスト、マン・ホイットニーＵ検定他）がある。そのようなフリークエンティスト仮説テスト(frequentist hypothesis tests)に加えて、ベイズ推定が使用されてもよい。解決されるべき特定の問題によって、当業者は、上の１つの方法を選択してもよい。
実施では、ウィルコクソン検定を使用する非母数試験が、データ分析に使用された。ウィルコクソン検定はマイクロアレイ実験に使用された分析パッケージの一部であるが、その使用は以下の例に述べられているものとは異なることを指摘することは重要である。より具体的には、ウィルコクソン検定を含む方法を使用する統計テストは、先行技術の中では、１つのサンプルがコントロールとして働く複数のサンプル間の、特定のプローブまたはプローブの組の有意の差を決定する。一方本発明の方法では有意差試験が、同じサンプルに属するコントロールに対するサンプル内の特異的プローブ・セットのテストに適用される。
本明細書に記載されたサンプル調製方法は、ａＣＧＨの代わりにシーケンシング方法を使用して分析される核酸を調製するために使用することができる。例示の方法のアウトラインは図３のフローチャートで説明される。シーケンシング方法を使用する場合、ＤＮＡフラグメントにリゲートされたアダプター・シークエンスは、次世代シーケンシング技術によってフラグメントがシークエンスされることが可能または部分的に可能となる。優先的に短いＤＮＡ断片を増幅する短くされたエクステンション時間と共に、上に記述されるように、増幅ステップが行なわれる。この増幅ステップはさらにシーケンシングステップに必要とされてもよい追加のＤＮＡシークエンスを加えるために使用されてもよい。増幅は、シークエンサーのフロー・セル上で直接起こることができる。あるいは、フロー・セル上でない場合には、ＤＮＡは次世代シークエンサー上へロードされてもよい。シーケンシングに続いて、対象フラグメントの数が、コントロールＤＮＡからのＤＮＡ分子の数と比較される。
他の分析方法は、サンプル中のＤＮＡの量を決定するために使用されるｑＰＣＲを含む。背景ＤＮＡ（母体／非腫瘍）と比較して、テストされている領域が対象ＤＮＡ（胎児／腫瘍）ＤＮＡの中でよりメチル化され、その後増幅の中で短くされたエクステンション時間を使用する場合、長いフラクション（より母体の／非腫瘍ＤＮＡ）と比較された、短いフラクション（より胎児の／腫瘍ＤＮＡ）の増幅の差があるべきであり、そのため、より低い胎児の／腫瘍フラクションでトリソミー／腫瘍の検出限界を増加させる可能性に帰着する。
上記のサンプル調製方法は、たとえば妊婦の循環セルフリーＤＮＡの中の胎児のフラクションに見つかるような、ターゲットとされたシークエンスがより大きなターゲットとされていないフラグメントの背景内の小断片の分析を可能にする。本発明の方法では、ＤＮＡを切る１ステップは不必要である。本発明の方法はアダプターＰＣＲのための短くされたアニーリング／エクステンション時間を有し、その結果、より長いフラグメントはより短いフラグメントより少ない量で増幅される。これらの増幅方法がうまくいくことは予期しえないものであった。小さな分子数のサンプルのシークエンス分析の当業者は、切断と長いＰＣＲサイクルがサンプルから分子のより高い収率およびより一定のカバレッジを与えることを期待するだろう。
実施例
例１ − GenomePlex（登録商標）およびアダプターＰＣＲ増幅の比較
方法
増幅の差を説明するために、モデルシステムがセット・アップされた。切断されていない材料（長い）あるいは切断された材料（メーカーの指示に従ってCovarisソニケーターを使用して約１８０塩基対に切り、Qiagen ＰＣＲ浄化カラムを使用して清浄にした）から成る、正常なゲノムＤＮＡ（Promega）が準備された。細胞ライン（Coriell）からのトリソミー２１ ＤＮＡ（Ｔ２１）はCovarisソニケーターを使用して切断された。
実験は以下のようにセット・アップされた：
サンプルＤＮＡ：
・ １ナノグラムの切断されたＴ２１ ＋ ２５ナノグラムの切断されていないPromega ＤＮＡ
・ １ナノグラムの切断されたＴ２１ ＋ ２５ナノグラムの切断されたPromega ＤＮＡ
・ ２５ナノグラムのPromega ＤＮＡ（ネガティブコントロール）
参照ＤＮＡは切断されたPromega ＤＮＡを使用して準備された。サンプルおよび参照ＤＮＡはサプライヤーの指示に従ってGenomePlex増幅キット（シグマ）を使用して増幅された。ライブラリー調製溶液の２μｌが加えられ、次いでライブラリー安定化溶液の１μｌが続けて加えられた。ＤＮＡは攪拌され、２分間９５℃のサーマルサイクラーに置かれた。氷の上でのインキュベーションの後、ライブラリー調製酵素の１μｌが加えられた。また、ＤＮＡは次の条件の下でインキュベートされた：２０分間１５℃、２０分間２４℃、２０分間３７℃、５分間７５℃。４℃でのインキュベーションの後、ＤＮＡ調製物の１５μｌが次のステップに使用された。ＤＮＡの１５μｌに、１０ｘの増幅のマスターミックスの７．５μｌ、水の４７．５μｌおよびＷＧＡポリメラーゼの５μｌが加えられた。ＤＮＡは３分間９５℃でインキュベートされ、次に、１５秒９４℃および５分間６５℃を１４サイクルさせた。
その後、ＤＮＡはメーカーの指示を使用して、Qiagen ＰＣＲ浄化カラムを使用して清掃化された。
その後、ＤＮＡの量はメーカーの指示に従って、NanoDropＵＶ分光測光器を使用して定量された。その後、CytoSure標識付キット（Oxford Gene Technology）で１マイクログラムのサンプルＤＮＡはＣｙ３を使用して、１マイクログラムの参照ＤＮＡはＣｙ５を使用して標識付けされた。ＤＮＡ調製物は水を使用して１８μｌまで増やされ、Random Primerの１０μｌおよびReaction Bufferの１０μｌを加え、３８μｌの全容積とした。ＤＮＡは３分間９５℃で変性された。氷の上の５分のインキュベーションに続き、以下の試薬が加えられ、２時間ＤＮＡがインキュベートされた：１０μｌのｄＣＴＰ Labelling Mix、１μｌのＣｙ−ｄＣＴＰ 、および１μｌのエクソフリーなクレノー・ポリメラーゼ（Klenow polymerase）。１０分６５℃のステップの後、サプライヤーの指示に従ってCytoSure浄化カラム(Oxford Gene Technology)を使用して、ＤＮＡは清浄化された。ＤＮＡは、４ｘ１８０ｋ CytoSure ISCAマイクロアレイ(Oxford Gene Technology)とのハイブリダイゼーションのために、スピードバック(speedvac)により乾燥され、４０μｌの水中で再懸濁され、コット１（Ｃｏｔｌ）(Kreatech)の５μｌ、１１μｌのブロッキング薬(Agilent)および５５μｌ ２ｘハイブリダイゼーション・バッファー(Agilent)を加えた。その後、ＤＮＡはサプライヤーの指示に従って、２０ｒｐｍで回転するＳｕｒｅｈｙｂオーブン(Agilent)の中で２４時間６５℃でSurehybチャンバー(Agilent)のアレイ内でハイブリダイズされた。ハイブリダイゼーションに続き、マイクロアレイ・サンドイッチがＣＧＨバッファー１(Agilent)下で取り外され、室温で５分間洗われた。その後、アレイはＣＧＨ２ Ｗａｓｈ２(Agilent)で３７℃で１分間洗われた。ついで、２μｍ解像度、１６ビット、１００％ｐｍｔでAgilentマイクロアレイ・スキャナで走査された。その後、ＴＩＦファイルはAgilentの特徴抽出ソフトウェアを使用して、特徴が抽出された。また、データはマイクロソフトエクセルを使用して分析された。アレイの各スポットのＣｙ３とＣｙ５の信号は検査され、３５０以下の強度の信号は削除された。Ｃｙ３／Ｃｙ５比率が計算された。比率の比率は以下のように計算した。比率の比率＝（ｃｈｒ２１の上のプローブの平均Ｃｖ３／Ｃｖ５比率）／（ｃｈｒ１〜２０の上のプローブの平均Ｃｙ３／Ｃｙ５比率）
対照的に、実験は、GenomePlex（登録商標）ランダムプライマー−ＰＣＲ方法の代替増幅方法を使用して実行された。
増幅の差を示すために、モデルシステムがセット・アップされた。切断されていない材料（長い）あるいは切断された材料（メーカーの指示に従ってCovarisソニケーターを使用して、約１８０ ｂｐに切断され、Qiagen ＰＣＲ浄化カラムを使用して清浄化した）から成る、正常なゲノムＤＮＡ（Promega）が準備された。細胞ライン（Coriell）からのトリソミー２１ ＤＮＡ（Ｔ２１）はCovarisソニケーターを使用して切断された。実験は以下のようにセット・アップされた：
サンプルＤＮＡ：
・ １ナノグラムの切断されたＴ２１ ＋ ２５ナノグラムの切断されていないPromega ＤＮＡ
・ １ナノグラムの切断されたＴ２１ ＋ ２５ナノグラムの切断されたPromega ＤＮＡ
・ ２５ナノグラムの切断されたPromega ＤＮＡ（ネガティブコントロール）
参照ＤＮＡは切断されたPromega ＤＮＡを使用して準備された。サンプルおよび参照ＤＮＡはアダプター−ＰＣＲ条件を使用して増幅された。ＤＮＡの量はメーカーの指示に従って、NanoDroＵＶ分光測光器を使用して定量された。ＤＮＡサンプルおよび参照サンプルはＯＧＴ次世代シークエンシングセイブラリー調製を使用して増殖された。サンプル(混合サイズのヒトDNA、5%の切断されたT21 DNAとPromega、Coriell細胞容器（Coriell Cell Repositories）)および参照DNA(切断されたヒトDNA、Promega)は、市販のDNAポリヌクレオチドキナーゼおよびDNAポリメラーゼを使用して、従来のプロトコルに従って端部変性されA−テイルされた。DNAアダプター(例えばAgilent SureSelect XT試薬キット)が、各アダプターハイブリッドおよび1200U T4のRapid DNA Ligase（Enzymatics)の1.9 pmolを直ちに加えて15分間20℃でインキュベートすることにより、端部を変性され、A−テイルされたDNAにリゲートされた。生産物はPCR Qiaquickカラムを使用して清浄化されて、30μｌのQiagen溶離バッファー中に溶出した。その後、リゲートされたDNAの半分は1x Accuzyme反応緩衝液(Bioline)、100 pmolのアダプター・シークエンスをターゲットにしたそれぞれのPCRプライマー(例えばAgilent SureSelect XT試薬キット)、50nmolのｄＮＴＰｓl(Bioline)および5U のAccuzyme DNAポリメラーゼ(Bioline)の中で使用された。サイクリング条件は以下の通りだった:３０分の９８℃、引き続く９８℃３０秒の変性、引き続く３０秒６５℃のアニーリングおよび１分７２℃のエクステンションの15サイクル。PCR反応はQiaQuickカラム(Qiagen)を使用して、清掃され、30μｌの中でQiagen溶離バッファーに溶出した。その後、DNAの量はメーカーの指示にしたがってNanoDrop UV分光測光器を使用して定量された。CytoSure標識付キット（Oxford Gene Technology）で１マイクログラムのサンプルＤＮＡはＣｙ３を使用して、１μｇの参照ＤＮＡはＣｙ５を使用して標識付けされた。ＤＮＡ調製物は水を使用して１８μｌまで増やされ、Random Primerの１０μｌおよびReaction Bufferの１０μｌを加え、３８μｌの全容積とした。ＤＮＡは３分間９５℃で変性された。氷の上の５分のインキュベーションに続き、以下の試薬が加えられ、２時間ＤＮＡがインキュベートされた：１０μｌのｄＣＴＰ Labelling Mix、１μｌのＣｙ−ｄＣＴＰ、 、および１μｌのエクソフリーなクレノー・ポリメラーゼ（Klenow polymerase）。１０分６５℃のステップの後、サプライヤーの指示に従ってCytoSure浄化カラム(Oxford Gene Technology)を使用して、ＤＮＡは清浄化された。ＤＮＡは、４ｘ１８０ｋ CytoSure ＩＳＣＡマイクロアレイ(Oxford Gene Technology)とのハイブリダイゼーションのために、スピードバック(speedvac)により乾燥され、４０μｌの水中で再懸濁され、コット１（Ｃｏｔｌ）(Kreatech)の５μｌ、１１μｌブロッキング薬(Agilent)および５５μｌ ２ｘハイブリダイゼーション・バッファー(Agilent)を加えた。その後、ＤＮＡはサプライヤーの指示に従って、２０ｒｐｍで回転するＳｕｒｅｈｙｂオーブン(Agilent)の中で２４時間６５℃でＳｕｒｅｈｙｂチャンバー(Agilent)のアレイ内でハイブリダイズされた。ハイブリダイゼーションに続き、マイクロアレイ・サンドイッチがＣＧＨバッファー１(Agilent)下で取り外され、室温で５分間洗われた。その後、アレイはＣＧＨ２ バッファー１(Agilent)で３７℃で１分間洗われた。ついで、２μｍ解像度、１６ビット、１００％ｐｍｔでAgilentマイクロアレイ・スキャナで走査された。その後、ＴＩＦファイルはAgilentの特徴抽出ソフトウェアを使用して、特徴が抽出された。また、データはマイクロソフトエクセルを使用して分析された。アレイの各スポットのＣｙ３とＣｙ５の信号は検査され、３５０以下の強度の信号は削除された。Ｃｙ３／Ｃｙ５比率が計算された。比率の比率は以下のように計算した。比率の比率＝（ｃｈｒ２１の上のプローブの平均Ｃｖ３／Ｃｖ５比率）／（ｃｈｒ １〜２０の上のプローブの平均Ｃｙ３／Ｃｙ５比率）
GenomePlex増幅およびアダプター−ＰＣＲを比較した結果は、以下の表１に示される：
結果は、GenomePlex増幅を使用する時、４％の切断されたＴ２１と２５ナノグラムへ切断されたゲノムＤＮＡで得られた比率の比率は、１．０２０の予期された理論的な比率に接近している。対照的に、２５ナノグラムの長いゲノムＤＮＡ内に、４％の切断されたＴ２１がスパイクされた時に得られた比率の比率は１．０００に近かった。この結果は、GenomePlex増幅方法が長いゲノムＤＮＡの増幅に好ましいことを示す。これは、対象のＤＮＡが循環セルフリーＤＮＡの短いフラクション内に見つかる場合には、ａＣＧＨの使用のための既知の増幅方法が適切ではないことを実証する。
長いゲノムＤＮＡに４％の切断されたＴ２１ＤＮＡをスパイクしたアダプターＰＣＲ増幅方法を使用する時、理論的な比率よりも有意に大きな比率を与えた。これは、アダプターＰＣＲ増幅方法が短いＤＮＡの増幅に好適であり、混合されたサイズのＤＮＡを含むサンプルの短いＤＮＡフラグメントを豊化するために使用することができることを示す。
出願人は、たとえばGenomePlexのような標準ＰＣＲ方法の使用は十分にうまくいかないことを示した。これは、長いＤＮＡ（例えば母体のＤＮＡ）からの背景の信号が、短いＤＮＡ（例えば胎児のＤＮＡ）からの信号を圧倒するからである。
例２ −トリソミー２１の検知用のアダプター−ＰＣＲ
Wessex National Genetics Reference Laboratory (NGRL)により提供された、ダイソミーあるいはＴ２１胎児のいずれかを有していると知られている妊婦からの冷凍のセルフリープラズマ・サンプルのメーカーの指示に従って、QIAmp Circulating Nucleic Acid (Qiagen)キットを使用して、１つのサンプル当たりの５ｍｌのプラズマからのＤＮＡ抽出を、１つのトリソミー・サンプルおよび３つのダイソミー・サンプルに対して実行した。
ＤＮＡは１０Ομｌヌクレアーゼフリーの水中で溶出され、SpeedVaｃを使用して乾燥し、１５μｌヌクレアーゼフリーの水で再構成された。各サンプルの全体は従来のプロトコルに従って端部変性されＡ−テイルされた。ＤＮＡアダプター（例えばAgilent SureSelectXT試薬キット）は、市販のＤＮＡリガーゼ（たとえば、 T4 Rapid DNA Ligase, Enzymatics）を使用し、メーカーの指示に従って、端部変性されＡ−テイルされたＤＮＡにリゲートされた。QiaQuickカラム（Qiagen）を使用して、反応物は清浄化されて、３０μｌのQiagen溶離バッファー中に溶出した。その後、リゲートされたＤＮＡの半分は、１ｘ Accuzymｅ反応緩衝液（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、アダプターシークエンスをターゲットとするＰＣＲプライマー（例えばAgilent SureSelectXT試薬キット）の各々の５０−２００ｐｍｏｌ、５０ｎｍｏｌのｄＮＴＰおよび５Ｕ Accuzyme ＤＮＡポリメラーゼ（バイオライン）がＰＣＲ反応の中で使用された。サイクリング条件は以下のとおりだった：３分間の９８℃、続いて３０秒間９８℃の変性、３０秒間６５℃のアニーリング、および１分間７２℃のエロンゲーションを１５サイクル。ＰＣＲ反応物はQiaQuickカラム（Qiagen）を使用して清浄化され、３０μｌのQiagen溶離バッファー中に溶出された。
その後、ＤＮＡの量はメーカーの指示に従ってNanoDrop ＵＶ分光測光器を使用して定量された。その後、サンプルＤＮＡの１マイクログラムはＣｙ３を使用して標識付けされた。CytoSure標識付キット（Oxford Gene Technology）で１マイクログラムのサンプルＤＮＡはＣｙ３を使用して、１μｇの参照ＤＮＡはＣｙ５を使用して標識付けされた。ＤＮＡ調製物は水を使用して１８μｌまで増やされ、Random Primerの１０μｌおよびReaction Bufferの１０μｌを加えた。ＤＮＡは３分間９５℃で変性された。氷の上の５分のインキュベーションに続き、以下の試薬が加えられ、２時間ＤＮＡがインキュベートされた：１０μｌのｄＣＴＰ Labelling Mix、１μｌのＣｙ−ｄＣＴＰ、および１μｌのエクソフリーなクレノー。１０分６５℃のステップの後、サプライヤーの指示に従ってCytoSure浄化カラム(Oxford Gene Technology)を使用して、ＤＮＡは清浄化された。ＤＮＡは、４ｘ１８０ｋ CytoSure ＩＳＣＡマイクロアレイ(Oxford Gene Technology)とのハイブリダイゼーションのために、スピードバック(speedvac)により乾燥され、４０μｌの水中で再懸濁され、コット１（Ｃｏｔｌ）(Kreatech)の５μｌ、１１μｌブロッキング薬(Agilent)および５５μｌ ２ｘハイブリダイゼーション・バッファー(Agilent)を加えた。その後、ＤＮＡはサプライヤーの指示に従って、２０ｒｐｍで回転するＳｕｒｅｈｙｂオーブン(Agilent)の中で２２時間６５℃でＳｕｒｅｈｙｂチャンバー(Agilent)のアレイ内でハイブリダイズされた。ハイブリダイゼーションに続き、マイクロアレイ・サンドイッチがＣＧＨバッファー１(Agilent)下で取り外され、室温で５分間洗われた。その後、アレイはＣＧＨ２ バッファー２(Agilent)で３７℃で１分間洗われた。ついで、２μｍ解像度、１６ビット、１００％ｐｍｔでAgilentマイクロアレイ・スキャナで走査された。その後、ＴＩＦファイルはAgilentの特徴抽出ソフトウェアを使用して、特徴が抽出された。また、データはマイクロソフトエクセルを使用して分析された。
データを分析するために、アレイの各スポットのＣｙ３およびＣｙ５信号が検査され、人の染色体にハイブリダイズするようには設計されなかったすべてのプローブ、および３５０より下の緑信号のプローブは削除された。緑／赤（Ｃｙ３／Ｃｙ５）比率はすべてのプローブについて計算された。また、平均の緑／赤比率は染色体２１に対応するプローブ、およびＸおよびＹ（参照プローブ）以外の他のすべての染色体に対応するプローブについて計算された。その後、比率（Ｃｈｒ２１／参照）の比率は各サンプルセットについて計算された。結果は図４に示され、ダイソミー２１コントロールと比較して、染色体２１ ＤＮＡの増加分を検知するために本発明の方法を使用することができることを実証する。
現在までテストしたすべての臨床のサンプルについては、図５に示される結果が得られた。箱のプロットは、すべての読みの平均値を表わす中央のラインと共に、各グループの比率の４分位数の１番目と３番目の数の間の範囲を表わす。エラーバーは、各コホート（cohort）で得られる最大値と最小値を示す。これは、アダプターリゲーションに続く増幅の本発明方法が、前述のサンプルの中で母体のプラズマを使用することにより、胎児の中のトリソミーとダイソミーの２１の正確な非侵襲的検知を可能にすることを実証する。
例３ − 短くされたエクステンション時間でのアダプター−ＰＣＲ
サンプル（混合サイズのヒトＤＮＡ、５％の切断されたＴ２１ ＤＮＡとPromega、コリエル セル レポジトリーズ（Coriell Cell Repositories））および参照ＤＮＡ（切断されたヒトＤＮＡ、Promega）は、例２に記述されたように端部変性（end-repair）、Ａ−テーリング（A-tailing）およびアダプターリゲーションにより処理された。清浄化されたリゲーション生産物は、異なるサンクリングパラメーターで、以前に記述されたようなＰＣＲ反応の中で使用された。サイクリング条件は以下のとおりだった：３分間の９８℃、続いて３０秒間９８℃の変性、３０秒間６５℃のアニーリング、および７２℃のエロンゲーションを１５サイクル。１分間のエクステンション時間は、１秒エクステンション時間に対してテストされた。ＰＣＲ反応は、１．８Ｘ AMPure XP磁気ビーズ（Beckman Coulter）を使用して清浄化され、３０のμｌヌクレアーゼフリー水中に溶出された。
ＤＮＡの量はメーカーの指示に従って、NanoDropＵＶ分光測光器を使用して定量された。その後、CytoSure標識付キット（Oxford Gene Technology）で１マイクログラムのサンプルＤＮＡはＣｙ３を使用して、１μｇの参照ＤＮＡはＣｙ５を使用して標識付けされた。ＤＮＡ調製物は水を使用して１８μｌまで増やされ、Random Primerの１０μｌおよびReaction Bufferの１０μｌを加えた。ＤＮＡは３分間９５℃で変性された。氷の上の５分のインキュベーションに続き、以下の試薬が加えられ、２時間ＤＮＡがインキュベートされた：１０μｌのｄＣＴＰ Labelling Mix、１μｌのＣｙ−ｄＣＴＰ、および１μｌのエクソフリーなクレノー。１０分６５℃のステップの後、サプライヤーの指示に従ってCytoSure浄化カラム(Oxford Gene Technology)を使用して、ＤＮＡは清浄化された。ＤＮＡは、４ｘ１８０ｋ CytoSure ＩＳＣＡマイクロアレイ(Oxford Gene Technology)とのハイブリダイゼーションのために、スピードバック(speedvac)により乾燥され、４０μｌの水中で再懸濁され、コット１（Ｃｏｔｌ）(Kreatech)の５μｌ、１１μｌのブロッキング薬(Agilent)および５５μｌ ２ｘハイブリダイゼーション・バッファー(Agilent)を加えた。
その後、ＤＮＡはサプライヤーの指示に従って、２０ｒｐｍで回転するＳｕｒｅｈｙｂオーブン(Agilent)の中で２２時間６５℃でＳｕｒｅｈｙｂチャンバー(Agilent)のアレイ内でハイブリダイズされた。ハイブリダイゼーションに続き、マイクロアレイ・サンドイッチがＣＧＨバッファー１(Agilent)下で取り外され、室温で５分間洗われた。その後、アレイはＣＧＨ２ バッファー２(Agilent)で３７℃で１分間洗われた。ついで、２μｍ解像度、１６ビット、１００％ｐｍｔでAgilentマイクロアレイ・スキャナで走査された。その後、ＴＩＦファイルはAgilentの特徴抽出ソフトウェアを使用して、特徴が抽出された。また、データはマイクロソフトエクセルを使用して分析された。データを分析するために、アレイの各スポットのＣｙ３およびＣｙ５信号が検査され、人の染色体にハイブリダイズするようには設計されなかったすべてのプローブ、および３５０より下の緑信号のプローブは削除された。緑／赤（Ｃｙ３／Ｃｙ５）比率はすべてのプローブについて計算された。また、平均の緑／赤比率は染色体２１に対応するプローブ、およびＸおよびＹ（参照プローブ）以外の他のすべての染色体に対応するプローブについて計算された。その後、比率（Ｃｈｒ２１／参照）の比率は各サンプル・セットについて計算され、表２に示された結果が得られた。
これらの結果も図６の棒グラフ中で説明される。結果は、６０秒から１秒のエクステンション時間のトリソミー・サンプルでの比率の著しい増加、およびダイソミーサンプルでの比率の著しい減少を示す。これは短いエクステンション時間が使用される場合、トリソミーとダイソミーの比率間の違いが増加することを導く。
例４ −エクステンション時間の長短の比較 Ｉ
Hyperladder（登録商標）（Bioline）のサンプルが使用され、上記のように端部変性、Ａテーリング処理され、リゲーションされた。異なるアニーリング／エクステンション時間で、上に記述されるようにＰＣＲが実行された。また、サンプルはＤ１Ｋテープステーション（Agilentテクノロジーズ）上で実行された。
結果は図７に示される。それはTapeStation分析ソフトウェア（Agilentテクノロジーズ）を使用して得られたゲル・イメージである。増幅標準状態（９０秒のアニーリング／エクステンション：３０秒の６５℃、６０秒の７２℃）の下で、サイズ範囲＜３５０ｎｔの生産物のフラクションはおよそ３６％である。対照的に、より短いアニーリング／エクステンションレジーム（１０秒のアニーリング／エクステンション：１０秒の６５℃）の下では、約６１％はこのフラクションにある。これは、より短いアニーリング／エクステンションレジームでのより長いフラグメントの増幅に対するバイアスによる。具体的には、より長いアニーリング／エクステンションでは３６％は＞７００ｎｔであり、より短いアニーリング／エクステンションでは存在しない。
例５ −エクステンション時間の長短の比較 ＩＩ
混合サイズ・ダイソミーヒトＤＮＡサンプル（Promega）および、４％の切断されたＴ２１ＤＮＡ（Coriell Cell Repositories）を含む混合サイズ・ダイソミーヒトＤＮＡサンプル（Promega）、および参照ＤＮＡ（切断されたヒトＤＮＡ、Promega）が、上に記述されるように端部変性、Ａテーリングおよびアダプターリゲーション処理された。清浄化されたリゲーション生産物は異なるアニーリング／エクステンション条件で、先に述べたようなＰＣＲ反応で使用された。サイクリング条件は以下のとおりだった：３分間９８℃、次いで３０秒９８℃の変性、６５℃アニーリング／エクステンションの１５サイクル。テストされたアニーリング／エクステンション時間は、３０秒、２０秒、１０秒および５秒だった。ＰＣＲ反応生産物は、ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ磁気ビーズ（Beckman Coulter）で清浄化され、標識が付けられ、アレイに適用され、先に述べたように信号データは分析された。結果として得られた比率は、以下の表３に示される。
この実験は、アニーリング／エクステンション時間が減少するにつれて、Ｃｈｒ２１／Ｒｅｆ比率が著しく改善されることを示す。
例６ − プローブ最適化
マイクロアレイのためのプローブ選択の間の１つの目的は、比較の結果に敏感であると知られている要因が、比較プローブ選択の間に一定に保たれるということでありえる。実際上、我々は最適化プローブセットを備えたマイクロアレイにハイブリダイゼーション実験を実行した。この最適化プローブセットは最終設計のために必要であるものよりはるかに多くのプローブを含んでいた。その後、この最適化プローブセットからの選択規則は、対象の染色体（例えば１セットのコントロール染色体と染色体１３、１８および２１）にわたる変数（例えばＧＣ含量）に関して同様の分布を維持し、同時にいくつかの最適化実験に基づいたプローブの平均の赤／緑信号のための制約を反映するために選ばれた。
例えば、ＧＣ含量は厳重にセット・ウィンドウ（例えば２０％＜ＧＣ含量＜６０％）から選ぶことができる。あるいは、複数のそのようなウィンドウをセットすることができ、各ウィンドウ内のプローブの割合をすべての染色体組にわたり維持することができる。同様のアプローチは信号の強度にも行い、最適化実験に信号のしきい値をセットするか、またはそれぞれのプローブ（例えば０−５００、５００−１０００、１０００−１５００など）の平均またはメジアン強度の１つ以上のウィンドウを設け、その間異なる染色体あるいは対象の領域からのプローブの割合が維持されることができる。当業者はこれらの例から、パフォーマンス基準（例えばＧＣ含量、または信号レベル）に基づいてプローブセットを一グループにすることができ、プローブのバランスのとれた設計を許容し、対象のプローブセットおよび参照セットが個々のそのようなグループの内でプローブの同様の数を有し、さらなるダウンストリームにおいてバランスのとれたセットの分析を許容する。
先行技術とは対照的に、本発明の方法では、我々は、プローブごとにサンプルと参照の間の差を示す領域を捜す。
例７ − データ分析
単純なデータ分析はここで示された実験的方法で行なわれてもよい。当該技術分野において周知のように、データ分析は抽出されたマイクロアレイ・データの特徴把握からスタートする。与えられたサンプルについては、下記手続きが母体の血液サンプルからの胎児のトリソミーおよびダイソミー・サンプルの間の差を見つけるために使用された：
（ａ）プローブごとに、すべてのプローブについて緑と赤の比率を計算する；
（ｂ）実験条件（例えば５００以上の任意の蛍光性のユニット（ａ．ｆ．ｕ）の平均の赤および緑信号）に適切な信号のしきい値を課することによって、実験的な基準によってデータセットをフィルターする；
（ｃ）プローブを、それらのＧＣ含量（これがアレイに対するプローブ選択の間にまだ行われていない場合）によってフィルターする；
（ｄ）対象の染色体（例えば染色体２１）について、フィルターされたＧ／Ｒ比率の平均およびメジアン値を計算し、同様に得られた値により規格化し、あるいは、固定された参照染色体（たとえば染色体１４）、あるいは１セットの適切に選ばれた染色体（例えば異数性（つまり、好ましくは染色体１３および１８を除外して）の重要な危険のないすべての常染色体）により規格化する。
これらの「比率の比率」は、調査されるトレーニング・セットについて、明瞭な分離を示す。それは特別の方法の分類されたしきい値を知るために使用することができる。例として、ダイソミー（「正常な」場合）とトリソミーの間の分類しきい値が約１．０３に選ばれるかもしれない場合、図５に示されるデータはこのしきい値を説明するために役立つ。
例８ − ウィルコクソン検定を使用するデータ分析
同じデータセットのデータ分析の代替例は、ウィルコクソン検定に基づく。ここでは、下記手続きが使用された：
（ａ）プローブごとのベースで、すべてのプローブについて緑と赤の比率を計算する；
（ｂ）実験条件により、例えば５００以上の任意の蛍光性ユニット（ａ．ｆ．ｕ）の平均の赤および緑信号）に適切な信号のしきい値を課することによってデータセットをフィルターする；
（ｃ）アレイに対するプローブ選択の間にまだ行われていない場合は、それらのＧＣ含量によってフィルターする；
（ｄ） 参考について、
（ｅ）対象の染色体（例えば染色体２１）についてのフィルターされた緑と赤の比率を規格化するためにステップ（ｄ）で得られた値を使用する；
（ｆ）ダイソミーを持った胎児のための期待値とデータが異ならない帰無仮説に対する（ｅ）で得られた値の群についてウィルコクソン検定を行う；理論上、この値は１である；しかしながら、ある状況で、例えばダイソミー妊娠からのサンプルのトレーニングデータに対して実行された前の実験が示す場合に、期待値が１とは異なる状況が発生してもよい；その場合、前の経験に基づいた帰無仮説の値への必要な調節を行うことは許容可能である；
（ｇ）タイプ１エラー（偽陽性）に対する適切なリスクを決定するためにｐ値のしきい値を選ぶ。
そのようなしきい値の正確な値は実験の詳細に依存し、テストの要求性能によって選ばれるだろう。当業者は、そのようなしきい値を決定するためにＲＯＣ曲線を評価することができるだろう。例において、しきい値は１０−２０を選ぶことができる。それは典型的な有意差試験の中で使用されるｐ値カットオフより本質的に小さい。例は以下の表４に示され、患者のサンプル用の比率およびｐ値を示す。
好ましい実施態様において、ウィルコクソン検定に対してステューデントｔ検定が先に記述した分析法において使用される時、偽陽性の数および偽陰性の数はウィルコクソン検定方法と比較してより多くなる。
例９ − トリソミー２１／ダイソミー ２１比率に対するアニーリング／エクステンション時間の影響の比較
この実験で、切断されたダイソミーＤＮＡあるいはＴ２１ ＤＮＡ（胎児のＤＮＡのモデル）のいずれかを１０％のスパイク・インとして、（２．５ナノグラム）の２５ナノグラムのサイズ・ミックスＤＮＡ（母体のＤＮＡのモデル）に加えた。サイズ・ミックスは１：１：１重量比の高分子量：約１０００ ｂｐ：１８０ ｂｐだった。その後、サンプルはＰＣＲ１とＰＣＲ２の３０秒または５秒を用いて、全ゲノム次世代シークエンスによりＮＧＳ分析のために準備された。より短いエクステンション時間がより短いシークエンスの増幅に好ましく（あるいは実際のサンプルでは、胎児由来のフラグメントの、増加したＴ２１／Ｄ２１比率に帰着することは本発明の出願人によって提案されている。
方法
端部変性／Ａ−テーリング反応ミックス中の量は、以下の表８に与えられる。
１つのＴ２１および１つのダイソミー・サンプルが準備され、３０分間２０℃、次いで３０分間７２℃でインキュベートされた。サンプルは氷の上に置かれた。リゲーション混合物は、２μｌのリガーゼ・バッファーを、４μｌのAgilentアダプター（１：５）および４μｌのＴ４ Rapid Ligaseに加えることによりセット・アップされた。リゲーション混合物の５マイクロリットルが各サンプルに加えられた。
生産物は３０分インキュベートされ、１．８ Ｘのビーズで清浄化されて、次いで３０μｌ水中に溶出された。サンプルは半分に分割され、Agilentプライマーを使用してSurecyclerで標準のランピング速度で３０秒または５秒で１０サイクル増幅された。（過剰に増幅された生産物が生産されないように、サイクル数が最適化された。）サイクルパラメーターは、３分の０の９８℃と次いで９８℃で３０秒および６５℃での３０秒または５秒の１０サイクルだった。
Agilent SureSelect PCR1試薬の５Ｘ マスターミックスは、以下により３５μｌにされ、１５μｌのライブラリーに加えられた（下記の表９を参照）。
１．８ Ｘ アンピュアを使用してサンプルは清浄化されて、Qubit broad range ＤＳ ＤＮＡキットを使用して定量された。ＰＣＲ２については、１０ナノグラムのＰＣＲ１生産物の二重反復試験が、上記の方法を使用して、６サイクル（８および１０サイクルが過剰な増幅に帰着した）で増幅された。またlllumina MiSeqデスクトップの次世代シークエンサーの多重処理のためのインデックスを付けられたバーコードが組込まれた。ＭｉＳｅｑシーケンシング用のプールは、以下の表１０に示される。
ＭｉＳｅｑプール中の目標の最終濃度は４ｎＭだった。したがって、サンプルはそれぞれ４／８＝０．５ｎＭだった。各フラグメントの両方の鎖の１００の塩基がシークエンスされた。シークエンスされたフラグメントあるいは「リード」は、ヒトゲノム中の染色体に整列された。各染色体のリードの合計が計算された。染色体２１に整列されたリードの数は合計の整列されたリードの割合として計算された。
結果
表１１はＰＣＲ１（QubitブロードレンジＤＳ ＤＮＡキット）の後のサンプルの濃度を示す。
Ｑｕｂｉｔ上で測定された時のＤＮＡ濃度は、３０秒のエクステンションからの産出が５秒のエクステンションのほとんど３倍であることを示す。表１２、図８および９は、ＰＣＲ２（QubitブロードレンジＤＳ ＤＮＡキット）の後のサンプルの結果を示す。
結果は図８および９にも示される。ここでＡＯはラダー（Ladder）であり、Ａ１がＴ２１、５秒、インデックス１，Ｂ１がＴ２１、５秒、インデックス２，Ｃ１がダイソミー、５秒、インデックス３、Ｄ１はダイソミー、５秒、インデックス４、Ｅ１はＴ２１、３０秒、インデックス５、Ｆ１はＴ２１、３０秒、インデックス６、Ｇ１はダイソミー、３０秒、インデックス７およびＨ１はダイソミー、３０秒、インデックス８である。
すべてのサンプルの最初の量が１０ナノグラムであるにもかかわらず、ＰＣＲ２の３０秒のエクステンションの後には、５秒のエクステンションのほぼ３倍の大きな産出を示す。５秒および３０秒のエクステンションのピーク目標長さに本質的な違いはなかった。しかしながら、より短いエクステンション時間では高い分子量生産物に大幅な減少があった。
シークエンスデータは以下の表１３および１４にまとめられる。表１３は各染色体に整列した列挙されたフラグメントを示す。表１４は各染色体に整列した合計のフラグメントのパーセンテージを示す。
各サンプルの整列したリード（ＸとＹ染色体以外の）の総数は、イタリック体で示される。範囲は１つのサンプル当たり２〜４００万のフラグメントあるいはリードである。
シークエンスレーン中の整列したリードの総数は２１，７１６，６６６である。
染色体２１は、リードの合計のちょうど１％以上（染色体のサイズから期待され、他のものによって報告されたように）を占める。Ｔ２１スパイクがＤ２１よりわずかに高い値を持っていることが見られる。これは、図１０と１１にグラフとして示される。これは５秒または３０秒のエクステンション時間でのダイソミーとトリソミーのサンプルについて染色体２１に整列した合計のリードのパーセンテージを示す。
図１０の左側は、５秒のエクステンション時間のパーセンテージを示す。また、右は３０秒のエクステンション時間の場合を示す。実験は２回行なわれた。図１１は、個々のサンプルの平均および２回の間での違いを示す。
どちらも１０％のＴ２１スパイク−インが、Ｄ２１スパイク−インより整列したリードの高い割合を有することが見られる。図１１は、ダイソミーとトリソミーの間の差が３０秒より５秒のエクステンション時間の方がわずかに大きいことを示す。これは、Ｔ２１リード／Ｄ２１リードの比率の計算により示される（下記の表１５を参照、それは５秒か３０秒のエクステンション・ステップでのトリソミー／ダイソミー・サンプルの比率の比率を示す）。
ダイソミーとトリソミーのサンプルがそれぞれのエクステンション時間で２回実行されるので、それぞれのエクステンション時間についてトリ／ダイ用の４つの比率と１つのダイ／ダイ比率が得られる。表１５は、５秒のエクステンション時間の平均が３０秒のものより高いことを示す。この結果の可能な１つの解釈は、より長いフラグメントのエクステンションに対して、より短いエクステンション時間がバイアスを有することを示す。それぞれの結果および平均は、図１２および１３にグラフとしてに示される。図１４は、染色体２１の比率を他の染色体と比較し、常染色体のすべてについてトリソミー／ダイソミー・サンプルおよびダイソミー／ダイソミー・サンプルの平均比率を示す。図１４は、常染色体のすべてについて、１つの染色体当たり４つのトリソミー／ダイソミー比率のデータポイントの平均と、１つのダイソミー／ダイソミー比率のデータポイントを示す。染色体２１用のデータは黒いバーで示される。データは、１と本質的に異なるただ一つの比率は、両方のエクステンション時間（点線）における染色体２１用のトリソミー／ダイソミー比率であることを明白に示す。
結論
１０％のトリソミー２１スパイクインは、５秒および３０秒のエクステンション時間の両方で先に述べたアダプターＰＣＲ増幅方法を使用して、ゲノムワイド次世代シークエンシングによって検知された。２つのダイソミーおよび２つのトリソミー・サンプルは、４つのトリソミー／ダイソミー比率の計算を許容した。オーバーラップがあるが、４つのＴ２１／Ｄ２１比率の平均は、３０秒のエクステンションより５秒のエクステンションにおいて１３％高い。この結果の可能な１つの解釈は、より長いフラグメントの増幅に対して、より短いエクステンション時間の方がバイアスがかかるということである。常染色体がすべて分析される場合、データが１と本質的に異なるただ一つの比率が、染色体２１についてのトリソミー／ダイソミー比率であることを示す。
例１０ − ストゥファー法を使用するデータ分析
１０７のサンプル（コントロールを含む）が集められた。そのうち２４はサンプルの明白な溶血により除外された。試験サンプルは、トリソミー２１胎児を持っている危険の高い妊娠している女性からの血液サンプルだった（コントロールは妊娠していない人々からの血漿だった）。その後、ＤＮＡはQIAmp Circulating Nucleic Acidキット（Qiagen）を使用してサンプルから抽出された。また、ＤＮＡは例２に述べられているようなアダプター−ＰＣＲ方法を使用して増幅された。増幅に続いて、ＤＮＡは標識付けされ、標識が付けられた参照ＤＮＡ（妊娠していない女性からのゲノムＤＮＡ）と一緒にマイクロアレイでハイブリダイズされた。その後、アレイは洗われ走査された。また、各スポットでの蛍光の量は例２に述べられているような特徴抽出ソフトウェアを使用して計られた。その後、Ｃｙ３／Ｃｙ５比率は以下のように計算され分析された。
各サンプルについては、ペアでウィルコクソンの順位和検定が、ボンフェローニ（Bonferroni）複合テスト補正を使用して、染色体位置（染色体Ｘを除き）によってグループ化されたサンプルログ−比率（sample log-ratios）間で行なわれた（Hollander & Wolfe (1999) Non Parametric Statistical Methods. New York: John Wiley & Sons)。その後、染色体２１について得られたｐ−値はストゥファー法(Stouffer et al. (1949) The American Soldier, Volume 1: Adjustment During Army Life. Princeton University Press, Princeton)を使用して組み合わされた。これは単一のｐ−値に帰着する。残りの８３のサンプル（１１トリソミー２１妊娠を含む）のうち、６５は真の陰性として呼ばれた。９は真の陽性だった。また、９は高いＤＬＲ（比率における高い変化）により判断できなかった。単一のｐ値の典型的なカットオフ値はサンプルまたはアレイの質スコアと組み合わされて０．０１だった。
上記の例は発明の好ましい実施態様を説明するために提供される。当業者は、修正が請求項の範囲から外れずになされてもよいことを認識するだろう。この特許出願の記述の長さを合理的にするために、特徴のあらゆる組み合わせの徹底的な記述は提供されていない。
記述された実施態様および従属クレームのオプションの好ましい特徴および修正はすべて、ここに教示された発明のすべての態様において使用可能である。更に、すべてのオプションの好ましい特徴および記述された実施態様の修正と同様に従属クレームの個々の特徴は、互いに結合可能で交換可能である。本用途の主題の前出生の診断方法に関して記述された特徴はすべて腫瘍の識別のために適用されてもよく、また逆の場合もある。当業者は、明示的にここに言及されない他の腫瘍および胎児の条件に当てはまるために開示をここに適応させることができるだろう。本出願は優先権を主張する英国特許出願１４０４０６３．８、および本出願に伴う要約での開示は、参照されここに組込まれる。

Claims (15)

  1. 第１のソースから誘導された核酸についての循環セルフリー核酸サンプルの豊化方法であって、該サンプルは第１のソースからの核酸と第２のソースからの核酸を含み、循環セルフリー核酸のサンプルはより短いサイズ範囲とより大きいサイズ範囲の２つのサイズ範囲内にある核酸を含み、第１のソースからの核酸はより短いサイズ範囲であり、
    ａ）少なくともより短いサイズ範囲の核酸から増幅用テンプレートを形成すること；および
    ｂ）テンプレートを増幅することにより、より短いサイズ範囲の核酸についてサンプルを豊化し、対象シークエンスを有する核酸のヌクレオチドシークエンスに無関係の方法で増幅生産物を形成することを含む方法。
  2. 増幅生産物は、約７５０ｂｐ未満のサイズを持っている、請求項１記載の方法。
  3. 増幅生産物は、約２５０ｂｐ未満のサイズを持っている、請求項１記載の方法。
  4. 増幅生産物は、約１４０−１８０ｂｐのサイズを持っている、請求項１から３のいずれか１項記載の方法。
  5. より短いサイズの範囲内にある最長の核酸が、より長いサイズ範囲内にある最短の核酸の１／２〜１／３倍である、請求項１から４のいずれか１項記載の方法。
  6. ステップａ）はサンプル中の核酸の端部へ、プライマー結合部位を含むアダプター分子をリゲートすることを含む、請求項１から５のいずれか１項記載の方法。
  7. ステップｂ）はアダプター・プライマー結合部位に相補的なプライマーをアニーリングし、ポリメラーゼ連鎖反応を使用してテンプレートを増幅することを含む、請求項６記載の方法。
  8. アニーリング／エクステンション時間が３０秒以下である、請求項７記載の方法。
  9. アニーリング／エクステンション時間が３０秒未満である、請求項７記載の方法。
  10. アニーリング／エクステンション時間が約２０秒または２０秒未満である、請求項７記載の方法。
  11. アニーリング／エクステンション時間が約１０秒または１０秒未満である、請求項７記載の方法。
  12. アニーリング／エクステンション時間が約５秒または５秒未満である、請求項７記載の方法。
  13. コントロール・シークエンスは対象の核酸シークエンスとは異なる染色体からのものである、請求項１から１２のいずれか１項記載の方法。
  14. 対象シークエンスは多形性の疑いがない、請求項１から１３のいずれか１項記載の方法。
  15. コントロール・シークエンスは多形性の疑いがない、請求項１から１４のいずれか１項記載の方法。
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