JP2017505618A - ハイブリドーマ細胞系統(My−C−cC0C2−259−1A4)および該細胞系統の、ヒトの心臓特異的なミオシン結合タンパク質C(C−タンパク質、MYBPC3、cMyBP−CまたはMy−C)に対するモノクローナル抗体の製造のための使用 - Google Patents
ハイブリドーマ細胞系統(My−C−cC0C2−259−1A4)および該細胞系統の、ヒトの心臓特異的なミオシン結合タンパク質C(C−タンパク質、MYBPC3、cMyBP−CまたはMy−C)に対するモノクローナル抗体の製造のための使用 Download PDFInfo
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Abstract
Description
例1:
ハイブリドーマ細胞系統の製造
My−CのcC0C2で公知のようにして免疫化されたマウスの脾臓を、滅菌条件下で取り出し、そして脾臓細胞を、脾臓皮膜内からシリンジを用いてRPMI1640培地(Life Technologies(商標)、カールスルーエ)ですすぎ出して、ばらばらにする。該脾臓細胞をペレット化(300×gで10分間)させ、RPMI1640培地で3回洗浄し、そしてRPMI1640培地中に再懸濁させる。次いで、該脾臓細胞を、系統P3X63Ag8.653(ATTC CPL 1580)の骨髄腫細胞と融合させる。そのために、対数増殖期にある培養された骨髄腫細胞を同様にピペットで取り、3回洗浄する。1×108個の脾臓細胞と5×107個の骨髄腫細胞を、遠心分離チューブ中にピペットで取り、激しく混ぜ、遠心分離し、その細胞沈降物に、1分以内で、1.5mlの予熱された50%のポリエチレングリコール1500(ロシュ、バーゼル)を37℃でその小さいチューブを連続的に回転させながら滴加する。次いで、その融合バッチを更に1分間にわたり37℃でインキュベートする。引き続き3分間で、予熱された培地(RPMI1640)を、最初の1分間で1mlで、2番目の1分間で3mlで、そして次に18mlで滴加する。引き続き、直ちに200×gで10分間にわたり遠心分離する。その細胞ペレットを、10%FCSおよびHATを含むRPMI1640培地中に取る。該ペレットの一部を、96ウェル培養プレート中に撒き、残りを液体窒素中で−196℃において凍結させる。その培養に際してフィーダー細胞として、前記融合前に1日間培養したマウス腹腔マクロファージ(1ウェル当たりHAT培地中1×104個のマクロファージ)を用いる。それらの細胞を、CO2インキュベーター中で37℃でインキュベートする。培地をそれぞれ3日〜5日後に新たなRPMI1640−HAT培地と交換し、前記融合された細胞の増殖に応じて、培養上清を、約2週間後にELISAで、抗原(My−C)に対するその反応性について試験する。
抗体を産生するクローンの選択
増殖している全てのクローンまたは該クローンの抗体を、その反応性についてELISA(酵素結合免疫吸着アッセイ)を用いて試験した。免疫吸着剤は、免疫原、つまりMy−Cの組換え型のcC0C2ドメイン(約2μg/ml)であった。
1. マイクロタイタープレート(Costar、高結合)を1ウェル当たり50μlずつの免疫原溶液により4℃で一晩にわたりコーティングする。
2. 該マイクロタイタープレート(MTP)を、TBS(トリス緩衝生理食塩水、pH7.4)で3回洗浄する。
3. 該MTPを、1ウェル当たりに200μlのブロッキング試薬(ベーリンガー、マンハイム)を用いて37℃で1時間にわたりブロッキングする。
4. 該MTPを、NaCl−Tween 20で3回洗浄する。
5. 1ウェル当たりに50μlずつのハイブリドーマ培養の培養上清と一緒に、TBS−Tween 20による約1:2希釈でインキュベートする。
6. 該MTPを、NaCl−Tween 20で3回洗浄する。
7. 1ウェル当たりに50μlのペルオキシダーゼに結合された抗マウスIg抗体と一緒に、室温で1時間にわたりインキュベートする。
8. 該MTPを、NaCl−Tween 20で3回洗浄する。
9. 1ウェル当たり50μlのABTS溶液(100mlの基質バッファー[クエン酸塩、過ホウ酸ナトリウム、pH4.4]当たりに100mgのABTS)と一緒にインキュベートする。
10. 60分間のインキュベーション時間後に室温でマイクロプレートリーダー(SLT)により405nmで測定する。
ヒト心臓特異的My−Cにおけるモノクローナル抗体1A4についてのエピトープマッピング
モノクローナル抗体1A4の結合部位の同定は、ペプチドスキャニング法により行った。その場合に、前記免疫化のために使用されたMy−CのヒトcC0C2ドメインの全アミノ酸配列は、全部で111種の、それぞれ15アミノ酸長の重複しているアミノ酸配列に分けられる。これらの配列は、個々のペプチドとしてスポットにおいてセルロースメンブレン上で直接的に合成される。前記メンブレンを、抗体を含有するハイブリドーマの培養上清と一緒にインキュベートし、そしてペルオキシド結合された抗マウスIg抗体と一緒にインキュベートすることによって抗体の結合部位を可視化させる。そのために、TBS−Tweenで3回洗浄した後に、該メンブレンを転写シート間に置き、次いでECL(商標)(増強化学発光(Enhanced Chemiluminescent))検出試薬(Amersham、ブラウンシュバイク)と一緒に3分間にわたりインキュベートする。フィルム(Hyperfilm−ECL(商標)[RPN 2103H Amersham、ブラウンシュバイク])を載せて、それを引き続き30秒から3分の間露光させる。抗体により検知された配列の同定は、前記フィルムに露光されたスポット31と32(図4)を、該スポットに局在する免疫原(My−CのcC0C2ドメイン)の15マーの部分配列に割り当てることによって行われる。
Claims (10)
- ヒトの心筋ミオシン結合タンパク質C(My−C)に対するモノクローナル抗体(抗My−C−cC0C2−259−1A4)を産生するハイブリドーマ細胞系統DSM ACC3224。
- My−CのcC0C2ドメインに対して免疫化されたマウスの脾臓細胞(リンパ芽球)と骨髄腫細胞とを融合させることによって得られ、かつ該My−Cにおける心臓特異的なエピトープに対するモノクローナル抗体を産生することを特徴とする、請求項1に記載のハイブリドーマ細胞系統。
- 脾臓細胞として、Balb/cマウス由来の脾臓細胞が使用され、かつ骨髄腫細胞として、系統P3X63Ag8.653の骨髄腫細胞または該系統のサブクローンの骨髄腫細胞が使用されることを特徴とする、請求項1または2に記載のハイブリドーマ細胞系統。
- ヒトの心筋My−Cの配列のアミノ酸A124〜K134の範囲のエピトープに対する特異的モノクローナル抗体を産生することを特徴とする、請求項1から3までのいずれか1項に記載のハイブリドーマ細胞系統。
- ヒトの心筋My−Cの配列のアミノ酸A124〜K134の範囲のエピトープを認識して結合することを特徴とする、モノクローナル抗体(抗My−C−cC0C2−259−1A4)。
- 請求項1から4までのいずれか1項に記載のハイブリドーマ細胞系統によって産生されることを特徴とする、請求項5に記載のモノクローナル抗体(抗My−C−cC0C2−259−1A4)。
- 請求項1から4までのいずれか1項に記載の骨髄腫細胞系統の製造方法であって、ヒトcC0C2ペプチドによって免疫化された実験動物(マウス)の脾臓細胞が骨髄腫細胞(系統P3X63Ag8.653)と融合されたことを特徴とする、前記製造方法。
- 請求項5および/または6に記載のマウスのモノクローナル抗体の製造方法であって、請求項1から4までのいずれか1項に記載の骨髄腫細胞系統を培養し、そして産生されたモノクローナル抗体を単離することを特徴とする、前記製造方法。
- 請求項5および/または6に記載のモノクローナル抗体の、分析目的のための、特に血清中のMy−Cの濃度を測定するための、更に心筋梗塞の早期診断のためのELISAにおける捕捉抗体または検出抗体としての使用。
- 請求項5および/または6に記載のモノクローナル抗体の、分析目的のための、特にイムノブロットにおける、免疫組織学における、およびその他の分析法における使用。
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